Determinarea nitrozaminelor genotoxice în Valsartan prin cromatografie

gazoasa cuplata cu spectrometrie de masa

INTRODUCERE

Cromatografia este o tehnică de separare a compuşilor dintr-un amestec pe baza repartiţiei lor
diferentiate între 2 faze: faza staţionară şi faza mobila.

Figura 1. Procesul cromatografic

 Faza staționară reține analiții datorită diferitelor interacții ce au loc.

 Atunci când diferiți compuși în concentrații diferite trec prin coloană, aceștia se separă în zone individuale.
INTRODUCERE
Cromatografia de gaze (numita adesea si cromatografie in faza gazoasa sau gazcromatografie) se aplica la
separarea substantelor volatile si usor volatilizabile la temperaturi mai mici de 400 oC.

Figura 2. Schema de
functionare a unui gaz
cromatograf

În cromatografia de gaze:
Faza mobilă este în stare gazoasă (Gaz Purtator ), compuşii de analizat în stare gazoasă
Condiția pe care compușii trebuie sa o îndeplinească pentru a putea fi analizați prin GC:
să fie volatili (volatilizabili ) şi stabili termic (trebuie să treacă în stare de vapori fără descompunere).
INTRODUCERE

Figura 3. Componentele unui gaz cromatograf

INTRODUCERE
 AUTOSAMPLER  proba poate fi injectata in stare lichida – INJECTARE DIRECTA
 proba poate fi injectata prin tehnica “headspace”  camera de agitare a probei

 INJECTORUL  poate fi de tip SPLIT (divizare)– doar o parte din proba este transferata in coloana
 poate fi SPLITLESS (fara divizare) – intreaga cantitate de proba este introdusa in
coloana

 COLOANA CROMATOGRAFICA  instrumentul unde are loc retentia si separarea analitilor dintr-un
compus

• Cum interacția analitului cu faza mobila (gazul purtator) este aproape neglijabilă, parametrii cei mai
importanți în vederea separării analiților vor fi faza staționară a coloanei și temperatura.
• Din punct de vedere chimic, fazele staționare sunt în principal de tip polisiloxan, dar și
polietilenglicol.

 DETECTORI ULITIZATI IN GC: Detectorul cu conductibilitate termica

Detectorul cu ionizare in flacara – cel mai folosit
Detectorul termoionic
Detectorul prin fotometrie de flacara
Detectorul cu captura de electroni.
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

 
Studiul are la baza compararea rezultatelor obtinute pentru determinarea nitrozaminelor
genotoxice prin metoda GC-MS utilizand cele doua moduri de injectare a probelor: injectare
directa (lichida) si tehnica “Headspace”.

Impuritatile genotoxice analizate in substanta activa Valsartan sunt:

 NDMA (N-nitrozodimetilamina) si respectiv,
 NDEA (N-nitrozodietilamina)

Aceste impuritati genotoxice sunt clasificate ca substanțe chimice cu

genotoxicitate/mutagenicitate și cancerigene, astfel încât in urma analizei probelor se
va asigura că nivelurile acestor impuritati nu sunt mai mari decât limitele acceptate.
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

1. Detectarea nitrozaminelor în Valsartan prin injectare lichidă GC-MS

Metoda instrumentala si pregatirea probelor - Ca sistem de analiza s-a folosit un gaz-cromatograf cu injector
split/splitless cuplat cu un spectrometru de masa cu un singur quadrupol.

Parametri Gaz cromatograf (GC)

Volum injectie (μL) 1

Liner Splitless
Temperatura injector 250 Parametri Spectrometru de masa (MS)
(oC)
Gaz purtator (ml/min) He, 1 Linia de transfer (oC) 250
Mod de injectie Splitless
Sursa Ion (oC) 300
Spltless time: 1min
Split flow: 50ml/min Metoda de achizitie Timed-SIM

Coloana TraceGOLD TG-WaxMS Parametri T-SIM NDMA: 6.08 min,74,42 m/z

30m x 0.25mm x 0.25μm (compus, timp DMF: 6.35 min,73,44,42 m/z
45oC (mentinere 1 min), 15oC/min 180oC, retentie, si ioni SIM) NDEA: 6.8 min, 102, 57, 42 m/z
Program temp coloana
20oC/min 250oC (mentinere 1 min)
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Prepararea solutiilor

 Soluția de referință pentru NDMA și NDEA a fost preparată în metanol la o concentrație finală de
0,03 μg/mL (ppm) fiecare.

 Soluția test a fost preparată prin dizolvarea a 0,5 g proba (medicament) în 5 mL metanol urmată
de extracție cu ultrasunete timp de 15 minute și centrifugare la 3000 rpm timp de 5 minute. Un
volum de 2 ml de supernatant a fost filtrat printr-un filtru de nylon de 0,45 μm.

 Soluția pentru adecvanta sistemului care conține N-dimetilformamidă (DMF) ca standard intern,
precum și NDMA și NDEA, a fost preparată în metanol la o concentrație finală de 6 μg/mL (ppm).

 Soluția pentru testarea sensibilității aparatului pentru NDMA și NDEA a fost făcută în metanol la
o concentrație de 0,005 μg/mL fiecare.
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Rezultate
Criteriile de admisibilitate pentru adecvanta sistemului au fost urmatoarele:

 rezolutia intre NDMA si DMF trebuie sa fie mai mare de 1.5;

 pentru testarea sensibilitatii, raportul S/N (signal to noise) >10;
 solutia de referinta trebuie sa prezinte un RSD (relative standard deviation) <10%, pentru 6 injectari consecutive.

Rezolutie NDMA si DMF – 2.64

Rezolutie DMF si NDEA – 3.17

Figura 4. Cromatograma obtinuta cu solutia pentru adecvanta sistemului, la nivelul de concentratie 6ppm
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

S/N pentru NDMA = ~85

S/N pentru NDEA = 61

Limita de detecție ( LOD, S/ N = 3) a

NDMA și NDEA a fost de 0.18 și
respectiv 0.24 ppb, în timp ce
limita de cuantificare (LOQ, S/N =
10) a fost de 0.6 și, respectiv, 0.8
ppb.
Concentrația LOQ corespunzătoare
medicamentului (API) a fost de 6.0
și, respectiv, 8.0 ppb.

Fig.5. Cromatogramele aferente testului de sensibilitate la nivelul de 5 ppb pentru (a) NDMA si (b)
NDEA.
 DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Pentru verificarea metodei analitice au fost luati in calcul o serie de parametri, cum ar fi: liniaritatea,
sensibilitatea, repetabilitatea si respectiv gradul de recuperare.
Liniaritate - calibrare externa, concentratii impuritati: 1, 2, 5, 10, 30, 50 și 100 ppb (ng/mL)

Criteriu de admisibilitate - R2> 0.995.

R2 = 0.9981 R2 = 0.9979

(a) (b)

Figura 6. Liniaritatea soluțiilor standard pentru concentratii de 1-100 ppb (ng/mL) pentru (a) NDMA; (b)
NDEA
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Repetabilitatea metodei – RSD (%) pentru soluția de referință de concentratie 30 ppb pentru 6 injectari

RSD, NDMA = 2.0 %

RSD, NDEA = 1.3%

Figura 7. Repetabilitatea ariilor pentru solutia referinta care conține

NDMA și NDEA
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Gradul de recuperare al NDMA și NDEA a fost investigat prin metoda de adaos a probei la nivel de 5 ppb,
30 ppb și 100 ppb.
 Concentrațiile calculate de NDMA și NDEA în capsula de Valsartan fără dozare au fost de 2,5 ppb și
2,7 ppb, corespunzătoare concentrațiilor de 0,025 ppm și 0,027 ppm în medicament, care sunt mai
mici decât limitele acceptate de 0,3 și 0,08 ppm.

Gradul de recuperare a fost, de asemenea,

calculat din probele cu adaos la 5 ppb, 30
ppb, 100 ppb cu valori de 105%, 93%,
101% pentru NDMA și de 104%, 92%, 102%
pentru NDEA.

Figura 8. Cromatograma pentru NDMA și NDEA

într-o probă (capsulă) Valsartan fără adaos,
precum și într-o probă Valsartan cu adaos la
niveluri de concentratie de 5, 30 și 100 ppb
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

2. Detectarea nitrozaminelor în Valsartan prin tehnica de injectare Headspace GC-MS

Metoda instrumentala si pregatirea probelor - in aceasta metoda s-a folosit un gaz cromatograf, un
spectrometru de masa avand un singur quadrupol si un autosampler tip “headspace”.

Parametri Autosampler Headspace Parametri Spectrometru de masa

Temperatura incubare (oC) 150
Linia de transfer (oC) 250
Timp incubare (min) 15
Sursa Ion (oC) 300
Bucla (oC) 180

Volum injectare (μL) 1000 Metoda de achizitie Timed-SIM

Alti parametri Mod agitare vial: rapid Parametri T-SIM NDMA: 6.08 min,74,42 m/z
Presiunea vial: 130kPa pentru 1 minut (compus, timp NDEA: 6.8 min, 102, 57, 42 m/z
Presiunea de umplere a buclei: 70kPa pentru 1 minut retentie, si ioni SIM)
Mod injectare: Standard pentru 1 minut

Parametri Gaz cromatograf

Linia de transfer (oC) 250

Mod de injectie Split ratio 5:1

Split flow 5 ml/min

Coloana TraceGOLD TG-WaxMS

30m x 0.25mm x 0.25μm

Program temp coloana 45oC (mentinere 1 min), 15oC/min 180oC,

20oC/min 250oC (mentinere 1 min)
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Prepararea solutiilor

 Solutia test a fost preparata prin cantarirea a 0.5 g pulbere din medicamentul Valsartan si dizolvarea
acestuia in DMSO (dimetilsulfoxid) la volum de 5 ml.

 Soluția pentru verificarea sensibilitatii aparatului a fost preparată prin cântărirea cantităților
adecvate de soluție de NDMA, NDEA care au fost apoi dizolvate în DMSO la o concentrație finala de
0,03 μg/mL.

 Concentrațiile soluțiilor standard utilizate pentru a testa liniaritatea au fost 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 1, 2
și 4 μg/mL.

Criterii admisibilitate pentru adecvanta de sistem:

 coeficientul de corelatie obtinut in urma liniaritatii R2 >0.995

 LOQ (limita de cuantificare) pentru NDMA: 0.1 ppm (μg/ml)
 LOQ pentru NDEA : 0.05 ppm (μg/ml) in substanta activa.
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Rezultate
Liniaritate

R2, NDMA = 0.999

R2, NDEA = 0.9997

Figura 9. Liniaritatea pentru NDMA și NDEA (0,03 μg/mL până la 20 μg/mL)

DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Sensibilitatea aparatului

S/N, NDMA = 206.3

S/N, NDEA = 96.9

LOD, NDMA = 0.4ppb (ng/ml)

LOD, NDEA = 0.9 ppb (ng/ml)

LOQ, NDMA = 1.5 ppb (0.015 ppm)

LOQ, NDEA = 3.1 ppb (0.03 ppm)

Limitele impuse initial :

LOQ, NDMA = 0.1 ppm
LOQ, NDEA = 0.05 ppm

Figura 10. Cromatograme GC-MS ale NDMA (a) și NDEA (b) la concentratii de 0,03
ppb (ng/mL) pe coloană (soluție pentru testarea sensibilitatii aparatului)
DETERMINAREA NITROZAMINELOR GENOTOXICE IN VALSARTAN PRIN GC - MS

Repetabilitatea – RSD < 5.0 % Gradul de recuperare – metoda de adaos la proba

test

Nivel de concentratie: 5 ppb, 30 ppb, 100 ppb

Proba fara adaos: NDMA = 3.1 ppb (0.031 ppm)

NDEA = ND
Limita impusa : NDMA = 0.3 ppm  corespunde
NDEA = 0.08 ppm

Proba cu adaos :

NDMA, adaos 0.25 ppb = 103.0 %

Figura 11. Repetabilitatea ariilor picurilor aferente compusilor 5.0 ppb = 84.0 %
analizati in urma a 6 injectari consecutive din solutia standard ce
contine NDMA si NDEA la nivelul de concentratie 50ppb NDEA, adaos 0.25 ppb = 92.0 %
5.0 ppb = 81.0 %
RSD, NDMA = 2.4%

RSD, NDEA = 2.1%

CONCLUZII

Rezultatele prezentate în urma acestui studiu demonstrează clar

aplicabilitatea metodelor de analiza utilizate in detectarea și cuantificarea
nitrozaminelor în medicamentul Valsartan, oferind flexibilitate și
performanță analitică excelente.

Au fost abordate doua metode instrumentale recomandate (GC-MS, HS-

GC-MS). Performanța analitică dovedită a celor doua configurații a
îndeplinit cerințele de reglementare în ceea ce privește sensibilitatea și
repetabilitatea, rezultatele obtinute incadrandu-se in criteriile de
acceptanta impuse.

Va multumesc!