- Biochimie analitica – caiet de probleme –

1. Definiți factorul de selectivitate al unei coloane (α) în cazul a 2 specii.

2. Care sunt efectele variației temperaturii asupra cromatogramelor?
3. Care este semnificația termenului de eluție în gradient?
4. Cromatografia cantitativă pe coloană – metode de analiză.
5. Pentru determinarea volumului spațiului gol se utilizează :
a. albastrul de bromfenol;
b. Coomassie Brillant blue;
c. Blue dextran 2000;
d. albastru de metilen.
Precizați caracteristicile unei substanțe utilizabile în determinarea volumului total al unei
coloane.
6. Descrieți succint trei metode de determinare a masei moleculare a unei proteine.
7. Se pregătește o soluție de acrilamidă-bisacrilamidă prin dizolvarea a 7,3 g acrilamidă si 0,2 g
bisacrilamidă în 25 ml apă distilată. Din această soluție se folosesc 2,5 ml la pregătirea unui
amestec de polimerizare cu un volum final de 10 ml.
a. Calculati T% initial și final;
b. Calculati C% initial și final;
c. Gelul obținut se poate utiliza drept gel de concentrare sau de separare?
8. Precizați și descrieți sumar o serie de metode de denaturare utilizate în analiza electroforetică a
unei proteine.
- denaturare cu detergenți (SDS, LDS, CTAB);
- denaturare folosind uree (6-8M);
- denaturare cu clorură de guanidină (6-8 M);
- denaturare folosind agenți reducători ai punților disulfurice : β-mercaptoetanol, ditiotreitol,
ditioeritritol;
- denaturare prin incubare la fierbere.
9. Determinati masele moleculare (lgMM) ale celor doua proteine separate prin PAGE (linia 3).
Markerii moleculari sunt miozina (200 kDa), betagalactozidaza (116 kDa), fosforilaza b (97
kDa), albumina serica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anhidraza carbonica (31 kDa),
inhibitorul tripsinei (21,5 kDa) si lizozimul (14,4 kDa).
10. Se amestecă 28,5 g acrilamidă cu 0,5 g bisacrilamidă și se aduce la 100 ml cu apă distilată
a. Calculați T% si C%;
b. Se realizează un amestec de polimerizare.
11. Definiți Ka si Kav (asemănari/deosebiri).
12. Avantajele eluției în trepte.
13. În cazul cromatografiei în strat subțire în sistem cloroform-butanol 7:3, o proba A se rezolvă
în 2 spoturi intim legate. Expuneți căile/metodele de crestere a rezolutiei.
14. Fenomene de adsorbție nespecifică în cromatografia de gel filtrare – enumerați cauzele
acestui proces.
15. Completați locurile libere. Volumele calculate sunt de 100 ml.
16. Aplicații ale electroforezei în flux liber continuu în separarea celulelor.
17. Calculați log Masa moleculară a unei proteine utilizând relația: log M = -1,10 log a + 6,23,
unde a este panta dreptei valorile experimentale sunt: …
18. Explicați rolul Blue Dextran 2000 în cromatografie. Ce se poate spune despre o proteină care
migreaza odată cu Blue Dextran? Cum se poate crește tR pentru aceasta proteină?
19. Un compus A nu poate fi extras din linia de start în sistemul cloroform-metanol-apă 7:2:1.
Încercați să explicați fenomenul si să gasiți soluția adecvată pentru a produce migrarea acestuia
pe suport.
20. In cazul cromatografiei de schimb ionic se poate vorbi de void volume? Ce proprietăți trebuie
să aibă o substanță pentru măsurarea acestuia?
21. Explicați relația dintre timpul de retenție și volumul de eluție.
22. Gel filtrarea – principiu, aplicatii, avantaje, dezavantaje.
23. Preparați 10 ml gel poliacrilamidă cu T=10% dintr-un amestec acrilamidă-bisacrilamidă
29,2:0,8 g/100 ml. Calculați C%. Calculați volumul de apă știind că amestecul de polimerizare
conține 2.5 ml tampon Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8, 0.1 ml APS 10% ; 0.05 ml TEMED și 0.1 ml
SDS. Care este rolul : APS, TEMED și SDS? Ce fel de gel s-a preparat? Care este rolul său în
separarea electroforetică? Peste acest gel se toarnă un nou gel cu T=4%, dar tamponul utilizat are
pH 6,8. Care este rolul acestui gel? Modificarea lui T% conduce la modificarea C%?
24. Metode de transfer pe membrane și de detectie după transfer.
25. Electroforeza în camp pulsatoriu – principiu, aparatură, utilizări.
26. Definiți sumar următorii termeni: eluție, faza mobilă, faza staționară, constanta de distribuție,
timp de retenție, factor de selectivitate, înălțimea talerului teoretic, rezoluția coloanei, eluent.
27. Descrieți problema generală a eluției.
28. Cum poate fi manipulat factorul de retentie în cazul unui solut?
29. Definiți procesul de alterare a fazei mobile și stationare. Exemple.
30. Descrieți o metodă de determinare a numărului de talere teoretice dintr-o coloană.
31. Caracterizați timpul de retentie și volumul de eluție în cazul unui solut.
32. Descrieți tipul de cromatografie de partiție în functie de starea stationară și mobilă.
33. Două proteine A și B se determină prin focalizare izoelectrică având pIA=7,5 și pIB=8,0.
Cele doua proteine se separă prin cromatografie de schimb ionic. Stabiliți tamponul de eluție și
matricea cromatografică utilizată. Matricea cromatografică : suport Dietilaminoetil (de ex.
DEAE-Sephadex) Soluție tampon : tampon fosfat pH alcalin Eluție în gradient sau în trepte cu
NaCl.
34. Cromatograma de mai jos prezintă modul de separare a doua proteine. Calculați rezoluția de
separare a celor două proteine și factorul de asimetrie al acestora. Care este factorul de trenare?
35. Descrieți succint o metodă cromatografică de determinare a masei moleculare a două
proteine.
36. Amestecul a doua proteine se supune separării prin electroforeză nativă pe un gel de
poliacrilamidă preparat astfel: …
37. Tamponul de migrare utilizat în PAGE este Tris-glicina pH 8,3. Explicați succint rolul
glicinei în separarea electroforetică a două proteine. Dar a SDS?
38. Amestecul a două proteine se separă prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă în prezență
de SDS. Dupa colorare, proteina B conduce la două benzi.
a. Ce se poate spune despre cele doua proteine?
b. Care este rolul SDS?
c. Care este rolul β-mercaptoetanolului?
39. Variabilele cinetice care afectează împrăștierea zonei cromatografice.
40. Utilizarea gel-filtrării la separările de grup ale proteinelor.
41. Rășini schimbătoare de ioni utilizate în cromatografia de schimb ionic a proteinelor.
Caracteristici.
42. Prezentați succint o serie de factori care influențează rezoluția de separare și mobilitatea
electroforetică a unei proteine (se dezvoltă).
43. Aplicații ale electroforezei frontale.
44. Calculul voltajului în sistemele electroforetice pe gel de agaroză submarine.
45. Factorii de care depinde viteza reacției de polimerizare a acrilamidei : bisacrilamidei (se
dezvoltă).
46. Principiul separării proteinelor prin cromatografie de afinitate.
47. Principiul separării proteinelor prin cromatografie de afinitate cu ion de metal imobilizat.
48. Comparați tehnica de separare a proteinelor prin cromatografie de prin cromatografie de
afinitate cu ion de metal imobilizat.
49. Definiți Rf în cromatografie și electroforeză. Prezentați asemănări și deosebiri îngtre cei doi
parametrii.
50. Definiți rezoluția de separare în cromatografie și electroforeză. Prezentați asemănări și
deosebiri îngtre cei doi parametrii.
51. Sisteme utilizate în denaturarea proteinelor în cazul electroforezei.
52. Rezoluția coloanei.
53. Prezentați succint o tehnică de cromatografie pe coloană.
54. Diagrama Ferguson în cazul a două proteine care diferă prin sarcină dar au aceeași
dimensiune moleculara. Ce reprezintă intersecția cu axa OY?
55. Prezentați componentele unui sistem de polimerizare în SDS-PAGE în condiții denaturante.
Descrieți succint rolul fiecărui component.
56. Se prepară un amestec de polimerizare: …
57. Punctul isoelectric al 6 fosfogluconat dehidrogenazei este 6. Explicați de ce tampoanele
folosite în cromatografia pe DEAE-celuloză trebuie să aibă pH mai mare de 6, dar mai mic de 9,
pentru ca enzima să se lege la suport. Se va lega această enzimă la CM-celuloză în același
domeniu de pH folosit pentru DEAE-celuloză? Explicați. În ce domeniu de pH vă așteptați să se
lege această dehidrogenază la CM-celuloză? Explicați.
58. Ce metodă cromatografică este adecvată pentru separarea următoarelor perechi de peptide :
Ala-Ala-Lys și Ala-Phe-Lys?
59. Cunoscând faptul că pI-urile următoarelor proteine sunt:
60. Stabiliți corespondența dintre proprietățile proteinelor prezentate în coloana din stânga și
metodele de separare și purificare prezentate în dreapta.
61. Descrieți succint principiul următoarelor tehnici de cromatografie : cromatografie pe
hidroxiapatită, cromatografia în fază inversă a proteinelor, cromatografia de interacție hidrofobă,
cromatografia de adsorbție tiofilă, cromatografia de schimb ionic. În care din aceste tehnici se
utilizează sulfatul de amoniu? Care este rolul lui? Dar clorura de magneziu și clorura de sodiu?
62. Rolul glicinei în electroforeza multifazică pe gel de poliacrilamidă.
63. Descrieți 3 metode de determinare a masei moleculare în biochimia analitică.
64. Matrici (suporturi) utilizate în cromatografia de schimb ionic.
65. Rolul Blue dextran 2000 în calcularea caracteristicilor unei coloane cromatografice.
66. Descrieți parametrii T% și C% în caracterizarea unui gel de poliacrilamidă.
67. Rolul albastrului de brom fenol în determinarea masei moleculare a proteinelor prin
electroforeză.
68. Principiul electroforezei native în prezență de Coomasie Brillant Blue (BN-PAGE).utilizări.
69. Geluri solubilizabile utilizate în electroforeză. Caracteristici.
70. Definiți factorul de retenție și modalitatea sa de determinare.
71. Talerul teoretic. Definiție și rolul său în determinarea eficienței de separare a unor compuși.
72. Definiți centrii C și P ai unui gel de hidroxiapatită. Rolul lor.
73. Separarea populațiilor de celule prin electroforeză în flux continuu.
74. Agenți de reticulare ai acrilamidei utilizați în electroforeză. Caracteristici.
75. Factorul de întârziere (Rf). Definiție și rolul său în determinarea eficienței de separare a unor
compuși prin electroforeză și cromatografie.
76. Caracteristici ale agarozelor utilizate în separarea proteinelor. Rolul grupărilor încărcate
electric din structura acestora și importanța punctului de topire în utlizarea specifică a acestora.