Sunteți pe pagina 1din 37

CAP.

III
BIOSENZORI
Biosenzorii reprezint sisteme biologico - electronice selective integrate ,
formate dintr-un receptor biologic activ, un traductor i un sistem electronic de
amplificare, prelucrare i afiare date. Receptorul biologic activ furnizeaz informaii
analitice specifice ce permit recunoaterea unei anumite specii biologice sau chimice
dintr-un amestec complex ce compune materia analizat, urmat de determinarea
cantitativ sau semicantitativ a acesteia. Receptorul biologic activ al biosenzorului
poate fi format din enzime, anticorpi , microorganisme, lektine, aptameri ,DNA i
tesuturi umane sau animale imobilizat pe un suport.

Fig.III.1. Schema de principiu a unui biosenzor

n urma interferenei dintre receptorul biologic activ i substana de analizat rezult


modificri ale soechiometriei reactanilor i produselor de reacie care provoac la
rndul lor, n funcie de sistemele biologice active folosite, evoluia proporional ale
valorilor unor mrimi fizico- chimice precum : sarcin electric, absorbie/ emisie
fotonic, temperatur, indice de refracie, grosime de strat, valori care snt convertite
cu traductoare de tip: amperometric, pH-metric, detector fotometric, termic,
refractometric, piezooscilator , rezonator plasmonic n semnale electrice proportionale
cu concentraia speciei urmrite n materia analizat. In figura III.2 este reprezentat
schematic aceast fenomenologie

81

Fig.III.2. Schema conversiei concentraiei , masei sau grosimii de strat a unei specii chimice sau
biologice ntr-o mrime electric proporional prin intermediul unei structuri biologic
active i a unui traductor adecvat

Sistemele de tip biosenzorii snt realizri relativ recente, cu tendin de cretere rapid,
ce permit determinri analitice cantitative rapide, ieftine i in situ, suficient de precise,
a cror selectivitate sensibilitate i limit de detecie depind de receptorul biologic
folosit ultimelele caracteristici avnd valori deosebit de ridicate . Biosenzorii nu folosesc
la determinri reactivi liberi, genereaz cantiti infime de deeuri chimico- biologice
care snt uor colectate i distruse. Un biosenzor este reutilizabil i ca atare poate fi
folosit pentru un numr mare de analiize. De regul recetorii biologici activi snt de
unic utilizare dar exist i situaii n care din motive de cost snt pstrate suporturile
i regenerate componentele active. Aplicaiile de baz pentru biosenzori snt n domeniul
medicinei, a problematicii de mediu, a industriei farmaceutice, a industriei alimentare
i a biotehnologiei.
Determinrile experimentale cu biosenzori snt simple i nu
necesit cunostiine de specialitate avansate ci numai parcurgerea a mai multor etape ,
dup cum urmeaz :
1 - pornirea aparatului
2 - ataarea receptorului biologic la sistemul electronic, urmat de recunoaterea
automat a acestuia de ctre sistemul electronic precum i de validarea (invalidarea)
acestuia
3 - dozarea unui anumit volum sau cantiti din analit pe sistemul biologic activ
4 - transformri chimico- biologice ntre materia analizat i sistemul biologic activ cu
generarea de produi de reacie specifici .
5 - transformarea, pe baza unor dependene fizico chimice specifice a
cantitii
produselor de reacie rezultate pe receptorul biologic activ , ntr- un semnal electric
proporional cu concentraia specieiei urmrite .
6 - procesarea datelor i afiarea electronic a rezultatului msurtorii

82

7 -ndeprtarea i colectarea receptoarelor biologic active folosite la determinare n


scopul dezafectrii chimico biologic ulterioare a acestora i pregtirii sistemului
pentru o nou msurare.
Pentru aducerea componentelor biologice active n apropierea nemijlocit
a
traductorului, a asigurrii unor productiviti mari la determinri precum i pentru
asigurarea unor condiii optime de reacie i de conservare n timp a acestora , snt
folosite suporturi solide i diferite metode de imobilizare a componentelor biologic
active pe acestea precum: adsorbie, absorbie, gelificare, lipire, legare n reea, realizarea
de legturi covalente. Metoda de imobilizare trebuie s asigure o legare bun a
componentelor biologice active de suportul solid astfel nct acesta s nu difuzexe n
materia de analizat dar s rmn totodat suficient de activ la reacia cu materia
analizat. Receptorii biosenzorilor cu componentele biologice active imobilizate pe
suprafa acestora se pstreaz n cutii nchise i au termene de valabilitate,
inscripionate pe cutie, ce trebuiesc respectate. In domeniul biosenzorilor snt ncadrai
oarecum greit i ali senzori ce nu au material biologic activ dar snt folosii n schimb
pentru deterinarea selectiv a concentraiei unui component n cadrul unor procese
biologice. In tabelul 1 sint prezentae cteva specii chimice i biologice importante ce
pot fi determinate pe cale biosenzorial,
Tab.III.1. Detecie biosenzorial pentru diferite specii chimice i biologice mpreun
cu senzorul corespunztor
nr.
crt.

Specia
chimic
biologic

sau

Senzorul folosit

Glucoz

biosenor amperometric

Uree

biosenor poteniometric

Lactoza

biosenor amperometric

Sodiu

electrod de sticl ion -selectiv

Potasiu

electrod de schimb ion -selectiv

Calciu

electrod de sticl ion -selectiv ionofor

Oxigen

senzor cu stingere de fluorescen

pH

electrod de sticl ion -selectiv

Penicilin

biosenor poteniometric

10

Colesterol

biosenor amperometric

11

Hepatita B

chemoluminiscen - immunoassay

83

12

Candida Albicans

piezobalant - immunoassay

III.1. Biosenzori electrochimici


Snt deosebit de performani, au aplicaii largi i se bazeaz pe detecie
electrochimic de tip amperometric sau de tip poteniometric.
Detecia amperometric este potrivit pentru detecia unor produse de reacie sau
de metabolism care se oxideaz respectiv se reduc uor . La metoda amperometric este
msurat curentul electric a unei celule miniaturale de electroliz (aceasta formeaz
sistemul biosenzorial) , alimentat la o tensiune electric constant. Conform legii lui
Faraday masa m a unei specii chimice descrcat la un electrod al celulei electrochimice
ntr-un timp t este proporional cu curentul de electroliz I i cu constanta
electrochimic k :
m k I t

(III.1)

Una din aplicaiile cele mai cunoscute ale deteciei amperometrice la biosenzori o
reprezint biosenzorul de glucoz,
fiind folosit la ora actual n medicin pentru
determinarea in situ a glucozei din snge la diabetici i la sportivi . Senzorul de glucoz
are ca material biologic activ enzima oxidoreductaz folosit pentru biocataliza
reaciei de oxidare a glucozei cu oxigenul din aer cu obinerea de gluconolacton i
de peroxid de hidrogen (H2O2) . Receptorul biologic activ pentru analiza rapid a
sngelui se prezint sub forma unor fii de plastic de unic utilizare ce dispun la un
capt de doi electrozi lamelari miniaturali ntre care se gsete depus oxidoreductaz
sub form de gel uscat iar la cellalt capt fia dispune de pini electrici de conexiune
cu sistemul electronic. La depunerea unei picturi de snge pe zona acoperit de
oxidoreductaz are loc reacia :

(III.2)
Peroxidul de hidrogen este deosebit de reactiv i se descompune electrozii celulei
electrochimice n compunerea creia mai intr i o surs de tensiune constant asigurat
de partea electronic i un circuit de amplificare i msurare a intensitii curetului
electric ce curge prin celula de electroliz, intensitate proporional cu cantitatea de
peroxid de hidrogen descompus i implicit cu cantitatea de glucoz din sngele
analizat. Conversia valorii intensitii curentului electric din celul cu valorile de
concentraie de glucoz din snge, precum i afiarea automat a rezultatelor este
realizat de partea electronic a aparatului. Determinarea este semicantitativ i
acoper un domeniu de la 20500 mg/dl, se consider c la concentraii <60 mg/dl
indicaia este marcat de erori destul de ridicate, motiv pentru care nu este indicat
determinarea glucozei prin aceast metod n domeniul acestor concentraii. La om se
84

consiter un metabolism glucozidic normal la valori cuprinse ntre 85 i 110 mg/dl , un


metabolism modificat la valori cuprinse ntre i un metabolism diabetic la valori de
peste 126 mg/dl. Pe lng determinarea glucozei din snge asemenea sisteme
biosenzoriale snt folosite pentru
determinarea concentraiei fenolilor, polifenolilor
flavonoizilor, precum i pentru dezvoltarea de substane cu aciune antioxidan. Mai jos
snt prezentate
exemple de biosenzori uzuali ce folosesc drept catalizator diferite
enzime , rezultatul fiind obinerea de ap oxigenat, ce se gaseste
n raport
stoechiometric cu specia analizat, fiind determinat pe cale amperometric i
convertit de partea electronic n uniti de concentraie a speciei analizate
1. D Glucoza O2

Glucozoxidaza

2.

Colesterol O2

Colesterol oxidaza

3.

Glutamate O2

D Glutamatoxidaza

Gluconolactona H 2 O2

Colestenona H 2 O2

Oxiglutarat NH 3 H 2 O2

aza
Piruvat H 2 O2
4. Lactate O2 Lactatoxid
daza
Acetilfosfat CO2 H 2 O2
5. Piruvat HPO4 Piruvatoxi

(III.3)
(III.4)
(III.5)
(III.6)
(III.7)

Detecia poteniometric este folosit la produse ionice . Determinarea cantitativ


a ionilor se face pe baza potenialului electric determinat la un electrod de msur. Spre
deosebire de senzorii pe baz de detecie amperometric cu sezorii poteniometrici
pot fi detectai produse enzimatice active ca element senzorial fiind folosit un electrod de
pH sau un electrod ion selectiv . n ultimul timp asemenea aplicaii au dus la
miniaturizri extreme prin combinarea elementelor constructive ale tranzistoarelor ion
selectivi
cu efect de cmp (ISFET) sau a tranzistoarelor de tip
electrolit/izolator/semiconductor (EIS) cu structuri enzimatice fiind posibil combinarea
mai multor biosenzori n matrici miniaturale cu posibilitatea urmririi paralele i
concomitente a mai multor parametrii. Un alt mare avantaj al biosenzorilor oteniometrici
l reprezint i faptul c la electrozi nu iau natere produi de reacie. De regul snt
folosite enzime care hidrolizeaz substratul produsele de hidroliz fiind pH- active .
Pe aceast baz se determin urme de penicilin , sulfoxizi de cistein , glucozide
cianogene .a.

III.1.1. Exemple constructive de biosenzori electrochimici


III.1.1.1. Biosenzor enzimatic amperometric i conductometric

85

Biosenzorul enzimatic descris n continuare folosete drept catalizator enzime


de tip oxidaz i este destinat determinrii rapide i in situ a concentraiei unor specii
chimice sau biologice.
In vederea determinrii rapide i in situ a concentraiei sau a masei unor specii
chimice sau biologice snt folosii la ora actual biosenzori care reprezint sisteme
biologico - electronice selective integrate , formate dintr-un receptor biologic activ,
un traductor i un sistem electronic de amplificare, prelucrare i afiare date. Receptorul
biologic activ d informaii analitice specifice ce permit recunoaterea i determinarea
cantitativ sau semicantitativ a unei anumite specii biologice sau chimice dintr-un
amestec complex ce compune materia analizat, componenta biologic activ a
receptorului putnd fi format dintr-o enzim, un anticorp, ADN, sau chiar din celule
ntregi. In domeniul enzimatic reprezentativi snt biosenzorii care folosesc drept
componenta biologic activ enzime de tip oxidaze care catalizeaz reacia specific
de transformare a speciei urmrite n produs de reacie de tipul celor descrise de relaiile
III.5-III.7. La toate aceste reacii rezult pe lng produsul de reacie specific i ap
oxigenat
care se determin cantitativ pe cale amperometric, cantitatea de ap
oxigenat generat n reacie i consumat n electroliz fiind stoechiometric
proporional cu concentraia speciei analizate, deci o msura a acesteia. Cel mai
reprezentativ biosenzor enzimatic este cel de glucoz folosit la scar larg pentru
determinarea glucozei din snge la diabetici i la sportivi n acest scop fiind necesar o
singur pictur de snge ce se aduce pe un suport de plastic de unic utilizare pe care se
gsesc doi electrozi si o depunere uscata a unui gel ce conine o cantitate de
glucozoxidaz dozat n aa fel nct s poat cataliza glucoza din pictura de snge n
cteva secunde n gluconolacton i ap oxigenat. Aplicarea unei tensiuni continue
constante din partea electronic celor doi electrozi face ca prin intermediul curentului de
electroliz i a legii lui Faraday s se determine cantitatea de ap oxigenat generat i
care la rndul ei este o msur a masei, i prin aceasta a concentraiei, glucozei din
pictura de snge transformat integral n glucozoxidaz.
La ora actual exist cereri mari de biosenzori industriali i medicali att pentru
glucoz , ct i pentru alte specii de tipul celor artate n reaciile de mai sus . Din pcate
profitul nregistrat cu folosirea chitului biologic de unic utilizare este atit de mare nct
productorii de biosenzori s-au orientat cu toii spre aceast form de aplicaie. Profitul
nregistrat cu producia i distribuia acestor chituri este ns att de mare nct la
cumprarea unui numr de la o sut de uniti n sus partea de electronic este oferit
drept cadou. Constatnd c partea electronic este de lung utilizare i c vnzrile scad ,
productorii acestui segment fac presiuni asupra productorilor de chituri biologice
determinndu-i s nu accepte uniti electronice universale i s schimbe la cicluri tot
mai mici de timp tipul de cipuri specifici produi, fiecare nou tip de cip necesitnd alt
parte electronic .
Problema tehnic pe care o rezolv biosenzorul descris const n realizarea unui
biosenzor enzimatic ce folosete drept catalizator enzime de tip oxidaz sub form
lichid senzorul fiind destinat determinrii rapide i in situ a concentraiei unor
specii chimice sau biologice fr folosirea unor chituri biologice de unic utilizare. Prin
folosirea acestui biosenyor se obin urmtoarele avantaje:
- se obine un biosenzor universal i fiabil utilizabil pe termen lung la toate
tipurile de reacii catalizate prin enzime de tip oxidaze

86

se elimin chiturile de unic utilizare i prin aceasta scade mult preul de cost
al analizelor
- prin folosirea att a metodei amperometrice ct i a celei conductometrice , n
cadrul aceleiai determinri, crete precizia msurtorilor
Se prezint n continuare un exemplu de realizare a biosenzorului n legtur cu figura
III.3. care reprezint o vedere n seciune a biosenzorului, figura III.4. care reprezint o
vedere din fa i lateral a biosenzorului i figura III.5. care reprezint schema de
principiu a msurrii amprometrice i conductometrice cu biozenzorul enzimatic.

Fig.III.3. Vedere n seciune a biosenzorului enzimatic . 1-corp, 2-unitate electronic de


achizitie , prelucrare i afiare date, 3-unitate electronic amperometric, 4-unitate electronic
conductometric, 5-tastatur , 6-capsul din plastic, o-soluie de oxidaz, 7-urub, 8-reper, pperforator, f-foliei termosudat, c-con, 9 - piulit, 10- furtun siliconic, 11- cilindru spijinit
excentric, l -locas conic, 12- clichet, 13- tij, 14,15-electrozi din platin, 16-con, 17-cup,
18,19-contacte electrice, e-loca, 20-clichet cu bil , 21-pipet sau dozator electronic manual.

87

Biosenzorul enzimatic conform figurii III.3., figurii III.4. i figurii III.5. este
format dintr-un corp 1 n care se gsete o unitate 2 electronic de achizitie ,
prelucrare i afiare date, o unitate 3 electronic amperometric pentru msurarea
curentului de electroliz, o unitate 4 electronic conductometric pentru msurarea
conductivitii electrolitului, o tastatur 5 pentru programarea diferitelor aplicaii cu
enzime diferite, un sistem de dozare peristaltic pentru soluia ce conine o enzim de
tip oxidaz compus la rndul lui dintr-o capsul 6 din plastic ce conine o soluie o de
oxidaz, un urub 7 , radalinat la partea superioar i cav la partea inferioar, un reper 8
prevzut la partea superioar cu un perforator p pentru tierea foliei f termosudate de
nchidere a capsulei 6 din plastic iar la partea inferioar cu un con c i o piulit 9 pentru
strngerea i etanarea unui furtun 10 siliconic subire prin care curge oxidaza, un
cilindru 11 spijinit excentric i cu rotaie excentric, acionat manual, prevzut cu un
locas l conic pentru plasarea cilindrului 11 spijinit excentric pe poziia obturat a
furtunului 10 , un clichet 12 cu un arc de compresie i o bil n corpul 1 se mai gsete
cuplat prin apsare o tij 13 prevzut la partea inferioar cu doi electrozi 14,15
semicirculari din platin pentru msurare amperometric i conductometric , un con 16
perforat pentru fixarea i strngerea furtunului 10, o cup 17 detaabil prin desfiletare
ce constituie camera de reacie i la

88

\
Fig.III.4. vedere din fa i lateral a biosenzorului enzimatic 1-corp, 2-unitate
electronic de achizitie , prelucrare i afiare date, 3-unitate electronic amperometric, 4-unitate
electronic conductometric, 5-tastatur , 6-capsul din plastic, o-soluie de oxidaz, 7-urub, 8reper, p-perforator, f-foliei termosudat, c-con, 9 - piulit, 10-furtun siliconic, 11- cilindru
spijinit excentric, l -locas conic, , 13- tij, 14,15-electrozi din platin, 16-con, 17-cup, 21pipet sau dozator electronic manual.

partea superioar cu dou contacte 18, 19 i un loca e de fixare elastic a tijei 13 prin
intermediul unui clichet 20 cu bil i arc de compresie , reperul 21 este extern
biosenzorului , poate fi o pipeta sau un dozator electronic manual, i folosete pentru
dozarea precis a unui anumit volum prescris din soluia de analizat n cupa 17 ce
constituie camera de reacie a biosenzorului.
Modul de lucru cu biosenzorul este urmtorul : se desfileteaz la maxim urubul
7 randalinat i cav dup care se ntoarce aparatul cu 1800 fa de poziia normal de
lucru, se aeaz capsula cu oxidaza n cavitatea urubului 7 dup care acesta se strnge cu
mna pn cnd este opus o rezisten mecanic sensibil ceea ce nseamn c folia
termosudat a capsulei 6 a fost perforat de cuitul p al reperului 8 iar gtul capsulei 6
89

a realizat etanarea cu reperul 8 dup care se ntoarce din nou biosenzorul n poziia de
lucru i se desfileteaz cupa 17 detaabil de pe tija 13, se execut cteva rotaii
complete spre dreapta a cilindrului 11 spijinit excentric pn cnd pe conul 16 perforat
apare o pictur de oxidaz. Dup aceste operaii se nfileteaz la loc cupa 17 se mai
execut o rotaie complet a cilindrului excentric n vederea dozrii , prin sistemul
peristaltic, a volumului necesar de oxidaz n cupa 17 cu

Fig.III.5. Schema de principiu a msurrii amprometrice i conductometrice cu biozenzorul


enzimatic. 2-unitate electronic de achizitie , prelucrare i afiare date, 3-unitate electronic
amperometric, 4-unitate electronic conductometric, 10-furtun siliconic14,15-electrozi din
platin, 17-cup, 21-pipet sau dozator electronic manual.

oprirea cilindrului 11 spijinit excentric pe poziia de opturare complet a futunului


siliconic, pozitie sesizat prin sgeata indicatoare de pe butonul de rotire dar i prin clicului bilei clichetului 12. Urmeaz dozarea n cupa 17 a volumului prescris pentru
specia de analizat cu virful unei pipete 21
de dozare sau a unui dozator electronic
manual dup care aparatul se ine n poziie vertical i se urmrete afiajul digital.
Declanarea reaciei catalizate duce la apariia pimelor cantiti de ap oxigenat, un
prag minim al concentraiei acesteia provoac iniierea msurtorilor amperometrice i
conductometrice, acestea desfurndu-se n mod alternativ prin comutare electronic
automat. Dup 20 secunde este afiat valoarea concentraiei rezultat din media a zeci
de msurtori amperometrice i conductometrice prelucrate statistic de microprocesorul
biosenzorului. Volumul unei capsule de oxidaz ajunge pentru sute de determinri, ntre
dou determinri cu aceeai oxidaz nu este necesar dect splarea sub jet de ap a a
cupei 17 . La schimbarea oxidazei se spal tot traseul folosind n acest scop o capsul
cu ap bidistilat care se fixeaz, precum s-a descris deja, pe corpul 1 al biosenzorului

90

i se execut mai multe rotaii complete a cilindrului 11 sprijinit excentric n vederea


pomprii apei prin circuit. In unele situaii este necesar nlocuirea furtunului 10
siliconic , aceste situaii apar la aplicaii specifice unde volumul de oxidaze dozat este
diferit fa de aplicaia precedent,
acest lucru reclam inlocuirea furtunului siliconic
cu un altul cu diametrul interior mai mare , respectiv mai mic, precum i la uzarea
furtunului 10 siliconic n zona de compresiune - ntindere ca urmare a unor pompri
repetate i numeroase de ctre cilindrul 11 sprijinit excentric. La nlocuirea furunului se
desface piulia de pe partea opus butonului de acionare a cilindrului 11 dup care acesta
se extrage din corpul 1 al biosenzorului urmeaz ntoarcerea aparatului cu 1800 fa de
poziia normal de lucru se desfiletarea urubului 7 , extragerea capsulei 6 i a
reperului 8 din locaul lui , desfiletarea complet a piulitei 9 , extragerea furtunului
siliconic de pe reperul 8, urmat de exragerea tijei 13 din corpul 1 , extragerea conului
16 din tija 13 , scoaterea furtunului 10 de pe conul 16 la montarea noului furtun
siliconic operaiile se repet n sens invers celor de la demontarea furtunului 10
siliconic.

III.1.2. Biosenzori optici


Senzorii optici snt folosii n principal pentru determinarea coninutului de
oxigen din lichide pe baza analizei de fluorescen . Structura acestora, figura conine o
surs de radiaie monocromatic , un sistem de transmisie cu fibr optic la captul
creia este depus un indicator a crui intensitate a luminiscenei este dependent de
mrimi chimice cum este spre exemplu i concentraia de oxigen n lichide. Intensitatea
radiaiei de de fluorescen este preluat de alt fibr optic i condus spre un detector
fotometric care o convertete ntr-un fotocurent proportional care n partea electronic
este transformat i afiat electronic n uniti de concentraie.

III.1.2.1. Fluorescen, fosforescen, chemoluminiscen


Fluorescena, fosforescena i chemoluminiscena snt fenomene optice de emisie
fotonic, cunoscute sub denumirea de luminiscen , pentru producerea lor fiind
necesar excitarea moleculelor care,
prin spectre de emisie molecular specifice,
permit analize chimice calitative i cantitative ale substanelor crora le snt specifice
aceste fenomene. Fluorescena i fosforescena se aseamn prin faptul c iau natere
prin absorie de fotoni , motiv pentru care poart i denumirea de fotoluminiscen .
Deosebirea ntre fluorescen i fosforescen const n faptul c fluorescena nceteaz
instantaneu dac nceteaz excitaia, iar fosforescena dureaz un timp dup ncetarea
excitaiei fotonice. De regul lungimea radiaiei de fluorescen este mai mare dect
lungimea de und a radiaiei de excitare ( deplasare Stokes). Atunci cnd lungimea de
und a radiaiei de fluorescen este egal cu lungimea de und a radiaiei de excitare se
vorbete de fluorescen de rezonan. Chemoluminiscena se bazeaz pe spectrul de
91

emisie a unei specii excitate ce ia natere n timpul unei reacii chimice. Avantajele
determinrii concentraiei speciilor pe baza msurii fotoluminiscenei sau a
chemoluminiscenei permite determinarea multor specii anorganice i organice cu
sensibiliti cu pn la trei ordine de mrimi mai ridicate ca cele obinute n cadrul
spectrometriei de absorbie , limitele de detecie situndu-se n domeniul ppb (10-9). Un
alt avantaj al metodelor i procedeelor bazate pe fotoluminiscen o prezint domeniul
liniar mai mare dect domeniul liniar al metodeor bazate pe spectrometrie de absorbie.
Dezavantajul principal al folosirii metodelor fotoluminiscente
l reprezint numrul
relativ redus de substane ce prezint aceste proprieti optice dependente de
concentraie . Att
fenomenul de fluorescen de
fosforescen ct i de
chemoluminiscen stau labaza a numeroase tipuri de biosenzori.

III.1.2.1.1. Analiza chimic pe baz de fluorescen


La absorbia unui foton , simbolozat prin expresia h abs , o substan F ce prezint
proprietatea de fluorescen trece n stare excitat F*:
F+ h abs

k
a

F*

(III.8)

Unde ka - reprezint constanta de vitez


Din starea excitat substana cu proprieti de fluorescen (fluorofor) poate reveni la
starea fundamental cednd energia primit prin diferite ci:
a. - F* k f F + h emisie
b. - F* + Q k q F +Q
c. - F* k c F +cldur

(III.9)
(III.10)
(III.11)

La situaia (a) substana fluorescent revine la starea fundamental prin emisia unui
foton , n situaia (b) substana fluorescent revine la starea fundamental prin stingerea
fluorescenei prin preluarea fotonului de o alt substan denumit Quencher fr s
apar emisie de energie radiant, n situaia (c) substana fluorescent revine la starea
fundamental prin preluarea energiei strii excitate prin alte procese dect cele de la
punctul (a) i punctul (b).

III.1.2.1.1.1. Determinarea concentraiei prin msurarea intensitii fluorescenei


Pentru situaia revenirii substanei fluorescente la starea fundamental prin emisia de
fotoni se iradiaz mediul fluorescent cu o radiaie dee excitare i se msoar intensitatea
If a radiaiei de fluorescen care este proporional cu diferena dintre intensitatea Po a
radiaiei de excitare i intensitatea P a radiaiei ce a traversat proba respectiv cu
concentraia [F*] a fluoroforului :pe o anumit grosime b :

92

If=K*.(P0- P) = K*.[F*]

(III.12)

unde: K* - constanta depinde de randamentul de fluorescen, de grosimea stratului


traversat si de natura speciei fluorescente. La determinarea concentraiei pe baza
msurrii intensitii radiaiei de fluorescren fiind valabile restriciile de liniaritate
specifice legii Lamber Beer , se consider [Skook ,p188-210] c la o valoare a
produsului :
2,303 b [F *] 0,05
(III.13)
dependena ntre intensitatea fluorescenei If , i a concentraia [F*] a fluoroforului este
neliniar i eroarea relativ este peste 2,5% ,
III.1.2.1.1.2. Determinarea concentraiei prin stingerea de fluorescen
Stingerea de fluorescen (n englez Quenching) sau mai simplu scderea
intensitii fluorescenei, chiar pn la valoarea zero, a unei substane ce prezint
fluorescen (fluorofor)
poate fi provocat prin intermediul unei specii chimice
(Ouencher). Avnd n vedere c este vorba de o eliminare de energie radiant pot fi
considerate efecte ale Quenching-ului toate fenomenele care aduc fie fluoroforul din
starea excitat n starea fundamental fr emisie de energie fotonic fie l mpiedic s
ajung n starea excitat.
Deoarece nivelul de reducere a intensitii fluorescenei este proporional cu
concentraia Quencher-ului msurarea fotometric a intensitii fluorescenei, dup
reducerea valorii iniiale a acesteia prin Quencher, reprezint
un mijloc de
determinare a concentraiei tuturor speciilor chimice ce pot activa drept Quencheri .
Avnd n vedere i faptul c acest fenomen este reversibil , odat cu ndeprtarea
Quencher-ului fluorescena crecnd din nou la valoarea iniial, tehnica determinrii
concentraiei pe aceast cale se prezint ca o metod de analiz instrumental
promitoare stingerea de fluorescen putnd fi urmrit i cuantificat uor .
Oxidri ntense care duce la decolorarea specieiei analizate sau orice alte
excitri de mare intensitate cu acelai efect de decolorarea nu pot fi considerate ca fiind
stingeri de fluorescen pe baz de Quenching ci snt denumite fotodecolorri n cadrul
acestor fenomene fluoroforul este distrus ireversibil .
III.1.2.1.1.1.1. Stingerea dinamic de fluorescen
La stingerea dinamic de fluorescen energia fluoroforului excitat este
transferat ctre moleculele Quencherului prin ciocnire
fr emisie de radiaie
luminoas, energia transferat transformndu-se exclusiv n cldur. In anumite condiii ,
cu ecuaia Stern-Volmer, poate fi descris dependena dintre durata de via a strii
excitate a materialului fluorescent de concentraia speciei care provoac stingerea
fluorescenei acestuia. Pentru
stingerea dinamic de fluorescen
n absena

93

Quencherului este caracteristic scderea timpului de via


valabil relaia :

a strii excitate , fiind

(III.14)
.
Unde: F0 - Intensitatea de fluorescen a substanei fluorescente n absena specieie ce
provoac stingerea fluorescenei
F - Intensitatea de fluorescen a substanei fluorescente n prezena
specieie ce provoac stingerea fluorescenei
[Q] - concentraia speciei (Quencher) ce provoac stingerea fluorescenei
Kd - constanta dinamic Stern - Volmer
0 - timpul de via a strii excitate a fluoroforului n absena Quencher-ului
- timpul de via a strii excitate a fluoroforului n prezena Quencher-ului
La aceeai concentraie a Quencher-ului la stingerea dinamic de fluorescen valoarea
constantei dinamice Stern Volmer KdSV crete odat cu creterea temperaturii. O
aplicaie de baz pentru msurarea concentraiei pe baza stingerii de fluorescen o
reprezint determinarea oxigenului liber din lichide n special din ap. La aceast
aplicaie reprezentat simbolic n figura substana de fluorescen este depus pe un
ansablu de dou fibre optice sub forma unui gel sau polimer aderent insolubil . Prin una
din cele dou fibre se realizeaz excitarea iar prin cealalt se msoar timpul de
stingere al fluorescenei, timp care este n legtur cu

a)

b)

Fig. III.6. reprezentarea simbolic a unui senzor pentru determinarea concentraiei unei
substane de analizat absorbante de fotoni (Quencher) pe baza fenomenului de stingere a
fluorescenei . a- radiaia de fluorescen inaintea prezenei substanei de analizat , b- radiaia
de fluorescen dup prezena substanei de analizat.

94

concentraia oxigenului liber (Quencher) prin relaia Stern - Volmer (III.15.) . n acest
scop se folosete ca surs de excitaie o diod laser pulsatorie cu lungimea de und a
radiaiei cuprins de obicei n domeniul luminii albastre , fluorescena avnd loc la valori
ale lungimi de und mai mari, respectiv n domeniul luminii

Fig. III.7. dependena dintre concentraie i intensitatea fuorescenei la un senzor bazat pe


principiul determinrii concentraiei prin msurarea timpului de stingere a fluorescenei

roii unde poate fi msurat uor cu fotodiode sau detectoare de tip Diode- Array,
determinndu-se fie timpul de stingere fie modificarea de faz dintre radiaia de excitare
i radiaia de fluorescen ( din modificarea de faz se poate determina cu precizie timpul
de stingere. In figura III.7. este prezentat evoluia concentraiei unei substane
(Quencher) n funcie de evoluia intensitii fluorescenei ( stingerea fluorescenei cu
creterea concentraiei Quencher-ului) Din
evoluia fluorescenei sub form de
hiperbol se oserv din figur c sensibiltatea acestui procedeu este mult mai bun n
domeniul concentraiilor mici ( la variaii mici de concentraii corespund variaii mari,
precis msurabile, de intensitate a fluorescenei) fiind folosit printre altele la
determinarea oxigenului liber din lichide , n special la ap unde aceste concentraii se
plaseaz la valori mici .
III.1.2.1.1.1.2. Stingerea static de fluorescen
La stingerea static de fluorescen fluoroforul i Quencherul formeaz un
complex care prezint o fluorescen mai redus sau chiar de valoare zero fa de
fluoroforul iniial. Prin formare de complexe se reduce concentraia iniial a
fluoroforului. La stingerea static de fluorescen dependena intensitii fluorescenei
unui material colorat fluorescent de concentraia unor specii (Quencher) ce prezint

95

proprietatea de stingere fluorescena proporional cu concentraia lor, este descris de


Ecuaia Stern-Volmer, care n forma clasic are expresia :

(III.15)
unde :KsSV reprezint constanta static Stern - Volmer
Adesea este preferat urmtorul mod de scriere pentru ecuaia Stern - Volmer

(III.14)
Prin reprezentarea termenului (F0 / F) 1 funcie de concentraia rezult o dependen
liniar de de tipul celei din figura III.8. unde panta de cretere este tocmai constanta
static Stern - Volmer KsSV

Fig. III.8 Reprezentare grafic a termenilor ecuaiei Stern - Volmer.

O condiie important pentru valabilitatea ecuaiei Stern-Volmer o reprezint faptul c


toate moleculele specieie de analizat s fie accesibile la fel de ctre Quencher numai
aa este valabil constanta Stern - Volmer KsSV.
III.1.2.1.1.1.2. Stingere prin transfer de energie la rezonan
La stingerea prin transfer de energie la rezonan energia strii excitate a
fluoroforului este transferat, prin efect de rezonan, fr radiaie luminoas de
la donor la acceptor reducndu-se proporional fluorescena fluoroforului .
Stingerea prin transfer de energie la rezonan poate fi descris prin transferul
Frster care arat c energia unui fluorofor colorat poate fi transferat , n limita de
lungime de und 1,5 nm-10 nm, fr radiaie fotonic de la un donor la un accceptor .
Dac att donorul ct i acceptorul snt substane fluorescente
se vorbeste de

96

transfer de energie fluorescen la rezonan (FRET) , dac n schimb donorul este o


celul de bioluminiscen i acceptorul o substan fluorescent se vorbete de transfer
de energie bioluminiscent la rezonan (BRET). Dat fiind faptul c transferul de
energie fluorescen la rezonan (FRET) depinde printre altele i de distana dintre donor
i acceptor acest tip de stingere este folosit In biologia molecular (de exemplu n
real time PCR) ca unitate optic n domeniul nanometric.

III.1.2.1.2. Exempe constructiuve de senzori optici de fluorescen


III.1.2.1.2.1. Biosenzor de luminiscen
Senzorul de bioluminiscen este destinat convertirii valorii luminiscenei unei
specii biologice din proba analizat ntr-o tensiune electric proportional cu aceast
valoare n scopul determinri, identificrii i dozrii rapide a acestei specii .
Chemoluminiscena alturi de fluorescen i de fosforescen st la baza unor
metode
fotometrice moderne de analiz instrumental. Anumite specii biologice
prezint proprietatea de emisie fotonic pe lungimi de und specifice n domeniul vizibil
atunci cnd particip la reacii chimice. Lungimea de und a radiaiei emise este
specific naturii speciei participante la reacie i st la baza analizei calitative, iar
intensitatea emisiei de bioluminiscen (BL) st la baza analizei cantitative.
Intensitatea radiaiei (BL) a unei speciei biologice este proporional cu concentraia (c) a
acesteia :
CB = K. c

(15)

Valoarea factorului de proporionalitate (K) depinde de natura speciei i


reprezint totodat sensibilitatea metodei pentru acea specie.
Exemple de bioluminiscene cunoscute snt:
- bioluminiscena folosit la identificarea petelor de snge n
H 2 O2 OH

Microperox idaz

Aminoftalat N 2 3H 2 O h

criminalistic
(III.16)

bioluminiscena licuriciului (Ponthius Pyralis)


2

E LH 2 ATP Mg E AMP PPi


E AMP O 2 oxiluciferin AMP CO 2 h (560m)

(III.17)

Aceasta reacie st la baza a numeroase chituri comerciale de luciferinluciferaz folosite in cercetarea biologic, medical i farmacologic
- bioluminiscena bacterial folosit pentru determinarea NAD (P)H cu
flavinmononucleotid (FMN)

97

NAD(P)H FMN

FMN reductaza

NAD(P) FMNH 2

FMNH 2 RCHO O2 FMN RCOOH H 2 O h (490nm)

(III.18)

Reaciile sint doar exemple reprezentative, la ora actual exist o adevrat competiie
privind dezvoltarea de noi aplicaii pentru bioluminiscen, iar n aceast competiie
dezvoltarea de noi senzori competitivi este de importan capital. Tot n acest context se
nscriu i cercetri astronomice privind identificarea bioluminiscenei de pe alte planete
ca o expresie a existenei vietii pe aceste corpuri cereti. In acest sens snt folosii senzori
de nalt performan ce au limite de detecie a speciei luminiscente la nivelul de 10-17.
Problema tehnic pe care o rezolv biosenzorul const n realizarea unui senzor
de bioluminiscen miniatural compact
i autonom destinat identificrii
i
determinrii concentraiei unor specii biologice care pot da reacii luminiscente.
Materia analizat poate s se prezinte sub form solid, lichid, pulverulent sau sub
form lichid mbibat n suporturi lamelare poroase. In acest scop msurarea radiaiei
difuze de luminiscen se realizeaz folosindu-se un pachet opto-electronic format
dintr-o lentil colectoare, un filtru de interferen i un detector de mare sensibilitate de
tip CCD, ntreaga structur fiind montat intr-un tub metalic cilindric de mici
dimensiuni ce are n partea superioar electronica de interfaare de tip USB .
Avantajele obinute prin folosirea biosenzorului snt urmtoarele :
- se obine un senzor de bioluminiscen miniatural compact destinat identificrii
i msurrii concentraiei diferitelor specii biologice conectndu-se direct la un
laptop
- senzorul are o construcie simpl i un pre redus
- senzorul de bioluminiscent reprezint un mijloc util n criminalistic pentru
identificarea i cuantificarea urmelor de snge invizibile cu ochiul liber
folosindu-se reacia de bioluminiscen a sngelui cu luminol.
- senzorul de bioluminiscent permite construirea de chit-uri ieftine specializate
pe o anumit specie biologic cum ar fi de exemplu celule canceroase din
plasma sanguin pentru identificare i dozare fiind necesar o singur pictur
de snge cu care se imbib o lamel poroas. In aceast execuie senzorul are
microprocesor propriu cu soft inscripionat i sistem de afiare digital
al
rezultatelor.
Se d n continuare un exemplu de realizare a inveniei n legtur cu figura
III.9. care reprezint o seciune prin senzorul de bioluminiscen. Biosenzorul are o
structur compact format dintr-un corp cilindric cav 1 ce conine o lentil colectoare
2, un filtru de interferen 3, i un detector CCD de mare sensibilitate 4, n partea
superioar a structurii se gsete un capac 5 ce conine electronica de interfaare
whirless 6 cu un laptop, iar la partea inferioar un capac 9

98

Fig.III.9. seciune prin senzorul de bioluminiscen. 1-corp cilindric cav, 2-lentil colectoare,
3-filtru de interferen, 4-detector CCD, 5-capac , 6-electronic de interfaare, 7, 8,9-capace
interschimbabile, 10-folie poroas , 11-prob de analizat

interschimbabil cu alte dou capace 7,8 folosite la rndul lor pentru adaptarea la
condiiile optime de msurare n funcie de starea de agregare a probei. Reperul 10
reprezint o folie poroas mbibat cu proba de analizat 11 i cu specia chimic ce
provoac luminiscen, ea este folosit n cazul identificrii cantitii unui anumit
component bioluminiscent din plasma sanguin. Modul de lucru este simplu: se pornete
laptopul, se verific prezena transmisiei whirless
i se provoac reacia de
chemoluminiscen prin amestecarea speciei biologice analizate cu specia chimic ce
d emisie luminiscent cu acea specie biologic dup care se aduce ct mai repede
posibil proba analizat n dreptul senzorului i se execut msurtoarea. In funcie de
starea de agregare a probei pentru determinri se folosete unul din cele trei capace
speciale 6,7 sau 8, astfel :
- pentru probe lichide sau pulverulente se folosete capacul cav 6, reacia de
bioluminiscen provocndu-se direct n cavitatea acestuia dup care senzorul se
nurubeaz cu grij n capac i se efectueaz msurarea
- pentru probe solide se nurubeaz capacul 7 pe senzor, se provoac reacia de
biloluminiscen pe proba solid prin adaugarea speciei chimice corespunztoare
i se aeaz senzorul pe prob n aa fel nct fereastra capacului 7 s fie in
dreptul zonei de reacie dup care se efectueaz masurarea
- pentru determinri din probe sanguine se nurubeaz capacul 8 pe senzor,
se provoac reacia de bioluminiscen prin picurarea unei picturi de snge
proaspt pe banda siliconic poroas 10, de tip chit, pe care se gsete
impregnat specia chimic de luminiscen, dup care se introduce banda prin

99

orificiul lateral al capacului 8 pn la atingerea peretelui opus i se efectueaz


msurarea

III.1.2.1.2.2. Sond fluorometric


Sondele fluorometrice
portabil de mici dimensiuni destinate determinrii
valorii fluorescenei unei specii chimice sau biologice i convertirea acesteia n uniti
de concentraie prin intermediul unui soft specific fiind conectat la un laptop snt
deosebit de utile la analiza in situ . Fluorescena,
alturi de fosforescen i de
chemoluminiscen,
st la baza unor metode fotometrice moderne de analiz
instrumental. Anumite specii chimice sau biologice prezint proprietatea de reemisie
fotonic luminoas, pe anumite lungimi de und specifice, atunci cnd snt iradiate
tot cu energie luminoas. Reemisia are loc totdeauna la lungimi de und superioare celor
de iradiere i poart denumirea de fluorescen atunci cnd reemisia nceteaz imediat
dup iradiere i de fosforescen atunci cnd reemisia persist un anumit timp dup
ncetarea iradierii. La o intensitate a radiaiei incidente (P0) constant, fluorescena
(intensitatea fluorescenei) (F) a unei speciei chimice sau moleculare este proportional
cu concentraia(c) a acesteia :
F= K. c

(III.19)

Factorul de proporionalitate (K) depinde de natura speciei i reprezint totodat


sensibilitatea metodei pentru acea specie. Ramura analitic ce se ocup de folosirea
acestei dependene n scopul determinrii concentraiei
poart denumirea de
fluorometrie. Unul din principalele avantaje ale fluorometriei este dat de faptul c
intensitatea radiaiei fluorescente este proporional cu intensitatea radiaiei incidente
ceea ce permite ca prin mrirea intensitii primeia s se ajung la o mrire la extrem a
sensibilitii metodei ceea ce determin implicit coborrea limitei de detecie a urmelor
speciilor chimice sau moleculare fluorescente analizate cu unul pn la trei ordine de
mrime fa de metodele spectrometrice clasice de absorbie sau de transmisie, limitele
de detecie obinuite pentru fluorometrie fiind situate n domeniul pri per bilion, (1
ppb = 1:10-9) sau chiar pri per trilion (1ppt = 1:10-12). Un alt mare avantaj al
fluorometriei este acela c domeniul de liniaritate al relaiei de mai sus (condiie
obligatorie pentru o precizie de msurare ridicat) este mult mai mare dect cel al
metodelor spectrofotometrice clasice de absorbie sau de transmisie. De asemenea, n
fluorometrie pentru analiz snt suficiente cantiti extrem de mici de soluie de ordinul
l, iar la metodele fluorometrice i selectivitatea este mai bun dect la cele
spectrofotometrice. Dezavantajul evident al fluorometriei este acela c se poate folosi
numai pentru determinarea concentraiei speciilor ce prezint fenomenul de fluorescen.
Pentru msurarea intensitii fluorescenei (F) speciilor chimice lichide sau
gazoase, substana de analizat este iradiat cu o radiaie luminoas monocromatic in
domeniul vizibil i msurat cu un senzor situat la un unghi de 90 0 fa de direcia
radiaiei incidente i a unei electronici corespunztoare, intensitatea radiaie de

100

fluorescen situat tot n domeniul vizibil dar la o lungime de und superioar celei a
radiaiei incidente. Determinarea concentraiei (c) a unei specii chimice sau biologice se
face prin extrapolarea valorii fluorescenei (F) msurate
pe o curb de etalonare
realizat n coordonate: fluorescen (F) - concentraie (c), curb realizat cu ajutorul
unor concentraii cunoscute pentru acea specie.
Problema tehnic pe care o rezolv sonda descris const n realizarea unui senzor
de fluorescen miniatural compact
i autonom destinat msurrii concentraiei
speciilor chimice sau biologice fluorescente de natur solid, pulverulent sau lichid
(ultimele numai dac snt absorbite pe materiale solide sau poroase de tip folie poroas).
In acest scop msurarea radiaiei de fluorescent se realizeaz la 90 0 fa de direcia
radiaiei incidente folosindu-se o surs de radiaie monocromatic de tip LED sau
diod laser cu emisie n albastru i pentru recepie un detector de tip CCD n faa
cruia se gsete un filtru de interferent, iar n faa filtrului o lentil colectoare,
ntreaga structur fiind montat intr-un tub metalic cilindric de mici dimensiuni, att
alimentarea LED-ului ct i preluarea datelor se realizeaz printr-o interfaa de tip USB
plasat n partea superioar a senzorului.
Folosirea sondei duce la obinerea urmtoarelor avantaje:
- se obine un senzor de fluorescen miniatural compact i cu pre redus destinat
msurrii concentraiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente
- senzorul de fluorescen nu necesit surs electric de alimentare, LED-ul emitor de
consum extrem de mic fiind alimentat prin interfaa USB a unui calculator sau
laptop, aceeai interfa prin care se preiau i datele de la senzor n vederea procesrii
acestora
- senzorul de fluorescen permite impreun cu o unitate de calcul extern i un soft
specializat determinarea concentraiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente
de natur solid pulverulent i lichid pe teren fr a fi necesar o pregtire
complex a probelor.
- printr-un suport prins cu dou uruburi senzorul permite analiza de fluorescen a unor
specii chimice picurate pe benzi de hirtie sau pe folii siliconice poroase
- folosindu-se avantajele
enumerate mai sus, senzorul de fluorescen permite
construirea de chit -uri miniaturale, ieftine i specializate pe anumite specii chimice,
inclusiv pe analiza plasmei sanguine folosind n acest scop o singur pictur de snge.
Este evident c, n aceast situaie senzorul devine o unitate autonom de analiz i
trebuie echipat cu microprocesor cu display electronic i cu soft inscripionat precum
i cu surs electric de alimentare proprie.
In figura III.10. este prezentat o seciune prin sonda fluorometric. Detectorul
de fluorescen se compune dintr-o specie chimic sau biologic fluorescent 1
existent n substane solide, pulverulente sau n lichide mbibate n materiale poroase
sau pulberi, un corp 2 n care se gsete canalul de excitare compus dintr-un un LED 3,
cu emisie n albastru i un canal de msurare a fluorescenei aezat la un unghi de 90 0
fa de canalul de excitare, format la rndul lui dintr-o lentil optic colectoare 4, un
filtru de interferen 5, un senzor CCD 6 de mare sensibilitate i o unitate
de
interfaare 7 de tip USB. Pentru msurri pe solide i pulberi pe corpul detectorului se
prinde cu dou uruburi un corp de adaptare 8, iar pentru msurri la lichide imbibate
pe benzi de hrtie sau pe benzi poroase siliconice este folosit un corp special de
adaptare 9, fixat cu aceleai dou suruburi ca i corpul de adaptare 8

101

Fig. III.10. seciune prin sonda fluorometric. 1-specie chimic sau biologic fluorescent, 2corp , 3-LED, 4-lentil optic colectoare, 5-filtru de interferen, 6-senzor CCD 7-unitate de
interfaare, 8-corp de adaptare, 9-corp de adaptare

III.1.2.2. Rezonana plasmonic de suprafa (SPR)


III.1.2.2.1. Principiul rezonanei plasmonice.
La rezonana plasmonic de suprafa ( SPR) o radiaie monocromatic polarizat cade
pe o suprafa subire de aur sau argint depus pe faa unei prisme de sticl de unde este
reflectat. Fotonii radiaiei laser incidente interfer cu electronii liberi ai aurului sau
argintului i formeaz o aa numit structur plasmonic . Dac ntre electronii liberi i
fotonii de iradiere se ajunge la rezonan se extrage din radiaia reflectat energia
consumat la rezonan, unghiul de reflexie nemaifiind egal cu unghiul de inciden , n
spectrul de reflexie aprnd o pierdere energetic care genereaz un anumit unghi de
reflexie, ( mai mare dect unghiul de reflexie normal n absena condiiilor de
rezonan) , a crui valoare este proporional cu valoarea pierderii de energie.
Frecvena de rezonana i prin ea unghiul de reflexie snt la rndul lor proporionale cu
gradul de ncrcare masic a stratului metalic de aur sau argint realizat de anumite
specii biologice ce ader specific pe faa metalic exterioar opus feei interioare
iradiat cu radiaia monocromatic. La ora actual SPR constituie una din cele mai
performante metode pentru determinarea unor creteri masice extrem de mici de ordinul
10-15 g ( femto grame). n acest scop un receptor specific este imobilizat pe suprafaa
metalic exterioar de aur sau argint iar interaciunea dintre receptor i un potenial
ligand ce constituie de fapt specia sau speciile biologice urmrite, crete proporional
gadul de ncrcare masic a stratului de metal, ncrcare care este msurat cu mare
precizie prin msurarea modificrii unghiului de reflexie cu ajutorul unui fotodetector
montat pe un goniometru unghiular sau prin intermediul unui detector Diode Array. O
modificare a condiiilor dielectrice n imediata vecintate a stratului de metal depus pe
prism , figura III.11.) , prin apariia unei specii chimice sau biologice noi , duc la
schimbarea condiiilor de rezonan ceea ce are ca efect deplasarea peak-urilor din
pozitia 1 n poziia 2 , (figura III.11.) valoarea deplasrii peak-uri fiind proporional cu
102

concentraia masic a speciilor respective. Moleculede precum : peptide, proteine,


acizi nucleici pot fi imobilizate pe suprafaa unor cipuri senzoriale, care aduse in
contact cu

Fig. III.11. Schema de principiu a msurrii variaiilor mici de mas sau de grosime de strat prin
fenomenul de plasmonrezonan

specii chimice sau biologice ce urmeaza a fi determinate , reactionez cu acestea


rezultnd produse de reacie ce provoac modificri masice pe suprafaa acestor cipuri ,
modificari care snt sesizate prin fenomenul de rezonant plasmonic care se
materializeaz n modifiri ale unghiului de refracie ale unei radiaii monocromatice
incidente in funcie de natura speciei i in modificari ale intensitii radiaiei refractate
n funcie de concentraia speciei . Semnalele electrice ale unui detector de tip Diode
Array snt transformate ulterior prin procesarea semnalelor n informaii analitice de
natur calitativ i cantitativa despre speciile biologice urmrite. Aplicaia poate fi
extinsa i la celule de curgere cu ajutorul crora se poat determina cinetica diferitelor
aplicaii biochimice. Expresiile grafice se prezint sub forma unor reprezentri in
coordonate: Intensitatea Radiaie reflectat (RI) in funcie de ungiul de refracie (teta) .
Un dezavanta al tehnicii SPR l reprezint faptul c nivelul rezonanei plasmonice este
dependent de temperatur ceea ce necesit o termostatare avansat a sistemelor de
analiz.
Biosenzorii SPR sint folositi n bioanalitic n special ca senzori de afinitate in
analiza de interaciune biomolecular fr markeri (BIA) , pe suprafaa stratului metalic
pot fi imobilizati parteneri de legare foarte diferii . In cazul clasic acesta este un
anticorp orientat spre o anumit protein. Cu ajutorul anticorpilor pot fi legate ns i
celule intregi. In figura III.12. este reprezentat schematic posibilitatea legarii pe un film
de aur de diferite tipuri de receptori .

103

Fig. III.12. Suprafaa aurit a prismei pe care s-au fixat diferite tipuri de receptori: a- receptor, banticorp pentru proteina, c- anticorp pentru structur celular, d-hidrat de carbon ce leag lectine,
e - receptor ce interacioneaz intit cu structuri proteinergene

III.1.2.2.2.Tehnice de valorificare a efectului rezonanei plasmonice de rezonan


In figura sint prezentate tehnici actuale de valorificare a efectului rezonanei
plasmonice de surafa . in figura III.13. a este prezentat schema de principiu a

Fig. III.13. Diferite modaliti de valorificare a fenomenului rezonanei plasmonice de


suprafa. a- clasic cu prism cu film de aur, b- sond cu fibr optic cu depunere exterioar de
film de aur , c-nanoparticule de aur analiyate optoelectronic

104

montajului devenit clasic cu folosirea unei prismei aurite pe o fa . Una din tendinele
actuale n biosenzoric este obinerea de sisteme de msurare miniaturale care pe ct
posibil s poat determina minimalinvaziv diversi parametrii direct n organismul viu .
Aceast tendin are anse reale n cadrul SPR. In acest sens la tehnica SPR este
avantajos faptul c fenomenul SPR apare i atunci cnd pe o fibr optic prin care
trece lumin este depus pe o poriune lateral un strat subire de aur pe care este depus
un strat subire din substana biologic activ. O asemenea sond , figura .13.b, poate fi
scufundat direct ntr-un recipient de lichid n vederea efectuarii de msurtori dar poate
fi introdus i ntr-un esut viu datorit diametrului fibrei optice a crui valoare se
situeaz
n domeniul m. are i un Dezavantajul aceastei tehnici const n
imposibilitatea realizrii termostatrii ceea ce duce la anumite probleme la interpretarea
rezultatelor , efectul rezonanei lasmonice de suprafa fiind puternic deendent de
temperatur.
Pasul urmtor n miniaturizare l constituie nano SPR unde aurul nu este
imbilizat pe o suprafaa de sticl ci introdus sub form de nanoparticule n soluia de
cercetat , figura III.13.c, suprafaa acestor nanoparticule este acoperit ca n cazul clasic
cu structura de legare. Dac pe suprafaa acestor nanoparticule se ajunge la reacii apar
efecte ale fenomenului SPR msurabile prin tehnic microscopic sau prin tehnica
fibrelor optice care deschid noi posibiliti de investigare cum ar fi de exemplu n
depistarea i investigarea tumorilor. Este posibil injectarea de asemenea nanoparticule
n tumoare urmat de investigarea efectului SPR prin fibr optic introdus n esut.
Dup rezultatul analizei , rezultat care este instantaneu, prin aceai fibr optic poate fi
introdus energie laser n esut n vederea distrugerii acestuia rezultnd concepte de
terapie noi i deosebit de performante.

III.1.2.2.3. Exemple constructive de biosenzori bazai pe fenomenul


rezonantei plasmonice de suprafat
III.1.2.2.3.1. Biosenzor pentru determinarea continu a variaiei de mas sau a
grosimii de strat prin rezonan plasmonic de suprafa
Asa cum s-a artat n scopul determinarii grosimii filmelor n zona activ a
biosenzorilor snt folosite aparate i echipamente bazate pe rezonana plasmonic
de suprafa (SPR) ce permite msurarea
unor variaii de mas extrem de mici sau a
unor grosimi de strat n domeniul nm. Tehnica folosirii rezonanei plasmonice de
suprafa (SPR) pentru determinarea de creteri de mas i de grosimi de strat este
relativ simpl i const n transmiterea unei radiaie monocromatice, emis de o diod
laser sau de un LED, perpendicular pe latura unei prisme echilaterale de sticl , latur
care este acoperit cu un strat foarte subire de metal ( zeci de nm), de regul aur sau
argint, efectul iradierii metalului depus pe prism
are urmri asupra structurii
electronice a acestuia el rspunznd iradierii printr-un aa numit cimp evanescent []
care duce pe de-o parte la modificarea valorii unghiului i intensitii refleciei specifice
metalului depus . De asemenea orice modificare a condiiilor dielectrice n imediata
vecintate exterioar a stratului de metal depus pe prism , prin apariia unei specii
chimice sau biologice noi , duc la schimbarea condiiilor de rezonan prin deplasarea

105

peak-urilor ce reflect absorbia de energie fotonic, deplasarea acestor peak-uri fiind


proporional cu cresterea de mas ( de grosime de strat) pe suprafaa exterioar a
stratului metalic. Rezonanta plasmonic de suprafa are utilizri importante n
bioanalitic n special ca senzori de afinitate in analiza de interaciune biomolecular
fr markeri (BIA) , pe suprafaa stratului metalic pot fi imobilizati parteneri de legare
foarte diferii . In cazul clasic acesta este un anticorp orientat spre o anumit protein
pe care o leag rezultnd produse ce provoac creteri masice pe suprafaa metalizat a
prismei , modificari care snt sesizate prin fenomenul de rezonant plasmonic care se
materializeaz n modificri ale unghiului de refracie ale unei radiaii monocromatice
incidente n funcie de masa speciei ce s-a depus pe suprafaa exterioar a metalului
de pe prism. Aplicaia rezonanei plasmonice de suprafa poate fi extinsa i la celule
de curgere cu ajutorul putndu-se urmri cinetica diferitelor aplicaii biochimice. In
cazul unor msurri unice expresiile grafice se prezint sub forma unor reprezentri n
coordonate: uniti ale intensitii radiaiei reflectat (URI) in funcie de ungiul de
refracie ( ) (fig. III.14), iar n cazuil unor fenomene dinamice, msurate prin
intermediul unor celule de curgere , expresiile grafice se prezint sub forma unor
reprezentri n coordonate : uniti ale intensitii radiaiei reflectat (URI) n funcie
de timpul (t) (fig. III.15). Dezavantajul pe care-l prezint acest procedeu este faptul c
activarea suprafeei prismei cu un ligand specific este greoaie, operaia necesit de
regul demontarea urmat de timpi de uscare care duc la scderea productivitii
procesului. De asemenea metalizarea suprafeei prismei , dup un anumit numr de
utilizri , prin depunere de aur n vacuum este scump i greoaie.
Problema tehnic pe care o rezolv biosenzorii descrii const n realizarea
unui echipament care permite pe baza msurrii rezonanei plasmonice de suprafa
(SPR) determinarea rapida i precis a cresterii grosimii de strat la msurri succesive
independente folosind lamele aurite interschimbabile sau care permite determinarea
continu a grosimii de strat atunci cnd pe el este montat o celul de curgere. n
scopul materializrii acestor echipamente
este folosit o structur modificat a
aparatului clasic de rezonan plasmonic de suprafa, astfel :
- n loc ca aurirea s fie realizat pe o fa a unei prisme optice aceasta se
realizeaz pe una din feele plan paralele a mai multor lamele din sticl optic lamele
ce au suprafaa aurit egal cu cea a unei laturi a prismei. n funcie de situaiile
analitice concrete partea aurit a lamelelor se trateaz cu acelai sau cu mai muli
liganzi biologici specifici dup care snt fixate pe rnd pe prisma de msurare folisinduse pentru cuplarea optic un ulei cu indice de refracie mare.
- n locul unui goniometru electronic de mare precizie echipat cu detector optic
singular, specific aparatelor clasice, ce are ca sarcin cutarea unghiului de refracie
obinut ca urmare a modificrii rezonanei plasmonice, este folosit un detector
optoelectronic de tip diode - array care determin indicele de refracie instantaneu , fr
cautare unghiular, cu o rezoluie foarte mare.
Din montajul experimental pentru msurtori succesive i independente fac parte
o surs de radiaie monocromatic de tip diod laser sau LED prevzut cu un sistem de
rotaie fr divizare unghiular, un detector optic de tip diode - array i o unitate de calcul
cu un program de achiziie i prelucrarea datelor, iar la msurtori continue n by - pass
mai este folosit suplimentar o pomp peristaltic, o celul de curgere i furtune
siliconice transparente cu diametru interior mic.

106

Folosirea acestor tipuri de echipamente duce la urmtoarele avantaje:


- folosirea unor plcute de sticl optic cu fee plan paralele, din care o fa este
aurit, fixate pe o prism de sticl cu un material lichid transparent cu indice de
refracie mare d posibilitatea folosirii succesive i rapid a mai multor lamele
pregtite n prealabil cu material biologic
i prin aceast crete mult
productivitatea procesului de analiz.
- evitarea auririi directe a suprafeei prismei scade costurile i timpii mori prin
nefolosirea acesteia n timpul procesului de aurire i crete totodat durata de
via a prismei optice.
- face posibil folosirea aceleai echipri a prismei att la la msurtori succesive
independente ct i la msurtori in -situ continuie n regim de by - pass.
- folosirea unui detector optoelectronic de tip diode array n locul unui
fotodetector monocelular montat pe un sistem goniometric de precizie duce la
eliminarea celui din urm al crui pre reprezint cca 2/3 din preul unui aparat
actual de rezonan plasmonic de suprafa. In plus un detector diode array
face posibil preluarea instantanee a tuturor ungiurilor de refracie eliminnd
timpii necesari pentru cautarea i msurarea unghiului de
Se dau n continuare un exemple de realizare a biosenzorilor n legtura cu:
- figura III.14. care reprezint schema de principiu
pentru determinarea rezonanei
plasmonice de suprafa cu lamele de sticl aurite
- figura III.15. care reprezint schema de principiu
pentru determinarea continu n
regim de by-pass a variaiei de mas sau a grosimii de strat prin rezonan plasmonic
de suprafa

Fig.III. 14 schema de principiu pentru determinarea rezonanei plasmonice de suprafa cu


lamele de sticl aurite. 1- prism din sticl optic, 2-lamela din sticl, 3-depunere de aur, 4-strat
biologic activ, 5-strat subire de ulei, 6,7-sistem de strngere, 8-corp, 9-surs de radiaie
monocromatic, 10-detector optoelectronic de tip diode- array, 11-unitate electronic central,
12-unitate de calcul

Echipamentul pentru determinarea grosimii de strat sau a variaiei acesteia n timp


conform figurii III.14 este format dintr-o prism 1 din sticl optic, o lamela 2 din sticl
optic avnd o depunere 3 de aur pur subire pe una din fee , un strat 4 biologic activ
depus pe stratul de aur, un strat 5 subire de ulei special cu indice de refracie ridicat
folosit pentru cuplarea prismei cu lamela de sticl, un sistem 6 i 7 de strngere, un corp
8, o surs 9 de radiaie monocromatic de tip diod laser sau LED un detector 10

107

optoelectronic de tip diode- array pentru msurarea unghiului de refracie , o unitate


11 electronic central, i o unitate 12 de calcul ce dispune de un soft specific pentru
achizitia i prelucrarea datelor.

Fig.III. 15 Schema de principiu pentru determinarea continu n regim de by-pass a


variaiei de mas sau a grosimii de strat prin rezonan plasmonic de suprafa. 1- prism din
sticl optic, 2-lamela din sticl, 3-depunere de aur, 4-strat biologic activ, 5-strat subire de ulei,
6,7-sistem de strngere, 8-corp, 9-surs de radiaie monocromatic, 10-detector optoelectronic
de tip diode- array, 11-unitate electronic central, 12-unitate de calcul, 13-celul de curgere, 14recipient sau reactor, 15-pomp peristaltic, 16-motor electric.

Echipamentul pentru determinarea variaiei grosimii de strat conform figurii III.15 este
format dintr-o prism 1 optic din sticl, o lamela 2 optic avnd o depunere 3 de aur
pur subire pe una din fee , un strat 4 biologic activ depus pe stratul de aur, un strat 5
subire de ulei special cu indice de refracie ridicat, un sistem 6 i 7 de stringere cu
colier , un corp 8, o surs 9 de radiaie monocromatic de tip diod laser sau LED, un
detector 10 optoelectronic de tip diode- array pentru msurarea unghiului de refracie ,
o unitate 11 electronic central, o unitate 12 de calcul , o celul 13 de curgere , un
recipient sau reactor 14 cu speciile biologice urmrite, o pomp 15 peristaltic
acionat cu un motor 16 electric.

III.1.2.2.3.2. Biosenzor interferometric pentru determinarea creterii de mas


respectiv a grosimii de strat prin rezonan plasmonic de suprafa.
Biosenzorul se refera la un aparat interferometric pentru determinarea cu
precizie
ridicat a creterii de mas respectiv a grosimii de strat prin rezonan

108

plasmonic de suprafa. In scopul determinarii creterii de mas respectiv a grosimii


filmelor, n zona activ a biosenzorilor , pe ling bane piezoelectrice snt folosite i
aparate i echipamente bazate pe rezonana plasmonic de suprafa (SPR) ce
permite msurarea
unor variaii de mas n domeniul 10 -15g sau a unor grosimi de
strat n domeniul nm. Problema tehnic pe care o rezolv biosenzorul const n
folosirea unei structuri modulare cu fibr optic i a unei structuri interferometrice de
tip Michelson pentru msurarea lungimii de und a radiaiei refractate cu efecte
deosebite asupra rezoluiei, preciziei i a productivitii msurrii la determinrii masei
sau a grosimii de strat prin tehnica rezonanei plasmonice de suprafa (SPR). In acest
scop o radiaie monocromatic emis de o diod laser, prin intermediul unei fibre
optice , este divizat n dou fascicule paralele , unul din fasciculele optice (de
referin) ocolete printr-o fibr optic structura de msurare a ungiului de refracie prin
tehnica SPR i ajunge ntr-un sumator optic. Cellalt fascicul (de lucru) este ndreptat
prin intermediul altei fibre optice spre sistemul de rezonant plasmonic de suprafa,
unde cade perpendicular pe o fa transparent a unei prismei optice, se reflect pe o
depunere de aur sau argint depus n strat subire pe o alt fa a prismei i prsete
prisma prin a treia fa transparent a acesteia ajungnd la o lentil optic convergent
ce focalizeaz radiaia pe o fibr optic care la rndul ei se unete prin intermediul
unui sumator cu fibra optic ce transport fasciculul de referin, cele dou semnale
luminoase cznd dup unire pe o oglind semitransparent a unui interferometru de tip
Michelson. Atunci cnd drumurile optice parcurse de cele dou fascicule snt identice
este indeplinit condiia de interferen , intensitile luminoase se sumeaz , iar
semnalul detectorului, dat sub form unui fotocurent, este maxim. Devierea unghiului
de refracie a fasciculului luminos de la valoarea unghiular iniial, ca urmare a
cresterii masei depuse pe stratul de aur sau argint, face ca acesta s cad la rndul lui
sub un alt unghi pe lentila optic de focalizare i corespunztor i focalizarea pe fibra
optic s aib loc sub alt unghi. Corespunztor drumul parcurs n fibr prin reflexie
total repetat pe pereii (modul specific de transmitere a radiaiei luminoase prin fibre
optice) este diferit fa de situaia anterioar, (fig.III.16). n condiiile mririi ungiului
de inciden a radiaiei n fibra optic
fasciculul luminos de lucru parcurge un drum
mai lung i sosete cu o ntrziere fa de un fascicul cu un unghi de inciden anterior
mai mic, corespunztor este diminuat i semnalul electric al detectorului . n structura
interferometric de tip Michelson drumului optic mai lung parcurs de fasiculul de lucru
este compensat de deplasarea proporional prin intermediul unui piezomotor a unei
oglinzi cu reflexie total fiind posibil obinerea unor interferograme , n coordonate
.intensitate reflectat timp care la rndul lor snt convertite n spectrograme, n
coordonate intensitate frecven prin intermediul transformatei Fourier. Din aceste
spectrograme se obin , prin extrapolarea automat a peak-urilor pe abscis, valorile
frecvenelor , care corespund valorilor unghiurilor de refracie ( ) din diagrama
clasic SPR. Rezoluia de msurare obinut prin structura conform inveniei se situeaz
la nivelul jumtii valorii lungimii de und folosite pentru iradiere (/2) (rezoluia
maxim ce se poate obine la interferometria optic) i este cu cca 10 -10 2 ori mai bun
dect la msurarea goniometric clasic a ungiului de refracie cu efect direct i asupra
preciziei de msurare a masei respectiv a grosimii de strat a speciilor urmrite. Prin
folosirea acestui sistem interferometric obin urmtoarele avantaje:

109

este posibil msurarea masei i a grosimii de strat cu rezoluii i precizii net


superioare fa de metoda clasic a msurrii unghiului de refracie
- msurarea are loc n mod continuu nefiind nevoie de goniometrarea manual sau
automat a unghiului de refracie cu efecte deosebit de favorabile asupra proceselor
cinetice
- prin msurarea instantanee a cca 10 3 valori diferite de frecven , caracteristic
specific sistemelor interferometrice cu transformat Fourier, viteza de determinare
experimental crete enorm cu aproximativ acelai ordin de mrime
- se obine un
raport semnal/zgomot foarte bun caracteristic metodelor spectrale
cu transformat Fourier
Se d n continuare un exemplu de realizare a biosenzorului n legtur cu figurile
prezentate mai jos ce reprezint :
- Fig.III.15. - Schema de principiu a sistemului interferometric de msurare a
masei respectiv a grosimii de strat prin rezonan plasmonic de suprafa
- Fig.III.16. - Schema de principiu a transmiterii radiaiei luminoase reflectate printr-o
fibr optic

Fig.III.15. Schema de principiu a sistemului interferometric de msurare prin rezonan


plasmonic de suprafa.. 1-surs de radiaie de tip diod laser, 2-fibr optic, 3-divizor optic, 4
- fibr optic, 5-fibr optic , 6-prism optic, 7-depuneresubire de aur sau de argint, 8-strat de
aderen, 9-substana activ , 10- structur chimic sau biologic urmrit, 11-lentil de
focalizare , 12-fibr optic, 13-sumator optic , 14-fibr optic, 15-oglind semitransparent,
16-oglind mobil cu reflexie total , 17-motor piezoelectric liniar, 18-oglind fix cu reflexie
total , 19-detector fotoelectric, 21-unitate electronic central, 22-unitate de calcul

110

Biosenzorul interferometric se prezint sub forma unei structuri modulare format dintro sursa 1 de radiaie de tip diod laser, o fibr 2 optic ce este scindat prin intermediul
unui divizor 3 optic ntr-o fibr 4 optic pentru transmiterea unui fascicul luminos de
referin i o fibr 5 optic pentru transmiterea unui fascicul luminos de lucru, o prism
6 optic cu o depunere 7 subire de aur sau de argint peste care este depus un strat 8

Fig.III.16. Schema de principiu a transmiterii radiaiei luminoase reflectate printr-o fibr


optic . 6-prism optic, 7-depuneresubire de aur sau de argint, 8-strat de aderen, 9-substana
activ , 10-structur chimic sau biologic urmrit, 11-lentil de focalizare , 12-fibr optic,

de aderen mpreun cu substana 9 activ pentru fixarea structurii 10 chimice sau


biologice urmrite, o lentil 11 de focalizare , o fibr 12 optic de transmisie
a
fasciculului luminos de lucru, un sumator 13 optic , o fibr 14 optic, un interferometru
Michelson format la rndul lui dintr-o oglind 15 semitransparent, o oglind 16 mobil
cu reflexie total , un motor 17 piezoelectric liniar, o oglind 18 fix cu reflexie total ,
un detector 19 fotoelectric, o unitate 21 electronic central i o unitate de calcul 22
prevzut cu un program de calcul pentru achiziia i prelucrarea datelor precum i
pentru transformata Fourier.

III.1.2.2.3.3. Biosenzor portabil cu fibr optic pentru determinarea variaiilor


mici de mas respectiv de grosime de strat a unor specii biologic active.
Biosenzorul portabil este aparat optoelectronic portabil , de tip biosenzor, folosit
pentru determinarea variaiilor extrem de mici de mas respectiv de grosime de strat a
unor specii biologic active. In vederea determinarii modificarilor masice si indirect a
grosimii filmelor n zona activ a biosenzorilor este folosit la ora actual balana
piezoelectric i aparate bazate pe rezonana plasmonic de suprafa (SPR). Problema
tehnic pe care o rezolv biosenyorul descris n continuare const n realizarea unui
111

biosenzor optoelectronic performant, bazat pe rezonana plasmonic de suprafa


(SPR), care permite determinarea ntr-un timp scurt a grosimii de strat a unor specii
biologic active. n acest scop este folosit un sistem optoelectronic portabil monobloc ce
are la un capt sistemul electronic de procesare i afiare date iar la cellalt capt o sond
optic de rezonan plasmonic de suprafa ce se scufund n mediul urmrit. Aparatul
este format dintr-o surs de radiaie monocromatic de tid LED sau diod laser ce
transmite radiaia luminoas printr-o fibr optic flexibil la un cuplor optic ce permite
conectarea rapid i pe rnd a unor sonde interschimbabile de rezonan plasmonic
de suprafa ce se prezint sub form unor de tije cilindrice , cu cma inoxidabil i
pat polimeric n care sint distribuite circular un pachet de dousprezece fibre optice fibre
optice n jurul unei fibre optice centrale . La captul opus fixrii n cuplorul optic
sonda prezint o suprafa circular plan pe care este depus un strat subire de aur pur
iar peste acesta este depus n laborator un strat subire ce contine componentele biologic
active ce urmeaz a interaciona cu specia sau speciile urmrite. In urma iradierii
luminoase a stratului subire de aur dinspre cele dousprezece fibre optice are loc
excitarea plasmonic de rezonan iar rspunsul sistemului este transmis prin fibra
optic central, sub forma unei anumite valori a unghiului de refracie determinat de
ctre un detector optoelectronic de tip ir de fotodiode (diode array) ce are n
compunere cca 4.000 de fotodiode. Detectorul convertete valoarea unghiului de
refracie intr-un fotocurent , a crui valoare reflect valoarea acestui unghi care la rndul
ei este proportional cu modificarea grosimii stratului biologic activ
Avantaje le folsirii acestui tip de biosenyor snt:
- se realizeaz un biosenzor optoelectronic portabil bazat pe fenomenul de
rezonan plasmonic de suprafa folosit pentru determinarea creterilor de mas
sau a grosimii de strat la msurri rapide in -situ
- se pune la punct un sistem de lucru cu chituri interschimbabile , folosind n acest
scop nite sonde cu pachete de fibr optic, care permite pregtirea prealabil a
mai multor substraturi active biologic fiind posibil lucrul n serie, determinrile
durnd n aceste condiii maxim citeva zeci de secunde fiecare.
- se elimin prisma optic din sistemul clasic de msurare
- folosirea unui detector optoelectronic de tip diode - array, de nalt rezoluie,
face posibil preluarea instantanee a tuturor ungiurilor de refracie eliminnd
timpii necesari pentru cautarea i msurarea unghiului de refracie
iar la
msurri cinetice elimin prezena unui sistem scump de goniometrare automat.
Se prezint n continuare biosenzorul descris n legtur cu: figura III.17. care reprezint
o vedere a biosenzorului portabil bazat pe fenomenul de rezonan plasmonic de
suprafa . Biosenzorul pentru determinarea variaiei de mas i/sau a grosimii de strat
conform inveniei este format dintr-un corp 1 prevzut cu display alfanumeric 2, i
tastatur 3, o surs 4 de radiaie monocromatic de tip diod laser sau LED , o fibr
5 optic de iradiere , o tij 6 de legtur , un cap 7 optic divizor , o piuli 8 special de
strngere, o sond 9 interschimbabil ce conine dousprezece fibre 10 optice dispuse
radial n jurul unei fibre 11 optice centrale, un strat 12 subire de aur depus pe captul
plan al sondei (9) i un strat 13 subire de material biologic activ ce urmeaz a
interaciona cu speciile biologice urmrite, depus la rndul lui pe stratul de aur. Fibra
optic central (11) este cuplat cu un detector 14 optoelectronic de tip Diode - Array

112

legat printr-un amplificator electronic 15 la o unitate electronic digital de achiziie ,


prelucrare i afiare date.

Fig.III.17. Vedere a biosenzorului portabil bazat pe fenomenul de rezonan plasmonic de


suprafa. a-diagrama intensitii de reflexie funcie de valoarea unghiului de reflexie , bdiagram de nregistrare continu a indicelui de reflexie funcie de timp. 1-corp, 2-display
alfanumeric, 3-tastatur, 4-sursde radiaie monocromatic, 5-fibr optic de iradiere, 6-tijde
legtur, 7-cap optic divizor, 8-piuli special de strngere, 9-sond interschimbabil, 10dousprezece fibre optice, 11-fibr optic central, 12- subire de aur, 13 -strat subire de material
biologic activ, 14-detector optoelectronic de tip Diode - Array, 15-amplificator electronic

Modul de lucru cu acest biosenzor este foarte simplu. Se prepar in laborator


componentele biologic active mpreun cu substratul de fixare a acestora dup care
acestea se ntind n strat subire pe stratul de aur pe tot setul de sonde 9
interschimbabile disponibile i se usuc la temperatura prescris. Dup uscare oricare
din sonde poate fi cuplat la aparat prin fixarea i strngerea acesteia cu piulia special
113

8 pe corpul de legtur 6. Inainte de scufundarea sondei 9 interschimbabile n mediul


biologic analizat se iniiaz electronic o diagram de rezonan plasmonic pentru a oine
peak-ul de calibrare I , fig. fig. III.17a a, dup care se scufund sonda n mediul analitic
i la un timp prescris se se execut o nou inregistrare a unei diagrame de rezonant
plasmonic pentru obierea peak-ului de msurare II, fig. III.17a. Diferena ungiulara
ntre Peak-u I i peak-ul II este convertit electronic fie in uniati de variaie masic fie n
uniti de grosime de strat i afiat electronic ca atare pe display-u 2 alfanumeric al
aparatului. n cazul urmririi unei cinetici a evoluiei speciei biologice vizate se
prescrie din tastatura 3 a aparatului timpul de citire iar n continuare memorie se
stocheaz perechile de valori mas i /sau grosime de strat la timpii corespunztori , iar
pe display-ul 2 alfanumeric apare afiat evoluia grafic a variaiei masei si/sau a
grosimii de strat la fiecare timp citit.
III.1.2.2.3.4. Biosenzor miniatural de rezonan plasmonic de suprafa
Biosenzorul miniatural descris se bazeaz pe efectul de rezonan plasmonic de
suprafa i este destinat analizei cantitative in situ specifice a unei specii biologice
sau chimice dintr-un mediu lichid sau dintr-un esut viu. Problema tehnic pe care o
rezolv acest biosenzor const n analiza unui mediu lichid sau a unui esut viu , prin
folosirea unei fibre optice speciale, cu eliminarea automat a influenei variaiilor de
temperatur asupra valorilor msurate. In acest scop este folosit un sistem de generare
a rezonanei plasmonice prin frolosirea unei fibre optice speciale, cu diametrul de cca
600 nm, cuplat la o extremitate la o surs de radiaie monocromatic ce asigur
iradierea alternativ a zonei de lucru cu dou frecvene fixe de radiaie electromagnetic
, cuprins n domeniul vizibil , una fiind situat n domeniul albastru i cealalt n
domeniul rou, iar la cellalt capt avnd un film subire de aur , cu lungimea de cca
10 mm i cu grosimea de cca 30- 50 nm, depus att pe partea frontal ct i pe partea
cilindric a fibrei. Suprafaa aurit se acoper cu un strat subire de ligand specific
speciei care urmeaz a se determina ( de ex. Ll folosirea senzorului ntr-un sistem de
detectare imunologic pe stratul de aur se va fixa anticorpul care va lega n timpul
procesului de analiz antigenul specific). Dat fiind faptul c la fibre optice, al cror
diametru este de acelai ordin de mrime cu ordinul de mrime al frecvenei radiaiei
electromagnetice transportate, transmisia luminii se face prin reflecii repetate pe perei
fibrei, fenomenul de rezonan plasmonic de la captul fibrei provoac n zona aurit o
reflexie multipla fiecare sub un alt unghi fa de cel precedent astfel nct de obine n
final o defazare pronunat a lungimii de und a radiaiei reflectate fa de lungimea de
und a radiaiei incidente, defazare
a crei valoare este o msur a intensitii
rezonanei plasmonice , respectiv a masei ( concentraiei) speciei urmrite ce se gsete
pe partea exterioar a filmului de aur .
Din cauza dimensiunii nanometrice a fibrei optice precum i a imposibilitii
asgurrii unei temperaturi constante n majoritatea situaiilor de msurare in situ precum
i datorit aceleai imposibliti de folosirea unui senzor de tempertaur pentru
realizarea coreciei electronice a valorii msurate cu variaia de temperatur, la acest
biosenzor eroarea dat de influena temperaturii asupra valorii msurate este eliminat
prin folosirea a dou frecvene diferite pentru iradiere i folosirea ca msur a

114

rezonanei plasmonice a valorii raportului celor dou valori ale defazri radiaiei
reflectate fa cele dou valori ale lungimilor de und ale radiaiei iniiale. Valorile
defazrilor acestor dou lungimi de und, provocate de aceeai modificare masic, snt
diferite deoarece cele dou radiaii au frecvene (energii) diferite, n schimb efectul
influenei temperaturii asupra valorii msurate este acelai n cazul ambelor frecvene i
ca urmare prin efectuarea raportului matematic aceast influen se simplific dnd
valoarea unu care prin inmulire cu valoarea msurtorii nu afecteaz rezultatul acesteia.
Prin folosirea biosenzorului portabil mimniatural se obin urmtoarele avantaje:
- se aduce un sistem de msurare pe baz de rezonan plasmonic la dimensiuni
miniaturale care permite msurri in situ n locuri greu accesibile inclusiv n
esuturi vii
- scade preul de cost prin nlocuirea unei prisme optice cu o fibr optic
- crete precizia de msurare prin inlocuirea msurrii unghiului de refracie, ca
expresie a modificrii masice a speciei urmrite , cu msurarea defazrii ntre
lungimea de und a radiaie incidente fa de lungimea de und a radiaiei
reflectate
- exprimnd valoarea mrimii msurate prin raportul celor dou valori ale defazri
radiaiei reflectate fa cele dou valori ale lungimilor de und ale radiaiei
iniiale este eliminat eroarea de msurare cauzat de influena temperaturii. .
Se prezint n continuare un exemplu de realizare a biosenzorului n legtura cu
figura III.18. care reprezint schema de principiu a biosenzorului. Biosenzorul este
format dintr-o surs de radiaie S ce conine dou diode 1 i 2 laser, un chopper 3
optic care comut alternativ cele dou fascicule f1 i f2 de radiaie monocromatic, de
radiaie monocromatic, de fecvene diferite spre un optocuplor 4 la care este
conectat o fibr 5 optic cu scindare, prevzut la un capt cu o depunere 6 subire
din aur pe o lungimea de cca 10 mm i avnd grosimea de cca 30- 50 nm, peste
care este realizat o depunere 7 subire biologic activ ce leag specific specia
urmrit, iar la cellalt capt cu o parte 8 electronic ce msoar defazajul ntre
valorile lungimilor de und ale radiaiei incidente i valorile lungimilor de und ale
radiaiei reflectate i efectueaza ulterior raportul celor dou valori ale defazajului n
vederea eliminrii erorii de msurare cauzat de influena temperaturii .

115

Fig..III.18. Schema de principiu a biosenzorului miniatural bazat

pe efectul de
rezonan plasmonic de suprafa. S-surs de radiaie, 1,2-diode laser, 3-chopper
optic, f1,f2-fascicule de radiaie monocromatic, 4-optocuplor, 5-fibr optic 6depunere subire din aur, 7-depunere subire biologic activ, 8-parte electronic

III.1.3. Microbalana piezoelectric


Microbalana piezoelectric reprezint un sistem de msurare foarte sensibil a
variaiilor de mas folosit cu precdere n aplicaii de biosenzori dar i n alte aplicaii
unde se reclam msurarea cu mare sensibilitate a unor variaii masice extrem de mici cu
rezoluii de pn la 80 .10-15g (10-15g = 1 femtogram). Microbalana piezoelectric se
bazeaz pe modificarea
frecvenei de rezonan f a oscilaie a unui detector
piezoelectric
ca urmare a modificrii masei m pe cele dou suprafee 2A ale
oscilatorului conform relaiei :
f K

m
2A

(III.20)

unde K reprezint o constant ce ine cont de frecvena de rezonan, de modulul de


forfecare i de densitatea a cuartului .
Din punct de vedere constructiv o piezobalan se compune un sistem oscilator
format dintr-un generator electronic de nalt frecven i un oscilator piezoelectric cu
dou fee planparalele, figura III.19. ce oscileaz pe frecvena de rezonan, denumit cip

Fig. III.19. Schema de principiu a unei piezobalane . 1-piezocuar, 2-matial biologic activ, 3,4
conductori electrici, 5- parte electronic

piezoelectric pe care se depune o componenta biologic activ , fig.III.20a., ca receptor


n msur s duc la interferene cu specia urmrit ceea ce duce la modificri de mas
la suprafaa piezocipului
sesizate prin modificarea frecvenei de rezonan. Peste
microcipurile de cuar cu depunere de biomaterial receptor snt trecute fie cantiti mici
din substana de analizat n flux continuu fie microcipul este scufundat n substana de
analizat unde este meninut un anumit timp

116

a)

b)

Fig. III.20. Apectul celor dou fee ale oscilatorului piezoelectric, a- faa activ pe care se
depunde materialul ce fixeaz specia biologic urmrit, b- faa opus feei active.

Dezavantajul folosirii microbalanei piezoelectrice const n faptul c un cip cu


depunere de receptor poate fi folosit o singur dat , iar frecvena de rezonan este
influentat de variaii de temperatur. Primul dezavantaj nu este major deoarece
depunerea de specie activ receptoare pe cele dou fee ale cip-ului se face uor iar dup
o scurt tarare electronic balana este funcional. Dependena valorii frecvenei de
rezonan de temperatur reclam n schimb termostatri avansate i destul de
costisitoare.

Concluzii Cap. III


In capitolul III snt prezentate in prima parte sintetic cunotinele actuale despre
biosenzorii cu detecie electrochimic, fotoelectric i piezoelectric , iar n partea a 2-a
preocupri i realizri
n domeniu. Se insist n mod deosebit asupra senzorilor
electrochimici i asupra senzorilor fotoelectrici din domeniul rezonanei polasmonice i
cel al determinrii concentraiei pe baza stingerii de fluorescen. S-au prezentat doi
biosenzori portabili cu avantaje deosebite
bazai pe fenomenul de reyonan
plasmonic.

117