Prezentul document este doar un model, textulse

va adapta dup fiecare test n parte !!!!!

RAPORT DE VALIDARE A METODEI DE

DETERMINARE A xxxxx PRIN HPLC

NUME STUDENT.................................................,
AN............, GRUPA..................
DATA......................................................................

CUPRINS

1.Introducere.................................................................................................................... 3
2.Metoda .......................................................................................................................... 3
3.Procedeu experimental i rezultate............................................................................... 4
3.1.Liniaritatea ................................................................................................................ 4
3.1.1. Procedeu ........................................................................................................................... 4
3.1.2. Soluii msurate ................................................................................................................ 4
3.2. Limita de detecie i limita de cuantificare ......................................................................... 7
3.3. Precizia i exactitatea ......................................................................................................... 7
3.3.1. Precizia sistemului............................................................................................................ 7
3.3.2. Precizia metodei ............................................................................................................... 8
3.3.3. Exactitatea metodei .......................................................................................................... 9
4. Concluzii generale ................................................................................................................ 9

1. INTRODUCERE
Prezentul raport descrie dezvoltarea i validarea metodei analitice de determinarea a ***
prin HPLC..
2. METODA
2.1. Aparatur

cromatograf de lichide echipat cu detector spectrofotometru UV - VIS;

coloan cromatografic Stable BondSB C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 m).

2.2. Condiii cromatografice

faza mobil este format din amestecul CH3CN : H2O : CH3COOH n raportul 99 : 99 :
1 cu un debit de 0,7 mL/minut;

detecia se realizeaz n fluorescen cu lungimea de und de excitaie (ex) de 228 nm

i lungimea de und de emisie (em) de 423 nm ;

volumul de prob analizat este de 20 L.

2.3. Soluii

1) Metanol HPLC;
2) Acetonitril HPLC;
3) Acid acetic glacial;
4) Ap dublu distilat;
5) Soluii etalon
Soluie etalon stoc (Soluie A): o cantitate de 5 mg *** dizolvat n 10 mL
metanol HPLC (1 mg/mL).
Soluie etalon: 1 mL soluie etalon stoc n 20 mL (cu metanol).

Din soluia etalon au fost preparate prin diluie cu metanol HPLC soluii de lucru cu
concentraii cuprinse n domeniul 10 ng/mL 1,25 g/mL. Soluiile astfel rezultate au fost filtrate
prin filtru de celuloz cu mrimea porilor de 0,2 m.
Limit: Testul nu este valid dac deviaia standard a unui numr de trei analize replicate
din soluie etalon este mai mare de 10%.

3. PROCEDEU EXPERIMENTAL I REZULTATE

3.1. Linearitatea

3.1.1. Procedeu
Se prepar i analizeaz soluii etalon de *** cu valorile concentraiilor cuprinse ntre
9,765625 ng/mL i 1,250 g/mL. Pentru fiecare valoare a concentraiei au fost analizate un
numr de 6 soluii. Valorile medii ale ariilor picurilor obinute se reprezint grafic n funcie de
concentraie.
Valorile experimentale obinute sunt redate n tabelul nr. 1 iar curba de calibrare n figura
nr.1.
3.1.2. Soluii msurate
Soluiile msurate sunt preparate din Soluia etalon prin diluare cu metanol HPLC.
1)

0,1 mL soluie etalon / 2,0 mL =>

2,500 g/mL

2)

1,0 mL soluie (1) / 2,0 mL

=>

1,250 g/mL

3)

1,0 mL soluie (2) / 2,0 mL

=>

0,625 g/mL

4)

1,0 mL soluie (3) / 2,0 mL

=>

0,3125 g/mL

5)

1,0 mL soluie (4) / 2,0 mL

=>

0,15625 g/mL

6)

1,0 mL soluie (5) / 2,0 mL

=>

0,078125 g/mL

7)

1,0 mL soluie (6) / 2,0 mL

=>

0,0390625 g/mL

8)

1,0 mL soluie (7) / 2,0 mL

=>

0,01953125 g/mL
4

9)

1,0 mL soluie (7) / 2,0 mL

=>

0,009765625 g/mL

Tabelul nr.1. Valorile ariilor picurilor corespunztoare *** pentru un numr de 6 determinri n
funcie de concentraia analizat.
Ochratoxina A

Arie pic

Arie

II

III

IV

VI

medie

0,009765625

20

17,1

15,9

13,8

18,1

17,8

17,1

0,01953125

33,8

26,7

30,9

25,4

26,2

33,3

29,4

0,0390625

56,1

53,4

45,1

47,9

42,6

48,7

49,0

0,078125

95,0

86,7

93,3

89,3

85,8

80,6

88,5

0,15625

177,3

172,8

165,8

165,7

164,5

158,3

167,4

0,3125

337,8

328,5

331,9

302,5

306,8

321,5

321,5

0,625

628,4

614,5

619,7

602,1

559,9

611,5

606,0

1,25

1232,1 1194,8 1166,5 1192,6 1041,4 1202,2

1171,6

(g/mL)

1400

Arie Medie

1200
1000
800
600
400
200
0
0

0.5

1.5

Concentratie (ug/mL)
Figura nr.1. Linearitatea metodei de determinare cantitativ a *** prin HPLC
Coeficient de corelaie (R) = 0,99979
5

Interceptul (a) = 16,80341

Panta (b) = 930,0621
Arie pic = a + b x Concentraia
Arie pic = 930,0621 x Concentraia + 16,80341

Date statistice
n urma prelucrrii statistice a valorilor ariilor picurilor corespunztoare ***, s-au obinut
urmtoarele rezultate:
A) Coeficieni statistici
Regresie
Coeficient de corelaie (R)

0,99979

Coeficient de regresie R2

0,999581

Eroare Standard (ES)

8,89368

Intercept

16,80341

Panta

930,0621

Conform acestor valori se obin:

a) ecuaia dreptei de calibrare: Arie pic = 930,0621 x Concentraia + 16,80341
b) coeficientul de corelaie (R) = 0,99979
c) eroarea standard a dreptei de regresie: ES = 8,89368

Concluzie: Metoda de analiz a *** prin metoda descris este linar pe domeniul de
concentraie cuprins n intervalul 9,765625 ng/mL - 1,250 g/mL, coeficientul de
regresie (R) avnd valoarea de 0,99979 (limita pentru coeficientul de regresie este:
R > 0,997.

3.2. Limita de detecie i limita de cuantificare

Pentru determinarea limitei de detecie i a limitei de cuantificare se utilizeaz urmtoarele
formule:
LD se calculeaz utiliznd formula:
LD = (ES x 3,3) / a
LC se se calculeaz utiliznd formula:
LC = (ES x 10) / a
unde ES reprezint deviaia standard a pantei dreptei de regresie iar a reprezint panta
dreptei de regresie.
Avnd n vedere faptul c valoarea concentraiei de interes este foarte sczut, s-a calculat
ecuaia dreptei de regresie doar pentru valori mici ale concentraiei, cuprinse n intervalul
9,765625 ng/mL - 0,0390625 g/mL. n acest interval, deviaia standard a dreptei de regresie are
valoarea 1,534983 iar panta dreptei de regresie are valoarea 1045,961.
Utiliznd aceste valori se obine c LD = 4,403 ng/mL, iar LC = 0,014675 g/mL.

3.3. Precizia i exactitatea

3.3.1. Precizia sistemului

Pentru a examina precizia sistemului, aceeai soluie coninnd *** n concentraia de
interes (19,5 ng/mL) a fost analizat de 5 ori i s-au nregistrat ariile picurilor obinute. Pentru
aceste valori s-a calculat valoarea medie, deviaia standard i deviaia standard relativ.

Nr.
crt.

Arie pic

26,7

30,4

30,7

26,2

31,8

Arie medie

29,16

SD

2,5344

RSD (%)

8,6912

Concluzie: avnd n vedere valoarea deviaiei standard relative obinute (RSD =

8.69127%), se poate afirma c la determinarea prin spectrofotometrie n vizibil a nimesulidului,
sistemul este precis.
Valoarea deviaiei standard relative (RSD) este mai mic de 10% (valoare ce reprezint
limita pentru precizia sistemului pentru determinarea *** n condiiile de lucru).

3.3.2. Precizia metodei

Pentru determinarea preciziei metodei de determinare a *** s-a ales varianta de lucru cu
un minim de 9 determinri acoperind domeniul specific de concentraie: 3 determinri la 3 valori
ale concentraiei
Prepararea soluiei test: se prepar soluii de *** n aceeai manier ca i n cazul curbei
de calibrare obinndu-se n final soluii cu urmtoarele concentraii:
1,0 mL soluie (6) / 2,0 mL

=>

0,0390625 g/mL (50%)

1,0 mL soluie (7) / 2,0 mL

=>

0,01953125 g/mL (100%)

1,0 mL soluie (7) / 2,0 mL

=>

0,009765625 g/mL (200%)

Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor picurilor corespunztoare

nimesulidului se calculeaz concentraia (n g/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin
concentraia calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile obinute sunt
prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaia standard, deviaia standard
relativ i intervalul de ncredere pentru fiecare valoare individual ca i pentru valoarea medie.
Deviaia standard relativ trebuie s aib o valoare ct mai mic.
Ecuaia dreptei de calibrare este:
C=

Arie 7,32283333333333
1075,20731428571

Soluiile test:

Nr.

Concentraie

crt.

teoretic (g/mL)

Arie pic

Concentraie

Regsirea

calculat (g/mL)

(%)

20,0

0,011790439

120,7

18,1

0,010023338

102,6

17,8

0,009744322

99,8

33,8

0,024625174

126,1

26,2

0,017556769

89,9

33,3

0,024160147

123,7

56,1

0,045365360

116,1

42,6

0,032809642

84,0

48,7

0,038482966

98,5

1
2

0,009765625

0,01953125

0,0390625

9
Date statistice

Media

106,8

Deviaia standard (SD)

15,3

Deviaia standard relativ =

14,3%.

3.3.3. Exactitatea metodei

Acurateea (exactitatea) este o caracteristic ce reflect apropierea rezultatelor analitice de
valoarea adevrat. Exactitatea este deci o msur a deviaiei valorii medii gsit prin analiz,
fa de valoarea adevrat.
Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se analizeaz un numr de trei probe,
msurndu-se experimental aria picului.

Soluiile test:
Nr.

Concentraie

crt.

teoretic (g/mL)

Concentraie

Regsirea

calculat (g/mL)

(%)

17,1

0,009093285

93,1

13,8

0,006024110

61,7

15,9

0,007977221

81,7

26,7

0,018021796

92,3

25,4

0,016812727

86,1

30,9

0,021928019

112,3

53,4

0,042854216

109,7

47,9

0,037738924

96,6

45,1

0,035134775

89,9

1
2

0,009765625

0,01953125

0,0390625

Arie pic

Regsirea medie = 91,5% (valoare minim = 61,7%; valoare maxim 112,3%)

Concluzie: regsirea medie n studiul exactitii metodei de determinare a nimesulidului

prin spectrofotometrie n vizibil are valoarea de 91,5 % pe intervalul 61,7 112,3 %.

Concluzii generale

S-a studiat liniaritatea funciei de rspuns (s-a urmrit modificarea ariei picurilor n
funcie de concentraia analizat). Funcia de rspuns este liniar pe domeniul studiat (0,009
1,25 g/mL). Ecuaia dreptei de regresie obinute s-a calculat prin metoda celor mai mici ptrate
(coeficient de corelaie r = 0,9997):
Absorban = 930,06 x Concentraia (g/mL) + 16,803

S-a calculat limita de detecie (LD = 4,4 ng/ mL) i limita de cuantificare (LQ = 0,014
g / mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviaiei standard i a pantei dreptei de
regresie.

Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

10

 repetabilitatea deteciei (precizia sistemului) pentru un numr de 5 determinri, valoarea

deviaiei standard relative (RSD) fiind de 8,6912%;
 repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluii independente la trei nivele
de concentraie diferite pentru care valoarea deviaiei standard relative (RSD) este de 14,3%;

n vederea estimrii exactitii s-a determinat regsirea pentru un numr de trei probe la trei
nivele de concentraie diferite obinndu-se o regsire medie de 91,5% (valoare minim = 61,7%;
valoare maxim 112,3%)

11