CUPRINS 1. 2. 3. 4. 5. 6.

DOMENIU DE APLICARE DOCUMENTE DE REFERINTA DEFINITII DESCRIEREA ACTIVITATII INREGISTRARI RESPONSABILITATI

1. DOMENIU DE APLICARE Prezentul document are rol de ghid pentru validarea metodelor in laboratoarele de analize medicale in vederea satisfacerii cerintei 5.4.5. Validarea metodelor din SR EN ISO/CEI 17025:2005 cu privire la metodele nestandardizate sau dezvoltate in laborator. Aceasta procedura stabileste directii minime cu privire la modul de validare si la parametrii de performanta care trebuie evaluati in vederea validarii medodelor utilizate de laboratorle de analize medicale. 4. DOCUMENTE DE REFERINTA 4.1. Ghidul EURACHEM - The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics 4.2. SR EN ISO/CEI 17025:2005 - Criterii generale pentru competena laboratoarelor de ncercri i etalonare. 3. DEFINITII 3.1. Validarea (SR EN ISO/CEI 17025:2005) - confirmarea prin examinare si furnizarea de dovezi obiective ca sunt indeplinite cerintele pentru utilizarea intentionala 3.2. Validarea metodei (Ghidul EURACHEM - The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics) procesul prin care laboratorul isi stabileste caracteristicile de perfomanta si limitele metodei si prin care identifica factorii care influenteaza aceste caracteristici precum si gradul de influenta al acestor factori procesul prin care laboratorul verifica daca metoda este adecvata scopului in care va fil utilizata 4. DESCRIEREA PROCEDURII

4.1. CONDITIILE IN CARE TREBUIE SA SE VALIDEZE METODELE 4.1.1. CAND SE REALIZEZA VALIDAREA METODEI Un laborator trebuie sa valideze o metoda de lucru atunci cand este necesar sa se stabilesca daca parametrii de performanta ai acesteia sunt adecvati pentru rezolvarea probele analitice urmarite, cum ar fi : atunci cand laboratorul introduce in lucru o metoda pe care nu a mai utilizat-o in trecut atunci cand trebuie implementate imbunatatiri ale metodei ca urmare a introducerii de imbunatatiri de catre producatorul reactivulului (ex. generatie noua de reactivi), a schimbarii echipamentului, a schimbarii producatorului reactivilor etc. atunci cand metoda este extinsa si pentru a fi utilizata si pentru un alt scop decat cel de pana in prezent (ex. extinderea utilizarii metodei de determinarea a glucozei din ser la urina) atunci cand rezultatele controlului de calitate indica o modificare a performantelor metodei pentru a demonstra echivalenta a doua metode utilizate in laborator (ex. o metoda nou introdusa fata de metoda utilizata pana in prezent, sau fata de o metoda standardizata) pentru a demonstra echivalenta utilizarii metodei cu instrumente diferite cand se utilizeaza o metoda validata in alt laborator, dar se utilizeaza echipament sau operator diferit

4.1.2. STABILIREA GRADULUI DE EXTINDERE AL VALIDARII Gradul de extindere al validarii trebuie sa tina cont de : - relevanta parametrilor evaluati pentru utilizarea intentionala (ex. pentru determinari de biochimie este relevanta determinarea limitelor de detectie ale metodei ; pentru determinari imunologice de markeri infectiosi este relevanta stabilirea sensibilitatii si specificitatii metodei) - relevanta parametrilor evaluati pentru a satisface cerintele clientului (ex. este necesara stabilirea limitelelor de detectie pentru a identifica daca metoda este potrivita pentru probe pediatrice si/sau probe de la adulti) - natura modificarilor aduse atunci cand se implementate imbunatatiri ale metodei - natura diferentelor atunci cand se compara metode diferite, echipamente diferite etc. Chiar si atunci cand se introduc in lucru metode standardizate sau publicate in literatura de specialitate este necesara o validare pentru a stabili modul in care laboratorul reuseste sa obtina performanta indicata in referential (standard, literatura, specificatiile producatorului date in prospectul de lucru etc.) Validarea trebuie sa fie un echilibru intre costuri, riscuri si posibilitati tehnice. 4.1.3. CONDITIILE TEHNICE IN CARE SE REALIZEAZA METODA Validarea metodei trebuie sa se realizeze in urmatoarele conditii: 1) Responsabilul de validare este o persoana competenta Documente doveditoare - dovezi ale calificarii si experientei responsabilului de validare in domeniul specific - Fisa postului responsabilului de validare 2) Conditiile de mediu cerute de specificatiile metode (ex. specificatiile date de producatorul echipamentului, reactivilor, literatura de specialitate) sa fie satisfacute Documente doveditoare - Inregistrari ale monitorizarii conditiilor de mediu in momentul validarii

3) Echipamentul este in buna stare de functionare, este etalonat inainte de validare si calibrat corespunzator Documente doveditoare - Dovezi ale verificarii bunei functionari a echipamentului - Certificat de etalonare - Plan si inregistrari ale mentenantei echipamentului - Curba de calibrare - Certificat de calitate/conformitate al lotului de calibrator utilizat care sa specifice termenul de valabilitate 4) Reactivii utilizati sunt adecvati lucrului cu echipamentul care urmeaza a fi utilizat si sunt in termen de valabilitate Documente doveditoare - Certificat calitate/conformitate al lotului de reactivi utilizati care sa specifice termenul de valabilitate - Specificatiile producatorului reactivului care arata ca metoda de lucru este destinata echipamentului utilizat 5) Materialele de referinta utilizate in procesul de validare sunt adecvate metodei care urmeaza a fi validate (ex. tabelele de valori ale concentratiilor analitilor serului de control intern au valori specifice analizorului si principiului chimic ce urmeaza a fi utilizate) si sunt in termen de valabilitate Documente doveditoare - Certificat de calitate/conformitate al lotului de material de referinta utilizat care sa specifice termenul de valabilitate - Tabel de valori ale concentratiilor analitilor pentru lotul de material de referinta utilizat, furnizat de producatorul materialului 4.1.4. PARAMETRII VALIDARII Informatiile folosite pentru a valida metoda pot fi obtinute prin testari in laborator sau din alte surse (informatii date de producatorul reactivilor/echipamentului, literatura de specialitate, standarde de metode etc.) Parametrii care trebuie evaluati sunt cel putin urmatorii : - limita minima de detectie - limitele domeniului de masurare - precizia (repetabilitate/reproductibilitate) - acuratete (exactitate) 4.1.4.1. Limita minima de detectie -LD Aceasta limita este cea mai mica valoare (concentratie, cantitate, etc) care poate fi detectata Aceasta limita se determina astfel : Se masoara de 10 ori un blanc al probei (o proba cu aceeasi matrice ca si probele care sunt masurate in mod normal, dar fara analitul care este analizat). Se calculeaza media celor 10 determinari si abaterea standard (SDblanc proba). LD = media blancului probei + 3SDblanc proba Observatie : un blanc al probei este greu de obtinut In acest caz se poate considera LD = 3SD al probei pentru care concentatia este egala cu limita minima de cuantificare (vezi mai jos)

4.1.4.2. Limitele de masurare Limitele de masurare sunt : a) Limita minima de cuantificare cea mai mica concentratie de analit care poate fi determinata cu un nivel acceptabil al repetabilitatii si acuratetii( cu calibratorii ) Aceasta limita se determina prin testarea mai multor probe preparate cu concentratii mici (ex. dilutii diferite ale unui ser de control), apropiate de limita minima de masurare specificata de producatorul kitului de reactivi. Fiecare proba este testata de 10 ori si se calculeaza pentru fiecare valoarea medie si abaterea standard. Se considera ca limita minima de masurare proba cu cea mai mica concentratie si pentru care abaterea standard are o valoare acceptabila. Observatii : 1. Daca limita minima a curbei de calibrare este mai mare decat limita minima de masurare, atunci trebuie acordata atentie modului in care se realizeaza extrapolarea. In acest caz, daca se utilizeaza un analizor automat, atunci limita minima de masurare pe care o poate obtine laboratorul este data de limita minima a curbei de calibrare. 2. Daca limita minima a curbei de calibrare este data de valoarea 0 a concentratiei, atunci limita minima de masurare a analitului va fi foarte probabil mai mare decat 0 si trebuie determinata de laborator ca mai sus b) Limita maxima de masurare cea mai mare concentratie de analit care poate fi determinata fara a dilua proba Aceasta limita se determina prin testarea mai multor probe preparate cu concentratii mari, apropiate de limita maxima de masurare specificata de producatorul kitului de reactivi. Fiecare proba este testata de 10 ori si se calculeaza pentru fiecare valoare medie si abaterea standard. Se considera ca limita maxima de masurare proba cu cea mai mare concentratie si pentru care abaterea standard are o valoare acceptabila. Observatii : 1) In cazul in care curba de calibrare a analizorului este liniara, atunci limita maxima de masurare este egala cu limita de liniaritate (specificata de producatorul kit-ului reactivi). 2) In cazul in care curba de calibrare nu este liniara (ex. determinari imunologice), atunci atunci trebuie acordata atentie modului in care se realizeaza extrapolarea. In acest caz, daca se utilizeaza un analizor automat, atunci limita maxima de masurare pe care o poate obtine laboratorul este data de limita maxima a curbei de calibrare. c) Adecvarea domeniului de masurare la cerintele clientilor Laboratorul trebuie sa arate ca domeniul sau de masurare include domeniul de referinta biologic (domeniul de valori normale) si acopera valorile patologice corespunzatoare populatiei de pacienti care se adreseaza laboratorului in mod obisnuit. 4.1.4.3. Precizie Laboratorul trebuie sa stabileasca repetabilitatea si reproductibilitatea pe materiale de referinta (pentru controlul intern) cu valori cunoscute ale concentratiei analitilor, atat pe probe cu valori normale, cat si pe probe cu valori patologice a) Pentru stabilirea repetabilitatii (precizia intra-determinare): laboratorul masoara mai multe replici ale materialului de referinta, una dupa alta, in aceleasi conditii, cu acelasi echipament, reactivi, operator, intr-un interval de timp foarte scurt si va estima abaterea standard

Abaterea standard obtinuta de laborator trebuie sa fie mai mica sau egala cu cea specificata de producatorul kitului de reactivi sau al echipamentului (daca aceasta informatie este disponibila) b) Pentru stabilirea reproductibilitatii (precizia inter-determinari)-+=repetabilitate interdeterminari laboratorul masoara mai multe replici ale materialului, in aceleasi conditii, cu acelasi echipament, reactivi, operator, in zile diferite si va estima abaterea standard Abaterea standard obtinuta de laborator trebuie sa fie mai mica sau egala decat cea specificata de producatorul kitului de reactivi sau al echipamentului (daca aceasta informatie este disponibila) si decat cea specificata de producatorul materialului de referinta utilizat.

4.1.4.4. Acutatete Laboratorul trebuie sa stabileasca acurateatea (exactitatea) pe materiale de referinta (pentru controlul intern) cu valori cunoscute ale concentratiei analitilor, atat pe probe cu valori normale, cat si pe probe cu valori patologice a) Bias-ul(%) : laboratorul masoara mai multe replici ale materialului de referinta, in aceleasi conditii, cu acelasi echipament, reactivi, operator, in zile diferite si va estima valoarea medie. Bias = 100x(Valoarea medie obtinuta de laborator Valoarea tinta a materialului de referinta)/ valoarea tinta a materialului de referinta. Aceasta marime trebuie sa fie mai mica sau egala cu valoarea permisa specificata de producatorul reactivilor sau analizorului, daca aceasta informatie este disponibila. Daca valoarea minima permisa a biasului nu este specificata de producator, atunci laboratorul trebuie sa isi stabileasca propriile criterii. b) Prin participari la comparari interlaboratoare, laboratorul trebuie sa identifice care este abaterea rezultatului pe care il obtine fata de valoarea cu care este comparat. Din analiza rezultatelor la comparari interlaboratore, laboratorul va stabili daca perfomanta sa in comparatie cu alte laboratoare este acceptabila. 4.1.4.5. Incertitudinea de masurare Incertitudinea de masurare va fi calculata astfel : a) Se determina incertitudinea de tip A Incertitudinea de tipa A este data de abaterea standard a mediei obtinuta in urma a 20 masurari realizate pe materialul de referinta, in zile diferite : U A = SDmediei =
x

(x
k =1

x)

n ( n 1)

unde este media aritmetic a celor n = 20 rezultate notate cu xk. b) Se estimeaza incertitudinea de tip B Sursele pot fi : - certificatul de etalonare al echipamentului (acolo unde este aplicabil) UB = U specificat in certificatul de etalonare /k specificat in certificatul de etalonare

- specificatii din literatura sau ale producatorului reactivului, echipamentului (daca aceste informatii sunt disponibile si daca certificatul de etalonare ala nalizorului nu specifica o valaore a incertitudinii pentru analitul respectiv) - specificatiile materialului de referinta utilizat: 12
UB = (limita superioara a materialului de referinta limita inferioara a materialului de referinta)/

c) Se calculeaza incertitudinea compusa:

2 UC = U2 A + UB

Daca sunt mai multe surse de incertitudine de tip B atunci:

2 2 UC = U2 A + U B1 + U B 2

d) Se calculeaza incertitudinea extinsa: Ue = kUc Pentru o distribuie normal de valori ale mrimii de msurat (Gauss), valoarea k = 1 a factorului de extindere corespunde unui nivel de ncredere de 68,27%, valoarea k = 2 corespunde unui nivel de ncredere de 95,45 % iar valoarea k = 3 corespunde unui nivel de ncredere de 99,73%. e) Rezultatul unei msurri a mrimii x va fi exprimat sub forma: x = kUc(x) cu nivelul de ncredere corespunztor factorului k ales Intervalul de incertitudine este exprimat sub forma:
x x

( - kUc(x), + kUc(x)) cu nivelul de ncredere corespunztor factorului k ales 4.1.5. RAPORTUL DE VALIDARE Raportul de validare trebuie sa contina urmatoarele: prezentarea conditiilor in care a fost realizata validarea (data, responsabil - competenta, echipamente certificat etalonare, reactivi, calibratori, materiale de referinta utilizate loturi, termene de valabilitate, conditii de mediu, etc) prezentarea cerintelor (de adecvare la scop si de performanta) pe care trebuie sa le satisfaca metoda prezentarea rezultatelor obtinute in urma testelor efectuate de laborator (de preferat sub forma tabelara) concluzii cu privire la satisfacerea fiecareia dintre cerinte o declaratie de validitate a metodei La raportul de validare se vor anexa curbele de calibare (sau punctele curbei de calibrare) si tabelele de valori pe baza carora s-au calculat parametrii considerati in validare. Raportul de validare va face referinta la aceste Anexe precum si la alte documente si inregistrari relevante. Documente relevante - Raportul de validare, inregistrarile anexate - Documente si inregistrari conexe 6 RESPONSABILITI

6.1 Seful de laborator - propune validarea metodei de analize medicale; - urmrete procesul de derulare a metodei de validare; - propune validri bilaterale (participarea la scheme de comparatii interlaboratoare) - aprob raportul de validare 6.2. Responsabilul de incercare : utilizeaza metodele validate - estimeaza incertitudineaa de masurare participa la desfasurarea programului de validare executa a analize, prelucreaza date, intocmeste raportul de validare 6.1.1.1.1 NREGISTRRI Raport de validare, cod PV 14-01