(5) Limitele de detecfie si de cuantificare

- pentru HPTLC-densitometrie:
- s-au considerat, ca limita de detecfie si de cuantificare, rapoartele semnal/zgomnot
de fond de 3:1 si 10:1; aceste limite au avut urmatoarele valori: LOD = 10 ng/spot $iLQ
= 20 ng/spot pentru tizanidina si LOD = 25 ng/spot si LOQ = 40 ng/spot pentru rofecoxib
ab,
- pentru HPLC
- LOD = 0,01 u.g/mL tizanidina si LOD = 0,10 Ug/mL rofecoxib;
- LOQ = 0,05 jig/mL tizanidina si LOQ = 0,15 (ig/mL rofecoxib.

r belul 8.15 Tebnica adaugarii de standard pentru determinarea tizanidinei (a) si rofecoxj (b) prin TLC - densitometrie si HPLC (n=6)
TLC-densitometrie
HPLC
J3C6S

Conjtout
teoretic
_J?R)

midina
rrTriz.
J
T 30

(6) Specificitatea
- pentru HPTLC-densitometrie: s-a evaluat puritatea picului pentru tizanidina151
rofecoxib, prin compararea spectrelor lor la startul, apexul si finalul pozitiilor spotului; de
exemplu, r(S;M) = 0,9995; 0,9997 si r(M;E) = 0,9992; 0,9996.
- s-a obtinut o buna corelatie (r = 0,9998 si r = 0,9997) intre spectrele standardulu:i?i
probei de tizanidina si rofecoxib.
)S
- pentru HPLC:
- specificitatea acestei metode este prezentata in Fig. 8.26.

Bf

54
L?
60
66
ecoxib
375
0
["xn 675
750
uM^
M20" 825

n<xL
53^

RegSsire

RSD%

SE

Ezces

Confinut
teoretic
(ng)

Regasire

KSD%

SE

99,65
98,56
99,25
100,04

2,50

1,01
9,98
1,23
1,56

0
80
100
120

60
108

120
132

100,26
99,41
99,88
100,57

1,56
2,42
1,65
1,44

1,11

1,84
1,71
1,95

1,23
0,98
1,95

99,62
100,25
100,85
101,21

2,63
2,14
1,56
1,35

1,94
1,38
1,05
0,96

0
80
100
120

750
1375
1500
1650

99,52
100,47
101,98
101,77

1,68
1,65
2,01
1,46

1,14
1,32
1,75
L69

Tabelul 8.16 Validarea parametrilor: datele statistics pentru graficele de calibrate ale

?i : > tawidinei (a) si rofecoxibului (b) prin TLC - densitometrie si HPLC (n=6)
Faranietrnl

.{

,!

;'!

'^

Fig. 8.26. Cromatograma HPLC a probei de tizanidina (50 Ug/mL; Rt = 3,192

0,05) si de rofecoxib (625 fig/mL; Rt= 7,108 0,07) in raport de 1:12,5, masmatah 235 ^,
run; faza mobila: metanol-tampon fosfatpH = 5,5 (55:45 v/v)

Uniantatea
Coeficientul de
corelajie
Limita detecjie
Limita de
cuantificare
Regasirea (n 6)
Precizia (RSD%)
- repetabilitatea
aplicarii"
- rcpetabttitatea
masuratorii*
-preciziainter-zile
(n = 6)
-preciziaintra-ri
Jobustejea
_Specificitatea

HPTLC-densitometrie
Tizanidina
Rofecoxib

Tizanidina

10-1 00 ng/spot

Rofecoxib

100-1500 ng/spot

1 0-200 fig/mL

100-2000 ng/mL

0,99961,15

0,99951,25

0,99971,02

0,99921,52

10 ng/spot

25 ng/spot

0,01 ng/mL

0,05 HK/mL

20 ng/spot

40 ng/spot

0,10 fig/mL

0,15jigfe>L

99,380,63

100,480,70

100,030,50

100,94I,16

1,89

1,26

0,48

0,67

1,85

134

1,65

RobustS
0,9998

Robusta
0,9997

HPLC

1,68
1,23

1,45

RobustS
0,05

Robusta
0.07

~^L

(7) Determinarea regasirii

Ambele metode (HPTLC-densitometrie si HPLC) au fost utilizate pentru extractia
tizanidinei si a rofecoxibului din dozaje farmaceutice, urmata de determinarea lor dupa
adausul de medicament standard; aceste mctode dau regasiri medii de 98-102% pentru
tizanidina si rofecoxib din formule comercializate; regasirile sunt prezentate in tabelul 8.15
(a) si (b), iar datele parametrilor de validate in tabelul 8.16.

352

(8) Stabilitatea in solutia probei

- pentru HPTLC-densitometrie
- din solutia amestecului de tizanidina si rofecoxib, pastrata la temperature camerei
de 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 si 24 h, s-au preparat solutii cu doua concentratii diferite: 30
pot si 80 ng/spot tizanidina si 375 ng/spot si 1000 ng/spot rofecoxib;
- aceste solutii au fost aplicate pe aceiasi placa TLC, iar dupa developare, s-a efectu353

at si evaluat densitograma, datele fiind prezentate in tabelul 8.17, pentru oricare dintre spoturile adi|ionale; nu s-a observat nici un indiciu de instabilitate in solutia probei.
Tabelul 8.17 Stabilitatea tizanidinei $i rofecoxibului in solntii de probe (n=6)

Parametrul

HPTLC-densitometrie *
Rofecoxib
Tizanidina

HPLC"
Tizanidini

Rofecoxib

2887984^36
426241,68
2887421,78426008,31Media ariei
4911,07^978,51
1821,64-1875,36
425911,82
2887998,58
0,12
0,81
1,58
1,25
RSD%
0,09
0,04
1,26
1,14
SE
a
media a 3 concentrafii 30, 50, 80 ng/spot 51 375, 625, 1000 ng/spot peatru flzanidma si rofecoxib
media a 3 concentra|ii 50, 100, 1 50 ng/spot si 625, 1250, 1875 ng/spot pentru tizanidina si rofecoxib
1845,90

4943,60

- stabilitatea spotului: timpul de sedere a probei in solvent inaintea separarii cromatografice poate influenta stabilitatea spoturilor separate si acest lucru trebuie investigat
pentru validare;
- s-a utilizat cromatografia bidimensionala, utilizand acelasi sistem de solvenfi, pentru a
studia eventuala descompunere in timpul spotularii si developarii; de aceea s-a facut developarea bidimensionala, neobservandu-se nici o descompunere in timpul celor doua developari.
- pentru HPLC: din solutia probei s-au preparat solujii cu doua concentratii si
anume: 50 p.g/mL si 100 [ig/mL tizanidina si 625 (ig/mL si 1875 (ig/mL rofecoxib, care au
fost pastrate la temperatura camerei timp de 3 zile;
- aceste solutii au fost injectate in sistemul HPLC; pe cromatograma nu s-a observat
nici un pic in plus, ceea ce indica stabilitatea celor doua medicamente in solutia probei
(tabelul 8.17).
(9) Analiza formelor comerciale
- pentru HPTLC-densitometrie:
- in densitograma probelor de medicament extras din tablete s-au observat spoturile
cu Rf = 0,36 pentru tizanidina si Rf = 0,65 pentru rofecoxib, constatandu-se ca excipienjii
comuni existenti in tablete nu au nici o influenta;
- continutul medicamentelor gasit a fost de:
- 99,40% 1,56 (RSD% = 0,58) pentm tizanidina;
- 99,63% 1,68 (RSD% = 0,64) pentru rofecoxib;
- prin urmare, se poate deduce ca nu are loc nici o degradare a tizanidinei si rofecoxibului in formele comerciale analizate; rezultatele experimentale sunt prezentate in tabelul 8.18;
valoarea redusa a RSD% arata ca aceasta metoda este potrivita pentru analiza de rutina.
- pentru HPLC:
- in cromatograma probelor de medicamente extrase din tablete exists doua picuri la
tj. = 3,19 min pentru tizanidina si la t,. = 7,11 min pentru rofecoxib (Fig. 8.26);
- rezultatele experimentale ale cantitatilor de tizanidina si rofecoxib gasite sunt in
buna concordanta cu valorile declarate de producator, ceea ce sugereaza ca excipientu
prezenti in forma farmaceutica analizata nu interfera determinarea medicamentelor; cantitajile de medicamente gasite sunt:
354

, 99,91% 1,62; RSD% = 0,68, pentru tizanidina;

. 100,16% 1,35; RSD% = 0,71, pentru rofecoxib;
. evaluarea statistics s-a facut folosind testul Student t si raportul F la 95% nivel de
redere (Tabelul 8.18).
-1& Rezultate experimentale.
Parametri
j^JP^ifdeclarat
-&^%SD
"S5%^

HPTLC-densitometrie
Tizanidina
Rofecoxib
2
25
99,401,56
99,631,68
0,58
0,64
0,23
0,26
0,063
0,105
1,093
1,263

HPLC
Tizanidina
2
99,911,62
0,68
0,36
0,315
1,255

Valoarea* t
'^^
^Vaioarea'F
' Valori teoretice pentru t ?i F, care sunt egale cu 2,57 5! 5,05 (p=0,05 sau 95%)

Rofecoxib
25
100,1 61,35
0,71
0,40
0,254
1,278

(10) Compararea HPTLC cu HPLC

- in analiza si controlul tabletelor continand cele doua medicamente s-au preparat 6
"solutii diferite de proba pentru determinarea lor prin HPTLC si HPLC; fiecare proba a fost
: jnalizata in duplicat;
- testele de diferenta dintre HPTLC si HPLC s-au efectuat la un nivel de incredere de
95% (P = 0,05), aplicandu-se doua cai ANOVA pentru testarea ambelor interactiuni
metoda-proba (variatia interactiei) si diferentele in precizia metodei (variatia coloanei);
- deoarece variatia in interiorul celulei (variatia reziduala) este mai mare decat variatia interactiei si decat variatiile coloanei, rezulta ca interactia metoda-proba si diferentele
fiDtre metode nu sunt semnificative;
- pe langa mediile testelor, s-a aplicat si o operatic de test-t; acest test elimina orice
variatie dintre probe;
- valoarea ts(at obtinuta este mai mica decat doua tcrit, ceea ce conduce la concluzia
ca mi este nici o diferenta semnificativa intre medii;
I
- rezultatele celor doua variante (cai) ANOVA si perechea test-t sunt prezentate in
labelele 8.19 si 8.20.
8.9.3. Determinarea prin HPLC a aciclovirului si a impuritatilor inrudite
I
'
;| Aciclovirul este o nucleozida punnica sintetica analoaga, avand o activitate inhiba-toare in vitro si in vivo fata de virusul herpes simplex si virusul varicella-zoster. Are aspectulunei pulberi albe cristaline (M = 225,21), solubila in apa (sub 2,5 mg/mL la 37C),
avand pKa = 2,27 si 9,25 [59].
Determinarea acestui medicament din forme farmaceutice se poate face prin metode
spectrofotometrice (in VIS putin sensibila, sau prin derivare si determinare spectrofotometaca sau prin spectrofotometrie diferentiala), dar mai ales prin HPLC cu detectie UV sau
m
cuplaj cu spectrometrie de masa ' ' '. Insa nici una dintre aceste metode nu se refera la
355

Tabelul 8.19 Doua procedee - teslANOVA ale determinant tizanidinei (a) $i rofecoxibu^
lui (b) in $ase probe independents, duphcatprin HPTLC fi HPLC
HPLC'
HPTLC"
Prima prelucrare
A dous prtjuciarc
Prima prelucrare
A doua prelucrare
(a) DouS procedee test ANOVA pentru dcterminarea tizanidinei
98,16
99,88
1
98,31
98,48
99.64
9939
1
98,94
98,24
98.41
9832
3
99^0
99,91
98,27
98,24
4
98,51
99,26
101.11
101,57
100,31
5
100,48
98,95
98.74
98,66
6
98,45
BPLC
reznmat
HPTLC
ANOVA: factorul 2 cu replicare
6
12
6
NumSr
596.48
1189,67
Sumfi
593,19
99,41333333
99,13916667
Media
98,865
1.551426667
1,125135606
0,74347
Variants
6
12
Numar
6
594,2
1189,76
595,56
SvoB
99,0333333
99,146666667
99,26
Media
1,260186667
0,822806061
Variants
0.51916
12
12
NumSr
1190,68
1188,75
Suma
99,22333333
99,0625
Media
U 17387879
0,616475
Varianja
Valoarca P
d.t
MS
F"
Snrsa
Frt
SS
varimflci
ANOVA
43512500027
I
0,98565727
0,0003375
0,000331
Proba
0,0003375
35
0,700401589
43512500027
1
0,155204167
0,152375
Coloane
0,15520416
942
7
43512500027
0,9009375
0,884520 OJ58188118
!
Intersec0,9009375
071
tie
1,018560833
20
racadrul
20,3712166
7
Total
23
21,4276958
3
HPLC'
Proba
HPTLC'
Prima prelucrare
A doua prelncrare
A dona prelucm e
Prim a prelncrare
(b) Doufi procedee test ANOVA pentm detenninareaTofecoxibului
99.77
99,74
100,35
1
99,42
99,96
99.94
99.86
2
9961
100,78
99,48
100,45
3
100,21
100,84
101,30
100.71
4
100,58
101.62
101,89
101,30
100,81
5
100,87
100.20
100.18
6
99.91
HrLC
Reznmat
HPTLC
ANOVA: factDTul 2 cu icplicarc
12
6
Numar
6
1203,52
602,49
Sumfi
601,03
100,2933333
100.415
Media
100,1716667
0,69907
0,478056667
0,551206061
Varianla
12
6
Numar
6
1206.26
603,84
SunpJ
602.42
100,5216667
0,45844
100,4033333
Media
0376033333
Variant?!
0,333226667
12
12
NurnSr
120633
Suma
1203.45
100,5275
100,2875
Media
0,539947727
Varianta
0,384311364
P
F'
MS
Sursa
SS
varia^ei

r
y vpT[,C ?i HPLC fi corelatia lor prin perechea test t

Proba

B
ii
i

Proba

jSrSiiilsL.
r-"

2
3
4
5

-
r-

~"~~

Media

NvfijiiiL
Mf1'9
rv^pT
"pfrafTvatii (dctci tninfin)
t

Aghga Pearson
pj^g mediei presupusS

7T~~

"wIH

p.(T <; t) o intersectie

jj nintersectie
p (T ^ t) dou8 intersects
i j douiintersecpi

5^

Proba
Jb)Rofecoxib
1
2
3
4
5
6
Media
Testnl t: doni probe
tmperecbeate pentm medie
Media
Varianta
^bservatii (detenninan)
Corelatia Pearson
ffiferenfa mediei presupusa
M.
&
I[L^t)ointer3ectJe

li

0,634905064
0,312816667
0,312816667
Proba
0,701443412
0,3456
03456
Coloanc
0,000135309
6.66666E-05
Intersec6.66666E-05
tic
20
9,853966667
9,853966667
locadrul
10,51245
23
Total
10.51245
* Rezultatele sunt prezentate ca % ale caniiujii declarate de tizanidina pe comprimat
b
F<F0),
c
R czultatclc sunt prezentate ca % ale canlilatii declaiatc dc rofecoxib pe comprimat
" F<FIrt

356

~-~

fnbt

0,434919409
0.412196085
0,990834274

jLd^t^doua intersectii

HPTLC'

HPLC'

98,40
98,59
99,56
98,89
100,40
98,56
99,07
Variabflal

99,02
99,52
9837
98,26
10134
98,85
99,23
Variab3a2

99,06666667
0,596146667
6
0,630454741
0
5
- 0,44510894
0337424859
2,015049176
0,674849718
2,570577635

99^2666667
U81026667
6

HPTLCb

HPLC"

99,58
99,78
10033
100,70
10130
100,05
100,29
Variabilal

100,06
99,91
100,13
100,78
101,76
100,54
100,53
Variabfla2

100,2875
0,4030075
6
0,910988973
0
5
-2,087482734
0,045595459

100,5275
0,4651875
6

HPTLC"
0,091190918

HPLC'

v
!

j 'teuhatele sunt prezentate ca % ale cantiSfii declarate de n'yjmiHinS pe comprimat

JLSHKatele sunt prezentate ca % ale cantita)ii declarate de rofecoxib pe comprimat

357

compusii inruditi, exceptand guanina. Farmacopeile se refera la determinarea aciclovirulyj

si a formei sale - acetat, considerata ca impuritatea A (Fig. 8.27).

Aciclovir

Guaniiii

X-f
Impuritalea C

Impuritatea A

JUCO

f '(
2) Chimicale
| - standardul de aciclovir si impuritati (A, C, F, G, Vir 3, N7), ca si tabletele si exci^pientii (SiO2, talc, stearat de magneziu, povidona, avicel si pumagel) de la CINEA
S^.A., Pamplona, Spania;
- guanina de la Sigma-Aldrich (Steinheim - Germania, NaOH (> 99%) de la Panreac
;:;{Barcelon, Spania), H3PO4 (85%) si CH3CN (de puritate HPLC) de la Merck (Darmstadt
- Gennania), iar apa a fost purificata cu un sistem Milli-Q plus, de la Millipore (Bedford,
I Ma, USA).

Impuritatea F

ImpuritateaVlR.3/4

Impuritalea N'

Fig. 8.27. Stmcturile cbimice ale aciclovirului si ale compufilor inmditi

Prezenta acestor impuritati este importanta, in primul rand, pentru controlul calitatii, iar
in al doilea rand, pentru intarirea drepturilor de patent, deoarece impuritatile pot arata calea sintezei aciclovirului. De regula, este dificila dozarea lor, deoarece este necesara extracts lichida,
urtnata de HPLC, colectarea frac^iei analizate si determinarea prin spectrometrie de masi.
Aciclovirul si guanina sunt foarte polare, putandu-se ioniza usor, de aceea ele se pot
separa pe faza inversa cu cromatografia perechii de ioni, in mediu acid, utilizand decansulfonat. Se stie insa ca analiza cromatografica a perechilor de ioni are unele neajunsuri, cum
sunt: timp mare de echilibrare, interactia putemica a substantelor ce se pot imperechea cu
faza stationara, eliminarea lor dificila din coloana dupa utilizare, ca 51 slaba reprpductibihtate a timpului de migrare; acest ultim aspect este foarte neplacut si ncdorit.
Aceste neajunsuri se pot evita prin utilizarea unor faze stationare noi, cu selectivitati
noi in HPLC cu faza inversa. Obiectivul studiilor acestora, care se dcscriu in continuare,
este acela de a cerceta si experimenta noi coloane pentru separarea impuritatilor aciclovirului, evitandu-se reactivii de imperechere a ionilor.
358

1) Aparatura
. s-a utilizat un echipament HPLC LaChrom Elite dela VWR, alcStuit din:
, o pompa cuaternara;
- un injector automatic;
. un detector la o singura lungime de unda;
- cuptorul coloanei.
- s-au utilizat diverse coloane si faze mobile, validandu-se, in final, metoda cu o
loans SB-CN de la Agilent (150 mm x 4,6 mm si 3,5 Jim), care ofera o separare baseline,
, conditii izocratice, la pH = 3,0 si o durata a ciclului de lucru de 15 min pentru guanini,
iclovir si impuritatea A; in plus, daca se mareste timpul ciclului la 40 min, se pot separa
jclovirul si sase impuritati (guanina, impuritatile A, F, G, Vir 3 si N7) in aceleasi conditii;
- ca faza mobila, s-a utilizat amestecul de tampon A/acetonitril (96:4 v/v), tamponul
|vfiind H3PO4 25 mM, adus la pH = 3,0 cu KOH;
- temperatura cuptorului a fost de 35C; detectia in UV la 254 nm;
- aceeasi coloana ofera separarea tuturor celor sapte impuritati, inclu2and impuritatea
; C care coelueaza cu aciclovirul in conditiile aratate mai sus, cu o faza mobila de H3PO4
& mM (pH = 1,8) / acetonitril (96:4 v/v).

!? 3) Prepararea solutiilor standard

j
Pentru prepararea tuturor solutiilor standard, ca si pentru dizolvarea probelor, s-a uti'faat, ca solvent, faza mobila tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril (96:4 v/v).
'Jeatru prepararea solutiei standard de aciclovir, s-au cantarit exact 40,0 mg substanfa si s: dizolvat inrr-un flacon volumetric (balon cotat) de 100 mL.
Solutiile de impuritati s-au preparat individual, prin cantarirea exacta a cate 10 mg
faibstanta si dizolvarea intr-un flacon volumetric de 250 mL, cu exceptia solutiilor de
S|uanina si aceea a impuritatii Vir 3, care necesita cate 25 mLNaOH 0,1 N. S-a preparat si
Osolutie conjinand toate impuritatile, prin masurarea a cate 0,2 mL din fiecare solutie stoc
tk irapuritate, aducandu-se impreuna la 10 mL cu faza mobila.
Pentru cuantificare, s-a cantarit o cantitate de pulbere de tablets egala cu 53,75 mg,
siiarc s-a adus la 100 mL cu faza mobila; solutia s-a sonicat 5 min si apoi s-a filtrat pe filtre
|A nylon de 0,45 ^m, inaintea injectarii.
4) Validarea metodei
(1) Testarea selectivitatii s-a facut prin efectuarea ciclului cromatografic pe solutii
excipientii specialitatii (formei farmaceutice), in aceeasi cantitate si conditii ca si

359

in cazul probelor, pentru a arata ca nu apare nici un pic la timpii de retentie corespunzatorj
analitilor. Mai mult, s-au introdus, in acest ciclu cromatografic, solutii de standard cu impu.
ritati identificate la nivel de 0,2%, pentru a demonstra rezolutia si selectivitatea metodei.
(2) Parametrii de validare au fost testa^i in doua domenii si anume in domeniul (Je
cuantiiicare a analitilor si in domeniul impuritatilor.
- liniaritatea a fost testata pentru un domeniu mare prin prepararea solutiilor standard la cinci nivele de concentratie (de la 75% la 120% din concentratia analitilor tinta); in
cazul acicloviruhii, concentratiile au fost de la 0,3 mg/mL la 0,48 mg/mL, cantarind exact
fiecare cantitate de aciclovir (de la 30 mg la 48 mg) Intr-un flacon volumetric de 100 ml,
dizolvand si completand la cota cu faza mobila; fiecare punct a fost analizat de trei ori, pentru domeniul scazut de concentrate; solutiile de aciclovir au avut concentratii in domeniul
0,2 p.g/mL la 4 jlg/mL, in timp ce concentratiile guaninei au fost in domeniul 0,2 ug/mL la
20 ug/mL, solutiile guaninei fiind preparate in flacoane volumetrice de 10 mL, adaugand
volvune de solutii standard stoc de aciclovir (0,050-1,00 mL) si de guanina (0,050-2,5 mL)
si completand volumul total cu faza mobila;
- exactitatea (acuratetea), in cazul studiilor efectuate pe produsi medicamentosi, s-a
determinat prin aplicarea metodei analitice elaborate la un amestec sintetic al componentilor medicamentului (forma farmaceutica reconstituita), la care s-au adaugat cantitati
cunoscute de substanta medicamentoasa (aciclovir), pentru a fi analizata; aceasta a fost
repetata la trei nivele de concentratie de 80%, 100% si 110%, in paralel cu cercetarea liniaritatii pentru aciclovir si guanina (principalii componenti); pentru domeniul de joasa concentratie, s-au cantarit 7,0 mg excipienti intr-un flacon volumetric de 50 mL ?i s-au adaugat volume corespunzatoare de solutie stoc de aciclovir pentru a se obtine 0,05%, 020%,
050%, 1,00% si 5,00%; aceste domenii sunt incluse in limita declarata pentru o valoare
limita de acceptanta;
- precizia (fidelitatea); datele preciziei intra-zi s-au obtinut prin analizarea repetata
intr-un laborator, intr-o zi, a 10 parti (portiuni) alicote din proba omogena (pentru domeniul inalt) si a sase parti alicote (pentru domeniul jos), fiecare dintre acestea fiind preparate
independent, conform metodei si standardelor corespunzatoare; s-au obtinut datele pentru
precizia intermediara prin repetarea intra experimentala pe o zi diferita cu solutii proaspat
preparate;
- limita de detectie - LOD s-a evaluat masurand zgomotul de fond (baseline) si calculand concentratia analitului care da S/N = 3;
- limita de cuantificare - LOQ s-a stabilit pentru concentratia de analit care da S/N
= 10; aceasta este totusi numai o abordare, limita de cuantificare fiind stabilita prin
validarea metodei pentru concentratia mai mica;
- factorii de raspuns pentru impuritatile A, F, G, Vir 3 si N7, fata de aciclovir, s-au
calculat prin analiza de 10 ori a amestecului continand impuritatile, plus 0,2% aciclovir:
- stabilitatea standard s-a testat prin analizarea succesiva a aceleiasi probe corespunzand la punctul mediu in studiul liniaritatii pentru 0-3 zile si cu aceeasi faza
mobila; intre ciclurile analitice, solutiile s-au pastrat la temperatura ambianta;
suprafata initials a fost considerata 100%, iar regasirile au fost evaluate in succesiunea zilelor.

360

5) Rezultatc si interpretarea lor

- pentru a obtine o rezolutie adecvata in conditii izocratice, fara a utiliza reactivi forde perechi de ioni, s-au testat diverse faze stationare si faze mobile cu pH diferit; s-au
jtilizat noi faze stationare compatible cu faze mobile 100% apoase si faze stationare polar
juverse, precum polietilenglicol si ciano care pot ajuta sa se evite utilizarea gradientului de
<lutie, cand se face separarea unui amestec de compusi cu concentratii mult variate; acesjuj'ofera un echilibru al retentiei pentru compusi polari si nepolari in faza cromatografica
joverea, cu retentie mai mare pentru compusii polari, in timp ce retentia este mai scazuta
fedusa) pentru compusii hidrofobi;
- au fost testate mai multe coloane, intre care:
- Atlantis d CIS (Waters), o coloana de 250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn, pe baza de
silicagel, faz legata C18 bifunctionala;
- Zorbax SB C18 Aq, 150 mm x 4,6 mm, d = 5 um (Supelco);
- Discovery cyanopropil, de 250 mm x 4,6 mm, d = 5 um, (Supelco), faza legata este
-0-Si(CH3)2CH2CH2CN, particule imbricate (acoperite) cu pori de 180 A;
- aceste coloane au unele caracteristici (in functie de producatqr), intre care: hidrofobicitate scazuta pentru elutia rapida a moleculelor hidrofobe, retentia si separarea
analitilor putemic bazici, compatibilitatea cu faze mobile cu procentaj mare de apa
si stabilitate remarcabila si reproductibilitate mare;
- s-a testat si o coloana foarte diferita si anume: Agilent Zorbax SB-CN, cu acoperire
completa, protejata steric, care este o faza stationara diizo-propil-cianopropil, neacoperita cu pori de 80 A; aceasta coloana a fost incercata in doua marimi: clasica,
de 250 mm x 4;6 mm, d = 5 Jim i o alta, cu lungime mai mica si cu diametm mai
mic al particulelor, considerata, de catre producator, echivalenta cu o coloana de
150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 urn;
- s-a mai testat si o coloana de polietilenglicol - PEG (Supelco), de 250 mm x 4;6
mm si d = 5 |J.m;
- toate coloanele incercate pot fi considerate echivalente in dimensiuni, de?i lucreaza
|a viteze diferite ale fluxului: 1 ml/min pentru coloane de 250 mm x4,6 mm, d = 5 urn si
lux de 0,6 mL/min pentru coloanele de 150 mm x 4;6 mm, d = 3,5 um;
- prima incercare s-a facut pentru a studia efectul pH al fazei mobile, fiind verificate
diferite coloane pentru amestecul de tampon fosfat 25 mM / acetonitril 90:10 si 95:5 (v/v):
Ililizarea tamponului fosfat s-a facut la pH = 3,0, pH = 4,5. si pH = 7,0; incercarile preli-

Fig. 8.28, Influenta pH-ului fazei mobile

asupra separarii aciclovimlui, guaninei
?i impuritatii A pe coloana. Agilent Zorbax
SB-CN (150 mm x 4,6 mm, d = 3,S \im),
cu faza mobila tampon fosfat 25 mM /
acetonitril (95:5 v/v) fi detectia UV la
254 nm

361

minare s-au facut numai cu aciclovir, guanina si impuritatea A, care sunt incluse in metodele
farmacopeii; in Fig. 8.28 sunt date rezultatele pentru coloana Agilent Zorbax SB-CN
(observandu-se tendintele similare pentru cele mai multe coloane), pentru care rezolutia este
crescuta la pH = 3,0, deoarece retentia guaninei descreste usor, ceea ce se poate justifica prin
pK-L = 3,30 a guaninei, deoarece la un pH mai mic, azotul primeste un proton, iar forma ionizata este mai slab retinuta, in timp ce azotul echivalent din aciclovir are pK^ = 2,01;

3..S-

e. 1.5-

- rezultatele pentru faza mobila de tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril 95:5

i i]

1 1*
Impuritatea N7
f "Impuritatea F
[ | Impuritatea A
1 1 '
Skj
.^ Impuritatea Vir 3/4
V

"

xului 0,6 mL/min);

B = Supelco PEG (15.0 mm x 4,6 mm, d = 5 \im, viteza fluxului 1,0 mL/min);
,i|
C = Agilent Zorbax SB-Aq (150 mm x 3 mm, d = 5 (im, flux 1,0 mL/min);
;|t
:
D = Waters Atlantis (250 mm x 4,6 mm, d = 5 |im, flux 1,0 mL/min);
ff
E = Supelco CN (250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn, flux 1,0 mL/min);
!|fj
F = Agilent CN (250 mm x 4,6 mm, d = 5 um, flux 1,0 mL/min);
f|
G = Agilent CN (150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 um, flux 0,6 mL/min);
- coloanele Polyetilenglycol PEG si CN de la Supelco au fost inlocuite, deoarece nu
dau o rezolutie suficienta in aceste conditii; a fost eliminata si coloana Agilent Zorbax SBAq CIS; iar coloana Atlantis (Waters) arata o rezolutie buna, dar un timp de retentie prea
mare pentru impuritate;
- eel mai bun raport si valori ale timpilor de migrare le arata coloana SB-CN
(Agilent), demonstrandu-se experimentul ca cele doua tipuri de coloane, cu dimensiuru de
250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn 150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 um, dau aproape acelasi timp de
retentie, dar lucreaza cu viteze diferite ale fluxului, de 1,0 mL/min si 0,6 mL/min;
- toate impuritatile au fost injectate in coloana SB-CN Agilent, iar Fig. 8.30 arata sep-

Impuritatea C

UL . , ,__. pi ,fi

^.
J V

ft

10

15

20
^
Timp (min.)

:V)

Impuritatea G
/

-. .

/' V

35

Se observa ca impuritatea si aciclovirul coelueaza In aceste conditii, iar marirea cantitatii de apa la 100% nu imbunata^este acest rezultat.
finand seama de valorile pKa, trebuie observat ca, la pH < 2, se poate produce o noua
protonare la azot cu modificarea corespunzatoare a timpilor de retenfie, care poate produce
a oarecare diferentiere. De aceea s-a testat compozitia fazei mobile formata di HgPC^ 25
finM (pH = 1,8) / acetonitril (96:4 v/v) cu coloana SB-CN, care este considerata stabila in
; iceste conditii. in Fig. 8.31 este prezentata separarea obtinuta cu impuritatea C, separata de
jBiclovir si impuritatea Vir 3 care elueaza la un timp de retentie mai mic.

Fig. 8.31. Cromatograma

aciclovirului (0,4 mg/mL),
a impuritatilor inmdite,
toate la 0,2%

Placebo

ararea pentru toate standardele 0,2%;

Timp (min.)

362

'

Fig. 8.30. Cromatograma aciclovirului (0,4 mg/mL) $i a impuritatilor inmdite

10,2% pentru picul principal), pe coloana Agilent - CN (150 mm x 4,6mm, d = 3,5 fim),
'pastrate la 35C; faza mobila: tampon fosfat (pH = 3,0) 25 mM/acctonitril (96:4 v/v),
viteza fluxului 0,6 mL/min, detectie UV la 254 nm; linia cea maijoasa corespunde
excipientilor

4
?

- coloane:
A = Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 urn, viteza flu-

ni
.-vl.

- conditii cromatografice: faza mobila data mai sus, detectie UV la 254 nm;

.Aciclovir

Fig. 8.29. Comportarea comparativa a aciclovirului, guaninei $i a impuritatii

Ape diferite faze stationare

S i
o
~
1
:

as

(v/v) sunt date in Fig. 8.29;

. " '

Guanina
.* ""

'

I1
c,

Q.

Icoloatia SB-CN Agilent de 150 mm

x 4,6 mm, d = 3,5 (im;
faza mobila tampon fosfat 25 mM
(pH = 1,8) / acetonitril 96:4 (v/v);
viteza fluxului: 0,6 mL/min;
detectie UV la 254 nm.

363

Insa impuritatea C provine din sinteza si deci nu este un produs de degradare, de

aceea ea a fost indepartata in materia prima la pH = 1,8, asa cum se poate vedea in Fig
8.32, dar metoda a fost validata la pH = 3,0, mai putin agresiv pentru lucrul de rutini

Validarea acestei metode s-a facut in confonnitate cu ghidurile ICH, cu standarde si

de validare sunt prezentati in tabelul 8.21.
nbelul 8.21 Validarea parametrilor principals pentru aciclovir $i guanina
-

~~

Domeniul de cuantificare
Aciclovir
-rJl^iStea standardelor
^P~
pU
r

-82135
12762i337
0,9996
0,3040-0,4800

Oonffliu
/ino/inn
Ljritateaprobei
toSSpT
-4193
12632I37
p ta
0,999

Timp (min.)

Fig. 8.32. Cromatograma corespunzand la:

(a) aciclovir fi impuritati (guanina pi C) in cantitate de 0,2%;
(b) materia prima 100%.
Cromatograma finala a aciclovir-tablete in conditiile de lucru descrise este prezentati
in Fig. 8.33.

a
a.
I

Timp (min.)

Fig. 8.33. Cromatograma corespunzatoare a aciclovir-tablete la nivel de cuantiGcare;

conditii: - coloana Agilent ciano, 150 ram x 4,6 mm, d = 3,5 um, pastrate la 35C;
- faza mobila: tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril (96:4 v/v);
- viteza fluxului: 0,6 mL/min, detecfie UV la 254 nm,
- picuri: 1 = guanina; 2 = aciclovir; 3 = impuritatea Vir %.
364

I5tod~
99,99
RSD(%)
0,47
proba
99,82
JSD(%>
0,18
Precizia instrumentala
Stasdarde intra-eseu
Media
0,39
(mg/ml)
RS0(%)
0,30
Precizia intermediara
Media
0,39
(mg/ml)
RSD(%)
0,74
Prccizia-instrunientala
Pioba intra-eseu
Media
0,41
(mg/ml)
RSDj%)
0,23
Precizi intermediara
Media
0,41
(mg/ml)
|SD(%)
0,26
Preciziametodelor

Domeniul impnritajilor
Aciclovir
Guanina
0,370,19
1280495
0,99999
0,0002-0,0040

0^80,34
19019i37
0,999998
0,0002-0,0200

0,29iO,13
1279563
0,99997

0,110,29
1876331
0,999996

99,4
1,8
98,7
U

98,4
3,4
96,4
6,7

0,001
n=10

0,002
n=6

0,61
0,001
n=19

0,0002
n=I2

1,3

n=10

n=12
0,42

0,001

0,002
n=6

0,69
n=20

n=6

0,23

n=6

0,51

0,30

0,002

n=12
0,88

n=12
0,62

De subliniat ca standardele au aratat o liniaritate buna si mai ales pentru aciclovir in

domeniul de cuantificare, ca si pentru aciclovir si guanina in domeniul scazut, coeficientii
fc corelatie fiind de peste 0.999. Nu s-a observat nici o oblicitate in dreptele de regresie,
"fcoarece inlerceptii cu limitele lor de incredere includ valoarea zero. De subliniat ca obiec*vul validarii metodei la nivelul impuritatii pentru aciclovir a fost utilizarea dilutiei stantflaidului pentru a cuantifica toate impuritatilc, diferite de guanina, cu factori corespunza!.tori de raspuns, deoarece aceste impurilati nu sunt disponibile de obicei.
Valorile RSD au fost reduse, deci metoda poate fi considerata precisa, atat pentru
'darde, cat si pentru probele de aciclovir. Regasirile nu difera statistic de 100%% (tes365

tul t, p < 0,05); factorii de raspuns sunt dati in tabelul 8.23, pentru diverse impuritJti
apropiate de aciclovir, valorile fiind foarte apropiate de 1, deoarece cromoforul este foarte
asemanator pentru toate irnpuritatile.
TabeM 8.22. Factorii de .raspuns pentru impuritati apropiate de aciclovir
Analitul
Impuritatea A
Impuiitatea F
Impuritatea Vir %
Impuritatea N7-diacetilaciclovir
Impuritatea G

Factoru! de raspuns
0,6974
1,1732
0,9053
0,9459
0,9681

Limita reala de cuantificare a metodei este valoarea cea mai mica a concentratiei $j
ea a fost validate, fiind in toate cazurile egala cu 0,05%. De mentionat ca valoarea ei rezultata dintr-o abordare matematica este de 0,004%. Limitele de detectie au fost de 0,001%
pentru aciclovir si guanina, ele fiind mai mici decat valorilepe care le da metoda.
Standardul a fost stabil pentru ultimele 72 ore de pastrare a solutiei la temperatura
camerei, iar regasirea dupa 3 zile a fost de 100%, cu RSD = 0,83%. Pe de alta parte, desi nu
s-a atins o dovedire formala a robustetii, aceasta metoda a fost aplicata peste sase luni intr-o
formulare farmaceutica si a trecut sistemul de testare pentru a fi considerata potrivita.
8.9.4. Determinarea rapida a colchicinei prin TLC-densitometrie
din medicamente $i extracte vegetale ps!
Colchicina este un medicament utilizat in atacul de guta si este componentul princi-
pal in Colchicum autumnale L., fiind toxica pentru om. Acest medicament inhiba migratia
leucocitelor catre zonele inflamate, intrerupand raspunsul infiamator care provoaca atacul
gutei. Colchicina are si o actiune antimitotica, opunand diviziunea celulelor in metafaza
prin impiedicarea functionarii normale a axului mitotic, care favorizeaza diviziunea
celulelor (nu este totusi un agent antimitotic selectiv).
Se cunosc diverse tipuri de metode de determinare cantitativa a colchicinei: spectrofotometrice, volumetrice, potendometrice, voltametrice, gravimetrica, cromatografice,
fiecare cu avantajele si dezavantajele ei.
Autorii acestei metode au combinat separarea cromatografica pe strat subtire de silicagel cu determinarea densitometrica in situ a compusilor separati; aceasta metoda este
foarte eficienta, rapida, exacta, care elimina interferentele posibile ale altor compusi
apropiati (inruditi) structural.
1) Experimental
1) reactivi: metanol, etanol, cloroform, acetona, de puritate analitica (de la Merck) i
dietilamina (de la Fluka, Switzerland).
2) probe: s-au preparat solutii proaspete de colchicina, in fiecare zi, pastrate la
intuneric s-au colectat seminte de sofran din fanetele din jurul municipiului Cluj-Napoca366

mania, din care s-au obtinut extracte Soxhlet, turboextracte si prin sonicare in etanol de
/. aceste extracte au fost diluate de 10 ori cu apa distilata, iar aceste solutii de lucru au
t injectate 1 sistemul HPLC (20 uL). In experientele TLC s-au aplicat pe placa 5 uX
s]ujje etanolica bruta.
- s-a delerminat colchicina din tablete de 1 mg (declarat) de la Fabiol S.A. Bucuresti
Romania; tabletele au fost catarite impreuna si apoi au fost pulverizate; din pulbere s-a
antarit exact o cantitate cunoscuta intr-un balon cotat si s-a adaugat metanol la cota,
01chicina fiind extrasa prin sonicare, timp de 5 min, iar suspensia a fost centrifugata trei
minute la 5000 rpm; cca 200 uL supernatant s-au diluat la 10 mL cu apa distilata, aceasta
solutie fiind utilizata pentru injectie in sistemul HPLC (20 \iL), iar in experience TLC
s-au'depus cate 5 uJL din aceasta solutie.
3) experience TLC
- separarea TLC s-a facut pe placi (de sticla) de Silicagel 60 si Silicagel 60 F254 cu
ainestec de cloroform /acetona / dietilamina (5:4:1), in camera de developare verticals si
orizontala Desaga, dupa 15 min de saturare;
- s-a realizat o separare unidimensionala cu un parcurs de peste 7,5 cm, cu faza
mobila mentionata mai sus si cu evitarea expunerii la lumina, cat mai mult posibil; sepajarile s-au facut la temperatura ambianta (20-24C) si umiditate de 46-56%;
- detectia s-a realizat, ca de altfel si cuantificarea, prin scanare densitometrica cu un
densitometru Desaga CD60, in reflectanta la 350 nm si fluorescenta (la 254 nm, lampa Hg);
- calibrarea TLC: s-au preparat solutii stoc de 10 mg/mL in etanol; s-au utilizat, in
fiecare din cele trei zile ale validarii, sase standarde de calibrare, de 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 si 0,6
mg/niL; s-au preparat cinci seturi de probe de control, corespunzand la 60%, 80%, 100%,
120% si 140% din 0,3 mg/mL; aceste solutii s-au preparat prin cantariri separate, iar ele au
fost pastrate la intuneric; solutii standard si de control s-au aplicat manual in benzi de 5
mm, utilizand capilare Desaga de 5 |jJL, la 1,5 cm de marginea inferioara a placii.
4) experience HPLC
- s-a utilizat un sistem HPLC HP Series 1100, cu o coloana Zorbax SB CIS (100 cm
*3mm, d = 3,5 (im);
- faza mobila utilizata a fost acetonitril/apa (75:25 v/v), la o viteza a fluxului de 1
mL/min, la temperatura constants, de 42C in timpul experientelor;
- solutiile standard de colchicina in metanol au fost injectate automat (10 uX), iar
detectia s-a facut la 243 si 350 nm;
- timpul de retentie al colchicinei este cca. 2,3 min;
- calibrarea HPLC: s-au preparat solutii stoc separate de 0,505, 0,628, 0,996, 1,802,
2,387 mg/mL in metanol; din fiecare solutie s-au transferal parti alicote de 100 U.L in flacoane volumetrice de 25 mL; parti alicote de 0,2 mL au fost diluate apoi la 5 mL cu apa"
distilata, solutiile obtinute servind pentru injectii HPLC (cate 10 U.L); s-au utilizat doua
abordari diferite: in prima s-au preparat cinci solutii standard de 30,1, 60,2, 120,4, 200,6 si
W,3 ng/mL, iar in a doua s-a cercetat un domeniu de concentratie mai larg, de 30,124.000 ng/mL;
5) determinarea spectrofotometrica
|;f - s-a realizat conform FR X;
;|| - tabletele de colchicina au un continut de 1 mg substanta, iar normativele admit un
367

rf itan part ' determinarea In fluorescenta nu este potrivita in TLC, deoarece colchicina se
6

con|inut de 90%-110% din valoarea declarala;

- pulberea de tablete corespunzand la cca 1 mg colchicina s-a agitat puternic cu 20
mT. etanol 100%, timp de 30 min, dupS care s-a centrifugal 2 min la 2000 rpm;
- 10 mL supernatant s-a diluat la 50 mL cu etanol 100% si s-a masurat imediat
absorbanta la 350 nm; absorbanta pentru o solute 1% si pentru un parcurs de 1 cm este
egala cu 425 la 350 ran.
2) Rezultate si interpretarea lor
1) comportarea spectrala si comatografica a colchicinei i a produsilor sai de
degradare:
- colchicina se degradeaza puternic prin expunere la lumina, produsii sSi de
degradare fiind farmacologic inactivi;
- spectrele de absorbtie sunt complet diferite dupa doua zile de expunere la lumina a
solutiei de colchicina (Fig. 8.34 (a)); datorita diferentelor structurale dintre colchicina i
produsii sai de degradare, comportarea cromatografica se modifica foarte mult (Fig. 8.34 (b)).

'JP

deaza JQ faza ,je excitafie, iar semnalul descreste pentru masuratori succesive; intensemnalului se imbunatateste semnificativ prin utilizarea extinc^iei fluorescerrfei pe
ilaci de silicagel 60 F254.
2) optimizarea picului:
- pentru detectia UV, lungimea de unda este parametrul principal care influenteaza
j JnSltirnea picului; in tehnica extinctiei fluorescentei, lungimea de unda nu se poate
ba din cauza fluorescentei indicatorului de la 254 sau 365 nm;
- alp patru parametri opera^ionali care pot modifica forma picului sunt: largimea (Sw)
si inalpn163 (Sh) fantei luminii de excitatie, viteza de scanare exprimata ca numar de scanari
r punct (nsc) si distanta dintre masuratorile succesive (d^;
- s-a realizat o optimizare pentru cresterea ariei si a inal|imii picului, cercetandu-se
infiuenta celor patru parametri folosind design-ul D optim; matricea confine 11 termeni
model (cu patru parametri, interactiunbile lor si un termen liber); au fost selectionate 18
puncte si douS puncte centrale din 2888 puncte ale design-ului factorial complet, fiecare
jjasuratoare lacandu-se in duplicat; valorile celor patru parametri au fost setate prin propam-densitometru in domeniul indicat in tabelul 8.23;
Tabelul 8.23 Domeniile parametrului pentru desigmil D optim fi valorile lor optimizate

40-

Parametrul
lirpmea deschiderii sw (mm)
lalifimea fentei Sh (mm)
Numar scanari per punct nK (mm)
Distanta dintre doua masuratori dm (mm)

353025-

20

(6)

40

BO

BO

Distanp (ram)

Fig. 8.34. Efectul expunerii la lumina

asupra spectrului (a) si comportarea.
cromatografica (b) a colchicinelor (-)
fi a produsilor de degradare ()

100

350

300

350

400

450

500

550

X(nm)

Optimizat
0,2
3
16
0,1

Domeniul
0,04-0,4
0,4-3
2-16
0,05-0,2

- modelul a fost ajustat prin regresie multiliniara (MLR), constatandu-se o corelatie

destul de buna intre valorile prevazute si observate ale ariei (Fig. 8.36 (a), R2 = 0,8720, Q2
=0,7645, reproductibilitatea = 0,8984) si inaltimii (Fig, 8.36 (b), R2 = 0,9314, Q2 = 0,9051,
Kproductibilitatea = 0,9913) picurilor;
: - s-a stabilit ca efectul principal il are numarul de scanari / punct pentru evaluarea
iriei si inaltimii, probabil din cauza intarzierii emisiei. prin cresterea numarului de scanari
MSC, creste si inaltimea picului;

Fig. 8.35. Spectml de fluorescenfa aJ

colchicinelor: excitatie (-) $i emisie

- datorita marii sensibilitati la lumina a colchicinei, nu este posibila decat o singura

scanare densitometrica, dupa fiecare scanare picul fiind mai mic, de aceea nu se poate efectua o cromatografie bidimensionala pentru a face o separate mai buna; in aceste conditii,
valoarea R f = 0,65 a colchicinei, iar pentru derivatul expus la lumina. Rf = 0,83;
- din cauza dificulta|ii de a man selectivitatea si sensibilitatea detectiei, s-a masurat
spectrul de fluorescenta al colchicinelor (Fig, 8.35); colchicina are o fluorescenta naturala,
dar intensitatea semnalului este mult mai mica in comparatie cu absorbanta in UV; pe de

Pre2ds

Fig. 8.36. Aria (a) $i inaltimea (b) picurilor, observate (b) y; prevazute (a),
pentru ajustarea MLR

369
368

- un alt parametru important este inaltimea fantei care afecteaza rezultatele in acelai
mod ca si n^, dar al|i doi parametri au o influents mai mica decat ceilalti, chiar daca ei sunl
statistic semnificativi;
- dupa optimizarea discutata, au fost alesi parametrii de scanare asa cum se observa
din tabelul 8.23.
;,;

i,
3) Validarea metodei

. ft

(1) Validarea TLC s-a facut utilizand ariile si inaltimile picurilor separate in dome.
niul 0,1-0,6 mg/mL, rezulta o regresie polinomiala de gradul doi, atat pentru reflectanta,
cat si pentru fluorescenta (Fig. 8.37), dar din pacate nu s-a atins o liniaritate intre semnalul
masurat si cantitatea de'colchicina aplicata, nici chiar pentru un domeniu ingust de concen- ;
tratie;
''i

lul 8 24 Exactitatea testarii colchicinei. Datele graficelor de calibrare

$~

TTdetoda

Aria "
a
b
c
-4587,6
8088,3
68,063
j^efiectanta
R7=0,9987
2
-4324,1
28653X
p^orescis^ -9596x
2
R =0,9995
t^fbrm cu aria = a (cone/ + b (cone) + c
k
Conform cu inalfimea = a (cone) + b (cone) + c
n=6
<n=5
;jedeteclie__

inaltimea
b
a
-2688,9x2
3532^x
R2=0,9997
-13956x2j 18787x

c
9,1633
-2254,7

- curbele de calibrare au fost preparate triplicat in trei zile diferite, aplicind cate 5 |iL
/fin fiecare solutie standard; au fost determinate ariile picurilor probelor de control si necunoscute $i s-au calculat concentratiile in acord cu aria picului, aria = f(c), pentru reflectanta si flu^escenta, deoai'ece panta lor este cea mai mare in domeniul de concentratie ulilizat;
- exactitatea metodei s-a evaluat folosind cinci probe de control si utilizand ariije picurilor determinate pentru calcularea regasirii (Tabelul 8.25).
Tabelul 8.25 Exactitatea testarii colchicinei
Reflectanta

(a)

02
0'.3
0.4
05
Concentratia (mg/nU)

0.3

0.4

0.5

Concentrajia (mg/rol)

0.6

0.3

02

0.4

0.5

Nominal
mg/ml

Regasire %

Procent %

60

0,18

80
100
120
140

0,24
0,30

98,70
104,44
102.44
97,87
99,76
100,64

60
80
100
120
140

O.G

ConcenUaJia (mg/ml)

0.3

0-4

Concentratia (mg/ml)

fig. <?J7. Calibrarea neliniara a colchicinelor

in reflectanta (a) fi in extinctia fluorescentei (b)
- datele curbelor de regresie in reflectan$a si in fluorescenta pentru arie si pic sunt
date in tabelul 8.24;

Fluorescenta

Procent %

Media
regiisirii%
RSD%
Test
Cocbran
lest Fischer
Interval
de incredere
[195%)

036

0,42

CW0.273
F^=0301

7,67
C(0,05;5;2)=0,68

F(0,05;4;14)=3,48
100,644,28

Test
Cochran
Test Fischer
Interval
de Incredere
(95%)

Nominal
mg/ml
0,18
0,24
0,30
0,36
0,42

Regasire %
114,44
92,08
105,66
103,98
99,12
103,03

0^= 0,644
Flc=0,68S

8,52
C(0,05;5;2)=0,68

F(0,05;4;14)=3,4g
104,605,70

Au fost masurate trei serii de probe de control, preparate in trei zile diferite ale validarii.
- precizia: au fost calculate repetabilitatea intra-zi si precizia intermediara in zile diferite,
Jfecinciconcentratii (0,18, 0,24, 0,30, 0,36, 0,42 mg/mL), exprimate ca RSD%; in tabelul 8.26
suit prezentate mediile a trei determinari (n = 3) efectuate pentru fiecare concentratie
Tabelul 8.26 Parametrii de fidelitate
i^WKtni de fidelitate
paetabilitatea (RSD)
Uaroductibilitatea (RSD)

Reflectanta
3,62
11,29

Fluorescenta
8,26
9,99
371

370

M K

5 - utilizand HPLC, s-a cercetat influenta tehnicii de extractie prin compararea celei
ai exhaustive metode Soxhlet (2,5 h) cu tehnica de extractie cea mai rapida, cum este
irboextractia la 6000 rpm, timp de 5 minute si sonicare (30 min.).
(3) Determinarea spectrofotometrica s-a facut urmand protocolul descris in FR-X
determinarea colchicinei din tablete, singura forma disponibila cu continut de
a in Romania; rezultatele au fost foarte asemanatoare cu cele obtinute prin metopLC-densitometrie si HPLC propusa; datele experimentale obtinute sunt prezentate in
tabelul 8.30; aceste rezultate arata o eroare de + 3% fata de valoarea farmacopeii ( 10%).

- limita de detectie - LOD si cea de cuantificare - LOQ au fost exprimate ca

nale pe baza deviatiei standard (Sb) a raspunsurilor blancului: LOD = 3Sb, iar LOQ = 10$,
aceste semnale au fost transformate in termeni de concentratie, utilizand dreapta de calj,
brare pentru reflectanta, deoarece ariile picurilor sunt func^ii de concentratie, astfel ca:
- ariile = f(c) si deci:
- LOD = 0,0021 mg/mL;
- LOQ = 0,027 mg/mL;
- deviatia standard a blancului, Sy, s-a determinat masurand sase solutii blanc (n =
6), ceea ce a fost posibil in reflectanja, dar nu si in fluorescenja;
- ca probe reale, s-au luat tabletele de colchicina si semintele de sofran (din pasuni)
din care s-a determinat continutul in colchicina, dupa tratarea probelor in modul descris
mai sus; rezultatele sunt date in tabelul 8.27.

Tabelul 8.30 Rezultatele determinarii spectrofotometrice a colchicinei din comprimate

Colchicina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)
frnbe
^cfrpfotometrie
1,030

Tabelul 8.27 Detenninarea colchicineiprin TLC - densitometrie

Probe
Colchicina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)
Semite cu colchicina; extractie Soxhlet (mg/lOOg)

TLC
1,03 0,028
0,438 0,022

(2) Validarea HPLC s-a facut pentru domeniul de concentratii 30,1-401,3 ng/mLale
solutiilor de colchicina; aceste cantitaji au fost injectate in sistemul HPLC pentru a se evalua liniaritatea detectorului; s-a lucrat, de asemenea, si intr-un domeniu mai mare de concentratie, de 30,1-24075,7 ng/mL; in ambele cazuri, inaltimea picului a fost reprezentata
grafic functie de concentratia solutiilor injectate, inregistrandu-se raspunsul care a fost
liniar (r > 0,999) (tabelul 8.28).
Tabelul 8.28 Datele graGcelor de calibrare
Detectia (nm)
Panta

30,1 - 401,3 ng/mL

350
243
0,0650
0,1246
-0,0194
-0,2687
0,9997
0,9988

30,1 - 24075,7 ng/mL

350
243
0,0726
0,1367
0,4033
2,0702
0,9999
0,9999

- probele de tablete si material vegetal au fost masurate la 350 nm, iar ariile picurilor
au fost utilizate pentru calcularea concentratiilor lor, folosind curba de calibrare in domeniul 30,1-401,3 ng/mL; datele experimentale sunt prezentate in tabelul 8.29.
Tabelul 8.29 Rezultatele pentm comprimatele de colchicina fi extracte
Probe
Colchicina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)
Semiiije cu colchicina (mg/lOOg)
Turbc extractie
Sonic are
372

HPLC
1,016
0,530
0^79
0,481

1. Marius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean,, Analiza ?/ controlul
medicamentehr, Vol. 1 p. 439-450 si Vol. 2 p. 26, Ed. Intelcredo, Deva, 2003
2. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza $i
control, Ed. Medicals, Bucuresti, 1998, p. 168-210
3. Bartolincici A., Druskovic, Sporec A., Vmcovic, /. Pharm. Biomed Anal., 36 (2005),
1003-1010
; 4 R.K. Bush, J.W. Georgitis, Handbook of Asthma and Rhinitis, first ed., Blackwell
Science Ltd., Abingdon, England, 1997
5 J. Rosenberg, P. Larson, L. Nyborg, J. Clin. Pharmacol. 49 (2000) 199-206
6K.H. Kim, H.J. Kim, E.Y. Jeun, S.H. Seo, S.P. Hong, J.S. Kang, J.R. Youm, S.C. Lee,
I
Arch. Pharm. Res. 24 (2001) 281-285
7D. Handley, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (1998) 2027-2041
8 D.W. Boulton, J.R Fawcet, Am. J. Respir. Med. I (2001) 1-7
9 J. Ahlner, R.G.G. Anderson, Eur. Respir. J. 13 (1999) 1230-1235
10R.P. Bakale, S.A. Wald, H.T. Butler, Y. Gao, Y. Hong, X. Nie, C.M. Zepp, Clin. Rev.
Allerg. Immun. 14 (1996) 7-35
11Y.K. Tan, S.J. Soldin, J. Chromatogr. 422 (1987) 187-195
12H.Y. Aboul-Enein, V. Serignese, Chirality 7 (1995) 158-162
13 R. Dhand, M. Goode, R. Reid, J.B. Fink, P. Jahey, M.J. Tobin, Am. J. Respir. Crit. Care
Med. 160(1999)1136-1141
14 W. Boulton, IP. Fawcett, J. Chromatogr. B 672 (1995) 103-109
15 R. Berges, J. Segura, X. Torre, R. Ventura, J. Chromatogr. B 723 (1999) 173-184
16 K.B. Joyce, A.E. Jones, R.J. Scott, R.A. Biddlecombe, S. Pleasabce, Rapi Coomun.
Mass. Spectrom. 12 /1998) 1899-1910
!7 K.M. Fried, P. Koch, J.W. Wainer, Chirality 10 (1998) 484-491
*8 G.A. Jacobson, F.V. Chong, N.W. Davies, J. Pharm. Biomed. Anal.31 (2003) 1237-1243
- Tang, Cgirality 8 (1996) 136-142
373

20 D.W. Boulton, J.P. Fawcett, Clin. Pharmacokinet. 40 (2001) 23-40

21 S. Palmarsdottir, L. Mathiasson, J.A. Jonson, L.-E. Edholm, J. Chromatogr. B 6gg
(1997) 127-134
22 K. Tachibana, A. Ohnishi, J. Chromatogr. A 906 (2001) 127-154
23 C. Yamamoto, E. Yashima, Y. Okamoto, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 12583-12589
24 M.P. Gasper, A. Berthod, U.B. Nair, D.W. Armstrong, Anal. Chem. 68 (1996) 25012514
25 C. Karlsson, L. Karlsson, D.W. Armstrong, P.K. Owens, Anal. Chem. 72 (2000) 43944401
26 E. Yashima, J. Chromatogr. A 906 (2001) 105-125
27 Necraj Kaul, Dhaneshwax I.R., et al., J. Pharm. Biomed. Analysis 37 (2005) 27-38
28 P. Koch, D.R. Hirst, B.R. von Wartburg, Xenobiotica 19 (1989) 1255-1260
29 F.L.S. Tse, J.M. Jaffe, S. Bhuta, Fundam. Clin. Pharmacol. 1 (1987) 479-485
30 M.K. Shellemberg, L. Groves, J. Shah, G.D. Novak, Drug Metab. Dispos. 27 (1999)
201-205
31 V. Healzlewood, P. Symonyw, P. Maruff, MJ. Eadie, Eur. J. Clin. Pharmacol. 25 (1983)
65-72
32 J. Lee, J.H. Seo, D.H. Kim, Analyst 127 (2002) 917-920
33 L.J. Jackman, T. Jen, J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 2818
34 B. Raman, D. Patil, Indian Drugs 39 (2002) 392-394
35 M.L. Qi, P. Wang, L. Wang, Anal. Chim. Acta 478 (2003) 171-177
36 K.R. Mahadik, A.R. Paradkar, H. Agrawal, N. Kaul, J. Pharm. Biomed. Anal. 33 (2003)
545-552
37 J.R. Vane, R.M. Botting, Inflamm. Res. 4 (1995) 1-10
38 H.R. Herschman, Biochim. Biophys. Acta 1299 (1996) 140-155
39 D.E. Griswold, J.L. Adams, Med. Res. Rev. 16 (1996) 181-206
40 M.C. Allison, A.G. Howatson, C.J. Torrance, F.D. Lee, R.I. Russell, N. Engl. J. Med.
327 (1992) 749-754
41 Y. Harada, K. Hatanaka, M. Kawamura, M. Saito, M. Ogino, M. Majima, T. Ohno, K.
Ogino, K. Yamamoto, Y. Taketani, Prostaglandins 51 (1994) 19-333
42 P. Prasit, Z. Wang, C. Brideau, C.C. Chan, S. Charleson, Bioorg.Med. Chem. Lett. 9
(1999) 1773-1778
43 E. Woolf, I. Fu, B. Matuszewski, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 730 (1999) 221227
44 C.Z. Matthews, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. A 949 (2002) 83-89
45 C.M. Chavez-Eng, M.L. Constanzer, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Biomed. Sci.
Appl. 748 (2000) 31-39
46 U. Werner, D. Werner, R. Mundkowski, M. Gillich, K. Brune, J. Chromatogr. B Biomed.
Sci. Appl. 760 (2001) 83-90
47 C.M. Chavez-Eng, M.L. Constanzer, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Analyt.
Technol. Biomed. Life Sci. 767 (2002) 117-129
48 T. Radhakrishna, D. Sreenivas Rao, G. Om Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal. 26 (2001)
617-428
49 S. Sattari, F. Jamali, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 3 (2000) 312-316
374

'"In pT. Vallano, R.S. Mazeno, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Analyt.
' Technol Biomed Life Sci 779 (2002) 249-257
51 M-K- Aravind, R. Prescilla, J.R Ofenstein, J. Chromatogr. Sci. 40 (2002) 26-28
_ g Mao, A. Abrahim, Z. Ge, O.K. Ellison, R. Hartman, S.V. Prabhu, R.A. Reamer, J.
Vyvratt, J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 1101-1113
I 53 K V.K. Reddy, J.M. Babu, P.K. Dubey, B.C. Sekhar, G. Om Reddy, K.J. Vyas, J. Pharm.
Biomed. Anal. 29 (2002) 355-360
54 *** Indin Pharmacopoeia,Government of India, Ministry of Health and Family,
Welfare, vol. II, appendix 13, A-147, 1996
55 *** ICH, Q2A, Harmonised tripartite guideline, text on validation of analytical procedures, IFPMA, in: Proceedings of the International Coference on Harmonization,
Geneva. March 1994, pp. 1-5
55 *** ICH, Q2B, Harmonized tripartite guideline, validation of analytical procedure:
methodology IFPMA, in: Proceedings of the International Conference on
Harmonization, Geneva, March 1996, pp. 1-8
57 P.D. Sethi, High Performance Thin Layer Chromatography, Quantitative Analysis of
Pharmaceutical Formulations, CBS Publishers and Distributors, New Delhi, 1996
58 J.C. Miller, J.N. Miller, Statistics for Analytical Chemistry, second ed., Ellis Horwood,
New York, 1992
59A.L. Huidabro, F.J. Ruperez, C. Barbas, J. Pharm. Biomed. Analysis, 37 (2005) 687-694
60 K. Balon, B.U. Riebesehl, B.W. Muller, Pharm. Res. 16 (1999) 882-888
61 K. Basavaiah, H.C. Prameela, Farmaco 57 (2002) 443-449
62H.G. Daabees, Anal. Lett. 31 (1998) 1509-1522
63 M.S. Mahrous, M.M. Abdel Khalek, H.G. Daabees, Y.A. Bellagy, Anal. Lett. 31 (1992)
1491-1501
64 G.C.K. Battermanru S. Heizenroeder, D. Lubda, Labor Praxis 30 (1998) 32-34
65 Y. Pramar, V. Das Gupta, T. Zerai, Drug Dev. Ind. Pharm. 16 (1990) 1687-1695
66 S.S. Dubhashi, P.R. Vavia, Indian Drugs 37 (2000) 464-468
67 E. Kourany Lefoll, T.D. Cyr, Ca. J. Appl. Spectrosc. 40 (1995) 155-159
68 A.M. Kamel, P.R. Brown, B. Munson, Anal. Chem. 71 (1999) 5481-5492
69 D.S. Ashton, A. Ray, Anal. Proc. 30 (1993) 44-46
70 *** The Official Compendia of Standards, U.S. Pharmacopeia National Formulary, 2004
711. Chappel, LC GC Int. 7 (1994) 282
72 K. Okusa, H. Tanaka, M. Ohira, J. Chromatogr. A 869 (2000) 143-149
73 W. Pleiderer, Ann. Chem. 647 (1961) 167
74 *** ICH, ICH Harmonised Tripartite Guideline, 1995, p. 1
75 *** ICH; ICH Harmonised Tripartite Guideline, 1996
76 *** ICH, ICH Harmonised Tripartite Guideline, 1996
77 *** ICHj 1CH Harrnonised Tripartite Guideline, ICH topic Q2B, 1996
78 E. Bodoki, R. Oprean, M. Tamas, R. Sandulescu, J. Pharm. Biomed Analysis, 37 (2005)
971-977
79 J.M. Schmit, Bull, Trav. Soc. Pharm. Lyon 12 (1968) 31-40
80 M.S. Karawya, A.M. Diab, J. AOAC 58 (1975) 1171-1173
81 *** Farmacopeea Romana, X ed., Editura Medicala, Bucuresti, 1998
375

82 *** European Pharmacopoeia, fourth ed., Directorate for the Quality of Medicines of
the Council of Europe, 2002
83 P.M. Bersier, J. Bersier, Electroanalysis 6 (1994) 171-191
84 J. Wang, M. Ozsoz, Talanta 37 (1990) 783-787
85 *** French Pharmacopoeia, seventh ed., Commission Pennanente de la Pharmacopee,
Paris, 1965
86 A. Poulev, B. Deus-Neumann, E. Bombardelli, M.H. Zenk, Planta Med. 60 (1994) 77-83
87 T.M. Sarg, M.M. El-Domiaty, M.M. Bishr, O.M. Salama, A.R. El-Gindy, Analyst 114
(1989) 575-578
88 *** The United States Pharmacopeia 24 / The National Formulary 19, United States
Pharmacopeia Convention Inc., 2000
89 M. Al-Fayyad, F. Alali, A. Alkofahi, A. Tell, Nat Product. Lett 16 (2002) 395-400

CAP. 9. CRITERII STANDARD DE VALID ARE

APLIC ATII LA DETERMINAREA IN UV A VITAMEVEID3
DIN VITAMINOL, DUPA SEPARAREA El PRIN HPLC

9.1. Criterii standard de validate

Daca un laborator utilizeaza o anumita rnetoda de analiza, el trebuie sa aiba o documentatie sigura ca metoda a fost validata in mod corespunzator, iar responsabilitatea in
aceasta privinta revine in intregime utilizatorului, care trebuie sa se asigure ca metoda de
analiza corespunde cerintelor. Acest lucru este valabil atat pentru metodele standard (de la
EPA, ASTMA, ISO sau USP), cat $i pentru metodele elaborate intern (In cadrul propriului
laborator).
Pentru o metoda standard trebuie sa se verifice daca datele/parametrii validati (de
exemplu, matricea probei, liniaritatea, domeniul, limitele de detectie si de cuantificare etc.)
sunt concordante cu cerintele tipului de analize ce se fac in laborator; daca acestea nu concorda, este necesara validarea metodei standard in conditiile caracteristice laboratorului,
ntilizand criterii proprii.
In cazul In care, Jn documentatia unei metode standard, nu exista nici o indicatie
teferitoare la tipul $i rezultatele validarii, se recomandJ efectuarea unei validari complete.
In general, pentru fiecare metoda de analiza trebuie sa fie definite domeniile de ope1816
(aplicare), pe baza experientei privind metode similare sau acestea se cerceteaza in
Otnpul elaborarii unei metode. Aceste domenii trebuie sa fie verificate in timpul validarii
, fnn studii de robustete, care sunt parte componenta a caracteristicilor metodei.
Revalidarea se face atunci cand se modifica metoda sau una din conditiile de lucru.
;* exemplu, daca o coloana lucreaza la 40C si a fost validata la aceasta temperatura, daca
376

377

apoi se lucreaza la 41C sau la o alta temperatura, este necesara revalidarea.

Aceasta este necesarS. si in cazul in care se modifica matricea probei sau daca se
schimbS tipul instrumentului si, implicit, caracteristicile tehnice esentiale ale acestuia (de
exemplu, daca in HPLC se modifica pompa, respectiv volumul ei).
in sfarsit, daca testele de acceptare ale unui sistem sau rezultatele analizei pentru controlul calitatii nu se incadreaza in criteriile de acceptare sau cand nu poate fi identificata
sursa erorilor, este, de asemenea, necesara revalidarea partiala sau totala.
Asa cum s-a mai aratat, parametrii pentru validarea metodelor de analiza au fost
definiti de ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for
the Registration of Analytical Procedures, 1995 si 1996) pentru aplicatii farmaceutice, ca
si de catre reprezentantii industriei si ai agentiilor de supraveghere din Europa, SUA,
Japonia. Acesti parametri sunt:
- specificitatea;
- selectivitatea;
- precizia:
- repetabilitatea (inclusa in documentele ICH);
- precizia intermediara (inclusa in documentele ICH);
- reproductibilitatea (inclusa in documentele ICH);
- exactitatea;
- caractcrul adevarat (exact);
- oblicitatea;
- liniaritatea (inclusa in documentele ICH);
- domeniul (inclus in documentele ICH);
- limita de detectie (inclusa in documentele ICH);
- limita de cuantificare (inclusa in documentele ICH);
- robustetea sau soliditatea (inclusa in documentele ICH).
Specificitatea este caracteristica metodei de analizS care da raspuns pentru un singur
analit. Exista insa foarte putine metode care dau un singur raspuns pentru un analit, deci un
semnal specific unui singur analit
Selectivitatea se refera la o metoda care da un raspuns (semnal) pentru un numar
mic de specii cbimice (analiti), care pot sa fie sau nu diferentiate Una de alta. De aceea,
selectivitatea este utilizata mai mult decat specificitatea (care exista, de exemplu, in cazul
electrozilor-enzima). Selectivitatea include si cazurile in care o metoda permite masurarea
cu exactitate a unui analit, in prezenta unor interferenti, cum sunt polimerii sintetici, enantiomcrii, excipientii si produsii de degradare cunoscuti care pot fi prezenji in matricea
probei.
In cromatografia de lichide, selectivitatea se asigura prin alegerea optima a coloanei
(fazei stationare) si a conditiilor de lucru, cum sunt compozitia fazei mobile, temperatura
coloanei si lungimea de unda la care lucreaza detectorul.
In schimb, este greu de precizat care dintre picurile unei cromatograme este pur ?i
care corespunde mai multor componente. de aceea, in prezent se utilizeaza detecton spectroscopici cuplati direct cu cromatograful (cu coloana capilara a acestuia).
Asa, de exemplu, detectorii UV/VTS cu diode in serie (barete de diode) si spectrome378

frele de mas5 pot prelucra toate picurile unei cromatograme (evident, pe rand, pe masura
componentii parasesc coloana cromatografica) si ofera spectre complete ale intregii crofflatograme.
Spectrele obfinute in timpul eluani unui pic sunt normalizate si suprapuse pentru
zentarea grafica si pentru a vedea daca, in spectrele astfel prelucrate, picurile corespund
C eel putin doi compusi. fn Fig. 9.1 se dau exemple de puritate a picurilor in HPLC.

pur

limp (min)

Fig. 9.1. Exemple de picuri HPLC:

pur fi impur (a) fi spectrele UV
corespunzatoare (b)

Daca semnalul cromatografic nu arata impuritati, evaluarea spectrala identifies picul

dia stanga ca fiind impur. Nivelul impurita{ilor ce pot fi identificate astfel, prin aceasta
metoda, depinde de diferentele spectrale, de performantele detectorilor si de algoritmul
software. In conditii ideale, se pot detecta 0,05 - 0,1% impuritati. In ceea ce priveste principiul detectie in HPLC cu serii de diode, aplicatiile si limitarile privind puritatea picurilor
sunt descrise in literatura.
Precizia unei metode este intervalul cu care concords rezultatele testului individual
sau al unor serii multiple de mjectari de standarde. In fond, precizia caracterizeaza concordanja dintre rezultatele masuratorilor individuale sau a masurStorilor seriilor multiple de
injectari.
Deviatiile standard masurate se pot imparti in trei categorii: ale repetabilitatii, ale
repetabilitatii intermediare si ale reproductibilitatii. Repetabilitatea se refera la repetarea
delerrainarilor (masuratorilor) sau aplicarca lor, in cadrul unui laborator, de catre un singur
analist (operator), cu un singur tip de echipament (aparat), intr-un interval de timp scurt.
Trebuie sa se efectueze eel putin:
- 5 sau 6 determinari;
- din 3 matrice diferite;
W - 2 sau 3 concentratii diferite.
Pentru toate aceste determinari se calculeaza deviatiile standard.
379

Criteriile de acceptare (sau acceptanfa) depind mult de tipul de analiza, de matrice

etc. Astfel, pentru analiza unor compusi in controlul fannaceutic de calitate, se poate obtine
usor o precizie buna, cu RSD < 1 %, dar pentru probe biologice cu matrice complexe si concentratii de analit mult mai mici, precizia si deci RSD sunt de ordinul a 16% pentru concentrajii limita si 10% pentru alte concentratii. Precizia poate varia intre 2% si 20% sau
chiar mai mult.
In literature se vorbeste despre precizia intermediara, concept defmit de ICH
(1996), prin care se intelege variabilitatea pe termen lung a masuratorilor. Ea se evalueaza
prin compararea rezultatelor metodei de analiza utilizati intr-un singur laborator timp de
mai multe saptamani.
Precizia intermediara a unei metode poate reflecta si diferentele dintre rezultatele
obtinute de analisti diferi^i, cu instrumente diferite, cu standarde si reactivi proveniti de la
furnizori diferiti, cu coloane din loturi diferite sau poate reflecta diferentele determinate de
dot sau mai multi factori din cei mentionati.
Reproductibilitatea, definita de ICH, exprima concordanfa dintre preciziile obtinute
de laboratoare si ea permite sa se evalueze si sa se verifice daca metoda conduce la aceleaji
rezultate daca este aplicata in laboratoare diferite, deci in conditii usor diferite.
Reproductibilitatea unei metode analitice se determina prin analizarea unor portiuni
alicote din loturi omogene, in laboratoare diferite, de catre analisti diferiti, utilizand
aparatura diferita si in conditii de mediu ce pot diferi de la un laborator la altul, care trebuie sa ramana in parametrii specificaji ai metodei (teste interlaboratoare). In tabelul 9.1
sunt date unele varia|ii ce pot afecta reproductibilitatea metodei.
Tabelul 9.1. Variatii care pot afecta reproductibilitatea metodei
- diferente ale temperaturii si umiditatii camerei (laboratorului);
- diferenta dintre experienta si constiinciozitatea analistilor;
- echipamente cu caracteristici diferite, cum este volumul ramas (intarziat) intr-un sistern HPLC;
- variatia conditiilor materialelor si aparatelor, cum este, de exemplu, compozi|ia fazei
mobile in HPLC, pH-ul, viteza de curgere etc.;
- vechimea echipamentelor si a materialelor consumabile;
- coloane din surse diferite de aprovizionare;
- calitatea diferita a solventilor, reactivilor si a altor materiale.

Validarea reproductibilitajii este importanta daca o metoda trebuie sa fie utilizata

in laboratoare diferite.
Exactitatea unei metode exprima concordanta intre rezultatele obtinute prin metoda
analizata si valoarea acceptata ca fiind adevarata.
Valoare adevarata, pentru o exactitate impusa, se poate obtine in cateva moduri:
- o cale consta in a compara rezultatele metodei cu rezultatele date de o metoda de
referinfa data (stabilita); aceasta abordare presupune ca incertitudinea metodei de referinfa
este cunoscutS;
380

y\ . o alta cale admite ca acuratetea poate fi stabilita analizand o proba cu concentratii

njjoscute, de exemplu un material de referinta certificat si comparand valorile masurate
valoarea adevarata furnizata' de producator pentru materialul de referinta; daca nu este
(fcponibil un material de referinta certificat, se poate prepara o proba blanc a matricei care
tereseaza cu concentrate cunoscuta; dupa extractia analitului din matrice, acesta se
.-jgcteaza in aparatul de analiza si se poate determina regasirea prin compararea raspunsu. gxtractului cu raspunsul materialului de referinta dizolvat intr-un solvent pur.
Concentratia trebuie sa acopere intreg domeniul ce intereseaza si sa includa obligatoriu limita de cuantificare. Regasirea asteptata depinde de matricea probei, de desfasurarea
procedeului de analiza si de concentratia analitului.
In tabelul 9.2 sunt date valori estimate ale regasirii in functie de concenlrafia analituilui.
^Jabelal 9.2. Regasiri ale analitului la diferite concentratii
"SJSstanta activa,
%
100
S10
Stl
>0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001

10-1

Unitatea
de exprimare
100%
10%

10-2

1%

10-3

0,1%
100 ppm
10 ppm
1 ppm
100 ppb
lOppb
1 ppb

Proportie analit
1

10-4
10-5

10-6
10-7

io-98
io-

Regasirea, media, %
98-102
98-102
97-103
95-105
90-107
80-110
80-110
80-110
60-115
40-120

Liniaritatea unei metode de analiza exprima abilitatea de a evidentia ca rezultatele

sunt direct proportionate cu concentratia analifilor in probe intr-un domeniu dat
Liniaritatea poate evidentia si ca media sau mediile unor transformari matematice bine deifraite sunt proportionate cu concentratia din probe.
Liniaritatea se determina printr-o serie de 3-6 injectii a 5 sau mai multe standarde ale
:
caror concentratii sunt cuprinse intre 80-120% din domeniul de concentratii la care ne
ajteptam. Raspunsurile trebuie sa fie direct proportionale cu concentratiile analitilor.
,.;
Ecuatia de regresie liniara, aplicata rezultatelor, trebuie sa aiba o ordonata (intercept) nesemnificativ diferita de zero. Daca se obtine un intercept semnificativ diferit de
i
zero, trebuie sa se demonstrcze ca aceasta nu are un efect asupra preciziei metodei.
Liniaritatea se apreciaza grafic sau printr-o evaluare matematica. Evaluarea grafica
se face observand inaltimea sau aria unui pic in functie de concentratie.
Intrucat deviatiile de la liniaritate sunt greu de sesizat (detectat), se pot utiliza doua
, procedee grafice suplimentare:
381

prin metoda enuntata.

Limita de detecfie este punctul in care o valoare masurata este mai mare decat incertitudinea ce o insofeste, fiind cantitatea ce mai mica de analit din proba care se poate detecte dar nu cuantifica in mod necesar.
Spre exemplu, in cromatografie se intelege prin limita de detectie, cantitatea iajectata
care da un pic cu inaltimea de eel putin 2-3 on mai mare decat linia' de baza a zgomotului
d-Limita de cuantificare este egala cu cantitatea injectata care da masuratori precise;
pentru cromatografie, trebuie sa se obtina o inaltime a picului de 10-20 de ori mai mare
iJecat aceca a zgomotului de fond.
DacS se specifica precizia necesara la limita de cuantificare, se poate utiliza metoda
HURACHEM (Fig. 9.3). Se injecteaza de cate 6 ori un numar de probe ce contin cantitati
: descrescatoare de analit. Se calculeaza valorile RSD% corespunzatoare ale preciziei, care
| se reprezinta grafic in functie de cantitatea de analit.

- unul consta in reprezentarea deviatiilor de la linia de regresie In functie de logaritmul concentratiei, daca domeniul de concentratie acopera cateva ordine de marimepentru domeniile liniare, deviatiile trebuie sa fie egal distribute intre valorile pozitive si negative;
- un alt mod de abordare consta in impartirea datelor semnalului la concentratiile ce
le corespund, obtinandu-se raspunsurile relative; apoi se reprezinta grafic raspunsurile relative fa[a de concentratie; trebuie sa se obtina o linie orizontala pe intres
domeniul de liniaritate; raspunsurile relative se inscriu pe ordonata, iar concentratiile corespunzatoare pe abscisa, pe o scala logaritmica; la concentratii mai man
deviatiile de liniaritate sunt negative; se traseaza linii orizontale paralele ce corespund, de exemplu, la 95-105%; metoda este liniara pan! in punctul in care linja
raspunsului relativ intersecteaza linia de 95%; in Fig. 9.2 se prezinta, pentru exemplificare, evaluarea HPLC a cafeinei prin cele doua procedee.

Fig. 9.3. Deteiminarea limitei de cuantiGcare prin metoda EURACHEM

<00

,00

1000

Log cant (ng/L)

Fig. 9.2. Grafice ale liniaritatii cafeinei din probe analizate prin HPLC
a) liniaritate clara raspuns/cantitate (11 citiri); b) reprezentare raspunsAogaritm de concentratie;
domeniul liniar mai mare ; R,, = linia de raspuns constant.

;"

Domeniul unei metode reprezinta intervalul dintre nivelul minim si eel maxim, p^*
tru care s-a demonstrat ca au fost determinate cantitatile cu precizie, exactitate si liniantaw
382

- se defineste precizia asteptata pentru limita de cuantificare Lq;

- se prepara matricea probei stabilita (prevazuta);
- se dilueaza si se injecteaza de 6 ori;
- se calculeaza RSD% pentru fiecare concentratie;
- se reprezinta precizia fata de concentratie;
- se determina concentratia la precizia asteptata, care este egala cu limita de cuantificare.

Prin urmare, limita de cuantificare este cantitatea egala cu cantitatea de analit care
jtorcspunde la precizia necesara stabilita anterior.
Robustetea se evalueaza prin teste care examineaza efectele parametrilor operatioasupra rezultatelor analitice. Dintre parametrii operationali in liPLC se pot mentiona:
a fluxului, temperatura coloanei, volumul de injectie al probei, compozitia fazei mobile,
nea de unda la care se face detectia (de regula, m UV), care poate varia intr-un domeJ; se determina cantitativ influenta acestor factori variabili. Cand influenta acestor
;t
ri se situeaza in domeniul de toleranfa stabilit anterior, se considers ca pai-ametrii
383

operational! se afla in domeniul robustefii metodei, deci ca metoda este robustj

Documentele ICH recomanda ca evaluarea robuste^ii metodei HPLC sa se faca in
fazei de developare (desfasurarea) a analizei.
Evaluarea robustetii prin efectele produse de variajia unuia sau a mai multor
parametri, in limite rezonabile, poate fi utilizata si pentru a aprecia necesitatea revalidarij
metodei.
9.2. Validarea unei metode de determinare in UV a Vitaminei D3 din
Vitaminol, dupa separarea sa prin HPLC
Vitaminolul este o formula farmaceutica care contine vitaminele D3, A, E, B2, B12,
B6, pantotenat de calciu, niacinamida etc., in urmatoarele cantita$i:
- Vitamina D3 (20 mg D3)
1,6 mg/g
,,
- Vitamina A
18,5 ng/g
- Vitamina E - acetat (7,9 ng)
39,7 ng/g
- Vitamina B2 (riboflavina)
3,1 ng/g
- Vitamina B6 (piridoxin-HCl)
3,5 ng/g
- Vitamina B ]2 (ciancobalamina)
12,0 ng/g
- Calciu - pantotenat
12,0 ng/g
- Niacinamida (Vitamina PP)
75,9 ng/g
- Menadion-Na-bisulfit
7,0 ng/g
-Dextroza
826,7 ng/g
1 UI exprima a'ctivitatea a 0,025

g Vitamina D3 pura.

3) utilizarea, ca solvent de elu^ie, a unui amestec de metanol-tetrahidrofuran-dimetilsulfoxid (DMSO) (500:500:50);

4) standardul intern contine ftalat de diundecil in faza mobila formats din acid aceticmetanol-tetrahidrofuran-dimetilsulfoxid (1000:50:50:50);
5) prepararea probei introducand 1,5 g proba in 20 mL ISS (solujie standard intern);
6) injectarea si separarea cromatografica.
Specificitatea separarii HPLC si implicit a dozarii Vitaminei D3 in raport cu al{i comnenti se evalueaza prin compararea cromatogramelor obtinute pentru:
- ejantionul supus dozarii;
- o proba de referinta de Vitamina D3 pura;
- ua placebo care nu contine Vitamina D3;
- un placebo care imboga^este referinfa de Vitamina D3 pura;
- o solutie ce confine standardul intern si faza mobila.
Jn efectuarea separarii HPLC trebuie sa existe certitudinea ca picul corespunzator
Vitaminei D3 nu se coelueaza intern impreuna cu alte substance. Trebuie, de asemenea, sa
custe certitudinea ca standardul intern, faza mobila si alte substante nu sunt incompatibile,
sdica nu trebuie sa existe un pic parazit, cu acelasi coeficient de retentie ca eel al Vitaminei
jj Un procedeu similar se aplica si pentru produsii potenjiali de degradare.
Procedand cu multa atentie si acuratete, respectand conditiile exact stabilite de sepajare cromatografica, se poate aprecia ca specificitatea confera garantia ca picul obtinut si
semnalul analitic masurat provin numai de la snbstanta de analizat, deci de la Vitamina D3.
Se reaminteste ca o metoda de analiza este selectiva daca ea permite detectia calitaliva a unei substante chiar in prezen^a alter component! existenti in proba. In cazul
Vitaminolului, nu se poate vorbi de o astfel de selectivitate, de aceea este necesara separarea cromatografica HPLC prealabila a Vitaminei D3 din solutia de proba, pentru a se
putea identifica picul caracteristic Vitaminei D3 chiar in prezenta altor picuri corespunzatoare Vitaminei E, slandardului intern etc., asa cum se poate observa din Fig. 9.4.

CH3

CH3

9.2.1. Separarea Vitaminei D3 prin HPLC

Inainte de determinarea spectrofotometrica a Vitaminei D3 este necesara separarea ei
prin HPLC, ceea ce implica:
1) utilizarea unei coloane ODS;
2) utilizarea, ca faza mobila, a unui amestec de metanol-acetonitril-apa (1000:200:50);
384

I Fig. 9.4. Cromatogramele

: HPLC ale e$antionului $i
referintei
'i a) cromatograma HPLC a
'Samionului de dozat (Vitamina
'I'.% b) cromatograma HPLC a
referintei.

385

Compararea cromatogramelor HPLC ale probei de analizat i ale referintei pertnite

testarea specificitajii separarii Vitaminei D3, care se dozeaza spectrofotometric in UV la
254 nm.
Testarea specificitatii inseamna si testarea faptului ca nu exista nici o interferenta, deci
ca semanlul masurat se datoreaza numai Vitaminei D3, ceea ce se ob^ine separand cromatografic un placebo si amestecul lui cu Vitamina D3, asa cum se poate vedea din Fig. 9.4

si 9.5.

Fig. 9.5. Cromatogramele

HPLC ale unui placebo (a)
$i ale aceluiafi placebo ce
confine fi Vitamina D3 (b)

9.2. Dozarea Vitaminei D3 in UV la 254 nm

Odata stabilita specificitatea separarii Vitaminei D3, se procedeaza la dozarea ei
spectrofbtometrica in UV la 254 nm, interesand exactitatea, fidelitatea sau precizia
metodei, care se caracterizeaza si se exprima prin repetabilitate si reproductibilitate, sensihilitate ?i liniaritate, adica domeniul de concentratie in care absorbanta (semnalul analitic)
variaza proportional cu concentratia analitului.
1) Exactitatea exprima concordanta dintre rezultatele exoerimentale si valoarea adevarata (sau media aritnictica a tuturor rezultatelor obfinute, X ).
Exactitatea exprima ingustimea acordului dintre valoarea adevarata (sau acceptata
conventional ca fiind adevarata) si un rezultat obtinut experimental. Prin urmare, exactitatea exprima ingustimea intervalului de incredere. Ea poate exprima si mgustimea acordului dintre valoarea adevarata si rezultatul final al analizei, obtinut prin efectuarea unui
mimar de "n" determinari, rezultat final care se exprima prin media aritmetica X ce se
gaseste in mijlocul intervalului de incredere. Daca nu exista o valoare care sa poata fi
acceptata conventional, se poate utiliza o valoare de referinta.
In general, evaluarea exacdtatii se face prin calcularea regasirii cantitafii de substanta luata in analiza. Pentru determinarea exactitatii se aplica metoda de analiza de "n"
on a unei solutii de standard (substanta de referinta) si de Vitamina D3 i se calculeaza
regasirea cantitatii de substanta de referin^a cunoscuta.
Exactitatea se poate aprecia prin "oblicitatea experimentala" si prin "oblicitatea
statistica".
Oblicitatea experimentala maxima la diferite concentratii se evalueaza in cadrul
unui interval de liniaritate care se exprima astfel:

Din aceasta figura se observa clai lipsa picuhii Vitaminei D3 din cromatograma
placeboului (a).
Tot in vederea evaluarii specificitatii, s-au separat cromatografic prin HPLC solutia
de standard intern si aceea de faza mobila, Cromatogramele corespunzatoare fiind date in

Fig. 9.6.

^-100<S%
Xa
Xj = cantitatea de Vitamina D3, in mg/g produs care se dozeaza;
Xr = cantitatea de Vitamina D3 gasita experimental, in mg/g produs analizat.

(9.1)

Abaterea P0| pentru fiecare concentratie analizata experimental se calculeaza

facand diferenta dintre cantitatea adaugata Xa si cantitatea gasita X,.:
\Xd\ = \Xr-Xa\
Fig. 9.6. Cromatogramele
HPLC ale standardului
intern (a) fi ale fazci
mobile (b)

(9.2)

Oblicitatea rezulta din compararea datelor pentru o concentratie gasita si o concentratie

teoretica, in domeniul de valabilitate, deci validitate, admis pentru metoda de analiza utilizata.
-;.
Determinarea oblicitatii experimentale se face prin metoda adausurilor standard,
aplicand metoda placebo-urilor (in prezenta tuturor componentilor, dar in absenta
Vitaminei D3), in care probelor de analizat li se adauga cantitati cunoscute de solutie standard de Vitamina D3.
Abaterea calculate Xd trebuie sa fie mai mica de 50%, deci \Xd = \Xr -Xa\< 50% ,
w domeniul dc liniaritate al metodei, cuprins intre 80% si 120%, in raport cu cantitatea teoretica de Vitamina 03 de dozat (tabelul 9.3).
387

Tabelul 9.3. Abaterile Xd pentru trei concentrafii diferite

Concentratia teoretica

80%

100%

123,7%

Xa

xr

Regasirea, %

X,], %

16,00

16,28

101,8

1,8

17,67

18,02

102,0

2,0

19,15

19,36

101,1

1,1

20,05

20,17

100,6

0,6

21,00

20,87

99,4

0,6

23,10

23,05

99,8

0,2

24,74

24,64

99,6

0,4

Fig. 9.8. Curbs de

regresie Xr/Xa

Aceasta curba de regresie arata o oblicitate crescuta, dar nesemnificativa.

to continuare, se aplica tesrtil privitor la ordonata la origine, comparand valoarea zero
I cu un test Student (t). Variants $1 a coeficientului a se estimeaza prin urmatoarea relatie:

Legenda:
Xa = cantitatea de Vitamina D3 dozata (mg/g produs);
Xr = cantitatea de Vitamina D3 gasita (mg/g produs);

^a ~ ^rezidual '

15

120,048

(9.4)

iar valoarea testului Student t este egalg cu:

(9.3)
(9.5)

71,329
Oblicitatile (abaterile) care pot sa apara sunt prezentate In Fig. 9.7, in care este
reprezentata grafic variatia lui Xr in functie de Xa.

oblicitate

metoda ideala
(panta = 1)

X
''oblicitate
constanta

~~~

oblicitate
cocrenla

oblicitate
proporjionala

2
. '
sl = srezidu
Fig. 9.7. Tipuri de
oblicit&ti
ce pot sa apara

2) Curba de regresie pentru valorile experimentale, obtinuta prin reprezentarea lui

X,. in funcpe de X^ este data in Fig. 9.8.

388

Se compara cu t13 = 2,16 pentru P = 0,95 (sau 95%).

Testul nefiind semnificativ, inseamna ca ordonata la origine nu este semnificativ
diferita de zero.
Desigur ca se poate face si un test de exactitate, comparand panta "b" a valorii teoretice "1" pentru un test "t" (Student). Variants 5^ a coeficientului b se poate calcula cu
ajutorul relatiei:

(9.6)

fn acest caz:
b-l

= 0,866

(9.7)

Comparand cu t13 = 2,16 pentru P = 0,95 (deci 95%), se constata ca testul nu este
semnificativ si, prin urmare, panta "b" nu este semnificativ diferita de 1, deci metoda de
analiza este exacta.
Odata evaluata oblicitatea experimentala, se procedeaza la evaluarea "oblicitatii
sfatisn'ce" globale maxime pentru o serie de concentrajii. Daca se noteaza cu |-^</| media
389

abaterilor individual \xd\ obtinute la toate concentratiile date in tabelul 9.4, oblicitatea
statistica globala se poate aprecia astfel:
i-100

_r*sDii<
L

libertate;
n = numarul determinarilor analitice, egal cu numarul de probe preparate si analizate.

100

i-100

(9.8)

L = valoarea teoretica indicata pe eticheta medicamentului conditional;

RSD = abaterea standard relativa a valorilor gasite prin analiza;
t = testul sau variabila Student la un nivel de siguranta de 95% si pentru n-1 grade de

Intmcat abaterea standard relativa este data de relatia RSD = 100

anterioara se poate scrie astfel:
"S

Rezultatul se exprima in procente, avand in vedere ca expresia anterioara reprezinta

diferenja intre doua procente, ceea ce apare mai explicit inlocuind RSD cu valoarea sa si
rtaranjand termenii expresiei astfel:

, expresia

(9.9)

-100

(9.10)

In aceasta expresie, termenul (g/Jn) t reprezinta intervalul de incredere.

3) Fidelitatea exprima concordanta tuturor rezultatelor obtinute, intre ele, respectiv
gradul de dispersie (de imprastiere) intre rezultatele unei serii de masuratori, care provin
Jin prize multiple, luate din acelasi esantion omogen, in conditii experimentale precis stabilite. Fidelitatea este urmarita sub aspectul repetabilitatii si al reproductibilitafii.
Repetabilitatea exprima concordanta dintre rezultatele masuratorilor efectuate in
conditii identice, adica: de catre acelasi analist, in acelasi laborator, cu acelasi echipament,
cu aceiasi reactivi, al intervale scurte de timp. Repetabilitatea se poate evalua prin calcularea abaterii standard relative (RSD%) si prin calcularea intervalului de incredere sau de
siguranta, la un prag de incredere de 95%:
- intr-un singur laborator, vezi tabelul 9.6;
Tabelul 9.6. Rezultate obtinute de acelafi laborator

Valorile oblicitatii statistice maxime sunt date in tabelul 9.4, iar rezultatele obtinute
in cazul determinarii Vitaminei D3 sunt date in tabelul 9.5.
Tabelul 9.4. Valorile oblicitatii
statistice maxime

Tabelul 9.5. Rezultatele determinarii Vitaminei D3

xd

Numar de valori

1,8

Media r^l
Abaterea standard S

2,0
1,1

Abaterea standard relativa RSD

0,70 in %
0,73 in %

t (6 dd 1,5%)

2,45

0,6

L in %
Oblicitatea statistica maxima:

100

0,4

(0,96 - 100/1 00)- ^,73/V7 ) 2,45 = 2,28%

Unii autori admit ca oblicitatea statistica maxima poate avea valori situate in intervalul 1,0-1,5% pentru o anurnita dozare, dar criteriul sau testul eel mai important consta in
detectia unei eventuate oblicitati cu ajutorul studiului oblicitatii experimentale.
390

Vitaminol, Lot A
XI
LI
11
Vitamir.a D3 (|Jg/g)
- 20,23
- 20,03
- 20,13
- 19,85
- 20,05
- 20,15

0,96 in %

0,6

0,2

Produsul
Analistul
Laboratorul
Ziua

Numar de valori (n)

Media X
Abaterea standard a repetabilitatii
Abaterea standard relativa a repetabilitatii
1 Intervalul de incredere la un nivel de siguranta de 95%
i
= +(s/Vn}= 20,08 ^,57 x 0,13/^6)

1
L

6
20,08 ng/g
S = 0,13ng/g
RSD = 0,65%
19,94- 20,22 ug/g

t(5 dd 1,5%)= 2,57

- pe baza normelor ISO 5725; in acest caz, se aplica acelasi procedeu de calcul dar
391

rabelul 9-8- Evaluarea reproductibilitatii rezultatelor pentru trei laboratoare diferite

alegand o abatere standard a repetabilitajii care provine din radicalul mediei variantelor rezultatelor mai multor laboratoare, in acest caz, trei: LI, L2, L3 (tabelul 9.7).

"

""

Produsul
Analistul XI
Laboratorul LI
Ziuall

Tabelul 9.7. Evaluarea repetabilitafii pentru trei laboratoare diferite

Produsul
LI

L2

Vitaminol, lot A
13

"

20,18
19,68
19,35
19,98
19,33
19,23

19,88
20,25
20,30
19,65
19,63
19,53

n=18

X = 19,86

S? = 0,017

S$ =0,151

sl =0,110
2

Sl +S2 + S3

S = 0,305; RSD = 1,536; t = 2,11

Intervalul de incredere al mediei la 95% prag de siguran^t este egal or. 19,86 ,1 1 x 0,305/Vl8
19,71 - 20,01 ug/g
Indiferent de modul in care se calculeaza si se evalueaza rezultatele analitice,
repetabilitatea se exprima, de regula, prin abaterea standard relativa (RSD) a repetabilitatii
si prin intervalul de incredere al mediei rezultatelor obtinute.
In general, calcularea RSD se face pentru o "populatie de rezultate" n > 6, iar intervalul de incredere al mediei se poate determina cu un coeficient de siguranta a = 0,05.
Reproductibilitatea caracterizeaza precizia (fidelitatea) in conditii usor variabile
(putin diferite), variabilitatea referindu-se la:
- laboratoare diferite care executa acelasi tip de analiza;
- analisti diferiti cu pregatire similara, dar usor variabila;
- reactivi identici, dar care provin din surse diferite;
- aparate de masura de acelasi tip, dar de fabricatii diferite.
Reproductibilitatea se evalueaza prin calcularea abaterii standard relative a reproductibilita|ii si prin determinarea intervalului de incredere al mediei la un prag de siguranta
de 95%, concomitent in trei laboratoare diferite, LI, L2, L3, asa cum se poate vedea din
tabelul 9.8.

392

VitaminoL, lot A
Analistul X3
Laboratorul L3
Ziual3

20,23
20,03
20,13
19,85
20,05
20,15
j^iar de vabri (n)
Media X
Abaterea standard a reproductibilitatii
Abaterea standard relativa a reproductibirjta{ii
Intervalul de incredere al mediei X la unnivelde siguranta de 95%
X = 19,86 + ^,1 1 x 0,34/Vl8 )
t(lldd 1,5%)= 2,11

Vitamina D3, [ig/g

20,23
20,03
20,13
19,85
20,05
20,15

|
Analistul X2
Laboratorul L2
Ziual2
Vitamina Da, ug/g
20,18
19,68
19,35
19,98
19,33
19,23

19,88
20,25
20,30
19,65
19,63
19,53

18
19,86 ng/g
S = 0,34 )ig/g
SR = 1 ,73%
19,69? 20,03ng/g

Trebuie subliniat ca este posibil sa nu poata fi utilizate trei laboratoare diferite pentru evaluarea reproductibilitafii. In astfel de cazuri trebuie sa lucreze trei analisti (sau
numai unul), dar in conditii de variabilitate a factorilor mentionati mai sus, pentru validarea
corecta a metodei de analiza.
4) Liniaritatea se refera la domeniul de variatie proportionala a scmnalului analitic
!
infunctie de concentratia analitului. Ecuatia dreptei celor mai mici patrate este urmatoarea:
Y= aX + b. Coeficientul de corelatie in cazul studiat este egal cu r > 0,990 pentru eel mult
S puncte si 3 rezultate pentru fiecare punct.
Pentru cercetarea liniaritatii se utilizeaza datele brute ale analizei pentru aprecierea
bblicitatii experimentale, prezentate in tabelul 9.9. Regresia liniara permite observarea
dreptei de raspuns a metodei de analiza utilizata (Fig. 9.9).

25 n

y = 0,9512x +1,0619

Fig. 9.9. Curbs, deregresie liniara

pentru dozarea Vitaminei D3

17

19

21

23

393

Tabelul 9.9. Rezultatele detenoinarii Vitaminei D3

Cantitatea de Vitamina D3 gasita
Cantitatea de Vitamina D.i de dozat
((ig/g Vitaminol)
15,95
16,40
16,00
16,48
19,64
18,95
19,15
19,50
19,52
20,80
20,05
20,18
23,51
25,89
21,00
24,52
23,51
24,74
25,89
54,52
Ecuatia acestei curbe de regresie este unnatoarea: Xr = 0,951 Xj + 1,06, iar coeficientul de corelatie r = 0,9778, ceea ce indica o oblicitate mica a metodei de analiza ( X, * 0 cand
Xj = 0). Un test F (Fischer) permite sa se obtina asigurarea ca nu este prezent un defect de
aliniere. Testul statistic asupra ordonatei la origine arata ca aceasta nu este semniflcativ
diferita de zero.
In acelasi context, comparand panta curbei cu valoarea teoretica "1", printr-un test1
Student, se constata ca panta nu este statistic diferita de 1 si, prin urmare, se poate trage
concluzia ca metoda de analiza este liniara in domeniul de concentratie 80-120%, in raport
cu valoarea teoretica a concentratiei in Vitamina D3 si nu prezinta oblicitate crescuta.
De regula, pentru studiul liniaritatii se analizeaza eel putin 5 probe cu concentratii
diferite cu eel putin trei determinari pentru fiecare concentratie (asa cum se vede si din
tabelul 9.10). Cum ecuatia regresiei liniare este data de ecuatia dreptei: Y = 0.951 X +
1.062, coeficientul de regresie este r = 0,9978.
Pentru efectuarea testului de regresie F se utilizeaza datele prezentate in tabelul 9.11.
Tabelul 9.10. Parametrii necesari testului de regresie
Grade de libertate
Suma patratelor
14
113,599
Total
1
108,609
Regresie
13
4,990
L
Reziduala

394

varianta regresiei
_~ 108,609 _

varianta reziduala
0,384

2,G)2t^y

Comparand cu FJJ = 4,67 pentru P = 95%, se constata ca exista o regresie, testul

nefiind semniflcativ.

Testul F poate fi utilizat si pentru cercetarea liniaritatii, folosind datele din tabelul

9.Hfabehd 9.11. Parametrii oecesari testului de liniaritate

"~Sursa de variajie
Reziduala
Intra
Defect de aliniere

Suma patratelor
4,990
4,879
0,111

Grade de libertate
13
10
3

, _ varianta defectului de aliniere _ 0,037

= 0,1045
varianta reziduala
~ 0,354

VarianjH
0,384
0,488
0,037

(9.12)

Comparand cu F^ = 3,14 pentru P = 95%, se constata c4 testul nu este semnificativ,

deci nu exista un defect de aliniere.
5) Sensibilitatea unei metode de analiza consta in capacitatea sa de a detecta variatii
jnici ale concentratiei, respectiv a unor cantitati foarte mici de substanta.
Definitia sensibilitatii, potrivit Notei Explicative a Comisiei CEEITI/844/87-FR, este
urmatoarea: sensibilitatea este capacitatea unei metode de analiza de a inregistra variatii
mici ale concentratiei, adica o variatie minima care se impune marimii X (de exemplu, concentratia) de determinat pentru a obtine o variatie semnificativa a semnalului analitic
masurat.
Pentru o metoda deja elaborata si verificata, a carei variabilitate este constants intrun domeniu de validitate, sensibilitatea ceruta, notata, de exemplu, cu RD, depinde de
fidelitatea "S" a dozajului, de marja existenta intre concentratia teoretica = 20 (ig/g
Vitamina D3 si Lj = 17 fig/g Vitamina D3 specificata in norma interna (sau a A.M.M), de
eantioanele dozate in analiza de rutina. Puterea de separare, in acest caz sensibilitatea
notati cu RD, este data de diferenta celor doua valori ale lui Ct si L;:

(9.13)
Varianja
8,114
108,609
0,384

Ct = concentratia teoretica.
Prin urmare, puterea de separare a metodei RD = D (D este puterea de separare penIra metode a caror variabilitatea nu este Constanta in domeniul de validitate considerat). De
aceea, se calculeaza valoarea lui D astfel:
-Jn

= 0,13,n = 3,

(9.14)

395

I az contrar, trebuie schimbata valoarea tg 05 in functie de numarul gradelor de libertate

_ ji-1 Daca n = 3, pentru K = n-1 = 2, tQ 05 = 4,30 (abaterea intre doua valori ale concentjei care se Poate distinge cu o probabilitate de 95%, este considerata, din prudenfa, mai
J^edecatdubla).
Pentru metode a caror variabilitate nu este constants in domeniul de validitate con
jn normele CEE, unul dintre criteriile de validare este pragul de detectie. In cazul
siderat (este vorba de metode noi, nevalidate), puterea de separare D se calculeaza cu aju- :ak < f
ijdarii metodei de dozare a Vitaminei D3 din Vitaminol, pentru aprecierea pragului de
;
torul relatiei:
-Sp
'1
ji ! detectie, trebuie sa se tina seama de urmatoarele date:
(9.16)
Vitaminol
Inaljimea picului
cantitatea (cunoscuta) de Vitamina D3
din proba/eantionul analizat este egala 32mm
in care:
t == variabila Student, dependents de numarul gradelor de libertate (k = n-1), la un
cua = 21,4(j.g/g
1 zgomotul de fond, s
1,5 mm
nivel de siguranta de 95%;
n = numarul de probe de esantion pentru care s-a estimat "S";
. pragul de detecjie (2 x zgomotul de
3,0mm
S = estimata abaterii standard reale s a metodei analitice;
fond), deci 21,4 x 3/32 = 2 tig I g
ne = numarul esantioanelor prevazute a fi analizate in rutina (ex.: in dozajul duplicat
ne = 2);
Pentru estimarea pragului de cuantificare prin metoda blancurilor, se pot utiliza doua
RD = puterea de separare impusa (ceruta).
dee:
a) conform USP XXH
Se admite ca se elaboreaza o alta metoda, mai putin precisa, pentru care S = 1,7 g/g
- injectii blanc
- inaltimea picului
Vitamina D3 (6 valori) si mai rapida; in cazul unui eseu in duplicat:
2,1 mm
2 57 1
2,8 mm
(9.17)
)= ' ' '.I = 3,lAJg/g; in acest caz D > RD
2,3 mm
1,8 mm
Numarul de eseuri necesare in determinarile de rutina, pentru ca D sS fie mai mic
2,9mm
dccat RD, este egal cu:
2,7 mm
media
X
2,43 mm
(9.18)
D<RD=>
< 3 ; deci ne = 3
- abaterea standard
0,44mm
ne
pragul
de
cuantificare
=
10
s
4,40
mm
Trebuie subliniat ca, pentru determinarile de rutina, se accepts o sensibilitate mai
mica numai dacS metoda este suficient de rapida pentru a permite efectuarea unui numar
- deci: 21,
mare de determinari intr-un timp rezonabil.
b) conform metodologiei de validare
De regula, sensibilitatea se exprima prin panta dreptei de regresie, sensibilitatea
putand fi asimilata cu puterea sau capacitatea de separare a metodei de analiza, deci cu cea
mai mica abatere care se poate detecta prin metoda considerata, cu un coeficient de sigu- injectii ale esantioanelor care contin
ranta a = 0,05.
cantitafi cunoscute de Vitamina D3
Daca se considers ca numarul de prize "n" luate dintr-un esantion omogen este foarte
1,0
1,5
mare, puterea de separare se apreciaza cu expresia: D < 1,96 Sj-Jn (rcpetabilitatea), in
2,0
3,0
care 1,96 reprezinta valoarea variabilei t a lui Student pentru o incredere de 95%, caz in
2,5
3,5
care n co (deci raportul numarului probelor si numarul citirilor tinde catre infinit).
3,0
4,5
In determinarile de rutina se recomanda, prin normativele in vigoare, triplarea doza3,5
5,0
jului, cand n = 3; in acest caz, D > 0,147 ug/g. Expresia 1,96 S/-Jn reprezinta o abatere,
4,0
6,0
in care variabila "t" este aleasa la o valoare minima, daca se poate demonstra ca variabili5,0
7,5
tatea metodei de analiza utilizata este constanta in domeniul de validitate (incredere sau
Dreapta
de
regresie
corespunzatoare
acestor
date
analitice este prezentata in Fig. 9.10.
siguranta), ceea ce este valabil pentru metodele bine cunoscute, care functioneaza corect.
D = 1.96-0,13 = 0 ^ 47

^ //\ f\c

396

l.\

^^ . mtr.a(ieVar D < RD

397

Fig. 9.10. Dreapta de regresie

fi pragul de cuantiScare

Mai trebuie mentionat ca, la criteriile de validare cuprinse in nota explicativa a CEE,
se adauga si unele "tcste de conformitate", cum sunt, de exemplu, pentru HPLC, numarul
de talere teoretice, asimetria picurilor, timpii de retenjie, rezolutia etc.
Din toate cele prezentate in acest paragraf, se pot trage o serie de concluzii importante:
1) o metoda de analiza poate fi considerate ca validata daca s-au determinat si stabilit: exactitatea, fidelitatea (repetabilitatea, reproductibilitatea si chiar
robustetea), specificitatea-selectivitatea, sensibilitatea, pragurile de detectie si de
cuantificare, liniaritatea si domeniul de variabilitate (mcredere) si daca i se cunosc
oblicitatea (abaterea) si interferentele, ca si posibilitatea de rezolvare a cestora;
2) pentru fiecare medicament si procedeu, tehnica sau metoda de analiza, se
intocmeste un dosar de validare care trebuie sa cuprinda: o descriere complete,
detaliata a modului de lucru, de operare (care include principiul care sta la baza
metodei de analiza, reactivii necesari 5! gradul de puritate cerut, aparatura utilizata si performantele ei, conditiile experimentale (domeniul de concentrate, pH-ul,
solventii, forta ionica etc.), calculele care s-au facut, inclusiv evaluarea statistics
a rezultatelor si, implicit, a erorilor, astfel incat orice analist competent in domeniul analizei si controlului de medicamente sa poata reproduce si aplica metoda;
3) de regula, la folosirea metodelor de analiza si control a medicamentelor au fost
observate unele probleme, Intre care:
- absenta dozajului probei care contine o impuritate critica, un produs de
degradare sau un standard intern necesar pentru obtinerea asigurarii ca metoda este adecvata;
- absenta indicatiei tuturor specificatiilor metodei de analiza sau selectarea
nepotrivita a unora dintre acestea;
- insuficienta documentare asupra metodei sau alegerea nepotrivita sau inacceptabila a metodei de analiza, a reactivilor si a aparatclor de masurare;
- utilizarea unor materiale de referinta necorespunzatoare sau nccaracterizate
complet si corect;
- date incomplete privitoare la metoda de analiza sau la produsul farmaceudc
analizat;
- toate aceste aspecte trebuie sa fie evitate si corijate, inainte de a publica o

398

metoda de analiza si control, deoarece, altminteri, o astfel de metoda, cu

defectiunile si neglijentele mentionate, nu poate fi acceptata;
4) la elaborarea si, mai ales, la alegerea unei metode de analiza si control de medicamente (cazul eel mai frecvent rntalnit in practica farmaceutica) trebuie sa se tina
seama de progresele tehnice si stiintifice ale momentului;
5) in unele cazuri se impune revalidarea unei metode de analiza si control, mai ales
cand:
- se transfera o metoda de analiza, elaborata anterior, la controlul de cah'tate a
unui medicament;
- se modifica semnificativ un procedeu de obtinere a unei materii prime sau a
unui intermediar;
- se schimba compozitia unui produs finit, deci a unui medicament;
- o metoda de analiza este utilizata pentru prima data intr-un laborator, inclusiv
de analiza si control de medicamente, caz in care este bine sa se verifice daca
rezultatele anaUtice obtinute concorda cu cele menfionate in dosarul de validare, mai ales in ceea ce priveste exactitatea si precizia metodei;
6) datele inscrise in dosarul de validare trebuie sa faca o critica obiectiva a performantelor metodei de analiza, pentru ca acestea sa fie un ajutor real si util pentru
analistul care aplica metoda.

1. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza fi

control, Bazele teoretice f i practice, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998, p. 129-151
2. Marius Bojija, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean, Analiza fi controlul
medicamentelor, Vol. 1, Ed. Intelcredo, Deva, 2003, p. 451-467
3. ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the
Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of Analytical
Procedures. Geneva, 1995, 1996
4. Commission of the European Communities "Guidelines on the Quality, Safety and
Efficiency of Medicinal Products for Human Use", 1990
5. Ferret - Liandet A., Organisation, raise en oeuvre et suivi d'un systeme de qualite
6. United States Pharmacopoeia, United States Pharmacopoeia! Convention Rockville
1995
1. United States Pharmacopoeia, XXIII, 1993

399

Fig. 10.1. Schema de principiu a unui gazcromatograf

...Mectie

. Coloana

Detector

Inregistrator

Cuptor

Rezcrvor
gaz purtalor

CAP. 10. VALEDAREA UNEIMETODE

GAZCROMATOGRAFICE

(A)
fi(A) Seringa de 10 uL; exista si seringi de 0,1-1,0 uL

10.1. Notiuni introductive

Cromatografia de gaze (gazcromatogarfia sau cromatografia in faza gazoasa) este,
prin excelenta, o metoda de separate a substantelor volatile si usor volatilizabile la temperatori sub 400C. Metodologia analizei gazcromatografice se aplica si substantelor medicamentoase, impuritatilor continute de acestea si substantelor inrudite, acestea din urma
incluzand si metabolitii substantelor medicamentoase "~5'.
Separarea gazcromatografica (GC) se realizeaza pe coloane cromatografice special
concepute, pe baza a doua procese (in functie de natura fazei stafionare) si anume:
- repartitia Tntre q faza stationara lichida si o faza mobila gazoasa, numita gaz purtator (ex.: He); aceasta tehnica se numeste cromatografie gaz-lichid (CGL);
- adsorbtia pe o faza stationara solida, urmata de elutia substantelor adsorbite cu o
faza mobila gazoasa; aceasta tehnica se numeste cromatografie gaz-solid (CGS).
Substantele supuse analizei GC strabat intreaga coloana (lunga de 1-4 m; exista si
coloane capilare Golay de 10-50 m, cu d.i. = 0,1-0,5 mm), cu viteze diferite, astfel ca ele
parasesc coloana succesiv, fund conduse la un detector potrivit, unde se face identificarea;
semnalele detectorului sunt apoi transmise la un recorder care inregistreaza gazcromatograma amestecului de substante separate. Mentinerea moleculelor substantelor analizate la o anumita temperatura (mai mica de 400C) se face cu pastrarea integrita^ii chimice a moleculelor.
Realizarea practica a analizei GC se face cu un gazcromatograf, pentru care se da, tn
Fig. 10.1, o schema de principiu; pentru introducerea probelor in gazcromatograf, se pot
utiliza microseringi, Fig. 10.2, sau diverse tipuri de injectoare, Fig. 10.2.B si Fig. 10.2.C.

Fig. 10.2. Modele de microseringa (A), injector cu divizor (B), injector la rece (C) ?i
injector cu vaporizare directa (pentru o mie de injectii) (D)
- B 51 C: 1 = iejire sept de curatire; 2 = ie$ire splitare; 3 = seringa; 4 = sept otin cauciuc; 5 = intiare gaz purtator, 6 =
I'anjon din sticlS; 7 = camera de vaporizare; 8 = coloana capilara; 9 = aer de rScire; 10 = valva de intrare; - D: 1 =
seringa; 2 = sept; 3 = intrare gaz purtator; 4 = manson; 5 = coloani

400

401

Injectoarele utilizate sunt, de regula, incalzite (exista insa si injectoare la rece, exemplul (C) in figura anterioara), ceea ce permite volatilizarea substantelor organice, inclusiv
medicamentoase, inca din faza de injectie; apoi moleculele in faza gazoasa sunt antrenate
de un gaz purtator, cum sunt AT, He, N2 etc., in coloana cromatografica in care se face separarea analitilor.
Trebuie precizat ca reusita separ5rii in GC depinde in mare masura de conditiile pe
care trebuie sa le indeplineasca un gaz purtator si anume: sa aiba puritate mare, sa fie inerte
fata de substance analizate, sa aiba o vascozitate redusa (pentru a nu fi necesara cre$terea
temperaturii), sa aiba conductibilitate termica potrivita, comparabila cu sistemul de
detectie, iar debitul sa se faca la o viteza optima, care variaza cu diametral interior al
coloanei gazcromatografice; asa, de exemplu, pentru un d.i. = '/< {ol = 0,635 cm = 6,35 mm
(1 tol = 2,54 cm), viteza gazului purtator trebuie sa fie de 50-70 rnL/min, iar pentru un d.i.
= 1/8 tol = 3,175 mm, viteza gazului purtator trebuie sa fie de 25-30 mL/min.
In general, se injecteaza 1-10 uL (sau mai putin) solute de analizat. In cazul substantelor foarte volatile, introducerea probei in gaz-cromatograf se face prin tehnica "headspace", pentru care se prezinta o schema in Fig. 10.3; pentru date suplimentare referitoare
la coloanele cromatograflce (clasice si capilare), la fazele stationare si suporturi etc., se
poate consulta "Analiza si controlul medicamentelor", Ed. Medicala, Bucuresti,
2002/1003, Vol. 2, p. 202 si u., M. Bojija, L. Roman, R. Sandulescu, R. Oprean.

SchonoKTM
probo

Pozijie normals

Prraurizare

Injccpc

Fig. 10.3. Schema de principiu a tehnicii "head-space":

A = sistemul Hcadspace HS6;
B = Sacon, gamituiS, incl si capsula de alutwniu;
C ~ sistemul de injecfie al HS6.

10.2. Conditii de operare in crornatografia de gaze

Conditiile de lucru (operare) in crornatografia de gaze implies tratarea mai multor

:, tinandu-se seama de relatiile urmatoare:

si
b = nVR/^IN
(10.1)
in care: b = largimea picului cromatografic la baza; VR = volumul de retentie; VM =
j volumul mort; K = CS/CM = coeficientul de repartitie al substanjei in faza stationara si
1 faza mobila; N = numarul de platouri teoretice.
Exista, desigur, mai multi factori care infiuenteaza procesele de separare in gazcromatografie. O separare buna depinde de volumele substantelor sau de distantele dintre
fimpii lor de retentie i de largimea picurilor lor; de aceea, pentru a imbunatati separarea,
trebuie sa se actioneze asupra unor factori, prin modificarea debitului fazei mobile gazoase,
a naturii coloanei, dar si prin variatia temperaturii. Prin toate aceste modificari se confera
gazcromatografiei o suplete reala de utilizare. Trebuie precizat ca temperatura modifica
tensiunea de vapori a substantelor ce se separa, a caror volatilitate intervine in procesul de
fepartitie a moleculelor de analiti intre faza mobila gazoasa si faza stationara. Astfel, once
crestere a temperaturii determina o crestere a concentratiei substan^elor in faza mobila
gazoasa si, implicit, o scadere a coeficientului de repartitie, K = CS JCM , iar once scadere
a temperaturii actioneaza invers; aceste variatii ale temperaturii se rasfrang asupra:
g 1) marimilor de retentie VR, dR sau t-^; cu cat temperatura creste, cu atat scade vaiparea K si, deci, cu atat substantele separate ies mai repede din coloana, iar VR este direct
proportional cu K; s-a observat ca o cretere a temperaturii cu 20C micoreaza volumul
de retentie la jumatate;
2) largimii picurilor substan^elor separate; cre?terea temperaturii determina
apropierea si ingustarea picurilor la baza (b) in functie de volumul de retentie, VR; conditiile referitoare la temperatura sunt valabile numai in anumite limite, deoarece, conform
teoriei cinetice, influenta temperaturii asupra inaltimii talerelor teoretice si, implicit, asupra
numirului lor, pentru o coloana cu o anumita lungime data, trece printr-o valoare optima;
de aici rezulta ca, pentru un anumit analit existent intr-un amestec, sunt necesare incercari
preliminare de stabilire a domeniului de temperatura pentru care eficacitatea coloanei este
maxima sau optima (acest domeniu se stabileste pe baza curbei De Wet si Pretorius, data
de ecuatia H = A + B/T + C T ; A = difuzia turbulenta, B = difuzia longitudinala, C = coeficientul de rezistenta la transferul de masa, T = temperatura);
3) programarea temperaturii se face astfel incat sa permita obtinerea unor separari
bune prin accelerarea proceselor cromatograflce; pentru aceasta, separarea cromatografica
incepe la o temperatura mai joasa, dar suficienta pentru separarea compusilor mai putin
retinuti; apoi temperatura este marita treptat pentru a putea avea loc elutia celorlalte substante, in timpi mai scurti (rapizi), cand se obfin picuri mai stranse, cu baza mai mica;
4) viteza de trecere a fazei mobile are o influenza asupra inaltimii talerului teoretic,
<ie aceea trebuie utilizata o viteza optima, definita pe baza curbei lui Van Deemter pentru
fiecare coloana; viteza optima a fazei mobile se calculeaza astfel: v = -J.B/C ; pentru o astfel de viteza, inaltimea talerului teoretic este mai mica, coloana avand un numar mare de

402

403

.M

-**-

mill'