BIOSENZORI ELECTROCHIMICI

Critu Adrian

UNIVERSITATEA POLITEHNICA BUCURESTI FACULTATEA DE CHIMIE APLICATA SI STIINTA MATERIALELOR

Cuprins Biosenzori enzimatici pentru determinarea compuilor de interes nutritiv..3 Biosenzori pentru glucoz.............................................................................................................3 Biosenzori electrochimici pentru colesterol....5 Biosenzori pentru determinarea calitii petelui...................................................................6 Biosenzori enzimatici pentru determinarea contaminanilor alimentari..............................8 Biosenzori enzimatici pentru determinarea metalelor grele...................................................8 Biosenzori enzimatici pentru determinarea pesticidelor.......................................................9 Biosenzori enzimatici pentru determinarea azotiilor si azotailor......................................10 Bibliografie...................................................................................................................................12

Biosenzori electrochimici

Biosenzorii electrochimici bazai pe utilizarea enzimelor au fost, de -a lungul timpului, cei mai studiai i mai dezvoltai. Biosenzorii dedicai analizei alimentelor beneficiaz de experiena ctigat la dezvoltarea senzorilor utilizai n domeniul medical, precum i n domeniul controlului calitii mediului. Cu toate acestea, biosenzorii enzimatici pot prezenta o serie de dezavantaje n cazul unor probe att de complexe ca cele alimentare: -stabilitate redus, transpus printr-un timp scurt de via a biosenzorului -interferene electrochimice datorit complexitii matricei probei -mbcsirea suprafeei active a senzorului O parte din aceste neajunsuri pot fi prevenite prin utilizarea de mediatori chimici (pentru micorarea potenialului aplicat senzorului, mare parte din interferenele electrochimice flind astfel evitate) i a unor filme (electropolimerizate, de Nafion, etc) pentru protejarea enzimei i a suprafeei electrodului. n controlul calitii alimentelor, exist cteva categorii importante de analii de interes: compui intrinseci cu valoare nutritiv (carbohidrai, proteine, vitamine, aminoacizi, lipide, etc), contaminani (pesticide, metale grele, nitrii, antibiotice, hormoni i stimulatori de cretere, micotoxine), aditivi alimentari (colorani, vitamine, corectori de gust), conservani.

Biosenzori enzimatici pentru determinarea compuilor de interes nutritiv n continuare vor fi prezentai o serie de biosenzori electrochimici enzimatici destinai determinrii din alimente a unor compui ce constituie un indicator al valorii nutritive sau a calitii produselor analizate. A)Biosenzori pentru glucoz Cele mai multe exemple de biosenzori de succes se refer la cei realizai pentru determinarea glucozei dintr-o gam larg de probe utiliznd glucozoxidaza (GOD). De altfel, de cele mai multe ori GOD este folosit ca enzim model n situaiile n care sunt testate noi metode de asamblare i realizare a unor biosenzori bazai pe enzime din clasa oxidoreductazelor. GOD este una dintre cele mai stabile enzime i are un pre de cost sczut, ceea ce o face extrem de atractiv pentru tehnologia biosenzorilor. Principiul de funcionare a unui asemenea biosenzor se bazeaz pe msurarea concentraiei de consumat sau de produs. glucoz + gluconolacton +

Cei mai simpli biosenzori amperometrici sunt bazai pe electrodul de oxigen Clark. Acesta const dintr-un catod de Pt la care are loc reducerea oxigenului i un electrod de referin de Ag/AgCl. La aplicarea unui diferene de potenial de -0,6 V Intre cei doi electrozi, are loc producerea unui curent proporional cu concentraia oxigenului.

Anod(Ag): Catod(Pt): n acest caz viteza procesului de reducere electrochimic a depinde de viteza de difuzie a oxigenului din masa soluiei, care este dependent de fapt de concentraia oxigenului din aceasta. La aplicarea unui electrod de Pt a unui potenial de aproximativ + 0,68 V vs. Ag/AgC1, se poate determina produs enzimatic. Anod(Pt): Catod(Ag): Aceti biosenzori de prim generaie sunt dependeni de concentraia oxigenului din masa de soluie a probei analizate. Primii biosenzori amperometrici pentru glucoz au fost realizai prin adsorbia sau re.inerea fizic a GOD la nivelul electrodului sau prin imobilizarea GOD pe o membran microporoas ce era apoi aplicat la suprafaa electrodului. O metod mai avansat de construcie a biosenzorilor a constat n nglobarea fizic a enzimei n matrici realizate din geluri sintetice sau naturale. n cazul acestor biosenzori, toi compuii din prob cu potenial de oxidare mai mic dect cel al vor interfera contribuind la semnalul electrochimic total. Astfel, compui ca acidul ascorbic, glutationul sau acidul uric vor fi oxidai la poteniale mai mari de +0,6 V impreun cu rezultat n urma reaciei ezimatice. Ca urmare a acestui fapt a devenit foarte important gsirea unor soluii fie pentru realizarea unor bariere care s nu permit trecerea interferenilor, fie pentru pentru aplicarea unui potenial ct mai sczut posibil.

B)Biosenzori electrochimici pentru colesterol Determinarea coninutului de colesterol din produsele alimentare de origine animal (ou, unt, ficat, rinichi, carne, pete, lapte) a devenit important, n special n ultima perioad datorit numrului mare de persoane care acuz un nivel sanguin crescut de colesterol i implicit a creterii pacienilor cu afeciuni coronariene. Biosenzorii electrochimici dezvoltai pentru colesterol se bazeaz pe utilizarea colesterol oxidazei (ChOx) i a determinrii directe sau enzimatice a apei oxigenate formate sau a medierii chimice a oxidrii ChOx reduse. Unul dintre primii biosenzori de acest fel a fost realizat prin imobilizarea covalent a colesterol oxidazei i a catalazei membran pe baz de Teflon montat pe un electrod de oxigen. Senzorul a demonstrat o reproductibilitate bun, un domeniu linear de concentraii ale colesterolului ntre 90 pM i 0,55 mM i un timp de via de o luna. Prin co-imobilizarea colesterol esterazei (ChEt) i a ChOx prin nglobare ntr-un film de polipirol electropolimerizat se poate realiza un biosenzor care la un potenial de lucru de +0,8 V permite determinarea colesterolului n domeniul de concentraii 1-8 mM. Un senzor similar bazat pe imobilizarea celor dou enzime prin reticulare cu BSA i glutaraldehid la suprafaa electroactiv a unui electrod de oxigen a permis determinarea colesterolului n domeniul 2-50 mg/dl. Biosenzorul este stabil mai mult de dou luni i a fost aplicat pentru determinarea colesterolului din ou i carne. Recent a fost raportat un biosenzor n care ChOx a fost imobilizat prin adsobie direct la suprafaa unui electrod de aur. Au fost testai diveri mediatori: hidroximetilferocen, tionina, Nile blue, Azure A cu rol de acceptori de electroni de la ChOx redus. Cele mai bune rezultate au fost obinute prin determinarea direct a la potenialul de +0,5 V, limita de detecie fiind de 60.

C)Biosenzori pentru determinarea calitii petelui Pescuitul, piscicultura i industria adiacent de procesare a petelui reprezint un domeniul extrem de important din sectorul alimentar. Calitatea petelui pescuit este dificil de controlat datorit diferenelor date de speciile diferite, habitat, aciunii enzimelor autolitice i hidrolitice ale enzimelor microbiene de la nivelul esutului muscular. n ceea ce privete petele de acvacultur sunt necesare operaii precise de control al calitii apei (pH, BOD, salinitate) i utilizarea unor nutrieni adecvai. Produsele piscicole sunt cunoscute ca fiind foarte perisabile, cu un grad mare de risc n ceea ce privete sntatea consumatorilor datorit unor microorganisme ca Salmonella sp. sau Vibrio sp., unor toxine naturale, a metalelor grele, etc. Uniunea European a impus reglementri severe referitoare la calitatea produselor piscicole comercializate de rile exportatoare. Imediat dup capturarea petelui, au loc o serie de modificri biochimice postmortem iniiate n esutul muscular, modificri ce sunt la inceput de natur autolitic, iar apoi sunt determinate de microorganismele contaminante. Imediat dup instalarea morii petelui, inceteaz biosinteza de adenozin trifos fat (ATP), iar ATP-ul existent este degradat de enzimele musculare conform urmtoarei serii de reacii: ATP ADP AMP IMP HxR Hx X U unde ADP = adenozin difosfat, AMP = adenozin monofosfat, IMP = inozin -5'monofosfat, HxR = inozin, Hx = hipoxantin, X = xantin, U = acid uric. Primele etape, pn la formarea de HxR, se desfoar rapid sub aciunea enzimelor endogene. Ultimele dou etape sunt mai lente i se datoreaz microorganismelor responsabile de alterarea petelui. Aceste enzime microbiene sunt: HxR + Pi Hx + X+
( ( )

HX + ribozopirofosfat

S-a dernonstrat c exist o legtur strns Intre catabolismul nucleotidelor i pierderea prospeimii. Astfel au for propui diveri indicatori pentru evaluarea prospeimii, cum ar fi valoarea = raportul hipoxantin / adenin. Un alt indicator al prospeimii este trimetilamina (TMA) care se formeaz n urma aciunii trimetilaminooxidoreductazei asupra oxidului de trimetilarnin. n cazul codului refrigerat, limitele acceptabile pentru Hx i TMA sunt de 50 mg i respectiv 15 mg la 100 g carne. Metodele clasice de determinare a Hx se realizeaz cu ajutorul unor tehnici laborioase de pregatire a probelor i a metodelor HPLC. Primii biosenzori pentru evaluarea calitii petelui au fost dezvoltai Inc din anii 80. Acetia s-au bazat pe XO imobilizat covalent pe o membran de acetat de celuloz aplicat pe un electrod de oxigen. XO oxideaz Hx cu generare de ap oxigenat i consum de oxigen ce
6

este monitorizat de electrod. A fost obinut un domeniu linear de concentraii de 0,06 1,5 mM hipoxantin, senzorul putnd fi utilizat pentru mai mult de 100 de determinri. O limit de detecie de 10 ori mai sczut a fost atins cu XO imobilizat pe membran de triacetat de celuloz montat la suprafaa unui electrod de past de carbon modificat cu hidroximetilferocen ca mediator pentru transferul de electroni. Pentru determinarea hipoxantinei, inozinei i inozin monofosfatului din pete s-au realizat electrozi enzimatici bazai pe ncorporarea alturi de ferocen a enzimelor xantin oxidaza, nucleozid fosforilaza i respectiv, nucleozidaza ntr-o membran conductoare de polipirol. Un alt mediator de elect-roni ce poate fi utilizat este violetul de metil nglobat n past de carbon, iar XO poate fi imobilizat ntr-un film de polianilin electrodepus pe suprafaa electrodului. n acest caz, deterrninarea Hx se bazeaz pe monitorizarea consumului de oxigen, practic rspunsul senzorului fiind dat de reducerea electrocatalitic a oxigenului. Domeniul de concentraii acoperit de acest senzor este 1 M 0,4 mM Hx, iar speciile coexistente n carnea de pete nu interfer. Recent a fost raportat un biosenzor pentru Hx i X realizat din microparticule de carbon sticlos modificate cu nanoparticule de Au i XO. Au fost obinute grafice de calibrare hneare pentrui domeniile de concentraii 0,5 M-0,0 1 mM xantin i 5 tM 0,15 mM hipoxantin. Biosenzorul a fost aplicat cu rezultate foarte bune pentru determinarea Hx din carnea de ton.

Biosenzori enzimatici pentru determinarea contaminanilor alimentari Biosenzorii enzimatici prezint caracteristiciIe necesare pentru screening-ul i determinarea cantitativ a multor compui care se incadreaz n categoria contaminantilor alimentari. Dintre acetia, n cele ce urmeaz, vor fi prezentai biosenzorii electrochimici enzimatici pentru determinarea metalelor grele, pesticidelor i azotiilor / azotailor. A)Biosenzori enzimatici pentru determinarea metalelor grele Principiul care st la baza constructiei biosenzoriIor pentru determinarea metalelor grele este cel al inhibitiei enzimatice. Fenomenul inhibiiei enzimatice este adesea complex, aceasta putnd fi reversibil sau ireversibil. Inhibitorii reversibili sunt n general compui cu structur similar substratului care se pot lega la centrul activ al enzimei competitionnd cu substratul (inhibiie competitiv). Dac inhibitorul nu se leag de enzim, ci de complexul enzim substrat, inhibitia este de tip necompetitiv. Inhibitorii ireversibili formeaz cu enzima legturi covalente la niveIul centrului catalitic activ al acesteia. Termenul ireversibil semnific distrugerea enzimei, prin hidroliz, oxidare, etc. Tipul de inhibitie depinde mult de cinetica acestui proces. De exemplu, s-a demonstrat c "n cazul inhibitiei peroxidazei, n primele 5 secunde ale incubrii inhibitorului cu enzima procesul este reversibil, dup care devine ireversibil. Gradul de inhibitie depinde de concentratia inhibitorului i de timpul de incubare. n cazul biosenzorilor pentru care fenomenele de difuzie sunt importante s-a constatat c, dup expunerea biosenzorului la inhibitor, inhibitia procentual este direct proportional cu concentratia inhibitorului i cu rdacina ptrat a timpului de incubare. Ionii metalelor grele au capacitatea de a inhiba n mod specific o varietate mare de enzime. Mercurul este unul dintre metalele grele cele mai determinate cu ajutorul biosenzorilor enzimatici. Au fost realizati biosenzori pentru determinarea mercurului i metilmercurului (fointa organic a mercurului) pe baza inhibitiei unor enzime ca: peroxidaza, ureaza, glucozoxidaza, alcool oxidaza, glicerol-3-fosfat oxidaza, invertaza, etc. Cadmiul inhib ureaza i butirilcolinesteraza, iar cuprul acetilcolinesteraza.

B)Biosenzori enzimatici pentru determinarea pesticidelor Pesticidele sunt utilizate pe scar larg in agricultur pentru creterea productivittii prin reducerea efectului negativ a1 insectelor i microorganismelor, precum i prin inhibarea creterii buruienilor. n ultima decad, n ntreaga lume s-au folosit aproximativ 1 milion de tone de pesticide / an. Acestea sunt mprite n aproximativ 26 % insecticide, 31 % fungicide i 43 % ierbicide. Majoritatea insecticidelor sunt inhibitori de acetilcolinesteraz (AChE), 55 % aparinnd organofasfailor i 11 % carbamailor. Datorit solubilitii relativ sczute n ap, pesticidele nu pot fi eliminate n totalitate de pe produsele agroalimentare printr-o simpl splare. Ca urmare pot fi ingerate de ctre consumatori ducnd 1a intoxicri acute sau cronice. Pentru a limita utilizarea pesticidelor n sectorul agricol, la nivelul diverselor organizaii internaionale i naionale au fost stabilite diverse reglementri. O preocupare deosebit o constituie expunerea copii1or la pesticide, acestea fiind neurotoxine putemice, datorit sensibilitii lor mai mari la efectele toxice ale acestor compui. n acest sens, Uniunea European a stabilit limite foarte joase pentru pesticidele din alimentele pentru copii (<101,1g/kg). Din aceste motive, a crescut foarte mult interesul pentru metodele rapide, sensibile i acceptabile ca pre pentru determinarea pesticidelor (avnd in vedere numrul mare de analize ce trebuie efectuate). Metodele tradiionale se bazeaz pe cromatografia de gaze i de lichide cuplate cu detectorii spectrometrici de mas. Aceste metode ofer informaii complexe privind tipul pesticidelor din probele analizate, dar sunt mari consumatoare de timp, necesit aparatur sofisticat i personal cu o calificare nalt. De asemenea, aceste metode pot genera rezultate fals negative datorit numrului mare de pesticide ce nu poate fi totdeauna acoperit de metoda aplicat. Biosenzorii bazai pe exploatarea efectului inhi bitor al pesticidelor asupra colinesterazelor reprezint o altemativ foarte atractiv n controlul calitii alimentelor. Acetia pot fi utilizai pentru determinarea rapid a organofosfailor i carbamailor ca un indice total exprimat in grad de inhibiie al AChE. AChE i BuChE (butilcolinesteraza) catalizeaz reacia de hidroliz a acetilcolinei ACh(substratul natural) i respectiv butilcolinei (BuCh), ca produi de reacie formndu-se colina i acidul acetic / acidul butilic. Pentru realizarea biosenzorilor electrochimici pentru determinarea pesticidelor, poate fi determinat fie acidul acetic / butilic, poteniometric, fie colina prin utilizarea unei a dou enzime, colin oxidaza (Ch0) care duce la fonnarea de ap oxigenat detectat amperometric. Cnd se folosete ca substrat enzimatic acetiltiocolina (ATCh) sau butiltiocolina (BuTCh), tiocolina rezultat poate fi determinat electrochimic prin utilizarea unor mediatori redox, cum ar fi cobaltftalocianina (CoPC). Marele avantaj al inhibiiei colinesterazelor de ctre pesticide este reprezentat de posibilitatea reactivrii enzimei cu piridin-2-aldoxim. Totui, biosenzorii pentru pesticide prezint i o serie de minusuri, precum: necesitatea punerii in contact a acestora cu proba pentau un anumit timp de incubare care poate varia intre 5 i 30 minute; necesitatea reactivrii enzimei dup fiecare prob; lipsa unei specificiti pentru clasa de pesticide determinat.

C)Biosenzori enzimatici pentru determinarea azotiilor si azotailor n industria alimentar azotaii i azotiii se folosesc pe scar larg ca aditivi, fiind cunoscui sub denumirea de E249 (azotit de potasiu), E250 (azotit de sodiu), E251 (azotat de sodiu) i E252 (azotat de potasiu). Acetia sunt utilizai pentru conservarea slninii, crnii, uncii, mezelurilor, pateurilor i brnzeturilor i pentru pstrarea culorii roii a crnii prelucrate. Azotiii se adaug n special pentru inhibarea creterii unor microorganisme cum ar fi Clostridium botulinum, care produc toxina botulinic. Azotaii pot fi detectai 1n concentraii relativ mari i n legume, datorit utilizrii ingramintelor pe baz de azotai. Azotaii n sine au o toxicitate redus, dar prin reducerea acestora la nivelul tractului intestinal se formeaz azotii care sunt mult mai toxici. Azotiii inhib respiraia tisular, reduc absorbia proteinelor, blocheaz transportul de oxigen prin formaxe de methemoglobin, formeaz cu aminele din carne nitrozamine. Acestea din urm sunt extrem de toxice, fi.ind dovedit caracterul lor mutagen i cancerigen puternic. La nivel european legislaia n vigoare impune anumite limite maxime pentru azotaii i azotiii din alimente. Astfel, directiva 2006/52/EC prevede o concentraie maxim admis a azotiilor de 150 mg/kg pentru came i 100 mg/kg pentru produsele sterilizate, iar pentru azotai 250 mg/kg pentru carne, 50 mg/kg pentru brnzeturi i pateuri de ficat i 200 mg/kg pentru hering. Directiva 2006/1881/EC stabilete pentru azotaii din salat, spanac, rucola o limit de 2000 4000 mg/kg, i de 200 mg/kg pentru hrana copiilor bazat pe cereale. Pentru determinarea azotiilor din produsele din carne exist diverse metode, cea mai popular fiind metoda spectrofotometric bazat pe sulfanilamid i N-1(1naftil)etilendiamina, dar o serie de studii extinse au demonstrat ca deseori se nregistreaz o regasire procentual de numai 50 % a azotiilor, datorit interferenei acidului ascorbic prezent i el ca aditiv in acest tip de probe. Au fost dezvoltate i o serie de metode cromatogratice pentru determinarea azoilor, dar aplicaiile cele mai atractive sunt cele bazate pe electrozi ion-selectivi. Datorit complexitii matricilor probelor de carne, rezultatele obinute cu aceste metode traditionale sunt puternic influentate de o multitudine de interfereni, fiind necesare adesea proceduri complicate de prelucrare a probelor. Prin utilizarea unor enzime specifice (nitrat reductaza i nitrit reductaza), extrem de selective i a unor mediatori pentru transferul de electroni de tipul Metil Violetului, biosenzorii pot constitui o alternativ atractiv pentru determinarea azotailor i azotiilor din produsele alimentare. Nitrat reductaza (NR) este NAD + / NADH dependent i catalizeaz reducerea azotatului la amoniac. Nitrit reductazele (NiR) pot fi fi izolate din diverse surse cum ar fi: Desulfovibrio desulfuricans, Alcaligenes faecalis i Paracoccus pantotrophus, prezentnd de cele mai multe ori un mecanism similar NR, de reducere a azotitului la amoniac. Pentru determinarea azotatului, Serge Cosnier a raportat dou strategii de imobilizare a nitrat reductazei (NR) in dou matrici redox, una fiind un polimer organic obinut prin electropolimerizarea pirol - violetului, iar cealalt un compozit argil polipirol. Biosenzorul bazat pe cea de a doua matrice depus pe un electrod de carbon sticlos a demonstrat un rspuns catalitic sernnificativ n prezena azotatului, fiind atins o limit de detecie de 0,5M. Pentru realizarea unui biosenzor conductometric pentru determinarea azotatului, nitrat reductaza din Aspergillus niger a fost imobilizat prin reticulare cu BSA, Nafion i Metil
10

Violet. Timpul de rspuns al acestui biosenzor a fost de 13 s, domeniul linear de 0,02-0,25 mM i limita de detecie de 5 M azotat. Recent a fost propus un biosenzor poteniometric pentru azotat bazat pe ncorporarea galvanostatic a NR i a cofactorului -NADH ntr-o membran conductoare de polipiro1. Rspunsul poteniometric optim pentru azotat a fost inregistrat la pH 7,3, limita de detecie fiind de 15 M, iar domeniul linear de rspuns de 0,1-5 mM azotat, Azotitul a putut fi determinat cu o limit de detecie de 5,4 M cu un biosenzor pe baz de citocrom c nitrit reductaz (ccNiR) din Desulfovibrio desulfaricans. Enzima a fost nglobat ntr-o membran electropolimerizat de poli(pirolviolet) la suprafaa unui electrod de carbon sticlos. Domeniul linear de rspuns a fost: 5,4 43,4M . Azotatul nu a interferat deloc, iar interferena sulfitului a fost neglijabil. Un biosenzor asemntor a fost propus prin ng1obarea nitrit reductazei (NiR) i violetului de metil (MV) intr-o membran bazat pe polivinilalcoo1 (PVA), polialilamin i poliuretan. Domeniul linear de rspuns al acestui biosenzor a fost 1,5-260 M azotit. Un nou format de biosenzor pentru determinarea azotitului a fost propus recent, pe baza efectului inhibitor al acestuia asupra catalazei. Biosenzorul a fost realizat prin nglobarea separat a peroxidazei ntr-un strat intern i catalazei ntr-un strat extern de argil anionic, n prezena H2O2, azotitul adugat va bloca consumul de H2O2 de ctre catalaz, determinnd o cretere a rspunsului amperometric datorat reducerii H2O2 de ctre peroxidaza din stratul intern. Limita de detecie a acestui biosenzor a fost de 4M.

11

Bibliografie Progrese n realizarea senzorilor si biosenzorilor pentru controlul calit ii alimentelor Mihaela Badea, Mihaela-Carmen Cheregi, Cecilia Lete, Stelian Lupu

12