UNIVERSITATEA “POLITEHNICA”, BUCUREŞTI

FACULTATEA DE CHIMIE APLICATĂ ŞI ŞTIINŢA MATERIALELOR

PRODUSE FARMACEUTICE ȘI COSMETICE

Chitosan sub formă de gel cu nanocapsule

polimerice: o nouă formulare pentru
administrarea de medicamente vaginale

Prof. Coordonator:

Conf. dr. ing. Paul Cătălin BALAURE

Masterand:

DUMITRACHE Georgiana-Elena

Grupa PFC, Anul II

București

2021
 CUPRINS
CUPRINS.........................................................................................................................................................2
1. Introducere............................................................................................................................................3
2. Materiale și metode...............................................................................................................................5
2.1. Materiale........................................................................................................................................5
2.2. Producerea de nanocapsule...........................................................................................................5
2.3. Caracterizarea nanocapsulelor.......................................................................................................5
2.4. Producerea gelului de chitosan......................................................................................................6
2.5. Caracterizarea gelului de chitosan.................................................................................................6
2.6. Studii in vivo folosind mucoasa vaginală........................................................................................7
2.6.1. Măsurători ale mucoadeziei...................................................................................................7
2.6.2. Test de lavabilitate.................................................................................................................7
2.7. Pătrunderea NR în mucoasa vaginală porcină................................................................................8
2.8. Analiza CLSM a penetrării NR în mucoasa vaginală porcină...........................................................9
2.9. Analize statistice.............................................................................................................................9
3. Rezultate și discuții..............................................................................................................................10
3.1. Proprietățile nanocapsulelor........................................................................................................10
3.2. Selectarea celui mai potrivit hidrogel pentru aplicare vaginală...................................................11
3.3. Aderența in vitro la mucoasa vaginală.........................................................................................13
3.4. Pătrunderea in vitro în mucoasa vaginală....................................................................................15
4. Concluzii...............................................................................................................................................19
5. Bibliografie...........................................................................................................................................20

2
1. Introducere
Eliberarea vaginală este o alternativă pentru mai multe tratamente farmacologice, fie
pentru efect local, fie pentru efect sistemic. Cu toate acestea, efectul local este vizat mai des ca o
metodă de administrare de antibacteriene, antifungice, antivirale, antiprotozoale, spermicide și
steroizi.

Utilizarea mucoasei vaginale drept cale de administrare a medicamentului are avantaje,

precum facilitatea aplicării medicamentului, suprafața ridicată de contact, aportul ridicat de sânge,
permeabilitatea bună pentru mai multe substanțe și evitarea metabolismului primului pasaj hepatic
și a efectelor secundare gastro-intestinale. Cu toate acestea, dezvoltarea formulărilor pentru
aplicare pe calea vaginală prezintă unele dificultăți. Una dintre aceste dificultăți este că histologia
și fiziologia vaginului variază în funcție de vârstă, ciclul menstrual și modificările hormonale.
Cealaltă dificultate este că vaginul secretă lichide endometriale.

Astfel de dificultăți contribuie la îndepărtarea ușoară a formulării, ceea ce determină

perioade mai scurte între aplicații și, prin urmare, o nerespectare a tratamentului.

S-a demonstrat însă, că utilizarea nanotehnologiei poate reduce dezavantajele mai sus
menționate ale administrării vaginale a medicamentelor. Acest lucru se datorează faptului că,
atunci când medicamentele sunt încapsulate în nanostructuri, eliberarea lor este controlată, sunt
protejate împotriva degradării și doza aplicată poate fi în cele din urmă redusă. În plus, trebuie luat
în considerare faptul că unele medicamente administrate pe calea vaginală pot provoca reacții
adverse, cum ar fi eritem, iritații, ulcerații și durere, iar astfel de efecte ar putea fi reduse prin
utilizarea nanotehnologiei.

Nanoparticulele au proprietăți puternice de aderență la țesuturi, ceea ce este util pentru

terapie, deoarece crește timpul de ședere al medicamentelor. Cu toate acestea, nanoparticulele sunt
obținute frecvent în suspensii apoase, astfel încât aplicarea la un anumit loc este dificilă. Prin
urmare, încorporarea nanoparticulelor într-un sistem vâscos este o alternativă care facilitează
livrarea corectă a substanței. Mai mult, utilizarea unui nanotransportor bioadeziv, cum ar fi
chitosanul, poate prelungi timpul de ședere pe mucoasă, ducând la acțiunea așteptată,
îmbunătățind acceptabilitatea tratamentului și sporind penetrarea și/sau absorbția.

Utilizarea formulărilor semisolide reprezintă o metodă alternativă pentru creșterea

perioadei de contact între medicament și mucoasă. În plus, utilizarea nanotransportorilor
bioadezivi, cum ar fi geluri, tablete, supozitoare și filme, poate îmbunătăți acțiunea mai multor
medicamente. Au fost descriși diferiți polimeri în literatura de specialitate pentru administrarea de
substanțe pe mucoasa vaginală, cum ar fi: polietilen glicol, derivați de celuloză și chitosan. Dintre
3
aceștia, chitosanul este singurul polimer care prezintă sarcină pozitivă la o interacțiune probabilă
cu mucoasa vaginală, crescând timpul de ședere al medicamentelor care contribuie la creșterea
penetrării mucoaselor. De asemenea, prezintă alte proprietăți interesante, cum ar fi
biocompatibilitatea, biodegradabilitatea, mucoadeziunea, activitatea antimicrobiană și formarea
filmului, precum și capacitatea de a vindeca țesuturile rănite.

Chitosanul, un polimer bioadeziv, a primit o mare atenție în ultimii ani. Acest polimer este
obținut prin deacetilarea chitinei, una dintre cele mai abundente polizaharide găsite în natură.
Chitosanul a fost aplicat pe scară largă în dezvoltarea diferitelor forme de dozare farmaceutică,
cum ar fi hidrogeluri, filme, microsfere și nanoparticule.

Hidrogelurile de chitosan pot fi produse prin interacțiuni covalente între lanțurile de

chitosan. Printre aplicațiile terapeutice ale hidrogelului de chitosan, eliberarea controlată a
medicamentelor este deosebit de notabilă. În plus, hidrogelurile de chitosan afectează joncțiunea
strânsă. între celulele epiteliale astfel încât aceste formulări pot crește capacitatea de penetrare a
medicamentului.

Utilizarea chitosanului și a nanoparticulelor pentru administrarea vaginală prind amploare.

De exemplu, hidrogelurile formate din derivați de chitosan au arătat o aderență mai mare la
mucoasa vaginală la porcine decât un gel comercial. Sarea citrată a chitosanului s-a dovedit a fi
adecvată pentru prepararea gelurilor care încorporează substanțe cu potențial scăzut de
permeabilitate pentru administrare vaginală. De exemplu, nanoparticulele preparate prin gelificare
ionică conținând tenofovir, un agent antiviral, au fost aplicate pe mucoasa vaginală la porcine.
Această formulare a prezentat un potențial ridicat de eliberare a agenților antimicrobieni datorită
eliberării controlate, bioadeziunii și siguranței.

Incorporarea sistemelor nanostructurate, cum ar fi nanocapsulele, în gelurile de chitosan

reprezintă unificarea diferitelor sisteme cu proprietăți interesante, așa cum a fost menționat
anterior. A fost deja descrisă încorporarea nanocapsulelor Eudragit® RS 100 (Evonik Industries
AG, Essen, Germania) în hidrogelurile de chitosan și proprietatea cu eliberare controlată a
formulării. În plus față de administrarea cutanată, utilizarea nanocapsulelor Eudragit RS 100 a fost
descrisă pentru căile de administrare ocular și vaginal.

Scopul acestei lucrări a fost de a evalua performanța hidrogelurilor de chitosan care conțin
nanocapsule pe bază de acril cationic și anionic (Eudragit RS 100 și Eudragit S 100 [Evonik
Industries AG], respectiv), cu roșu de Nil (NR) ca substanță lipofilă model , pentru administrare
vaginală, măsurată prin creșterea timpului de ședere și penetrarea acestor formulări.

4
2. Materiale și metode
2.1.Materiale

 Chitosan cu greutate moleculară medie (1.136 kDa) și 92% grad de deacetilare, acid lactic
90%, NR, polisorbat 80, sorbitan monostearat 60, acetonă (grad analitic)- Sigma-Aldrich
(St Louis, MO, SUA).

 Trigliceride caprice/caprilice (Miglyol 812) și Eudragit (S 100 și RS 100)-Sasol

(Johannesburg, Africa de Sud) și, respectiv, Evonik Industries AG.

 Acetat de izopentil- Carlo Erba Reagents (Milano, Italia).

2.2.Producerea de nanocapsule

Nanocapsulele au fost produse prin metoda denumită depunere interfacială a polimerilor

preformați, folosind Eudragit RS 100 sau Eudragit S 100 ca înveliș polimeric (10 mg/mL),
trigliceride caprice/caprilice ca miez uleios (33 μg/mL ), polisorbat 80 ca stabilizator (7,6 mg/ml)
și NR (0,0825 mg/ml, amestecat anterior cu trigliceridele caprice/caprilice) ca model de
medicament lipofil. Pentru producerea formulării Eudragit S 100, s-a utilizat monostearat de
sorbitan (7,6 mg/ml). Nanocapsulele produse cu diferiți polimeri care conțin NR au fost denumite
NC-RS-NR (preparate cu Eudragit RS 100) și NC-S-NR (preparate cu Eudragit S 100). În mod
similar, suspensiile de nanocapsule fără marker fluorescent au fost utilizate drept controale și au
fost denumite NC-RS (Eudragit RS 100) și NC-S (Eudragit S 100).

2.3.Caracterizarea nanocapsulelor

Nanocapsulele au fost caracterizate în termeni de pH, dimensiune și potențial zeta imediat

după producție. Analiza pH-ului a fost efectuată prin măsurare directă utilizând analiza
potențiometrică (B474, Micronal, São Paulo, Brazilia). Mărimea nanocapsulei a fost măsurată prin
diferite tehnici, inclusiv difracția laser (Mastersizer 2000, Nano ZS; Malvern Instruments,
Malvern, Marea Britanie), împrăștierea dinamică a luminii (Zetasizer Nano ZS; Malvern
Instruments) și urmărirea particulelor (Nanosight LM 10), prin diluare de nanocapsule în apă
bidistilată. Pentru determinarea potențialului zeta, nanocapsulele au fost diluate în soluție de NaCI
(10 mM) și a fost analizată mobilitatea electroforetică (Zetasizer, Nano ZS).

5
 2.4.Producerea gelului de chitosan

În primul rând, au fost produse diferite formulări cu concentrații crescânde de chitosan

(1,5%, 2%, 2,5% și 3% greutate/greutate [g / g]) pentru a determina cel mai potrivit gel de
chitosan pentru administrare vaginală. Hidrogelurile au fost preparate prin amestecarea manuală
de chitosan, acid lactic (115 μL) și apă bidistilată sau suspensie de nanocapsule fără marker
fluorescent (10 ml). Formulările au fost denumite CH-RS (gel de chitosan care conține
nanocapsule Eudragit RS 100), CH-S (gel de chitosan care conține nanocapsule Eudragit S 100) și
CH (gel de chitosan preparat cu apă).

După determinarea gelului cel mai potrivit, nanocapsulele care conțin NR au fost încărcate
în gelul de chitosan selectat și formulările au fost denumite CH-RS – NR (gel de chitosan care
conține nanocapsule Eudragit RS 100) și CH-S – NR (gel de chitosan care conține nanudapsit
Eudragit S 100) ). Pentru gelul obținut cu apă în loc de nanocapsule (CH-NR), s-au adăugat 330
μL din amestecul de NR și trigliceride caprice/caprilice (2,5 mg/ml) în timpul producției a 10 g
din formulare. Prin urmare, în etapa finală, toate gelurile au avut aceeași concentrație de NR
(0,0825 mg/g).

2.5.Caracterizarea gelului de chitosan

Gelurile de concentrații crescânde de chitosan (de la 1,5% la 3%) au fost evaluate în

termeni de valori ale pH-ului și proprietăți reologice pentru a identifica cel mai potrivit gel pentru
aplicare vaginală. Valorile pH-ului au fost măsurate prin potențiometrie (B474, Micronal) după
diluarea formulării în apă ultrapură (1:10 greutate:volum [w:v]). Fiecare formulare a fost supusă
caracterizării reologice prin reometrie de rotație (Rheostress 600; Haake Technik, Vreden,
Germania) la 25°C folosind o combinație de plăci conice (C35/1: 35 mm diametru și 1° unghi) ca
sistem de măsurare. Măsurătorile reologice au fost efectuate după 3 minute de repaus.

Vâscozitatea aparentă a fost determinată la 200 s-1. Au fost efectuate teste oscilatorii
dinamice în domeniul liniar viscoelastic la 25°C; o valoare constantă a tensiunii de forfecare
(determinată anterior în regiunea liniară viscoelastică) a fost aplicată probei, iar răspunsul
viscoelastic al probei a fost înregistrat și exprimat prin modulul conservator sau elastic G′ și
vâscos sau modulul disipativ G″. G′ și G″ au fost înregistrate la 10 Hz. Tangenta pierderii (tgδ) a
fost calculată ca raport G” la G′

6
 2.6.Studii in vivo folosind mucoasa vaginală

După selectarea celei mai potrivite concentrații de chitosan, pe baza vâscozității,

elasticității și pH-ului, gelurile care conțin nanocapsule sau apă au fost analizate în termeni de
mucoadezie in vitro, lavabilitate și penetrare a NR în mucoasa vaginală. Pentru experimentul de
mucoadezie, a fost utilizată mucoasa vaginală congelată anterior (-20°C) în timp ce, pentru
experimentele de lavabilitate și penetrare, a fost utilizată mucoasa proaspătă pentru a menține
proprietățile și viabilitatea țesutului. Pentru a simula corect mediul vaginal, lichidul de spălare
selectat a fost soluție salină tamponată cu fosfat pH 4,5 menținută la 37°C.

2.6.1. Măsurători ale mucoadeziei

Probele (CH, CH-RS și CH-S) au fost supuse măsurătorilor de mucoadezie prin

intermediul unui tester de tensiune (TA.XTplus Texture Analyzer; Stable Microsystem,
Godalming, Marea Britanie) echipat cu o celulă de încărcare de 1 kg și un sistem de măsurare.
Sistemul de măsurare constă dintr-o sondă și un suport, ambele realizate din teflon. Suportul este
format din doi cilindri; cilindrul inferior servește ca bază pentru substratul biologic, în timp ce
cilindrul superior are o gaură circulară în centru (∅: 14 mm), care permite pătrunderea sondei.

Fiecare probă de mucoasă a fost umectată cu de tampon acetat, pH 4,5, pentru a simula
lichidul vaginal. 40 μL din fiecare probă au fost stratificate pe un disc de hârtie de filtru (∅: 10
mm) care a fost fixat pe sonda cilindrică cu bandă bi-adezivă. După un timp prestabilit (180
secunde), sonda cilindrică a fost pusă în contact cu proba prin aplicarea unei preîncărcări de 2.500
mN timp de 3 minute. Sonda a fost ridicată la 2,5 mm/min până când s-a realizat separarea
completă a interfeței de mucoadezie.

Parametrii experimentali au fost aleși pentru a permite rezultate exacte și reproductibile,

precum și cea mai bună diferențiere între diferitele probe. În special, alegerea a fost făcută pe baza
testelor preliminare la diferite rate de detașare și valori de preîncărcare. Forța de detașare (mN) și
forța de detașare în funcție de deplasare (lucrarea de aderență [mN∙mm]) au fost determinate
pentru toate formulările.

2.6.2. Test de lavabilitate

Probele (CH – NR, CH-RS – NR și CH-S – NR) au fost supuse măsurătorilor de

lavabilitate prin intermediul unei celule de difuzie Franz (Permeager; Hellertown, PA, SUA) cu o
7
cameră de donor modificată. Pe scurt, în camera donorului, un flux de tampon (pH 4,5) a fost
pompat între două găuri. Fluxul a fost stabilit la 0,2 mL/min cu o pompă de cromatografie lichidă
de înaltă performanță (pompa HPLC 420; Kontron AG, Eching, Germania). Tamponul de ieșire a
fost colectat într-un pahar cu agitare continuă. Mucoasa vaginală a porcului a fost stratificată pe o
membrană Parafilm (impermeabilă la fluide) și împărțită între camerele donor și acceptor ale unei
celule Franz. Apa distilată a fost utilizată ca fază receptoră pentru a menține mucoasa vaginală la
37°C. Fiecare probă (100 mg) a fost răspândită pe mucoasa vaginală și tamponul de pH 4,5 a fost
pompat (37°C) peste probă pentru a simula acțiunea de eliminare a lichidului vaginal. Tamponul
de pH 4,5 care iese din camera donoare a fost colectat în pahare diferite, umplând un pahar pe oră
până la 6 ore și obținând șase fracțiuni. Paharele au fost înghețate și conținutul a fost liofilizat timp
de 24 de ore (Heto Dryer; Analitical De-Mori, Milano, Italia). Apoi, fiecare peletă a fost
reconstituită în 500 μL de acetonă pentru a solubiliza polimerii Eudragit. Probele au fost apoi
diluate cu acetat de isoamil la o concentrație adecvată. Fiecare probă a fost testată pentru NR
utilizând o metodă spectrofluorimetrică. Lungimile de undă de excitație (λex) și de emisie (λem)
aplicate tuturor probelor au fost de 517 nm și, respectiv, de 587 nm. Metoda a fost liniară în
intervalul de la 6,25 ng/mL la 100 ng/mL cu un R2 întotdeauna mai mare de 0,9995.

După experimentele de lavabilitate, țesuturile vaginale au fost clătite de două ori în soluție
salină pentru a elimina reziduurile probei și au fost înghețate în azot lichid. Trei probe au fost
prelucrate pentru a evalua cantitatea de NR care a pătruns în țesut în funcție de adâncimea
țesutului și trei probe au fost supuse microscopiei de scanare laser confocale. (CLSM).

2.7. Pătrunderea NR în mucoasa vaginală porcină

A fost folosit un criostat (temperatura de lucru -20°C) (Leica CM1510; Leica

Microsystem, Wetzlar, Italia) pentru a tăia felii orizontale de 50 μm grosime. Patru felii au fost
colectate în microtuburi Eppendorf. Cantitatea de NR care a pătruns în diferite felii a fost extrasă
prin adăugarea a 300 μl de acetat de isoamil și 50 μL de acetonă. Probele au fost menținute în timp
ce se agită timp de 15 minute la temperatura camerei și supuse centrifugării (5.000×g) pentru a
separa reziduurile de țesut de supernatant.

S-a realizat o curbă de calibrare prin prelucrarea probelor așa cum s-a descris mai sus.
Metoda a fost liniară în intervalul de la 6,25 ng/mL la 100 ng/mL cu un R 2 întotdeauna mai mare
de 0,9995.

8
 2.8.Analiza CLSM a penetrării NR în mucoasa vaginală porcină

Țesuturile mucoasei vaginale supuse experimentelor de lavabilitate au fost clătite de două

ori cu tampon fosfat, pH 7,4 (USP 35) și congelate în azot lichid. Probele înghețate au fost
depozitate la -80°C până la analiză.

NR interiorizat în țesuturile vaginale a fost analizat utilizând CLSM. Fiecare probă

vaginală înghețată a fost tăiată perpendicular pe suprafața mucoasei în felii groase de 25 μm
folosind un criostat (temperatura de lucru -20°C). După depunerea pe o lamă de microscop, fiecare
felie a fost deshidratată timp de 12 ore și înmuiată în acetonă pentru fixare. Nucleii prezenți în
feliile de țesut au fost colorate folosind 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma-Aldrich) la 1:
100.000. Feliile de țesut de pe lamele de microscop au fost scufundate în soluție DAPI timp de 2
minute și spălate în tampon fosfat, pH 7,4, pentru a elimina excesul de colorare care nu a
reacționat cu ADN-ul.

După uscarea feliilor de țesut la temperatura camerei timp de 12 ore, au fost tratate cu
alcool polivinilic cu antifading DABCO (BioChemika, Fluka, Italia) - un amestec de clorhidrat de
tris(hidroximetil) aminometan/tris(hidroximetil) aminometan, alcool polivinilic 22.000 Da,
glicerol anhidru , și 1,4-diazabiciclo [2,2,2] octan - au fost puse pe o lamă de microscop și aplicată
o sticlă de acoperire.

Analiza CLSM a fost efectuată utilizând λex = 549 nm și λem = 628 nm pentru
vizualizarea NR și λex = 340 nm și λem = 488 nm pentru vizualizarea DAPI. Imaginile
achiziționate au fost procesate prin intermediul unui software specific (Leica Microsystem).

2.9.Analize statistice

Diferențe semnificative au fost determinate prin intermediul analizei varianței. Diferențele

dintre grupuri au fost considerate semnificative la P<0.05. Analizele au fost efectuate cu software-
ul SPSS Statistics 17.0® (SPSS Inc., Chicago,IL, SUA).

9
3. Rezultate și discuții
3.1.Proprietățile nanocapsulelor

Tabelul 1 prezintă dimensiunile nanocapsulelor măsurate prin diferite tehnici. Toate

particulele au diametre nanometrice (aproximativ 200 nm) și o omogenitate adecvată a distribuției
mărimii (indicele de polidispersitate [PDI] ≤ 0.2). Incorporarea NR și tipul de polimer utilizat nu a
modificat semnificativ dimensiunea nanocapsulelor. Prin astfel de analize, a fost, de asemenea,
posibil să se determine concentrația de nanoparticule în suspensia apoasă (particule/ml). S-au
observat valori similare pentru toate formulările (NC-RS = 11,83 ± 2,5 × 1012, NC-S = 7,66 ±
0,67 × 1012, NC-RS – NR = 9,0 ± 2,4 × 1012, NC-S – NR = 8,9 ± 1,0 × 1012). Acesta este un
parametru important pentru o comparație exactă a formulărilor.

Tabelul 1. Caracterizarea dimensiunii suspensiilor de nanocapsule prin diferite tehnici

În ceea ce privește potențialul zeta, nanocapsulele produse cu Eudragit RS 100 au

prezentat valori pozitive (+ 13,6 ± 0,8 mV pentru NC-RS și + 10,45 ± 0,9 mV pentru NC-RS –
NR), în timp ce nanocapsulele produse cu Eudragit S 100 au prezentat valori negative ( -12,93 ±
0,6 mV pentru NC-S și -10,78 ± 1,15 mV pentru NC-S – NR). Valorile pozitive observate pentru
formulările NC-RS și NC-RS-NR se datorează trimetil-amoniului -metil-metacrilat prezent în
Eudragit RS 100.

Formulările NC-S și NC-S – NR au avut potențiale zeta negative datorită acidului

metacrilic prezent în Eudragit S 100. Diferențele de încărcare în potențialul zeta al nanocapsulelor
au fost studiate pentru a determina efectul unei substanțe lipofile asupra aplicării vaginale.
Suspensiile de nanocapsule au prezentat valori ale pH-ului de 6,1 ± 0,1 (NC-RS), 5,3 ± 0,2 (NC-
S), 6,2 ± 0,1 (NC-RS – NR) și 5,1 ± 0,1 (NC-S – NR).

10
 3.2.Selectarea celui mai potrivit hidrogel pentru aplicare vaginală

S-au aplicat măsurători de reologie și pH pentru a selecta cea mai potrivită concentrație de
chitosan pentru aplicare vaginală. Gelurile au prezentat valori ale pH-ului variind de la 3,8 (1,5%
chitosan) la 5,2 (3% chitosan) datorită prezenței acidului lactic. Cu excepția formulării produse cu
3% chitosan, toate gelurile au fost considerate adecvate pentru administrarea vaginală, deoarece
valorile lor de pH erau compatibile cu pH-ul la locul de aplicare. pH-ul mucoasei vaginale este
între 3,5 și 4,5, menținut de lactobacili care transformă glicogenul epiteliului în acid lactic.

În ceea ce privește proprietățile reologice, toate gelurile de chitosan au prezentat o scădere

a vâscozității cu o creștere a ratei de forfecare, indicând faptul că sunt fluide non-newtoniene cu
comportament pseudoplastic (Figura 1).

Figura 1. Vâscozitatea în funcție de graficele vitezei de forfecare

(A) Hidrogeluri de chitosan, (B) hidrogeluri de chitosan cu nanocapsule Eudragit® RS 100

și (C) hidrogeluri de chitosan cu nanocapsule Eudragit® S 100 (Evonik Industries AG, Essen,
Germania).

Pentru o comparație mai bună între formulări, parametrii reologici au fost obținuți la o
viteză de forfecare de 200 s-1 (vâscozitate) și o frecvență de 10 Hz (date de reologie oscilatorie) la
25°C (Tabelul 2).

11
 Următoarele două variabile au fost studiate: 1) adăugarea de nanocapsule (NC-RS sau NC-
S) la gelurile de chitosan; și 2) creșterea concentrației de chitosan (de la 1,5% la 3%). Tabelul 2
arată că adăugarea nanocapsulelor a crescut vâscozitatea gelurilor la toate concentrațiile studiate
(P<0.001). Comparând cele două tipuri de geluri care conțin nanocapsule (CH-RS și CH-S),
vâscozitățile au fost similare, cu excepția unei concentrații de chitosan de 3%, caz în care gelul
care conține nanocapsule anionice a prezentat vâscozitate mai mare. Acest rezultat ar putea fi legat
de o vâscozitate mai mare a formulării obținute cu NC-S datorită utilizării monostearatului de
sorbitan sau a caracteristicilor polimerului. Acest rezultat ar putea fi, de asemenea, legat de
interacțiunea crescută dintre particulele anionice și lanțurile polimerice de chitosan. În ceea ce
privește rigiditatea/elasticitatea gelurilor, Tabelul 2 arată că încorporarea nanocapsulelor nu a
influențat în mod clar parametrii oscilatori la frecvența studiată. Au fost obținute structuri mai
rigide când NC-S a fost încorporat în gelul de chitosan 3% (P<0.001). Rigiditatea mai mare ar
putea fi, de asemenea, legată de interacțiunea dintre lanțurile chitosanului și nanocapsulele
anionice, așa cum este descris pentru vâscozitate. Diferența de rigiditate măsurată a fost observată
și vizual; formularea compusă din NC-S a prezentat un aspect asemănător lipiciului cu o
răspândire redusă.

Pentru toate formulările studiate (concentrații diferite de chitosan), Tabelul 2 arată că a

avut loc o scădere a valorilor tgδ cu concentrații crescute de chitosan. Aceste descoperiri indică
faptul că, cu cât este mai mare concentrația de chitosan, cu atât rigiditatea gelului este mai mare.
Un astfel de comportament este de dorit pentru a păstra formularea la locul de aplicare. Acest
lucru ajută la evitarea fluxului de produs din zona dorită, ducând la o posibilă creștere a eficacității
formulării.

Tabelul 2. Parametri reologici la 25°C pentru formulări la diferite concentrații de chitosan

cu și fără nanocapsule polimerice

12
 Având în vedere că prezintă cele mai mari valori ale vâscozității măsurate și cea mai mare
elasticitate a gelurilor (valori mai mici ale tgδ), gelul chitosan de 3,0% g/g a fost ales ca cel mai
potrivit pentru livrarea vaginală. Cu toate acestea, această formulare a prezentat unele dezavantaje.
Valorile pH-ului au fost mai mari de 4,5, ceea ce ar putea perturba mediul microbian. În plus,
vâscozitatea vizuală a fost inadecvată (prea mare) și s-a observat o dificultate în aplicarea pe
mucoasă în timpul testărilor prealabile. Astfel de proprietăți ar putea compromite îndepărtarea din
aplicator și aplicarea corectă pe țesut. Prin urmare, gelurile compuse din 2,5% g/g chitosan (CH,
CH-RS și CH-S), care au prezentat un pH de 4,5 și proprietăți reologice adecvate, au fost alese
pentru alte experimente folosind mucoasa vaginală (mucoadezie, lavabilitate și penetrare).

3.3.Aderența in vitro la mucoasa vaginală

Aderarea in vitro a formulării la mucoasa vaginală a fost studiată prin intermediul

experimentelor de mucoadezie folosind un tester de tensiune și prin analiza profilelor de
lavabilitate. Au fost evaluate gelurile cu 2,5% g/g chitosan cu și fără nanocapsule (CH-NR, CH-
RS-NR și CH-S – NR).

Pentru măsurătorile de tensiune la tracțiune, s-au determinat forța, distanța de deplasare și

lucrările necesare pentru detașarea hidrogelurilor de mucoasa vaginală, așa cum se arată în Figura
2.

13
 Figura 2. Mucoadeziunea hidrogelurilor chitosanice (2,5% chitosan) determinată de forța
de detașare și de distanța de întindere pentru a se desprinde de mucoasă (medie, n = 6).

Această figură arată forța medie necesară pentru a separa formularea de mucoasă și
distanța de deplasare realizată pentru ca formularea să se desprindă de mucoasă. Zona de sub
curbă (Figura 2) reprezintă lucrarea (adică produsul forței și distanță) necesară pentru a desprinde
o formulare de mucoasă. Astfel de valori de lucru [W(CH); W(CH-RS); W(CH-S)] sunt o
reprezentare a proprietăților mucoadezive ale fiecărei formulări.

Figura 2 arată că formularea CH a necesitat un efort mediu mai mare pentru a realiza
detașarea, în timp ce a parcurs o distanță mai mică de întindere pentru a se detașa de mucoasă.

În schimb, formularea CH-S a necesitat un efort mediu mai mic, dar a atins distanțe mai
mari de întindere pentru ca formularea să se detașeze de țesut. Formularea CH-RS a prezentat un
comportament intermediar. Având în vedere valorile absolute ale muncii pentru fiecare formulare
(Figura 2), s-au găsit diferențe semnificative între probe (P = 0,033). În acest sens, hidrogelurile
cu nanocapsule (CH-RS și CH-S) au arătat valori mai mari pentru detașare comparativ cu
hidrogelurile fără nanocapsule (CH), în timp ce nu s-au găsit diferențe datorate tipului de
nanocapsule încorporate în gel (CH-RS și CH-S). În consecință, gelurile cu nanocapsule (CH-RS
și CH-S) au potențialul de a rămâne în contact cu mucoasa pentru o perioadă mai lungă de timp.
Astfel de rezultate ar putea fi legate de vâscozitatea mai mare datorată încorporării nanocapsulelor
și de modificările structurale pe care le induc nanocapsulele în rețeaua de geluri.

Privind Figura 2, în ceea ce privește proprietățile materiale ale formulărilor, se poate

concluziona că hidrogelurile care conțin nanocapsule (CH-RS și CH-S) au prezentat un
comportament ductil, deoarece a fost necesară o forță mai mică pentru a separa formularea și
14
distanțe mai mari. În schimb, gelul de chitosan fără nanocapsule părea a fi fragil; s-au aplicat forțe
mai puternice și s-au parcurs distanțe mai scurte de întindere până la detașare.

În plus, hidrogelurile cu și fără nanocapsule polimerice și markerul fluorescent NR (CH-

RS-NR, CH-S-NR, CH-NR) au fost testate în experimentele de lavabilitate. Experimentul a fost
efectuat timp de 6 ore, care este timpul mediu în care formulările, atunci când sunt aplicate pe
calea vaginală de administrare, trebuie păstrate în contact cu mucoasa pentru a prezenta efectul
dorit. Figura 3 prezintă profilurile de lavabilitate (procentul de NR spălat în funcție de timp).

Figura 3. Profiluri de lavabilitate după încorporarea NR în hidrogelurile de chitosan

Nu s-au observat diferențe semnificative între formulări (analiza varianței, P = 0,107)

pentru toate perioadele studiate. Un posibil motiv pentru aceasta este că, atunci când timpul este
luat în considerare în analiză, cel mai relevant factor care trebuie luat în considerare este tipul de
nanotransportorcare va fi spălat, adică chitosanul. Deoarece cele trei formulări au fost derivate din
același polimer și au avut aceeași concentrație (2,5% g/g), nu au fost detectate diferențe între
formulări. În acest sens, formulările care conțin nanocapsule au fost spălate în același mod ca cele
compuse doar din chitosan și NR.

3.4.Pătrunderea in vitro în mucoasa vaginală

Pătrunderea in vitro în mucoasa vaginală a fost determinată prin următoarele două tehnici:
1) cuantificarea fluorescenței în funcție de adâncimea mucoasei după extracția din țesut; și 2)
CLSM. În ambele experimente, penetrarea medicamentului a fost determinată pe substraturi
vaginale supuse testului de lavabilitate și încărcate cu NR.
15
 Tabelul 3 prezintă cantitățile totale de NR care au pătruns în țesut, iar profilurile cantității
de NR (μg) care a pătruns în funcție de adâncimea țesutului vaginal sunt prezentate în Figura 4.

Tabelul 3. Cantități de NR care au pătruns în țesutul vaginal (medie ± deviație standard, n

= 3) și raportul de îmbunătățire calculat ca raport între formularea NR nanoîncapsulată și

NR în gel de chitosan

Figura 4. Cuantificarea acumulării NR în mucoasa vaginală în funcție de adâncimea

mucoasei, după încorporarea în hidrogeluri chitosanice (medie ± eroare standard, n = 3).

Conform rezultatelor prezentate în Tabelul 3 și Figura 4, când NR a fost încapsulat în

nanocapsule, cantitatea de penetrare a fost mai mare. Figura 4 arată că NR în CH-RS-NR a pătruns
de trei ori mai adânc, în timp ce, în cel al CH-S-NR a pătruns aproape de două ori mai adânc.

16
Analiza profilelor de penetrare a NR a relevat comportamentul diferit al formulărilor; CH-NR a
prezentat aproape un model liniar cu distribuție omogenă a penetrării NR în țesut. Formulările în
care NR a fost nanoîncapsulat au prezentat modele diferite, în special la adâncimi cuprinse între
2.200 și 3.800 μm, unde s-au găsit diferențe semnificative între formulări (P<0.001).

CH-RS–NR a prezentat valori mai mari decât celelalte formulări testate la adâncimea
menționată (de la 2.200 μm la 3.800 μm). La 2.600 μm, 3.400 μm și 3.800 μm, de asemenea, CH-
S – NR este diferit semnificativ de CH – NR.

Nanocapsularea NR a crescut penetrarea sa în mucoasă, probabil din cauza diferiților

factori:

1) dimensiunea mică, care le permite să fie transportate cu ușurință prin bariere, cum ar fi
mucusul din epiteliul mucoasei prin transport pasiv sau activ – s-a observat, de asemenea, că,
datorită dimensiunii lor, nanoparticulele pot pătrunde prin și în celule, eliberând medicamente fără
a suferi degradări extracelulare;

2) bioadeziunea nanostructurilor, care contribuie la creșterea timpului de ședere a

medicamentului pe țesut, ducând la o îmbunătățire a penetrării substanței;

3) proprietatea de eliberare controlată, care poate prelungi eliberarea și crește timpul de

contact între medicament și mucoasă. De asemenea, tipul de polimer care compune învelișul
particulelor, reprezentat în această lucrare de Eudragit RS 100 și Eudragit S 100, ar fi putut juca
un rol important în penetrarea în mucoasă. Nanocapsulele bazate pe Eudragit RS 100 au prezentat
acumularea de NR la aproximativ 2.500-3.000 nm cu un vârf ascuțit, în timp ce nanocapsulele
bazate pe Eudragit S 100 s-au acumulat la adâncimi cuprinse între 1.000 nm și 2.400 nm, cu un
vârf mai mic și mai lin. Comportamentul diferit este probabil legat de caracterul ionic diferit al
celor doi polimeri; Eudragit RS 100 este cationic, iar Eudragit S 100 este anionic. Sarcina
cationică a nanoparticulelor RS ar putea permite CH-RS-NR să dezvolte un contact intim cu
suprafața mucoasei încărcate negativ. Prin urmare, nanoîncapsularea unui ingredient activ
hidrofob, în special în nanocapsule încărcate pozitiv, ar putea crește penetrarea în mucoasa
vaginală, îmbunătățind eficacitatea medicamentului. Mai mult, o creștere a penetrării ar putea
permite, de asemenea, o reducere a dozei.

Figura 5 prezintă imaginile CLSM ale mucoasei vaginale după aplicarea diferitelor
formulări de chitosan și după supunerea la experimentele de lavabilitate.

Figura 5A reprezintă mucoasa fără aplicarea oricărei formulări. Figura 5B, C și D au fost
obținute după aplicarea CH-NR, CH-RS-NR și, respectiv, CH-S-NR. Figura 5B-D permite
detectarea vizuală a fluorescenței în feliile de mucoasă. Figura 5B arată că aplicarea formulării
17
CH-NR a dus la o cantitate mai mică de fluorescență în mucoasă (zona mică roșie a imaginii)
comparativ cu Figura 5C și D reprezentând geluri care conțin NR nanoîncapsulat. O fluorescență
mai mare a fost vizualizată în formularea CH-RS-NR (Figura 5C) comparativ cu formularea CH-
S-NR (Figura 5D). Rezultatele bazate pe astfel de imagini sunt toate în conformitate cu profilul de
penetrare obținut cu probele extrase (Figura 4).

Figura 5. Imagini microscopice de scanare laser confocale ale mucoasei vaginale după
aplicarea gelurilor de chitosan care conțin NR

Comparația dintre gelurile chitosanice care conțin nanocapsule cationice și anionice este în
concordanță cu rezultatele măsurării tensiunii de tracțiune pentru mucoadezie, unde formulările
care conțin nanocapsule au rămas în contact cu mucoasa vaginală pentru o perioadă mai lungă de
timp. Astfel, timpul de contact crescut al acestor formulări care conțin nanocapsule duce la o

18
penetrare crescută a NR. Astfel de rezultate arată că medicamentele nanoîncapsulate pot pătrunde
cu ușurință în țesut.

4. Concluzii
Nanocapsulele polimerice cu încărcări de suprafață cationice și anionice care încapsulează
NR ca substrat lipofil model au demonstrat proprietăți adecvate pentru aplicare vaginală. Gelurile
de chitosan au fost produse ca nanotransportori pentru acele nanocapsule, cu o concentrație de
chitosan de 2,5% greutate/greutate determinată a fi cea mai potrivită pentru eliberarea vaginală.
Hidrogelurile chitosanului au prezentat o aderență mai mare la mucoasa vaginală, care este cel mai
probabil legată de contribuția mai mare a proprietății vâscoase asupra proprietății elastice a
gelurilor. În ceea ce privește pătrunderea NR în mucoasă, rezultatele au indicat că o cantitate mai
mare de NR a pătruns în mucoasă atunci când a fost nanoîncapsulată, mai ales atunci când este
încărcată în nanocapsule încărcate pozitiv, cel mai probabil datorită interacțiunii electrostatice cu
țesutul încărcat negativ.

Având în vedere aceste rezultate, această lucrare arată aplicabilitatea acestei formulări
inovatoare compusă din 2,5% g/g gel de chitosan, ca nanotransportor, și nanocapsule polimerice la
administrarea de medicamente vaginale. Gelul de chitosan și nanocapsulele polimerice cresc
mucoadeziunea și cantitatea de medicament lipofil care pătrunde în țesut și ar putea duce la un
efect mai mare în comparație cu medicamentul liber. Formularea inovatoare poate fi considerată o
alternativă pentru tratamentele în care medicamentul trebuie păstrat, pentru o perioadă lungă de
timp, în contact cu mucoasa și, de asemenea, pentru tratamentele în care efectele adverse ale
medicamentului, cum ar fi iritarea mucoasei, ar trebui să fie a scăzut, ceea ce ar putea fi realizat
prin nanoîncapsulare.

19
5. Bibliografie

1. Frank LA, Sandri G, D´Autilia F, Contri RV, Bonferoni MC, Caramella C, Frank AG,
Pohlmann A, Guterres S. Chitosan gel containing polymeric nanocapsules: a new
formulation for vaginal drug delivery. Int J Nanomedicine. 2014; 9(1) :3151-3161
https://doi.org/10.2147/IJN.S62599

20