L 2.

Determinarea acidului uric prin voltametrie în puls diferenţial (DPV)

pe electrod de carbon vitros

Scopul lucrării
Determinarea acidului uric (AU) prin intermediul unei metode electrochimice –
voltametria în puls diferenţial. Determinarea limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare
pentru electrodul utilizat.

Principiul metodei
Acidul uric este un acid slab cu douã constante de disociere, şi are structura
prezentatã în Fig. 1:

Fig. 1 Reprezentarea 2D şi 3D a structurii acidului uric

Pentru determinarea AU se pot folosi metode cum ar fi: electroforeza capilarã,
cromatografia pe coloanã de schimb ionic, metodele enzimatice, HPLC (cromatografie
lichidã de înaltã performanţã), metoda colorimetricã. Toate aceste metode necesitã
instrumente sofisticate şi scumpe, etape de pretratare a probelor complicate (preconcentrare
şi/sau purificare), timpi de analizã mari şi consum mare de reactivi. Pe lângã faptul ca sunt de
obicei complicate şi foarte scumpe, aceste metode clasice de detecţie prezintã adesea şi
probleme de selectivitate, sensibilitate şi reproductibilitate.
 din pacate, metoda colorimetricã nu are o acurateţe foarte bunã.
 metoda enzimaticã are selectivitate mai bunã, dar este mai scumpã şi nu poate
atinge limite de detecţie scãzute. Un alt dezavantaj este stabilitatea redusã şi preţul
ridicat.
 metodele HPLC necesitã pregatirea rapidã a probelor, un timp îndelungat de analizã
şi materiale scumpe. Metodele de electroforezã capilarã necesitã de asemenea
aparaturã foarte scumpã.
Pentru a surmonta aceste neajunsuri, a fost necesarã dezvoltarea unor metode noi,
simple, rapide şi cu costuri scãzute. Astfel de metode pentru detecţia acestor biomolecule
sunt metodele electrochimice, care prezintã caracteristici favorabile precum: costul scãzut al
aparatelor, operarea simplã, senzitivitatea mai scãzutã, şi faptul ca pot fi uşor miniaturizate.
Un alt avantaj pentru utilizarea tehnicilor electrochimice pentru detecţia acestor compuşi este
faptul ca aceştia pot fi uşor oxidaţi. Reacţia electrochimicã a acidului uric este:

1
 Metodele electrochimice impun utilizarea unor senzori şi a unor cellule
electrochimice. Senzorul este un dispozitiv ce detecteazã un analit, prin intermediul unui
receptor ce este cuplat la un traductor. Interacţia analit – receptor produce un schimb de
electroni sau emite/absoarbe fotoni pe care traductorul îi transformã într-un semnal electric,
analogic sau digital. Principiul general de construcţie şi funcţionare a unui sensor este redat în
Fig. 2.

Fig. 2 Principiul general de construcţie şi funcţionare a unui senzor

Sunt mai multe tipuri de senzori dar în lucrarea de faţã se vor utiliza cei
electrochimici. Senzorii electrochimici sunt utilizaţi în circuite electrochimice ce conţin o
celulã electrochimicã cu soluţia de analizat şi trei electrozi. Dacã s-ar lucra într-un sistem
numai cu doi electrozi, pentru electrodul de referinţã ar fi dificil sã se menţinã un potenţial
constant, în timp ce prin el trece un curent pentru a contracara procesele redox care au loc la
electrodul de lucru. De aceea se lucreazã cu un sistem de trei electrozi. Se utilizeazã un
electrod de referinţã (RE) cu un potenţial cunoscut, cu ajutorul cãruia se controleazã şi
mãsoarã potenţialul electrodului de lucru (WE) şi un contra-electrod (CE). Schema unei
celule electrochimice este prezentatã în Fig. 3.
 pe electrodul de lucru au loc procesele de electrod care furnizeazã
informaţiile analitice; poate fi anod sau catod în funcţie de reacţia care are
loc: reducere sau oxidare;
 contraelectrodul are o suprafaţa mult mai mare decât a electrodului de lucru.
E fabricat din materiale inerte precum Au, Pt, Carbon vitros. Prin el trece tot
curentul necesar pentru a contracara procesele redox care au loc la
electrodul de lucru;
 electrodul de referinţã serveşte la controlul potenţialului electrodului de
lucru. Poate fi de hidrogen, Ag/AgCl 3M KCl, calomel.

Fig. 3. Celula electrochimicã

Pentru determinarea unui analit cu ajutorul unui senzor electrochimic e necesarã
aplicarea unei metode electrochimice. Existã mai multe metode electrochimice. În lucrarea de
faţã se va folosi voltametria. Sunt mai multe tipuri de tehnici voltametrice pulsate:
voltametrie în puls normal, diferenţial şi cu unda pãtraticã. Deoarece voltametria în puls
diferenţial (DPV) va fi folositã pentru acestã lucrare, numai aceastã metodã va fi descrisã.

2
 DPV este o metodã de voltametrie pulsatã în care fiecare puls aplicat electrodului
(caracterizat de timpul t şi de amplitudinea ΔE) e precedat de un timp de aşteptare. Pulsurile
sunt mici, de amplitudine constantã. Mãsurarea curentului se face în douã puncte: în punctul
1, înainte de iniţierea pulsului, şi în punctul 2, la sfârşitul pulsului. Dupã ce pulsul e complet,
potenţialul nu mai revine la valoarea iniţialã. Diferenţa de curent este reprezentatã în funcţie
de potenţial. Modul de aplicare al potenţialului şi tipul de rãspuns este exemplificat în Fig. 4.
Tehnicile pulsate oferã avantajul cã masoarã un curent care depinde direct de
concentraţia speciilor de analit redox active din soluţie. Au limite de detecţie foarte scãzute.

Fig. 4. Voltametria în puls diferenţial: modul de aplicare al potenţialului şi tipul de rãspuns

Caracteristicile senzorilor electrochimici sunt:

 Funcţia de transfer. Reprezintã expresia relaţiei dintre semnalul de intrare şi cel de
ieşire al senzorului;
 Selectivitatea (specificitatea);
 Sensibilitatea. Se exprimã prin derivata funtiei de transfer;
 Limita de detectie (LOD) este conform Uniunii Internaționale de Chimie Pură și
Aplicată (în engleză: International Union of Pure and Applied Chemistry,
prescurtat IUPAC): concentraţia sau masa de analit ce poate fi detectatã sau
cuantificatã cu un anumit grad de certitudine;
 Limita de cuantificare (LOQ), este cea mai micã concentraţie sau masã de analit
care poate fi cuantificatã cu o precizie și acuratețe adecvată, printr-o procedura datã;
 Stabilitatea în timp;
 Timpul de rãspuns. Reprezintã decalajul în timp între variaţia semnalului de intrare şi
variaţia corespunzatoare a semnalui de ieşire. Acesta trebuie sã fie cât mai scurt
posibil;
 Gradul de participare al senzorului. Interacţiunea senzorului cu mediul studiat trebuie
sã fie cat mai redusã, perturbaţiile cauzate de prezenţa senzorului în sistem sã fie
minime. Este avantajos ca senzorul sã funcţioneze cât mai reversibil;
 Siguranţa în exploatare;
 Economicitate;

Existã mai multe metode de determinare a LOD şi LOQ: definirea vizualã, calculul
din raportul semnal/zgomot (signal/noise ratio), deviaţia standard a semnalului probei martor,
calculul prin metoda regresiei liniare din curba de calibrare la concentraţii reduse sau din
studii de precizie.
O metodã aplicabilã în toate cazurile şi mai ales atunci când metoda de analizã nu
implicã zgomotul de fond, este metoda regresiei liniare din curba de calibrare la concentraţii
reduse.
În analiza cantitativă curba de calibrare este cea care premite determinarea
concentrației unei substanțe într-o probă necunoscută prin compararea concentratiei probei
necunoscute cu un set de probe standard de concentrație cunoscută. Curba de calibrare este

3
un grafic al modului în care semnalul analitic se modifică cu concentrația analitului
(substanța care trebuie măsurată). Operatorul pregătește o serie de standarde (minim
6) în care concentraţia de analit este cunoscutã. Gama de concentrații trebuie aleasă în
apropierea valorii așteptate de concentrație a analitului. Concentrațiile standardelor trebuie să
se încadreze în domeniul de lucru al tehnicii (instrumentelor) utilizate. Analiza fiecăruia
dintre aceste standarde folosind tehnica aleasă va produce o serie de valori. Pentru
majoritatea analizelor, un grafic de semnal vs. concentrație va arăta o relație liniară. În cazul
curbei de calibrare liniare, rãspunsul este de formã algebricã y = a + b·x, unde b este
panta dreptei, iar a este ordonata la origine. Utilizând curba de calibrare şi semnalul
obtinut pentru proba necunoscută, se poate determina concentrația analitului.
Pentru aceastã metodã, se iau o serie de probe (minim 6) în care concentraţia de analit
este cunoscutã. Probele standard sunt mãsurate cu ajutorul instrumentul analitic iar rezultatele
sunt reprezentate într-un grafic de calibrare. Reprezentarea este de tipul celei din Fig. 5.

Fig. 5. Curba de calibrare liniarã

Pentru concentraţia de analit – x şi semnalul - y, se pot determina valorile medii cu

ecuaţia (1); punctul (x , y) fiind cunoscut ca „centroidul” tuturor punctelor.
x i y i
x i
; y  i
(1)
n n
unde n este numãrul de înregistrãri minime.
Panta liniei de regresie, b, poate fi determinatã cu ecuaţia 2:
 [( x - x)  (y - y)]
i i
b i
(2)
[x i
i
- x) 2

Pentru determinarea ordonatei la origine se foloseşte ecuaţia 3:

a  y  b  x (3)
Ecuatia y = a + b · x, este ecuaţia de regresie a lui y pe x, arãtând cum variazã y atunci
când x ia valori stabilite.
Valorile ŷ i reprezintã puctele de pe linia de regresie corespunzãtoare valorilor
individuale ale lui x. Se calculeazã cu ecuaţia 4:
ŷi  b  x i  a (4)
Sy/x estimeazã eroarea aleatoare în direcţia y, şi se calculeazã cu ecuaţia 5:
 (y  yˆ ) i i
2

Sy / x  i
(5)
n2

4
 Deviaţia standard a ordonatei la origine, Sa, se calculeazã cu relaţia 6 (35):
x
2
i
S S  (6) i

n   (x  x )
a y/x 2
i
i

Cu ajutorul valorii erorilor aleatoare în direcţia y (Sy/x), se calculeazã şi deviaţia

standard a pantei, folosid ecuaţia 7:
Sy / x
Sb  (7)
 (x  x ) i
i
2

Folosid fie valoarea erorii aleatoare în direcţia y sau deviaţia standard a pantei, se
pot determina limita de detecţie şi limita de cuantificare a metodei de regresie liniarã, cu
formulele 8 şi respectiv 9:
3  Sy / x 3  Sa
LOD  sau LOD  (8)
b b

10  Sy / x 10  Sa
LOQ  sau LOQ  (9)
b b
În reprezentarea graficã, limita de detecţie este acea valoare a lui x corespunzãtoare
unei valori y = a + 3·Sy/x sau y = a + 3·Sa, dupa cum este ilustrat în Fig. 6:

Fig. 6. Metoda regresiei liniare, calculul erorii aleatoare în direcţia y, a deviaţiei standard a
ordonatei la origine şi a limitei de detecţie
În lucrarea de faţã se vor utiliza doar soluţii ce conţin numai AU. În probele
biologice, AU, acidul ascorbic şi dopamina coexistã. Poate apãrea o suprapunere a
potenţialului de oxidare pe electrozii solizi, ceea ce conduce la o suprapunere a peck-urilor.
Aceasta are un efect advers asupra selectivitãţii şi reproductibilitãţii electrodului. Pentru a
rezolva acestã problem, pentru probe biologice, au fost utilizate diferite metode pentru
modificarea suprafeţei electrozilor. Electrozii modificaţi prezintã proprietãţii mecanice, fizice
si chimice unice, cea ce îi face potriviţi pentru rezolvarea dificultãţiilor privind suprapunerea
peak-urilor.
Aplicabilitatea metodei
Acidul uric este un antioxidant puternic dar se comportã şi ca factor pro-oxidant şi
proinflamator. Acesta datoritã faptului cã acţioneazã diferit în interiorul celulei şi în mediul
extracelular. Un nivel ridicat al AU la cei ce fac exercitii fizice, se poate datora propritãţilor
sale antioxidante. Nivelul ridicat al acestuia protejând, probabil, împotriva stresului oxidativ
din timpul exerciţiilor.
Acidul uric contribuie la > 50% din capacitatea antioxidantã a sângelui. De asemenea
acidul uric are o acţiune protectivã asupra vitaminei C (acidului ascorbic) şi a vitaminei E,
având acţiune stabilizantã asupra acestor vitamine. Pentru a se manifesta efecul antioxidant al
AU în plasma e nevoie de prezenţa acidului ascorbic. De asemenea, AU are un efect direct
asupra inhibiţiei radicalilor liberi, protejând membrana celularã şi ADN-ul. Activitatea

5
antioxidantã a acidului uric are loc şi în creier, fiind un protector împotriva unor boli precum
scleroza multiplã şi boli neurodegenerative.
Xantina si hipoxantina sunt alţi produşi de degradare a metabolismului purinelor în
organismul uman alãturi de acidul uric. Datorita lipsei unei enzime (uricaza), oamenii au
nivelul seric de AU mai ridicat în comparaţie cu alte mamifere. AU este excretat în urinã.
Astfel, nivelul AU din plasmã e determinat de balanţa dintre aportul alimentar, metabolismul
endogen al purinelor şi excreţia în urinã.
Nivelul AU pentru o persoanã sãnatoasã, în ser, este cuprins între 240 şi 520 μM şi în
urinã între 1.4 şi 4.4 mM. Nivelul AU în ser este diferit pentru femei şi bãrbaţi, fiind mai
scãzut pentru femei. În salivã, nivelul de acid uric pentru indivizii sãnãtoşi variazã, dar, în
general, este în intervalul 120 µM - 400 µM. Pentru pacienţii care suferã de gutã s-au detectat
concentraţii de peste 1 mM.
Nivelul anormal al concentraţiei acestuia indicã boli precum: hiperuricemia, guta,
boala Lesch-Nian, parkinsonul, xantinuria, ischemia cerebralã, insuficienţa renalã,
toxoanemia in timpul sarcinii, etc. În mod similar, nivelurile ridicate de acid uric sunt legate
de alte afecțiuni, cum ar fi: consumul crescut de alcool, obezitatea, cu hiperglicemia, un
anume tip de diabet, colesterolul ridicat, bolile renale, apariţia şi progresia bolilor coronariene
și bolile cardiace. Multe studii epidemiologice au sugerat că acidul uric seric este, de
asemenea, un factor de risc pentru bolile cardiovasculare. Deşi pacienţii cu funcţia renalã
afectatã prezintã un nivel ridicat al acidului uric în ser, nu a fost gasitã o asociere
semnificativã a nivelului acidului uric din ser cu cauza bolilor renale.
De asemenea, o concentraţie ridicatã de uraţi (sãruri ale acidului uric) şi un pH scãzut,
conduc la formarea pietrelor de acid uric. Aceste pietre de acid uric pot fi asociate cu guta.
Hiperuricemia reprezintã un nivel foarte ridicat al acidului uric în sânge. Barbaţii au
un risc mai mare de a face hiperuricemie comparativ cu femeile. Acesta boalã devine din ce
în ce mai frecventã. Se crede cã AU joacã un rol patogen în hipertensiunea mediatã de
anumite mecanisme şi astfel hiperuricemia poate fi asociatã cu hipertensiunea.
Creşterea nivelului de acid uric în ser coincide cu creşterea presiunii sângelui şi
precede apariţia proteinuriei. Nivelul acidului uric din ser este utilizat în diagnosticul
timpuriu al pre-eclamsiei. Nivelul AU din ser creşte pe mãsurã ce boala evolueza: o cantitate
> 5.5 mg/dL e un indicator puternic al bolii, iar o cantitate >7.8 mg/dL e asociatã cu o
morbiditate semnificativã în rândul mamelor.

Aparatură şi substanţe

- Potenţiostat, celulă electrochimică, electrod de carbon vitros, electrod de referinţă Ag-

AgCl - 3 M KCl, electrod auxiliar de Pt
- Şase soluţii de AU de diferite concentraţii (solventul utilizat fiind 0.10 M tampon
fosfat, pH 7) şi soluţie de tampon fosfat 0.1 M, pH 7

Modul de lucru
 Se clãtesc electrozii apã distilatã din pisetã şi se şterg cu hârtie de filtru
 Se pregãtesc cele şase recipiente cu soluţii de acid uric
 Se coboarã electrozii astfel încât sã fie imersaţi în soluţia de AU
 Se conectează electrozii la potenţiostat/galvanostat (albastru – electrodul de referinţã
Ag/AgCl - 3 M KCl; negru – contraelectrodul de Pt, roşu – electrodul de lucru carbon
vitros GC) – Fig. 7

6
 Fig. 7. Aparatul Autolab şi conectarea celulei electrochimice
 Din softul NOVA, se deschide din Setup View, în care se introduc pe rând datele
referitoare la electrodul de lucru şi electrolitul folosit. Se stabilesc parametrii
electrochimici: domeniul: (-) 0.3 V - (+) 0.8 V, cu un pas de 5 mV, o amplitudine de
50 mV şi o vitezã de scanare de 10 mV/s (Fig. 8)

Fig. 8. Meniul Setup View

 După ce cadrul didactic a verificat corectitudinea montajului şi a parametrilor, se

înregistrează curbele DPV pentru soluția de tampon fosfat fără AU şi soluțiile de AU
de concentraţie cunoscutã. Se porneşte de la cea cu concentraţia cea mai scãzutã.
Pentru fiecare soluţie se vor face 3 măsurători.
 Cu ajutorul softului Nova, pentru fiecare din cele 6 curbă DPV înregistrată pentru
soluţiile de AU de concentraţii cunoscute se va nota înãlţimea peak-ului. Se va da
click dreapta în dreptul δi vs. E, Add Analysis, Peak search (Fig. 9. A şi B), şi apoi
Show data grid (Fig. 9. C). Se va face media aritmetică a înălțimii peak-ului pentru
soluțiile de AU cu aceeași concentrație și se vor nota în tabel.

7
 Fig. 9. Determinarea înãlţimii picului

Rezultate şi calcule
Un referat complet trebuie sã conţinã OBLIGATORIU:
1. Curbele DPV pentru soluţiile de tampon fosfat şi de AU, obţinute în urma
desfãşurãrii experimentelor;
2. Curba de calibrare: graficul înălţimea peak-urilor (axa OY) vs. concentraţie AU
(axa OX), cum este îndicat în Fig. 5 (semnal - înãlţimea peak-ului; concentraţie
analit - concentraţia de AU)
3. Ttabelele 1, 2 şi 3 completate cu ajutorul unui program de calcul, determinând
valorile cerute cu ajutorul ecuaţiilor 1 - 9, ştiind cã fiecare x reprezintã
concentraţia de AU (μM) şi fiecare Y înãlţimea peak-ului corespunzãtoare acestei
concentraţii (Atenţie! în μA). N va fi în acest caz 6 (numãrul minim de
determinãri).

Tabelul 1. Calculul parametrilor necesari determinãrii erorii aleatorii, a deviaţiei standard, a

ordonatei la origine şi a deviaţiei standard a pantei

Parametru X y x- y- (x- )2 (y- )2 (x- )(y- )

(μM) (μA)
Valoare

Suma

8
 Tabelul 2: Calculul altor parametri necesari

Parametru y- (y- )2 x2
Valoare

Suma

Tabelul 3: Calculul limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare

Parametru Sy/x a b Sa Sb LOD LOQ

Valoare

4. Concluzii cu privire la valoarea limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare. Se

va apreca dacã în urma valorilor obţinute experimental, tipul de senzor utilizat ar
corespunde pentru detectarea nivelului de acid uric în ser, salivã şi respectiv urinã
(vedeţi valorile indicate la Aplicabilitatea metodei)

5. Raspunsul la urmatoarele intrebari:

I. Ce este un senzor?
II. Ce rol au cei trei electrozi utilizati in aceasta metoda?
III. Ce sunt limita de detectie si limita de cuantificare?
IV. Ce este o curba de calibrare?