Măsurarea solventiilor reziduali din probele

farmaceutice folosind tehnici rapide de

cromatografie cu gaz

Scopul lucrarii

Solvenţii reziduali realizati din probele farmaceutice sunt monitorizati cu ajutorul

cromatografiei cu gaz (GC), fie prin detectare de ionizare cu flacără (FID) sau cu
spectrometrie de masă. In general, metodele GC au fost elaborate pentru a
monitoriza solvenţi de rutină utilizati în procesul de sinteza a medicamentelor. În
această lucrare, se va discuta despre dezvoltarea şi punerea în aplicare a
metodelor rapide GC pentru solvenţii reziduali de testare.

Cuvinte cheie: Solvenţi reziduali, cromatografie cu gaz rapida; probe

farmaceutice

1. Introducere

Solvenţi sunt de obicei folositi în procesul de sinteza si de chimie a

medicamentelor. Aceşti solvenţi din proces nu pot fi eliminati complet prin bunele
practici de fabricaţie practicate cum ar fi congelare-uscare şi uscarea în vid la
temperaturi ridicate. Unii solvenţi sunt bine cunoscuti de a provoca toxicitate
inacceptabilă, subliniind importanţa limitării prezenţei solvenţiilor reziduali la un
nivel minim. Bazat pe o monografie Pharmacopea din Statele Unite de impurităţi
organice volatile în produsele farmaceutice, solvenţi cum ar fi benzen, cloroform,
1,4-dioxan, clorură de metilen si tricloretilenă sunt plasate sub supraveghere.
Conţinutul de solvenţi organici reziduali în farmaceutice este de obicei măsurat
prin cromatografie în fază gazoasă (GC). Aplicatiile de rutină prin GC includ
analiza probelor cu ingrediente farmaceutice active şi intermediari lor de a se
conforma laboratoarelor şi bunelor practici de fabricaţie, precum şi testarea în-
proces a solvenţilor reziduali laoptimizarea procedurilor de uscare.

2. Experimentale secţiune

2.1. Aparatura si materialele cromatografiei de gaz

Au fost utilizate cromatografe de gaz de la Agilent Technologies (Palo Alto, CA),
modelele 5890 din seria a II-a şi 6890, pentru dezvoltarea şi validarea metodelor.
Cromatografe de gaze au fost echipate cu opţiunea cuptor standard pentru
cresterea temperaturii, impartirea porturilor de injecţie şi detectia de ionizare prin
flacără (FID). Injectarea eşantionului de lichid a fost realizat prin intermediul
unităţii 6890 auto-prelevarea de probe de la Agilent Technologies, folosind o
seringă de 10 µ l (număr parte 9301 - 0713) compatibil cu MerlinTM Microseal
(număr parte 5182-3444). Impartirea injectarii de 1 µ l a fost realizata în portul de
injectare menţinut la temperaturi ridicate. O linie-conica cu vată de sticlă
dezactivata (Agilent Technologies, numărul de componentă 5183-4711) a fost
folosit ca linie port.O coloană RTX502.2 (Restek, Bellafonte, PA, numărul de
componentă RK10915), cu o pelicula de 1.4 µ m difenil/dimetil polisiloxani in
faza staţionară,
30m x 0.25mm i.d., a fost utilizată în dezvoltarea unor metode de GC pentru
testarea solventilor reziduali. Acest coloana 0.25mm i.d., cu o faza de polaritate
scăzută ofera avantajele combinate de înaltă rezoluţie cu vârfuri analit şi
capacitatea probelor acceptabile. Heliu de puritate ridicata a fost folosit ca gaz
purtător.

2.2. Prepararea soluţiilor de proba si standard

Dimetilacetamidă (DMA) a fost selectata ca solutie standard şi diluant, bazat pe
capacitatea sa de a dizolva o gamă largă si variata de substanţe
medicamentoase. De asemenea, DMA este un solvent cu un punct de fierbere
înalt care nu interferează cu mai multi solvenţi volatili testati prin GC.
Pentru metoda care implică analiza punctului de fierbere ridicat al solventilor,
metanolul a fost selectat ca diluant.
Soluţiile mamă standard de la 1,0% (v / v) au fost pregătite prin
pipetarea a unui 1 ml din fiecare test solvent într-un balon volumetric de 100 ml şi
se diluează la volum cu solventul adecvat.
Concentratia soluţiilor etalon de lucru variaza de la 0.0004 - 0.04% (v / v) si au
fost utilizate pentru a valida metodele generale, utilizand instrumente
convenţionale de GC.
Pentru metoda care implică tehnologia Flash GC, concentratia standard de lucru
variaza de la 0.001 la 0.1% (v / v).
Probele intermediare a noilor substante medicamentoase au fost obţinute
de Grupul de Proces Cercetare Dezvoltare al Institutului de Cercetare
Farmaceutica Bristol-Myers Squibb situat în Candiac, Québec, Canada.
Solutiile standard au fost pregătite prin transferul de greutate corespunzătoare
probei,de la 25 la 100 mg, în funcţie de solubilitatea în diluant, într-un flacon.
Fiecare proba a fost dizolvată într-un 1 ml de diluant într-un flacon plafonate,
care au fost agitate pentru a realiza dizolvarea.

2.3. Cromatografia de gaz EZ FlashTM

Tehnologia, cromatografia de gaz Flash, foloseste incalzirea rezistiva a unui

capilar din coloana pentru a realiza separarea rapidă a analiţilor cu o gamă largă
a punctului de fierbere. Încălzire rezistivă este bazează pe principiul că
temperatura unui metal creste atunci când un curent electric trece prin el, şi
rezistenţă la metale creşte, prin urmare, într-o manieră care poate fi prezis.
Temperatura metalului poate fi determinată prin măsurători de rezistenţă şi poate
fi ajustata prin controlul cantitatii de energie aplicat pentru a ajunge la setarea
temperaturii definite. Cu tehnologia EZ FlashTM a lui ThermoOrion, asamblarea
coloanei se realizeaza prin introducerea unui capilar standard de coloană într-o
manta metalică fiind folosit pentru a incalzi coloana. Având în vedere că masa
termică a boilerului este redusă la minimum, timpul de incalzire si de racire a
unui coloane capilare EZ FlashTM este mai mic, spre deosebire de cromatograne
de gaz conventionale, care impun ca întreagul cuptor a cromatogramei de gaz sa
se incalzeasca si sa se racesca. Utilizarea cromatogramei de gaz FlashTM este
simpla si nu necesita extra-training, cu excepţia ansamblari coloanei care
necesită unele cunostinte.

Accesoriile cromatografiei de gaz EZ FlashTM (ThermoOrion, Beverly, MA),

inclusiv adaptoarele injectorului şi detectorului, au fost instalate pe un
cromatograf de gaz conventional 5890 din a II-a serie de la Agilent Technologies
(Palo Alto, CA). Asamblarile corespunzătoare coloanei capilare 10 m EZ FlashTM
au fost obţinute de la ATS Stiinţific Inc (Burlington, Ontario, Canada), distribuitor
canadian de produse ThermoOrion.

2.4. Metodele de cromatografie de gaz Flash pentru solvenţii de testare

reziduali

A fost folosita o coloana EZ FlashTM ansamblata cu o coloană RTX-624 10m x

0.18mm i.d. (ATS Scientific, numărul de componentă C420011550). Metoda
generala a cromatografiei de gaz Flash implică injecţii cu lichid de 1 µ l în
impartirea instrumentala a portului. Temperatura injectarii a fost menţinută
la 250 oC, si divizarea injectiilot au fost efectuate cu un raport de 100:1 datorita
capacităţii limitate a eşantionului a sondei (bore) coloanei înguste.

Transportatorul sub presiune de heliu a fost setat la 9,5 psi pentru un flux de 0,6
ml / min. Temperatura detectorului de ionizare cu flacără a fost setat la 280 oC.
Gradientul termic EZ FlashTM a menţinut temperatura iniţiala la 38 oC timp de 30
s, apoi a crescut de la o rată de 48 oC / min la 110 oC, apoi la 130 oC / min pentru
a ajunge la o temperatură finală de 240 oC, timp de 1 min. Gradientul termic total
a fost atins în 4 min.

Pentru metoda Flash GC implică analiza punctului de fierbere ridicat al

solvenţilor, următoarele condiţii experimentale au fost utilizate: 1 µ l de standard
sau a fost injectata soluţia de probă în portul de injectare a GC, care a fost
menţinută la 250 oC. Au fost efectuate injecţii cu un raport de 100:1.
Transportatorul sub presiune cu heliu a fost setat la 16 psi pentru un flux aşteptat
de 1,0 ml / min. Temperatura gradientului EZ FlashTM menţine temperatura
iniţială la 100 oC timp de 45 s. Temperatura EZ FlashTM a fost apoi crescuta la
180 oC în 30 s, pentru a ajunge la o temperatura finală de 230 oC în 90 s, care a
mentinuta timp de 15 s, pentru o functionare totala de 3 min.
3. Rezultate şi discuţii
3.1. Metode rapide folosind cromatograme de gaz Flash

Această metodă a derivat dintr-o aplicatie a ThermoOrion, sugerand folosirea

unei foraje (bore) a coloanei mai scurte si mai înguste, 10m x 0,1 mm i.d, cu un
film de 0.4 µm din 6% cianopropil/94% siloxan polidimetil. Cu toate acestea,
datorită capacităţii limitate a eşantionului şi a dificultăţii in obţinerea
cromatografiei fiabile şi reproductibile, utilizarea unei foraje înguste cu un film de
0,4 µm din 6% cianopropil şi 94% siloxan polidimetil a fost abandonată.

Fig. 1. Cromatograma cu 20 de solvenţi de interes farmaceutice de către Flash

GC. Concentraţia probei strandard este de 0,01% (v / v). Dizolvarea solventului
angajat, N, N-dimetilacetamidă, se dizolva in mai putin de 3 min. Impurităţile
dizolvate cu solvent sunt indicate pe cromatograma printr-un "I".

Tabelul 1.
Validarea rezultatelor pentru metoda Flash GC pentru solvenţii reziduali de
testare
Coloana de 10m x 0.18mm i.d., cu un film de 1 µm din 6% cianopropil/94%
siloxan polidimetil in faza staţionară avut mai mult succes în produsele
farmaceutice în realizarea analizei de solventi reziduali. Un exemplu de
cromatografie de gaz, cromatograma de solvenţi volatili folosind tehnologia EZ
FlashTM fiind prezentate în Fig. 1. Această metodă are avantajul de a utiliza un
bore scurt si îngust a coloanei şi o temperatura rapida a rampei pentru a realiza
separarea celor 20 de solvenţi volatili în 4 min. Aceasta insemnand o
îmbunătăţire semnificativă a productivităţii în procesul de testare al solvenţilor
reziduali, deoarece fiecare analiză necesită mai puţin de 7 min, inclusiv injecţia
de rutina, analiza, şi timpul de racire.
Solvenţi testati prin metoda de cromatografie de gaz Flash sunt enumerati în
Tabelul 1. In aceasta metoda, toluenul şi iso-butilacetatul nu sunt substantele de
baza analizate. Se extrag acetonitril şi diclormetan, insa, doar diclormetanului a
fost inclus în lista de testare a solvenţilor prin metoda de cromatografie de gaz
Flash.

Dacă ambii solvenţi sunt folositi într-un proces sintetic de o substanţă de

medicamente sau intermediari sai, metoda convenţionala GC, care poate realiza
separarea de acetonitril şi diclormetan, ar trebui mai degrabă folosita decât
metoda GC Flash.

Am folosit un gradient de la 35 oC, menţinut timp de 30 s, consolidat la 85 oC, în

2 min, avand loc in timp de 1,5 min. Acest gradient aproximează creşterea
temperaturii ca urmare a caldurii disiparsate creata de temperatura gradientului
EZ FlashTM în cuptorul GC.

Fig. 2. Cromatograma punctului de fierbere ridicat al solvenţilor prin GC Flash.

Concentraţia probei standard este de 0,01% (v / v). Metanolul, solventul dizolvat,
se extrage primul în primele 60 de secunde. Extragerea metanolului este urmată
de DMF, DMSO şi NMP.
Cu coloana de asamblare EZ FlashTM, o combinaţie garnituri drepte, cu vată de
sticlă şi split mai mare, rezervele par a fi ideale pentru a evita supraîncărcarea
coloanei şi pentru a optimiza cromatografia. Utilizarea preparatelor injectabile
split la ratii mai mici decât 50:1 cauzeaza decantarea şi pierderi a rezolutiei. Mai
mult decât atât, injecţiile splitless par foarte dificile cu tehnologie de EZ FlashTM
pentru aceleaşi motive.
Dimetilacetamida (DMA), un solvent cu punctul de fierbere ridicat, care se
extrage a sfârşitul cromatografiei, a fost selectat ca solvent ideal pentru probele
farmaceutice de analizat. Un avantaj suplimentar, multe substanţe
medicamentoase sunt solubile în DMA.
Dimetilsulfoxid şi dimetilformamida au mai multe impurităţi care interferează cu
analiza unor solventi organici frecvent utilizati in proces.

Liniaritatea, precizia şi sensibilitatea metodei GC Flash au fost evaluate.

Liniaritate pentru fiecare solvent testat a fost stabilită la concentraţii cuprinse
între 0.001 la 0,1% (v / v). Analiza regresiei liniare a fost aplicată şi a fost obtinut
un coeficient de corelatie ≥ 0.999 pentru fiecare solvent. Deviatia relativa
standard obţinuta din rezultatele a şase injecţii consecutive a solutiilor standard
la 0,005% (v / v) şi 0,01% (v / v) au fost <10%.
Limita minimă de cuantificare a fost stabilit la 350 ppm sau mai bine, pe baza
unui eşantion de concentrare ţintă de 0,1 g / ml. Rezultatele sunt prezentate în
tabelul 1.

Tabelul 2 Validarea rezultatelor pentru metoda GC Flash pentru punctele de

fierbere a solventilor

Solvenţi non-volatili sunt utilizati ocazional ca solvenţi de proces. Folosind

coloana EZ FlashTM RTX-624 de 10m şi o rampă rapidă, N, N-dimetilformamida
(DMF), sulfoxid de metil (DMSO) şi 1-metil-2-pirolidinone (NMP) pot fi analizate
în mai puţin de 3 min. Un exemplu de astfel de cromatogramă este ilustrata în
Fig. 2.

GC Flash, ca şi în alte metode pentru a monitoriza solvenţi volatili reziduali,

liniaritatea, precizia, şi limitele de sensibilitate au fost stabilite cu succes prin
această metodă. Sunt prezentate rezultatele de validare în tabelul 4. Bazat pe
concentratia unui esantion de proba de 0,1 g / ml, limitele de cuantificare stabilite
au fost 146, 227, şi 234 ppm pentru DMF, DMSO, şi respectiv NMP.
4. Concluzii

Acum este posibil sa profitam de tehnologia îmbunătăţită a cromatografiei de gaz

pentru a realiza separari rapide şi analize ale solventilor reziduali solvenţi din
probele farmaceutice.

Utilizarea tehnicilor rapide de GC, cum ar fi tehnologie rezistenta la incalzire EZ

FlashTM, poate accelera in continuare analiza solventiilor reziduali. Procesul de
separe a 20 de solventi a fost realizat în mai puţin de 4 minute folosind
tehnologia EZ FlashTM. Tehnologia GC Flash ofera avantajul suplimentar de un
timp de racire mai. Deşi mai puţin sensibila, metoda GC Flash poate fi aplicata
încă avantajos la monitorizarea solventului în proces atunci când un raspunsul
unei probe este necesar intr-un timp mai rapid. O analiză completă inclusiv o
injecţie martor, urmată de teste de calibrare cu un standard şi testarea în timpul
procesului a unei solutii proba farmaceutice pot fi atinse în aproximativ 20 min.
De asemenea, tehnologia GC Flash poate transforma din punct de vedere
economic o cromatograma de gaz învechita într-un instrument care poate realiza
separări cromatografice de gaz foarte rapide.
Bibliografie

[1] U.S. Pharmacopeia, _4 6 7_ Organic Volatile Impurities, USP25-NF20,

2002.
[2] ICH Harmonized Tripartite Guideline for Residual Solvents, Step 4,
17 July 1997.
[3] A.M. Dwivedi, Pharma. Technol. 26 (11) (2002) 42.
[4] European-Pharmacopoeia Commission, Pharmeuropa 5 (1993) 145.
[5] M.V. Russo, Chromatographia 39 (11–12) (1994) 645.
[6] R.B. George, P.D. Wright, Anal. Chem. 69 (1997) 2221.
[7] Q.C. Li, K.A. Cohen, G. Zhuang, J. Chromatogr. Sci. 36 (3) (1998)
119.
[8] T.K. Chen, J.G. Phillips, W. Durr, J. Chromatogr. A 811 (1998) 145.
[9] Z. Li, Y.H. Han, G.P. Martin, J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002)
673.
[10] C.C. Camarasu, Chromatographia 56 (2002) S137.
[11] C.A. Cramers, J.G.M. Janssen, M.M. van Deursen, J. Beens, in: A.J.
Handley, E.R. Adlard (Eds.), Gas Chromatographic Techniques and
Applications, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001, p. 207.
[12] W. Jennings, Analytical Gas Chromatography, Academic Press, San
Diego, CA, 1987, p. 80.
[13] D. Rounbehler, S. MacDonald, D. Lieb, D. Fine, in: Proceedings
of the First International Symposium on Explosive Detection Techniques,
vol. 1, 1991, p. 703.
[14] S.J. MacDonald, D. Wheeler, Int. Lab. 28 (6) (1998) 20.
[15] S.J. MacDonald, D. Wheeler, Int. Lab. News 28 (5A) (1998) 13.
[16] J. Dalluge, R. Ou-Aissa, J.J. Vreuls, U.A.Th. Brinkman, J.R. Veraart,
J. High Resolut. Chromatogr. 22 (1999) 459.
[17] ThermoOrion Application Note, CHEM-017.