Determinarea clorhidratului de metoclopramid prin injecie de flux de chemiluminscen din formulri farmaceutice i lichide biologice folosind un sistem [Ru(dipy)

32+] permanganat
Este descris o metod de injecie de flux (FI) folosind (2,2-dipiridil) rutheniu (II) [Ru(dipy)32+] chemiluminiscent (CL) pentru determinarea cantitativ rapid i sensibil a clorhidratului de metoclopramid. Metoda se bazeaz pe reacia CL a metoclopramidului cu [Ru(dipy)32++ i KMnoO4 n mediu de acid sulfuric. Am obinut o curb de etalonare, n condiii optime, pentru domeniul de concentraie 0,005-3,5 ug/ml cu o limit de detecie (S/N =2) la 1ng/ml. Coeficientul de corelaie a fost 0,99993 (n=8) iar deviaia standard de 0,48% pentru 10 determinri pe 1ug/ml de substan. Metoda a fost aplicat cu succes pentru determinarea clorhidratului de metoclopramid n formulri farmaceutice i lichide biologice, dup administrarea unei doze IP de 25mg/kg la oareci. Timpul de njumtaire este de 2,5 0,4h. 1. Introducere Metoclopramid, 4-amino-5-dicloro-2-mtoxi-N-(2-dietilamino-etil) benzamida, este un antagonist al receptorilor dopaminergici, un antiemetic i un stimulent al motilitii gastro-intestinale superioare. Este folosit pentru managementul disfunciilor de motilitate gastro-intestinale i de reflux i pentru chimioterapia de prevenire a cancerului, n emeza indus de chimioterapia cu doze mari. Numeroasele aplicaii ale metoclopramidei, n medicina clinic i experimental, au solicitat o cercetare extensiv privind dozarea acesteia din forme farmaceutice i din lichide biologice. Att Farmacopeea Britanica (BP), ct i Farmacopeea Statelor Unite (USP), recomand titrarea n mediu neapos, cu detectarea poteniometric a momentului final al titrrii; pentru forme farmaceutice, BP folosete metode spectrofotometrice, n timp ce USP recomand metode HPLC. Majoritatea metodelor analitice de dozare a metoclopramidei din forme farmaceutice sau lichide biologice sunt metode cromatografice inclusiv HPLC [4-13], LC [[14], HPLC de faza invers [15], HPLTC [16], GC-MS [17], captare de electroni GC [18], electroforez capilar de nalt performan (HPCE) [19,20]. De asemenea, metodele spectrofotometrice sunt printre cele mai analitice metode folosite, pentru dozarea metoclopramidei din preparate farmaceutice, lichide biologice sau combinaii cu alte substane. Alte metode folosite sunt si titrimetria [32-34], colorimetria [35-37], fluorimetria [38,39], voltametria [40], spectroscopia 1H-RMN, spectrofotometria de absorbie atomic fr flacr *42+ i dozarea radio-imunologic [43]. Din studierea literaturii reiese c, pn n prezent, nu au fost publicate articole privind determinarea cantitativ a clorhidratului de metoclopramid prin chemiluminiscen (CL). Reactiile CL au fost utilizate la scar larg pentru detectarea selectiv i sensibil prin injecie de flux i analiz cromatografic [44]. Una dintre cele mai interesante serii de reacii CL implic (2,2-

dipyridyl) ruthenium (II) [Ru(dipy)3 2++. Aceast reactie presupune oxidarea [Ru(dipy)3 2+] la [Ru(dipy)3 3+], urmat de reducerea cu un analit specific, cu emiterea consecutiv de lumin. Au fost folosite o serie de metode pentru obinerea [Ru(dipy)3 3+], inclusiv chimice/fotochimice, oxidarea electrochimic i electrochimic, electrochemiluminiscen in situ. Generaia chimic de [Ru(dipy)3 3+]a fost obinut printr-o serie de reactani, inclusiv sulfat de ceriu (IV)*46+, dioxid de plumb*47+ i permangamant de potasiu. [48] Metodele CL cu [Ru(dipy)3 3+] au fost raportate pentru determinarea unor substane, ex hidralazina [49], eritromicina [50], clindamicina [51], codeina i heroina [52], 6-mercaptopurina [53], antibiotic b-lactamice *54+, acid mefenamic i acid flufenamic *55+, cteva fluorochinolone *56+ i derivai de tioxanten [57]. Prezenta lucrare descrie dezvoltarea unei metode de injecie de flux (FI) chemiluminometric pentru dozarea clorhidratului de meoclopramid, avnd la baz reacia substanei cu *Ru(dipy)3 2++ i permanganat de potasiu n mediu de acid sulfuric. Metoda a fost aplicata eficient pentru determinarea clorhidratului de metoclopramid n preparate farmaceutice i n lichide biologice, dup administrarea unei doze de 25 mg/kgc IP la oareci. 2. Partea experimental 2.1. Aparatura i colectarea datelor Sistemul de generare a fluxului folosit pentru determinarea i detectarea CL a clorhidratului de metoclopramid este ilustrat schematic in Fig 1. S-a folosit o pomp peristaltic Gilson Minipuls 3MP4 (dou canale, viteze variabile), pentru a conduce purttorul i curenii de reactivi n sistem. Fiecare curent a fost pompat la flux constant, folosind tuburi PTFE (0,8mm i.d.). Soluia de substan (250l) a fost injectat n valve de injectare a probei, care permite amestecarea probei cu o soluie acidulat 1x 10-3 M de KMnO4 i apoi combinarea cu o soluie de 1x10-2 M [Ru(dipy)3 2+], la intrarea n detector. Lumina emis a fost msurat cu un tub fotomultiplicator (PMT) (THORN EMI, 9789 QB). Potenialul de alimentare pentru PMT a fost de 900 V, provenind dintr-un generator stabil (THORN EMI, Model PM 28 BN). Semnalul a fost reinut de un aparat de nregistrare Kip psi Zonen BD 112. S-a masurat nalimea fiecrui pic i a fost exprimat ca rezultat voltaic de tubul fotomultiplicator. Rezultatul analitic a fost calculat ca semnal prob minus semnal blank.

Fig. 1. Aparatul de FI for dozarea CL a clorhidratului de metoclopramid

2.2. Reactivi i material

Toi reactivii folosii au fost de puritate analitic, i soluiile au fost preparate cu ap nalt distilat. Soluia apoas de permanganat de potasiu (Fluka, Stoc UK de concentratie 1x0,3 M a fost preparat n acid sulfuric 0,5 M (Reidel- de Haen). Soluia apoas de [Ru(dipy)3 2+] (Aldrich Chemical Co.) de concentraie 1x10-2 a fost preparat prin dizolvarea [Ru(dipy)3 2++ hexahidrat n ap distilat. S-au mai folosit soluie apoas de NaOH 5% i acid clohidric (Reidel-den Haen). Ali reactani folosii au fost cloroform (BDH, UK) i diclormetan (Riedel-den Haen. Clorhidratul de metoclopramid a fost obinut prin bunvoina Memphis Chemical Company (Cario, Egipt). Preparatele farmaceutice au fost obinute din surse locale. Probele de urin au fost recoltate de la voluntari sntoi. 2.3. Tehnici de lucru standard Soluia stoc (1,0 mg/ml) de clorhidrat de metoclopramid a fost preparat prin dizolvarea a 100 mg de prob de substan n 100 ml ap distilat. Soluia a fost ulterior diluat zilnic cu ap, pentru a o aduce la o concentraie adecvat de lucru. 2.4. Tehnici de lucru generale S-a folosit aparatul de nregistrare al FI, din Fig 1. O soluie de 250 l substan a fost injectat n gazul purttor de soluie acidulat de KMnO4 i apoi combinat cu o soluie de [Ru(dipy)3 2+]; a fost masurat nalimea picului rezultat, curba de etalonare prin corelarea nlimii picului cu concentraia substanei.

2.5. Tehnica de lucru pentru preparatele farmaceutice 2.5.1 Tablete S-au cntrit i pulverizat 10 comprimate. 10 cantiti precise de pulbere de substan, echivalent a 10 mg fiecare, au fost dizolvate n ap distilat. Soluia a fost filtrat i diluat la 100 ml cu ap distilat. Pentru etalonare s-a folosit tehnica descris mai sus. Coninutul nominal al comprimatelor a fost calculat fie folosind o curb de etalonare determinat anterior, fie din ecuaia de regresie. Fiecare dilutie a fost masurat n 3 exemplare. 2.5.2 Sirop *+

2.6 Procedura pentru dozarea din urina si ser *+ 2.7 Schema de dozare la soareci *+

3. Rezultate si concluzii Aa cum am spus i mai sus, [45-48,58], s-au folosit oxidani comuni precum acidul nitric, dioxidul de plumb, ceriul (IV), clorul i permanganatul de potasiu pentru a oxida [Ru(dipy)3 2+] la

[Ru(dipy)3 3+]. n aceste experimente s-au ncercat diferii oxidani, precum iodat de potasiu , bromat de potasiu, dicromat de potasiu, perclorat de potasiu, persulfat de potasiu, permanganat de potasiu, Nbromsuccinmida, sulfat de ceriu (IV) i peroxid de hidrogen, n mediu acid sau bazic. Semnal CL s-a obinut doar n cazul KMnO4 i Ce(IV) n mediu acid. Intensitatea semnalului CL obinut cu KMnO4 a fost superioar celei obinute cu Ce(IV). Astfel, KMnO4 este folosit pentru a produce [Ru(dipy)3 3+] din [Ru(dipy)3 2+], care va fi utilizat pentru determinarea clorhidratului de metoclopramid prin metoda FI. 3.1. Configurarea design S-a folosit un sistem de nregistrare pe dou benzi (canale). Intensitatea maxim a semnalului CL a fost obinut cnd proba a fost injectat ntr-un curent de KMnO4 acidulat i apoi amestecat cu [Ru(dipy)3 2+], la intrarea n detector. 3.2. Optimizarea variabilelor experimentale Condiiile optime de reacie pentru dozarea clorhidratului de metoclopramid au fost determinate prin injectarea unei probe de 250 l/ml de soluie de substan n gazul purttor, cu un debit de 1,3 ml/min n fiecare canal. S-au efectuat o serie de experimente pentru a determina variabilele analitice optime. Parametrii optimizai vizeaza concentraiile reactivilor i civa parametri de inregistrare. 3.2.1. Optimizarea concentratiei reactivilor Au fost testate concentraii diferite de acid sulfuric ca solvent pentru permanganatul de potasiu, permanganatul de potasiu i [Ru(dipy)3 2+]. S-a studiat efectul variaiei concentraiei acidului sulfuric ca solvent pentru KMnO4, ntr-un domeniu de 1x10-5 la 2,0M. Semnalul analitic de valoare CL cel mai bun a fost obinut pentru H2SO4 0,5 M, peste aceasta limit intensitatea fiind n scdere. Efectul concentraiei permanganatului de potasiu asupra intensitii CL, este ilustrat in Fig.3. Cel mai bun semnal CL a fost obinut la 1x10-3 M KMnO4, concentraii mai mari determinnd scderea intensitii CL. Concentraia [Ru(dipy)3 2++ a fost studiat ntr-un domeniu de la 1x10-5 la 0,1M, nlimea picului crescnd cu concentraia [Ru(dipy)3 2++. Fig. 4 demonstreaz c 1x10-2 M au dat cea mai mare intensitate, limita peste care intensitatea a nceput uor de scad. Investigarea sensibilizanilor intensitii CL, cu diferii fluorofori, precum sulfatul de chinin, rodamina 6G, Rodamina B i fluoresceina au demonstrat c intensitatea Cl nu a fost afectat.

Fig. 2. Efectul variatiei concentratiei acidului sulfuric ca solvent al KMnO4 asupra intensitatii CL a clorhidratului de -3 2+ -2 metoclopramid (1 g/ml), KMnO4 1x10 M, Ru(dipy)3 1x10 M, rata fluxului 2,6 ml/min

Fig. 3. Efectul variatiei concentratiei KMnO4 asupra intensitatii CL a clorhidratului de metocloprmid (1g/ml), 2+ -2 Ru(dipy)3 1x10 M, rata fluxului 2,6 ml/min

Fig. 4. . Efectul variatiei concentratiei Ru(dipy)3 asupra intensitatii CL a clorhidratului de metocloprmid (1g/ml), 2+ -2 Ru(dipy)3 1x10 M, rata fluxului 2,6 ml/min

2+

3.2.2. Optimizarea paramentrilor de nregistrare Parametrii de nregistrare studiai pe soluiile de reactivi optimizai au fost cantitatea de prob injectat i debitul. S-a considerat un volum injectat din domeniu 30-600 l. nalimea picului rezultat a crescut cu creterea volumului pn la 250 l, limit peste care intensitatea a nregistrat o uoar scdere. (Fig. 5) Debitul total al curenilor de *Ru(dipy)3 2++ i permanganat de potasiu au variat ntr-un domeniu de 0,7-7,0 ml/min, cu debite constante n ambele canale. Rezultatele obinute au artat c 2,6 ml/min (1,3 ml/min pentru fiecare canal) a fost cea mai bun valoare a debitului pentru substana studiat, limit peste care intensitatea a sczut constant. 3.3 Mecanimul posibil al CL CL de [Ru(dipy)3 2+]s-a dovedit a fi o metod foarte sensibil pentru substane care conin grupri amince alifatice secundare sau teriare *59+. Substana studiat conine grupare amino i dietilamino, astfel mecanismul propus este probabil similar celui descries anterior pentru determinarea aminelor prin reacia generata electric cu [Ru(dipy)3 2+][59,60].

Fig. 5. Efectul variatiei volumului de proba asupra intensitatii CL a clorhidratului de metoclopramid (1g/ml), Ru(dipy)32+ 1x10-2 M, rata fluxului 2,6 ml/min

Fig. 6. Rata totala a fluxului

Mecanismul propus include oxidarea [Ru(dipy)32++ i a gruprii amine primare prezente n molecula metoclopramidei cu permanaganat de potasiu, avnd n vedere c ionul radical rezultat este mai stabil prin rezonan. Produsul de oxidare al aminei este supus deprotonrii pentru a forma un radical. Acesta reduce [Ru(dipy)3 2+] la starea excitat care emite lumin, dupa cum urmeaz:

3.4. Determinarea cantitativ a clorhidratului de metoclopramid Dup ce au fost optimizai reactivii i variabilele instrumentale, pentru a obine o intensitate CL maxim, o serie de soluii standard au fost pompate, fiecare n 3 exemplare, pentru a testa liniaritatea curbei de etalonare. Relaia intensitii CL (I,mV) fa de concentraia clorhidratului de metoclopramid a fost liniar, n domeniul 0,005-3,5 g/ml, cu un minim detectabil valid (S/N=2) de 0,001g/ml n lichidele biologice. Regresia liniar a rezultatelor a generat urmatoarea ecuaie:

Deviaiile standard ale pantei i ale nalimii picurilor au fost de 0,48, respectiv de 0,75. Precizia metodei a fost apreciat prin analizarea soluiilor standard de metoclopramid. Rata de reproductibilitate a fost de 99,9 1,7 (adica +-S.E.). Reproductibilitatea a fost studiat folosind 1,0 g/ml de substan (n=10) i procentul de deviaie standard relativ (%RSD) a fost de 0,48%, ceea ce ilustreaz c rezultatele sunt foarte reproductibile. 3.5 Analiza preparatelor farmaceutice Metoda propus a fost aplic mai departe pentru analiza anumitor preparate farmaceutice cu clorhidrat de metoclopramid pentru a verifica utilitatea metodei chemiluminiscente. Rezultate foarte bune i recuperri bune s-au obinut pe baza a 3 determinri pentru diferite concentraii pentru fiecare preparat farmaceutic. Rezultatele din tabelul 1 sunt n concordan cu cele obinute prin metoda fluorimetric *39+. Rezultatele demonstreaz c metil- i propilparabenii nu interfereaz dozarea clorhidratului de metoclopramid n sirop. Analize statistice [61] a rezultatelor prin testul t si testul f nu au aratat diferene semnificative ntre cele dou metode, din punct de vedere al acurateei i preciziei.

4.Concluzii Metoda chemiluminiscent descris pentru dozarea clorhidratului de metoclopramid n preparate farmaceutice i n lichide biologice, este simpl, rapid i foarte sensibil. Soluiile pot fi analizate la o rat de 67 probe/h. Metoda descris se remarc prin simplitate, comparativ cu celelalte metode oficinale. USP recomand o metod HPLC pentru dozarea formelor farmaceutice, care necesit abiliti special la dozare, pentru a obine rezultate valide, care consum mai muli solventi organici sau necesit un timp de lucru mai lung. BP recomand o metod spectrofotometric pentru determinarea cantitativ din preparate farmaceutice n medii neapoase. Prezenta metod descris are o sensibilitate suficient pentru determinarea farmacocineticii metoclopramidei dup o singur doz administrata IP. Contribuii Autorul multumeste Drei Asma B. Al-Angari pentru sprijinul tehnic extraordinar. Referine
[1] American Hospital Formulary Service, Drug Information, American Society of Hospital Pharmacists, Inc., Bethesda, MD, 1989, p. 1622. *2+ British Pharmacopoeia, Her Majestys Stationery Office, London, 1998. [3] The United States Pharmacopoeia, XXIV Revision, the Nation Formulary XIX Rockville, USP Convention, 2000. [4] M.A. Radwan, Anal. Lett. 31 (1998) 2397. [5] T.G. Venkateshwaran, J. Liq. Chromatogr. 18 (1995) 117. [6] N.H. Foda, Anal. Lett. 27 (1994) 549. [7] Y.M. El-Sayed, S.H. Khidr, E.M. Niazy, Anal. Lett. 27 (1994) 55. [8] B.J. Shields, J.J. Mackichan, J. Liq. Chromatogr. 13 (1990) 2643. [9] J.G. Besner, C. Band, J.J. Rondeau, L. Yamlahi, G. Caille, F. Varin, J. Stewart, J. Pharm. Biomed. Anal. 7 (1989) 1811. [10] M.S. Suleiman, N.M. Najib, Y.M. El-Sayed, A. Badwan, Analyst 114 (1989) 365. [11] H. Takahashi, H. Ogata, H. Echizen, T. Ishizaki, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 63 (1987) 243. [12] F. Albani, R. Riva, M. Contin, A. Baruzzi, Biomed. Chromatogr. 2 (1987) 135. [13] H.Y. Aboul-Enein, M.R. Islam, Toxicol. Environ. Chem. 26 (1990) 1. [14] A.A. Fatmi, G.V. Williams, Drug. Dev. Ind. Pharm. 15 (1989) 1365. [15] J.W. Kelly, J.G. Ni Kelly, LCGC 6 (1988) 61. [16] M. Prosek, M. Katic, I. Verbic, Comput. Appl. Lab. 1 (1983) 223. [17] K.W. Riggs, A. Szeitz, D.W. Rurak, A.E. Mutlib, F.S. Abbott, J.E. Axelson, J. Chromatogr-B. Biomed. Appl. 660 (1994) 315. [18] L.M. Ross-Lee, M.J. Eadie, F. Bochner, W.D. Hooper, J.H. Tyrer, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 9 (1980) 175. [19] Y.S. Chang, Y.R. Ku, K.C. Wen, L.K. Ho, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 23 (2000) 2009. [20] R. Kerr, L. Jung, Spectra 2000 [Deux-Mille] 18 (1990) 33. [21] J. Fan, Y.H. Chen, C.L. Ye, S.L. Feng, Fenxi. Huaxuc. 29 (2001) 216. [22] B.A. Moussa, J. Pharm. Biomed. Anal. 23 (2000) 1045. [23] P.G. Ramappa, S. Revanasiddappa, H.D. Revanasiddappa, Indian- Drugs 36 (1999) 381. [24] M. Royo-Herrero, A. Mellado-Romero, J. Martinez, Calatayud Talanta 47 (1998) 223. [25] F.M. Abdel-Gawad, N.M. EL-Guindi, Anal. Lett. 28 (1995) 1437. [26] A.E. El-Gendi, Spectrosc. Lett. 25 (1992) 1297. [27] Z. Chen, X. Wang, Yaowu. Fenxi. Zazhi. 12 (1992) 113. [28] P.G. Ramappa, C. Shivakumara, East. Pharm. 33 (1990) 149. [29] S.S. Zarapkar, S.R. Mehra, Indian-Drugs 26 (1989) 357. [30] A. Abd-El-Bary, N.H. Foda, S. Tayel, S. El-Shater, Egypt J. Pharm. Sci. 29 (1988) 493. [31] D.M. Shingbal, S.V. Joshi, Indian-Drugs 21 (1984) 517. [32] Metrohm Application Bulletin, 263/1e, 2001. [33] C. Diaz, J.C. Vidal, J. Galban, J. Lanaja, J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. 258 (1989) 295. [34] A.A. Badwan, O.A. Jawan, L. Owais, Inst. J. Pharm. 28 (1986) 41. [35] V.P. Kalaschnikov, T.M. Dolotova, A.F. Minka, V.A. Kotlyarova, Farm. Zh. Kiev. 5 (1997) 66. [36] D.M. Shingbal, V.S. Velingkar, Indian-Drugs 25 (1988) 529. [37] D.M. Shingbal, H.S. Kudchadkar, Indian-Drugs 25 (1987) 75. [38] M. Buna, J.J. Aaron, P. Prognon, G. Mahuzier, Analyst 121 (1996) 1551. [39] H.L. Rao, A.R. Aroor, P.G. Rao, Indian-Drugs 28 (1991) 195. [40] Z.H. Wang, H.Z. Zhang, S.P. Zhou, W.J. Dong, Talanta 53 (2001) 1133. [41] G.M. Hanna, C.A. Lau-Cam, Drug. Dev. Ind. Pharm. 17 (1991) 975. [42] M.K. Park, B.R. Lim, K.S. Yu, K.H. Yong, Yakhak. Hoe. Chi. 22 (1978) 27.

[43] M. De-Villiers, D. Parkin, P. Van-Jaarsveld, B. Van-der-Walt, J. Immunol. Methods 103 (1987) 33. [44] K. Robards, P.J. Worsfold, Anal. Chim. Acta 266 (1992) 142. N.A. Al-Arfaj / Talanta 62 (2004) 255263 263 [45] R.D. Gerardi, N.W. Barnett, S.W. Lewis, Anal. Chim. Acta 378 (1999) 1. [46] N.W. Barnett, T.A. Bowser, R.A. Russell, Anal. Proc. 32 (1995) 57. [47] N.W. Barnett, T.A. Bowser, R.D. Gerardi, B. Smith, Anal. Chim. Acta 318 (1996) 309. [48] H. Han, Z. He, Y. Zeng, Anal. Sci. 15 (1999) 467. [49] W.K. Nonidez, D.E. Leyden, Anal. Chim. Acta 96 (1978) 401. [50] N.D. Danielson, L. He, J.B. Noffsinger, L. Trelli, J. Pharm. Biomed. Anal. 7 (1989) 1281. [51] M.A. Targove, N.D. Danielson, J. Chromatogr. Sci. 28 (1990) 505. [52] G.M. Greenway, A.W. Knight, P.J. Knight, Analyst 120 (1995) 2549. [53] Z. He, X. Liu, Q. Luo, X. Yu, Y. Zeng, Anal. Sci. 11 (1995) 415. [54] P. Liang, R.I. Sanchez, M.T. Martin, Anal. Chim. Acta 68 (1996) 2426. [55] F.A. Aly, S.A. Al-Tamimi, A.A. Alwarthan, Anal. Chim. Acta 416 (2000) 87. [56] Idem, Talanta 53 (2001) 885. [57] Idem, Anal. Sci. 17 (2001) 1257. [58] I. Rubinstein, A.J. Bard, J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 512. [59] G.M. Greenway, S.J.L. Dolman, Analyst 124 (1999) 759. [60] A.W. Knight, G.M. Greenway, E.D. Chesmore, Anal. Proc. 32 (1995) 125. [61] R. Caulcutt, R. Boddy, Statistics for Analytical Chemists, Chapman and Hall, London, 1983. [62] Martindale, In: James E.F. Reynolds (Ed.), The Extra Pharmacopoeia, 31st ed., The Pharmaceutical Press, London, 1996.