s:

m
C
n»
s:
m
z
-1
m
C
m
!II
o
(/)
Z
-1
m
N
»,
 ilfi!2<?!;
Cătălina Daniela Stan
Descrierea CIP a Bibliotecii Nationale a României
STAN, CĂTĂLJNA DANIELA
Medicamente de biosinteză / Cătălina Daniela Stan - laşi:
Editura Gr. T. Popa, 20 I 1
Bibliogr.
Index
ISBN 978-606-544-041-8
MEDICAMENTE_.
615.45
DE BIOSINTEZA
Referen~i
Prof univ.
Prof. univ.
ştiin~ifici:
dr. Monica Hăncianu
dr. Lenuta Profire
~MC'~~ ::OP~I
Prof univ. dr. Ursula Stănescu BIBLIOTECA CE~TRALAJ

Coperta: Marius Atanasiu

I U~G'. T. popa.,AS'1 BIBLIOTECA U.M.F. IASI

~~Ir.l.a)l(f"r!P~. 0'/. 01.0a"

' U~tlOl~~. ~!I'T"'Lţ
I_~ .- • _ ••_ __ __.; 1'~ill~IIIII~~
BARCOD: 1652662388
Univcrsitatea de Medicină şi Farmacie laşi
Str. Universităţii nr. 16

Toate drepturile asupra acestei lucrări apar/in autorilor şi Editurii .. Gr. T Popa" laşi.
Nici o parte din acest 1'0111/11 I1U poate ii copiată sau transmisa prin nici 11/1 mijloc. electronic ,
S(lU mecanic, inclusiv fotocopiere, fără permisiunea scrisă din par/ea autorilor sali CI !
editurii. .J
.,
!! Editura "Gr. T. Popa", U.M.F. Iaşi
;î
Tiparul executat la Tipografie Universităţii de Medicinii şi Farmacie "Gr, T. Pura" I"şi ,1
.\
2011
str. Universităţii nr. 16, cod. 700115. Tel. 0232 2677lJX int. 231, Fax 0232 211 X2 ,1
;'j
{J
;~
~
 Cuprins

Prefaţă . .9
Abrevieri . II

introducere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . . . . 19

Capitolul I
CONCEPŢIA SI PRODUCŢIA UNUI NOU MEDICAMENT · q}
1.1. Crearea noilor entităţi moleculare . . ............... (f{)
1.2. Dezvoltarea unui nou medicament . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ®
1.2.1. Studiile pre-clinice . . . . .. ®
1.2.1.1. Studiile de preformulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 31
1.2.1.2. Studiile tie formulare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .34
1.2.1.3. Studiile de optimizare . .36
1.2.2. Studiile clinice ... ' . . '.. ~ . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. (3H)
1.2.2.1. StudIIle clinice de faza I ..... . . . . . . . . . . . .. Y9
1.2.2.2. Studiile clinice de fază II . ....................... 39
1.2.2.3. Studiile clinice de fază III · .. 39
1.2.2.4. Studiile clinice de fază IV · . 41
.,
1 I.J. Patemarea noilor candidaţi terapeutici . . . .. . .. .(4t;
\1
~..~l 1.4. Realizarea in fază pilot a noului medicament . . . . . . . . ... . @)
, 1.5. Producţia la scară industrială a,~llXdicamentclor .... ',.'-::-" .:_: . · ('50
;1
.~
.
Bibliografie L).Ct':l6' WN:'_~ . fo.10." MI:.;...'c\v· ,"0,1'(-1. : .e~iJ . .~

.~
Capitolul II
,1 BIOTEHNOLOGIA ACIZJLOR ORGAN ICI ....................... 62
~~ 11.1. Biotehnologia acidului lactic . 63

j 11.2. Biotehnologia acidului gluconjc . (j§)

1 11.3. Biotehnologia acidului citric . 77
Bibliografie . . 86
 f

Capitolul VII
Capitolul III
BIOTEHNOLOGIA AMINOACIZI LOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 B10TEHNOLOGIA ANTIVIRALELOR ................. 246
, / .• ')
VII.1. Antivirale active asupra virusului HIV . . . . .. 250
111.1. Biotehnologia acidului glutamic
-._- (95
. ,~.,~
111.2. Biotehnologia L-lizinei
-,-

102
VI! .1.1. Biotehnologia larnivudinei @.Q)
VII.I.2. Biotehnologia abacavirului . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 254
111.3. Biotehnologia L-treoninei . 109 VII.2. Antivirale active asupra virusuri lor gripa le 259
111.4. Biotehnologia L-triptofanului 112 V11.2. 1. Biotehnologia zanamivirului 259
111.5. Biotehnologia L-fenilalaninei 116 V11.3. Antivirale active asupra virusurilor herpetice . . . . . . . 262
111.6. Biotehnologia acidului L-aspartic 119 VI1.3.!. Biotehnologia vidarabinei . .. 262
111.7. Biotehnologia L-DOPA 122 Bibliografie . . . . .. .. . . . . . . 264
111.8. Biotehnologia L-cisteinci 125
Capitolul VII!
Bibliografie 129 BIOTEHNOLOGIA ACIZILOR GRAŞI POLlNESATlIRAŢI 16R
VIII.!. Acizii graşi ... 268
Capitolul IV
BIOTEHNOLOGIA VITAMINELOR 133 VIII.2. Lipidele microbiene - SCO 275
V1I1.2. 1. Biotehnologia acidului y-linolenic .

"1-
IV 1. Vitaminelc hidrosoluhile . . . . . . . . . . . .. 137
IV.I.I. Biotehnologia vitaminelor din grupul B . . . . . . . . . . .. 137 VI!1.2.2. Biotehnologia acidului iJrahido!li.c . . . 2R5
IV.I.I.I. Biotehnologia vuuminei O, _ . . . . . . . . . . . . . . . . .. 139 VII1.2.3. Biotchnolngia acidului d(~cos!!!_l.~~..!!.oic V
.. 2R
IV.I.I.2. D~()lChno!~gia. vitaminei D~- <1l!.47_) VI 11.2.4. Biotchnolog ia acidului eicosapcntacnoic 294
IVI.2. Biotehnologia vuanunei C . . . . . . . . . . (J..g) Bibliografie 298
IV2. Vitarninele liposoluhile . . .. . . . . . . 167
IV.2.1. Biotehnologia ergosterolului . .. .. . . . . . . 19_7 Bibliografie generală 305
IV.2.2. Biotehnologia (3-Carotcnului . . . . . . . . . . . . (l];l) Index . . .310
IV.2.3. Biotehnologia carotenoidelor 1'83
Bibliografie IR9

Capitolul V
BIOTEHNOLOGIA HIPOLIPIDEMIANTELOR . .. 194
VI. Staunele · ·.· .. 199
V.I.I. Biotehnologia mevastatinei (20~)
VI.2. Biotehnologia pravastatinei ~;
V.I.3. Biotehnologia lovastatinei 211
Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .214

Capitolul VI
BlOTEHNOLOGIA IMUNOSLIPRESOARELOR ............ 217
VI.I. Ciclosporinele .. . . . . . . . . .. . 218
VI.I.I. Biotehnologia ciclospqrjnejA âîJ)
V1.2. Biotehnologia rapamicinei. . 227
V1.3. Biotehnologia lacrolimusului 233
VI.4. Biotehnologia ascomicinei 238
Bibliografie 240

]
 Prefaţă

Biotehnologia este ştiinţa cu cea mai accelerată rată de progres, În ce priveşte

dezvoltarea noilor tehnologii şi a aplicatiilor lor practice. Fiecare decadă de timp
vine cu noi achizitii În acest domeniu, ceea ce justifică avalanşa de informatii care ne
bombardează aproape zilnic. Acest progres se bazează pe impactul biologiei mole­
culare şi al geneticii asupra biotehnologiei şi implicit asupra bunăstării omenirii.
Ţinând cont de diversitatea biotehnologiei, o ştiinţă ce are aplicatii În foarte multe
domenii (farmaceutic, medical, alimentar, de protecţie a mediului etc.), este imposibil
de atins Într-un singur volum toate aspectele importante. De altfel, nici nu mi-am
propus realizarea unui astfel de tratat, ci doar condensarea şi prezentarea unitară a
ultimelor noutăţi În domeniul biotehnologiilor fermentative cu aplicatii În domeniul
farmaceutic.
Literatura românească de profil nu are un astfel de volum, care să prezinte de la
,
J A la Z un medicament" biotech", motiv pentru care am dorit să completez golul
:1 existent.
"1
j Aşa cum aminteam În prefata cărţii Biotehnotogii farmaceutice. Antibiotice .
1 apărută În anul 2007 sub semnătura mea, biotehnolog ia nu Înseamnă doar inginerie

l
genetică, ci şi producerea prin tehnologii lermentative a unor substante medica­
meruoase. Dacă În volumul anterior m-am axat doar pe biotehnologia anubioticelor,
volumul de faţă prezintă tehnologiile lermentative de obtinere ale unor substante
medicamentoase ce aparţin claselor de: acizi organici, aminoacizi, vitamine, hipo­
lipiderniarue. imunosupresoare, antivirale. acizi graşi polinesaturaţi.

1
~
Întrucât cercetarea şi dezvoltarea noilor medicamente este ea însăşi o adevărată
ştiinţă, am Încercat să prezint Într-un capitol separat toate etapele ce trebuie parcurse.
! în acord cu legislatia În vigoare. pentru ca o substanţă chimică să ajungă o formă
farmaceutică cu drept de punere pe piaţă.
În capitolele ulterioare sunt prezentare clasele terapeutice În care se regăsesc
substante farmaceutice de biosinteză. Pentru fiecare substanţă activă de biosinteză

1 sunt prezenta te proprietăţile fizice, chimice şi farrnacologie. inclusiv produsele

farmaceutice care se utilizează acum În terapie. Tehnologia de biosinteză este detaliată
şi contine cele mai noi achiziţii, precum şi perspectivele cercetării.
 r

10 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Aşa cum orice lucru este perfectibil, şi această lucrare se supune acestei reguli,
putând fi îmbunătăţită prin sugestiile pertinente ale celor ce o parcurg.
Fiind prima carte cu acest specific din literatura ştiinţifică românească, am dorit
să deschid un drum al cunoaşterii medicamentului "biotech" sub toate aspectele sale,
inclusiv al modului de obţinere. Lucrarea de fată se adresează tuturor acelora care au
ca ohiect de studiu sau ca preocupare hiotehnologia.
Doresc să multumesc familiei mele, în special copiilor mei, şi nu în ultimul rând,
referenţilor care şi-au arătat disponibilitatea de a aprecia această carte.
Abrevieri
Cătălina Daniela Stau
Iaşi, ianuarie 2011
 Ăngstrom (1O.IU m), unitate ele măsură a lungimii ele undă
AA acid arahidonic
AAL acid a-I inolenic
Ahu acid L-2-aminohutiric
ADA enzirna adenozin dezaminaza
ADH acid docosahexaenoic
ADHD Attention Deficit Hyperactivity Disordcr = sindromul deficitului de atentie
',j
adrn. administrare
ADN acid dezoxiribonucleic
ADN< acid dczoxiribonucleic complementar
.~
AEP acid cicosapenraermic
~
.::',1\ AGL acid y-linoJenic
AL acid linoleic
Ala alanină
, ANS antranilat sinretaza
~ ARN acid ribonucleic
j
.;; ARN", acid ribonucleic mesager
.'
AS[l acid aspartic
j aun. aunosfere
ATCC American Type Culture Collection = Colectia de culturi americane de control
i
1 ATP adenozin trifosfut
bari unitate de măsură a presiunii (J(}' pascali)
Bmt (4 R)-4- [( E)- 2 -buteni I J-4-mei i 1- L-treoni na
BOPI Buletinul Oficial de Proprietate Industrială
C4• CI~ atomul de carbon numărul 4. numărul 18 etc.
cartier termen in limba engleză ce defineşte un uunsportor pentru subsrantcle

l
active În organism
C/N carbon/azot
CDSCO Central Drugs Standard Control Organiz.ation = Organizatia centrală pentru
controlul standardelor pentru medicamente din India
CM Comisia Medicamentului

II
CMV citomegalic virus = virus ce determină sindroame proteitorrne
 12 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOStNTEZĂ 13

CN grupare cian "ex ternporae" termen in limba latină ce arată că forma farmaceutică se prepară În
CN­ ion cianură momentul irnrebuinţării
colab. colaboratori tactor LLD factorul Lactobacillus lactis Dorner
coord. coordonator FAD flavin-adenin-dinucteotid = grupare din structura unor enzirne din
cp. comprimate clasa oxidoreductazelor ce funcţionează ca transportor de hidrogen
cps. capsule FADH2 1.5 dihidro-FAD = forma redusă a FAD ce este un transportor de
CTD Common Technical Document Documentatia tehnică comună electroni
d densitate FDA Food and Drug Administration = Agenţia Americană pentru alimente
D, D( +) configuratie dextro şi medicamente
d20 densitatea determinată la 20()C FK523 analog al ascomicinei
Da daltoni FK506 taerolimus
D-Ala dextro alanină FK520 ascomicina
DAP acid diamino-pimelic FKBPI2 FK506-Binding Protein 12 = enzimă formată din 107 aminoacizi ce
Deoxi-Me-Bmt deoxi N-metil {4R)-4-( (E)-2-buteni 1)-4-metil-L-treonina catalizează legarea de substrat a tacrolirnusului şi a rapamicinei
dj. drajeuri FMN flavin-rnono-nucleotid = grupare din structura unor enzime din
2.5 DKG acid 2,5-diceto-D-gluconic clasa oxidoreductazelor ce funcţionează ca transportor de hidrogen
DL amestec racernic FR-900520 ascomicina
DL-ATC acid DL-2-amino- D2-tiazo] in-4-carbox i I ic FRAP FKBPl2-Rapamycin Associated Protein = proteină asociată cu
DL-Met amestec racemic de rnetionină i complexul FKI3Pl2-rapamicină = este o fosfatidil inozitol kinază ce
D-Me-Yal dcxtro N-metil valină este receptor intracelular pentru rapamicină
D-Ser dextro serină ~ g grame
DMFA diruetilformamidă j Gln gtutamină
DMSO dimetilsulfoxid :j Glu acid glutamic
Dn ditiotreitol = reactiv ce stabilizează/refacc cnzimele şi alte proteine ~ Gly glicină
;,
cu grupări sulfhidrice
oxidarea in vitro
libere a căror activitate s-a pierdut prin
"; GMP Good Manulacruring Practice = Norme de bună practică
g/g concentratie proccntuală raportată la grame pe gram
EBV Epstein-Barr virus virus ce determină rnononucleoza (boala
(gr.) În limba greacă
sărutului)
~ h ore
(ed) editor i
.j H" ionul de hidrogen
Ed. editură
i H1 atomul de hidrogen
EDTA acid etilcn diaminotetraaceuc j
Ha hectare (10~ 1112)
(eds) editori ~ HC Health Canada = Ministerul Sănătăţii din Canada
ee enaruiomeric exces = exces de enantiomer = reprezintă diferenta
absolută dintre Iractiile molare ale fiecărui enantiorner şi este o
măsură a gradului de puritate a unui enantiorncr (celălalt enanuomer
este ca impuritate)
j HIV
HMG-CoA
HO'
Human lmmunodeficicncy Virus = virusul imunodcficientei
3-hidroxi-3-mctilglutaril-coenzima
anionul hidroxil
A
umane

EFPIA European Fcderation or Pharrnaceutical Industries and Associations = HPLC High Pressure (Pcrformancc) Liquid Chromatography = Cromatografie
Asociatia Europeană a Producătorilor din Industria Farmaceutică de lichide de inaltă presiune (performanţă)
e.g.
EMEA
exempli gratia = de exemplu
European Medicines Agency = Agentia Europeană a Medicamentului 1 HSV
HVI3
hv
herpes simplex virus = virusul herpesului simplex
hcpatuis B virus = virusul hepatitei B
lumină
(engl.) in limba engleză
el al. el alii = şi altii i­ izo-
etc. ct caetera = şi altele (şi aşa mai departe) " l-aza cnzirna integraza
European Patent Organization = Organizatia Europeană pentru patente ICCF Institui de Cercetări Chimica-Farmaceutice din Bucureşti
/1'

EuPO j

J
 f
~
1
I
14 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 15

ICH Interoational Conference on Harmonisation Asociaţia MHLW Ministry of Health, Labor and Welfare = Ministerul Sănătăţii, Muncii ~i al
Internaţională pentru Armonizare Protectiei Sociale din Japonia
i.e. id est = care este rnin. minute
IFN interferon mi mililitri (10-3 1)
IL-2, lL-4, IL-IO interleukina 2, interleukina 4, interleukina 10 mM concentraţie milimolară (l0') M)
Ile izoleucină rnm Hg milimetri coloană de mercur
i. m. intrarnuscular MI" masa moleculară relativă
IMP dehidrogenază inozin monofosfat dehidrogenază m/s metri pe secundă
inj. injectabil MS Ministerul Sănătăţii
in situ expresie in limba latină ce defineşte locul unde se desfăşoară MSG monosodium glutarnare = glutamat de sodiu
procesul chimic (in acelaşi loc, la fala locului, in acelaşi mediu) MTCC Microbia! Type Culture Collection = Colecţia de culturi microbiene de
il! vacuo expresie in limba latină ce defineşte un spaţiu gol, lipsit de aer control
(vid), sau se referă la substanţe ori obiecte aflate in vid N azot (arată ataşarea de azot il unor grupări), conceruratie normală
in vitro expresie in limba latină ce arată că experimentul s-a efectuat in n număr de molecule
atara unui organism viu (in eprubetă, în sticlă) 11- normal-
in vivo expresie in limba latină ce arată că experimentul s-a efectuat N2 atomul de azot
intr-un organism viu NAG N-acetil- D-glucozami nă
i.v. intravenos NAM N-acetil-D-manozamină
JPMA Japan Pharmaceutical Manufacturers Association Asociatia NANA acid N-acetil neuraminic
Producătorilor Farmaceurici din Japonia NCAIM National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms =
Kcal kilocalorii (103 calorii) Colectia Naţională de Microorganismc Industriale şi Agricole din Ungaria
2-KLG acid 2-ceto-L-glucnnic NEM noi entităţi moleculare
kg kilograme (103 g) 'i NFAT Nuclear factor of activatcd T-cells = factor de activare al celulelor T
I litri ;j
familie de factori de transcriptie importanţi pentru răspunsul imun
I- rotaţie levo ~ nanomctri (10.9 m)
L, L(-) configuraţie Icvo .i, 11In
nr. număr
(lal.) in limba latină
NRRL Northcrn Regional Research Laboratory (acum denumit National Centcr
L-ATC acid L-2-amino-D~-tiazolin-4-carhoxilic '1 for Agriculiural Utilization Research) = colectie de culturi microbiene din
Leu leucină :1
l SUA
L-Glu acid levo glutamic i Nva L-norvalină
L-Lys levo lizină
OMS Organizatia Mondială a Sănătăţii
M concentratie molară
OSIM Oficiul de Stai pentru Inventii şi Mărci înrcgistrate din România
m2 metri pătraţi
P-aza enzirna preteaza
m3
mbar
metri cubi
milibari (100 pascali) 1
'1
PCT
PEG
Patent Cooperation Treaty = Tratatul international de cooperare a patentelor
polietilenglicol
MeAoa acid N-mctil L-2-alllinooctanoic j
:1 p.f. punct de fierbere
MeBmt N -meti I (4 R)-4-( (E)- 2-buteni 1]-4-met i I-L-treon i na
pH logaritm zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de hidrogen
MeGly N-metil glicină 1 PhD Philosophy doctor = persoană care a sustinut () teză de doctorat şi are tillul
Melle N-metil izoleucină
ştiinţific de doctor
MeLeu
ML-236B
N-meti! leucină
numele codificat al mevastatinei 1 Phe
PhRMA
fenilalanină
Pharrnaceutical Research and Manufacturcrs of America = Asociatia
mEq
MeYal
miliechivalcnti
N-metil valină
J Producătorilor şi Cercetătorilor Farrnaceutici din America
PIC/S Pharmaceutical Inspection Cooperation Scheme = Inspectia Farmaceutică
mg mii igrarne (10') g)
1

J
 16 CĂTĂLlNA DANtELA STAI'< MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 17

pK = logaritm cu semn schimbat al constantei de disociere a unui electrolit TG trigliceridc

slab, care indică proportia de transformare în ioni, În solutie diluată, a TGA Therapeutic Goods Administration = Autoritatea Sanitară din Australia
acelui compus Thr treonină
ppm = părţi per milion = conceruraţie corespunzătoare la 1· 10-6, sernnificând Tris-HCI clorhidrat de hidroximetil aminomctan
I git, I mg/kg Tyr tirozină
PQQ = pirol-chinolin-chinonă = cocnzimă a unor dehidrogenaze şi aminooxidaze tPAr activatorutui tisular al plasminogenului uman recombinant
PQQH2 = pirol-chinolin-chinol = forma redusă a PQQ U unităţi
p.1. = punct de topire UE Uniunea Europeană
PlD = Patent aud Trademark Oftice = Oficiul pentru Patente şi Mărci Înregisuute UI unităţi internationale
din SUA USP United States Pharmacopncia = Farmacopcea Statelor Unite ale Americii
PUFA = Polyunsaturated fauy acids = acizi graşi polinesaturati UV radiaţii ultraviolen,
pvc = polyvinyl chloride = clorură de polivinil - polimer termoplastic v/v concentraţie proceruuală raportată la volum pe volum
R" Rz, R3 = radicali ataşaţi de o moleculă Val valină
(R)- = rectus (laI.) = dreapta var. variatia
raze X = radiaţii electromagnetice ionizante cu lungimi de undă mici cuprinse vol. volum
intre 0,1-100 A v/v/m volum/volum/minut
RN-aza = enzima ribonucleaza VZV varicclla zosrer virus virusul varicclei zoster
rot/min = rotaţii pe minut pg microgramc (10·" g)
RSV = respiratory syncytial virus virus ce determină infecţii ale tractului Ilm micrometri (l0·" m)
interior respirator ~IM concemraţie micromolară (10-1' M)
RT = enzima reverstranscriptaza urnoti micromoli
S­ = sulf (arată ataşarea unor grupări de atomul de sulf) aproximativ
(S)- = sinister (lat.) = stânga > mai mare
$ = dolari americani < mai mic
Sar = sarcozină (- ) enantiomerul levo
s.c. = subcutanat (+) enamiomerul dextro
SCO = Single Cell Oils = lipide produse de unele microorganisrne (±) amestec racernic
= S-carbamoil-L-cisleina / per
SCC ~"
SFDA = State Food and Drug Administration = Administratia de stai pentru t % concentraue procemuulă
"~ "C grade Celsius
al irnente şi medicamente din China
SH = grupări sulfhidril
~ 11 randament
SJDA = Syndrome dhumunodeficience Aquise = Sindromul irnunodeficienţei ~ a alfa

sin.
SNC
sol.
umane dobândire
= sinonim
= sistem nervos central
= solutie
,
~
~
~

1~
p
y
s
L
bela
gama
delta
cpsilon
sp. = specie K kappa
spp. = specii ~;. 69 desaturază ce introduce o dublă legătură In pozitia 9 a lantului hidrocarbonar
SUA = Statele Unite ale Americii !O omega
supl , = supl iment i
target (engl.)
= tonă
= (intă, loc dc actiune
!
t.carn. = temperatura camerei
TFL = tirozin fenol liaza i
1
t
 1 ''.

Capitolul 1
CONCEPŢIA ŞI PRODUCŢIA
UNUI NOU MEDICAMENT

i Medicarnenrul este definit de către OMS ca tiind orice substanţă sau asociere
'i de substante care modifică un proces fiziologic sau patologic în beneficiul celui
~
i care îl foloseşte.
I
\
,! ... ~edica~.~~!ul este un produs preparat de specialişti pentr~~~
1 ([area)Sau:4?-r~.x.~~ unor boli, sau a unor tulburări funcţionale , la om sau la
anmlale; orî'pentru stabilirea unui~~~!,ios®
j J3..\iilli?1!u:.a. unui medicament este un proces complex, care necesită vaste
.\
~ cunoştinţe ştiinţifice şi o foarte bună colaborare interdisciplinară intre specialiştii
~;1 ce lucrează la elaborarea acestuia. Între aceştia, farrnacistul este specialistul
numărul unu În domeniul medicamentului, el participănd la toate etapele de
ii cercetare şi dezvoltare a medicamentului.

!1
,1
0-:-
Farmacistul participă la :
crearea de noi entităţi moleculare;
~).:- elaborarea de forme farmaceutice ;
,$)-:- productia industrială a medicamentului;
:' 'V-:- eliberarea medicamentului către bolnavi.
1 \A. În productia industrială de medicamente farrnacistul are un rol central, el
regăsindu-se la toate nivelurile de producţie :

1 • dirijează serviciile deQ!QQ.lJ~.t!.~(sectii de fabricare, conditionare, ambalare erc.) ;

• dirijează serviciile de C~!~~~.\~ţ.şLgezyolta[e(obtinere de noi substante active,
de noi forme farmaceutice, elaborarea de noi metode de control, noi metode
de fabricare, realizarea de studii farmacologice, studii toxicologice) ;

1 • dirijează serviciile de aproviziona!]<_ş_i_elep.QZ.illu:.e (documentare bibliogratică,

documentare statistică," do~'u~;~îareinformatică) ;
• dirijează serviciul de ~butie ;
• dirijează şi participă la c~mp.ar~~~_pu~~ic.!!~r:_ă a unui medicament etc.
 l'
~
~
i
,1
J MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 25
24
CĂTĂLIN A DANIELA STAN iI
La început, descoperirea de noi medicamente era apanajul companiilor farma­
Farmacistul are competenţă pentru a colabora În cadrul unor echipe complexe
ceutice, care realizau medicamentul de la A la Z, dar care comunicau prea putin
cu medicul, chimistul, biologul şi inginerul. El este cel care tace legătura Între
cu alţi specialişti (din alte companii farmaceutice. universităţi, laboratoare de
~j _şpe_cil!~ăţi care participă la productia de medicamente.
div~~:s..ele._<?_o_l_~~~r_t~1.f!.!lt~ :1 cercetare etc.), astfel încât dezvoltarea de noi medicamente era fragrnentată.
(Etapele vietii un_ui medicament)pot ti grupate în două perioade distincte :
•... ~---'-~----- _-_
.. -- .----._ .. __ -_.-_ .. -_. Astăzi, datorită cerinţelor actuale, studiile ce implică obtinerea de noi medi­
1. Crearea, productia şi comercializarea unui medicament camente sunt multidisciplinare şi se referă la proiecte mari de cercetare, în care
"
i sunt angrenate numeroase companii farmaceutice, universităţi şi laboratoare de
• cercetarea şi dezvoltarea unei noi entităţi moleculare în scopul obţinerii unui j cercetare.
nou candidat terapeutic; 4 Pentru a scoate pe piaţă un medicament conventional. costurile se ridică la
• realizarea În fază pilot a noului candidat terapeutic; i
i aproximativ 800-880 milioane $, conform unui studiu al lui J. A. DiMasi publicat
• producţia industrială a noului medicament;
în 2003 (după alti autori suma s-ar ridica la 1-1,2 miliarde $, incluzând şi
• conditionarea; chelruieliule cu cercetările eşuate).
• comercializarea. Unii specialişti din domeniul medicamentului arată că doar transformarea unei
2. Administrarea propriu-zisă 1 noi entităţi moleculare într-un medicament necesită costuri de 200-350 milioane $.
t
În anii'60 dezvoltarea unui nou medicament se realiza în - 8, I ani, În anii '70
•
•
administrarea la bolnavi;
exercitarea efectului terapeutic.
,j timpul a crescut la - 11,6 ani, iar În anii '80 a ajuns la - 14,2 ani. Între anii 1990-
',t 1995 dezvoltarea de noi medicamente se realiza în - 15,3 ani, unii specialişti
,~
1. Crearea, producţia şi comercializarea unui medicament afirrnând că uneori sunt necesari chiar şi 20 de ani (8. Sharpiro, 1995).
~,t
Această etapă presupune parcurgerea mai multor paşi in scopul obţinerii unui nou .~ Astăzi, se a"Pr,e~c,~t!Z~ ~ă entru q:ţ_cet<ţrea şi d.s~v.olt<l:rea unui I!QU rnedjcament .
medicament:
J sunt ~e~~_saJ~ îIll~$. i!lP,. 1(în functie de natura noii entităţi moleculare). Timpi i

.,/ obtinerea de noi entităţi moleculare, sau îmbunătăţirea celor deja existente;
1 necesari studiilor de specialitate, aprobărilor din partea comisiilor avizare şi

.,/ testarea pre-clinică şi clinică a noilor candidati terapeutici ;

.,/ alegerea formei farmaceutice;
il punerii pe piaţă a unui nou medicament se pot observa în figura nr. I (adaptată
după D.1.A. Crornmelin, R.D. Sindelar (eds.). 2002).
;1 lJ~94$.II,iilJar~1l'lGe~tj~~ investeşteJ~ţi9.r:!nliIi~rde de $ a1w~~(e.g.- 30 miliarde
.,/ formularea; '1 $ numai În J 998) pentru idenţil)q!rea de' noi eiitităţi moleculare şi dezvoltarea
,j
.,/ obţinerea avizului de fabricatie;
'~
noilor ~~!!.9i?Ni.}e.~,al?~uticCArro~imati/'22 % din această sumă se ~h~ltuie pe
.,/ realizarea în fază pilot a noului medicament;
screening-ul şi testele de toxicitate. Problemele administrative contribuie şi ele la
.,/ transpunerea la nivel industrial (fabricarea şi condiţionarea) ; j rata mare de insucces a unui nou candidat terapeutic.
.,/ comercializarea noului medicament.
2. Administrarea proprju-zisă
1'i
<~
Date statistice oferite în 2007 de The Pharmaceutical Research and Manu­
[acturers of America, arată că sumele investite de companiile farmaceutice pentru
Această etapă presupune exercitarea efectului terapeutic al noului meidcament la cercetarea şi dezvoltarea unui nou medicament se dublează la fiecare 5 ani.
~
nivelul organismului uman, prin parcurgerea etapelor tarmacocinetice şi farrnaco­
dinamice. caracteristice pentru fiecare medicament în parte: administrare, ab­ 1 ajungând în 2006 la - 55,2 miliarde de dolari. Acest lucru înseamnă că din
fiecare 5 $ câştigaţi la vânzarea unui produs farmaceutic, 1 $ se cheltuie pentru

I
sorbtie, transport, metabolizare. exercitarea efectului terapeutic etc. viitoarele cercetări.
De exemplu, l1rma.rXi~er, cea mai mare companie farmaceutică din lume la
ora actuală, a cheltuit în 2006 pentru cercetare-dezvoltare 7,6 miliarde $. în
1 .1. fGfearE!ă'i!nbil6t:~entitătr·trto..l~~gl.~~,e l'-' vreme ce câştigurile firmei pentru acelaşi an au fostde4~-,.,!_1!lijtiarde $. Acest
lucru arată că ~~'!:D.~
~~,l)R\mU.,~~~!1),~c~~utic~!f~~\~t~{)~WJtJil, s.~r.~~!a,r~:pentru a
În ultimii 15-20 de ani au apărut modificări importante în procesul identificării , rămâne lideri de piaţă ..
""i:.."I"·\··""- . • •.;-.:., . <:,·~,,.. ";;;:::<:."-;.";",. -v-: . ..•
descoperirii şi dezvoltării la nivel industrial de noi medicamente, în ceea ce
priveşte natura chimică a acestor noi compuşi şi modul lor de utilizare.
 ~r
,
i

26 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ

27

2 - 10 ani cercetări ale noilor ~SOOO entităţi I Medicament 12 ani

Descoperire moleculare no aprobat
entităţi moleculare

I T I I I ~I 00 candidaţi
9,5 ani

Teste prcclinice 1-3 ani testări pc animale

terapcutici
6,5 ani
1.
1 I I ~90 candidaţi
Faza I clinică lan 20-100 voluntari
sănătoşi terapeutici

I I I ~ 70 candidaţi
Faza II clinică .... 2 ani 100-300 tcrapeurici aprobarea
pacienţi
candidatilor faza III Iaza ll faza I testare
T I I ~30 candidaţi
tcrapcutici clinica clinica clinica preclinica

I - 4 ani 1000-5000 tcrapcutici Figura IIr. 2 Descoperirea şi aprobarea noilor candidati terapeutic:
Faza-III clinic i

I
pacienţi

I I T I I tare. în ultimii ani s-a putut realiza reducerea timpilor necesari procedurilor de
aprobare. În mare parte dosarele depuse se pot analiza În 10- J 2 luni şi astfel
analiza de către specialişti ~ I O candidat i
Analiza FDA 2 luni - 7 ani ,1 autorizatille sunt eliherate mai repede.
, a dosarelor preclinicc şi clinic' tcrapeutici
EMEA.CM I Cu toale noile reglementări. modificări şi reduceri ale timpului de analiză şi
I I I I I I I I I I I I J a costurilor, obţinerea de noi medicamente din categoria "biotech" se realizează,
I 2I T3 T4 5I 6I I I I I I I
i
încă, cu costuri foarte mari. comparativ cu medicamemele convenţionale (tra­
Ani O 1 7' 8 9 10 11 12 13 ditionale),
Ahilitatea noastră de a obţine entităţi moleculare noi. cu afinitate mare pentru
Figura nr, 1 Cercetarea şi dezvoltarea unui nou medicament I receptori, a crescut simţitor, Însă studiile pre-clinice şi clinice ale acestor enrităţ.
Legendă: FDA - Food and Drug Adrninistration ; EMEA - European Medicines Agency :
1 moleculare nu s-au îmbunărănr semnificativ.
CM - Comisia Medicamentului
1 Studiile de specialitate estimează că aproximativ 40% din aceste entităţi ,
obţinute de companiile farmaceutice, sunt candidaţi pentru testările pre-clinice.
Din datele statistice oferite de companiile farmaceutice şi laboratoarele de Doar 10% din aceştia trec testele clinice şi primesc aprobare de punere pe piaţă,

cercetare se constată că. d~i.2.J.(199d_~ .can9.ipatLtH~p.e.utici ce intră în t~ş!ţle
P.!],~s!iui!;:e doar J",.ajung să fie t~~tiHL.fEpic (în faza III) şi 18its,Lpin 5 candidati
terapeutici va primi ,!P,.rQ~ft,,~~Jl'\l.P.~!f-,p~,piaţă (tigura nr. 2).
Nu este surprinzător că. pe an ce trece, costurile pentru introducerea pe piaţă
a noilor medicamente sunt din ce ~pce mai ;;;-ri,'î,;"timp ce candidaţii terapeutici
care primesc aprobare de pUllere,pe'pîaîii'sun'tdin ce in cemai putini ca număr.
Toate acesteaau cr~at"o p~;;'b1e'mă serioasă pentru ipdustria i~r'tlia~eutică, care
i!!}(~st\(~~,;,~~,u.ltş.i r~fu.p'~,r,e~~.~.~p~uţ\l}r,.dil:t,sl,le,~t,~,~~li,d~';"'şr-p~~tru pacienti, care
aşteaptă am de zile pentru utilizărea de nOI medicamente.
Întrucât industria farmaceutică presează agenţiile guvernamentale să grăbească
procedurile de aprobare, ceea ce ar presupune şi reducerea costurilor din cerce-
I
Totuşi, În unele cazuri, se poate ca timpul necesar introducerii pe piaţă a unui
nou candidat terapeutic să fie cât mai scurt posibil.
Astfel, o echipă de cercetători de la compania Merck, folosind hiotehnologiile
avansare şi design-ul molecular, necesar stabilirii celui mai promiţător rnedica­
:) mentb;ţp putut accelera descoperirea unui n0l! ~nlljbitor:-f!! pI:9le_azei antiretrovirale
'ţRIXJYĂ.t!5, cel mai folosit inhihitor proteazi« pentru tratâ~l'eiîtur i-i-âci'entlfor
inf-ectaţi cu 'virusul HIV
Cercetătorii au secventializat preteaza HIV şi au demonstrat rolul et 111
replicarea virală, au clonat şi puri ficat enzirna şi au produs cantităţi suficiente
pentru a identifica structura proteinei în aproximativ 2 ani. Aceste realizări se
Obţineau în trecut în 8-10 ani de studii.
 'jy'"

~
:1
~
1
1 MEDICAMENTE DE BtOSINTEZĂ 2\1
28 CĂTĂLlNA DANtELA STAN
11 a noilor candidati terapeutici. Această organizatie este formată din reprezentantii
Ulterior, au fost scanate aproximativ 3000 de entităţi moleculare noi, pentru a .' agentiilor nationale şi a asociatiilor producătorilor industriali ale celor trei
putea fi detectată entitatea ce are activitatea antivirală şi proprietăţile farmaceutice
parteneri, SUA, UE, Japonia (tabelul nr. 1). Comitetul de conducere al ICH se
cele mai acceptabile.
Astfel, s-a ajuns la descoperirea indinavirului (L-735524) În 1992. Testele Tabelul nr. 1
clinice pentru viitorul medicament CRIXIVAN s:~~ Încheiat în aproximativ 3 ani, Membrii ICH-International Conference 011 Harmonisation
iar FDA, la presiunea opiniei publiZ~~-I~~-~prob~t în42 de zile (figura 111". 3 adaptată ...
Organizaţia Membrii organizatiei Rolul organizaţiei
după R.J.Y. Ho, M. Gibaldi, 2003).
Agentia SUA a Responsabilă cu aprobarea
Scanarea a peste Medicamentului şi tuturor produselor
3000 de NEM Realizarea studiilor clinice Alimentului farmaceutice comercializate
Elucidarea

u structurii
proteazei HIV
si identificarea
indinavirului
cu participarea
a peste 4000 de pacienti
,
i~
Food aud Drug
Administration (FDA)
in SUA

r~
Formarea echipei
Agentii guvernameruale
Agentia Europeană a
Medicamentului
Este formată din membrii a
22 de (ări ale Uniunii
Europene şi lucrează la
European Medicines Agency armonizarea procedurilor de

1987
1993
~
Martie 1996 I
j
(EMEA)

şi al Protectiei Sociale din

Japonia
autorizare a medicamentului
În toată Europa
Ministerul Sănătăţii, Muncii Prin intermediul Diviziei de
Medicamente şi Produse
Cosmetice. autorizcază toate
Ministrv of Health, produsele farmaceutice În
Labor (Ind welfare Japonia
IMHLW)
Este o asoc iat it: a 67 de
companii farmaceutice
Asociaţia Producătorilor şi
implicare În cercetarea.
Cercetători lor Farrnaccutici
dezvoltarea şi producerea de
Stabilirea dozelor Aprobarea FDA din America
Identificarea, Identificarea unui ~ Pharmaceiuical Research
medicamente şi a 24 de
active de indinavir pentru CRIXIVAN cent re de cercetare În
caracterizarea, inhibitor de pretează and Manufacturers
in 42 de zile domeniul produselor bioiech.
si clonarea din clasa ren,inei cu În 6 luni ofAmerica (PilRMA)
Oferă consultanţă tehnică lui
proteazei HIV propietăti toxice. pe
ICH
parcursul studiilor preclinice Asociaţia Europeană li Este o asociatie a marilor
Figura nr. 3 Conceperea şi dezvoltarea indinavirului (Crixivan) de către Merck Agentii neguvernamentale Producătorilor din Industria .ompanii farmaceutice din 16
Farmaceutică ţări europene implicare in
Legendă: NEM - noi entităţi moleculare; FDA - Food and Drug Administration:
European Federation of cercetarea. dezvoltarea şi
HIV - Human Immunodeficiency Virus Phannaceuticat lndustries producerea de medicamente.
aud Associations Oferă consultanţă tehnică lui
Pentru a facilita înregistrarea şi marketing-ul noilor medicamente, cercetarea­ (EFPIA) ICH şi EMEA.
-dezvoltarea-productia candidatilor terapeutici se realizează astăzi În diverse Asociatia Producătorilor Este () asociatie a peste 90 de
centre din ţări diferite. Farmaceutici din Japonia companii farmaceutice şi
În aprilie 1990 s-a infiinţat la Bruxelles o organizatie tripartită. International Japan Phurmaceutical centre de cercetare. ce
Manufacturers Association promovează adoptarea
Conference 011 Harmonisation-l Cll (Asociatia Internaţională pentru Armonizare),
(lPMA) standardelor internationale.
cu scopul de a creşte eficacitatea procesului de aprobare, pe piata internaţională,
'i
"·'1
I ~
I 1
i5
30 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
; MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 31
i
.:. realizarea studiilor clinice, ce cuprind:
întruneşte de cel puţin două ori pe an pentru a dezbate problemele armonizării '1 - faza I clinică;
cerintelor legislative. s
Până în acest moment s-a reuşit emiterea unui ghid comun, acceptat de agenţiile .~ - faza II clinică;
nationale ale ţărilor membre ale acestei organizatii internationale (SUA, UE,
,,
,J
- faza III clinică;
Japonia). i1 .:. obţinerea avizului de fabricatie;
.:. studii de post-marketing (faza IV), ce este o continuare a studiilor clinice după
ICH-ul face recomandări În scopul armonizării cerinţelor pentru înregistrarea
~\ obtinerea avizului (farmacovigilenţa).
unui nou produs. Organizatia doreşte să realizeze ghiduri unice, ce ar putea fi
utilizate pe plan international. Aceste ghiduri unice sunt structurate în 4 categorii Schematizarea acestor etape poate fi observată În figura nr. 4.
majore (calitate, siguranţă, eficacitate şi multidisciplinaritate). 'J "'h,d.,; J.. \"·.• 1::lt/V".J".l\.f
Ca rezultat al eforturilor comisiilor ICH, În iulie 2003 s-a reuşit implementarea } ""l~;';;;\~;>:~;}';" .",;': ",':: .. ,~-'><:") J~ •. \"",\",,,.:..~,"! r
~:'1 ~\
1 .2. 1 . ~Şţl:lijlţi}~p"!,~'1."(ilnwr~ c'i" \..,-1, "" ",r,
Common Technical Document (CTD) pentru Înregistrarea medicamentelor de uz j
uman, ce reprezintă documentatia standard de Înaintare către autorităţile de
reglementare a rezultatelor studiilor cu privire la noii candidaţi terapeutici. ~ Aceste studii au ca obiectiv S!.@f.t~!".!~!![~!Lfizjf..\til!i!ll!"iLa1~i!.Himolecu­
Această armonizare a normelor şi a documentaţiei ajută la scăderea costurilor i lare, stabil~~~J?E~r.~~.!.~te[!lli!gQ.S![Ielifla el!}ĂmilJe, a Rr9prietă!ll2I,Jar~!.~~~o­
şi la accelerarea timpului de punere pe piaţă a unui nou medicament. În acest fel
creşte eficacitatea dezvoltării acelui nou medicament.
u1 ~~ a efectelor E2~~asupra '!.!li!ll~~J.9r, a stal~!.'.9.!<l2!J!E...s~lit,!!epentru acel
candidat terapeutic, a lI1et<zs!~!Q!.s!LcLw.are şi idelJWlgm:, precum şi realizarea
}
În paralel lucrează şi Inspectia Farmaceutică - Pharmaceutical lnspection el studiilor de formulare.
Cooperation Scheme (PIClS) - Înfiinţată În 1995, care are rolul de a dezvolta, .~ Studiile p~ demonstrează că o entitate rnoleculară nouă poate deveni
implementa şi menţine standardele GMP. La PICIS au aderat foarte multe ţări, medicament dacă CI fost inclusă Într-o formă farmaceutică şi dacă, în urma
printre care şi România. Inspectiile GMP realizate de către un membru al PIC/S
sunt mutual recunoscute de către ceilalţi membri. 1a testelor efectuate, corespunde din punct de vedere:
• chimic; •
(_\.\.,'\J .>
< \
v
i
(!).I· .....•
.
t:...J
I
ei.
'l", .;:,-'
-::'.\...~"
i • cinetic; ...-P
. •..•.• .r

• terapeutic; .~'\.; It":

1.2. !1ezvoitâr~a"!firtui-nou medicament! • toxicologic; ";-,..7 f' 'i,)
• industrial:
După ~ri~~~_~~ientităţi moleculare (prin sinteză chi.mică, sernisinteză, • economic.
biosinteză) ŞI<PJ_t~ ,~:.~.<0acestora, urmează două etape principale :
>- dezvoltarea pre-clinică ;
).- dezvoltarea clinică.
Studiile de preformulare se realizează pe o perioadă de timp cuprinsă Între 3 luni­
Aceste etape presupun: I~~.; an..
Ele furnizează caracteristicile fizice. chimice, ~n,!Iitice, farrnacologice şi toxi­
.:. optimizarea moleculară a noii entităţi, pentru a obţine un compus cu stabilitate
cologice ale noii
~. entităţi moleculare. În paralel se fac studii şi. pentru substantele
fizico-chirnică şi cu afinitate maximă pentru receptori; ,

auxiliare, ce sunt indispensabile pentru realizarea unei bune formulări farmaceutice .

•:. realizarea studiilor pre-clinice, ce cuprind:
Preforrnularea se referă la :
- preformularea ;
. il'
- formularea; V controlulfizico-chjrnic al noii entităţi moleculare;
- optimizarea; • stabilirea proprietăţilor fizice: solubilitate, dimensiuni ale particulelor,
.:. obţinerea avizului terapeutic, după studierea dosarelor pre-clinice, pentru stare cristalină, forme polimorfe, constanta de ionizare, coeficientul de
dezvoltarea clinică a noului candidat terapeutic; partitie etc.,

.
ţi
 r"
'1
I
I
32
CĂTĂLlNA DANIELA STAN Ii MEDICAMENTE DE lllOSINTEZĂ :\3

sţabilirţ~ prypr~~_ţălilor chirnice : stabilitate, influenţa factorilor externi

i (lumină, oxigen, temperatură, umiditate, microorganisme etc.).
Descoperirea de noi \
enti tăţi mo leculare . 1 .· .'·~7
':;,:,".
~ţ<;lRUir.e,a_prQprietă~ilorJarll1acologice ;
1 farmacocineţjcă (absorbtie. distributie, rnetabolizare, eliminare),
j • farmacodinamie o.9G de actiune, mecanism de acţiune),
• b~Qpisp'ong~ilit.\lte,
caracterizar~a il~ială ]
• bioechivalenţă (pentru generice).
--_. L__
[ fizice-chimică
II
./ sţ~bJ·li~~~::p.~.Opr(e.AiMqrJQţi(:ologice;
• toxicitate acută,

~tudiile pre-clinice
I toxicitate cronică,
• efecte secundare.

--J._ _. . - I teratogenitate,
muragenitate,
• carcinogenitate.

[ Analiza dosarelor pre-clinice

pentru primirea avizului terapeutiC] 1 imunotoxicitate,

----~~-~_.. _._._[-=~~~_._-- I
I
toleranta.
toxicitate asupra reproducerii.
1 incomparibilităţi.
St~(tiile clini~---I
(faza 1, LI, lll~ Studiile farmacologice şi toxicologice se realizează pe animale de laborator
\ (şoar~ctşobolani, hamsteri, câini, iepuri, maimuţe etc.). St~diile se realizează
_.=-~-[~-_ . . . _._---.. _., pe rJ1~i.9.ţ: animaledelaborator, de ambele sexe, ceea ce presupun costuri foarte
mari şi supraveghere din partea asociaţiilor de protectie a animalelor.
Analiza dosarului clinic, dosarelor pre-c1inicje '1 Atunci când în studiile clinice, realizate pe om, apar diferente fală de studiile
a normelor de calitate. a cererii de autorizare,

I
pre-clinice realizate pe animale, se reiau studiile pe primate (animalele cele mai
a mostre lor din produs şi apropiate de modelul uman),
li certificatului GMP al producătorului

-l---·-
Pentru reducerea cheltuielilor se Încearcă. ca alternativă, utilizarea culturilor

·__··~~~=-_L . de celule animale şi umane (cultivarea pe scară largă a anumitor tipuri de celule
în prezenta noii entităţi moleculare şi a unui indicator molecular pentru verificarea
Obtinerea stării de sănătate a celulelor). Totuşi, comisiile de specialitate ale autorităţilor
I-~utorizaiiei de Fabricare sanitare de control încă nu acceptă Înlocuirea animalelor de laborator cu aceste
~_._-_._ _----------_.
..
culturi de celule, până când nu se dovedeşte totala siguranţă a datelor obţinute şi
veridicitatea lor.
;ţ~'il
I;~~t~(-)d-l-IC-e~r-e;-l
La
pc--p-i
noului Jl1e<ticamen~J 1 O schemă a datelor pe care le furnizează studiile de preformulare este prezen­
tată în figura nr. 5.

_~:_.. __l ~ _
Studii de l'armacovigilenţă
[ . _. (faza IV)
-----'

Figura 111-. 4 Crearea şi dezvoltarea unui nou medicament

 ,;'.'
)
i
I
J
34 CĂTĂLlNA DANIELA S'IAN

Stabilirea proprietăţilor fizico-chimice ale

I
f
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ

candidatului terapeutic şi ale substanţelor auxil iare şi caracteristicile produ

35

Studii pentru alegerea sului finit.

noii entităţi moleculare substanţelor auxiliare
.1 Etapele studiului procesutui ţehnqlo&ic şi transpunerea la scară industrială
sunt:
~ / I

1. domeniul experimental initial - este un studiu realizat la nivel de laborator

PREFOHMlJLARE (1 kg), ce ~ltili~e~ză condiţii de fabricare cât mai apropiate de cele industriale;
II. domeniul şelecti<;)Jlat redus,.. presupune realizarea a câte 3 loturi de I kg,

/ <, după formula optimă şi corijarea datelor necorespunzătoare, dacă este cazul;
III. domeniul selectionat la scara de 1 kg - stabileşte formulele cantitarive ce duc
la ~btiner~a ~';;-ui răspuns calit~'ti~ ;
Stabilirea proprietăţilor farmacologicc
ale noii entităţi moleculare
Stabilirea proprietăţilor toxicologice 1i rv. domeniul selecţionat,la scara cle 7 kg - formula stabilită în etapa anterioară
ale noii entităţi moleculare
I
prin studi i pe animale prin studii pe animale este implementată la scară mai mare şi se fac corecţiile necesare pentru
i cantităţile mai mari;
i v. domeniul seleqionat la scara pilot de 50 kg - reproduce la scară mult mai

I'
Figura nr, 5 Studiile de preformulare
I~are formula ~labilită ca fii;ld optimă. '

Produsul industrial este cgn~rolf:ţt, în fiecare etapă a procesului de fabricare

1.2. J .2, I'mnr~*OO'ntlllltf~
Formularea este procedeul prin care candidatul terapeutic (substanta activă) este
asociat cu substanţele auxiliare pentru realizarea unui preparat dozat (formă
farmaceutică). adecvat administrării la bolnavi,
Formularea urmăreşte ca acel candidat terapeutic să corespundă scopului
pentru, care afostcreat, să fie lipsit detoxicitate şi să fie acceptat de pacient.
FO~I11~larea medicamentului se'
rea'lizează după reguli şriinţifice, pe baza unor
planuri bine documentare şi finalizate cu o evaluare statistică a rezultatelor
obţinute. Nimic nu este lăsat la Întâmplare, iar studiile nu se fac prin încercări,
întrucât acestea sunt irelevante, ineficiente şi neeconomice.
Studiile de formulare presupun alegereaoptimă a parametrilor ti;:ic9-chimici
şi b\~far1}1~\el!Jici ai candidatului terapeutic şi ale substanţelor auxiliare, a reci­
pientelor de condiţionare cât şi a parametrilor tehnologiei ,de realizare şi control
a medicamentelor ca sisteme farmaceutice de cedare, sau de transport la ţintă.
Stabilirea procesului tehnologic de fabricare şi control al viitorului medicament
este o fază importantă a formulării farmaceutice,
~[8ce.s.ultehnologic presupune o succesiune de etape prin care candidatu)
terapeuti'c este transformat cu ajutorul substanţelor auxiliare şi a operatiilor speci­
t~~e î1{tr~o formăfarmaceutică, ce"va fi introdusă Într-un recipient de condiţionare
şi Într-un all1pa!;j specific, ' ' ,
Studiul acestui' proces presupune cercetarea materiilor prime din punct de
vedere tehnologic şi cercetarea influenţei modului de formulare asupra procesului
de fabricare, La terminarea studiului se vor cunoaşte proprietăţile tehnologice ale
stahilinclu-se concomitent şi parametrii de calitate ai produsului finit,
În final se alege r~sipieqtul"9~'c'~I~diti~'~a~~ pri;nară şi ambalajul produsului
Concluzionând, putem spune că etapa de formulare se referă la:
,/ formularea farmaceutică
~
J • alegerea corespunzătoare a substanţelor auxil iare;
• stahilirea cantităţilor exacte ale componenţilor
,/ alegerea recipientului de condiţionars primară şi secundară
tipul de recipient, calităţile acestuia, rezistenta;
• modul de arnbalare, inscripţionare, identificare,
-rc ,/ stabilirea procesului tehnologic de obtinere a formei farmaceutice
• etapa I - clomeniul experimt:ntal initial;
• etapa II - domeniul selecţionat redus;
• etapa III - domeniul selecţionaj la scara de I kg;
• etapa IV - domeniul selecuonai la scara de 7 kg ;
• etapa V - domeniul selecţionat la scară pilot de 50 kg,
,/ realizarea controlului de calitate
• controlul materiilor prime;
• norma de calitate pentru proclusul finit.
O schemă a datelor pe care le furnizează studiile de formulare este prezentată
în figura nr. 6,
il
ji
,~

:.': ;~ .
 l.,., ..
'1

36 CĂTĂLlNA DANIELA STAN I MEDtCAMENTE DE BtOStNTEZĂ 37

Stabilirea compoziţiei calirative şi cantitative Alegerea recipientelor de condiţionare I Modulare •• proprietăţilor

a formei farmaceutice primară şi secundară I substanţelor auxiliare
Modularea proprietăţilor
candidatului terapeutic

<, -:
FOHMULARE Alegerea unei
~ /
Alegerea unui
1. forme farmaceutice - IOI'TJMIZARE 1- proces tehnologic

-: <. I
I
I

Alegerea procesului tehnologic de obţinere Stabilirea normei de calitate pentru

I
a formei farmaceutice materiile prime şi produsullinit
Modularea

I
compartimeruelor organismului
Figura III". 6 Formularea farmaceutică

Figura ur, 7 Optimizarea formulării farmaceutice

1.2.1 .3. gffl'd~~~]f~'7!
Optimizarea formulării farmaceutice este o etapă cheie din dezvoltarea pre-clinică Toate d.aţele şi. rezultatele obţinute in urma c.\:.lS~!~~n2r,J?!·e.~.~!il~icţ ale noului
candidat terapeutic se GOJ:I(;;rt:ţi.?:ează în"1. 3t , i "<l9s~re :
a noului candidat terapeutic. . ... . __' •••. , '" ,.... .•...·; __,.••....

Ea presupune o optimizare.a proprieţăţilor big.t~nnaceutice ale candidatului 1. I)OSf\RULFARMÂ-<;:EUTlC

terapeutic studiat, astfel încât acesta să ajungă intact la locul de absorbţie, iar II. POSAI,{UL F4-RJ\lJACOWGIC PRE-CLINIC
profilul
.
său de eliberare să fie optim, pe,~trG""l' putea 'reali;' ul~'ei'e~Lt!:rapeutic
.._, .... III. DQS.!\S:YL TQXICOLOGIC "RE-CLJNJ~
maxim.
"'~A~eastă etapă se derulează în d.()~ll_~ di.reqii principale: J. Dosarul farmaceutic cuprinde:
:;
.~ °l)till1izal:e<\Jgn~\ulă~jj • date chimice, analitice, farmaceutice şi de biodisponihilitate ale candida­
• ";noduiarea proprietăţilor bio-fizico-farmaceutice ale candidatului terapeutic tului terapeutic;
(substanta activă) ; • date chimice, analitice, farmaceutice ale substantelor auxiliare ;
• adaptarea formulării şi a formei farmaceutice realizate. • date despre forma farmaceutică - compoziţie, proprietăţi, date cantitative
;r optimizarea ţJip.4isp.onibil ităţi i şi calitative etc. ;
• -"n1odularea profilului de eliberare optimă a candidatului terapeutic (substanta • descrierea procedeului de fabricare ; -----
activă) ; • modalitătile de control ale materiilor prime şi ale produsului finit:
• modularea mediului din compartimentele organismului. • modalităţile de condiţionare primară şi secundară;
• descrierea condiţiilor de depozitare şi transport.
Scopul optimizării
, '.~ ,~_ ,·,o~",,,,-
..se poate atinge intervenind
'-.
la nivelul:
.. ,. ,'" . _,."""~'''',.'' ...• ~,.".•. _", ,_"
Il. Dosarul farmacologic pre-clinic cuprinde:
../ candidatului terapeutic (modularea proprietăţilor fizice şi chimice) ;
./ ~ub'~t;',;iejof iluxlliare (rnodularea proprietăţilor fizice şi chimice) ; • date farrnacocinerice, farmacodinamice şi de biodisponibditate ale candi­
./ proce~u.l_ui< ~e'f<l.bJ:icflre (alegerea unor tehnologii corespunzătoare) ; datului terapeutic, obţinute in studiilt(§__':lniÎnalele "de lab~;:~tl)U
../ conlpCţ[timenteÎo'r'organismului (mai greu de realizat). III. Dosarul toxicologic pre-clinic cuprinde:
. '. ,-,_. " ." '. : ,~

O schemă a datelor pe care le furnizează studiile de optimizare este prezentată

• date farmacotoxicologice ale candidatului terapeutic, obţinute în studiile
în figura nr. 7. pe animalele de laborator.
·f

l:
~

a :

"
j!
 ,~,

'l
'J MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 39
CĂTĂLlNA DANIELA STAN
38 :~
'1
Pe baza acestor dosare şi a cererii de autorizare/înregistrare, autoritatea
~~~~um
. J.2.2.1"~~~J~;jtll>
sanitară a ţării respective decide dacă acel candidat terapeutic poate primi aviz
terapeutic favorabil. Studiile c1inice din faza 1 se realizează pe voluntari 4iTIâ!J.L_ş.~n~~QşN20-100 de
Autorităţile sanitare ale principalelor ţări sunt:
1 persoane), ce sunt atent monitorizaţi după ce au primit dozele necesare ale
candidatului terapeutic. Voluntarii sunt recompensati financiar pentru participarea
Food and Drug Administration (FOA) în SUA;
- European Medicines Agency (EMEA) în UE;
_ Biroul Afacerilor Farmaceutice din cadrul Ministry of Health, Lahor and j lor la aceste studii. În unele situatii, pacientii aflati în stare critică, sau în fază
terminală, solicită includerea lor În aceste studii pentru faza I de cercetări c1inice.
În cazul studiului candidatilor terapeutici cu potenţială acţiune în terapia SIDA
Welfare (MHLW) în Japonia; cI

- State Food and Drug Adrninistrarion (SFDA) în China; .j

! şi a cancerului, cercetările clinice de fază I se realizează pe voluntari umani ce
.~ prezintă afecţiunea vizată în cercetare şi nu pe voluntari sănătoşi.
Central Drugs Standard Control Organization (COSCO) în India; :j
Therapeutic Goods Administration (TGA) În Australia; .} Studiile se întind pe o perioadă de câteva luni până la 1 an şi au costuri de
- Health Canada (HC) În Canada; j ~ 10 milioane $.
_ Comisia Medicamentului din cadrul Ministerului Sănătăţii (MS) În România etc. Aceste studii au ca obiectiv stabilirea următorilor parametri:

În cazul primirii unui aviz terapeutic favorabil, producătorul prezintă comisiei • date !~r.!,!1?5~9c..inetic~.p_!:im(lre despre candidatul terapeutic (repartitie în diverse
probe din seria zero, prospectul şi norma de calitate internă. lesuturi şi organe: blorJ"<lnstormare, eliminare etc.) :
Autoritatea sanitară analizează aceste dovezi şi în cazul unui verdict favorahil • t9.lerqnt~,I~ dozelecrescute ;
aprobă dezvoltarea clinică a candidatului terapeutic vizat în clinici autorizate • stabilirea !PEy!.qLP,e}ls_{illl1e şi a Ipţc\lni?!~~lIllli de acţiune;
(după cum se poate observa şi în figura nr. 8). Odată începute studiile clinice, • stahilirea p~liţ~ului dintre do~.a terapeutică şi dqZ(i,lOX,!că ;
producătorul este ohligat să ofere autorităţii sanitare rapoarte periodice cu privire
la studiul atlat În curs de desfăşurare.

Studiile clinice de fază II se realizează pevol0Uăl:Iillliaru':\;im~jjî:.c.~!ntă afecţiunea

Aplicaţia iniţială către Studierea dosarului Aprobarea pentru dezvoltarea clinică vizată în studiu. Pentru această etapă sunt selecţionaţi sute de pacienţi (Trlire 100-
Autoritatea Sanitară (max. )0 zile În cazul FDA) pentru acel candidat terapeutic 300 de bolnavi), ale căror conditii medicale sunt bine cunoscute.
Aceste studii se realizează pe o periodă cuprinsă Între câteva luni-2 ani şi au
costuri de ~ 20 milioane $.
În faza a [1" a studiului clinic se stabileşte:
Trimiterea raportului I ISOlicitarea de informaţii suplimcntarc • ~tisacitatea, c_(if!didatului terapeutic ;
cu informaţiile suplimcntarc -- din partea Autorităţii sanirarc
• d~z~' activă ~5i schema de' posologie ;
'a
• pr~zenia eventualelor reil\;tii.aOverse
.~ ....,. ,~
",~." ..
acute;
Figura nr, R Aplicaţia pentru obţinerea avizului pentru dezvoltarea J:
.j
clinică a unui nou candidat terapeutic ~"'I
I.2.2. 3. ,~f,'I"li!l'!i!I~!I'1!'!!I~"'A~_
~tl1I:l111'e~.IDl;l1(IJi.~'\'~Gi1~~
1-
'îÎ La studiile clinice de fază TII participă multiple centre medicale, iar cercetările se
1.2.2. ~tu(ijU~mlrue~jl,
-~....".~.-t ," ..,',' .
~
;..
realizează pe mii de pacienţi (1000-5000). În cazul bolilor infecţioase studiile se
~
Studiile clinice ale unui candidat terapeutic presupun studiul activităţii farmaco­ realizează pe zeci de mii de pacienti pentru a putea detecta reactiile adverse
logice a candidatului terapeutic pe subiecti umani. Aceste studii se realizează în ~~
.
"rare" .
Aceste studii se desfăşoară pe o perioadă cuprinsă între 1-4 'ani şi au costuri
trei faze distincte.
de aproximativ 50-100 milioane $.
 r
1
,)
I
40 CĂTĂLlNA DANIELA STAN J MEDICAMENTE DE B10SINTEZĂ 4.1
1
În această etapă se urmăreşte: f
'1
• stabilirea efic~cităţij noului candidat terapeutic în cadrul afecţiuni] studiate; 1
stabilirea ,.~.•,;,h""'
::i'c'cWeptâbliltăţii
»''''''''';I",,~,:-,.,~.,.,,",.~
de către ~oln;lVj
,...,.,~1
a noului candidat terapeutic,
Aceste trei faze de cercetare clinică a noului candidat terapeutic sunt schernati­
I
zate în tabelul nr, 2. I
Fazele cercetării
Tabelul nr. 2
clinice ale candidaţilor terapeurici
j
Experţi FhC tiin diverse specialităţi
(fanuncişti, medici. 111111lucologi.
, ', .', :1;-".i:'·NUmăfl:':~~'··I·);·~~· t)l!t~u., ':·::~".'I J,tâtâ.de SUCţ_f_Ş microhiologi. chimişti, biostutisticieui ele, )
o<~<~~~f,}t~:'~~'~f~<:h'delp~d.~liti .:0:' ~ '~"'sl~~liiior <', " ':;, (~).

Faza 1 Siguranta I 20-100 I 1 an I 70-75 J

Siguranţa şi f:,J.jJer{isU{J('/T;:;,:.,.i Fhl:
Faza II eficacitatea pe I 100-300 I câteva luni-2 anii 28-33
termen scurt
Siguranta şi
1000-5000 Recomandarea pentru eliberarea '_J-Jmis;CI A1I!di('(JIIJ(,IIIIIIIIÎ
eficacitatea
zeci de mii Autnrizatie! de Fabricare/Certificatului de Înregistrare . .._ din cadrul Autorităţi, sanitarc
Faza .III globală, I 1-4 ani I - 25
(pentru boli a ţăru respective
Evaluarea risc-
infecţioase)
beneficiu Figura nr. 9 Schema procesului de analiză a dosarului
unui nou medicament

La terminarea studiilor, produ(;il,.t_Q~·ul.,dţ:PIJP-C;: la autoritatea sanitară dosarul

studiilor "t\!1.~Ge alături de: c~Ii.l~i'te~t~((i ,~osare preclinice, cererea de auto;'i~~';:~/
Înregistrare, normele de caliate, mostrele 'dTo"j)roduspentru analize şi certificatul
GMP al producătorului (după cum se poate observa şi În figura nr. 9).
La noi În ţară, Comisia Medicamentului din cadrul Ministerului Sănătăţii
analizează în decurs"de"3 jU~lLrezultatele stllY.iilor şi se pronunţă asupra Auto­
rizaţiei de Fabricare sau<Certitic~tu'iui d~'Î-;':;;~gistrare, rrimiţând documentatia la
Ministerul Sănătăţii.
Ministerul Sănătăţii, ca factor decizional, eliberează Autorizaţia de Fabricare
şi/sau Certificatul de Înregistrare pentru acel medicament, in care specifică
şi modul de distributie al medicamentului (cu sau fără prescripţie, exclusiv prin
farmacii , şi/sau În alte unităţi), Înregistrarea este valabilă pentru o perioadă de
' ,",,·e'" "--"',' -v-'
5 aru.
""A~torizaţia de Fabricare este acordată producătorilor, iar Certificatul de
Înregistrare este acordat celor care doresc să deţină şi să elibereze medicarnentul.
1.2,2 ,4. SUM'ler.wm~ilVJtI
Aceste studii (numite şi studii de farmacovigilen!ă) se realizează după obţinerea
Autorizatiei de fabricare şi introducerea pepiaţă a noului medicament.
Faia'1V de cercetări reprezintă o continuare a studiilor clinice. Se realizează
pe un număr ~(,>arte mare de pacienti şi pe o perioadă lungă de timp,
Studiile de farmacovigilenp; urmăresc:
• eficienţa. siguranţa şi ;;,aljta.tea noului medicament pus pe piaţă;
se • aparitia unor interacţiuni cu alte medicamente şi cu alimente ce nu au fost
evidentiate În studiile c1inice;
apariţia altor reactii adverse, a unor efecte toxice ce nu au fost evidentiate În
studiile c1inice.
Studiile de rarmacovigilenră au o valoare foarte ,mare pentru protecţia l?,ac,ien­
ţilor, Întrucât În studiile clinice nu se pc;î
realizamodele optime"ă -ce~a"c~ se
întâmplă În mod real, În organismul uman, cu acel medicament.

f4~::'~'

42 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Uneori, în aceste studii sunt reliefate şi alte,.:_, proprietăţi ale medicamentului
'. '.,' .
studiat:
• aparitia unor beneficii suplimentare - ceea ce reorientează medicamentul spre
alte arii terapeutice ;
• apariţia unor reactii adverse neevidenţiate în cadrul studiilor clinice - care
impun reajustarea dozelor sau retragerea de pe piaţă a medicamentului;
• o eficacitate terapeutică pe grupuri populaţionale :
};> medicamente maieficace asupra sexului feminin ("medicamente miso-
gine ") ;
};> medicamente n.m! greutolerate de rasa neagră ("medicamente rasiste "};
};> medicamente cu ~~tiune asupra vârstnicilor etc. ;
Toate aceste studii de farmacovigilenţă completează dosarul clinic al noului
medicament, după ce a fost pus pe piară. Pe baza lor, factorii decizionali hotărăsc
dacă noul medicament rămâne pe piaţă sau nu, dacă Îşi schimbă aria terapeutică,
dacă Îşi completează aria terapeutică etc.
Studiile pre-clinice şi clinice necesită cantităţi suficiente ale candidatului
terapeutic pentru a putea realiza evaluarea sa. În funcţie de natura candidatului
terapeutic şi de fazele de testare sunt necesare pentru studii câteva sute de grame
sau chiar kilograme, după cum se poate vedea şi În figura nr, 10.
Cumctcrizarcu iniţiulă "
Studii prc-clinicc/clinice I'n)llus comercial
noiicntităti moleculare
Figura nr. ]0 Cantitătile de substanţă necesare pentru studiile de specialitate
Aceste cantităţi se obtin parcurgând acelaşi proces tehnologic de obtinere ce se
va aplica la nivel industrial, dacă candidatul terapeutic va primi aprobare de
punere pe piară. Orice modificare a protocolului de obtinere poate duce la
invalidarea studiilor pre-clinice şi clinice, deoarece ele determină modificări ale
caracteristici lor produsului finit.
Din acest motiv, protocolul procesului de productie trebuie dezvoltat cât mai
repede, urmând ca acesta să fie transferat la nivel de statie pilot şi ulterior
implementat la nivel industrial, după optimizarea sa.
·~"·
r
?
,
"
i! .
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
l 43
l
,1
. 1.3. *p.at~nt~re~';lIo.i1or';~aJld.idatj terţl~etfti~j;
Obiectivul principal al industriei de medicamente şi implicit al biotehnologiei
este obţinerea unui produs comercial - produs farmaceutic.
Descoperirea şi caracterizarea fizică, chimică, farmacologică a unei substante
1 cu potenţială aplicaţie farmaceutică este urmată de patentare.
De regulă, patentarea se realizează după ce testele pre-c1inice şi faza I clinică
1 s-au Încheiat. Obtinerea patentului nu garantează deţinătorului dreptul automat
'! pentru utilizarea sau vinderea acelui produs. Va trebui demonstrată siguranta şi
~ eficacitatea produsului În testele clinice ulterioare şi apoi acesta va fi aprobat
'i
pentru utilizarea în scop medical. Deci, nu orice produs patentat va ajunge
medicament cu drept de punere pe piaţă.
Unii producători păstrează secretul acelui produs şi ÎI patentează spre sfârşitul
cercetărilor. În acest fel, riscul de a patenta un produs care la sfârşitul cercetărilor
se dovedeşte ineficient din punct de vedere terapeutic este mai mic, dar păstrarea
secretului pe o perioadă mai mare de timp este foarte dificilă.
Nici o companie nu riscă pe termen lung (din punct de vedere financiar) fără
să ştie că rezultatele eforturilor sale, din domeniul cercetării, sunt protejate legal
faţă de competitori. Deci, guvernele trebuie să garanteze inventatori lor drepturi
exclusive pentru noile produse sau tehnologii, pentru a stimula companiile să
investească În cecetare.
Toate acestea sunt drepturi de proprietate intelectuală şi ele includ, printre
altele :
.~+,:,
:ii .:. secrete de fabricaţie - informatii despre proceduri tehnice secrete pe care o
J,~, companie doreşte să le protejeze de concurenti;
.:. copyright - protejează autorul unei publicatii de utilizarea neautorizată a
muncii sale;
.:. mărci înregistrate - cuvinte sau simboluri ce identifică un produs. un proces,
.j~
o tehnologie a unei companii;
.:. patent (brevet de invenţie) - document legal ce oferă deţinătorului drepturi
.~
·j{i exclusive pentru implementarea comercială a inventiei descrise În patent.
;:1
!'il
;t
Patentul este un document puhlic ce trebuie să conţină descrierea detaliată a
inventiei pentru a-i informa pe alţii cu privire la natura inventiei şi a limitelor
sale. Conform legislatiei româneşti patentul este definit de legea 344/2005 ca
fiind UII titlu de protecţie care poate fi obţinut pentru orice invenţie, ce are ca
obiect un produs sau un procedeu, În toate domeniile tehnologice, cu condiţia ca
invenţia să fie nouă, să implice o activitate inventivă şi să fie susceptibilă de o
aplicare industrială.
~J
:~~i;i:.,

44 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Invenţia poate ti definită ca fiind o creaţie tehnică dintr-un domeniu al
tehnologiei ce are ca obiect un produs sau un procedeu care implică o activitate
umană inventivă. nouă şi susceptibilă de aplicare industrială şi protejată juridic.
Patentul poate fi descris ca un monopol garantat de stat unui inventator, astfel
încât doar inventatorul să-I poată exploata pentru o perioadă fixă de timp (15-20
de ani). În schimb, inventatorul detaliază descrierea tehnică a inventiei, astfel
Încât atunci când perioada de monopol expiră, invenţia să poată fi exploatată şi de
către alti specialişti (fără a avea nevoie de permisiunea inventatorului).
Patentul oferă protectie inventatorului doar în tara în care este obtinut, perioada
de timp putând varia de la o Iară la alta.
Legile patentării variază şi ele de la o ţară la alta, deşi există încercări pe plan
international de realizare a unor standarde universal valabile.
De exemplu, În 1989 compania Gennentech a aplicat pentru patentarea activa­
torului tisular al plasminogenului uman recombinant (tPAr), obtinut prin tehnica
ADN-ului recornbinant. Patentul a fost respins de Oficiul pentru Patente din
Anglia. Aceeaşi aplicaţie a fost depusă şi În SUA, care nu numai că a acordat
patent pentru noua entitate moleculară, dar a acordat şi exclusivitate pentru toate
formele active similare cu tPAr. Folosind această decizie, Gennentech a câştigat
procesele cu alte două companii de biotehnologie care cornercializau forme
similare de tPAr În SUA. În Japonia, firma a primit patent, dar nu avea exclusi­
vitate pentru tPAr, deci alte companii puteau comercializa variante proprii ale
tPAr. Prin urmare, aceeaşi aplicaţie a patentului a fost respinsă, aprobată şi
acordată diferit de către diverse oficii de acordare a patentelor, din ţări diferite.
Durata maximă de exercitare a drepturilor exclusive, adică a patentului, este
de 20 de ani de la data la care aplicati a este realizată. În cazul În care există mai
mulţi aplicanţi pentru aceeaşi inventie, primul aplicant al patentului are drept de
utilizare.
Din momentul depunerii documentatiei până la acordarea patentului poate
trece o perioadă de 2-5 ani, iar costurile sunt de aproximativ 10.000 $, în funcţie
de rară.
Pentru ca o inventie să poată ti patentată (brevetată), trebuie să îndeplinească
cumulativ câteva conditii de fond :
.:. să prezinte un caracter de noutate;
.:. să prezinte un caracter de utilitate (să fie susceptibilă de aplicare industrială) ;
.:. să implice o activitate inventivă (să nu tie ceva evident pentru specialiştii din
domeniu) ;
.:. aplicaţia trebuie să conţină o descriere suficientă a inventiei astfel încât un
specialist să o poată implementa;
Patentul nu se poate acorda pentru produse ale naturii ce apartin publicului
larg şi nu unei persoane sau unei ţări (e.g. soiurile de plante, rase le de animale,
r :,1..'
J
,~
il
.
.1 MEDICAMENTE DE BIOS.INTEZĂ 45
I
invenţiile ce au ca obiect corpul uman, metodele de tratament ale corpului uman
. sau animal, creatiile intelectuale - descoperirile, teoriile ştiinţifice, modelele
matematice, creatiile artistice etc.).
Totuşi, astăzi se patentează produse obţinute prin purificarea, îmbogăţirea,
modificarea substanţelor naturale, ce devin astfel disponibile pe piaţă pentru
prima dată. Altfel spus, se poate patenta tot ceea ce se obtine prin munca omului,
dacă aceasta a jucat un rol evident în obtinerea acelui produs.
De exemplu, deşi vitamina 812 este un rnetabolit al multor microorganisme din
natură, produsul obtinut prin fermentaţia microorganismului Propionibacterium
shermanii, ca substanţă cristalizată, pură, cu utilizare terapeutică s-a patentat în
Iara unde a fost depusă documentatia (SUA).
Tot astfel s-au patentat culturi pure ale unor microorganisme, proteine cu
importantă terapeutică, microorganisme modificate genetic etc.
Deşi astăzi patentele pentru produse sau tehnici de biotehnologie se acordă
relativ uşor şi fără probleme deosebite, în trecut, patentarea microorganismelor
recombinante a creat mari dispute juridice. Astfel, patenta rea primului microorga­
nism modificat genetic a fost respinsă initial pe motiv că rnicroorganisrnul este un
produs al naturii. Acest microorganism a fost dezvoltat de către microbiologul şi
imunologul Ananda Chakrabarty, pornind de la () bacterie din clasa Pseudomonas,
astăzi tulpina fiind clasificată ca Burkholderia cepacia, EI a studiat tulpinile de
Pseudomonas, care se ştie că pot digera deversările toxice de petrol. Problema
;'1 este că fiecare tulpină în parte poate digera o anumită fracţie petrolieră, tiind
inactivată de prezenţa altor fracţii. Cercetările sale s-au axat pe obtinerea unei
tulpini de Pseudomonas care să digere mai multe fracţii petroliere odată.
Dr. A. Chakrabarty a stabilit că în anumite conditii de timp, temperatură şi
nutrienţi se poate obtine un microorganism transgenic (realizat din 4 tulpini
diferite), care este capabil să digere mult mai rapid hidrocarburile petroliere şi să
le transforme În proteine inofensive ce pot fi consumare de animalele marine. in
acest fel se pot neutraliza scurgerile toxice de titei, realizându-se depoluarea
mărilor şi oceanelor.
În data de 17 martie 1980, printr-o decizie istorică a Curtii Suprerne a SUA,
s-a hotărât că acel microorganism este patentabil, pentru că munca omului ajucat
un rol important în obtinerea lui. Decizia a creat un precedent pentru patenta rea
viitoarelor animale transgenice, celule umane etc. Reprezentantii companiei
Genentech au declarat ulterior că această decizie a Curtii Supreme a SUA a
asigurat viitorul tehnologiei ADN-ului recombinant. Toti au recunoscut că bătălia
doctorului Ananda Chakrabarty pentru obtinerea patentului a pavat drumul pentru
~
11
·,1 viitoarele patente din domeniul biotehnologiei şi mai ales al ingineriei genetice.
J
;!.
Primul animal transgenic s-a patentat în 1988 de către Universitatea Harvard
din SUA, patentul fiind obtinut pentru un şoarece ce avea gena care-i conferea
~

46 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
susceptibilitate la cancer şi astfel era mult mai sensibil În detectarea posibilelor
substante carcinogene ("oncomouse", "Harvard mouse"). Patentarea nu a Întâm­
pinat probleme deosebite, deşi mai târziu patentarea animalelor transgenice a
ridicat şi continuă să ridice probleme etice şi sociale serioase.
Un pas important în rezolvarea disputelor juridice a fost introducerea în 1998
a Directivei Europene pentru Patente (European Patent Directive), care
specifică că materialele biologice ce există în narură (gene, secvente de nucleotide,
metaboliţi, celule specifice, proteine etc.) pot fi patentabile dacă sunt izolate din
mediul lor natural, sau sunt obţinute printr-un proces tehnologic. Toate aceste
produse se patentează dacă îndeplinesc cele patru conditii generale şi dacă
utilizarea lor respectă conditiile de moralitate.
Documentatia pentru obtinerea patentului se întocmeşte de către experţi sau
avocati specializaţi. Aplicaţia trebuie să conţină :
.:. solicitarea acordării patentului (brevetului de inventie) ;
•:. titlu explicit;
.:. autorul/autorii (datele de identificare ale solicitantului/solicitantilor) ;
.:. rezumatul invenţiei - descrierea succintă a naturii inventiei;
.:. un background al inventiei - descrierea stadiului cunoaşterii în domeniul inventiei;
.:. listă cu revendicările solicitantului (revendicările definesc obiectul protectiei
solicitare) ;
.:. descrierea detaliată a invenţiei cu explicatii, figuri, reprezentări grafice, la
care se, fac referire În revendicări etc. ;
.:. semnătura solicitantului şi data.
Sunt două modalităţi de înregistrare a patentului :
1. o aplicatie în fiecare ţară în parte unde se doreşte patentarea produsului;
2. o singură aplicaţie prin intermediul Patent Cooperation Treaty-PCT.
1, Aplicaţia se trimite la oficiul national pentru patente, unde este examinată
de către specialişti:
Oficiul de Stat pentru Invenţii şi Mărci Înregistrare (OSIM-România) ;
Patent and Trademark Oftice (PTO-SUA);
European Patent Organizat ion (EuPO-UE).
Specialiştii oficiilor nationale, membri ai Comisiei de examinare de speciali­
tate, întocmesc un raport de examinare pe baza căruia acordă patentul. Hotărârea
de acordare a patentului produce efecte începând cu data publicării acesteia în
BOPI - Buletinul Oficial de Proprietate Industrială. Patentul trebuie obtinut
înainte de punerea pe piaţă a produsului farmaceutic.
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 47
Dacă patentul este respins, la cererea aplicantului, se reexaminează documen­
tatia de către Comitetul Director al Oficiului. În cazul primirii unui nou vot
negativ, patentul va putea ti primit doar pe cale juridică. întrucât miza este foarte
mare, financiar vorbind, sunt multe cazurile care ajung în instanţă, deşi costurile
unor procese juridice sunt mari, iar durata lor este deasemenea mare,
2. Majoritatea ţărilor dezvoltate (Japonia, SUA, UE etc.) au aderat la Tratatul
international de cooperare a patentelor (International Patent Cooperation Treaty­
';J PCT), care numără la ora actuală peste 90 de ţări membre. Este important de ştiut
că PCT nu acordă patente, ci doar oferă o serie de date preliminare.
1 Aplicaţia realizată prin intermediul PCT are o etapă internaţională şi una
naţională. În etapa internaţională aplicatia este studiată preliminar, după care se
,
emite un rezumat al studiului, care oferă indicatii cu privire la răspunsul pe care
I-ar putea da fiecare oficiu national. Răspunsul primit joacă un rol important în
decizia de aplica în continuare pentru acordarea patentului în ţările vizate .
Aplicaţia intră apoi în etapa naţională a fiecărei ţări, care prin intermediul
oficiilor naţionale oferă patentul pentru produsul, sau tehnologia respectivă,
Drepturile ce decurg din realizarea unei inventii sunt drepturi morale şi drepturi
patrimoniale. Drepturile morale vizează:
./ dreptul la recunoaşterea calităţii de inventator;
,, ./ dreptul de a aduce invenţia la cunoştinţa publică;
~<1
./ dreptul la recunoaşterea priorităţii ştiinţifice.
"SJ
'.j Drepturile patrimoniale vizează:
.'
l"'
,,1 ./ dreptul la exploatarea exclusivă a inventiei;
)fr. ./ dreptul la despăgubiri.
-10'>
J Protejarea drepturilor patentului este responsabilitatea titularului patentului
n; şi/sau Iicenţiatului autorizat să utilizeze dreprurile ce decurg din patent. EI urmăreşte
,f;: concurentii şi îşi apără drepturile prin mijloace de d_rept civil şi/sau penal.",
Avantajele unei companii, care are un medicament·pr()tejât de' part!'lt: sunt
imense. Ea are exclusivitate în producerea şi vânzarea acelui produs farmaceutic
pe perioada exercitării protectiei oferite de patent. Produsul este vândut la un pret
mare, pentru ca acea companie să-şi poată recupera o parte din investiţia făcută
pentru cercetarea şi dezvoltarea acelui nou medicament. Odată ce patentul pentru
noul produs expiră, acesta poate fi realizat şi de alti producători, sub formă de
medicament generic, dar care va fi vândut la un pret mult mai mic.
De exemplu, tluoxetina (PROZAC - Eli Lilly) a reprezentat unul din medica­
mentele cele mai importante pentru firma Eli Lilly, având vânzări de 1,3 miliarde
$ în prima jumătate a anului 2001, când încă era sub protectia patentului. După
 ~ţ!
48 CĂTĂLlNA DANIELA SlAN 1[
expirarea patentului, În decurs de l an, au apărut pe piaţă generice ale fluoxetinei
comercializate de alte companii. În aceste conditii, vânzările pentru PROZAC, :1
ale firmei Eli Lilly, au scăzut la 380 milioane $ în prima jumătate a lui 2002.
Un alt exemplu îl constituie cimetidina (ZANTAC) comercializată de firma
GlaxoSmithKline căreia, după expirarea patentului În SUA, i-au scăzut vânzările
în 4 ani cu 90 %. Dacă în 1995, în perioada protectiei oferite de patent, firma
GlaxoSmithKline înregistra vânzări la ZANTAC de 2085 milioane $, în 1999
când produsul nu mai era protejat de patent, vânzările au ajuns la 277 milioane $.
Durata normală a unui patent este de 20 de ani Însă, în cazul produselor
farmaceutice, se poate prelungi protecţia oferită de patent cu până la 5 ani. În
acest fel se poate compensa timpul pierdut de la data aplicării pentru patent şi
până la aprobarea finală pentru utilizarea acelui medicament.
Deasemenea, ţinând cont că protectia oferită de patent durează cel mult 20 de
ani, iar pentru dezvoltarea unui nou candidat terapeutic sunt necesari aproximativ
15 ani, rezultă că noul produs farmaceutic va fi protejat doar 5 ani. Deci, o
companie farmaceutică mare trebuie să pună pe piară un medicament nou la
fiecare 3-5 ani, pentru a putea, beneficia de avantajul unicului producător şi
pentru a-şi păstra poziţia de lider pe piata farmaceutică (după unii autori e nevoie
de 4-5 noi medicamente/an). lotuşi, nici măcar marile companii farmaceutice nu
pot pune pe piaţă mai mult de 1-2 medicamente noi/an.
Taxele ce derivă din drepturile patentelor reprezintă o sursă de venit pentru
companiile farmaceutice, pentru universităţi, sau pentru centrele de cercetare. De
~
.~
exemplu, S. Cohen şi H. Boyer au patentat În decembrie 1980 tehnologia
ADN-ului recombinant, patent ce a durat până în 1997 şi care a adus Universităţii
~
,<
Stanford şi respectiv Universităţii California 45 de milioane de dolari. Institutul
de Tehnologie din Massachusetts aplică pentru aproximativ 100 de patente pe an
şi primeşte aproximativ 5,5 milioane $/an din drepturile patentelor.'
Marile companii şi universităţi au dezvoltat politici eficiente de obtinere a
patentelor, având departamente specializate pentru întocmirea dosarelor şi pentru
facilitarea obţinerii lor.
~~edliZa:re~~(?îlf;;faZă,: pilcra. ,noului: . medicament Svi.
Este o etapă absolut necesară introducerii unui nou medicament pe piaţă. Este o
verigă între centrul de cercetare şi serviciul de fabricate. Acest serviciu "pilot"
permite transferul de tehnologie ("know-how") de la cercetare la productie, .'
:;
""
precum şi optimizarea procesului tehnologic de fabricare a unui. medicament.
Studiile în fază pilot ale viitorului medicament se realizează după ce Comisia
Medicamentului a analizat dosarele pre-clinice şi cel farmaceutic ale noului
r ~ ! t,
I o" ~' oi- ,\'; f{_~
/?\(( } 1..' ' (( .
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 49
candidat terapeutic şi a dat un aviz favorabil. După analizarea şi aprobarea
, probelor din seria zero, realizate cu ajutorul serviciului pilot, se primeşte avizul
pentru dezvoltarea clinică a acelui candidat terapeutic.
Laboratoarele "pilot" permit:
• trecerea uşoară şi fără grijă a unui produs creat de centrul de cercetare în faza
de microproducţie ;
• optimizarea procesului tehnologic de fabricare a unui medicament;
• aprecierea şi cuantificarea beneficiului adus de noile tehnologii sau materiale.
Obţinerea unui produs industrial se poate realiza doar dacă se dispune de o
tehnologie de fabricare reproductibilă.
Prin urmare, în faza pilot, se culeg informatii de la serviciul de cercetare, se
studiază rnodalităţile de preparare, se controlează riguros fiecare etapă a procesu­
lui, se stabilesc parametrii optimi de lucru şi se asigură o continuă conformitate
a produsului cu normele de calitate stabilite anterior.
Serviciul pilot are următoarele obiective:
./ realizarea unui medicament cu aceleaşi norme de calitate, ca cele stabili le în
etapa de formulare;
,/ detectarea şi eliminarea cauzelor de eroare;
,/ descoperirea operatiilor inaplicabile pentru acel medicament;
./ optimizarea procesului tehnologic în vederea creşterii randamentului ;
./ optimizarea procesului tehnologic in vederea reducerii pretului de cost;
,/ ameliorarea conditiilor de lucru (dacă produsul este deja în fabricatie) ;
,/ ameliorarea conditiilor de calitate (dacă produsul este deja În fabricatie).
Studiile pilot şi-au atins scopul atunci când:
• s-au verificat toate fazele tehnologice, astfel încât să tie adaptare la subsranţele
care se prelucrează;
• tehnologia utilizată duce la obtinerea unui produs reproductibil şi care indepli­
neşte normele de calitate.
La nivelul studiului pilot. trecerea de la faza de cercetare la cea de productie
industrială se realizează prin executarea q_5.JQ!!![!_ge R1:9_t1.\l1i.ţ!, în colaborare cu
sectia industrială. La nivelul fiecărui lot se stabilesc anumiti parametri, se
corectează o serie de deficiente şi se adaptează productia la cantităţi industriale.
Lotul I
Se fac studii specifice de obtinere a unei formule optime pentru "scara pilot". Tot
aici, se corectează formula obţinută în studiile de formulare şi se adaptează fazei
pilot, corectând concomitent şi parametrii procesului tehnologic.
 ,,w..'r'Jr'"

MEDICAMENTE DE RIOSINTEZĂ 51
50 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

./ substanţele active, substanţele auxiliare, produsele parafarmaceutice trebuie

Lotul 2 şi 3 '{
, să îndeplinească condiţii de calitate superioare, conform standardelor din
La acest nivel se obţine formula industrială (cantităţi şi compozitie) şi se stabileşte Farmacopeea Europeană şi Farmacopeea Română (puritate superioară, steri­
procedeul industrial de obtinere a noului candidat terapeutic. litate etc.) ;
./ Întreprinderile farmaceutice trebuie să fie autorizate de Ministerul Sănătăţii
Lotul 4 şi 5 (dar şi de Ministerul Muncii, Ministerul Industriei, Ministerul Mediului etc.) ;
Se aplică formula şi procedeul industrial de fabricare. ./ utilajele, aparatele şi tehnologiile utilizate trebuie adaptare complexităţii pro­
În cadrul studiului pilot, după obtinerea loturilor 4 şi 5, urmează să fie ducţiei şi trebuie certificate conform Sistemului de Asigurare a Calităţii.
identificate testele rapide de stabilitate pentru evaluarea stabilităţii produsului Întreprinderea farmaceutică este spatiul unde o societate (companie) prepară
finit (ce se derulează pe o perioadă de aproximativ 2 luni). medicamente ~i produse parafarmaceutice. Ea trebuie să deţină un sistem de
Serviciul pilot tinde să devină o entitate nouă în companiile farmaceutice, asigurare a calităţii, iar medicamentele trebuie preparate conform Autorizaţiei de
întrucât el optimizează procedeele tehnologice şi ajută la scurtarea timpului de Fabricare.
productie. Etapele productiei industriale ale unui medicament sunt schernatizate în figura
Se poate concluziona că, serviciul pilot are o importanţă deosebită în: nr. Il.
Farmacistul responsabil cu productia răspunde de calitatea medicamentului,
);- introducerea în producţia industrială a unui nou produs farmaceutic;
adică .• trebuie să dea asigurarea că într-o cutie de medicamente, luată la
).- îmbunătăţirea unor procese tehnologice deja existente;
Întâmplare la ieşirea din Întreprindere, conţinutul corespunde În totalitate
» evaluarea influenţei unui echipament (instalaţii) de productie.
poziţiei care figurează pe etichetă, chiar dacă el ;/11 l-a văzut niciodată . .
COI/l­

Rolul jarmacistului, În această etapă de studiu pilot, este de a cerceta calitatea Calitatea medicamentelor este asigurată prin procedeele de validare. Validarea
produsului şi a materiilor prime, reproductibilitatea tehnologiei folosi te, stabili­ conferă lin grad Înalt de siguranţă produsului farmaceutic şi demonstrează că
tatea farmaceutică a produsului finit şi, nu în ultimul rând, de a observa şi procedeele de fabricatie sunt reproductibile şi permit realizarea unui medicament
Îndruma realizarea la scară industrială a noului candidat terapeutic. ce îndeplineşte specificaţiile stabilire anterior în Autorizaţia de Fahricare.
t~lem~nţele ce generează catitatea medicamentului.suntcei 4: M_:
•
_ti • personalul (Men) ;
].5. $Pro(lu~tiă':qa' :scarăXiDBustri~lif, 'â)Yitidlcamentelor • materialele (Materials) ;
• echipamentele, instalatiile, utilajele (Machinery) ;
Specialităţile farmaceutice sunt realizate de industria farmaceutică. • tehnologiile de fabricare (Methods).
Companiile farmaceutice, În functie de dotări şi de scopul urmărit, sunt
structurate
•
astfel:
companii ce produc materii prime sub formă de "vrac" prin:
.~~.
i~~'
Personalul
Personalul angajat al unei Întreprinderi de medicamente are un rol primordial În
o transformarea substantelor naturale ; 'j obţinerea unui produs finit (medicament) de calitate superioară.
o sinteză şi semisinteză chimică; &. Personalul trebuie să aibă calificare corespunzătoare locului de muncă, să tie
'f,.
''';1
o procese ferrnentative ; periodic instruit, astfel Încât să poată Îndeplini sarcinile de serviciu cu maximum
o tehnici de inginerie genetică. de promptitudine şi corectitudine.
• companii ce prepară substanţe auxiliare utilizate în industria farmaceutică; Fiecare companie farmaceutică alcătuieşte organigrama Întreprinderii, pentru
• companii ce realizează condiţionarea şi ambalarea formelor farmaceutice, ca toate sectoarele să tie acoperite cu personal calificat. Responsabilităţile fiecărui
plecând de la substanţele "vrac". angajat sunt incluse în fişa postului şi aduse la cunoştinţa lor.
Industria de medicamente are câteva caracteristici proprii, deşi se Înrudeşte cu Într-o Întreprindere de medicamente, farrnacistul are un rol deosebit de impor­
industria chimică, ţinând cont de condiţiile de calitate pe care trebuie să le Înde­ tant, el putând lucra, conform calificării sale, În sectoarele cheie ale producţiei,
plinească un medicament. Aceste caracteristici sunt schematiza te În continuare: controlului, cercetării-dezvoltării şi distribuţiei de medicamente.
52 CĂTĂLlNA DANIELA S'II\N MEDICAMENTE DEHIOSINTEZĂ 53

Achi zi ţi onarea de Materialele

materii prime Materiile prime ca: substantele active, substanţele auxiliare, materialele de
----- .. --r' _____l condiţionare, aerul, apa, toate acestea definesc caracterele unui medicament.
Ele trebuie să corespundă exigentelor de calitate specificate În caietul de sarjă.
Recepţie Furnizorii şi distribuitorii acestor materiale sunt deosebit de importanti,
întrucât ei trebuie să asigure o caliate superioară şi constantă a acestor materiale.
Depozitare
Toate materiile prime parcurg un tlux bine stabilit (intrare, depozitare, prelevare
Controlul calităţii de probe, carantină până la terminarea analizelor, stocare în magazie până la intro­
-
H ducerea în fabricatie), iar mişcarea lor este înregistrată pe Fisele de stoc zilnice.
Stocarea
materiilor prlme ~J Fluxul parcurs de materiile prime poate fi schematizat astfel:

• etapa de punere În .\"[0(' farmaceutic - are loc trecerea din carantină În

'1 depozitele centrale;
• etapa de introducere şi transformare - materiile prime sunt introduse În

Productia
1 procesul de fabricatie

de expeditie.
şi sunt transformare in produs finit;
• etapa de eliberare a loturilor - trecerea din depozitul de produse finite în cel

'------1--·'
(prelucrarea materiilor prime)
Echipamentele de productie
Utilajele, instalatiile, echipamentele de lucru sunt alese în funcţie de substanta
Lntermedi ari rnedicamentoasă fabricată, sau de forma farmaceutică obţinută. Toate acestea
sunt dispuse in spatii ce asigură o instalare logică şi ordonată a utilajelor, astfel

~uscvra:= .~'!

î
incât se împiedică confuziile, se evită contaminările şi se elimină manevrele
defectuoase.
luate echipamentele de producţie, ansamblurile, subansarnblurile
trebuie să demonstreze
şi instalatiile
că permit obtinerea unui medicament de calitate şi
~- reproductibil, prin executia riguroasă a procedeului de fabricare.
Aparatele şi maşinile folosire trebuie însoţite de instructiuni de folosire, de

I-·'-'·;=.~~'---J
~iţiona,'C
instructiuni de protectia muncii, pentru a putea fi exploatate in siguranţă şi pentru
a obtine un medicament de calitate.

r:~::~- Tchnologiile dc fabricatie

Acestea permit realizarea unui medicament În cantităţi mari şi reproductibile.
Tehnologia de fabricatie (procesul tehnologic) este o succesiune de operatii
mecanice, fizice, chimice, concornitente sau ciclice, ce sunt necesare preparării
--PI':dUS finit " unui medicament.
[ ~ Un proces tehnologic se poate realiza pe mai multe căi. Alegerea uneia dintre
------_._.' .,
i,' ele se face În functie de considerente economice, de productivitate, de conditiile
Figura nr, 11 Etapele producţiei industriale ale unui medicament
j
fi de lucru.

"1
_~1
';tI
't
'.ţ~.\..,
54 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 55

Operatia este o fază distinctă a unui proces tehnologic. Ea reprezintă o

J ~
activitate efectuată asupra unei substanţe medicamentoase, ce este asociată cu
substanţe auxiliare, pentru a ti transformată într-un medicament. Operaţia poate
fi de natură chimică, fizică, sau fizice-chimică. Fiecare fază nechimică a pro­
cesului tehnologic se numeşte operaţie unitară.
Operaţiile unitare pot ti :
• operatii mecanice - depozitare, transport, divizare, clasare, filtrare etc.
•
•
•
operaţii
operaţii
operatii
hidro şi aerodinamice - comprimarea gazelor, sedirnenrarea etc.
termice - încălzire, răcire, distilare, uscare, evaporare etc.
de difuziune - extracţie, adsorbţie, cristalizare, concentrare etc.
Operaţiile unitare se realizează înaintea procesului principal şi atunci sunt
L -_- --
I
"1' '. G
l'enICl1I.l"
-~~ ('i~~i:~><1--+
=,"'_~/'-
------._:::-, , .. __~ ~~-
~y-

;-11 --
//
.

-'-, ~
~I
_~
__---==--'-PCl'i(s~~
. _

operatii preliminare (divizare, amestecare, solubilizare etc.), sau după încheierea

procesului principal şi atunci sunt opera/ii finale (cristalizare, decantare, filtrare,
evaporare etc.).
Procesele tehnologice de fabrica re a medicamentelor sunt complexe şi sunt
alcătuite din mai multe faze. \.- ~
~
Faza de tabricatie cuprinde totalitatea operaţiilor tehnologice, care duce la
obţinerea unui produs. Etapizarea procesului tehnologic pe faze ajută la orga­
nizarea pe sectoare de producţie a tehnologiei respective.
Schema de fahricatie este o modalitate de reprezentare a unui proces tehno­
logic, care redă grafic instalaţiile folosite şi ordinea lor de utilzare. Pot ti scheme
pentru întreg procesul tehnologic, sau doar pentru o singură fază a procesului
~
J,
~i
,
-,
[, d l,
._"_ ~J~ _;. I
~-- .,J ._~/r~
-~.ţ-T~fl~ r~,r
tehnologic. De exemplu, în tigura nr. 12 se poate observa schema de fabricatie a filtrat
acidului 6-aminopenicilanic prin hidroliza chimică a penicilinei G sare de potasiu. ,~

Fluxul tehnologic este o reprezentare schematică a operatiilor succesive ce

formează o fază de fabricaţie. Procesele unitare se încadrează intr-un dreptunghi, --o
formănd o coloană centrală. Materiile prime se inscriu in stânga fiecărei operaţii,
în dreptul unor săgeţi orientare spre dreptunghi, sugerând introducerea lor in
procesul de fabricatie. Produşii secundari, ce nu interesează, se scriu în dreapta
L ._ ,. I I K':;~
fiecărei operaţii, la capătul unor săgeţi ce sugerează scoaterea lor din procesul de
3,
~ W __ .::I±_
fabricaţie. Legătura intre procese şi operatii este reprezentată prin săgeţi verticale, i"i'
iar reintroducerea în ciclul de fabricaţie se indică prin săgeti punctate. De ~! Figura nr, 12 Schema de fabricaţie la hidroliza chimică a pcnicilinei G sare de K
exemplu, in figura nr. 13 se poate oherva fluxul tehnologic de obţinere a etilsuc­ ~} Legendă: I-vas de reacţie ; 2-ccntrifugă filtrantă : 3-uscălor in strat fluidizat : 4-vas de măsură
cinatului de eritromicină. 1; pentru dimeulanilină : 5- vas de măsură pentru diclormeian : o-vas de măsură pentru dimetil­
-diclorsilan ; 7-vas de măsură pentru butanol ; 8-VilS de măsură pentru apă; 9-vas de măsură
2;~: pentru soluţia de amoniac.

i'
-~l

,~
_:J,I
 ,~~j:

CĂTĂLlNA DANIELA STAN

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 57
56

Soluţie diclorrretanică a
Fisa de fabricatie (fisa tehnologică a producătorului) este documentul care
ckirurii de rronoetil-succinil cuprinde informaţii despre produsul respectiv şi despre fazele procesului tehno­

Eritromicină
L____~--~ logic, cu descrierea fiecărei operaţii şi ordinea lor cronologică.
Producţia industrială a unui medicament se realizează În cantităţi mari, divizate
În şarje (serii) de fabricaţie.
Şarja reprezintă cantitatea dintr-un produs farmaceutic obţinută În condiţii
ape spălare identice, Într-un singur ciclu de operaţii şi a cărui calitate este omogenitatea.
LOlul reprezintă cantitatea de materie primă, presupusă a fi unitară, din care
~a~03 sol 2(%;
se obţin una sau mai multe serii de produse.
~
:1 Dosarul seriei de tabricatie reprezintă un set de documente care permit
J reconstituirea istorică a unui serii. EI este consultat În caz de reclamaţii şi este
Na,50. anh _•..[J;C~hid~;;-;;-'~ păstrat un timp egal cu perioada de valabilitate a produsului.

r- J---•..
lază orgal1~1 Numărul seriei de fabricatie se inscripţionează pe fiecare unitate de medi­
cament (cutie), pentru a putea reface etapele parcurse de serie.
L- F JI~ ~I~ ~-_.- NazSO~ CPUll1l( Dosarul tehnic al produsului garantează realizarea şi reproductibilitatea prin­

. L _ J-._-- .. cipalelor procedee folosite, precum şi obţinerea unui produs de calitate superioară .
EI este un element al sistemului de asigurare a calităţii prin procedura de calificare

_
[

-.~~__ .~ L~=--j-
Distilare a,....:otror~i
LOI1Ccntralc DCM

recuperat
_
şi procedura de validare.
Procedura de calificare constă În verificarea fiecărui ansamblu şi subansamblu
al unui aparat, sau al unei instalaţii. Se verifică funcţionarea lor corectă pentru
acctona
_________ .. I Ollel."De' M ( 1 .'1 )
[ tlce ---....acctona
+
realizarea operaţiilor, conform specificatiilor din caietul de şarjă,
25-2XOC DCM
Caietul de sarjă cuprinde:
.NaHCO;j sol
. ?"/. :.:_:~.J~ . -=-l2_(_J-c='XJ"T'L.--==
Cnst.ahzarc .. ,
1'11"·l:'-X.~1
l • destinaţia echipamentului;
• exigenţe particulare;
• specificări funcţionale (aspecte ale securităţii farmaceutice. ale securităţii de
-·--l··------~
[
- --T- Fil~;~~~c ape 11llUl)C
personal, temperatura şi presiunea de utilizare, condiţii de Întreţinere etc.) ;
• limite de prestare ;
"1'"., ,1',,1',1,,('-\<.......rC'-I.O •
'_______ ~--------l S pdktlC
:" 1,- •• _____....... al' t.:.. s1 ,'".".,
c k ~ • nivel tolerat de uzură;
~ ,~ • condiţii de montare, transport. punere În funcţiune etc.
~., • condiţii de punere În aplicare a procedurii de verificare;
;:ii
-----~ umiditate
;j. • termen de exploata re ;
~"

• exigente de aprovizionare cu piese de schimb etc.

l___ Ccnlcn; -] ~i
Procedura de validare este () operaţie ce demonstrează că toale procesele şi
j
! -----~ umiditate ~:
procedeele utilizate pentru fabrica rea , conditionarea şi controlul unui produs
farmaceutic conduc la un rezultat definit, reproductibil şi omogen pentru un
'(\
produs determinat.
~:
Etil-s uccina t de cri(nJn,idnă ,~,?!
Figura nr. 13 Fluxul tehnologic de obtinere a etil-succinatului de er itromicină II
 'r"
\'" ~~.~ ..... ,j
.~

't

~
.~~

CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 59

58 t~;1
~,1 .:. organizarea conducerii producţiei - se referă la stabilirea structurii organi­
-1 CENZORI I :}~ zatorice a întreprinderilor (organigrama), la stabilirea şi îmbunătăţirea meto­
delor de conducere şi la sistemul inforrnaţional ;
.:. organizarea producţiei - realizată pe baza unui studiu privind determinarea
capacităţi lor de producţie şi a posibilităţilor de sporire a lor, raţionalizarea
fluxurilor tehnologice, determinarea surselor de pierderi, programarea pro­
ductiei, dezvoltarea în perspectivă a întreprinderii;
.:. organizarea şi normarea muncii - stabileşte normele tehnice pentru toate
locurile de muncă, urmăreşte aplicarea corectă a normelor tehnice; îmbună­
'1,1
tăţeşte normele existente, elaborează norme noi etc.
r,
1:;
Fabricile de medicamente sunt organizate pe sectii şi subsecţii , ce sunt utilate
conform specificului lor. Personalul angajat are calificarea necesară locului de
muncă, iar sarcinile fiecărui angajat sunt cuprinse în fişa postului, fiind însuşite
de fiecare persoană. Personalul de specialitate trebuie să beneficieze de o instruire
,. continuă, pentru a putea îndeplini toate sarcinile de lucru.
Organigrama unei întreprinderi de medicamente de mărime medie poate fi
.il observată în figura nr, J 4 (adaptată după M. Cornan et al" 2003) .
~~
c
, ~,
",'::.,
Bibliografie
. i~i
!::
\r
't~
:Î'l 1. Adler R" Science , 1984, 224: 357-363;
.~~
2, Allison J'O Lemley M., Boston Univ. Law Rev. , 2002, 82(1): 77-144:
~ 3, Ardley J., Hoplroff C.G.M" Tib/ech, 1996, 14: 69-79;
~!
'::j
/:
4, Barton J" Scientiţic American, 1991, (march) : 18-24;
5. Beatrice M,. Cun, Opin. Biotechnoi., 1997, 18(3): 370-378;
6, Belcher M" Sheard A,G., Ann, Clin. Biochem. 1993,30: 1-10;
7. Berks A., Trends Biotechno!., 1994. 12: 352-364:
~I~' 8. Bienz-Tadrnor B'O Bio/Technol . 1993, 11: J68-172;
9, Bodoaşcă T, Dreptul proprietăţii intetectuale , editia 2. Ed. C.H. Beck , Bucureşti,
~i 2007, 230-304;
~: 10. Chahine K,G" Nat . Biotechnol., 1997, 15: 586-587;
Figura nr. 14 Organizarea unui producător de medicamente 'l
:ţ II. Chow S" Liu J .. Design and analysis of clinical trials, John Wiley & Sons.
il 12,
England, 2004;
Coman M., Bota c., Pop C'O Industria Medicamentului, Baze teoretice şi practice;
Organizarea unei fabrici de medicamente .{~!
îl Ed. Srima, Cluj-Napoca, 2003, 7·24;
O industrie este formată din totalitatea unităţilor economice productive, indiferent î!
~~,
13, Crespi R" Biotechnol. Genet . Eng. Re)!.. 1993, II: 229-261 ;
de dimensiunile lOT şi de puterea economică. Deci, formele de organizare vor ti 14, Crespi R" Trends Biotecnnol., 1994, 12: 395-397;
foarte variate. :~,
?i-.
15. Crespi R.S. Trends Biotechnol.; 1997, 15: 123-129;
Organizarea unei fabrici de medicamente se realizează ştiinţific şi vizează mai 16, Crespi R,S. Trends Biotechnot.; 1998, 16: 450-455;
multe aspecte genera le : .~\'.
y.'
:'
17, Crespi R.S, Trends Biotechnot .. 1999, 17: 139-142;

il
·1~~
 l'
~t
·~· r\i;'·'·
;',
60 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BlOSINTEZĂ 61

18. Crommelin D.J .A., Sindelar R.D. (eds.), Phurmaceutical Biotechnology , 2'kl edition, 45. Mahmood 1., Green M., cu». Phannacokin., 2005, 44(4): 331-347;
Taylor & Francis Group, Philadelphia, 2002, 389-406; .46. Marshall E., Science , 1997,275: 780-781 ;
19. Crooke 5., Bio/Technology , 1995, 13: 25-29; 47. Oi!ă I.D., Stan C.D., Tănase D., Rev, Med. Chir., 2005, 109(sup!.I): 97-101:
20. Cuvillier A., "The mie of the European Medicines Evaluation Agency in the har­ 48. OrI' R., O'Neill C., Curr. Opin. Molec. Ther., 2000, 2(3): 325-331 :
monization ofpharrnaceutical regulaiion" În: Pharmaceutical Medicine, Biotechno­ 49. Pignaui F., Aronsson B., Vamvakus S. et ul .. Crit. Rev. Oncol. Haematol .. 2002.
logy and European Patent Law, Goldberg R., Lonbay J. (eds.), 2001. Cambridge 42(2): 123-135:
University Press, London. 137-154; 50. Peste G., Nature , 1995, 378: 534-536;
21. De .Jong M., FAQ OII EU Pharmaceutical Regulatory Affairs, Brookwood Medical 51. Rick N.G., Drugs-from discovery /0 approval, second edition, John Wiley & Sons
Publications. Richrnond on Thames Surrey, England, I 998 ; Inc., Hoboken, New Jersey, 2009;
22.
23.
24.
DiMassi J. A., Paquette C., Phannacoeconomics,2004,2: 1-14;
DiMassi J.A., Hansen R.W., Grabowski H.G., 1. Health Econ .. 2003,22:
Drews J., Science , 2000, 287(5460): 1960-1964:
151-185; I 52.
53.
54.
Sauer F., Drug In! 1.. 1997. 31: 1-6:
Schellckens (-1., Trends Biotcchnol., 2004. 22 (8): 406-410;
Schwardt O., Kolb H., Ernst B., Curr. Topics Med. Chem., 2003, 3( 1): 1-9:
25. Eckenswiller c., Morrow J., Policy Options. 1996, 17: 11-15; 55. Shankar G., Shores E., Wagner C., Mire-Sluis A., Trends Biotechnol., 2006,24:
26. Evans P.. Genet . Eng News, 2001, 21 : 6-44; 274-280 ;
27. Evens R. P., Dinarello G.A., Brownc J., Fenton D., Hospital Physician part 1, 56. Sharpiro B. et al ., "The impact of biotechnology on drug discovery ", The 9'''
1995a, 31 (II): 27-36; lnternatioual Congress of lmmunotogv, San Francisco, California, SUA. 1995 ;
28. Evens R.P., Dinarello G.A., Browne J., Fenton D., Hospital Physician part 2, 57. Smith A.E .. Lancet , 1999.354 (sup!. 1): 1-4;
199511,31(12): 26-31: 58. Stan C.D., Ştefanache A., Dumitrache M., Profire L .. "Patcntarea primului micro­
29. Everin B., George S., Textbook ofclinica! trials , John Wiley & Sons Ltd., England, organism transgcnic", A XV-a Reuniune Naţională de lstoria Farmaciei. Galaţi,
2004 : România, iunie 2009 :
30. Far nley S., Morey-Nase P., Sternfeld D .. Curr. Opin. Bioteclinot., 2004, 15(3): 59. Streatfield S., Expert Rev. vaccines, 2005, 4(4): 591-601;
254-257 ; 60. Struck M. M .. 13io/TechIZOI., ] 994, 12: 674-677;
31. Flauman G.J .. Kaplan J. M .. Nat. Biotechnol.; 2001, 19: 683-684 şi 777-779: 61. Walsh G., "Drug approval in the European Union and United States", În: An
32. Gordon J., "Intellectual property" În: Manual of Industrial Microbiology and "?i introduction /0 moiecular biotechnotagv, Wink M. (ed.), Wiley-VCI-I Verlag Gmbl-l.
Biot echnologv , Demain A. L. (ed.), 2'" edition. ASM Press, Washington, 1999, >li Weinheim, 2006, 651-662:
••. 1

309-320 ; :~ 62. Walsh G., Biopharmaceuticals. Biochemistrv and Biotechnology, second edition.
33. Graffeo A., Bio/Technot., 1994, 12: 865-866: .,îi John Wiley & Sons L1d .. England, 2003. 43-91 :
34. Gyongyi D., Szckely P.. Molnăr J., Csep K., Industria şi Biotehnologia Medicamen­ .j 63. Walsh G., Nature Biotechnol, 1999, 17: 237-240;
tului. Îndrumător de lucrări practice, Litografia UMF Tg. Mures. 2009, 112-130: :~! 64. Walsh G., Phar/llaCeZllica!13iolechnology-C(Jllcep/s and Applications, John Wilcy &
35. Helrns P., Pediat . Allergy 11Il1IZ1IIzol .. 2002, 13(1): 4-9;
< Sons. England, 2007. 57-104;
36. 1-10 R. D. Y .. Gibaldi M., Biotechnology and biopharmaceuticals. Transforming 65. Williamson A.R., Trrnds Genet .. 2001. 17: 670-673 :
proteins and genes into drugs , John Wiley & Sons lnc., Hoboken, New Jersey, 66. Yablonsky M. D., Hone W. J .. Bio/Technnt., 1995, 13: 656-657;
2003, 3-95 : 67. Yeh J., Fernandez D._ Assoy Drug Develop, Technol .. 2004,2(6): 697-702:
~
37. Jefferys D .. Jones K .. Eur. 1. Clin. Pharmacot., 1995, 47: 471-476: .~
68. ***, Biotechnologv Mediciues in Development, Washington DC, 2000;
38 . .Iohnson E., Nat. Biotechnol.; 1996. 14: 288-291 ; 69. ***, U.S. Patent and Trademark Oftice, Fed . Regis! .. 2001. 66: 1092-1099.
39. Kaitin K .. Drug lnf.L, 1997,31: 27-33:
40. Kevles D.J., .. Pa/eli/ing lire: A historical overview ofIaw. interests and ethics '',
Legal Theory Workshop, Yale Law School , New Haven, Conn .. 200.1. 37-43 :
41. Knight H., Patent strategy. John Wiley & Sons. England , 2001 ;
42. Lee Jr K.B., Burrill G.S., Biotech 96: The lndustry Annual Report, Ernst 'Ind
Young LLP, 1995;
43. Leucuţa S., Tehnologie [armaccutică industrială, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 2001.
658-660 ;
44. Lubiniecki A., Curr. Opin. Biotectmo!., 1997, 18(3): 350-356;
 . ·'
r
,.
.

,
., MEDICAMENTE DE BJOSJNTEZĂ
63
I
II .1. Biotehnologia acid ului lactic
r, sin: acid 2-hidroxi propanoic, acid u-hidroxi propionic
CJH60J
Capitolul II M, = 90,08

BIOTEHNOLOGlA ACIZILOR ORGANICI

COOH
, COOH COOH

H-C-OH
I
Acizii organ ici sunt biosintetizaţi de câteva eucariote şi procariote. CHOH HO-C-H ,
La nivel industrial,
organici :
prin metode fermeruative, se pot obţine următorii acizi

CH3
I
CH3 CH3
• acizi policarboxilici - acidul itaconic ;
O-acid lactic O,L-acid lac tic L-acid lactic
• acizi monohidroxi-monocarboxilici - acidul lactic;
• acizi monohidroxi-policarboxilici - acidul citric ;
Acidul lac tic este produs de animale, plante şi microorganisme.
• acizi polihidroxi-monocarboxilici - acidul gluconic, acidul L-ascorbic.
A fost identificat prima dată de chimistut suedez Cari Scheele în 1798 În
Pentru o serie de acizi organici obtinerea pe cale fermentativă ar putea fi il laptele acru. După aproape 80 de ani, În 1857, L. Pasteur demonstrează că
·1"
posibilă, această tehnologie oferind cantităţi suficiente pentru a ti implementată ~ acrirea laptelui se datorează unei ferrnentaţii microbiologice (acidul lactic racemic
<~!
industrial. Astfel de acizi organici sunt: este rezultatul activităţii bacteriilor Iactice prezente în lapte). Se mai găseşte în
ti! melase (datorită conversiei parţiale a glucidelor). în fructe, legume, sucuri,
acidul malic, acidul fumaric, acidul tartric, acidul succinic, acidul kojic, acidul
,
;1' băuturi alcoolice, plante superioare (mai ales În timpul germinării) .
galic, acidul salicilic, acidul mevalonic, acidul diamino-pimelic, acidul propio­ .

.-~ A rost primul acid organic produs la nivel industrial prin fermentatie, în
nic, acidul giberelic, acidultrans-2,3-epoxisuccinic (precursor de ~-Iactame).
.~,
'l};
Littletown, statul Massachusetts, SUA în 1881.
Deocamdată, pentru aceşti acizi organici tehnologiile fermentative nu sunt Piaţa actuală a acidului lactic este de aproximativ 50.000 t/an. Din această
4
aplicabile la nivel industrial. Pentru unii dintre ei tehnologiile chimice sunt încă cantitate, 70% se obtine prin procedee fermentative, iar restul de 30% prin
importante din punct de vedere cantitativ şi economic. ~: sinteză chimică. Ambele procedeee sunt extrem de competitive şi apreciare din
Nu toţi acizii organici enumerati mai sus au aplicatii farmaceutice. În tabelul k punct de vedere al raportului cost/eficienţă.
nr. 3 (după C. Ratledge, B. Kristiansen (eds), 2006) sunt prezentate productiile 'h'
~: Datorită pătrunderii pe piata farmaceutică mondială a producătorilor chinezi,
anuale ale unor acizi organici de importantă farmaceutică. .~
pretul de vânzare al acidului lactic a scăzut simţitor în ultimii ani. Dacă în 1995
$.: acidul lactic produs de companiile din SUA şi VE se vindea cu 2,2 $/kg, in 2007
Tabelul nr, 3 acidul lactic produs de companiile din China se vindea cu 1, I $/kg.
Acizi organici de uz farmaceutic obţinuţi prin biotehnologie
••• -.----=--_--.-------;-0.,-'<")'-
Proprietăţt fizice, chimice, farmacologicc
~: ;.;ti·,:Nr(: q:t~i;;':. "~r:}.?;d".'·· .i 4cidul (ţ(~~Qi!= I ; J)rDd~c!ia anu~'.ă (t/an) .
1. Acid citric 1.400.000 Este un hidroxiacid organic natural, ce apare sub forma a doi izomer: optici D( +)
şi L(-) acid lactic, dar şi sub forma unui amestec racemic DL-acid lactic.
2.
3.
Acid gluconic
Acid lactic
60.000
50.000 i Amestecul racernic anhidru (obtinut prin distilarea sub vid a unei soluţii de
acid lactic) se prezintă sub formă de cristale monoclinice, incolore, fără miros, cu
4. Acid L-ascorbic 60. ()()() p.t.=16,8°C.
64 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE UlOSINTEZĂ 65

De regulă apare ca un lichid siropos, higroscopic, cu volatilitate scăzută şi cu sânge. Lactatul feros se absoarbe digestiv la fel ca şi sulfatul, fumaratul, glu­
P.f.15 unu Hg = l220C şi d2o= 1 ,206-1 ,216. Are un pK=3,86 la 250C. Se amestecă conatul, glutamatul, succinatul feros - 25 % din fierul continut într-o doză.
în orice proporţie cu apa, alcoolul, glicerolul, eterul şi este insolubil în cloroform Absorbtia digestivă este favorizată de acidul ascorbic, acidul succinic, fructoză,
şi eter de petrol. cisteină şi este mai bună pe nemâncate.
Soluţiile apoase au gust acru. În solutie formează dimeri ciclici sau polimeri
liniari în proportie de peste 20%. Soluţiile concentrate sunt caustice. Formează Produse farmaceutice:
săruri cu metalele (bariu , cupru, calciu etc.).
LAC1'AT DE SODIU
Izomerul D-acid lactic se prezintă sub formă de cristale (cristalizat din eter +
fiole soluţie i. v. 11,2 % lactat de sodiu (20 mEq lactat)
eter izopropilic), cu p.l. =52,8oC. Are un pK=3,83 la 25uC. Este solubil În apă,
SOLUŢIE RINGER LACfAT (Inforned Fluids SRL - România)
alcool, acetonă, eter, glicerol şi insolubil În cloroforrn. Formează săruri cu multe
saci pvc 250, 500 mi cu soluţie perfuzabilă cu clorură de sodiu 0,6 g +
metale (multe dintre ele tiind dextrorotatorii).
clorură ele potasiu 0,4 g + clorură de calciu 0,27 g + lactat de sodiu 3,2 g
lzomerul L-acid lactic apare în cantităţi mici În sângele şi muşchii animalelor
SOLUŢIE RINGER LACTAT VIOSER (Vioser SA - Grecia)
şi ale omului. Concentratia lui în muşchi şi sânge creşte după o activitate fizică
tlacon 1000 mi sol. perfuzahilă
intensă. Se mai găseşte În ficat, rinichi, glanda timidă etc.
DIANEAL J 37 (Baxter - Anglia)
Se prezintă sub formă de cristale higroscopice (cristalizare din acid ace tic sau
saci pvc 1500, 2000 mi cu sol. pentru dializă renală cu glucoză + NaCI +
cloroforrn), cu p.t. = 53°C. Are un pK=3,79 la 25°C. Formează săruri cu multe
CaCI2 + MgCI2 + lactat ele sodiu
metale, ce sunt mult mai solubile În apă decât sărurile arnestecului racemic (multe
dintre ele fiind levorotatorii). CAPD 4 şi CAPD 4 A.N. D. Y. PLUS (Fresenius - Germania)
Produsul de uz farmaceutic este un amestec de acid lactic şi acid lactil-lactic saci pvc 200 mi cu sol. pentru dializă renală cu dextroză + CaCI" + MgCI~
(60% acid lactic + 30% acid lacul-tactic + 10% apă) cu un conţinut total de 85-
+ lactat ele sodiu + NaCI
LACfAT DE POTASIU
92 %, exprimat în acid lactic.
Acidul lactic ca atare se utilizează în preparatele externe (unguente, loţiuni, fiole 10 mi, soluţie orală 25,63% lactat de potasiu (20 mEq lactat)
solutii) pentru actiunea sa reductoare (diminuă procesele metabolice din celulele fiole soluţie i. v. cu lactat de potasiu + KCI
derrnice, influenţând favorabil procesele inflarnatorii cronice şi keratinizarea). CALCIU LACTIC (Zentiva - România)
Produsele farmaceutice contin de regulă şi alti acizi (e.g. acidul salicilic). ep. 500 mg
Cel mai adesea se utilizează sub formă de săruri, În funcţie de metalul cu care GLUCONOLACfAT DE CALCIU (8. 8raun Melsungen - Germania)
formează sarea având diverse utilizări terapeutice. fiole 10 mi, solutie inj. 10% cu gluconolactat de calciu
Lactatul de calciu se utilizează în deficitele de calciu (tetanie, afectiuni MAGNE 86 (Sanofi Synthelabo - Franţa)
alergice, rahitism, osteoporoză, profilactic în sarcină, alăptare şi în perioada de dj. lactat de Mg 470 mg + piridoxină 5 mg
creştere la copii etc.) având acţiune recalcifiaruă, de scădere a excitabilităţii fiole la mi, sol. buvabilă lactat de Mg + pidolat de Mg + piridoxină
neuro-musculare şi de relaxare a muscularurii netede. Se mai indică şi pentru
actiunea antialergică, antiinflamatoare şi de normalizare a permeabilităţii capilare. Tehnologia de biosinteză a acidului lactic
Lactatul de potasiu se indică în tratamentul tulburărilor metabolice cu bilanţ Acidul lactic se poate obţine prin fermentatie cu bacterii selecţionare, pe medii de
potasic negativ (diaree, acidoză diabetică,
diuretice etc.).
tratamente cu corticosteroizi sau
.~.
;
cultură ce au la bază materii prime naturale : făină de porumb, cartofi, melasă,
:1 zer de lapte.
Lactatul de sodiu este utilizat ca alcalinizant (lactatul se metabolizează la
~ Ferrnentaţia lactică a glucidelor decurge după următoarea reactie:
bicarbonat, iar sodiul creşte rezerva alcalină şi diminuă aciditatea urinii) în ~
tratamentul comei diabetice şi a stărilor de acidoză. Efectul antiacidozic are o
;î
latenţă de ci rea 1-2 ore, necesare biotransformării lactatului în bicarbonat. ~ C6HI206 ~ 2 CJH60J
Lactatul feros se utilizează curativ în deficite ele fier (anernii feriprive) şi J~, glucoză acid lac tic
profilactic la femei Însărcinate, la sugari, la copii mici, la donatorii periodici ele
68 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE AIOSINTEzĂ 69

Purificarea acidului lactic după separarea din biomasă se realizează diferit, În Mediu de cultură cu
functie de utilizarea sa. Oricum, concentratia glucozei reziduale trebuie să fie sub glucoză pură
0,1% (v/v) atunci când este necesar un acid lactic de puritate farmaceutică.
Mediile de fermentatie obţinute cu materii prime de calitate mai proastă, vor
necesita mai multe etape de purificare, inclusiv recristalizarea produsului final.
Ca alternativă, se utilizează extractia cu solvenţi (eter izopropilic, 2-butanol,
amine terţiare trialchilice În solvenţi organici), sau esterificarea cu metanol,
J
Încălzire pentru dizolvarea
lactatului de calciu
urmată de distilare:
Acidul lactic de uz farmaceutic necesită o purificare avansată. Biomasa se
tratează cu floculanţi organici la un pH =7, o temperatură de 6SJC şi o concen­
traţie a floculantului de 0,08 g/I. Celulele bacteriene sunt floculate, Îndepărtate
Precipitarea
1
prin filtrare, iar acidullactic se izolează şi se purifică din solutia limpede obţinută
după centrifugare. sulfatului de calciu
Una din metodele de separare şi purificare a acidului lactic din biomasă se
poate observa În figura nr. 15.
Au fost descrise şi alte metode de separare şi purificare. 1
Obtinerea unui acid lactic de Înaltă puritate (metodă descrisă de O. Hitomi în
1989) presupune utilizarea cromatografiei cu răşini schimbătoare de ioni (Diaion I FT"e I
SK I B), concentrarea până la 90% a acidului lactic şi distilarea concentratului la
130(lC. Etapele acestui procedeu sunt:
Concentrare
).;- mediul de fermentatie se trece peste o coloană cu răşini cationice pentru desa­
linizare;
).;- solutia
acidului
obţinută se trece peste (J coloană cu răşini anionice pentru adsorbţia
lactic ;
!
Îndepărtarea ionilor metalici
;. eluarea coloanelor cu solutia unui acid puternic, când acidul lactic trece de pe prin precipitare cu hexacianoferat
coloană în solutie.
Y. Heriban şi colah. descriu în J 993 extractia acidului lactic din mediul de
fermentatie cu ajutorul electrodializei combinată cu cromatografia cu schimbători !
de ioni, randamentul în acid lac tic fiind de 85 %.
La noi în ţară, la ICCF Bucureşti (Institutul de Cercetări Chirnico-Farmaceu­
tice) s-a pus la punct un procedeu de obtinere a acidului lactic de uz farmaceutic,
folosind tulpini de Lactobacillus delbrueckii (Şt. Jurcoane şi colab., 1994).
/p"r",e~
Fermentaţia tulpini lor producătoare se realizează pe medii ce contin: cu schimbător: de ioni prin tratare cu H202 prin tratare cu KMn04
• făină de porumb furajeră (cu 10-12 % glucide reducătoare) ;
• (NH4)3P04 0,1% ;
1
• CaCO) 1%.
Materiile prime (amidonul din făina de porumb furajeră) au fost hidrolizate
I Concentrar~ I
enzimatic cu preparate standardizate (Therrnarnyl J20L şi San Super 240L-Novo,
Danemarca) timp de 10 h la 650C şi pH =5,5. Figura nr. 15 Separarea acidului lactic din hiomasă

'l.L.:t
 'JJ1r?
_",,!
\.

70 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE D10SINTEZĂ 71

Ferrnentatia propriu-zisă se realizează timp de 96 de ore la temperatura de
420C şi la un pH =3,8-5,2 corectat cu suspensie de CaCO,. La sfârşitul termen­
taţiei, concentraţia acidului lactic în mediul de cultură estede 9-10%. De fapt, în
mediul de cultură există un amestec de acid lactic 2-4 % şi lactar de calciu 6-7%.
Mediul de cultură se filtrează pentru îndepărtarea celulelor producătoare.
Filtrarea biomasei se realizează optim la 60-7rflC, când are loc o coagulare
parţială a biomasei şi denaturarea diverselor proteine din mediu. Ulterior, se
concentrează filtratul până la 50% acid lactic, când se obţine aşa numitul "acid
lactic tehnic" (acest acid lactic poate fi utilizat ca atare în industria pieIăriei).
Acidul lactic tehnic se purifică ulterior pentru obtinerea acidului lactic de uz
farmaceutic.
După separarea biornasei, filtratul obtinut se decolorează cu cărbune activ
1%, la pH =4-5 şi la 60°C. Deoarece filtratul contine un amestec de acid lactic­
lactat de calciu, acesta se neutralizează cu Ca(OH)2 timp de I h la 70°C. Ulterior
se fi I trează.
În final, lactatul de calciu se cristalizează din alcool etilic şi se recristalizează
din apă la 80oC, când rezultă o solutie de 20% lactat de calciu, care, după răcire,
se precipită cu alcool etilic în raport de I : 2 (v/v).
Cristalele de lactat de calciu de uz farmaceutic se usucă sub vid la 600C timp
de 24 h.
11.2 .. Biotehnologla acid ului gluconic
sin: acid D-gluconic, acid maltonic, acid dextronic, acid glicogenic. acid penta­
hidroxicaproic, acid pentahidroxicarboxilic
C6HI207
M, = 196,15
COOH
IHC-OH
-) neuro-rnusculare
În ultimii 100 de ani s-au publicat numeroase patente şi procedee de obtinere
. a acidului gluconic. Plecând de la glucoză se poate obtine acidul gluconic prin
procese chimice, electrochimice, enzimatice (cu enzime libere sau imobilizate),
procedee fermentative continue sau discontinue ce utilizează fungi, bacterii,
drojdii ca celule libere sau imobilizate.
H. Hlasiwetz şi J. Habermann descoperă în 1870 acidul gluconic.
Acumularea de acid gluconic a fost observată prima dată la bacteriile forma­
toare de acid acetic Acetobacter aceti de către L. Boutroux în 1880, dar şi la
Pseudomonas savastanoi (un parazit al măslinilor). Ulterior, în 1922, s-a observat
producerea acidului gluconic de către fungi ca Aspergillus niger.
Astăzi, se ştie că acidul gluconic este produs de câteva procariote şi eucariote
din categoria bacteriilor şi a fungilor :
• bacterii din genurile: Pseudomonas , PltytOIll0I111S, vibrio, Acetobacter , Achro­
mobacter, Klebsiella, Zymomonas mobi lis, Acetobacter methanolicus, Gluco­
nobacter ;
• fungi din genurile: Aspergillus, Penicillium, Gliocladium, Mycoderma , Aureo­
basidium pullulans.
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
Acidul gluconic se prezintă sub formă de cristale aciculare, cu p.t. = 131oC, gust
acid şi un pK(250C) =3,60. Este uşor solubil în apă, greu solubil in alcool
absolut, insolubil În eter şi solventi organici. În solutii apoase, acidul gluconic
este partial transformat Într-un amestec de părţi egale de y şi o gluconolactonă.
Echilibrul dintre acidul liber şi forma lactonică este dependent de pl-l şi de
temperatură. Acidul gluconic se poate prezenta şi sub formă de lichid siropos.
Se utilizează sub formă de săruri, în functie de metalul cu care formează sarea
având diverse utilizări terapeutice,
(' Gluconatul de calciu se utilizează in deficitele de calciu (tetanie , afectiuni
\ a(t!rgice;-i:âhTiiiiTi-;-osteoporoză, profilactic în sarcină, alăptare şi in perioada de
" creştere la copii etc.), având actiune recalcifiantă, de scădere a excitabilităţii
şi de relaxare a musculaturii netede. Se mai indică şi pentru

HO-CH
I i actiunea antialergică, antiintlamatoare şi de normalizare a perrneabilităţii capilare.
\._. Gluconatul feros se utilizează curativ în deficitele de fier (anemii feriprive) şi

HC-OH
I profilactic la femei însărcinate, la sugari , la copii mici, la donatorii periodici de
sânge. Gluconarul feros se absoarbe digestiv la fel ca şi sulfatul, fumaratul, lacta­

HC-OH
I tul, glutamatul, succinatul feros - 25 % din fierul continut într-o doză. Absorbtia
digestivă este favorizată de acidul ascorbic, acidul succinic, fructoză, cisteină şi
este mai bună pe nemâncate.
I
CH20H
Gluconatul de zinc se utilizează în tratamentul unor afectini dermice (menţine
integritatea epiteliilor şi ajută la refacerea acestora), este adjuvant În tratamentul

~,
.,l!tilli-.:,
 CĂTĂLIN A DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 73
72

sterilităţii, normalizează activitatea prostatei şi are rol în menţinerea activităţii GLUCONAT FEROS (Stanley - SUA)
sistemelor enzimatice ale organismului. cp. tilmate, 300 mg gluconat feros (35 mg Fe)
Gluconatul de potasiu se indică în tratamentul diferitelor tulburări metabolice TOT'HEMA (Lab, Innothera - Franţa)
cu bilanţ potasic negativ (diaree, acidoză diabetică, tratamente cu corticosteroizi tiole 10 ml sol. buvabilă cu gluconat Fe + gluconat Mn + gluconat Cu
POTASSIUM GLUCONATE (Swanson Health Products - SUA)
şi diuretice etc.).
cps. gluconat de potasiu (99 mg K) - supliment nutritiv
Produse farmaceutice : ZINC GLUCONATE (Swanson Health Products - SUA)
cps. gluconat de zinc (50 mg Zn) - supliment nutritiv
GLUCONAT DE CALCIU (Zentiva - Romania)
fiole de 5, 10 mi cu soluţie i.m., i.v. 10% de gluconat de calciu Tchnologia de biosinteză a acidului gluc,onic
GLUCONAT DE CALCIU (8. Braun Melsungen - Germania)
fiole de 10 mi cu soluţie i.m., i.v. 10% de gluconat de calciu Se poate obţine prin fermentatia unor fungişi bacterii. Cel mai adesea se utilizează
ca microorganis~;-p~oduc~'itoft'ungi'd~tipl~IA.0;-drgillus niger, sau hacterii ca
CALCIU GRANULAT (Meduman - Germania)
Gluconobaaeroxidans. ..' . . .. . .
granule, 100 g cu 50% gluconat de calciu ".'_ v .~ ' •. ,'_ • ,. _.",.. _. ,.,'

Tehnologia ce utilizează tulpinile de Aspergillus niger a fost dezvoltată încă

CALCIU EFERVESCENT 200 (Sicorned - România)
din anii '30. Iniţial se realizau ferrnentaţii de suprafaţă care durau 11-12 zile şi
cp. 1,85 g gluconolactat de calciu (200 mg Ca)
atingeau randarnente de 70-80% (L.A. Underkofler, 1954). Astăzi, ferrnentaţiile
CALCIU 200 (Sicomed - Romania)
sunt submerse, iar randamentele sunt de peste 95 %. Aproximativ 45.000 t din
cp. efervescente cu gluconolactat de calciu (1,850 g)
cele 60.000 t obţinute anual sunt produse prin fermeruaţia submersă a tulpini lor
CALCIUM FORTE 500 (Novartis - Anglia) de Aspergillus niger. ...- __ o --~ •• _ •••••••• ---.---.-- _._. '.. •

cp. efervescente 500 mg, gluconolactat de Ca 2,94 g + CaC03 0,3 g

'. --Mediul contine 120-150 g/I de glucoză. Concentraţii mai mari de glucoză sunt
CALCIUM SANOOZ FORTE (Novartis - Elveţia)
cp. efervescente 500 mg, gluconolactat de Ca 2,94 g + CaCO) 0,3 g
limitate de solubilitatea scăzută a gluconatul~Cde-'c-âTCJU~ la ce poâte-p~eC'ipita
suprafaţa rniceliului şi astfel poate inhiba utilizarea substratului şi a oxigenului de
CALCIUM SANOOZ (Sandoz - Germania)
către tulpina de fung.
fiole soluţie i.m., i.v. cu gluconobionat de calciu
Mediul mai contine surse de azot (extract de porumb, uree), surse de fosfor _şi
GLUCALCIUM (Lab. Renaudin - Franţa)
concentratii maride-imiTdenlagn~~:l'u.-Aceştia suntTii~I?~g;!}iCR·~~ţi:~:jQ(marea
fiole 10 mi sol. inj. cu gluconat de Ca 0,9 g + glucoheptonat de Ca 0,11 g
"gTucOzo-Oxfda~Ceilz1mă-c. as!gl!~.ă
~ oxlciarea'-6-::gl~'Cozei înJ?-o-g!~Q,!!Qla~jQnă
GLUCONOLACTAT DE CALCIU ŞI MAGNEZIU (Zentiva - România)
ca~:e-I;id;0if~_'.l!..~_~I2~~ri~~-
(sau cata Îiiic-li1preze'n\a I actouaze i) ]iU!.r.;ll!_g!J!\;Q.W(:.
tiole 2 mi, sol. inj. 5% cu gluconat de Ca 8 mg + gluconat de Mg 4 mg
-------Glucozo-oxidaza este o enzimă extracelulară, a cărei actiune este favorizată de
GLUTAMAG + B6 (Sicomed - România)
conceI2tra~ marJ~~ilu~Qii=~QD~ţn!@t!i_!ii.~C~__Q_\lge;i-~şI d~~_1i.!Ui:r>4:.·be··
cps. glutamo-gluconat de Mg 0,299 g + vitamina B(, 0,06 g
MAGNEVIT (Arena - România)
-aceea, pe parcursul ferrnentaţiei, s~.::l._cIl!g~}_!1_ln(!_sI!ll. CaCO) ce ajustează pH-ul la
cp. filrnate cu gluconat de magneziu + piridoxină
"·val~~re~~e6:.r'AstreI:TnTlnar~ tO!~!~~~~ gluconatul de caicili~- '.
Schema transformării O-glucozei în acid gluconic cu ajutorul fungilor este
FERROUS GLUCONATE (Natures Bounty - SUA)
redată în figura nr. 16.
cps. gluconat feros (28 mg Fe)
f~ffi1tt se realizează aeroh, în prezenta unor concentrarii mari de_oxige.~,
ASCOFER (Arena - România)
la ternperaturi de 25-281JC şi se încheie după 24 ore, când se obtin randamente de
cp. 40 mg gluconat feros + acid ascorbic peste 90%.
SIROFER (Gedeon Richter - România)
La sfârşit, biornasa se filtrează cu ajutorul filtrelor presă, iar filtratul obţinut
sirop, gluconat feros 4,6 g/IOO g sirop + acid ascorbic 600 mg 1
/<
contine gluconatul de calciu. Acesta se separă din mediu prin precipitare la rece
FERGLUROM (Biofarm SA - Romania)
l din solutii suprasaturate. Precipitatul se tratează cu cantităţi stoechiometrice de
tiole 5 mI soluţie buvabilă 2 %, 4 % gluconat feros (12 rug, 24 rug Fe) ~
.}
.~
'1.;
~
i
.~

~.
74 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
r . '
.

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 75

O-Glucoză °z O-Glucoză

~ FAD
glucozoxidază
glucozo-dehidrogenază ( P QQ

y
r--'" FADHz
?--PQQHz
lanţul respirator
HzOz O-D-GlucollolactoIlă
8~O-GI uconolactonă
chimic (Iactonază)
chimic (Iactonazâ)
HzO ori
HzO I ori spontan
spontan

Acid gluconic
Acid glllconic
Figura nr, 17 Obtinerea acidului gluconic din O-glucoză cu ajutorul bacteriilor
Figura nr. 16 Obtinerea acidului gluconic din O-glucoză cu ajutorul fungilor

Fermenraţia se conduce la un pl-l < 3.5 şi la concentraţii de glucoză mai mari

HZS04 când se eliberează acidul gluconic, iar solutia clară obţinută este con­
de J 5 % (v/v), pentru ca 9,cidul gIi!coni<,: să se acumuleze în cl~n~ie_il.~I}_;2~o=­
centrate'! la 50% (v/v). gluc~atului.
Se poate obtine şi gluconatul de sodiu, metoda fiind una superioară celei prin
Gluconatul de ~odi!! obţinut in urma ferrnenraţiei se precipită după concen­
care se obtine gluconatul de calciu. Procedeul a fost pus la punct de firmele trarea solutiei la 45 % (v/v) din volumul iniţial şi modifica;:e-;;-pi'l-ului la 7'3.-­
japoneze ca un proces fermentativ continuu. Ferrnentaţia se realizează la concen­ ---S_"'a~'des~ris şi procedee ce utilizează celule imobilizate, dar care încă nu sunt
traţii mai mari de glucoză (până la 350 g/I), iar pH-ul se ajustează la valoarea de aplicate industrial.
6,5 prin adăugare de NaOH. S-au obtinut conversii ale solutiilor de glucoză de La noi__î.!ua.!.ă s-a pus la punct la lCCF Bucureşti. în 1982, tehnologia de
35% (v/v), procesul având un randament de 95%. obtinere a gluconatului <!_e c;_,!I.c::i~de uz farmaceutic prin fermentaţia glucozei cu
Tot japonezii au raportat şi utilizarea fungilor osmotoleranţi de tipul Aureo­ tulpini de A~p'!_rgillus:..!.l{!{!_!.:
basidium pullulans, ce fermentează în medii cu peste 350 g/I glucoză. Recent, Mediul de cultură contine:
<. . .•
4

S. Anastassiadis el al. au raportat în 2003 realizarea ferrnentaţiei continue, pe un

mediu mineral, a tulpinilor de Aureobasidium pullulans şi obtinerea unor cantităţi • glucoză tehnică-20% ;
• CaCO)-3,4%;
de 260 g/l acid gluconic la o conversie totală de glucoză, după 2 zile de
• NaNOJ-0,05 % ;
fermentatie continuă.
• MgS04'7HP-O,OI25%;
Fermentaţia bacteriilor, în scopul obtinerii acidului gluconic, se aplică mai
• KH2P04-O,01 % ;
putin la nivel industrial. Ca tulpină producătoare se utilizează Gluconobacter
• ulei vegetal-O, I %.
oxidans . Bacteriile transformă glucoza extracelulară în acid gluconic extracelular
cu ajutorul glucozo-dehidrogenazei, enzimă ce foloseşte PQQ drept coenzimă. Mediul de cultură, sterilizat la 1I0oC timp de 30 minute, se inoculează cu o
Schema transformării D-glucozei în acid gluconic cu ajutorul bacteriilor este suspensie de spori a tulpinilor de A-;p;;-;gillusllige;:'iCCF~-- - - . - - ..
redată în figura nr. 17. . ~~a se realizează la]~~~, la o presiune în bioreactor de 2 bari, un
~ debit de aer de 0,7 I aer/mediu/min. şi o turaţie de 280 rot/min. a agitatorului.
"
î,
:~
·~~I
 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 77
76

Pe tot parcursul procesului E.!:!~_!' se menţine la valoarea de Q2prin adăugarea

suspensiei de CaCO}.: 11.3. Biotehnologia acidului citric
După 30-400e0re de fermentaţie concentraţia de glucoză scade sub 0,5%,
. având o conversie a substratului de 94 %. La sfârşit, concentraţia gluconatului de
calciu în mediu este de 9-10%.
Biornasa se filtrează, iar solutia nativă se concentrează până la 20-30%
sin:
C6Hs07
acid ~-hidroxitricarboxilic
I M F-~'2 T, 7pa-IASI
Mr = 192,12
gluconat de calciu, "~rI11ând să se cristalizeze glu~onatu'l-pri-n r.ăcj~!.!!._1-50C.
Se mai poate realiza uscarea prT;;--a-toÎllizare, când se obţine un gluconat de BUOTECA CENTRALA
/COOH
calciu tehnic, care se decolorează, se pu~jţ}9. ulterior prin recrjstalizare din
alcool etilic, obţinându-segliiconatul de calciu de puritate 99%.
H2C
. -Scnei';~ fluxului tehnologic de obţinere a gluconatului de calciu de uz farma­
ceutic este prezentată în figura nr. 18. HO-C--
I COOH
apă
I
glu,:~ -1
inocul
J (',_:;_",g,,,,, H2C -,
'COOH

_~~~':IL(~;_~:(~~G[Fe~~'~I~~~~~J Acidul citric este larg distribuit În plante precum şi În nuielele şi ţesuturile
animale.
CaC03 ,;
Acidul citric a fost izolat initial din sucul de lămâie de către chimistul suedez
perlit [-~ -'---l
___~ . ._~~!tr_are _l---" miceliu
. .
+ perlit
Cari Scheele În 1784.
În 1826 a inceput În Anglia productia comercială de acid citric din lămâi le
italiene, ce a fost pusă la punct de John şi Edrnund Siurge .. Întrucât importanta

C activ [__ L .
--------~ Decolorar·e~--- .•. C epuizat
acidului citric a crescut, producătorii italieni de lămâi au decis să obţină ei acidul
citric în Italia, stabilind astfel de-a lungul secolului al XIX-lea un monopol

-=I:
asupra producţiei.
Până în 1919 sucul de lămâie a reprezentat singura sursă ele acid citric. Acest
monopol determina o lipsă a competitiei şi deci un pret de cost foarte mare.
Rezultatul a fost căutarea altor surse, mai ieftine, de acid citric. Cum alte surse
alcool etilic Cristalizare şi vegerale bogate în acid citric nu s-au descoperit, s-a mers pe studii chimice şi
--_._-~ recristal izare microbiologice.
._._------,------'
În 1880 E. Grirnoux şi P. Adams au realizat sinteza acidului citric pornind de
i la glicerol, iar mai târziu de la dicloroacetonă. care se transformă În acid citric
" printr-o succesiune de 4 reacţii. Sinteza chimică era neeconomică (materiile prime
[_O ~~~!~~I:~~eJ---.---•• filtrat erau mult mai scumpe decât produsul finit), randamentele de obţinere foarte
i1 mici, erau multe etape de reacţie, iar intermediarii erau toxici şi greu de utilizat
1 .•~ (acid cianhidric, cianură de potasiu, acid diciano-acetonic etc.). Toate acestea au
pledat pentru renuntarea la metoda chimică de obţinere a acidului citric,
Gluconat de calciu 99%
În 1893, C. Wehmer descoperă acidul citric ca produs al culturilor de Peni­
:(ţ' cillium glaucum, ce ferrnentează pe medii de glucoză şi săruri anorganice. Această
Figura nr, 18 Fluxul tehnologic la obţinerea gluconatului de calciu de uz farmaceutic
~
1
~Lg lj:,1
'"
 s=
;.(

MEDICAMENTE DE iJlOSINTEZĂ 79
78 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Tabelul nr, 4
descoperire nu a dus imediat la stabilirea unui procedeu comercial de obtinere a
Utilizări ale acidului citric
acidului citric, dar a impulsionat cercetarea altor microorganisme, potenţial
producătoare de acid citric. Astfel au fost descoperite şi alte microorganisme ce Nr. ert. Industria utilizatoare Procent din cantitatea anuală
..
acumulează acidul citric: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus
1. Industria berii 45%
fonsecaeus , Aspergillus luchensis , Aspergillus phoenicus, Aspergillus wentii ,
2. Industria al imentară 21%
Aspergillus saitoi , Aspergillus lanosius , Aspergillus flavus, Absidia sp., Acremo­
3. Industria detergentilor 19%
nium sp., Aschochyta sp., Botrytis sp., Eupenicillium sp., Mucor piriformis,
4. Industria farmaceutică 8%
Penicillium janthinellum, Penicillium restrictuni, Talaromyces sp., Trichoderma
5. lndustria materialelor plastice 7%
vi ride , Ustulina vulgaris .
În 1917 J. N. Currie descoperă acumularea acidului citric de către fungii
Aspergillus niger, care sunt cultivaţi pe medii de glucoză şi săruri minerale la Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
valori mici de pH. A luat legătura cu firma Pfizer & Co. Inc. care a implementat Acidul cirric anhidru apare sub formă de cristale monoclinice obţinute din solutie
descoperirea sa În SUA. Astfel, În 1923 se obţinea industrial acidul citric prin apoasă concentrată fierbinte. Are p.t.=1530C. La 250C are un pK1=3,128;
ferrnentaţia de suprafaţă a tulpini lor de Aspergillus niger. pK~=4,761 ; pK1 =6,396. Este solubil În apă (v/v) în diferite proporţii, În funcţie
Acest procedeu industrial a impulsiona! obţinerea acidului citric prin procese de -temperatură:' 54,0% la lOuC; 59,2% la 20oC; 64,3% la 30oC; 68.6% la
termentative, Încât În J 935 aproximativ 95 % din producţia mondială de acid 4OoC; 70,9% la 50oC; 73,5% la 60oC; 76,2% la 701lC; 78,8% la 80oC; 81,4%
citric se realiza prin fermentaţie. la 90uC; 84,0% la ioo'c.
S-au îmbunătăţit procedeele ferrnentative (de suprafaţă, submerse, ferrnentaţii
continue, procese cu sisteme imobilizate, fermeruaţii cu ciuperci, procese koji etc.),
Forma hidratată are o moleculă de apă de cristalizare (C6H807' 1-12 °,
M, =210,14)
şi se prezintă sub formă de cristale ortorombice obţinute din solutie apoasă rece.
iar mai târziu s-au Îmbunătăţit şi tulpinile producătoare prin mutaţii genetice pentru are un gust plăcut şi o densitate la 18°C, d = 1,665. Cristalele monohidratate pierd
a creşte productivitatea. Astăzi, aceste tulpini şi caracteristicile lor productive apa de cristalizare în prezenţa aerului uscat, sau prin Încălzire la 40-50uC. Sunt mai
sunt un secret de fabricaţie foarte bine păstrat. greu delicvescente în prezenţa aerului umed. Se Înmoaie la 750C şi au p.t. = IOO°C.
Având gust plăcut şi toxicitate mică, acidul citric este foarte utilizat în industria Soluţia apoasă 0,1 N are pl-I = 2,2 iar solutia apoasă 10% are o densitate la 150C
alimentară, farmaceutică, a materialelor plastice etc., obţinănduse În cantităţi u= 1,0392.
foarte mari. Este solubil În diverse proportii (g/IOO g solvent) : 2,17 în eter; 0,007 În
Pe plan mondial se obţin aproximativ 1,4 milioane de tone/an (ce valorau În cloroform : 15.43 în alcool amilic; 5,98 în acetat de arnil ; 5,28 în acetat de etil;
2001 aproximativ 0,5 miliarde de lire), cu o creştere continuă a cererii de 5% 197 În metanol ; 62,8 în propanol.
anual. Producătorii reprezentativi sunt cei din Uniunea Europeană (41 % din Este larg utilizat În medicină (conservant al probelor de sânge-citratul trisodic),
cantitatea mondială) şi SUA (28% din cantitatea mondială). Modul de utilizare a În industria alimentară (Ia obţinerea brănzeturilor, a berii), În industria maselor
acidului citric la nivel mondial se poate observa În tabelul nr. 4. plastice etc.
Odată cu dezvoltarea companiilor chineze preţul de cost al acidului citric a În industria farmaceutică se utilizează sub formă de săruri ruetalice , având
indicatiile ionilor respectivi (citrat de calciu, citrat de magneziu, citrat de fier).
scăzut simtitor în ultimii ani. Dacă În 1995 acidul citric produs de companiile din
Se mai utilizează pentru proprietăţile sale acide în produsele farmaceutice efer­
SUA şi UE se vindea cu 2,5 $/kg, în 2007 acidul citric produs de companiile din
vescente, pentru rolul său antioxidant În produsele farmaceutice cu vitamine uşor
China se vindea cu 0,83 $/kg.
oxidabile şi în produsele cosmetice pentru rolul său de tampon.
\!Î;

t Produse farmaceutice:

~1 CALCIT (PharmexRom - Romania)

~
cp. cu citrat de calciu şi magneziu + vitarnina D2
ii
;:1
*'
'~Ii
'ill '~.
 ]WJof

80 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ HI

CALCIUM FORTE VON CT (CT Arzneimittel GmbH - Germania)
suspensie orală cu citrat de calciu
MAGNESIUM CITRATE (Life Extension - SUA)
cps. cu citrat de Mg 160 mg
MAGNE B6 PREMIUM (Sanofi Synthelabo - Franta)
cp. filmate cu citrat de Mg 618 mg + piridoxină 10 mg
BERES MAGNEZIU + B6 (Beres - Ungaria)
cp. filmate cu citrat de Mg 463 mg + oxid de Mg 352 mg + piridoxină 1,6 mg
OSTEO GUARD (Heritage Health - SUA)
cp. cu citrat de Mg + citrat de Ca + vitamina D)
Tehnologia de biosinteză a acidului citric
Pentru obţinerea acidului citric s-au utilizat diverse tehnologii fermentative,
acestea îrnbunătăţindu-se pe parcursul anilor În scopul creşterii productivităţii
procesului şi al scăderii pretului de cost al acidului citric.
Initial s-au utilizat fermentatiile de suprafată, ce presupuneau cultivarea micelilor
pe un mediu lichid atlat în vase cu suprafata de 5 m '. adâncirnea de 5-20 crn şi
capacitatea de 50-100 litri. Ferrnentatia se realiza 8-15 zile, la 28-30oC şi un
pH =5-7, obţinându-se aproximativ l kg produs/mvzi, cu o conversie a glucidelor
de 75 %. La sfârşitul fermentaţiei biornasa conţinea 15 % acid citric. Produsul se
izola sub formă de citrat de calciu (biomasa se trata cu Ca(OH)2 la 90oC), care
elibera acidul citric prin suspendarea în H2S04. Procedeul de supra fată a tOSI
foarte productiv pentru multi ani, deşi presupunea un regim de muncă intens şi
spatii de producţie mari şi ineficient folosire.
La sfârşitul anilor '40 s-a pus la punct fermentatia submersă, mult mai
productivă. Procedeul industrial (ce se foloseşte şi astăzi) a fost îmbunătăţit de
D.S. Clark la sfârşitul anilor '50 (în laboratoarele din Canada). Fermentatie se
realizează În conditii subrnerse cu un inocul de Aspergillus niger cultivat pe medii
cu melasă.
La sfârşitul anilor '70 B. Kristiansen, C.G. Sinclair şi R.C. Charley au
descris un procedeu continuu de obtinere a acidului citric, care deşi are produc­
tivitate foarte mare, nu a găsit o aplicaţie industrială.
Procedeele cu micelii imobilizate pe substraturi de alginaţi sau colagen s-au
dovedit posibile, dar au o productivitate mică pentru a prezenta interes industrial.
Pentru a face fată concurentei şi a rămâne pe piaţă, unii producători au
dezvoltat recent fermentatiile pe substrat solid (ce folosesc ca substrat diverse
subproduse ale industriei alimentare-rnelasă, glicerină etc.), fermentatiile con­
tinue ale ciupercilor (ce folosesc tulpini modificate genetic care permit acumularea
a 200-250 g/I acid citric). Aceste tehnologii promit să devină atractive pentru
producători, astfel Încât aceştia să poată rămâne În competitie.
Tehnologiile ce folosesc ciuperci tCandida catenula , Candida guilliermondii ,
.Candida tropicalis, Candida oleophila, Candida intermedia, Candida tipolyticaş,
au fost elaborate încă din 1965, când n-alcanii erau foarte ieftini. Ciupercile
produc concomitent şi acid izocitric În proportie de până la 50 %, atunci când se
folosesc drept surse de carbon n-alcanii. Productia industrială a acidului citric
din Il-alcani nu este economică, totuşi tehnologia s-a implementat în Italia În 1970
(compania Liquichimica din regiunea italiană Calabria). Procesul foloseşte tulpini
de Candida tipolytica cultivate În reactoare de 400 rrr', ce operează Într-un ciclu
de 72 de ore. La sfârşitul ferrnentaţiei cipercile sunt îndepărtate prin centrifugare,
iar filtratul se purifică În mod traditional. Conversia alcanilor este de 130% (deşi
teoretic este de 250%).
Procesul koji de obtinere a acidului citric a fost implementat în Japonia. Este
o tehnologie ce operează la scară mică şi foloseşte tulpini de Aspergillus sp.
cultivare pe medii de amidon şi celuloză sterilizate cu abur. La sfârşitul sterilizării
se obtine () pastă (cu 70% apă) ce are un pH =5,S~ Fermenraţia se realizează
aproximativ 5 zile, obţinându-se în final randarnente destul de mici în acid citric
(procesul e greu de controlat).
Obtinerea industrială a acidului citric prin fermentaria submersă, aerobă, a
tulpini lor de fungi, folosind drept sursă de carbon zahărul pur sau rnelasa este cea
mai utilizată metodă la ora actuală. Cererea mondială de acid citric este foarte
mare (ţinând cont de larga sa utilizare în domeniul farmaceutic şi alimentar şi de
toxicitatea sa scăzută), astfel încât productia mondială creşte anual cu 3,5-5 %.
Tulpinile producătoare au fost modificate genetic cu scopul de a deveni mai
rezistente la concentraţii mari de glucoză, la valori scăzu te de pH, la inhibitori ai
lanţului respirator, sau pentru a scădea/elimina producerea concomitentă a altor
acizi (e.g. acid oxalic, acid gluconic).
Acidul citric se poate obţine prin fermentaţia tulpinilor de: Aspergillus niger,
Aspergillus clavatus, Aspergillus ventii, Penicillium luteum, Penicillium citrinum.
Se utilizează medii de cultură pe bază de melasă, săruri minerale, surse de azot
şi stimulatori de biosinteză.
Condiţiile optime pentru productia ele acid citric sunt sumarizate În tabelul 111". 5.
Acumularea de acid citric se realizează convenabil atunci când conditiile de
lucru sunt strict respectare. Astfel, prin păstrarea conditiilor prezentare în tabelul
nr. 5 se pot acumula cantităţi foarte mari de acid citric.
Cel mai important parametru este tipul şi concentratia sursei de carbon.
Zaharidele de tipul sucrozei, maltozei, glucozei sunt rapid catabolizate de tulpinile
de Aspergillus niger şi permit obţinerea unor randamente mari În acid citric. Cele
mai bune surse de carbon sunt melasele elin trestie ele zahăr şi sfeclă de zahăr,
folosire În concentraţii mari (100-250 g/I). Atunci când concenrraţia sursei de
carbon scade sub 100 g/l acumularea de acid citric este scăzută, iar la concentrarii
sub 50 g/l acumularea acidului citric scade aproape total.
 r
.
.

82 CĂTĂLlNA DANIELA S'IAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 83

Tabelul nr, 5 Odată terminată ferrnentaţia, biomasa se încălzeşte la 700C pentru coagularea
Conditiile optime de obtinere a acidului citric · proteinelor şi se filtrează pentru a Îndepărta miceliul. Filtratul obţinut se tratează

; >: ;~~;.;ţrL/;} :~,t\~,i4W~~~f~~o~d;ţ.ie.:~:.' """ .;, Yal!)~rţa:p~:!.~:~W!Q~/;' cu o solutie de Ca(OH)2Ia 700C şi pH=2,7-2,9
se îndepărtează prin filtrare.
pentru a precipita oxalaţii, care

1. Concentraţia glucidelor (g/l) 120-250 Separarea acidului citric din filtrarul obtinut se poate realiza prin:
2. Concentraţia ionilor Mn2t- (M) < 10-' • precipitare;
3. Conceutraţia ionilor ZnH (M) < 10'(,_10.7
• extracţie ;
4. Concentraţia ionilor Fe' t (M) < 10.4 • adsorbţie pe răşini schimbătoare de ioni ;
5. Presiunea 02 dizolvat (rnbar) > 140 • separare cu membrane lichide ;
6. Concentratia ionilor PO,,· (g/l) 0.2-1,0 • electrodializă ;
7. Concentraţia sărurilor de amoniu (g/l) >2,0 • ultrafilrrare, nanofiltrare.
8. Timpul de fermentatie (h) 160-240
Cele mai utilizate metode sunt primele două. Celelalte metode, deşi promit
9. pH 1,6-2.2
mult, sunt realizate fie În fază de laborator, fie În statii pilot, dar Încă nu sunt
aplicare pe scară industrială.
Astăzi se fac cercetări în scopul obtinerii unor tulpini de Aspergillus niger Precipitarea este cea mai utilizată metodă de separare a acidului citric. Metoda
modificate genetic (în care gena responsabilă de enzima trehaloză 6-fosfat sinte­ constă în adăugarea treptată a solutiei de Ca(OH)2 peste filtratul obţinut la
taza este suprimată), care să producă cantităţi mari de acid citric în conditiile unei separarea miceliului şi precipitarea acidului citric sub formă de de citrat de
concentraţii mici ale sursei de carbon. calciu. Precipitarea se realizează la 950C şi pH =7, iar suspensia obţinută se
Concentraţia ionilor metalici în mediu este şi ea importantă pentru o producţie filtrează. Prin tratarea citratului de calciu cu acid sulfuric 60-70% se eliberează
mare de acid citric. Cei mai influenţi sunt ionii de Mn2+, care fiind prezenti în acidul citric, care ulterior se decolorează, iar soluţia se evaporă sub vid la
:~
mediu în concentraţii mai mari de 2 ~g/l scad concentraţia de acid citric din temperatură mai mică de 400C pentru a evita caramelizarea.
j
mediu cu 20%. f-':,
Dacă cristalizarea se realizează la temperaturi sub 36,50C se obtine acidul
Pentru a îndepărta excesul de ioni metalici, toate sursele de carbon utilizate în :~ citric monohidratat, iar dacă se realizează la ternperaturi peste 36,50C se obţine
fermentatie trebuie purificate iniţial, fie prin precipitări (cornplexări cu fero­ acidul citric anhidru.
cianuri), fie prin adsorbtie pe răşini schimbătoare de ioni (cationi). Se mai poate Fluxul tehnologic al separarii acidului citric, din mediul de fermentatie, prin
utiliza adăugarea în mediu a ionilor de Cu~+, care blochează transportul ionilor ~
.
precipitare se vizualizează în figura nr. 19 .
de Mn2+ în miceliu, sau adăugarea unor cantităţi mici de alcool sau lipide ce J! Extractia cu solveuţi este o metodă alternativă de separare a acidului citric
facilitează transportul acidului citric din celulă în mediul extracelular. din biomasă. Din extractul obţinut se recuperează acidul citric prin distilarea
Acumularea de acid citric este influenţată de concentraţia oxigenului dizolvat. solventului, sau prin spălarea cu apă.
Este nevoie de o concentraţie mai mare decât cea necesară creşterii vegetative, ce
este realizată prin adăugarea vectorilor de oxigenare de tipul Il-dodecan în
i~ •
Pentru extracţie se folosesc:

solvenţi organ ici nemiscibili cu apa, alcooli alifatici , cetone, eteri, esteri etc.
proportie de 5 % . ~
a
~ (T. Kasprzycka Guttman, 1989);
O balanţă optimă a surselor de azot-fosfar-ioni metalici este foarte importantă
A • compuşi organo-fosforici (tri-s-bunlfosfarut) şi alchil-sulfoxizi (oxidul trioctil­
pentru acumularea unor cantităţi mari de acid citric. ~

,
~ fosfinic) ;
Valoarea pll-ului este un parametru deosebit de important pentru ferrnentaţia ~ • amine insolubile în apă, sau arnestecuri de amine, dizolvate În solvenţi organ ici
i~
tulpini lor de Aspergillus niger În scopul obtinerii acidului citric. Se ştie că valori (A.M. Baniel, 1981).
mari de pH duc la obţinerea acidului gluconic şi a acidului oxalic în detrimentul I
acidului citric. La valori de pH < 3,5 enzima glucozo-oxidaza este inactivată şi Extractiile sunt utilizabile atunci când concentraţia acidului citric în soluţia
~ apoasă este mare.
deci se împiedică formarea acidului gluconic. I

M.ii
I
..I
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 85
84 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

La ora actuală se utilizează pe scară largă doar extracţia cu amine, (a primit

.aprobare din partea FDA În 1975 pentru separarea acidului citric ce va fi utilizat
În industria alimentară şi farmaceutică). Ceilalţi solvenţi extracrivi sunt fie toxici,
700C fie teratogeni şi deci nu pot fi utilizaţi la scară industrială.
Adsorbţia pe răşini schimbătoare de ioni se aplică doar la scară pilot şi
foloseşte rezi ne polimerice anionice slab bazice impregnate cu amine terţiare sau
piridină (S_ Kulprathipanja, 1989; R_S. Juang , TC Chou, 1996), sau rezi ne
anionice puternic bazice. Eliberarea acidului citric de pe granulele polimerice se
realizează prin spălarea coloanelor cu apă, sau cu acizi anorganici diluaţi.
Folosirea mcmbranelor lichide pentru separarea acidului citric este relativ
recentă (R.S. Juang, 1995; C Albulescu, A. Guzun-Stoica, 1996). Carrier-ul
mobil al membranelor lichide conţine un suport microporos inert impregnat cu
compuşi nerniscibili cu apa. Utilizarea acestei metode de separarea acidului citric
din biomasă oferă un consum redus de energie, un factor de separare mare Într-o
('a(011)2
singură fază şi posibilitatea de a concentra acidul citric pe parcursul separării.
'lotuşi, aplicarea la nivel industrial nu s-a realizat Încă, datorită stabilităţii reduse
pll-7
95°('
a suporturi lor acestor membrane lichide.
Deşi sunt câteva patente ce relatează electrodializa ca metodă de separare a
apă i-·- - ~-I
_:___
900(' --'I-'-
Filtran.· --_ filrrat acidului citric, ea nu se aplică industrial, nefiind economică. Membranele bipolare
sunt membrane cu schimbători de ioni speciali care, într-un câmp electric, sunt
capabile să despartă ionii apei. Pe acest principiu se poate transforma citratul de
sul. HoS04 70%G _ :--l
----=---. .... Aculularc I
l~ sodiu în acid citr ic În 4 celule unde se separă ionii sării electrodialitic şi ulterior
se convertesc în acid.
_ _!---
L_r~i!I'::'.~~J-- .. C"S04 Ultrafiltrarea şi nanofiltrarea se pot aplica pentru separarea continuă a
acidului citric. Y. Visacky a realizat În 1996 separarea acidului citric în 2 faze,

------ '2_]~~~_:-"
C activ ~------'l
c
.'
epuizat
din mediul de fermentatie al microorganismului Aspergillus niger. cu membrane
polisultonice. În prima fază a folosit membrane cu o mărime a porilor de 10.000
Da, care relin toate proteinele şi peptidele din biornasă. În a doua fază a folosit
membrane cu o mărime a porilor de 200 Da, care permit trecerea a 90% din
acidul citric.
[ Cris-;aIi1 d J. Bohdziewicz şi M. Bodzek au descris În 1994 o separare similară. Solutia
--T-
_ _l __
diluată de acid citric, obţinută ca permeat în urma primei faze de ultrafiltrare, a
fost concentrată până la 20 % prin osmoză inversă.
[ Filtra~" ape uuunc Astfel de separări cu membrane pot fi importante pentru procesele industriale

"=C J----.
[uscare
de separare a acidului cirric, Întrucât beneficiază de () serie de avantaje, cum ar
fi: consumul mic de energie şi posibilitatea utilizării' unui proces continuu.
-'-T umiditate
lotuşi, tehnologia trebuie optimizată şi adaptată pentru un proces industrial,
pentru a putea ti utilizată la scară mare.
ACI!) crnuc

Figura nr, 19 Fluxul tehnologic al separării acidului citric prin precipitare

~'I' -,
:.,\.I~
.";-:i
 1·;1'·:'·:':~
86 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Bibliografie
1. Albulescu C., Guzun-Stoica A., Proceedings of the lntemational Conference Advances
in Citric acid technotogv . Bratislava, octobcr 1996,32;
2. Alvares-Vasquez F., Gonzalez-Alcon C., Torres N.V., Biotechnol. Bioeng.; 2000,
70: 82-108;
3. Anastassiadis S .. Margunov I.G., Kamzolova S. v., Finogenova T. v., Recent Pa/
Biotechnoi., 2008, 2(2): 107-123;
4. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C .. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003,
61 (2): 1I0-Il7;
5. Archer D.B., Connerton 1.F.. MacKenzie D.A., Adv. Biochem. Engin/Biotechnol ..
2008, 111: 99-144;
6. Arisan-Atac 1., Wolschek M. F., Kubicek C. P., FEMS Mierobiol. LeII., 1996, 140:
77-82 ;
7. Audet P.. Paquin C., Lacroix C.; Appl. Microbiol. Biotechno!., 1988,29(1): 11-18;
8. Baniel A.M., Eur. Patent, 1981,0049.429;
9. Bălănescu Gr. (ed.), Dicţionar de chimie. Ed. Tehnică, Bucureşti. 1964;
10. Beral E., Zapan M .. Chimie organică, Ed. Tehnică, Bucureşti. 1973,520-528;
11. Bigclis R., Arora D.K., "Organic acids of fungi" in: Handbook of applied mycology:
[unga! biotechnotogy ; Arora D.K., Elander E.P., Mukerji K.G. (eds.), Marcel
Dekker, New York. 1992. 357-368;
12. Bizukojc M .. Ledakowicz S., Enzvme Microb. Technol .. 2003, 32: 268-281 ;
13. Bloom R.H. et al ., Ind. Eng, Chem .. 1952,44: 435-441 ;
14. Bohdziewicz J ., Bodzek M., Proc. Biochem., 1994. 29: 99-107:
15. Champagne c.P., Lacroix C., Sodini-Gallot 1., CRC Crit, Rev. Biotechnoi., 1994,
14: 109-134;
16. Charrington C.A .. Hinton M., Mead G.C., Chopra 1., Adv. Microb. Pltysiol .. 1991,
32: 87-108;
17. Cocain-Bousquet M .. Even S .. Lindley N.D., Loubiere P., Appl. Microbiol. Bio­
technoi., 2002, 60: 24-32 ;
18. Cornan M .. Bota C., Pop C .. Biotehnologiijarmaceutice , Ed , Medicală Universitară
"Iuliu Haţieganu", Cluj-Napoca. 2004. 156-161 ;
19. Dobrescu D., Farnutcoterapie practică, vol. l , II. Ed. Medicală, Bucureşti. 1989:
20. Fiedurek J., Biotechnot. LeII., 2001, 23: 1789-1793;
21. Gallmctzer M .. Burgstaller W., Microbiology , 2002, 148: 1143-1152;
22. Gluszcz P., Ledakowicz S .. "Downstream processing in citric acid production" in:
Citric acid biotechnology , Kristiansen B., Mattey M., Linden J. (eds.), Taylor &
Francis, London, .1999, 135-148;
23. Groboillot A.F., Champagne C.P .. Darling G.D., Poncelet D., Neufeld R.J.,
Biotechnol. Bioeng.; 1993,42(10): 1157-1163;
24. Hancock R.D., Viola R .. Trends Biotechnol .. 2002. 20: 299-305:
25. Heriban V., Skara J., Sturdik E., llavski J., Biotechnol. TecII., 1993,7: 63-68;
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 87
26. Hesse S.J.A., Ruijter G.J.G., Dijkema C., Visser J., Eur. J. Biochem., 2002, 269:
3485-3393 ;
27. Hitomi O., Hiyama K., Yoshida T.. Chem. EI/g. Res. oes.. 1989,67: 225-261 ;
28. lovu M., Chimie organică, Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 1978, 321-323 :
29. Juang R.S. , Chou T.C., 1. Chem. Eng, Japan, 1996,29: 146-151;
30. Jurcoane ŞI.. Fundamente, bioreactoare, enzime , Ed. Tehnică, Bucureşti, 2000,
164-214 ;
31. Jurcoane ŞI., Săsărrnan E., Lupescu 1.. Roşu A., Berchoiu Tarnba R .. Banu A.,
Rădoi F., Tratat de Biotehnologie, vol. 1, Ed. Tehnică. Bucureşti, 2004. 171-222;
32. Karaffu L., Kubicek C.P .. Appl. Microbiol. Biotechnol .. 20D3, 61 : 189-196;
33. Kascak K., Kominek J., Roehr M., .Lactic acid" in: Biotechnologv, Roehr M.
(ed.), 2'd edition, voI. 6 Products of Primary Metabolism, Verlag Chernie, Weinheim,
1996. 294-306:
34. Kasprzycka Guttrnan T.. Jarosz K., Semcniuk B., Myslinski A., Wilczura H.,
Kurcinska H., Polish Patent, 1989. 160.397:
35. Kirimura K., Yoda M .. Shimizu 1-1 .. Sugano S .. Mizuno M., Kino K .. Usarni S.,
Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64: 2034-2041 :
36. Kirimura K .. Yoda M., Usami S., Curr. Genet .. 1999.34: 472-478:
37. Kubicek C. P.. Karaffa L .. "Organic acids" in: Basic Biotechnologv. Ratledge C.,
Kristiansen B. (eds), 3nJ edition. Cambridge University Prcss, Anglia. 2006, 359-380 ;
38. Kubicek C.P., Food Technol. Biotechnol .. 1998.36: 173-178;
39. Kulprathipanja S .. US Patent, 1989,4.851.574;
40. Kurnar S .. Punekar N .S .. SatyaNarayan V.. Venkatesh K. v., Biotechnol . Bioeng.:
2000, 67: 575-560;
41. Kurosawa H., Nomura N., Tanaka H .. Biotechnol. Bioeng.; 198R. 31: 183-187:
42. Lesniak W., "Fermentation substrates" in: Citric acid biotechnology, Krisuansen
B., Mattcy M .. Lindcn J. (eds.), Taylor & Francis. London, 1999, 149-161 ;
43. Marz U., "World markets for citric, ascorbic. isoascorbic acids : highlighting
antioxidans in Iood" in: Report GA-115, Business Comrnunicauons Company.
Norwalk CT, SUA, 2002 :
44. Mattey M., Kristiansen B., "A brief introduction to citric acid biotechnology " in:
Citric acid biotechnoiogy, Kristiansen B., Mauey M .. Linden J. (eds.), Taylor &
Francis. London, 1999, 1-10;
45. Mehaia M.A .. Chcryan M., Applied Biochem. Biotechnol .. 1987. 14: 21-27:
46. Miron J., Gonzălez M.P., Pastrana L.. Murado M.A .. Ent: Microbiol. Technoi.,
2000. 10: 51-56:
47. Nduka Okafor. Modem lndustrial Microbiology aud Biotrchnotogy; Science Publishcrs,
Enfield, New Hampshire, SUA. 2007, 365-379:
48. Nimiţan E .. Biotehnoiogii microbiene; Litografia Universităţii "AI. 1. Cuza" laşi,
I 992, 64-85 :
49. Oniscu C.; Tehnologia produselor de biosinteză, Ed, Tehnică, Bucureşti, 1978,
288-323 :
50. Panneman H., Ruijtcr G.J.G., van den Broeck H.C.. Visser J., ElII: 1. Biochem.,
1998. 258: 223-229:
 ~r

CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE 8tOSINTEZĂ 89

88

51. Papanikolaou S., Galiotou-Panayotou M., Fakas S., Komaitis M., Aggelis G., 73. Visacky V.. Proceedings of the Iruernationa! Conference Advances in Citrie acid
Bioresour. Technol., 2007, 99: 2419-2428; technology , Bratislava, october 1996, 31 ;
52. Papanikolaou S., Fakas S., Fick M., Chevalot 1., Galiotou-Panayotou M., Komaitis 74. Ward w.P., Singh A., Adv. Appl. Microbio!., 2003, 51 : 53-80;
M., Marc 1., Aggelis G., Biomas. Bioenerg., 2008, 32: 60-71; 75. Willke T., Vorlop K.O., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56: 289-295;
53. Ratledge C., FEMS Microbiol. LeII., 2000,189: 317-321; 76. Wolschek M. F., Kubicek C. P., .Biochcmistry of citric acid accumulation by Aspergillus
54. Ratledgc C., Trends Biotechnoi., 1993, 11 : 278-281 ; niger" În: Citric acid biotechnology. Kristianscn B., Mauey M., Lindcn J. (eds.),
55. Ratledge C., Wynn 1.P., AdI'. Appl. Microbiol ., 2002, 51: 1-5; Taylor & Francis, London, 1999, 11-19;
56. Rochr M., Kubicek C.P., Kominek J., "Citric acid" În: Biotechnology, Roehr M. 77. Yabannavar Y.M., Wang 0.1., Biotechllol. Bioellg., 1991,37(6): 544-550;
(ed.), 2nd edition, voI. 6 Products of Primary Metabolism, Verlag Chemie, Weinheim, 78. Zidwick M.J., "Organic acids" În: Biotechnology of filamentous fungi " technologv
I.IlId products, Finkelstein D.B., BaII C. (eds.), Bunerwonh-Heinemann. Boston,
1996, 308-345 ;
57. Roehr M., Kubicek C.P., Kominek J., .Punher organic acids" În: Biotechnology . 1992, 303-321.
. Rochr M. (ed.), 2'<1 edition, voI. 6 Products of Primary Metabolism, Verlag Chemie,
Weinheirn, 1996, 364-379 ;
58. Roehr M., Kubicek C.P., Kominek 1., "Gluconic acid" În: Biotechnology, Rochr
M. (ed.), 2,01 cdiuon, voI. 6 Products ()( Primarv Metabolism, Verlag Chernie,
Weinheilll, 1996, 347-362;
59. Roehr M., Kubicek C.P., Kominek J., "Industrial acids and other small molecules"
. În: Aspergillus : Biology and Industrial Apptications, Benneu 1.V., Klich M.A.
(eds.), BuHerworth-Heincmann, Rcading-SUA, 1992,91-131 ;
60. Rohr M., Food Trend Biotechnol .. 1998.36: 163-169;
61. Ruijter G.J.G .. Kubicek c.P .. Visser J .... Production of organic acids by fungi" În:
The ntycota X,' industrial applications . Osiewacz H.O. (ed.). Springer. Berlin
Heidelberg New York. 2002. 213-224;
62. Ruijter G.J.G., Panneman H., Visser J .. Biochem. Biophys. Acta. 1997, 1334:
317-322 ;
63. Ruijter G.J.G .• Panneman H .. Xu O.B., Visser J., FEMS Microbiol. LeII., 2000.
184: 3542;
64. Ruijter G.J.G., van de Vondervoort P.J.I., Visser J., Microbiotogy, 1999, 145:
2569-2575 ;
65. Ruijter G.J.G., Visser J., .,Strain improvemeru" În: Citric acid biotechnoiogy.
Kristiansen B., Mattey M., Linden J. (eds.), Taylor & Francis, London, 1999.
55-68 ;
66. Sambamurthy K .. Ashutosh K., Pharmaceutical Biotechnotogy. New Age Interna­
tional ua., New Delhi, 2006, 273-283,
67. Sankpal N.V .. Joshi A.P., Kulkarni 8.0., 1. Microbiol, Biotechnol . 2000, 10:
51-58 ;
68. Sankpal N.V., Kulkarni B.O., Process Biochem., 2002,37: 1343-1348;
.~
69. Stieher R.W., Coulman G. A., Gerhardt P.. Appl. Environ. Microbiol., 1977, .e.
"~1
34(6): 733-739; \
il
70.
71.
Stiles M.E .. Holzapfel W.H., Imer. J. Food Microbiol., 1997,36: 1-29;
Suganuma T., Tahara N., Kitahara K., Nagahama T., Inuzuka K., Biosci. Biotechnol.
"ţi'~
Biochem., 1996, 60: 177-180;
.~,).1'
72. Suzuki A .• Sarangbin S., Kirimura K., Usami S., J. Ferment. Bioeng.. 1996,81:
320-328 ; •:~*~[
. . ,,1

Ar'I>"
~~"i'
.,i t;.f!
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 'il

Atât omul cât şi animalele trebuie să-şi suplimenteze alimentaţia cu aminoacizi

esenţiali. Arninoacizii esenţiali participă la biosinteza altor compuşi esenţiali cum
ar Ii histamină, catecolarnine, vitamine etc. Lipsa aminoacizilor esenţiali din
organism creează carente, ce au manifestări c1inice grave.
Prin urmare, aminoacizii sunt folositi pe scară largă În zootehnic la creşterea
valorii nutritive a nutreturilor pentru animale şi În industria alimentară pentru
Îmbunătăţirea valorii nutritive a alimentelor. Parte din aminoacizi sunt utilizaţi şi
În terapeutică, În tratamentul diverselor afecţiuni.
Capitolul III Istoria producţiei aminoacizi lor a Început În 1907 În Japonia, când ehi mistui

BIOTEHNOLOGIA AMINOACIZILOR I dr. Kikunae lkeda cerceta o serie de alge brune din ordinul Laminariales tLaminaria
japonicaş, În scopul obtinerii de aromatizanţi, Algele brune se foloseau În Japonia
din timpuri străvechi (sub forma condimentului combuş, ele având o aromă şi
gust plăcut. Prin metode chimice (extracţii acide, fracţionări etc.), K. Ikeda a
Aminoacizii intră În componenta proteinelor tproteinus (gr.) = primul), fiind reuşit să izoleze din algă acidul glutamic, substanţă Cll gust plăcut, folosit astăzi
substante necesare organismelor vii pentru mentinerea funcţiilor metabolice. ca potenţiator de aromă pentru preparatele din carne, dar şi În domeniul farma­
}
Proteinele contin În structura lor aminoacizi esentiali şi neesenţiali. ceutic.
Din cei 20 de aminoacizi proteici cunoscuti, 8 sunt esenţiali. Aceştia sunt: Glutamatul rnonosodic se obţinea industrial, de către companiile japoneze,
fenilalanina, izoleucina , leucina, lizina. metionina, treonina, triptofan, valina, prin extractie din proteine vegetale (grâu, soia etc.), Însă procedeul se realiza cu
H istidina este un arninoacid esenţial doar pentru sugari. Aminoacizii esenţiali nu pierderi mari.
pot fi sintetizati de organismul uman sau animal şi trebuie aduşi zilnic prin dietă. "ţ
Sinteza chimică totală este ineticientă, pentru că duce la obtinerea unui amestec
Necesarul de aminoacizi esenţiali pentru om este exemplificat În tabelul 111'. 6. .~l~ racemic de DL-acid glutamic neutilizabil, întrucât sarea sodică a acidului D-glu­
Restul aminoacizilor sunt neesenţiali, Întrucât pot fi sintetizaţi de organismul :~
" tamic este lipsită de gust.
uman din alte substrate. ;; izolarea În 1957, din mostre de pământ. a bacteriei Corynebacterium gluta­
)
miCiIIII, de către doi cercetători japonezi S. Udaka şi S. Kinoshita şi evidenţierea
Tabelul nr, 6 ;~: ;.t,
faptului că bacteria produce acid glutamic, a impulsionat producţia industrială a
Necesarul de aminoacizi esenţiali pentru om 'i, acidului glutamic, dar şi a altor aminoacizi.
·f
r'; S-au identificat ulterior o serie de microorganisme (bacterii, drojdii. mucegaiuri,
~J;:;~tlţj! :lJ~~:~:~~~jl~f·*:;,;.;:·; ';I';~,i~ ţ~~~'·:,;'i le~.~:!nlg~~~::~~ \~
'.'
,;, actinomicete) producătoare de aminoacizi. Cele mai bune tulpini producătoare de
aminoacizi sunt bacteriile ce fac parte din genurile: Corvnebacterium. Brevi­
1. Histidină 29 } bactcrium , Microbacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium etc .
2. Izoleucină 88 28 10 .i;.
Deşi aminoacizii se pot obtine prin hidroliza proteinelor vegetale şi animale,
3. Leucină 150 44 .14 "
~~,
'C" sau prin sinteză chimică, metodele sunt dificile, costisitoare şi neaplicabile la
4. Lizină 99 49 12 .~
scară industrială astăzi,
S. Metionină (şi cisteină) 72 24 13 ';j
Fenilalanină (şi tirozină) 120 24 14
.( Cele mai eficiente metode de obtinere sunt cele biotehnologice. Aceste procese
6. j
7. Treonină 74 30 7 'Il pot ti enzimatice, fermeruative cu precursori, fermentative directe, aşa cum se
8. Triptofan 19 4 3 !f poate observa În tabelul nr. 7 (modificat după M. Coman el ai., 2004).
9. Valină 93 28 13 J~ În ultimii 30-40 de ani cererea de aminoacizi a crescut dramatic, piata lor
10. Total aminoacizi esenţiali crescând cu 5-10% anual, Încât la aproximativ 10 ani ea se dublează. Cererile
715 231 86
(fără histidină) cele mai mari sunt pentru aminoacizii cu utilizare În industria 'alimentară şi În
zootehnie, aceştia având vânzările cele mai spectaculoase, dar şi preturi de cost
92 CĂTĂLlNA DANtELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 93

Tabelul nr. 7 Tabelul nr. 8

Metode de obtinere a aminoacizilor Aminoacizi produşi În mod curent

Nr.~n;l~~p~:;:~,UI"J.!,.' ' ,M~r~~::::~'~ 'Sub~trlit' . .r :J'ip de Nr,.

crt,
-_ ....
. -Cantitatea
(tone/an)
.' -
AiriÎiload~~1
.."

..' M~tQ!la " ..

, ..

Domenii
de utilizare
. , '

fermentaţie .•'. de obţinere

1. Acid L-Aspartic Acid Iumaric şi Industria al irneruară şi
Escherichia coli 1. 1.2(x),OOO Acid L-Glutamic Biotehnologie
amoniac farmaceutică
Acid fumaric şi Zootehnic,
Pseudomonas dacunhae 2. 800.000 L-Lizină Biotehnologie
amoniac Industria farmaceutică
2. . L-Alanină Acid lumaric şi [Proces enzirnatic Sinteză chimică Zootehnic,
Esrherichia coli 3. 55,000 DL-Metionină !

amoniac Procese enzimatice Industria farmaceutică

Pirocatehol, Zootehnie.
4, 40.000 L-Treonină Biotehnologie
3. L-DOPA Erwinia herbicola piruvat şi Industria farmaceutică
amoniac Industria alimentară şi
5. 16.CXlO Glicină Sinteză chimică
Acid farmaceutică
4. L-lzoleucină Bacil/lis subtilis
aminobutiric Industria alimentară şi
6. 14.000 Acid L-Aspanic Procese enzimatice
Hansenulla anomala Acid antranilic farmaceutică
Indoi şi DL- Biotehnologie Industria alimentară şi
5, L-Triptofan Escherichia coli Fermentatie cu 7. 13.000 L-f'enilalanină
serină Procese enzimarice farmaceutică
precursori
Corynebacterium Industria alimentară şi
Glicină 8. 4.500 L-Cisteină Biotehnologie
glyciniphylum Iarrnaceut ică
6, L-Serină Glicină şi Biotehnologie
Pseudomonas sp. 9. 2.000 L-Arginină Industria farmaceutică
metanol Extracţie
Corynebacterium Glucide şi acid Biotehnologie
7. Acid LsGlutanuc 10, 1.500 L-Alanină Industria al imentară
glutamicum acetic Procese enzirnatice
Corynebacterium Biotehnologie Zootehnic,
Il. 1.200 L- Triptofan
glutatnicum Glucide şi acid Procese enzimatice Industria farmaceutică
8. L-Lizină Brevibacterium acetic Biotehnologie
12. 1.200 L-Leucină Industria farmaceutică I
lactofermentum Fermentaţie Extracţie
Corynebacterium directă Biotehnologie
9. L-VaJină Glucide 13. 1,000 L-Valină Industria farmaceutică
glutamicum Procese enzimatice
Escherichia coli Biotehnologie
14. 500 L-lzoleucină Industria farmaceutică
Corynebacterium Glucoză Extracţie
10. L-Fenilalanină
glutamicum
II, L-Treonină Escherichia coli Glucoză, suc roză
Dinamica vânzărilor unor aminoacizi poate ti observată şi în figura nr. 20
(adaptată după C. Ratledge, B. Kristiansen (eds), 2006), unde cantităţile reprezintă
mai mici. Ceilalţi aminoacizi, mai ales cei de uz farmaceutic, au cereri mai mici tone pe an,
pe piaţă, dar şi preturi mult mai mari. Se estimează că piata aminoacizi lor se
ridică astăzi la aproximativ 5 miliarde $ anual.
Cantităţile de aminoacizi realizate anual cle diverse companii şi tehnologiile
lor de obtinere sunt prezentate În tabelul nr. 8.

.ltU
 Of'
;;,

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 95
94 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Tabelul nr. 9
3xl06~------------------ Utilizări terapeutice ale aminoacizilor

-----------j-Altele INr. I eri. Alhinoacidul l' U_~~tăr! tei:apeutiee I

1. Arginină Hepatoprotector, Detoxifiant În hiperamoniernie,
D,L-Met Sterilitate masculină (este o proteină spermatică)
2 x 1061 __1
2. Oruitină Hepatoprotector, Detoxifiant În hiperamoniernie
3. Acidul aspartic Hepatoprotector, Detoxifiant în hiperamoniemie,
Afecţiuni cardiace (ca transportor de K"' şi Mg!')
Hepatoprotector În iruoxicaţii cu arsen, cloroform şi
4. Metionină derivaţi de benzen,
L-Lys Terapia ulcerului (Împiedică actiunea histarninei),
Acidi liant urinar
5. Glutamină Terapia ulcerului
1 x 1 06,-------.----
6. llistidină Terapia ulcerului, Antioxidant.
Terapia anemiei (ajută la regenerarea hemoglobinei)
7. Acid glutamic Afectiuni neuronale
Afecţiuni pulmonare, Antioxidant.
L-Glu 8. Cisternă Antidot În intoxicaţii cu paracetamol,
Hepatoprorector În iruoxicaţii cu cianuri
9. Asparagină Diuretic
1982 1991 1998 2003 10. Izoleucină Soluţii nutritive i.v.
Il. Leucină Soluţii nutritive i.v.
Figura nr. 20 Dinamica vânzărilor unor aminoacizi 12. Fenilalanină Solutii nutritive i. v.
13. Prolină Solutii nutritive i.v.
Legendă: DL-Mcl - amestec racemic de metionină ; L-Ly~ - levo lizină ; L-Glu - acid levo
14. Valină Solutii nutritive i. v .
glutamic.
15. Treonină Solutii nutritive i.v.
Productia mondială de aminoacizi are câteva direcţii importante de utilizare: 16. Lizină Soluţii nutritive i.v.
17. Triptofan Soluţii nutritive i. v., Antioxidant.
• _ 66% din productia industrială este utilizată În zootehnie, la furajarea ani­ Afecţiuni nervoase (aruidepresiv)
malelor: 18. Tirozină Soluţii nutritive i.v., Precursor pentru L-OOPA
• _ 30 % din producţia industrială este utilizată În industria alimentară, sub 19. Serină Cosmeucă
formă de aditivi alirnetari ;
• _ 4% din producţia industrială este utilizată În terapeutică, ca principii active
şi suplimente nutritive. III .1 .. Blotebnologia -actdulul glutamic
Aminoacizii utilizaţi În terapeutică sunt indicati În tratarea anumitor afectiuni,
sin: acid glutaminic, acid n-arninoglutanc
exemplificare în tabelul nr. 9.
Datorită cererilor tot mai mari de aminoacizi, tehnologiile lor de obtinere sunt CSH9N04
Într-un continuu proces de dezvoltare şi îmbunătăţire. Utilizarea unor tulpini M, = 147,13
mutante înalt productive, înţelegerea mecanismelor de biosinteză şi utilizarea
HOOC---CH -CH ---'-CH--COOH
cunoştinţelor din domeniul ingineriei genetice fac ca productia industrială de 2 2 I
aminoacizi să fie un exemplu de integrare şi întrepătrundere a diverselor domenii
NH2
ştiinţifice.
 96 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 97

Acidul glutamic este un aminoacid neesential, fiind produs de organismul culinare japoneze şi chinezeşti. În prezent, această companie încă mai produce o
uman în cantităţi suficiente şi relativ importante. . treime din cele 1,2 milioane tone ale productiei mondiale de MSG.
Consumul zilnic de acid glutamic, provenit din alimentele proteice, variază Acidul glutamic se poate obtine astfel:
între 10-20 g, din care 1 g reprezintă glutamatul liber.
.:. extractie din 2.':!.!~s~_natu.I.~~ni!!lale(cazeină, cartilagii de bovine şi porcine
Alimentele ce reprezintă surse de acid glutamic sunt enumerate în tabelul nr. 10.
etc.) şi~.~~~~~!c:Jg)~t.~.n!"prote!!}~.9.in.Şoi;;: _g;Şe.u;:rd:eJa]abriCil~de~-i~Tl~I~~au
_'!!1li!i.0n etc.) - ast~~iar~a.pli(;atiţ_i!:l~i.~stria.Iă .~~9~~.~~~nd_Eo~turi de producţie
Tabelul nr. IO . foarte !~ari ; . - _.- _.
Conţinutul in acid glutamic al unor surse naturale .:. sinteză chimică tot_a.I!..RLeE~I!.d.Q~__ltI acri.!ol~iţr!1 - aplicaţie industrială foarte
~e(fusă ';' . . . _._-
N~fţtt;; F ,.' ,
.-.,.
.:; I:i1(;~.!.nologie..!.R!"!.!l_.f~rrr1e!1!ali<j unormutanţi d.e_CorYl1eb~/cte_riul/I glutamicum _
1. Mazăre verde aplicaţie industrială pe scară largă.
2. Ciuperci (Lentinus edodesţ 0,14
3. Tomate 0,14 Proprictăţl fizice, chimice, farmacologicc
4. Porumb 0,13
Acidul glutamic se prezintă ca o pulbere cristalină de culoare al.~ă,. cu_mjros
5. Sparanghel 0,14 . caracteristic şi gust_a_Eru. Din soj~i~ apoasă-alcoolică c~i~talizează în sistem
6. Brânză de vaci 0,6-1,2 ---oTi6roii1bic.-Are'-p.i. = 160oC, când se transformă în acid L-pirolidon carboxilic şi
7. Peşte 0,14 sublimează la 200oC.
8. Carne de pasăre 0,044 Acidul L-glutamic este solubil în apă în proportii diferite, în funcţie de
9. Carne de vită 0,033 temperatură: 8,64 g/l la i5oC:'2l ,86'gÎÎla50oC;"s5jigÎIÎa isuc şi 140,0 g/l la
1 o. Carne de porc 0,023 l()(l'C. Este insolubil în alcool, eter, acetonă, acid acetic glacial rece şi cloroform.
II. Extracte de carne 0,5 Soluţia sarurară are pH =3,2.
Sosul de soia Sub formă de sare sodică .- glutarnat monosodic (sin: MSG, C5HMNNa04•
12. I 0,8
(folosit În gastronornie) M, = 169, Il) se prezintă ca o pulbere cristalină albă, fără miros. Cristalizează sub
Sosuri de peşte formă de pentahidrat, care pe parcursul filtrării şi expunerii la aer se transformă
13. I
(folosire in gastronomie)
I 0,95
în monohidrat. Este uşor solubil în apă, la 200C are o solubilitate de 41, 7g1 100 g.
Soluţia 5 % are pH =6,8, iar solutia de 3 % are pH =7,0 la 250C. Se conservă ferit
de lumină. Echivalenta între acid glutamic şi glutarnat rnonosodic este: 32 g
Acidul glutamic a fost cJ..t::§~~:lJ.)!erj!_şj_i_Qţ:!ltjţ}9j:1_t_P~11!!:\:!_.p.ri!!I.~
cJ~~.i!!..glute.~l.~.de
glutamat de sodiu =25 g acid glutamic.
către H. Ritthausen în 1866. În 1883, E. Schultze şi E. Bosshardau au reuşit să-l
separe din sucul de sfeclă şi să-i descrie proprietăţile. Mai târziu, În 1890. L. Sub formă de clorhidrat (C/'9N04'HCI, Mr= 183,59) este uşor solubil în apă
şi apare ca plăcute ortorombice, de culoare albă, care se descompun la 2140C.
Wolff reuşeşte să sintetizeze acidul glutamic din acid levulinic.
Profesorul dr. Kikunae Ikeda a întreprins încă din 1907 cercetări privind Sub formă de brornoglutamat de magneziu monohidratat (CIOH'7BrMgN20~'
corelatia Între continutul în acid glutamic al unor produse alimentare japoneze şi H20, Mr =41 5,48) se prezintă sub formă de cristale ortorornbice (cristalizate din
gustul specific al acestora. EI identifică acidul glutamic în specii de Laminaria apă), care se descompun la 225-227°C. Este solubil În apă În proporţii diferite,
japonica şi pa tentează obtinerea lui. În funcţie de temperatură: 20,54 g/l la 250C, 49,34 g/lla 50oC, 118,6 g/l la
În 1917, la initiativa sa, firma Ajinomoto Co. Inc. asimilează şi pune la punct 750C, 284,9 g/l la l00oC. Este puţin solubil în alcool, eter, eter de petrol.
productia industrială a glutamatului de sodiu (monosodiurn glutarnate (engl.)­ Acidul L-glutamic este implicat în activitatea non~.!~!~JL~~!!!!~Qf.jlt:J:.Y.oase, în
sinteza OeAtp,-fii detOxi fierei·excesi.i·luTde-â;';;~niac.
MSG), prin izolarea din proteine vegetale (soia, grâu). În anii '20 compania
deţinea monopolul absolut al acestui produs, care s-a răspândit, în perioada -se-r;.;dT2(f,ltl~ăt-âinerÎtursincii-(;-;i~·îelâr~~;tfZt;: a surmenajelor psihice, a
interbelică, în toată Asia şi a devenit un ingredient de bază al preparatelor __
deQ~esi i lor, asteml1or, ....Q[ig9"Ji'enle 1 ŞI I ~JlrecorriâŞîCOi11allep~mca:-AiTîeflorează
----_ .. -__ .... _. ._
 "'Ii~:'

98 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 99

cl!I!acitatea funcţională a scoarţei cerebrale, influenţează favorabil memoria. Se Tabelul nr, 11

iml~ă, caact]uvant, JI1 tratamemulUi1oTfol:mede epilepsie (mlcUTrăuepiieiJtic). Microorganisme producătoare de acid glutamic
1n functie de sarea folosită are actiuni farlnacofogIcediverse: ,

- acidul glutarnic, ca atare, este indicat în tratamentul epilepsiilor, sindroamelor I Nr, crt.
1.
J' T!J)pÎna. prQ~ucătoare
Corvnebacterium glutamicum
.'
-r

nevrotice, surmenajelor psihice etc. ; 2. Brevibacterium [luorum

- sub formă de clorhidrat se indică ca acidifiant gastric În aclorhidrie, hipoclor­ 3. Brevibacterium lactoţennentum
hidrie, În dispepsii gastrogene, datorate absentei efectului inhibitor al acidului 4. Brevibaaerium divaricatum
clorhidric în special asupra microtlorei de putrefactie sau fermentatie, în 5. Brevibacterium amoniogenes
anemie pernicioasă etc. ; 6. Brevibacterium thiogenitalis
- sub formă de bromoglutamat de magneziu se indică ca anxiolitic ; 7. Microbacterium amoniophilum
- sub formă de săruri de calciu, potasiu, magneziu, sodiu se indică în deficitul 8. Corvnebacterium lilium
acestor minerale. 9. Corynebacterium callunae
10. Corvnebacterium herculis
Produse farmaceutice: 11. Corvnebacterium melassecola
12. Corvnebacterium alkanolvticum
GLUTAROM (Terapia - România)
dj. 400 mg acid glutamic; sol. injectabilă i.ll1. 10% glutamat de sodiu
MLJLTIGLUTIN (Terapia - România) Toate aceste tulpini produc acid glutamic cu randamente de 30-50-70 % din
fiole, sol. injectabilă i.Il1./i.v., glutamat de sodiu + potasiu + calciu glucozacollsumată~-'---
ACIDOPEPS (Sicorned - România) Acidul glutamic se_0line ,!.!!~ust!.l~I.J?ll!2._~~!!ivarea ~~():~_!~~\l.Xnalt__p!?­
cp., clorhidrat de acid glutamic 500 mg + pepsină 100 mg ~l!_c~i.~j_~~_'qbCYjfj!~ţerjuTII
glUIGfllkuJn:. pe_~~.9.~_de _cul_turii_~.~~.~~ll:
ACIDULIN (Eli Lilly - SUA)
- 2urse de carbon şi energie: cel mai adesea glucoză 10-12 %, dar şi zaharoză,
cp. 340 rng , 500 mg clorhidrat de acid glutarnic
fructoză, melasă, acid acetic, etanol;
GLUTAMAG + B6 (Sicorned - România)
- surse de azot organic: extracte de porumb, hidrolizate de soia, uree;
cps., glutamolactat de magneziu 304 mg + clorhidrat de piridoxină 62,5 rng
GLUBIFER (Terapia - România) - su~.şe-de _'!~ anorgallic: săruri de amoniu ;
dj., cp. filmare. 100 mg glutamat feros - . ~~y~i miner~e: sulfaţi şi fosfaţi de Ca, K, Mg;
GLUTAMAT FEROS (Biofarm - România) - ... oligo~t;!~!~!!Le: săruri de Fe, Zn, Mn, Co;
sol. buvabilă, glutamat feros -:_ ,biotină _- in cantităţi foarte mici.
PSYCHOVERLAN (Verla Pharm - Germania) Fermentatia este favorizată de o serie de factori, iar cunoaşterea şi aplicarea
cp., bromoglutamat de magneziu lor asigură productii mai mari de acid L-glutamic.
L-GLUTAMINE ( Jarrow Formulas - SUA) Astfel, anumite sursede carbQJ1 (gly_coza, D-riboza etc.) sunt mai bine asimi-
cp., cps., 1000 mg acid glutamic - supliment nutritiv late-'de-m;Ci'oorianis;~~i'produ-că~~)r:"~~~~' ce "~r~'-câ-;:e'iuiiăt-bi~sinte;-a~~~r
HORMOSTIN (Vita Care - Canada) ~~coricentnilii rTellcâte de~~i~~ L~gLlJJ!ll:nl~-"-----'-' - .. - .. '--.__ .- .. '---.- -' .....
cps. 500 mg acid glutamic - supliment nutritiv Un alt factor este ~"'~~{;
buna aerare.•, .••..•a- .•_-~
mediului de••...•.cultură, care favorizează acumularea
. __._---_ ,.._ •• _--~., •.. "•••.••. _"' .• -" .•._,~-•.• -.,# .. ,,_. ~-."", ,-,'-
L-GLUTAMINE (Organika - SUA) de acid L-glutamic. La concentraţii mici de oxigen microo~ganisl11ul produce acid
cps. 500 mg acid glutamic - supliment nutritiv ~~~~_ a~~cci~jCf;:;d~trin).ţ.w..yJ._ill;.id.kllYil..:;g1utaDlic. La concentrarii mari
de oxigen se acumulează c-cetoglutaratul, in defavoarea acidului L-glutamic.
'~Tehn~i~gi-;··de·I;'i~';il;t~~ă~.r~~idului glutamic
_ ',-;"~, •. , ~~""'.".J .,.'.•.. :~.,,<;-. ~ ••• 01" .~,.~.-:" .• ~.,.!t- •• ,..,,;_:',;ţ.;;.-!.- 4": •••••. .., Concentraţia biotinei în mediul de cultură este deosebit de iruportantă pentru
Acidul glutamic se obtine prin fe!2~len11ljia \!ll2.~.~licroorganisllle ce apartin mai acumularea acidului L-glutamic în mediul de cultură (tabelul 111". J 2).
mulLor specii (tabelul nr. TI).-- . . -- -------.- . - . . _
 ]00 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 101

Tabelul nr, 12
gIUCOZii~_~1 adăugare solutii NH40H
Concentraţia biotinei În mediul de cultură În functie ~ tampon
de conceruraţia sursei de carhon folosite (control pH)

'.~;.. ;;r;~f.~~"i·~~~:~~:~~~~;~;)~"~~:: dh~~t~iîi~şiffs;i;d~ C~b6~

(zah!lroZ~i) {']O)
nutricnti 'IJ;WI~"I {,ion';'M'I_1 ~"--~l
adăugare soluţii"j
1""""inoc~__

1. I 1,5-2,0 5

"1:
2. I 2,0 - 3,0 10
3. I 4,0 - 8,0 15
4. I 7,0 - 10,0 20

Biotina influenţează permeabilitatea membranei celulare În cursul migrării

glutamatuluiCîTil celu1ăÎii"liledii.iYde cul~;ă·. Cantităţ] mari de biotină nu permit ~_:L~J_
;';:;ig~a-n!â-;~idul~Ti-:'-giW:amic d-inTiiierr2r!!!._~e!~leip;~iitQa·re~cătr~~lediul de
[._- ••. biomasă
'culturlCaci!sta' ă(;Uii1Uiâmi-;;-se)~~'!<::.e.!.l!l'!r. Cp'!!tilă1U1J~ de bjmiQL1.~.Y_~!!i~r
9.ţ.fl~.km.1L!?jg.!inei (concentriii'i suboprimale), favorizează migra~e,! gtutamatului Figura 111', 21 Schema procesului de fermentaţie de la obţinerea acidului Lvglutamic
sj_ac.UJnIJJi![~a_1 'l..!.. Jn.)~~di u . __ ... ,----.. ' ." ,
Acidul L-glutamic se poate acumula şi in prezenta unui exces de biotină dacă Cantitatea de acid L-glutamic obţinută depinde de tulpina producătoare şi de
În mediul de cultură se~augă În faza e~ponenlială de creştere a microorga­ sursa de carbon utilizată (tabelul nr. 13).
nismului ~nicilină sau derivaţi de 3l.tiz.Lgraşi satUl'ati (tween 40, tween 60).
Adău ga rea 1l!~.!lM;ill~~j)l~ed.~~ de_..c:,!.!ţură~_î n J'c!ţll,!,ie creştere. a rnicrcorga­ Tabelul nr, 13
_~smuluil_Q!!~.J~-Înhiba~!! ...§i_nţ(!:z:ei.p~ _(;~h.!lar,_ţ\sţfel Încât memhrana ",:11 Cantitatea de acid L-glutamic obţinută in urma fermeruaţici unor microorganisme
celulară va fi sJ!PlJ.să _yari!!Iijlor ,.9imm.i.l;i!_,_ Prin urmare, se a~ază permeabi­ ... .-+ _-.
.',' ~ '. -
litatea
.~_ _._
membranei
.. _-..... celulare, iar acidul
""
L-glutamic se acumulează in mediul de Nr.crt,
" j_
Ţplpi)ia'
._.,·pi:oducăloare' , ,
CaDtital~ de acid
. L-~l!ltamic (gll). '
. Sursa ţie carbon
. , utjJiz;lt.ă
"
Adăugarea derivaţilor de acizi graşi saturaţi În mediul de cultură duce la 1. CoryllebaClerill/ll...f{ltllilllliclI/l1 50-60, glucoză 100 g/l
rno..~!!!~r~a ~.c!1lr~bruIu·i~clzi g!:.a~atu@ti~~<:~~~lurali.rf(:cun~_.şi a 2. Brevibacterium s~ 60 etanol
~~meruhx:anag;, ceea ce are ca rezultat a.!!~,@.rea I2~_<!bili.@ii rnern­ 3. Corvnebacterium alkanolvticum 40 zr-paraflne
branei ŞI deci posibilitatea migrării acidului L-glutamic in mediu.
;.;:

::_'~'I
4. Brevibacterium lactofcrmentum 60-70 glucoză 10-12 %
e
Cercetătorii japonezi au reuşit să obţină mutanti de Brevibacterium thiogenitalis ~
~t
dependenţi de acid oleic, care produc şi acumulează acidul L-giutalllic indepen­ \
Procesul se consideră terminat când continutul de zahăr este de 0,8-0,9%.
dent de concentraţia de biotină. La sfârşitul termentaţiei, mediul de cultură conţii:;;acidul L-glutamic sub
FITmentatia ~ste condusă În fermentatoare de capacitatea mare, de aproximativ i formă de glutamat cle amoniu.
500 nr'. Temperatura de fermentaţie este 31 (lC, mediul este bine aerat (1 1 aer/I Biomasa-de .~ pen"Lru a L~ă epuizată. În scopul
mediu/minut), iar pH-ul se menţine la 6:o-=7,"s',-ăTustarea' â~lizându-se
cr~ de filtrare biomasa se acidulează cu H2~Q4 până la un pH =6,5,

1
p_~i.n_.ad.ăl!~a..~~~_~?I~ti.~~J:i ~~e cultură (figura nr. 21). se tratează cu adiu~nti de filtrare şi se Încălzeşte la ~C pentru I h. După
Fermentaţia se realizează în două etape:
-------
- multipl~'!!:.~ microorganismului ---+ 10-12 ore;
~~ulare, se răceşte biomasa la .~.22°C şi se filtrează cu ajutorul filtrului
celular rotativ sau a filtrului presă.
- ,~c.!!_~ul~r:~_~~id~lui L-glutamic ---+ 20-23 ore. ~ohtinut se ~ În continuare cu ajutorul răşinilor schimbătoare
de ioni. Anion.ii glutamat se fixează pe răşină, iar cationii de amoniu sunt
~---- ---_, .- _-
102 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
ÎI~părtaţi şi recuperaţi prin distilare pentru a putea fi refolosiţi În procesul de
biosinteză. C~e-se eJueazăcu o soluţie de NaOH, anionii glutamat sunt
Îndepărtaţi de pe coloane, iar e~J va conţine glutamat monosodic.
Din eluat se ~c.t..glutamatulmonosodic, care se
decolorează şi
se purifică, pentru a corespunde cerintelor fannaceUtlCe. ._~
dratîecercetărilor specialiştilor de Ia Facultatea de Biotehnologii din cadrul
USAMV Bucureşti, s-a pus la punct şi În România biosinteza acidului L-glut<lmic.
Ca microorganism producător se folosesc tulpini rnutante de Brevibacterium
lactofermentum, care se cultivă pe un mediu format din: glucoză (IO-IS %),
extract de porumb (0,3%), uree (2-3%), fosfat monopotaslc (0-,1 %), fosfat
bipotasic (0:15%), sul fat de magneziu (O,OS %). Ferrnentaţia se conduce timp de
30-36 ore, În conditii de aerare puternică, când se obtin 60-70 g/l glutamat.
111.2. Biotehnologia L-Iizinei
, pretul de cost al L-lizinei a scăzut simtitor În ultimii ani. Dacă În 1995 L-lizina
sin: acid a, e-diaminocaproic, acid 2,6-diaminohexanoic
C{lH,4N202
M,= 146,19
H2N-CH2-CH2----CH2-CH2--iH--COOH
NH2
L-Iizina este un arninoacid esential pentru om, necesarul zilnic fiind de 12 mg.
A fost identificată în hidrolizate de cazeină, de către Drechsel, În 1889. Iniţial
a fost denumită .Jisatină", Însă în 1891 a primit numele de lizină.
L-lizina se poate obţine prin 3 metode :
• extractie din produsele naturale ;
sinteză chimică;
• biotehnologie fermentativă.
Extractia din produsele natura le se poate realiza din: caseină, gelatină, gluten
de grâu, soia etc.). Prin metode extractive se obtin compuşi optic activi (confi­
guratia L). Totuşi, sunt mai puţin utilizate astăzi, deoarece sunt neperforrnante
din punct de vedere economic, necesitând cantităţi mari de materii prime ce duc
la o producţiei redusă şi preturi de cost ridicate.
Sinteza chimică are dezavantajul obtinerii unui racernic, ce trebuie separat În
final în cei doi antipozi optici. lnexistenta unui procedeu chimic industrial pentru
MEDICAMENTE DE LlIOSINTEZĂ 103
separarea celor doi antipozi a tăcut ca sinteza chimică a Iizinei să nu aibă efectele
.econornice scontate. Metoda (ce pleacă de la caprolactamă) este complexă şi are
preţuri de cost ridicate.
Impasul a fost Înlăturat prin utilizarea metodelor enzimatice. Astfel, potrivit
procedeului pus la punct de INSA (Franta), lizina sintetică se combină cu un
compus X. L-Lizina şi D-I izina formează câte un complex cu acest compus X. O
enzimă irnobilizată scindează complexul L-lizină-compus X, eliberând L-Iizina,
ce se extrage ulterior cu solvenţi. Complexul D-lizină-compus X rămâne ca atare
(enzirna nu recunoaşte legătura din complexul cu forma dextrogiră şi deci nu o
poate scinda), Acest complex se izolează, se supune încălzirii pentru desfacere şi
D-lizina este reciclată.
Biotehnologia fermentativă are avantajul utilizării unor materii prime iefune şi
accesibile. Totuşi, metoda fermentativă duce la biosinteza unui complex de
aminoacizi. din care se separă la final L-Iizina.
Datorită pătrunderii pe piata farmaceutică mondială a producătorilor chinezi,
produsă de companiile din SUA şi UE se vindea cu 2,S $/kg, în 2007 L-lizina
produsă de companiile din China se vindea cu 1,2 $/kg.
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
L-Lizina cristalizează din apă sub formă de ace, iar din alcool diluat sub formă
de plăcute hexagonale. Se Închide la culoare la 210uC şi se descompune la 224,SoC.
Este foarte uşor solubilă în apă, insolubilă in solventi neutri comuni.
L-Lizina intră în componenta triptofanului şi a metioninei.
Sursele principale de L-lizină sunt brânza de vaci, carnea, peştele. Cerealele
sunt sărace În L-lizină. Insuficienţa L-lizinei În ratia alimentară are drept conse­
cinţă dereglarea circulatiei sangvine, micşorarea numărului de eritrocite in sânge
şi a continutului de hemoglobină, dereglări în calcitierea oaselor şi diverse
modi ticări patologice in ficat şi plarnâni.
lnsuficienţa L-lizinei la oameni provoacă cefalee, vertijuri, greaţă, vomă,
anemie, leucopenie.
.::: Sub formă de acetilsalicilat de lizină se utilizează ca antiinflamator, analgetic
şi antipiretic.
:~:.:
~I Produse farmaceutice:
ASPEGIC (Sanoti-Synthelabo - România)
flacon injectabil cu 900 mg pulbere acetilsalicilat de lizină
ASPEGIC 2S0. SOO (Sanoti-Synthelabo - România)
plic cu 4S0 mg, 900 mg pulbere acetilsalicilat de lizină, oral
 ''''1"'
I

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 105

104 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Tabelul IIr. 14
ASPISOL (Bayer Vital - Germania) Productivitatea unor mutanţi producători de L-lizină
flacon cu pulbere pentru adm. parenterală 0,9 g cu acetilsalicilat de lizină . .-_. - . ~ .. . _., ., .. -'
-- -- :' . .
'.~ .
DELGESIC 100, 500, 1000 (Sanoti-Avensis - Germania) Nr,c!1, !~Ipip~ ,: C~rll!ite,rul;ţlIlpjqij Randamentul in L~IQ;ină (%)
. ..
plic cu pulbere cu 180 mg, 900 rng, 1,8 g acetilsalicilat de lizină, oral Tulpina sălbatică
1. Al 1511 O
FLECTADOL 500, 1000 (Sanoti-Avensis - Italia) 2. Al 3445 AEC' 16
plic cu pulbere 900 rng , 1,8 g acetilsalicilat de lizină, oral 3. AJ 3424 AEC' Ala- 33
VENOPIRIN (Sanofi - Japonia) 4. AJ 3796 AEC' Ala- CCL' 39
fiole cu sol. i. v. cu acetilsalicilat de lizină 5. AJ 3990 AEC' Ala- CCL'ML' 43
MULTI- VITAMOL (Dr. Theiss - SUA) 6. Al 1204 AEC' Ala CCL'ML'FP' 50
sirop, 200 mi clorhidrat de lizină -1- vitamine -1- lecitină - supliment nutritiv Legendă: AlOC' - mutam rezistent la (SHII-aminoctil)-L-cistein~: Ala- - mutant ce arc nevoie
L-LYSINE (Organika - SUA) de L-alanină: CCL' - mutant rezistent la n-clorocaprolactama : ML' - mutam rezistent la
y-mctil-L-lizină; FP' - mutam sensibil la [J-tluoropiruvat.
cps. 500 mg lizină - supliment nutritiv

Tehnologia de hiosinteză a L-Iizinei
L-Lizina se obtine prin ferrnentaţia tulpini lor de Corvnebacterium glutamicum,
sau Brevibacterium lactcfermeruum. Pentru biosinteza L-lizinei se pot folosi şi
alte microorganisme, cum sunt: Artlirobacter cit rus , Trichospora cutaneum,
Hycobacterium tuberculosis ATCC 15073, Streptomyces coronoformis ATCC 15074.
Tulpinile utilizate pentru obtinerea mutanţilor apartin următoarelor genuri:
Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, COI)'lIelmc/eriul/'l etc. S-au obtinut
un număr mare de bacterii mutante prin:
• mutageneză indirectă ;
• selectia unui fenotip specific ;
• selectia celor mai bune tulpini producătoare.
La ora actuală se folosesc industrial tulpini mutante înalt productive. Aceste
tulpini sunt rezistente tată de analogii L-lizinei [(S)-(p-aminoetil)-L-cisteină;
y-l1letil-L-lizină; a-c1orocaprolactamaJ, astfel că ele nu mai sunt inhibate de
aceştia şi producţia de L-lizină este mai mare. Dezavantajul este timpul mai mare
de fermentatie, însă avantajele economice (productivitate mărită) sunt deosebite,
astfel că acum se folosesc doar tulpini mutante. Productivitatea unor mutanti utilizaţi
pentru biosinteza de L-Jizină se observă în tabelul 111'. 14 (după C. Ratledge,
B. Kristiansen (eds.), 20(6).
Mutanţii producători obtinuti prin procese de mutageneză şi prin tehnologia
ADN-ului recornbinant sunt capabili să biosintetizeze 80 g/l L-lizină cu o pro­
ductivitate de 3 g/l/h L-lizină. O serie de mutanţi pot elimina extracelular mai
mult de 170 g/I L-lizină.
Aminoacizii sunt folositi de celule pentru sinteza proteinelor şi de aceea, în
Mecanismele reglatoare de control sunt eficiente. pentru ca bacteriile (rulpinile
sălbatice) să producă aminoacizi strict pentru necesarul propriu.
Mecanismul molecular de export extracelular al aminoacizi lor era necunoscut
până în 1996, când s-a reuşit identificarea carrier-ului pentru lizină şi cercetarea
lui. Carrier-ul pentru L-lizină este LysE, o proteină rnernbranară mică de 25,4 Da.
Prezenta ei în celula producătoare asigură eliminarea extracelulară a L-lizinei. În
lipsa acestui carrier L-lizina se acumulează intracelular şi provoacă moartea
celulei datorită prezentei ei în exces.
Initial L-Iizina se obtinea printr-un proces fermentativ în 2 etape, pus la punct
de cercetătorii de la Pfizer în 1956. În prima etapă se obţinea acidul diarnino­
-pimelic (DAP) prin ferrnentaţia unor tulpini de E. coli pe un mediu cu exrract de
porumb şi săruri minerale, iar în a 2" etapă se adăuga şi o cultură de Aerobacter
aerogenes, continuându-se fermentatie. Această bacterie produce enzima DAP-decar­
boxilaza, care realizează decarboxilarea DAP şi duce la formarea L-lizinei. Astăzi
metoda este abandonată, fiind mai scumpă.
Fennentatia Într-o singură etapă a fost pusă la punct de S. Kinoshita şi colab.
în 1958, fiind aplicată industrial din 1960 de către firma Kyowa Hakko Kogyo.
Metoda utilizează mutante auxotrofe de Corynebacterium glutamicum, depen­
dente de unii aminoacizi.
Thlpina (o mutantă auxotrofă dependentă de biotină şi homoserină) este
cultivată pe un mediu format din surse de carbon, de azot, săruri minerale şi
aminoacizi (treonină, metionină, homoserină). Fermentatia se realizează aerob,
la 24-370C, la pH =5-8,5 timp de 4-5 zile. La sfârşitul procesului se acumulează
în biornasă 20-25 g/I L-lizină.
A Biomasa obţinută se filtrează, iar din filtrat se separă L-lizina prin adsorbţie
:~~

mod normal, bacteriile nu excretă cantităţi mari de aminoacizi. Bacteri ile nu ,J' pe răşini schimbătoare de ioni, eluţia coloanelor realizându-se cu o bază slabă,
"1 după care se concentrează eluatul şi cristalizează L-Iizina.
secretă nici surplus de aminoacizi, ei tiind imediat folositi în sinteza proteinelor.
 106 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE HIOSINTEZĂ 107

L-lizina se obţine la ora actuală din mutanţi înalt produc tivi de Corynebac­ Aeratia optimă (48-50 mg 02 dizolvat/l/min.) conduce la cantităţi maxime de
terium glutamicum cultivati pe medii de cultură propice pentru obtinerea unor L,-lizină biosintetizată. Concentrarii mai mici de 02 orientează biosinteza spre
cantităţi mari. alanină, valină şi acid lactic.
Randamentul procesului şi viteza de fermentaţie sunt influentare de: Pe parcursul fermentaţiei pH-ul trebuie menţinut ÎJl limite de 6-7. În prima
parte a biosiruezei pH-ul optim este de 7-7,2, iar după inceperea biosintezei
• compozitia mediului de cultură;
L-lizinei şi spre sfârşit este de 8-8,2.
• aportul de oxigen;
lemperatura optimă de biosinteză este de 32oC. Alte valori de temperatură
• pH;
(mai mari, sau mai mici) duc la scăderea randamentelor În L-lizină.
• agitare ;
La sfârşitul fermentatiei L-lizină se găseşte În mediul de cultură sub formă de
• temperatură;
sul fat. Procesul decurge cu randarnente de 45-50 g L-lizină pentru fiecare 100 g
• durata ferrnentaţiei.
sursă de carbon.
Compozitia mediului de cultură este hotărâtoare pentru biosinteza L-lizinei. Biomasa obţinută se clarifică, după care se filtrează în vederea indepărtării
EI trebuie să conţină : masei celulare epuizate.
Filtratul limpede obţinut se trece peste coloane cu răşini schimbătoare de ioni
». surse de carbon: melasă (În funcţie de calitatea ei se obtin 40-45 gll L-lizină,
(cationiţi puternic acizi), care sunt eluate cu soluţii de amoniac. Eluatul se
30-40 gll L-lizină). glucoză, fructoză, sucroză, hidrolizate de amidon, acetaţi
concentrează, se tratează cu acid clorhidric şi se obţine monoclorhidratul de
(I ,5 % concentratie În mediu), acizi organ ici (10- 15 % concentraţie în mediu) ;
L-lizină.
);- surse de azot organic: extracte de porumb bogate În aminoacizi, extracte de
Concentrarea ulterioară duce la apariţia cristalelor. Cristalizarea se perfectează
cartofi, şroturi de soia. hidrolizate de gluten. făină de peşte, extracte de
cu alcool etilic 96%. Se recristalizează Lvlizina. când se obtine produsul de
peşte;
puritate 98,5% cu un randament global de 52,5%.
;.... surse de azot anorganic: săruri de amoniu (1,2-3.5 %), amoniac sub formă de
Fluxul tehnologic de obţinere a L-lizinei de uz farmaceutic se poate observa În
gaz sau soluţie apoasă;
figura nr. 22.
;.... săruri minerale: fosfaţi, sulfaţi de Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, K;
Izolarea şi purificarea L-lizinei se realizează diferit În funcţie de utilizarea
;.... aminoacizi: biotină şi homoserină (esenţiale pentru biosinteza L-lizinei),
dorită:
leucină, izoleucină, merionină (cresc excreţia L-lizinei în mediu).
• clorhidrat de L-lizină 98,5 % (cristale) - izolarea L-Iizinei prin cromatografie
Sursele de carbon cele mai utilizate sunt melasa , sucroza şi hidrolizatele de
cu răşini schimbătoare de ioni, urmată de evaporarea eluatului şi cristalizarea
amidon. Utilizarea melasei, deşi este O sursă ieftină de carbon, are câteva
finală (sau direct atomizarea eluatului) - uz farmaceutic;
dezavantaje:
• concentrat alcalin cu 50.7% L-lizină - separarea biomasei prin filtrare,
• stocarea melasei pe perioade îndelungate (datorită caracterului sezonier al evaporarea liltratului şi filtrare finală - uz tehnic;
producţiei fabrici lor de zahăr) duce la scăderea calităţilor ei ; sulfat de lizină 50% (granule) - Întreg mediul de fermentatie se atomizează şi
• costuri suplimentare prin cumpărarea melasei de la producătorii de zahăr. se granulează pulberea obţinută - furajeră.

În primele 24 ore ale ferrnentaţiei consumul de glucide este mic, dar În Aceste modalităţi de separare diferă prin costuri, timpi de lucru, pierderi de
perioada de creştere logaritmică a masei celulare (următoarele 24 h de ferrnen­ substanţă, cantitatea de L-lizină obţinută şi puritatea acesteia. Diverşi producători
taţie) consumul creşte foarte mult. Ulterior, consumul de glucide scade. Pe apelează la modalităţi diferite de separare, în funcţie de util izarea produsului
parcursul etapei de biosinteză a L-lizinei (după 40 h de fementaţie) concentrat ia final.
de glucide În mediu trebuie să tie de 2,5-3 %. in ţara noastră obţinerea industrială prin biosinteză a L-lizinei s-a realizat pe
Datorită costurilor mari ale surselor de azot folosite, Ierrnentatoarele se medii de cultură ce conţineau: 3 % exrract de porumb, 10-12 % melasă, 3 %
alimentează continuu cu nutrienţi până la atingerea unor cantităţi de 170 g/l săruri de amoniu, 0,02 % sulfaţi de Zn, Mg, Mn. 1% CaCO), 0.2 % ulei. Prin
L-lizină. mutageneză cu radiaţii UV şi cu nitrozoguanidină s-a obţinut o mutantă auxotrofă

,""';k;
 '~l'"',
"

I
I
108 CĂTĂLlNA DANIELA STAN I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ t09

o, i de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13896, care producea 35-45 g/I L-lizină.

surse de carbon I .Acest procedeu s-a realizat la Antibiotice laşi, încă din 1973, obţinându-se
sUI~cdCilzut I Ft:'rllli4.·nl~--~C02 L-lizină furajeră (atomizarea biomasei pe suport de carbonat de calciu).
La ICCF Bucureşti s-a pus la punct izolarea şi purificarea din mediul de
l!f.!._..[ CI!Jrific~rl' I I cultură a L-lizinei, pentru obţinerea produsului de uz farmaceutic.
I În Europa, singurul producator de Iizină este societatea Eurolizina din Amiens,

. .E~~~{
I J--~ I
Franta, care lucrează după un brevet japonez, producând - 11.000 tone/an
L-lizină.

=r-
Ffftr arv II'I;lS[1 bactcriauă

Pe plan mondial, Japonia este cel mai mare producător de L-lizină, aceasta
fiind obţinută prin procese ferrnentative continue.
Gds(lrl~k 'JI.' •..•\şilli ]
I În ultimii ani s-a pus la punct un proces ferrnentativ de producere simultană a
,ul Nlll )"~

--__._-~CI)CSflrl'lll'
.. _J-_'-J'-- L-lizinei şi a acidului gluramic. Procedeul foloseşte o tulpină producătoare de
L-lizină şi metodele ferrnentative de obtinere a acidului glutamic (fermentatia în

-=r--- prezenta unor tensioactivi, sau a penicilinelor). Productivitatea procesului este

mare, rezultatele obţinute fiind foarte promiţătoare.
I
--r----·
CUIICl'~--]-----~NHJ,H20

""-f- ""jo.;;-J 111.3. Biotehnologia L-treoninei

'----1 sin: acid c-amino-Bshidroxibutiric

C..2.f..._~
tiv 1.
._---[--Dcculorar c

C4HqNOJ
M, = 119,12
~(rHrt'~--,_.(" epuizat

_L
c=5'CIIIt:C~ '-'--"~H'lO
OH
,
O
I
CH C
al"",1 'Im.
------~
l----J---1
Crls tullzure I
/""/",,
sol NI11 25% - --r-----· H3C CH
i
OH

------ [Di;~~~~~!_J
-··i~k;l(IÎ:(}(:'~~~· ••
I NH2
-_j----
~Inlrl' }--.- •. H20 ,:dellul

L-Treonina este un aminoacid esential pentru om.

A fost identificată în proteinele din cereale (ovăz) de către 8. Schryver şi H.
----1'--
C~~~I--- ",0
. W Buston în 1925. Mai târziu (1935), Wc. Rose reuşeşte să o izoleze din fibrina
sangvină,
Ctortndrat de 1.-li:t.ină 98.51,11.,

Figura nr, 22 Fluxul tehnologic de obţinere a L-lizinei de uz farmaceutic

 "!("I~ ~I'"
_-:;i_' [fi
.:~~;
i .:
i
i11;

IlO CĂTĂL1NA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ III

Aspartat
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice uspartat

L-Treonina se prezintă sub formă de cristale incolore, ce se descornpun la 225- 1 kinaza

257oC. Amestecul racernic este sub formă de cristale ortorombice, care se Asparti I fosfat
descompun la 229-230oC. Este uşor solubilă În apă şi insolubilă În solvenţi neutri
comuni. 1
Se utilizează pentru alimentatia parenterală, sub forma unor solutii nutritive [ Lizina [--- Aspartat semialdehida
complexe, În asociere cu vitamine, minerale, electroliţi etc. Intră În compozitia IIJlA 1 dchidrogenaza
homoserin
multor preparate utilizate ca suplimente nutritive, alături de alti aminoacizi şi
vitamine. Hcmoscrl na
h "il
f I
1 hOlllos.-erill
kinaza
Produse farmaceutice:
Homoseri n fosfat
MECOPAR (Biofarrn SA - România)
cps.. aminoacizi esentiali + vitamine - supliment nutritiv tll"':;1 treonin
suuetaza
INFESOL 40 (Berlin-Chernie Menarini Group - Germania) --·TREONINA
- ..._.. . · ·.---1
sol. perfuzabilă , nacon 500 mi, aminoacizi + minerale
AMINOSTERIL (Fresenius - Germania)
l -----_ _- .•
treonin
sol. perfuzabilă, aminoacizi + electroliţi + vitamine 1 dehidrogenaza
AMINOPLASMAL (B. Braun - Germania) r--;~:::-;··-·-··"-."":-I
sol. perfuzabilă, aminoacizi + xilină + electroliţi + vitamine ~cucil~

Tehnologia de biosinteză a L-treoninci Figura ur, 23 Schema de biosinteză a L-treoninei in celula de E. coli

Producţia comercială de L-treonină se realizează cu mutanţi de E. coli. Biosinteza

L-treoninei la nivelul celulelor producătoare se realizează în 5 etape (fig. nr. 23).
Primele etape sunt comune cu biosinteza L-lizinei şi a L-metioninei, iar L-treonina
este şi intermediar în biosinteza L-izoleucinei.
Ţinând cont de aceste date, ruutantii utilizaţi la nivel industrial trebuie să
îndeplinească câteva criterii, pentru ca biosinteza să tie orientată preponderent
spre L-treonină :
Mediile de cultură utilizate contin drept surse de carbon ne glucoza. fie
sucroza, extracte de drojdii ca surse de azot. săruri minerale. amoniac sau solutie
de NH40H pentru controlul pH-ului etc. Pe parcursul ferrnentatiei mediul de
cultură este alimentat continuu cu surse de carbon, astfel încât microorganismul
producător să aibă la dispozitie surse de energie.
Fermentaţia se realizează pe parcursul a aproximativ 77 ore, la sfârşitul ei
L-treonina găsindu-se în mediu în proporţie de -100 gll, cu un randament de ':)1

• să nu producă L-izoleucină, adică treonin dehidrogenaza, enzimă ce catalizează conversie de până la 60 %.

transformarea L-treoninei în L-izoleucină, să tie inactivă;
să conţină un nivel înalt şi stabil al thrABC-operoni relevanţi pentru biosinteza
Ltreoninei în celula de E. coli.
Sursele de carbon utilizate În mediile de cultură industriale sunt relativ scumpe,
ceea ce are o influenţă covârşitoare asupra pretului de cost al aminoacidului
biosintetizar. Tulpinile mutante de .E. coli nu sunt capabile să utilizeze sucroza,
La sfârşitul fermentaţiei, biornasa se Încălzeşte şi se tratează cu acid pentru
facilitatea coagulării proteinelor, uşurăndu-se astfel liltrarea. Filtratul obtinut se
concentrează. iar prin răcire va cristaliza L-trconina. "it,
,. ;,
Cristalizarea se realizează uşor, (inând cont de solubilitatea redusă a L-treoni­ ':~
nei şi de concentraţia mică a sării de L-treonină prezentă În mediul de cultură.
-s
Separarea şi cristalizarea L-treoninei se realizează cu randamente de 80-90%.
1ţ.•.~
- L-Treonina astfel obţinută are o puritate mai mare de 90%. Pentru puritate
i~

aşa cum se întâmpla cu tulpina originală producătoare de L-treonină. Prin mutaţii

genetice s-a reuşit introducerea unor gene caracteristice în celula de E. coli astfel
;t
t,
. avansată se recristalizează, când se obtin valori de 99% .
. ! r~;

:':11
încât celulele au devenit capabile să utilizeze sucroza.
:\: :'ft~·
:';:;t
"'It
~':\:!1i~
:~~(~
 "r"·"'\
1"
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 113
112 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
I
OPTIMAX (Merck Serono Ltd. - Anglia),
cp. 500 mg
111.4. Biotehnologia L-triptofanului PACITRON (Sanofi-Avensis - Franţa)
cp. 500 I11g
sin: acid l-a-aminoindol-3-propionic, indolilalanină
pulbere pentru soluţii orale, tlacon 500 g
C"H'2N202 NEUROMED (Rhone-Poulenc - Australia)
M, = 204,22 cp. 500 I11g
COOH SEDANOCT (Woelm - Germania)
cp. 500 mg
TEMPIDORM (Roland - Germania)
NH2 cp. 500 I11g
TRYPTO-SLEEP (Vitaplex - Australia)
cp. 500 rng rriptofan + vitamine complex B + minerale - supliment nutritiv
L-Triptofanul este un aminoacid esenţial pentru om, fiind un precursor al TRYPTOPLEX (Tyson - SUA)
serotoninei (mediator chimic). cp. 500 mg, triptofan + piridoxină + acid nicotinic - supliment nutritiv
Initial a fost izolat din cazeină de către EG. Hopkins şi W. Cole În 1902. TRYPTACIN (Arther - SUA)
Este prezent În albumină (1,3 %), cheratină (1,8 %), cazeină (2,2 %), herno­ cp. - supliment nutritiv
globină (3,61 %) şi lipseşte din gelatină. ORGANONEURO OPTICO (Gross - Brazilia)
cp., triptofan + vitamina A, B2' B(o + acid ascorbic - supliment nutritiv
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice PROMELAlDNIN (Laborest - Italia)
Se prezintă sub formă de plăcute sau cristale lamelare când cristalizează din cp., triptofan + magneziu + acid nicotinic - supliment nutritiv
alcool diluat. Cristalele sunt incolore şi se descompun la 289°C. Este solubil În
Tehnologia de hiosinteză a L-tripfofallllllli
apă în proportii diferite, în functie de temperatură: 8,23 gll la OoC; 10,57 g/l
la 20oC; 11,36 g/lla 250C; 17,06 gllla 50oC; 27,95 g/lla 750C; 49,87 g/l Productia industrială se realizează cu tulpini mutante de E. coli, Corynebacterium
la 100oC. glutamicum, Bacil/LIS subtilis .
Este solubil în alcool la cald, în hidroxizi alcalini şi insoluhil în cloroform. S-au realizat o serie de progrese pentru creşterea cantităţii de aminoacid
L-Triptofanul este un aminoacid foarte scump, care se obţine În cantităţi biosintetizată de Corynebacterium glutamicum. Sinteza de L-triptofan a fost
relativ mici (-1200 tone/an) şi exclusiv prin biotehnologie fermentativă cu crescută introducând În tulpina sălbatică de Corynebacterium glutamicum o genă
precursori. ce codifică antranilat sintetaza (ANS), enzimă ce intervine În biosinteza rriptofu­
Se utilizează cu precădere în zootehnie, dar şi În industria farmaceutică, fie ca nului. Cantitatea de Lvtriptofan produsă de tulpina mutantă a crescut cu 130%,
solutii nutritive i. v., fie ca antioxidant, tie În tratamentul insomniilor, depresiilor, aşa cum se poate vedea În tabelul 11f. 15 (adaptat după B.R. Glick, J.J. Pasternak
schizofreniei şi a altor tulburări neuropsihice. (eds.), 2003). Cantităţi şi mai mari se pot obtine dacă rnutanţii contin şi celelalte
2 gene ce codifică cele 2 enzime care mai intervin în biosinteza triptofanului
Produse farmaceutice: (deoxi-arabino-heptulosonat fosfat sintetaza, antranilat fosforibozil transferaza).
ARDEYTROPIN (Ardeypharm - Germania) Procesul industrial este o biosinteză enzimatică, ce utilizează surse de materii
cp.500 rug prime ieftine (precursori) care se transformă în L-triptofan cu ajutorul unei
ATRIMON (Asta Medica - Germania) enzime specifice. Procesul decurge cu randamente mari, iar L-triptofanul obtinut
este de puritate mare. Biosinteza se bazează pe activitatea triptofan-sintetazei,
cp. 500 mg
KALMA (Stada - Germania, Austria) enzimă care catalizează transformarea indol-3-glicerol fosfatului şi a L-serinei În
L-triptotan (aşa cum se poate observa În figura 11f. 24 şi în figura nr. 25).
cp. filmare 500 mg
 MEOICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 115
114 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Tabelul nr. 1S L-Serina astfel purificată se adaugă peste celulele de E. coli pre-cultivate în
Caruitatea de Ltriptofan obţinută prin cultivarea în conditii standard . fermentator, iar indolul se adaugă continuu în biomasă pe parcursul fermentaţiei,
a unor tulpini de Corynebacterium glutamicum astfel încât concentraţia sa în mediu să fie de 10 l11M. Conversia indolului în
.. .' -; . . .:~- ~ L-triptofan este cantitativă, acesta formându-se cu o rată de -75 g/l/zi.
·Nr;crt. ,'ŢjJip~~·r,':; " . ,,'4=!onceptţatia' de u,~iptor: La sfârşitul ferrnentaţiei mediul de cultură se filtrează, pentru îndepărtarea
" (:
","" ": (~~~l~>' biomasei, iar filtratul se decolorează cu cărbune.
1. ulpina sălbatică 0,48 Din filtratul decolorat cristalizează L-triptofanul, se filtrează suspensia, iar
2, ulpina sălbatică clonată cu gena ANS 1,12 precipitatul obtinut se usucă, se cerne, urmând să se prepare o solutie sterilă de
L-triptofan de uz farmaceutic.
triptofan Schema procesului de obtinere a L-triptol'anului plecând de la L-serină şi indoi,
Indol-3-glicerol fosfatul sintetaza ,
indol + gliicera Id eliI id a-3-foslatu
.. I folosind mutanţi de E. coli pre-cultivaţi, este prezentată În figura nr, 26 (adaptată
(subunitatea al după C. Ratledge, 8. Kristiansen (eds.), 20(6).

inclusă mutanţi de E cr.li

triptofan
ce conţin
sinietaza
Indoi, + t-serină triptofan sintctuza
L-triptofan + H20
(subunitatca 1~2)

Figura 111'. 24 Schema reacţiilor catalizate de triptofan sinteraza

cromutografie cromatogrutic
de cxcludcrc schimbătoare

y
HOHnCH20P ionică de iuni
COO
~O '\ COO

rgd NH
+
HOH2C

NH3
+ triptofau
sintel,ml VNl ~H3
+

L-scrin[1
indol

1
iudol-J-gticcro! tosfatul 1.-sefiTlfl L-triptofun
bctaină T
...ahăr
1
scrină 1 filtrare. decolorare. cristalizare

Figura nr, 25 Reactia simplificată de obţinere a L-triptofanului

1
uscare. ccmerc, condiţ ionarc
Enzirna este produsă de E, coli, tiind un al31-tetramer ce se poate disocia În
unităţile sale funcţionale, subunitatea uşi subunitatea 132, Subunitatea a catali­ 1
zează scindarea indol-3-glicerol fosfatului, în timp ce subunitatea catalizează r~2 L-triplofan

condensarea L-serinei cu indolul, când se formează Ltriptotanul. De fapt, această Figura IIr. 26 Schema obtinerii L-triptofanului cu rnutanţi de E. coli pre-cultivaţi
ultimă reacţie se utilizează la nivel industrial, folosind materii prime adecvate şi
ieftine.
În scopul reducerii costurilor şi al controlului mai eficient al procesului
Se utilizează tulpini rnutante de E. coli, ce contin enzima triptofan sintetaza cu
industrial, se utilizează în ultima vreme, celule de E. coli (ce contin enzima
activitate Înaltă,
triptofan sintetaza) imobilizate pe SUP0rl solid. Pentru a creşte permeabilitatea
Indolul provine din industria petrochimică, fiind o materie primă ieftină, iar
mernbranei celulare şi deci difuzia enzimei , este totuşi necesar adaosul de solventi
L-serina este recuperată din mei asa rămasă de la rafinarea zahărului din sfeclă
sau de surfactanţi În mediul de cultură. Celelalte enzime ale celulei sunt distruse,
prin cromatografie de excludere ionică (ion-exclusion chromatography) şi croma­
fie prin căldură, fie prin adosul de solventi specifici.
tografie schimbătoare de ioni (ion-exchange chrornatography).
 _~P:1'

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 117

116 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Este un aminoacid esenţial pentru om. L-Fenilalanina a fost izolată iniţial din
Unii producători (compania japoneză Tanabe Seiyaku) utilizează o amino­
muguri de lupin (plantă din America de Nord din genul Lupinus fam. Fabaceaeş
acilază imobilizată prin legare ionică pe suport polimeric (DEAE-Sephadex),
de către E. Schulze şi 1. Barbieri în 1879.
într-un proces de operare continuu, pentru biotransformarea DL-aminoacizilor
aci laţi în L-triptofan (figura nr. 27). lzomerul nedorit se racernizează in situ cu Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
ajutorul unei racemaze specifice (produsă de tulpini de Amycolatopsisi cu randa­
merite de aproximativ 45 %. L-Fenilalanina se prezintă sub formă de plăcute cristalizate În sistem monoclinic,

RyCOOH . '1 -
amll10aCI aza ~
(soluţie tampon)
R
y COO
+
R~COOH
sau cristale lamelare atunci când cristalizează din soluţie apoasă concentrată
caldă. Se prezintă sub formă de ace hidratate, când cristalizează din soluţie
apoasă diluată. Are p.t. =283(1C (cu descompunere). Sublimează in vacuo.
Este solubilă În apă, în proporţii diferite, în functie de temperatură: 19,8 g/Ila
NHAc NH3 + NHAc oOc, 29,6 g/iia 250c, 44,3 g/l la 50oC, 66,2 g/iia 750C, 99.0 g/iia lOOoC. Este
l.-ami noac id n-ami noacid uşor solubilă în metanol şi etanol.
D,L-aminoacid aci lat
Amestecul racemic se prezintă sub formă de cristale lamelare monoclinice sau

l_
raccmază
Figura nr. 27 Obţinerea L-triptofanului cu ajutorul arninoacilazelor
Aminoacilaza comercială provine din celule din rinichi de porc sau, cel mai
adesea, din celule de Aspergillus oryzae . Procedeul industrial al companiei
japoneze foloseşte coloane împachetate cu aminoacilază de Aspergillus orytae
imobilizată. Alte companii (Degussa, Germania) utilzează aminoacilază de Asperglllus
oryrae liberă, În bioreactoare tip membrană. L- Triptofanul obtinut se separă
ulterior pe o coloană cu schimbători de ioni.
Folosind ca substrat diverşi aminoacizi acilaţi, compania Tanabe Seiyaku pro­
duce cantităţi importante de L-triptofan (5-20 tone/lună) prin procese enzimatice.
Tot astfel se pot obtine şi alti aminoacizi de puritate foarte mare: L-metionina,
L-fenilalanina, L-valina etc.
prismatice atunci când cristal izează 'din apă sau alcool. Cristalele au gust dulce,
sublimează in vacuo şi au p. t. =271-273°C (cu descompunere). Amestecul race­
mic este solubil în apă în proporţii diferite în funcţie de temperatură şi este
insolubil în eter.
D-Fenilalanina se prezintă sub formă de cristale lamelare atunci când crista­
lizează din apă. Are p.t. =2850C (cu descompunere). Este puţin solubilă în apă,
Ig în 35,5 mi apă la 16°C şi foarte putin solubilă În rnetanol sau alti solventi
organici. Se poate biotransforrna În organismul uman În L-fenilalanină.
Produse farmaceutice:
INFESOL 40 (Berlin-Chernie Menarini Group - Germania)
sol. perfuzabilă, flacon 500 mi, aminoacizi + minerale
AMINOSTERIL (Fresenius - Germania)
sol. perfuzabilă, aminoacizi + electroliţi + vitamine
AMINOPLASMAL (8. Braun - Germania)
sol. perfuzabilă, aminoacizi + xilină + electroliti + vitamine

Tehnologia de biosinteză a L-fenilalaninei

111.5. Biotehnologia L-fenilalaninei
Se realizează cu mutanţi de E. coli al căror metabolism a fost modificat prin
sin: acid a-amino-l3-fenilpropionic, acid a-aminohidrocinamic inginerie genetică, În scopul folosirii raţionale a surselor de carbon pentru a
favoriza conversia glucozei în L-fenilalanină.
CqH11N02
Mr = 165,19
o La concentraţii mari de glucoză microorganismul are tendinta de a produce
acid acetic. Acesta determină un puternic efect negativ asupra productiei de
r L-fenilalanină. Pentru a preveni formarea acidului acetic, pe lângă folosirea
'OH tulpinilor modificate genetic, se aplică şi o strategie de fermentaţie eficientă
astfel Încât concentraţia de glucoză, concentratia de O, şi concentraţia biomasei
să tie monirorizată atent pe tot parcursul fermentaţiei. -În figura nr. 28 (adaptată
NH2
 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE IJIOSINTEZĂ 119
118

după e. Ratledge, 8. Kristiansen (eds), 2(06) se poate observa graficul celor 4 stadii
de fermentaţie. Este evidenţiată corelaţia factorilor ce influenţează biosinteza şi .IIl.6. Biotehnologia acidului L-aspartic
care favorizează obţinerea unor cantităţi mari de L-fenilalanină Într-un timp cât
mai scurt. sin: acid asparaginic, acid asparagic, acid n-aminosuccinic

SladiullV
C4H7N04
Stadiul II Stadiul Il Stadiul III
Mr = 133,10
»:
o
fenilalanină
HO~OH
oxigen
dizolva! O NH2
--_._--/---_._-----,----.......... .
biomasă -_
Acidul L-aspartic este un aminoacid neesential. S-a obţinut iniţial prin hidroliza
acidă a asparaginei de către A. Plisson în 1827, ulterior tiind izolat din proteine

glucoză 11 '~~'~~ii--
de către H. Ritthausen în 1868.

Proprietăţi fizice, chimice, farrnacologice

Acidul L-aspartic se prezintă sub formă de cristale larnelare ortorornbice
/acid
bisfenoidale ce au p.l. =270-271 (le. Este solubil în apă 1 g/222,2 mi la 200C şi
__ ..
acctic
L__________I
1 gll49,9 mIla 30°e. Formează uşor solutii suprasaturate. Este solubil in soluţii
Timpul de fcrmentanţic acide, bazice şi în prezenţă de săruri. fiind insolubil în alcool.
Acidul Dvaspartic este mai puţin răspândit În natură comparativ cu acidul
Figura nr, 28 Stadiile de fermentatie În cazul obtinerii L-fenilalaninei
L-aspartic.
Sub formă de acid N-acetil-L-aspartic se găseşte la nivelul sistemului nervos,
Ferrnentatoarele sunt alimentare cu glucoză În functie de necesarul energetic al
tiind al doilea cel mai răspândit arninoacid liber la mamifere.
tulpinii şi în functie de stadiul de dezvoltare al acesteia. În acest fel, concentrat ia
glucozei in mediul de cultură nu va fi mare şi deci se va preveni formarea acidului Produse farmaceutice:
acetic, dar şi formarea de CO2 În exces.
Fermentaţia se realizează pe parcursul a 2,5 zile, când se ating concentraţii de ASPARA K (Tanabe Seiyaku - Japonia)
50,8 g/l L-fenilalanină. cp., aspartat de potasiu şi magneziu
Procesul fermentativ se realizează cu randarnente de aproximativ 27,5 %. KALlUM MAGNESJUM ASPARAGINAT (Berlin Chernie - Germania)
Compania japoneză Tanabe produce Între 6-20 tone/lună L-fenilalanină prin flacon 500 mi cu sol. perfuzabilă cu acid Dl.-aspartic 15,160 g + KOH +
procedee enzirnatice utilizând ca substrat OL-aminoacizi acilaţi. Aceste substraturi MgO
sunt converti te în L-fenilalanină folosind drept biocatalizator aminoacilaza irnobi­ PANANGIN (Richter Gedeon - Romania)
lizată prin includere ionică în geluri poliacrilarnidice (OEAE-Sephadex), având fiole 10 mi cu aspartat de Mg 0,4 g + aspartat de K 0,452 g
avantajul reutilizării. cp. filmate cu aspartat de Mg 0,14 g + aspartat de K 0,158 g
ASPACARDIN (Terapia - Romania)
cp, cu aspartat de K 180 mg + aspartat de Mg 180 mg
120 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
T
I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 121

TROPHICARD (Kohler Pharma - Germania)

I H
aspartază
dj. cu aspartat de potasiu şi magneziu (125 mg + 125 mg) 'H3N~coo-
fiole 10 mi solutie i.m., aspartat de potasiu 0,5 g şi magneziu 0,5 g
-ooc~coo + NH3 -----_._~
TROMMCARDIN (Trommsdorf GmbH & Co. - Germania) eoo
cp. aspartat de potasiu şi magneziu (125 mg + 125 mg)
acid fumaric acid L.-aspartic
SIDERYL (Laboratoires Sterop SA - Franta)
fiole 10 mi sol. orală aspartat feros Figura nr. 29 Procesul catalizat de aspartază
fiole 5 mi solutie parenterală, 500 mg aspartat feros
SPAR1DCINE N (UCB Pharma - SUA) Dacă este irnohilizată pe suport solid stabilitatea ei creşte. Datele prezentare în
cp. filmate 250 mg aspartat feros tabelul nr. 16 (după C. Ratledge, B. Kristiansen (eds), 2006) demonstrează
SPARTOCINE N (Darci Pharma - SUA) eficienta diverselor sisteme de imohilizare.
dj. 250 mg, 350 mg aspartat feros Când se imobilizează în poliacrilamidă enzima are o activitate reziduală de
CALCIRETARD (Kohler Pharrna - Germania) 10%. Dacă este imobilizată pe x-caragheenan stabilitatea enzimei este irnbună­
cp., dj., aspartat de calciu tăţită, iar productivitatea creşte. Timpul de injumătătire al acestui sistem este de
UNIZINK (Kohler Pharma - Germania) peste 2 ani, comparativ cu cel al enzimei libere care. este de câteva minute.
cp., 50 mg aspartat de zinc Pentru a îmbunătăţi şi activitatea enzimei (prezenta fumarazei duce la transfer­
SARGENOR (Sarget Lab. - Franta) marea parţială a acidului furnaric în acid L-malic, cu micşorarea randamentului
fiole 5 mi cu sol. orală, I g aspartat de arginină în acid L-aspartic) se supun încălzirii celulele cu aspartază pentru a îndepărta
complet activitatea fumarazei. Folosind astfel de conditii se pot obtine, plecând
Tehnologia de biosintcză a acidului L-aspartic de la I M de fumarat de amoniu, 987 mM acid- L-aspartic. 10,7 mM fumarat
Deşi initial s-a obtinut prin fermentatie, la ora actuală acidul L-aspartic se obtine nereactionat şi doar 1,9 mM acid L-malic.
prin procedee enzimatice, ce presupun transformarea acidului fumaric şi a am 0-
niacului sub acţiunea catalitică a aspartazei. Tabelul nr. 16
Procedeele enzirnatice se real izează cu randamente foarte mari şi costuri Eficienta diverselor sisteme de imobilizare a aspartazei
reduse. Folosirea enzimei imobilizate permite reutilizarea ei, astfel încât se pot - .. . ,

obtine peste 22.000 tone de acid L-aspartic pentru fiecare kilogram de enzimă
Nr. su·~_~i~~i.. Activitaţea aspartazei Tia Productivitatea
.crt. de imoJli!izare , .. . ~/~ cel\l~e) . , ' (zile), (%) .•..
folosit.
Compania Tanabe Seiyaku Co. Ltd. din Japonia obtine prin acest procedeu l. Pol iacrilamidă 18850 120 100
2. Caragheenan 56340 70 174
aproximativ 100 tone/lună de acid L-aspartic, iar compania DSM (Olanda) lono
3. Caragheenan (GA) 37460 240 397
tone/an. 4. Caragheenan (GA + HA) 49400 680 1498
Utilizarea aspartazei drept catalizator pentru obtinerea acidului L-aspartic
legendă: GA - gluiaraldehidă : HA - hexarnetilen diarnina (reaciivi bifuncţionali cu care se
reprezintă cel mai eficient proces enzimatic din biotehnologie. Procedeul foloseşte
realizează imobilizarea enzimei)
enzima imobilizată pe suport solid (K-caragheenan-polimer glucidic natural extras
din algele roşii Chondrus crispa). Întrucât reactia catalizată de aspartază este exoterrnă, pentru a preveni scăderea
Enzima catalizează transformarea acidului fumaric şi a amoniacului, aşa cum activităţii sale catalitice, procesul se realizează industrial în coloane de 1000 litri,
se poate vedea în figura Of. 29. care permit răcirea celulelor imobilizate (cantitatea ele căldură eliberata din reactie
Aspartaza este un tetramer cu greutate moleculară de 196000, fiind produsă este considerabilă, 6 kcal/moi substrat).
de E coli. Enzima este foarte instabilă, producerea ei necesitând prezenta ionilor Procesul continuu este automatizat complet şi astfel condus încât să se obţină
metal ici bivalenţi. lncubată în solutie la 50llC pierde activitatea catalitică după 3,4 tone acid L-aspartic/zi (adică aproximativ 100 t/lună).
nici o jumătate de oră.
 •...;,'

122 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE OlOSINTEZĂ 123

• reactii gastrointestinale (vomă, greaţă, anorexie etc.), ce apar la doze crescute

III. 7. Biotehnologia L-DOPA de levodopa ;
• reactii cardiovasculare (aritmii, hipertensiune ortostatică etc.), care sunt mai
SIn: 3-hidroxi-L-tirozină, dihidroxifenil-Lvalanina, levodopa rare;
• reacţii la nivelul SNC-ului, ce apar mai des (agitatie, anxietate, insomnii,
C9HIIN04 depresii etc.).
Mr = 197,19 o Atunci când apar agresiunea. fenomenele paranoide, halucinatiile, delirul,
HO
I L-DOPA trebuie Înlocuită cu un alt antiparkinsonian.
OH Produse farmaceutice:

HO NH2 LEVODOPA cornp B (Statia - Germania)

cps., cp., levodopa + benserazidă (4: 1)
LEVODOPA cornp C (Stada - Germania)
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice cps., cp., levodopa + carbidopa
L-DOPA este o pulbere cristalină aibă sau crem, fără gust şi fără miros. Atunci SINEMET (Merck Sharp & Dohme - Austria)
când cristalizează din apă se prezintă sub formă de ace. Are un p.t. =276-278oC, cps., cp., levodopa + carbidopa (4 : 1), (10 : 1)
deşi unii cercetători au raportat şi alte valori ale p.t. =284-286°C. MADOPAR (La Roche - Austria)
Este greu solubilă în apă (66 mg/44 mi), solubilă în solutii diluate (IM) de cps., cp., levodopa + benserazidă (4: 1)
HCI, acid forrnic şi insolubilă în alcool, benzen, cloroform, eter, acetat de etil. CEREDOPA (Ratiopharm - Austria)
Suspensia apoasă 1% are un pH =4,5-7. cp., 100,250,500 mg
in prezenta umidităţii este oxidată rapid de oxigenul din aer şi se Închide la DOPAFLEX (Medphano - Germania)
culoare. cp., 500 mg
Se conservă În absenţa luminii, in locuri uscate, la maxim 40°C. LARODOPA (La Roche - Elvetia)
Dispersi ile orale reconstitui te (prin dizolvarea "ex temporae" a comprirnatelor
cp., 100,250,500 mg
DOPAR (Procter & Garnble - SUA)
de L-DOPA) sunt destul de instahile, de aceea la prepararea lor se adaugă acidul
cp., 100,250.500 mg
ascorbic care stabilizează levodopa (2 mg acid ascorbic/l dispersie apoasă).
Se absoarbe rapid din tractul gastrointestinal şi are un T 1/2 = 1-3' ore. Se Tehnologia de biosintcză a L-DOPA
decarboxilează rapid, astfel că o mică parte rămâne nernodificată şi poate trece
bariera hernato-encefalică pentru a se transforma În dopamină la nivelul creierului. L-DOPA se obtine pornind de la pirocatehol , piruvat şi amoniac Într-o singură
Din acest motiv, se asociază cu un inhibitor periferic de dopa-decarboxilază (e.g. etapă enzirnatică folosind rirozin fenol liaza (TFL), o enzimă piridoxal 5-fosfat
benserazidă, carbidopa), care creşte cantitatea de L-DOPA ce poate traversa dependentă (aşa cum se poate observa în figura nr. 30). Enzirna catalizează
bariera hernato-encefalică. Se excretă renal sub formă de rnetaboliţi. descompunerea tirozinei În Ienol, piruvat şi amoniac. Reactia este reversibilă.
L-DOPA este un precursor al dopaminei (ce este un neurotransrniţător). tiind Reactia inversă este folosită la obtinerea L-DOPA. utilizându-se pirocatehol În
necesară în tratamentul bolii Parkinson, în care există un deficit de doparnină la loc de fenol.
nivel cerebral. După aproximativ 2 ani de utilizare, beneficiile tratamentului se Tulpinile de Erwinia herbicola au fost alese pentru fermentaţie, care se conduce
la 28oC, la un pH =7,5 şi intr-un mediu ce contine:
reduc, iar boala progresează.
Cea mai serioasă reactie adversă (se manifestă la 75% din pacienti), care • L-tirozină-0,2 % (este esenţială pentru formarea enzimei TFL) ;
limitează utilizarea levodopei , este dischinezia (mişcări involuntare anorrnale). • L-fenilalanină-O, 1% (nu induce formarea enzimei dar acţionează sinergie cu
Aceasta poate apărea chiar la doze terapeutice de levodopa. Frecventa acestor Lvtirozina pentru formarea enzimei, a cărei activitate creşte de 5 ori la
mişcări creşte odată cu durata tratamentului. Alte reacţii adverse sunt: adăugarea Lfenilalaninei, alături de L-tirozină, În mediu);
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 125
124 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

1f Producţia mondială de L-DOPA este de aproximativ 250 t/an, care se obtine

liaza fie prin sinteză chimică, fie prin metoda enzimatică ,
Pirocatchol-j- Piruvat + NH1 -__.. L-DOPA Sinteza chimică presupune parcurgerea a 8 etape chimice laborioase şi de
o H'N eOOH lungă durată. Metoda a reprezentat singura modalitate de obtinere a L-DOPA

xf
până în anii '90.
~. ONa HO Metoda enzimatică este un procedeu simplu, ce se parcurge într-o singură
HO~ 1FL "'"
/ -. / + NH) ------_ ___.. etapă, fiind şi mai economică. A fost implementată prima dată în J 993, de
HO N + HJC C
I
O
Erwinia
herbicola HO +
1120
compania japoneză Ajinomoto Co.
°
comparaţie a metodelor de obtinere a L-DOPA se poate observa în tabelul
L-DOI'A nr. 17.
pirocateho! pi ruvat de sodi li

Figura nr. 30 Schema obtinerii L-DOPA Tabelul IIr. 17 .

Comparaţie intre metodele de obţinere a L-DOPA

• KH2P04-0,2%;
MgS04'7HP-O,1 %;
FeS04'7Hp-2 ppm ;
• extract de drojdii, extracte de carne, peptone, hidrolizate proteice (ce sunt
N~~.~.
.,:' :';' ~,;.
;p.C~,". . i>;;;~,..:itn;~ti,,' .,' §bii~'~h'l~i'Î
'.~ ~ ... " . ';: ... ~: "'."
~'I.

necesare creşterii celulei bacreriene, dar şi formării enzimei TFL) ; pirocatehol. piruvat , vanilină , hidantoină, anhidridă
glicerol-O,6% (necesar creşterii celulei bacteriene, dar şi formării enzimei 1. Materii prime
amoniac acctică , hidrogen
TFL); 2. Număr de etape l 8
• acid succinic-O,5 % (creşte procentul de enzimă formată) ;
3. Rezolutie optică nu este necesară necesară
• piridoxină-0,01 %, metionină-O, 1%, alanină-0,2 %, glicină-0,05 %.
4. Aparatură fermenrator clasic instalatii speciale
Fermentatia se conduce timp de 28 de ore, iar la sfârşitul ei, enzirna TFL 5. Durata 3 zile 15 zile
reprezintă 10% din totalul de proteine celulare solubile. Celulele de Erwinia 6. Produşi secundari apă, amoniac amoniac, CO!, acerati
herbicola sunt separate prin centrifugare din mediul de fermentatie şi transferate
într-un reactor, unde va avea loc biotransformarea enzirnatică a pirocateholului şi
piruvatului în L-DOPA.
Procesul enzimatic este parcurs în sistem "hatch" în care, celulele de Erwinia 111.8. Biotehnologia L-cisteinei
herbicola cu un continut mare de enzimă TFL transformă piruvatul, adică
substratul. sin: Cys, tioserină
Întrucât piruvatul este instabil la temperatură, procesul enzimatic se realizează
C/17N02S
la 16°C timp de 48 de ore în prezentă de piruvat de sodiu, acetat de amoniu (5 g),
M, = 121,16
pirocatehol (0,6 g), sulfit de sodiu (0,2 g), EDTA (0,1 g). În acest mediu, ajustat
la pH = 8 cu amoniac, se aduce masa celulară separată din mediul de fermentaţie. o ',!.

La intervale de 2 ore se completează piruvatul de sodiu şi pirocateholul, pentru I

a se menţine concentraţia lor iniţială. Cantitatea maximă de L-DOPA se obtine / /,CH
•......2 ,./ C~
când concentrat ia de piruvat sodic este de 0,5 %. Concentraţii mai mari de piruvat HS
~ <,
'CH
/'
OH
sau de pirocatehol inhibă enzima prin denaturare, inhibând deci şi producţia de
L-DOPA. Sulfitul de sodiu previne oxida rea levodopei formate, prin mentinerea
ei în formă redusă. Fiind insolubilă în mediul de reactie, L-DOPA cristalizează pe
i
NH2
măsură ce se formează şi se acumulează în cantităţi de 110 g/l.
.1
,.;'1'
i
:;'111
 iit"ţ,\

126 CĂTĂLlNA DANIELA S'IAN MEDICAMENTE DE OIOSINTEZĂ 127

pulbere pentru suspensie orală, plic 100, 200 mg

Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
ACETYLCYSTEINUM 1001200 VON CT (CT Arzneimittel GmbH _
L-Cisteina se prezintă sub formă de cristale uşor solubile în apă, alcool, acid Germania)
acetic, solutii de amoniac. Este insolubilă în eter, acetonă, acetat de etil, benzen, granule, I plic/IOO mg, 200 mg acetilcisteină
tetraclorură de carbon. În solutii apoase neutre sau slab alcaline este oxidată la ACETILCISTEINĂ (LaroPharm SRL - România)
cistină (C6HI2N204S2) de către aer. Este mai stabilă în solutii acide. cps. 200 mg acetilcisteină
Sub formă de clorhidrat (ClI7N02S . HCI) se prezintă sub formă de cristale HIDONAC (Inpharzam Zarnbon SA - Italia)
cu p. t. = 175-178oC. Clorhidratul este solubil în apă, acetonă, alcool, solutii sol. perfuzabilă 20 % cu 5 g acetilcisteină
apoase acide. Se descompune şi se oxidează încet. Se conservă în recipiente bine FLUIMUCIL (Inpharzam Zambon SA - Italia)
închise, întrucât este higroscopic. granule pentru susp. orală, 1 plic/IOO, 200 mg acetilcisteină
Ca acetilcisteină (CSH9N03S, sin: N-acetil-L-cisteină) se prezintă sub formă sol. inject.Zinhalaţii/insnlaţi! endotraheale, fiole 3 mi, 100, 300 mg/rnl
de cristale cu p.t. =109-110°C. sol. orală 2 % flacon 100 mi
Carbocisteina [CSH9N04S, sin: S-(carboximetil)-L-cisteina] se prezintă sub SIRAN (Temmler-Phanna - Germania)
formă de cristale cu p.t. =204-207°C. cp. efervescente 200 mg, 600 mg acetilcisteină
L-Cisteina, prin grupul sulfhidric din moleculă, reduce legăturile disulfidice granule pentru suspensie orală, I plic/200 mg acetilcisteină
din mucoproteine, având actiune fluidifiant-rnucolitică. Aceasta este influenţată pulbere suspendabilă, 1 plic/.lOO rng , 200 mg
de concentraţia substanţei active şi de pH (fluidifierea este intensă la pH = 7). DIAMEL (Catalysis SL - Italia)
Este indicată În tratamentul tuturor afectiunilor respiratorii care, În urma unei cps., complex de aminoacizi Între care acetilcisteină 14,2 mg + vitamine
productii excesive de rnucus şi a solidificării consecutive, antrenează formarea de + minerale
secreţii dense care sunt eliminate cu greutate sau de loc. Este cazul tuturor susp. orală, complex de aminoacizi
formelor de infectii respiratorii (inclusiv gripe) asociate cu tuse, al bronşitelor M UCOSOLVIN (Berlin-Chemie - Germania)
acute şi cronice, sinuzitelor, anginelor, faringitelor, astmului bronşic şi mucovis­ sol. apoasă 10%,20%, fiole 2 ml/0,4 mg acetilcisteină pentru aerosoli şi
cidozei (fibroza chistică). instilaţii traheale
Poate produce o serie de reactii adverse: tulburări gastrointestinale, urticarie, RHINATHIOL (Sanofi-Synthelaho - Franta)
dureri de cap, febră şi reactii alergice. sirop 2 %, 5 % flacon 125 mi carbocisteină
Se utilizează şi pentru proprietăţile ei de aminoacid esential în: pierderi crescute cps. 375 mg carbocisteină
de proteine sau malabsorbtie proteică din traumatisme , arsuri, hemoragii severe, MUCOTREIS (Ecobi Pharrnaceutici - Italia)
complicaţii postoperatorii, vărsături şi diaree severă, tulburări cronice gastro-intes­ sirop 2 %, 5 % carbocisteină
tinale, neoplazii cu caşexie, stări acute şi cronice toxico-septice, Se utilizează În pulbere pentru suspensie orală 1 plic/300 mg carbocisteină
alimentaţia preoperatorie a pacientilor cu malabsorbţie sau deficit proteic. MUCOSOL (CTS Chemical - Israel)
Se indică şi ca antidot în intoxicatiile accidentale sau voluntare cu paracetamol. sirop 250 rng/5 mi carbocisteină
Are şi rol de antioxidant şi de precursor al glutationului. cps. 375 mg carbocisteină
În terapie se utilizează sub formă de Neacetilcisteină, carbocisteină, clorhidrat ,f- KARBOCISTEIN (Galenika - Serbia)
de cisteină şi chiar L-cisteină. :~.: cps .. 375 rug carbocisteină
ţ HUMEX (Lahoratoires Urgo SA - Franţa)
Produse farmaceutice: ~: sirop, carbocisteină 2 g , 5 g/IOO mi
~~
ACC-200 (Hexal Pharma - Germania)
-1'.'
ti;, FLUIFORT (Dornpe - Italia)
~.
sol. injectabilă i.m., i. v., fiole 3 ml/300 mg acetilcisteină .'1' sirop 9% flacon 200 mi carbocisteină
'g ESTIVAL (Specifar - Grecia)
cps., 200 mg
cp. efervescente 200, 600 rng sirop 5 % tlacon 120 mi carbocisteină
128 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
CARBOCISTEINĂ (Terapia SA - România)
sirop, 100, 250 mg/5 mI carbocisteină
sol. 'internă 5 %, flacon 100 mI
RODILEMID (Sicomed - România)
sol. injectabilă, fiole 10 mI cu EDTA Na şi Ca 1 g + gluconat de Ca 0,05
g + clorhidrat de cisteină 0,01 g
'. COLVITIOD (Biofarma - România)
sol. oftalrnică, complex de vitamine + clorhidrat de cisteină 0,03 mg
REVALlD (Europharm - România)
cps., vitamine + minerale + aminoacizi, între care cisteină 50 mg
. INFUSAMIN (Teva - Ungaria)
sol. perfuzabilă 20 %, complex de 18 aminoacizi între care L-cisteină I g/I
Tehnologia de biosinteză a L-cistcinei
L-Cisteina se obţinea initial prin extractie din hidrolizatele acide de păr sau blană
animală. Aceste procese extractive aveau un consum mare de energie, emanau
mirosuri dezagreabile, produceau ape reziduale acide în cantitate mare şi în
primul rând depindeau de o materie primă greu de procurat în cantităţi mari -
părul şi blana animalelor.
Deşi există numeroase microorganisme care biosintetizează în mod natural
L-cisteina, acestea nu pot fi utilizate la scară industrială, pentru că procesul de
biosinteză este supus inhibiţiei prin produsul final (prima enzimă a căii metabolice
- serin acetiltransferaza - este inhibată de L-cisteină).
S-a încercat obtinerea unor mutanţi prin prelucrarea genei cysli ; astfel încât
proteina codificată să devină insensibilă la inhibitia cu L-cisteină. Clonarea genei
cysli într-o tulpină de E. coli a permis obtinerea unor mutanţi capabili să
biosintetizeze cantităţi crescute de L-cisteină. Deşi s-au obtinut o serie de pro­
grese, rezultatele nu au fost suficient de bune pentru a permite utilizarea la nivel
industrial a acestor tulpini mutante.
În 1970 s-a pus la punct, de către cercetătorii de la compania japoneză
Ajinomoto Co., un procedeu enzimatic în 3 etape (figura nr. 31), care porneşte de
la acidul Dl.-z-amino-Dj-tiazolin-q-carboxilic (DL-ATC).
Enzimele care transformă DL-ATC în L-cisteină sunt:
• DL-2-amino-D2-tiazolin-4-carboxilat racemaza (ATC racemaza);
• L-2-amino-D2-tiazolin-4-carboxilat hidrolaza (L-ATC hidrolaza) ;
• S-carbamoil-L-cistein hidrolaza (SCC hidrolaza).
Tulpina bacteriană telurică de Pseudomonas thiazolinophilum a demonstrat că
poate transforma eficient şi cantitativ DL-ATC în L-cisteină. Enzimele respon­
sabile de cele 3 etape de transformare sunt inductibile, iar adaosul de DL-ATC în
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 129
ATC L-ATC SCC
racemază hidrolază hidrolază
. DL-ATC---_ L-ATC _.--_ S-carbamoil-L-cisteină---_ L-Cistcină
FigUJ"3 nr, 31 Schema obtinerii enzimatice a L-cisteinei
mediul de cultură este esential pentru a avea o acnvitate enzimatică înaltă.
Adaosul ionilor de Fe:>+ şi Mrr'" contribuie şi elIa creşterea activităţii enzimatice
Reactiile enzimatice încep în momentul adăugării celulelor de Pseudomonas
thiazolinophilurn (cu activitate enzimatică înaltă) în mediul de cultură, ce contine
ca substrat DL-ATC.
Adaosul de hidroxilarnină, ca inhibitor al enzimei dependentă de vitamina B6'
este benefic pentru prevenirea degradării L-cisteinei în mediul de fermentatie.
Hidroxilamina inhihă cistein-desulfhidraza, o enzimă ce degradează L-cisteina.
S-au obtinut şi tulpini mutante ce nu contin această enzimă şi care sunt folosire
la nivel industrial pentru obţinerea L-cisteinei. L-Cisteina produsă în mediul de
fermentatie este oxidată pe măsură ce se formează, trecând în L-cistină. Oxidarea
se realizează de către oxigenul furnizat în fermentatie. L-Cistina este insolubilă în
apă şi cristalizează.
Acest procedeu enzimatic se realizează cu randamente de 95 %, din 40 g/I
DL-ATC obţinându-se 31,5 g/l L-cisteină.
S-carbamoil-L-cisteina se obtine prin acelaşi procedeu enzimatic, pornind de
la materia primă corespunzătoare.
Obtinerea L-cisteinei folosind procedeul enzimatic, s-a implementat la nivel
industrial încă din 1982 de către compania Ajinornoto Co.
Bibliografie
1. Anastassidis S., Recent Pat Bitechnot.; 2007, 1(1): 11-24;
2. Anderson S., Marks C. B., Lazarus R., Miller J., Siafford K., Seymour J., Light
O., Rastettcr w., Estell O., Science, 1985. 230: 144-149 ;
3. Araki K., Amino acids-Othmer Encyclopedia of chemical technologv, voI. 2, 2003,
554-618 ;
4. Bailey J.E., Science . 1991,252: 1668-1675;
5. Bălănescu Gr. (ed.), Dicţionar de chimie, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1964;
6. Banu C. (ed). Aditivi şi ingrediente pentru industria alimentară, Ed. Tehnică,
Bucureşti, 2000;
7. Beers M.H., Berkow R. (eds), Manualul Merck de Diagnostic şi Tratament, (tradu­
cere Chirculescu R.), Ed. Bie AII, Bucureşti, 2002, 2-23 ;
8. van Beilen J. B., Li Z., Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13: 338-344;
9. Bommarius A.S., Riebel B. R., Biocataiysis, Wiley-VCH, Weinheim, 2004;
130 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE 1l10SINTEZĂ 131

10. Bongaerts J., Krămer M., Miiller U., Raeven L., Wubbolts M., Metab. ElIg., 2001, 38. lovu M., Chimie organică, ed. a va, Ed. Monitorul Oficial, Bucureşti, 2005,
3: 389-300; . 655-673;
II. Burton S.G., Cowan O.A., Woodley J.M., Nature Biotechno!., 2002, 20: 37-45; 39. Ishida M.· K .. Miwa S., Nakarnori S., Sano K., Processfor producing Lnryptophan,
12. Burton S.G., Trends Biotechnol., 2003, 21: 543-549; U. S. Patern, 1989,4,885,245;
13. Cao L., Cun: Opin. Chem. Bio/., 2005, 9: 217-226; 40. Ishige T., Honda K., Shimizu S .. Curr. Opin. Chem. Biol .. 2005. 9: 174-180;
14. Cao L., van Langeny L.. SheldonR.A., Cun: Opin, Biotechnol., 2003, 14: 387-394; 41. Jurcoane ŞI. (ed.), Tratat de biotehuologie, voI. II, Ed. Tehnică. Bucureşti, 2006,
15. Chibata I. (ed.), Immobilized enzytnes , John Wiley, New York. J978, 1-73: 236-244, 470-488;
16. Chihata 1., Tosa T., SatoT., "Irnmobilized biocatalysts" in: Biotechnology , voI. 7a. 42. Jurcoane ŞI. et (II., Tnuat de biotehnologie , voI. 1. Ed. Tehnică, Bucureşti. 2004,
J. F. Kenedy (ed.). VCH, Weinheim, 1987,653-684; 222-254 ;
17. Chibata 1.. Tosa T., Shibatani T., .,The industrial production of optically active 43. Jurcoane Şt.. Biotehnologii. Fundamente. Bioteactoare. Enzime , Ed. Tehnică, Bucureşti.
cornpounds by imrnobilized biocatalysts" În: Chirality in lndustry; Coli ins A. N .. 2000, 214-246;
Sheldrake G. N., Crosby J. (eds.), John Wilcy&Sons, London. 1992, 351-370; 44. Kclle R., Hermann T., Bathe B., "L-Lysine" În: Handbook o] Corynebacterium
18. Coman M., Bota c.. Pop C., Biotehnoiogii fannaceutice; Ed. Medicală Universitară glutamicum, Eggelin L., BOII M. (eds.), Taylor & Francis Group. Boca Raton FI,
"Iuliu Hatieganu", Cluj-Napoca, 2004, 156-161şi 162-166; SUA, 2005, 465-488;
19. de Graaf A.A., "Metabolic flux analysis of Corvnebacterium glutamicum" în: 45. Kimura E., Adv. Biochem. Eng.rbiotectuio!., 2003, 79: 37-57;
Bioreactor Engineering, Modeling arul Control, Schugerl K., Bcllgardr K. H. (eds.), 46. Konstantinov K. B .. Nishino N., Scki T., Yoshida T., J. Ferment. Bioeng.; 1990,
Springer- Verlag, Berlin, 2000, 506-555 ; 71: 350-355;
20. Debabov V. G., Adv. Biochem. Eng . Biotechnoi., 2003. 79: 114-136; 47. Krărner R., J. Biotechnoi., 1996.45: 1-21;
21. Dey P.M., Harborne 1.B .. Plant Biochemistry, Academic Press, London, 1997; 48. Krishna S.H., Biotechnol. AdI' .. 2002.20: 239-266;
22. Dobrescu O., Farmacoterapie practică, voI. 1, II. Ed. Medicală, Bucureşti. 1989; 49. Lazarus R.A .. Hurle M .. Anderson S., Powers D. B.. Enzymes for the production
23. Eggeling L., Pfefferle W., Sahm H., .Arnino acids" În: Basic Biotechnologv. of 2-keto-L-g[uconic acid. U. S. Patent, 19'14,5.376,544:
Ratledge C.; Kristiansen B. (eds), 3'd edition, Cambridge Univcrsity Press, 2006, 50. Lehninger A.L., Nelson O.L.. Cox M.M, Principles de biochimie, 2""'" cdition,
Anglia, 335-357; Medicine-Sciences/Flammarion, 1994, New York-Paris;
24. Eggeling L., Salim H., Arch. Microbiol., 2003.180: 155-J60; 51. Leuchtenbcrger w.. Huthmacher K .. Dranz K., Appl. Microbiol. Biotechnoi., 2005.
25. Faber K., Biotransformation in organic chemistry; Springer- Verlag, Berlin, 2000, 69( 1): 1-8;
334-418 ; 52. Milică I.C .. Biotehnologiite viitorului, Ed. Universitară "Ion Ionescu de la Brad",
26. Fernandes P.. Cabral J.M.S .. "Bi'otransformation" În: Basic Biotechnologv. Rarledge laşi, 1999, 350-354;
C .. Kristiansen B. (eds), 3'" edition. Cambridge University Press, 2006. Anglia. 53. Mueller H .. Huebner S., Adv. Biochem. Eng, Biotechnoi., 2003, 79: 137-170;
579-626 ; 54. Miiller M., Curr. Opin. Biotechno! .. 2004, 15: 591-598 ;
27. Gavrilescu M .. Chisti Y., Biotechnol. Adv., 2005, 23: 471-499; 55. Nakaruori S., Kobayashi S.I., Kobayashi C .. Takagi H., Appl. Environ. Microbiol .,
28. Ghiorghiţă G .. Petrescu Nicută D., Biotehnologiile azi, Ed. Junimea, laşi. 2005, 1998,64: 1607-1611;
10ll-J08, 56. Nduka Okafor, Modem lndustrial Microbiology and Biotechnologv, Science Publishers,
29. Gilll., Ballesteros A., Trends Biotechno!., 2000.18: 282-296; Entield, New Hampshire, SUA. 2007. 380-396;
30. Glick B. R., Pasternak J. J., Molecular biotechnology. Principles (//1(1 applications 57. Nimiţan E .... Biotchnoiogii microbiene", Luografia Universităţii .. Al. 1. Cuza"
of recombinant DNA. 3'" edition, ASM Press, Washington OC, 2003, 350-354; laşi. 1992,85-91 ;
,'1
31. Hermann T., J. Bioiechnol .. 2003, 104(1-3): 155-157; 58. Ninorniya K., Food Revi ews International. 2002, 18(1): 504- 509; "
32. Hodgson J., Bio/Technology . 1994, 12: J52-155; 59. Ohnishi J .. Mitsuhashi S., Hayashi M., et {II., Appl . Microbiol . Biotechnol .. 2002, "1 '/1

33. Holum J. R., Fundamentals of General. Organic and Biologica! Chemistry, 5th 58: 217-223; !I'~:i
edition, John Wiley & Sons Inc., New York, 1994; 60. Oniscu C., Tehnologia produselor de biosinteră, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1978,
i
34. HutchinsonC.R., Bio/Technology. 1994, 12:375-380; 2R8-323 ;
t,:,,i,1,
35. Hutchinson C.R., Fujii 1 .. AIIIIII. Rev. Microbio!., 1995.49: 210-238; 61. Ozaki A., Katsumata R., Oka T., Process for producing tryptophan, U. S. Patent. 'tI;
36. Ikeda M., Adv. Biochem. EngBiotechnot., 2003, 79: 1-35; 1989. 4,874,69R ; ,;

37. Ikeda M., Nakanishi K., Kino K., Katsumata R .. , Biosci. Biotechnol . Biochem., 62. Pleflerle W.. Mockel B., Bathe B.. Marx A., Ac/r. Biochem. Eng . Biotechno!., . , '~i;
1994, 58: 674-678; 2003, 79: 59-112; :)1
"J
. Iti'i!'tjI'i'!
;"!":i
~,~~I
i[i:1r1!1
I'
132 CĂTĂL1NA DANIELA STAN

63. Popa L., Biotehnologii moderne, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1990,239-256;

64. Prenosil J.E., Kut O.M., Dunn I.J., Heinzle E., "Irnmobilized biocatalysts" În:
Ulmann,s Encyclopedia of Industrial Chemistry , 5'" edition, vol. A 14, Kandy L.,
Rounsaville J.R, Schutz G. (eds.), VCH, Weinheim, 1987, 1-48;
65. Sano K., "Host-vector systerns for amine-acid producing Coryneform bacteria.
Irnprovemeru of useful enzymcs by protein engineering" În: Recombinant microbes
for industrial and agricultura! applications, Murooka Y., Imanaka T. (eds.), Marcel
Dekker, New York, SUA, 1994,485-507;
66. Săsărrnan E., Condur M., Rădulescu C., Niţelea 1., Vociu M., Minculescu A.,
Marica E., Mutant de Brevibacterium lactofermentum şi procedee de obtinere a
acestuia, Brevet OSIM, 65097, 1975;
67. Schmid A., Dorc1ick J. S., Hauer B., el ai., Nature . 2001, 409: 258-268;
68. Schmid A., Hollmann F., Park J. B., Buhlcr B., Curr. Opin. Biotechno!., 2002,
13: 359-366;
69. Schwarzer A., Puhler A., Bio/Technology, 1991, 9: 84-87;
70. Sheldon R. A., Chirot echnology , Marcel Dekker, New York, 1993,205-270;
71. Stan C. D., Stefanache A., Dumitrache M., Wolszlegcr O., Profire L., "The story
of amino acid production", 14'" Panhellenic Phurmaceutical Congress, 9-11 May,
Athena , 2009, Proceedings CD,
72. Takagi H., Awano N., Kohayashi S. 1., Noji M., Saito K., Nakamori S., FEMS
Microbiol. Lett., 1999, 179: 453-459;
73. Terasawa M .. Fukushima Y., Kurusu Y., Yukawa H., Process Biochem. lni., 1990,
25: 172-175;
74. Turner N. J., Trends in Biotechno!., 2003, 474-478;
75. Voet D., Voet J. G., Biochemistry: John Wiley & Sens, luc., New York, 1990;
76. Yamaguchi S., Ninomiya K ., J. Mllr., 2000,130: 92IS-926S;
77. Zhao H .. Chockalingam K., Chen Z .. CI/IT. Opin. Biotechno!., 2002, I:l: 104-110.
Capitolul IV
BIOTEHNOLOGIA VITAMINELOR
Vitaminele sunt substante organice esenţiale, cu rol de biocatalizatori, absolut
necesare organismelor în cantităţi minime. Ele provin din alimentaţie, ca atare
sau sub formă de precursori. '
Descoperirea vitaminelor a parcurs un drum lung ce se Întinde pe mii de ani.
Simptomele unor maladii au fost descrise şi observare Încă din antichitate, ulterior
dovedindu-se că ele au ca etiologie avitarninozele.
În 1912 Kazimierz Funk izolează din tărâţele de orez o substanţă care vindeca
polinevrita aviară şi propunea denumirea de vitamină (arnină vitală). Meritul lui
Funk este, nu numai de a fi descoperit prima vitamină (care de altfel s-a dovedit
a fi un amestec de vitamine din grupul 8 ÎIl care predominau vitamina 81 şi PP),
ci şi enuntarea concepţiei că unele boli Îşi au originea în lipsa unor substante din
alimentaţie.
În 1914 E. Y. McCollum şi M. Davis au denumit "factor de creştere liposolubil
A" campusul izolat din extractele lipidice ce era capabil să vindece unele simptome
ale avitaminozei A. În 1916 J. Drummond denumeşte compusul vitamina A, iar
În 1931 P. Karerr Îi stabileşte structura chimică.
În perioada 1927-1937, A. Windaus stabileşte structura provitaminelor D şi
modul de transformare fotochimică a acestora În vitamina D, iar În 1936 D.E.
Emerson şi H.M. Evans izolează din uleiul de germeni de grâu vitarninele Eşi
le stabilesc structurile chimice. În 1930 G .0. Burr şi colaboratorii săi descriu
simptomele carentei vitaminei F, iar în 1929-1930 H. Dam evidenţiază existenta
vitaminei K (K=koagulation vitamin). În perioada 1933-1936 P. Karerr, P.
Ruhn şi colaboratorii lor au stabilit sinteza vitaminei 8" aceasta fiind denumită
riboflavină. În 1931 s-a extras acidul folie de către M.K. Mitchell, F.E. Snall şi
R.l. William. În 1936 F. Kogl şi 8. Tonnis au izolat biotina sau vitamina H.
Ulterior, în 1938, R. Kuhn şi G. Wendt au identificat vitamina B6 (piridoxina),
iar în 1939 s-a izolat acidul nicotinic şi arnida sa (vitamina PP) de către G.A.
Elvehjen şi colaboratorii săi.

;)

ti
,;1
134 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 135

Împreună cu aminoacizii, vitaminele fac parte din cei 24 de compuşi organici Vitaminele sunt implicate În metabolismul intermediar care menţine echilibrul
ce sunt considerati esenţiali pentru organismele animale, vegetale şi pentru .fiziologic in organism; intervin în toate celulele organismului În reactiile de
rnicroorganisme. oxido-reducere (vitarnina PP, 82, acidul folie etc.) ; unele dintre ele intră În
Denumirea vitaminelor se face după criterii diferite: structura enzimelor fiind părţi active ale acestora, având denumirea de coenzime.
Acţionează la diverse nivele:
.:. În ordinea descoperirii cronologice, folosind literele mari ale alfabetului : A,
B, C, O, E, F etc. Pe măsura avansării cercetărilor şi stabilirii existentei de • influenţează formarea unor proteine cu rol biologic (vitamina A, D) ;
noi factori În cadrul aceleaşi grupe, s-au notat vitaminele cu indici numerici: • împiedică formarea unor radicali liberi la nivelul membranelor biologice
AI' A2, A3, O2, 03, 81.15 etc. Mai târziu s-au evidentiat subgrupe În cadrul (vitamina E) ;
aceluiaşi indice numeric, notate cu litere mici: BI2<1' 812b, 812c etc. ; • au rol de coenzimă în transferul unor grupări de tipul -COz' -CHl' -NH2
.:. după structură, vitaminele au o denumire chimică. Vitarnina 02-ergocalciferol, (vitamina BI' Br" B12. acidul folie, acidul pantotenic etc.) ;
vitarnina OJ-colecalciferol, vitamina 86-piridoxină, vitamina BI2-ciancobala­ • au rol În transferul de electroni (vitamina PP, B2, K, C).
mină etc. ;
Dacă nu sunt acoperite cerintele fiziologice, apare carenţa sau starea de
.:. după actiunea fiziologică, respectiva bolii carenţiale, vitaminele se denumesc:
hipovitaminoză. Aceste hipovitaminoze se manifestă prin tulburări specifice
antirahitică (vitamina O), antiscorbutică (vitamina C), antipelagroasă (vitamina
pentru fiecare vitamină în parte (anemie, xeroftalmie, scorbut, rahitism etc.).
PP), antixeroftalmică (vitamina A), antisterilică (vitamina E) etc. ;
Vitaminele se folosesc profilactic (în doze mici), sau pentru tratarea hipovita­
.:. după reguli stabilite de comisia de nomenclatură biochimică vitaminele se
minozelor, Sunt bine tolerate, Însă administrarea vitaminelor liposolubile în doze
denumesc: vitamina A I-retinol (forma alcoolică), vitamina 02-ergocalciferol, mari duce la aparitia reactiilor adverse.
vitamina 03-colecalciferol etc.
La ora actuală vitaminele se obtin prin sinteze şi sernisinteze chimice, dar şi
În 1915 T. 8. Osborne şi L.B. Mendel grupează vitaminele în liidrosolubile şi prin biotehnologii fermentative.
liposolubile pe baza solubilităţii lor in apă şi solvenţi pol ari şi respectiv în lipide O serie de vitamine (D2, 86, 8'2' F) se produc prin fcrmentaţia unor micro­
şi solvenţi organici, organisme, iar p-carotenul şi vitamina F prin cultivarea de alge. Vitamina 82 se
produce atât prin sinteză chimică cât şi prin procedee fermentative. Procedeul de
Vitamine liposolubile sunt :
obtinere al vitaminei C este unul mixt, ce implică etape de sinteză chimică şi
- vitamina A, O, E, F, K;
etape de biosinteză fermentativă. Vitamine ca: biotină, acid pantotenic, vitamina
Vitamine hidrosolubile sunt:
A, OJ' E, K, B" H, PP etc .. se obtin doar prin sinteze chimice, deşi sunt puse
- grupul de vitamine B (81, B2, Bu' 812, vitamina PP, acidul pantotenic, acidul
la punct şi metode fermentative. Biotina s-ar putea obtine prin cultivarea micro­
folie, acidul folinic, biotina, acidul p-aminobenzoic), vitamina C.
organismelor din genul Pliycomyces, Torulopsis, Aspergillus; vitamina K s-ar
Vitaminele se găsesc in organism ca atare. sau ca provitamine, ce sunt putea obtine prin cultivarea algei Chlorella, sau a bacteriilor din genul Bacillus ;
precursori inactivi (e.g. carotenoidele, ergosterolul etc.). vitamina PP s-ar putea obţine din culturi de Corynebacterium; r)-carotenul s-ar
Există şi vitarninoide, ce sunt factori biochimici lipsiti de funcţie enzimatică : putea obtine din culturi de Mucor sau Choanephora . Însă, aceste metode fermen­
mezoinozitol, colina, acid a-lipoic, vitamina P etc. tati ve, nu s-au dovedit a fi mai performante din punct de vedere economic, nefiind
Principalele surse de vitamine pentru om sunt reprezentate de plante, animale, aplicare la scară industrială, motiv pentru care aceste vitamine se obtin Încă prin
dar şi de flora intestinală, ce poate produce cantităţi apreciabile de vitamine sinteze şi semisinteze chimice.
(vitamina K, BI, 82, 86, biotină, acid pantotenic, acid folie, acid p-arninobenzoic). ° serie de date ce relevă modalitatile de obtinere a unor vitamine şi provi­
Vitaminele sunt factori esentiali pentru toate speciile. Sunt factori exogeni, ramine, sunt redate în tabelul nr. 18 (adaptat după S. Himizu, 2001).
adică provin din din alimentaţie, nefiind biosintetizate de organismul uman sau de Deşi tehnologiile ferrnentative par a fi, la prima vedere, mai scumpe, totuşi
unele animale. Din aceste surse exogene organismele preiau atât vitaminele cât şi sunt mai performante, produsul obtinut este de puritate mai mare şi uneori este
provitaminele (precursori inactivi ce se transformă în organism în vitamine, singura tehnologie aplicabilă la scară industrială pentru obtinerea unei vitamine
forma activă biologic). de uz farmaceutic. Mai mult, in cazul substanţelor active pentru care doar unul
136 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 137

Tabelul nr. 18
Metode de obţinere a vitaminelor
;rif:.~~I'\c:; ;~:J; :i':' vit~~~:/'~'<i'Yi~I':' /<'~'ii'~i~~if~~::~~Hii'tt~;'.~:': ,::
din enantiomeri este biologic activ, tehnologiile fermentative oferă posibilitatea
obtinerii exclusiva izomerului optic activ biologic. Sintezele chimice clasice duc
la obţinerea de amestecuri racemice, cu activitate biologică diferită, din care este
·A:;~tj.ate· .
J ((ollţ/8,ij)
greu de izolat enantiomerul activ.

Extractie 400
1. f3-caroten (provitamina A)
Biotehnologie
IV.]. Vitaminele hidrosolubile
2. Vitamina A Sinteză chimică 2700
3. Ergosterol (provitamina D2) Biotehnologie 40
Extracţie IV.] . 1. Biotehnologia vitaminelor din grupul B
Sinteză chimică
4. I Vitamina D I 5000
Biotehnologie Vitaminele din grupul B cuprind o serie de substanţe solubile În apă, ce sunt de
Extracţie origine vegetală sau animală. Prin convenţie, din acest grup fac parte substanţele
Sinteză chimică 22000 ce Îndeplinesc următoarele condiţii:
5. I Vitamina E I
Biotehnologie
Extractie - se găsesc În drojdia de bere, ficat şi cereale;
Sinteză chimică - sunt solubile În apă;
6. Vitamina F 2000
Biotehnologie - sunt factori de creştere esenţiali pentru microorganisme ;
7. Viramina K Sinteză chimică S()()
- acţionează drept coenzime, sau sunt activatori ai proceselor enzimatice din
8. Vitarnina B, Sinteză chimică 4200
organismele superioare şi inferioare.
Sinteză chimică
9. Vitarnina B2 2500
Biotehnologie Complexul de vitamine B cuprinde: vitaminele B1• B2• B(" B12, biotina,
Sinteză chimică inozitolul, colina, acidul pantotenic, acidul folie, acidul p-aminobenzoic,
10. Vitamina BI> 2600
Biotehnologie Elaborarea vitaminelor din grupul B de către bacterii a fost mult studiată,
II. Vitamina B'2 Biotehnologie lO utilizându-se medii de cultură sintetice sau naturale.
12. Vitamina PP Sinteză chimică 22000
Bacteriile propionice produc: vitamina B1 (tiarnină), vitamina B2 (riboflavină),
Sinteză chimică şi
13. Vitamina C biotehnologie (mecanism mixt) 65000 vitamina B(> (piridoxină), vitamina BI2 (ciancobalamină), vitamina B5 (acid panto­
Sinteză chimică tenic), acid nicotinic, acid folie, acid folinic. Cantităţile de vitamine obţinute sunt
14. Acid pantotenic 7000 determinare de natura şi compozitia mediului de cultură.
Biotehnologie
15. Acid folie Sinteză chimică 400 Astfel, cultivând Propionibacterium shermanii şi Propionibacterium technicum
Sinteză chimică pe medii sintetice şi pe medii narurale s-au obţinut, după 72 de ore, cantităţi
16. Acid nicotinic 220()()
Biotehnologie apreciabile de vitamine din grupul B, după cum se poate vedea În tabelul nr. 19
Sinteză chimică şi tabelul nr. 20 (după C. Oniscu, 1978).
17. I Biotină I 25
Biotehnologie
Datorită avantajelor economice oferi te de procedeele biochimice se tinde tot
Extracţie
18. I Acid n-lipoic I Sinteză chimică
30 mai mult să se utilizeze aceste metode pentru obţinerea de vitamine hidrosolubile.
Extractie Totuşi, biosinteza tiaminei, piridoxinei, acidului folie, acidului nicotinic şi a
19. Inozitol acidului pantotenic de către bacteriile propionice şi fungi poate avea o importanţă
Sinteză chimică
20. Colina Sinteză chimică practică doar dacă tehnologiile de fermentaţie şi cele de separare se dovedesc a ti
21. Acid p-aminobenzoic Sinteză chimică rentabile, comparativ cu metodele tradiţionale.
Din grupul de vitamine B se obţin astăzi industrial, prin biotehnologie termen­
tativă, doar vitaminele B2 şi B12.
138 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
139

Tahelul nr, 19
Caruităţile de vitamine din grupul B obţinute prin cultivarea bacteriilor propionice jv 1 .1.1. Biotehnologia vitaminei B2
pe medii sintetice
sin: riboflavină, lactoflavină, vitamina G
C17H20N4°1>
Mr = 376,36
CH20H

.. \ HO-C--H
I
~\<.~~i~ , ;. ...

1.
2.
Tiamină
Riboflavină 241 1 180 1 2lO
562
420
I
HO-C--H
3. Piridoxină - 4,5 125 4,9 25
_
4. Vitamina BI2
Acid
181 O 230 o I
5. 500 25.8 235 25 1 227 HO--C'-H
EantolelJ)c
6.
Acid
nicotinic
230 524 1 522 I
H -'._ C ._-_._ H
7. Acid folie 155 35,4 I 72.5

Tabelul nr. 20
H3C~r;;?JC/~'I ,?Ny N",
O

Cantităţile de vitamine din grupul B obţinute prin cultivarea Propionibacterium

technicum pe medii naturale H3C
~
' N II
). /N""
H

lil
1. Tiamină
'~f.~ţ~l,;:!0~!;:?!~:,·!ţ~~~S.~::,
11.8 1 53
O
Vitamina 82 a fost izolată iniţial din lapte (A. W. Blyth, 1879) şi denumită
lactocrom, culoarea sa galben-intensă tiind responsabilă de cea a laptelui natural.
Mai târziu s-au descoperit În ouă şi ficat substanţe cu structură flavinică, ce s-au
dovedit a ti identice cu substanta izolată din lapte.
2. Riboflavină 50
3. Piridox ină 168,4 124 În 1932 O. Warburg şi W. Christian au descris o enzimă respiratorie galbenă pre­
4. Vitamina BI2 () 180 o zentă în fungi, ce a fost identificată În 1933 ca tiind vitamina B, de către P. Ellinger
5. Acid pantotenic 87 4.3 30.5 şi W. Koschara şi concomitent de R. Kuhn, A. Szent-Gyorgyi şi J. Wagner-Jauregg.
6. Acid nicotinic 804 140 627 Se mai numeşte şi riboflavină (termenul sugerează prezenta ribozei în struc­
tură). Are o structură flavinică, rar întâlnită în natură. Conţine un nucleu
henzopterinic (izoaloxazinic) dimetilat şi o catenă derivată din riboză. Gruparea
ribitil din catena laterală asigură stabilitatea, solubilitatea şi obtinerea de enzime
şi coenzirne prin fosforilare,
Formele active ale vitaminei se obtin prin esterificare cu acid fosforic având rol
de coenzimă. Acestea sunt : tlavin-mono-nucleotid (FMN) şi flavin-adenin­
-dinucleotid (FAD), cu rol important în procesele de oxido-reducere din reacţiile
metabolice intermediare ale glucidelor, lipiclelor, proteinelor etc.
 140 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 141

(
\ .
P rovme diIn aport exogen, fi'lind smtetizată
si . ~ d e pante
I ŞI. de une I e microorga-
. - stabilă timp de 1 h la lOOoC când este la pH = 1,7 -5,5 ;
J nisme, dar este produsă şi de flora intestinală endogenă. - stabilă timp de I h la 800C când este la pH = 1 ,3-6,5 ;
\ Surse de vitamină B, sunt: unele specii de rnicroorganisme, lactatele, ouăle, - expusă timp de I h la JOOoC şi pH=8,7 pierde jumătate din activitatea sa
) carnea, fi,catul, peştele, -cerealele integrale, ciupercile, legumele verzi, drojdia de biologică.
l
bere etc. In tabelul nr. 21 este prezentat conţinutul În vitamină B2 al unor alimente Este stabilă în mediu acid faţă de unii oxidanţi (HNOJ, HP2)' dar instabilă
şi microorganisme (adaptat după l. Mincu, 1993; C. Oniscu, 1973; 0.0. Bedeleanu, faţă de persulfaţi, permanganaţi şi fală de reducători.
1. Manta, 1985). Este greu solubilă în apă, foarte solubilă În soluţii alcaline, solubilă În acid
acetic, piridină, alcool benzilic, alcool amilic, fenol, insolubilă în alcool, cloro­
Tabelul nr, 21
form, eter, benzen, acetonă. Soluţiile apoase neutre au o fluorescenţă galben­
Continutul În vitamină 82 al unor surse naturale
-verde. Solutiile acide sunt stabile la cald, dar În mediu alcalin se degradează
~i\ ţH.1 :;:·?r:'{.: ·~:=.Sti}$~ lJf~lţi~~~;:} .. ',._ .•.. . ·G~;;ţ;~d~!i~~ln~·(4\~%) rapid. Solutiile apoase saturate au un pH =6 .
Sub actiunea luminii, solutiile îşi pierd fluorescenţa şi activitatea biologică,
1. I Lapte de vacă 0,2 când se formează lumicrornul (în mediu acid), sau lumiflavina (în mediu alcalin),
2. I Ou de găină 0,36
aşa cum se poate observa În figura nr. 32.
3. I Unt 0,4
Solutiile apoase neutre şi acide au o slabă activitate optică. Soluţiile apoase
4. I Carne de vită 0,3
5. I Carne de pui 0,16 alcaline au activitate optică în funcţie de pH şi de concentratie.
o. I Carne de porc 0,19
7. I Ficat 3,5
8. I Peşte 0,10 CH20H
9. I Mazăre uscată 0,3
HO-C-H
I
10. I Fasole verde 0,2
11 . I Salată verde 0,12 i
12. I Cererale integra le 0,2 HO-C······H
13.
14.
I
I
Drojdia de bere 4-5
I H3CX~"î(N N O
Penicillium crysogenum 4-4,8 HO-'C--H
15.
16.
I
I
Clostridium btuilvcum
Mycobacterium smegmatis
13-20
860 H-C--H
I H'/
/h" H,C ~NJ'X F"f '<, H
Astăzi se obţine la nivel industrial atât prin sinteză chimică, cât şi prin bio­
I O Lumicrom O

sinteză, producătorii majori fiind Hoffmann-La Roche (Elvetia), BASF (Germania), H3C)::XNyN'(
ADM (SUA), Takeda (Japonia). Anual se obţin aproximativ 2500 de tone, din
H3C NP"1i ~H
care 75% se folosesc În industria alimentară şi În zootehnic, iar restul de 25% în ~hV CH3
industria farmaceutică. O HO·~ I O
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
Riboflavină
H3CX
N"-X
'
. 1)
:?Ny N
Este o substanţă solidă, cristalizată (se prezintă sub trei forme polimorfe cristaline
cu puncte de topire diferite), de culoare galbenă până la galben-portocaliu, cu
-"'.1 .:
.,
H3C ~ N4 iJ ~H
O
p.t. =280-287oC (cu descompunere). Are un gust amar şi miros slab. Este l.urniflavnă
termostabilă, proprietate dependentă de pH :
Figu ra n r, 32 Degradarea ribollavinei În solutie apoasă În conditii diverse
- stabilă timp de 1 h la 1200C când este la pH =2-5 ;
 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 143
142

Este importantă pentru procesul de creştere, asigură integritatea epiteliilor, ashbyi, care parazitează bumbacul, cafeaua, tornatele şi citricele. În tabelul nr.
este protectoare pentru celula hepatică şi favorizează absorbtia Iipidelor din tubul 22 se pot observa o serie de producători de vitamină B2 şi productivitatea tulpinilor
digestiv. respective (după M. Coman et al., 2004).
Se utilizează pentru prevenirea şi lraf:g@.l! _d~fi.c;it~.lgL.'!..c~ş_ţei _vitamine_, În Tabelul nr, 22
tratamentul unor dermatite, eczeme, stomatite, keratite, irite, conjuctivite, tulbu- Microorganisme utilizate În biosinteza vitarninei B2
i:~@"~~f~ţen;ia~~pil~tuib~ri~j~~e~Qlogjce;;, i!1sYJ!J~iţntii.hipAtj_~~:.ţi~tamentul .
. ___
--,---- --,_
"
-wlOr ..anemii
_--_._din
. -,...- bolile
.. ~-~ .•. . - .•.. ~._infecţiQase.
---. Nr.crt, ~~roorgani~.Di~ ~t~i.Za!e . ! Ptod.,.ct~viiiife '
Nu are reactii adverse, chiar şi la doze mari. 1. Eremothecium ashbyi > 2000 ug/ml
'S"e administrează oral şi parenteral (i.rn., i.v.). 2. Ashbya gossypii > 5000 ~lg/llli
Se comerclaiIieâî.Ifs-':ii;-fon11ă·oei%oflavină, ribotlavină 5-fosfat şi riboflavină 3. Candidaflaeri 700-800 ug/ml
5-fosfat sodică. Esterii fosfaţi se utilizează În produsele farmaceutice de tip 4. Bacillus subtilis 4,5 g/l
multivitarnine. Alcoolul benzilic (3 %), acidul gentisic (3 %), ureea şi niacinamida 5. Corynebacterium ammonigenes 17,4 g/l
se utilizează pentru solubilizarea riboflavinei, atunci când se comercializează ca 6. Closiridium acetobutilicum 80-100 ug/ml
solutie pareuterală.
Deşi speciile de Candida (Candida flaeri , Candida tropicalis, Candida guiller­
Produse farmaceutice: mondii, Candidafamataţ cresc uşor şi rapid pe medii simple şi au o productivitate
RlBOFLAVIN FOSFAT (Sicomed - România) satisfăcătoare, totuşi nu se folosesc la scară industrială pentru că sunt foarte
fiole 10 mg/2 mi sensibile faţă de ionii de fier, care afectează f1avinele.
Vitamina Bl se poate obtine şi cu ajutorul tulpinilor modificate genetic ale
Tehnologia de biosinteză a vitaminei E2 baterii lor de tipul Bacillus subtilis şi Corynebacterium ammonigenes, la care
Vitamina B2 se izola din surse naturale (ficat. drojdie, zer, extract de malţ) pe genele responsabile de enzirnele implicate În biosinteza ribotlavinei sunt supra­
baza adsorbţiei pe părnânturi decolorante din solutii acide, urmată de o serie de exprimare şi pot biosintetiza cantităţi de aproximativ 4,5 g/l respectiv 17,4 g/l de
desorbţii şi readsorbţii şi în final de purificare, pentru a obţine produsul de ribotlavină (S. Koizumi et al ., 1996; J.B. Perkins et aI., 1999).
puritate farmaceutică. Procedeul era foarte laborios, cu preturi de cost ridicate, Microorganismele de tipul Ashbya gossypii (sin: Erell/o/heci/l_!!!__E.ossypii) şi
EpeilwiliecTiiinashbYI'sun'i"f"6Iosite"ilTelllleÎi.la:ilire·,ndustri~t;p'~-;Uru că-;U"(; pro::-'
fiind abandonat la ora actuală.
ductivitate mare, nu sunt sensiblie-liiCantităţi mici-cte'joni fier, deşTs'iii1llIlstabile
S-au făcut o serie de Încercări de separare a vitaminei B2 din mediile de
cultură ale bacteriilor lactice şi butirice. Acestea nu sunt capabile să biosintetizeze
-dTii punci"de-vedere'geiletic-:-l'riii"oiversemutaţ;rale tulpinilor originale (iradleri
riboflavina. dar o acumulează în biomasă în cantităţi mari (115 ug/g biornasă ~-;;-me X)~~u'obiilîutmutan!iînalt productivi care produc peste 5000 ug/rnl, în
cazul mutanţilor de Ashbya gossypii şi peste 2500 ug/rnl riboflavină în cazul
pentru bacteriile lactice şi 136 ug/g biornasă pentru bacteriile butirice). Biomasa
mutanţilor de Eremothecium ashbyii (unele tulpini mutante de Ashbya gossypii
este utilizată în zootehnie, Însă restrângerea productiei ferrnentative a acizilor
pot atinge o productie de 1750 mg/l riboflavină, iar tulpinile rnutante de Eremo­
lactic şi butiric face ca aceste procedee să fie şi ele abandonate.
>,
thecium ashbyi pot produce 86 mg/l ribotlavină).
O metodă aplicată la ora actuală este sernisinteza chimică, ce porneşte de la
Tehnologia de fermentaţie este cea clasică, etapele parcurse fiind: pregătirea
riboză, care se transformă pe parcursul a 3 etape chimice în riboflavină. Riboza
inoculului, pregătirea mediului de cultură şi sterilizarea lui, fermenta(lăprupriu-
provine la rândul ei din culturi de Bacillus, tulpini modificate genetic ce contin
'~i.~ă, s.~p~~:~~ şi j'iiillficarearil5l5f1avliiei. '
operonul gluconat supraexprimat. Metoda este economică, motiv pentru care
Mediul de CUlLU'fă conţine : ..- . .
multi producători preferă sernisinteza chimică în defavoarea metodei biochimice.
Metoda biochimică de obţinere a vitaminei se bazează pe o serie producători surse de carbon: glucoza (3-4%)" :lalmrl)~<l.J .I:)1.<i1.t.9A.'b ).n~.@_Şll_jm!li putin
de vitamină B2' ce sunt sunt-specii de bacterii, mucegaiuri şi drojdii. Cei mai loi(isii~r-pejlfru-că oferă randamente scăzute), extract de malţ 1 %, manoză,
buni producători sunt însă ascomicetele de tipul Ashbya gossypii şi Eremothecium glicerol, manitol, sorbitol, lipide (duc la randari1eilte-iiiai:iliiri'60flavină);
 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
144
- _ sllr_s~._<t~~zot__9Ig!!.nic.: extract de _p'QnJmb,--cazeină, .făina.de.soie--făină de
peşte, peptonă (extracte de carne), extracte de drojdie, micelii de peniciline şi
tetracicline, colagen, clei de oase;
- _surse..de_azoLanorganic: săruri de amoniu ;
- vitamine: inozitol, biotina, tiarnina etc. ;
precurs.()r_i: _.~antină, hipoxantină, guanină, adenină (precursori purinici) ;
_ oligoeleme~t~ __şi micr<?elel!1ente: săruri de fosfor, magneziu, zinc, fier etc.
Sursele de carbon cele mai folosite sunt glucoza şi fructoza. Ele sunt necesare
atât în faza de creştere a microorganismului cât şi în cea de elaborarea a vitarninei.
Sursele de azot organic asigură necesarul de aminoacizi care stimulează creşterea
biomasei (acidul glutamic, acidul aspartic, asparagina) şi asigură formarea vitami­
nei B, (treonina, serina, tirozina).
Precursorii purinici se utilizează în concentrarii molare mici de I ,5-2x 10-3 şi
asigură un randament cu 25-40% mai mare decât în cazul termentatiei fără aceşti
precursori.
_tv1edi':l~_<:!~~~~~!~_~-e_p-gatţjI}Jţg~ _d.ţŞJ!lLcf<;!.yşQr, ceea ce fa_c~__"e._ş.terilizarea
.să fiţ__.uD.:_p_roc;esdeoseb.it.gt':jrnpo(tafllln a,,-~?ştă tehnologie. Se realizează la
1400C timp de 3 minute, componentele glucidice sterilizându-se separat, pentru
a împiedica formarea bazelor Schiff.
Fermentaţia se realizează pril!_E..ultivart:~J!~_p.!Q!llllzin_~_~._mic.!~9!ganismului
eroducător oferind randarnente satisfăcătoare, economie de spatiu şi manoperă şi
·(;bii-;;~~~~nuiprodUs·de·-caniaie-super'ioară.
Ca orice proces ferrnentativ, biosinteza ribotlavinei este influenţată de o serie
de factori, cum ar fi :
• tipul de microorganism;
• calitatea inoculului ;
• compozitia mediului de cultură;
• pH-ul mediului;
• temperatura;
• aeraţia ;
• agitarea mediului;
• aparatura folosită.
Fermentaţia se conduce la un pH =6,5-7 pentru tulpinile de Eremothecium
ashbyi şi la pH=6-6,5 pentru tulpinile de Ashbya gossypii. Procesul are loc în
cele trei stadii :.j!Joculato~!-im~r:nlţ_di_aŢ,r~gi!!!l_p~__ !:!..n 1ŢI_C::~!l! ~~_<:!:!Iţl:lf-~.c~ontine
glucoză, extract de porumb, aminoacizi; uls;_ÎuIi.vegetale, microelemente şifosfat
monop~U;-;ic.- Fe-rmentalia-a~i~~'ti-~p de aproximativ J 50 de ore, la temperaturi
cuprinse între 28-30oC, o aeraţie de 0,25 rrr' aer/rrr' mediu/min. şi o viteză de
agitare a mediului de 140-150 rot/min.
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ J45
Biosinteza vitaminei are loc în 4 faze:
- p~ima fază ai:ireaZa-2t)=25"ore~timp în care se acumulează biomasa, iar
illTcrobrg3ilisn;'ufajurige-ia"inatuî-ităte3ă;~--âe-la-b()ra:' vltall1ina;"'îri acea'slăTaiă
-conslÎfffar-degluc'i~reeste"iilaie; 'ial:ptrt;r~-;~d~ d~t~~i'~ă ~cti~'i;ăţii-~ic~oorga-
11isilii.iTiii;-i11oD~~.Ii..ţqtr!l_99Xe.. d :se._ âju;tea~I~'o;'tlnulÎ;' ',- '. -. , --
- îiî·a··do;:iâ'''i~?ă (20-25 ore) se formează spori În biornasă care declanşează
tl~v_i.!!·og~n~za ; consumul de glucide şi'de-pl:eciirsori-este n1are~"ia-j:pH-uÎ are
o..!~n~Flftrde"~~ădere ; " -. - .---
- în faza a treia (100 de ore) se formează cantităţi mari de vitamină, iniţial ca
n1etabOIit-;;;t~~~eiulardupă care-se reaparti"ieaza între
-rllicefiu şrÎÎ1-edlll:-Tă;la
s1fuş;Wi-bi~;si~t~zei' se găseşte preprindereîîtînrueditîl de culii.i"r·ir;gTiiCidele
sunt"'~~~;ul11ate aproape în întregime, iar pH-til încep(:""s~rcj-ească;'- '. ''''-
- tazaa patra este caracterizată deincetarea biosiniezei, inceperea unui proces
de~~toiIză a miceliului şi . creşterea- br:lisca a plr-lliLII.· ·E-iapi; ti:ebuie- evitată
î~'i'~ucât începe şi ~:~I:adâi:e~:~.~t~~i_~~~_!~~.--· '-. - .. --- -.-- ..... -_.---.- .. --
La sfârşitul procesului fermentativ vitamina B, se găseşte preponderent În
mediul 'de cultură. Pentru a cIepTasa"ioâti:Cvitaiilinil'B, din miceliu, se}!da~gă În
-nledi~f: d~__ .<:Ll_ltură la sfârşitul fe~rrleîltăi,el,- o·--se,:!~·-ci,~'-su-~_ş!.a_~·i~_~e mă~sc
săi~bilitatea vitaminei în apă, forţând-o să iasă din rniceliu. Astfel, se u'iiTii"ează
substante ca: acid formic, acid galic, acid p-arninobenzoic, acizi hidroxibenzoici,
amide alifatice, nicotinarnida, tirozinaminda , N-metil acetamida, propilenglicol,
boraţi, uree etc.
Prin concentrarea mediului de fermentatie ca atare şi atomizarea directă a
acestuia (riboflavina este stabilă terrnic) se obtine un produs de puritate mai mică
(contine şi o serie de zaharuri şi proteine) folosit Îli hrana animalelor.
În cazul vitarninei B2 de uz farmaceutic, ce trebuie să aibă o puritate mare, se
aplică izolarea ei din mediul de cultură, urmată de purificare.
Miceliul de Eremothecium ashbyi, sau cel de Ashbya gossypii . este fin dis­
persat, motiv pentru care biomasa se încălzeşte la 60-70oC şi se acidulează, când
coagulează proteinele, astfel încât filtrarea biornasei se poate realiza rapid şi
eficient cu ajutorul filtrelor presă, după o prealabilă răcire la 20oC. Filtratul
obţinut, se supune procedeelor de separare a vitaminei, care se pot realiza prin:
• reducere chimică la dihidroribotlavină şi reoxidare la riboflavină;
• reducere şi reoxidare biochimică ;
• extracţie cu solvenţi selectivi ;
• adsorbţie pe răşini schimbătoare de ioni.
Separarea cu ajutorul schimbătorilor de ioni, deşi oferă puritate mare, nu este
încă aplicată industrial.
 146 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 147

Extractia cu solvenţi este neeconomică, necesitând consumuri mari de solvenţi

(raportul solvent : soluţie apoasă este de 1 : 1), este relativ toxică şi implică multă 1V. 1 . l .2, IJiqtC?M()logia vitaminei'~2"
manoperă. Fazele de extractie implică precipitarea din soluţie apoasă cu acetat de
plumb, acid fosfotungstic şi săruri de argint. Precipitatul argentic eliberează sin: ciancobalamina, factor extrinsec, factor LLD, factor antipernicios
vitamina prin tratare cu HCI. Se purifică prin adsorbţie şi eluare cu soluţie diluată C63H8sCoN 14014P , nH20
de piridină, urmată de obţinerea complexului argentic şi eliberarea vitaminei M, = 1355,36
cu H2S.
Cele mai folosire procedee sunt primele două metode: cea de reducere şi

-z
reoxidare chimică şi cea de reducere şi reoxidare biochimică. Dihidroriboflavina, CN
obţinută prin reducere, este o subganţă insolubiIă_~~lap~_.~.<irţ: .?t! _şt!P(i~ăprin
filtra~~-se- us'~~ăşfse-preiuCreazăult~rior Tn-ve(le-~ea reoxidării şi purificării.
o I
( H3C
V)~~
_. ._. •• _. __ •__ .,_ •• 0 __ • __ "'_' __ •• .._"_ '_.'_. __ ~~ '~"'_~ __ "' __ " ._. _ ._ •••• • _'_'._" ' __ ' ••• ._ •• _ •• _~ •••• - ••••••••••••

R R H macroc ic lu HzN--\_- <,. ( ~ NH O

I I I
H3CXX/Nx;. N,y H3CXX' i. NXNyO
O corinic
+ 2H+

H3C I ~
I N
::;;r==..~

r I. II/" '''1 / N"" X

/"--.,A ;'/ \\ NH2

H3~A /.fo"~
" -, (
- 2H+
~ N '----..·H HC/
3 I
~ N '("-...H I Hl:f
O
O H O
Dihidroriboflavină
/' 'N / \ ~- CH3
Riboflavină \ D " Ij (" .. _

2
17' \ --z~.
/
~/,/",~
1,
. . . -r-,
-- CH3
,,/ N H 2
._ Reducerea chimică se realizează cu Na2Sp4' SnCI2, TiCI] în medii acide,
când se'eTibereaiă-Tîidrc)geri: ca-ie--ie-ăflzează .
reduc~}·ea ,rjQQtlavjnei. Precipitarul
,---
H3C ""~I"'" -: \ ',/ il
obţinut ';~';~p~ră"'pr;n-
cel1tr'i f~gar'e, se'
uS;_;~i(}<C~_():-s. Q~_<;:, Şe pulverizează şi se ' O
oxid"eăZ1nntr_:-u-ntu~i;de-o~ida~e 'c'li aercald '(40-450C) timp de 2 ore. Oxidarea CH3 \ CH
se'perte'cteaz1\'aporcu''fi ~(5;:dupi:(care se H3C"Ţ"~/
~
'O
,
'N~ =X'" / 3

<'2 ~ (,
cristalizează vitamina B2. 5

Procedeul de reducere şi reoxidare chimică se realizează cu randamente de partea O"

90-95 %, iar vitamina obţinută are puritate farmaceutică, nuc leotidică Pl·-~O
'.. .__· •....•. ....__ N C H3
Reducerea biochimică se realizează cu ajutorul unor microorganisme, care 0- <; 0 HO I
prin fermentaţie anaerobă pun în libertate hidrogen, ce va reduce riboflavina
aflată în mediul de cultură,
Astfel de microorganisme sunt: Streptomyces zymogenus, Streptomyces cre­ f···-~
moris, Clostridium acetobutilycum, Escherichia coli etc. Aceste microorganisme
f-"""""'O""""'---­
sunt cultivate anaerob în soluţii apoase ce conţin ribotlavină.
Metoda este elegantă, mai putin toxică, oferă randamente mari în riboflavină, HO/
dar este mai putin folosită de către producătorii industriali, deoarece are o durată
mai mare (24-48 h), comparativ cu reducerea şi reoxidarea chimică,

Descoperirea vitarninei B 12 începe cu 187 de ani în urmă şi include acordarea

a două premii Nobel.
 ·mr

148 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDtCAMENTE DE BIOSINTEZĂ 149

1. Combe de Edinburgh şi Th. Addison au descris prima oară anemia megalo­ Tabelul nr, 23
blastică În 1824. Mai târziu, În 1860, Austin Flint a descris atrofia gastrică severă Continutul În vitamină B 12 al unor surse naturale
ce are legătură cu anemia, iar În 1872 M.A. Biermer a denumit afecţiunea ca $~k'd~ :vit8ti.{~~:~î2 .•.
Nj:.:Cf't. C,~Qtitatf,!iI de :vjUpnil!~(Jl~ro).
fiind anemie pernicioasă progresivă.
În 1926 G.R. Minot şi W.P Murphy au obtinut premiul Nobel întrucât au l. Lapte de vacă 500
demonstrat importanta consumului de ficat crud pentru combaterea anemiei, din 2. Ouă 0,4
3. Carne de vită 2,0-2,7
acesta separându-se acidul folie, care Însă corecta doar tulburările hematopoietice
4. Carne de oaie 2,5
fără a influenta şi tulburările nervoase. 5. Carne de porc 0,9
W:B. Castle evidenţiază în 1929 necesitatea existentei factorului intrinsec şi
M. Shorb a factorului extrinsec în 1947, necesari absorbţiei vitaminei. Analogii vitaminei BI2 sunt clasificaţi în două grupe:
Peste 20 de ani, E. L. Rickes, E. L. Smith şi colaboratorii lor au izolat şi • analogi semisintetici ;
cristalizat vitamina B12• Dorothy Crowfoot-Hodgkin a determinat structura prin • analogi naturali.
cristalografie cu raze X, primind în 1964 premiul Nobel.
Structura vitaminei B 12 cuprinde: Analogii semisintetici provin prin înlocuirea ligandului CN cu alti liganzi
anorganici:
1. macrociclu porfirinic (corinic) format din 4 inele pirolice (A,O), cu 6 duble
legături conjugare, substituit cu resturi metilice, propionamidice şi acetarni­ aguacobalamina (sin: vitamina B 12) are ci moleculă de apă;
dice, ce are un atom de cobalt central legat covalent şi coordinativ de cei 4 - hidroxicobalamina (sin: vitarnina B 12h) are o grupare -01-1 ;
atomi de N coplanari din macrociclul porfirinic, de atomul de N din restul de - nitro-cobalamina (sin: vitamina B I~J ;
5,6-dimetilbenzimidazol şi de o grupare CN ; - clor-cobalamina;
2. rest de 5,6-dimetilbenzimidazol, ce se leagă de nucleul corinic în unghi drept - brom-cobalamina;
prin intermediul ionului de cobalt şi al ribozei ; - sulfat-cobalamina;
3. riboza esterificată cu acid fosforic, - tiocianat-cobalamina;
- vitalllina Bili (are atomul de Co bivaleru, fiind de culoare portocalie-brună);
Molecula vitaminei B 12 are deci 2 portiuni: - vitalllina Bili (are atomul de Co monovalent, fiind de culoare cenuşie-verde);
- partea nucleotidică, formată din: restul de 5,6-dimetilbenzimidazol + riboză Aquacobalamina şi hidroxicobalamina sunt compuşi tautorneri izolaţi din
+ acid fosforic ; mediul de cultură al speciilor de Streptomyces aureofuciens, Streptomyces griseus,
- partea macrociclică, formată din: macrociclul corinic şi ionul central de Co'~+ Streptomyces fradiae , cultivare în absenta ionilor CN. Pot fi obţinute şi prin
cu număr de coordinaţie 6. reducerea vitaminei B12' sau prin fotoliza acesteia. Ele sunt forme fiziologice de
Organismul uman este dependent de sursele exogene. Vitamina BI2 se găseşte depozitare a vitarninei Bil în ficat. Nitro-cobalarnina. clor-cobalamina, tiocianat­
în cantităţi foarte mici în produsele de origine animală (carne, ficat, ouă, lapte, -cobalamina au fost şi ele izolate elin mediile de cultură ale specii lor de Streptomyces
peşte), Iipsind din produsele vegetale. Vitamina este sintetizată aproape exclusiv griseus. Se pot obtine şi prin tratarea vitarninei BI2 cu aciziicorespunzători. Aceste
doar de bacterii. Conţinutul în vitamină B 12 al unor alimente este prezentat în cobalamine, sunt însă putin stabile, iar În prezenţa ionilor CN trec în vitamina
tabelul nr. 23 (adaptat după 1. Mincu, 1993). B12. Reducerea vitaminei B12' în solutie acidă sau alcalină în prezenta cisteinei,
Ciancobalamina este prototipul familiei de compuşi ai cobaltului numită duce la formarea vitaminelor B 12r şi B 12s'
corinoidc. Analogii vitaminei Bp' ce diferă prin natura 0-ligandului legat de Analogii naturali cuprind:
cobalt, se numesc cobalamine. În organismul uman vitamina BI2 este transformată - analogi fără nucleotid: acidul cobiric (sin : factorul VI,,)' cobinamida (sin:
în formele ei bioactive, metilcobalamina şi 5-dezoxiadenozilcobalamina, ce sunt factorul B) ;
coenzirne. - analogi cu nucleotid , care au altă bază în loc de 5,6-dimetilbenzimidazol :
pseudovitamina B.l2-are adenină, factorul A-are 2-metil adenină, factorul G-
,:)

.~
o'!!
 150 CĂTĂLlNA DANtELA STAN MEDICAMENTE DE BIOStNTEZii 151

are hipoxantină, factorul H-are 2-metil-hipoxantină, factorul III (vitamina În terapie se indică în tratamentul:
B12I1)-are 5-hidroxibenzimidazol.
- anemiei megaloblastice prin deficit de B]2 ;
- coenzime: metilcobalamina şi 5-dezoxiadenozilcobalamina; - neuropatiilor;
- analogi biosintetici: dehidrovitamina B 12' - nevralgiilor;
Toti aceşti analogi au o activitate mai scăzută, sau cel mult similară vitaminei BI2'
- afecţiunilor psihiatrice;
La nivel industrial, vitamina BI2 se obtine folosind culturi de Propionlbacterium
- cirozei hepatice;
shermanii, sau de Pseudomonas denitrificans, principalul producător fiind com­
- tulburărilor de creştere;
pania Rh6ne-Poulenc (Franta). Se obtin aproximativ 10 tone/an de vitamină B'2'
- rnalnutriţiei.
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice Preparatele farmaceutice se prezintă sub formă de solutii apoase de culoare
Se prezintă ca o substanţă cristalizată. sau pulbere cristalină, de culoare.roşie roşie ce se administrează i.m., s.c.
închisă •. fără miros şi fără gust. Substanta anhidră este higroscopică (fixează până Se comercializează şi sub formă de preparate polivitaminice, sau o serie
la 12% apă prin expunere la aer). Cristalele se innegresc la 210-220°c_ Are de asociatii cu extracte de antru piloric, extracte vegetale etc., care se adminis­
p.t. =300-320oC (cu descompunere). Este putin solubilă în apă (1 g se dizolvă în trează oral.
-80 mi apă), greu solubilă în etanol. insolubilă în eter, cloroforrn, benzen,
Produse farmaceutice:
acetonă. Cristalele hidratate sunt stabile în prezenta aerului. Solutiile apoase sunt
neutre şi au un maxim de stabilitate la pH =4,5-5, putând ti autoclavate 20 de DEPOVIT B'2 (Amriya - Egipt)
minute la 120°c_ Este foarte stabilă în timp În solutie neutră (Ia 200C şi la fiole I rnl, 1000 ug/ml
întuneric, după I an, are aceeaşi activitate). În solutii puternic acide şi alcaline VITAMINA B'2 (Sicorned - România)
este rapid inactivată. Lumina inactivează vitamina, putând duce la pierderi de fiole I ml, 50 ug/ml, 1000 ug/ml
80% în decurs de 6 luni. VITAMINE B'1 (Lab. Renaudin - Franta)
Absorbtia orală a vitaminei BJ1 necesită prezenta factorului intrinsec al lui fiole 1 mi, 100 ug/rnl
Castle (o glicoproteină secretată de"celulele parietale gastrice). În sânge, vitamina VITAMINA B'2 (GeroVital - România)
este transportată de o bera-globulină - transcobalamina Il - care o distribuie în fiole 1 ml, 50 ug/ml. 1000 ug/rnl
ţesuturi. Se depozitează în ficat. În organismul uman, coenzimele active la nivel BEPLEX FORTE (GeroVital - România)
celular sunt - metilcobalamina şi S-detoxiadenorincobaiamina, flacon solutie injectabilă II mi, complex de vitamine
Carenta de vitamină B" este rară, principala cauză fiind lipsa factorului BECOBION (GeroVital - România)
. iIJJJ:in~ţ_c~.caK9_~lţ_r.mioii_
i!pID:iJia_allerllie.i.pernicioase (anem ia Bi~rITier)-:-ce-fuce fiole 1 rnl, complex de vitamine grupul B
parte din categoria anemiilor rnegaloblastice. BENA INJECTION (GeroVital - România)
.. Esfe-blile'ioierat~(de organisfnul uman, deşi poate produce reacţii alergice la fiole Imi, 1000 ug/rnl
administrarea parenterală. MECORET (GeroVital - România)
Prezintă importantă farmacoterapeutică. având următoarele roluri: fiole Imi, 500 ug/rnl, metilcobalamină
este implicată în sinteza nucleoproteinelor ; VITA-RUB (GeroVital - România)
- este iniplic-arâîTISînteza-ĂDN=tIlW'; fiole Imi, 1000 ug/ml, hidroxicobalamină
- este implicam-îifmâi:urarea'ceftiiară ; METHYLCOBALAMINE (Smart City - SUA)
- este implicatăîn sinteza-âcizilorg"'aşi, care sunt importanti pentru normalitatea cp. sublinguale, lmg
membranei neuronale şi âteciloroemielină de la nivelul SNC-ului ; VITAMINA B'2 FORTE (Organika - SUA)
- influenţează activitatea măduvei hematopoietice ; cp. rnasticabile, 1000 pg, metilcobalamină
- este factor lip6[f6p~pf6Tejâna-ficatur;--· FERRO-FOLGAMMA (Worwag Pharma GmbH - Germania)
__ ._-_ ... .....• _~_ ... ~
- menţine trofiCitatea-inucoaseT-g-astrice.
---------~,. _
cps. moi, fier + acid folie + vitarnina B'2 0,01 mg
 152 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 153

FARCOVIT 812 (Pharco Pharmaceuticals - Egipt)

cps. moi, fosfolipide + complex vitamine (8'2 10 ug) + extract de Cynara
3) ~(ju?t_i!_~~!-e''mic,!!Qţetitfireprezintăsursa cea mai importantă, acestea fiind folosite
. astăzi pentru obtinerea industrială a vitaminei 8'2 de uz farmaceutic.
+ ulei de şofranel Speciile microbiene pot produce vitamină 13'2 printr-o fermentatie nespecifică,
HEPA1DN PLUS (GlaxoSmithKline - SUA) sau printr-o fermentaţie specifică.
cp., complex de vitamine (8'2 5 ug) + minerale + extracte din plante +
fosfolipide
v9ca !!~ unor actinornicete duce la ~~~~~=~~~_~~.~i antibi?tic,
p;o\lspm:pa;a;;;;nnentatiei,~i secundar la QQţi!l_ţ!~Jlanllne:l-B 12'
MILGAMMA (W6rwag Pharma GmbH - Germania) Tulpinile de tipul: Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus , Streptomyces
cps. moi, vitaminele 8, 40 mg + 8'2 250 ug a ti reofaciens, StreptomycesfradTae :-uril lor-
izaie-la-prc)ai.iCere'iialliThl'otlce s trepto­
MILGAMMA N (W6rwag Pharma GmbH - Germania) micină,'au-ieomiCinK, teramTcTi1ă-;--tetraciclină "şTneomicin( pot-prodUCe'secundar
cps. moi, fiole I mg/2ml, vitaminele 8, 40 mg + 8290 mg + 8'2250 Jlg vitanli~ă,B-,;. Mediile lo~ a~'ctiitui-ă'coiltli';~-inlîneiec'ăZlij-I:-O:-5=-TiiiiVIvÎt~ilTiina 8,~.
8EVIPLEX N (Galenika - Serbia) Prin biosinteză n~c:lir.U~~ţ~ se obtin cantităţi !1)i(;ide vitamină 8'2' ceea ce face
dj., vitamine din complexul 8 (8'2 0,001 mg) ca acest procedeu să "nufie prea economic şi deci putin aplicat industrial, deşi
NEUROMULTIVIT (Lannacher Heilmittel GmbH - Germania) materiile prime folosii~' sunt ieftinetun avantaj pentru această tehnologie). Totuşi,
cp. filmare, vitamine din complexul 8 (8'2 0,24 mg) se poateeizola,vÎfamina,812 din aJ:?~!~ industriale rămase de la sep.~~~r_ţa.ş_t.r.:ţpt()l11i­
CALl8RUM (Zentiva - Cehia) cinei, tetraciclinei şi neornicinei. Din aceste ape se adsoarbe vitamina pe coloane
cp., complex de vitamine (8'2 5 ug) cu cărbune, bentonire, sau arnberlij, după care- se e1ueaza c-orc.lanele C;U solvenţi
OLiGOVIT (Galenika - Serbia) s~Pfi-ldlnă:-soiuiiraeCIanu·ri.alneStec-apă-ăc'itonă:'=·HC(~tc·.)ŞT;;puritlc'~
cp., complex de vitamine (8'2 2,5 ug) -fnti~i(vitarnina prin metode cromatografice. Aceste procedee de separare şi
CENTRUM CU LUTEINĂ (Wyeth - Germania) purific'ilre-ille'vitaminei suniexirem de scunlp;: ceea ce constituie un dezavantaj
cp., complex de vitamine (13 '2 l ug) major al acestei tehnologii.
De exemplu, mediul de cultură obtinut în urma fermentariei tulpini lor de
Tehnologia de biosinteză a 'Yri~ti1inei, B12 Streptomyceş griseus se tratează cu KCN şi se Încălzeşte, când se eliberează
I Vitarnina se poate obţine astfel: vitarnina de proteine. Solutia obţinută se trece peste coloane cu cărbune, care se
spală ulterior cu fenol 6 % pentru îndepărtarea impurităţilor şi se eluează cu o
f- prin extractie din ficat de hovine ;
'/ I din nămolul activ al statiilor de epurare;
solutie de acetonă 60%. Solutia acetonică obţinută se fracţionează cu amestec
butanol : sulfat de amoniu, după care se separă vitarnina din solutia alcalină cu
1- din culturi microbiene.
fenol-benzol. Ulterior, au loc o serie de precipitări repetate cu eter şi în final
~) 1!pi:.()i;e.d~e!e:.@găi;ţ7ve~s-auaplicat în trecut. Din ficatul hovinelor, separarea . cristalizarea vitaminei 8'1 din soluţie apoasă 'cu acetonă.
vitaminei se realiza prin proteo!iză cu ~iDt.activatR cu ReN şi .~d~e
c~. Coloanele cu cărbune se eluau cu alf.~tillsQ~u la cald, urmând ca
a~ ~erealizează ~1 s:OP~~?~J~ne.~i~~ami~L..'?12:~~_produs
pririCt;aFermerrtatiel:...1\stfel, se obtin cantităţi mult mai mari de vitamină,
solutia alcoolică să se purifice prin trecere peste coloane cu silice hidratată. De comParcîtTv~~-;';:;etodelenespecifice. Tulpinile folosite în fermeruaţiile specifice
pe aceste coloane, vitamina se elua cu alcool etilic de 50°. Solutia alcoolică se pentru obtinerea vitaminei 8'2 sunt: PropiollibacteriulI1 shermonii, Proplonibac­
supunea recristalizării din acetonă, iar vitarnina se purifica prin cromatografie. terium freundenreichii ; Propionibacterium technicum, Pseudomonas denitrificans.
Metoda a fost abandonată, Întrucât ~ml!entele de extractie erau ~250- Alte tulpini producătoare sunt: Bacillus megatherium , Bacillus coagulans, Strep­
300 mg vitamină 8,/t ficat), tehnologia era foarte costisitoare, iar separarea tomyces olivaceus. De exemplu, bacteria Pseudomonas denitrificans produce de
vitaminei de analogii naturali era foarte greu de realizat. 50.000 de ori mai multă vitamină 8'2 decât necesarul propriu, putând f folosită
~ _.:. ,~?Jj_aT:,!ţ~at!.t,!!,:.~ir}~~~!_tictiv·al'st{itiiloF.i1~'ef1ilrat.~a apelor: r,eZidu,P.1f se aplică ca producător.
cel mult pentru obtinerea ~a'iJil~et13)2 !!m!jere. In acest nămol vitamina se Tulpinile utilizate pentru obţinerea vitaminei 8'2 şi cantirăţile de vitarnănă 8'2
găseşte În concentraţie de - 2 mg nămol activ. Totuşi, ~3 şi pl).rific'lLe_a obţinute sunt prezentate În tabelul nr. 24 (modificat după E. Nirniţan, 1992).
vitaminei prin metode cromatografice este c~~.rţ şi ,!e_~~g,nor:lică.
 154 CĂTĂLlNA DANIELA S'[I\N
MEDICAMENTE DE BJOSJNTEZĂ
155
Tabelul 111". 24
• microelemente şi oligoelemente: carbonat de zinc, sulfat de nichel, săruri de
Canritătile de vitamină BI2 obţinute, utilizând diverse tulpini producătoare fier, săruri de mag~m: ; .. ,_
• reglatori de pH: acid cirric, amoniac, acid lactic 2 %, săruri tampon etc. ;
" ; Tuipi~a. Gompozitia meJljU!~ ,', Aerarea -: tremp, :;i),uraq.;} C$titatea
t:" • 'yllamine: colina, ribotlavina, biotina, tiamina etc. ;
pt~iJ~~oat::e ,1,', ,,·cdl!.ctdtură· ,0).\-; , "~Plediuiui ,~ .. (0(;:)', !e,t~~I!~ti~i dţ:'vi.Ulmipă
,. .' .,,' (oie), ;10" " ,p(l:u~jl)
'~_r I • precursori: 5,6-dimetilbenzimiclazol 0,5-7 mg/I ;
melasă, săruri . .' ... • '~ ~C~~.s-fJ~t~~~i_ vitaminei B12: clorura de cobalt 0,04-0,06%, alte
Bacillus minerale, fosfat de săruri de cobalt, acid 8-aminolevulinic.
megatherium amoniu, aerobioză 30 18 0,45
cobalt Mediul de cU!l\J.!:!~~~t~l?!~1?~I.!!t se sterilizea~dbc9J!tinuu~::._J.250C, sau
Bacillus extract de porumb, continuu la 140°C. Ulterior este -illocul'!.~,_~~,_J!!..aL_t.2!2.§i!.~_J~J.pJn~ . ..lU!ivel
coagulans lriet~olamillă, acid aerobioză 55 18 6
indu~~ial Ei!!5!_f.!.vl?iO/i7i)g_Oed~;-;I;'sl;erll1al1ii.
ciine, cobalt . - Fermelllali_?.2..<:..c:.l}fg!'!_după.cele,,![ei ,stadii ..:.jnoculator,_.intenn~d~aI •. restm. . .pe
. . glucoză anaerobioză tot parcursul ei se Ră~t[ţ!!:lii)'iguros Dar~metrii_Q~!!!.!:!!,_~,!_Qfoductivitatea tulpinii
P/,°PIOIII- -, , '. . . -
, . extract de porumb ŞI aerobioză proOucfuoMe să-fi~~;;-a;illlă şi o suprapres~lle de 0,2-0,3 atJ:;':p~~~'i~~;'ig~;;lrea
bacterium " amoniac precursor ' ( concentraţu
. . ." 30 140 25-40 sterilli:1iIllbioma..;eC-·_-- --
shermanii ,. , foarte mici
cobalt . pH-ul optim este de 7-7,5 şi se menţine constant pe tot parcursul fermentaliei
de 02)
Streptomyces glucoză, făină de soia, ' priJ~_~c!ăugarea-d~~i0ziJni.n!:d:i!U_şaLLhaze. Ternperatura pro~esului este _~
olivaceus săruri minerale, cobalt aerobioză 28 96 5,7 ~~.c, aeraţia optimă de 0.4-0,7 milimoli 0/1 mediu/minut, iar durata procesului
Pseudomonas sucroză, betaină, 'acid de 140-160 ore,
denitrificans glutamic, săruri aerobioză - 48 150 Bicsinteza vitaminei BI2 este stimulată de prezenta În mediul de cultură a unor
minerale, cobalt substante şi inhibată de prezenţa altora.
UJ~i~_ aJ11i!10ac~zi:_~u_J~1 __ ~~nt J~~.eti?Jlina, serina, g_I!~!.I1_<::.3_u_.':'.!)_ efe~.t _po_~tiv
Biosinteza dirijată ce foloseşte tulpini de Bacillus megatherium are loc în
asupra biosintezei vitaminei, iar alţii ca valina, leucina şi tre()_ni_nCl.. stimulează
decurs de 18 h, cultivarea se face pe un mediu ce contine melasă şi săruri ·de~vorraieit-b~cte~~i~~Uirop.i.(0[~~-'_"" '" , , . '-,,- - -
minerale, când se obtine un lichid bogat în vitamină, care după centrifugare şi
,.' Viliul1inel~_9'=!f....lil cr~~B!n_<I~i (ribotlavina, colina), sa~!.a.,sresterea
uscare permite obtinerea vitaminei cu randament ridicat.

__
biosinteze.i .. ~i_ţ_a~~inei (tiamina, biotina).
Biosinteza~~ realizată cu specii de Propiolli_!?.JJ.fJ.~riul/I sherllJLlţ}j,i,~~!~loc
printr-o,fu!Jij,entatie
, ..-" anaerobă.,...... (-3
. zile) __ __ _--
. urmată
... de ~~
una aerobă (-4 zile) ce durează
în total 140-160 ore, pe un mediu steril ce contine glucozli'--ex"ti-ăcfaeporumb,
Microelementele (Jkr, zinc, magneziu) favorizează hiosinteza vt_t_amil.lii,_ş_au
pot 'inhiQ~ bios"i"ntţza (Cup;:Z-;11ercur, bismut). -----.-
'Adăugarea in mediul de cultură a săruri lor de cobalt la Începutul perioadei de
-şăJ~~~:i'de'~iiliiE')_;@nlehlb~dj-epTpjecursor, la 3~~~ă
.00

fermentatie şi a acidului o-aminolevulinic-spre sthrşitul pe~ioadcicfe 'ifr:';;:;~~t~ţie

la cO.~S__~J~!~<:gl~<:i9.~!~. La sfârşitul biosintezei vitarnina BI2 se găseşte în
duce-ia creşierea semnificatlvif" a ~ailtli~nj"de'v'itamină.BI2 bi()sintetiZâîa. '-.
rniceliu (este metabolir intraceliilar)" Procedeul" este--e'conoiljÎt" dacă' se obţin
Precui_'s"o'iill,-.~.?).:aim~tilbeoi4_~L~ adau.g~_ în ~pă ~~~.~:de
coricentrâtii maTillă-ITde 2. I-lg/ml mediu de cultură, sau 16 ug/g biornasă separată,
Compozitia mediului de cultură este dependentă de tulpina producătoare I~- Începutul fermentaţie, dar nu mai târziu de 72 ore, pe~l2:I.. ~'ăJ)Josll1!eza
vitaminei să fie maximă.
folosită, totuşi unele valori aproximative pot fi redate:
în"'urm~ brO_~~J1t~_~eise obtineti1idroxi-cObal!lmina care in mediul de cultură
• surse de carbon şi energie: glucoză 5-10 %, amidon 2 %, melasă etc. ; fixează la'atomul de COi"o-iili(OH-. Aili conlpuşTdln aceeăşTfamTiTe-;-coiliindrept
• ~actde porumb 2-4 %, făină de soia, făină de peşte, lig,in(rceJiifăn(illlrbroÎnu;'ă:~I()rură, rodanură, nitrit, având o activitate fizio­
, extraCtaeGrof<:rie~-borhoturide spirt, hidrolizate de cazeină etc. ; logică de 30-100% tată de vitamina BI~'
r
______,---_.
• surse __
.- -_ azotat de amoniu 0,6-1,2 %, fosfat de amoniu etc. ;
de azot anorganic: Bacteriile propionice biosintetizează vitamina B12' ca metaboliţ{!!!tracelu~
• săruri_~'nin~: NaCI 0,2-0,3%, CaCO) 0,4-0,5% etc.: Deci, la sfârşitul biosintezei, vita~lina BI2 se g~~_eşte în miceliu, fiind le~de
 'T~
1"
,
156 CĂTĂLfNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE B10SINTEZĂ 157

__ .~ei91 a_~~est!:lia. Pentru__a__Pl!ţ~~__ ~~l2ara.şi p~rific?_.'yitamina, masa are loc creşterea cristalelor), se ~ia, se spală precipitatul cu
..~~I~I~~ .. Qbti~ut? _pri:'1.filtrar~a. biomasei se ', prelucrează p~i_n.~~_<!.~ţie. acetonă şi eter şi se usucă la vid.
Procedeele de separare şi purificare sunt extrem de costisitoare, mai ales Separarea vitaminei se poate tace şi prin complexare cu acid metilen-disalicilic
datomICdifufi!for(oarte-marlah;' vltalliinei. ..... _.-. -.- ..-- .--
o ~~~~~~~!!tlW~J!Jlfi~L.lL sunt: I
I
I
la pH acid, sau cu alti acizi, randamentul complexării tiind de 90-100%. Elibe­
rarea vitaminei BI2 din complex se realizează în soluţie acetonică la pI-l alcalin,
când precipită vitamina pură.
\ • ~a şi denaturar~ prot~inelor celulare;
\ • adsorbtia vitaminei ;T-r;~~ 'A-J.!,C1-?","'.):>-"'j Productivitatea mică a suşelor şi procedeul laborios de separare-purificare
l, • purifican:~rin_~~cţie cu solvenţi ; sunt probleme deosebite din punct de vedere tehnologic şi economic. În plus, cali­
tatea şi natura materiilor prime sunt esenţiale pentru productivitatea şi reproduc­
I)(3c~;
· (2urificarea f.!._nală ;
• cristalizarea.
tibilitatea tehnologiei, care depind în mare măsură de furnizori.
Ţinând cont că în urma unei şarje industriale se obţin cantităţi mici de vitamină
BI2 (În medie 23 rng/I), la aceasta adăugându-se dificultăţile de producţie, se
La, sf~rşiţuJ. fermentaţiei, biomasa obtinutli ~eprelucrează.J.e.rIHk_§i se adaugă înţelege de ce putini producători obţin această vitamină.
coagulanţi pentru ca separarea masei celulare să se realizeze rapid şj-cllc(ent.
;--Acest luCit se realizează fie prin centrifugarea biomasei, fie prin tilt;:are-cu
ajutorul filtrului ~ă. rvi.z. BiotehnoJogia vitaminei C
Masa celulară rămasă pe filtru se suspend~îlLill2!: se acidulează eli HCI şi se
încălzeşte fii-SCj::-90oC, când vitamina Bp este eliberată din cehi-Ia mlci:6fiiană şi sin: acid L-ascorhic, vitamina antiscorbutică
fi~'e-Îrisolutia ap~. Masa celulară este îndePELată l?~inj~l~a.!e, iartiltratul C6Hg06
~~Jinut, ce contine vitamina BI2 în solutie apoasă, este supus în continuare Mr=176,12
operatiilor de separare şi purificare.
Din solutia apoasă obţinută, vitamina se ~xtrage cu un amestec de fenol : buta­ CH20H
noi, sau crezol : CCI4 de 1 : 1, iar extractul organic se reextrage cu ap~ dernine­ I
ralizată. Se separă fazele, iar solutia apoasă ce contine vitamina B p se supune
I
H-C-----OH

W=0
_<::i~l1ură.l:ii cu NaCN, la un pH =7,5-8, când cobalaminele se tra"'nsfOri-i1i{-în 1
I /0·"
Ci<:lI)'~.Qffiila[)] j ne.
Această purificare a ciancohalaminei reprezintă, de regulă, un secret de
fabricatie şi presupune realizarea unor extractii succesive cu solvenţi organici,
urmate de reextracţii În apă. Solutiile obţinute după aceste extractii şi reextracţii HO OH
au o concentraţie de 5000-8000 pg vitamină BI/ml.
P:;_;;.u;.;ri_fi_lc,",a=re::::;a;;_:_.:ti_nal~-?_'yi!~n:il~~~.~~_!~~~~~~~~_PE_i!1_'::.:on~at~at.:"M;.pţ~u Vitamina C este o vitamină biosintetizară de plante, animale, microorganisme,
alumină partial activată, sau cu ajutorul schimbătorilor de ioni. dar nu de 0111.
- 'Procesele cromatografice sunt esenţiale~ologie, întrucât asigură Surse naturale de vitamină C sunt: legumele, fructele, laptele nefiert, citricele
puritatea farmaceutică a vitaminei B12, precum şi separarea ei de pseudovitarnine, etc. În tabelul nr, 25 este prezentat conţinutul în vitamină C al unor alimente'
analogi cu structuri apropiate vitaminei dar fără utilitate terapeutică. Drept (adaptat după J. Mincu, 1993).
adsorbant se utilizează oxidul de aluminiu cu o umiditate de 1-6 %. După eluţia
coloanelor cromatografice, solutia obţinută are o concentraţie În vitamină BI2 de Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
-20.000 ug/ml.
Vitamina C se prezintă sub formă de cristale aciculare, incolore, sau pulbere
S[istalizarea vitaI_Tlinei Bil se r.:ali::.a~z.ăprin_~garea_~:.~<:.~eipeste solutia
cristalină aibă, fără miros, cu gust plăcut, acrişor, Are p. t. = 190-192uC. Este
obtinută 'ffiii7area coloanelor cromatografice. După 20-30 de ore (timp în care
'-----------~---.-.--.-._---. '_--" .--'-_' uşor solubilă în apă, în proportie de 80% la 1000C şi de 40% la 450C. Este
 :'1' ?'~
I
158 CĂTĂLlNA DANIELA STAN I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 159

Tabelul nr, 25 I apărare a organismului fală de infecţii. Are actiune antialergică şi favorizează
Conţinutul in vitamină C al unor surse naturale . vindecarea rănilor.
Nu se depozitează În organism, fiind necesar aportul exogen continuu.
Nr.-trt.'·1 , , . ; SiJrs~ )~e;tiUlJJil~ă C , Gantiiâtea~~e vj~IlJÎIlă
Nu are reactii adverse, Însă dozele foarte mari pot produce diaree sau predispun
1. Ardei roşu >200 la litiază oxalică urinară.
2. Pătrunjel frunze 151-200
Lipsa vitaminei C din organism duce la aparitia scorbutului, care se manifestă
3. Mărar 100-200
prin tulburări osoase, hemoragice, nervoase etc.
4, Varză verde 75-100
5. Spanac 60-75 Se conservă Îll recipiente bine Închise, ferite de lumină şi căldură.
6. Varză albă, roşie 45-60
Produse farmaceutice:
7. Urzică 30-45
8. Ceapă verde 30-45 CEBION (Merk - Germania)
9. Cartofi 15-30 cp. efervescente 1 g
10. Fasole 15-30 CEVITIL (EIPICO - Egipt)
II. Mazăre 15-30
cp. efervescente 1 g
12. Tomate 15-30
13. Morcovi <15 REDOXON (La Roche - Elvetia)
14. Castraveţi < 15 cp. efervescente I g
15. Lămâie suc 50 UPSA C (Bristol Myers Squibb - Franta)
16. Lămâie coajă 65 cp, efervescente 1 g
17. Portocale suc 50 VITAMINE C (Upsa - Franţa)
18. Portocale coajă 200 cp. efervescente I g
19. Mandarine 30 VITAMIN C (Pharmacia - Bulgaria)
20. Cireşe 3,5
cp. efervescente 600 mg
21. Fragi 60-85
Căpşuni
VITAMIN C (Soma - Germania)
22. 35-40
23. Mere 5-50 cp. efervescente 225 mg
24. Lapte de vacă 2 VITAMIN C (Oberlin Upsa - Franta)
25. Ficat 31 cp. masticabile 500 mg
26. Rinichi II VITAMINE C (Stanley Pharma - Canada)
27. Inimă 6 cp. masticabile 250 mg, 500 mg
VJTAM1NA C (Pharmex - România)
solubilă în alcool, metanol. insolubilă în eter, cloroform, benzen, eter de petrol, cp. masticabile 250 mg , 500 mg
uleiuri grase. I g de vitamină C se dizolvă În 3 mi apă, 30 mi alcool, 50 mi alcool VlTAMINA C (Aesculap - România)
absolut, 100 mi glicerol, 20 mi propilenglicol. Solutia apoasă are pH=5,5-7. cp., 200 mg
Este stabilă în prezenţa aerului, dacă este În stare uscată. În soluţie apoasă se VITAMINA C (Sicorned - România)
oxidează rapid În prezenţa aerului. cp. 200 mg
Vitamina C intervine În oxidoreducerile biologice, în respiratia celulară, in fiole, sol. apoasă 500 Il1g/5 mi
mentinerea formei reduse a grupărilor -SH enzimatice, scade permeabilitatea capi­ ASCOVIT 200 (Europharrn - România)
larelor şi creşte rezistenta acestora, stimulează sinteza colagenului etc. De asemenea. cp., 200 rng
favorizează absorbtia fierului din tubul digestiv şi depunerea calciului În oase, VITAMINE C (Lab. Renaudin - Franta)
stimulează formarea corticosteroizilor şi a hemoglobinei şi creşte capacitatea de fiole, sol. apoasă 500 mg/5 mi
 ' f~y
I
I
I
160 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
161

prin sinteză chimică totală au fost abandanoate, la ora actuală tiind metode
TehhOlo~6';,~~~i(jsinteză li vltăminel C neperformante din punct de vedere economic.
În 1933, Tadeus Reichstein şi colab. a realizat sinteza acidului L-ascorbic (vita­ Astăzi, vitamina C se obtine la nivel industrial prin 3 metode:
mina C), în laboratoarele Institutului Elvetian Federal de Tehnologie (Ziirich).
- biosinteză combinată cu metode chimice (metoda Reichstein) ;
Punerea la punct a acestei sinteze a fost un eveniment deosebit de important, biosinteză fermentativă În 2 etape;
reprezentând punctul de plecare În obtinerea industrială a vitaminei C, prin altă - biosinteză fermentativă într-o singură etapă.
metodă decât cea extractivă,
Patentul pentru această sinteză chimică a vitaminei C a fost obtinut de o firmă a.~resupune reducerea catalitică a P=gJucozei .I~ sorbitol,
elveţiană mică, Haco, ce avea ca ohiect de activitate produsele alimentare. Această urmatâoetfansormafeâMochimi~hl.:sOrbit~;)~i~·i; L-sorboză tQ19_şI~
firmă l-a plătit pe Tadeus Reichstein pentru punerea la punct a sintezei vitarninei de--;rcetobacter-.;ub-oxida,~s:Acetobacw l7le/anogenu,;·, Gluconobacter oxydans,
C. În acelaşi an, În luna mai, patentul a fost oferit companiei F. Hoffmann-La 'B{/(:teriulli-xylillulI/, Erwinia sp., COIynebacleriulIl sp. ŞI o serie cle etapede
Roche, care nu a fost interesată de el, Întrucât compania nu avea ca prioritate sinteză chimică. Ultima e~ă este o transformare catalitică a acidului 2-ceto­
obtinerea vitaminelor. În acel moment compania obţinea vitamina C prin extractie -L- luconic În âcid ascorbic(figUrarlr~33)"-----' ----- ---"- _- -
din produse naturale, metodă ce era economică pentru acele timpuri şi raţională Această meto ă este aplicată de companiile Roche, BASF, Takeda.
din punctul de vedere al cercetătorilor vremii.
CH20H CH20H
Tadeus Reichstein şi colahoratorii săi au încercat să Îmbunătăţească procedeul CH20H
1 1
de obtinere al vitaminei C, principala problemă fiind transformarea sorbitolului HO'----C-H HO--C-H 1
C-~=·O
în sorboză. Această transformare se putea realiza chimic, dar cu randamente

-~1
1 1
mici. Procedeul era pus la punct Încă de la sfârşitul secolului al XIX-lea de către HO--C-H HO ··--C·-·····H 1
.. _~
--~+H, +0 HO--C---H
1 - z 1
chirnistul şi biologul francez Gabriel Bertrand , Însă metoda nu era aplicată la H-C'--OH
1
H--C-'-"-OH (j~-;'I'-~
scară industrială datorită cererii mici de sorboză de la vremea respectivă. Introdu­ deilidrozenaza 't H -- C ---'- OH
1 1 • 1
cerea metodei fermentative de obtinere a sorbozei a rezolvat problema acestei HO-·C-H HO'-C--H
1 HO-C-H
etape dificile. T. Reichstein a cercetat o serie de bacterii, stabilind că Acetobacter 1 1
CHO CH20H 1
suboxidans poate' realiza transformarea sorbitolului În sorboză, Însă tulpinile CH,OH
O-glucoză O·sorbilol
preluate de la diverse laboratoare, nu au avut randamentele scontate. Astfel că, a L·sorboză

folosit insecte ca Drosophlla melanogaster , În intestinul cărora se dezvolta

bacteria. După punerea la punct a noii metode de obtinere a vitaminei C, ce se
0=1'------] COONa
1 <f~
C-OH C---ONa
realiza cu ajutorul etapelor chimice şi a unei etape fermentative, Tadeus Reichstein
a luat legătura din nou cu firma F. Hoffmann-La Roche, care de data aceasta a
I
C'-OH
O
I I
C '---ONa
HO"'-
C=-O
1
c---- H
cumpărat patentul, pentru aşa numita "metoda Reichstein". Această metodă mixtă
(chimică şi fermentativă) de obţinere a vitaminei C s-a dovedit mai economică şi
H-J---- __ +H<
. . . :---._ 1
H-"-C-OH
...• _._-._-
- H, 1
H---C'-'-OH
1
mai eficientă decât metoda extractivă ce se aplica la vremea respectivă. HO-C--H 1
HO-C---H 1
HO--C--'H
Această decizie, de a cumpăra patentul şi de a-I implementa la nivel industrial 1
1
CH20H 1
a reprezentat prima utilizare a tehnologiei fermentative (şi prima aplicatie a CH20H
CH20H
ferrnentatiei în profunzime) În obţinerea de medicamente. Ulterior, compania F. acid L· ascor1Jic
, sarea de sodiu a acidului
acid 2-celo-L-gluconic
2-celo-L-gluconic
Hoffrnann-La Roche a devenit interesată de dezvoltarea diviziei de vitamine, (Iorma enolică)
astfel Încât la sfârşitul anilor '30 a devenit lider de piară În producţia de vitamine Figura nr, 33 Obţinerea vitaminei C prin metoda Reichstein
(vitamina C, BI' E).
Vitamina C se poate obtine prin extracţie din plante, prin sinteză chimică, prin Cel mai folosit microorganism pentru etapa fermentativă este ,tlq__fJobact.er,
biosinteză, sau prin metode mixte chimice/biochimice. Obţinerea prin extracţie şi ,,,sub24yda'f!..! care se cultivă În PfQfunzirrlf~f.peun mediu propice.
• 'i. '~.,:.~. ,'-.- .•.• ._ •. _•• ~_._. __ •__ . _ •• •__

,!

:'j

ii
 162 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

--..
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 163

_
Fermentaţia are loc În cele 3 stadii (inoculator,
.. --' -----------_ ... _ .. -_ ... _ .. intermediar,
_-------~- __
regim), iar
D-sorbitolul se oxidează biochimie la L-sorboză cu un randament mediu de
..
Mediu de cultură
,... Fermcntaţj a subme rsă
--,

ii =70-75 %. ----.---------- .. - -.-- .. ----- .. -- - -.------ D-sorbilol a tul pi nil OI' de

lnoculul se repară pe mediu lichid steril ~':lp.A,_extrac_t4_eQ2!:~, . _~xtract IJ10Cui
Acetobacter suboxidans ""C02
E.~_~_;_ D-::sâ-rbit~1 ~~ill:~- '-:l.n...g~:~d de ().x.id~r~ de 10-80% la 24 Il şi o vârstă de
AcI'
pll=4,5-5,30-3:;9C
2 atm, 60-65 h
24-48 h. ---_ .. _-----,...
(0,8 l/l mcdiu/min)
Ferrnentaţia se realizează pe medii de cultură ce con\.irl_~p~l...~)(tr'l.~t_Qe porumb,
ul~I.," ..~oCşT bJneintele<b ..-s_~~~i.ţol.ce.:u~ITI(:!ază să se oxideze. M~diu_I_Q~
J
__
_--cuTtilră
.. __ .. _ -.. . _"''__-
se sterilizează
- la i200C timp de 45 de minute, iar aparatura utilizată În
fermentatie se sterilÎzează la 1000C timp de 10-15 minute.
Ferrnentaţia este aerobă (0,8 I aer/I mediu/min.) şi se conduce pentru 60-65
_[ .FL~" [_ masa celulară

or;-hîpi-f=:;:f,5.::5: .. t~20C şi presiune de 2 atm.

OXldarea este reăTizata-de_....... ..... _~~.
sorbitol dehidrogenază, ~ă
organism. Această enzimă este sensibilă şi se degradează ujor În prezenta unor
_--- __
.. ...
generată ..de ._.micro-
Concentrarc
0.8-0.9 atrn, 43-41)C 1__ apă
săruri ~~etalice: sulfat de fier, d~l, de al~'inin~-:-P~~~e~l'aacestor săru~
16 h
~ură duce la scăderea randamentelor de oxidare (cu până la 60%) şi
la creşterea duratei procesului fermentativ. În plus, săruri le de nichel diminuă
-·-- . -1·.. ·-- .-
creşterea şi diviziunea celulelor microorganismului.
S-au tăcut studii pentru a utiliza microorganisme imobilizate pe geluri poliacril­ ----_ .. ~.- -_----_ .. _--

arnidice. În acest fel, ele sunt protejate de o serie de factori nocivi şi deci Cr istal izar e
irnbunătăţesc procesul de fermentatie. 2 h la 1. cam

La sfârşitul ferrnentatiei, ~~bl~.~~~~~~~ ~:a.~_de.oxi?~L<:.s!~_cel putin

90%. Aceasta se filtrează pentru Îndepărtarea masei celulare, iar solutia de
'i-sorbozăsi:-'CoÎlc~rează sUb-Y-iatTolpae-"ro"ore-ră"Îeli-iperaturi:ide' 43-47oC.
-~~~-----~--~------~
'---.. -1---
2-3 h la 0-30C

Procesul are loc până la o concentraţie finală de 80-90 %, când Încep să apară
criStalele de L-sorbo~ă. Concentratul se transvazează Într-un cristalizor unde
;:-istalizează L-sorboza îi~I~lalen~p~~~iu~acamerei-şi apoi la 0-3°~
timp de alte 2-3 ore. ---- -~-- ---
-' --1-'--
['Ce '~t-ri fug:I~-;;- -]--- ..•. fi ltrat

_~:,~~~~. se filtrează, s~_!!:.~I~~~tul cu alcool1i..~~ usucă la 1400C timp

~~~.?-()~~.. - Spăla~e - J----~apc de spălare
de 160 secunde (sau Într-un uscător cu circulatie de aer cald timp de 8 ore) până
la o umiditate a Lvsorbozei de 0,2 %.
Fluxul tehnologic la transformarea biochimică a D-sorbitolului În L-sorboză
. -----r- ·---
este prezentat În figura nr. 34. [-- . . us~:;:;--J
b:_~'$a fost dezvoltată În China, Încă din
1987, şi este aplicată astăzi de MerC'K,ADM, Genecor International, Eastman,
BASF, Electrosynthesis Company lnc., MicroGenomics Inc.
-1-- -·-
Studiile biochimice ale metabolismului diferitelor microorganisme au arătat că t-sorboza
biosinteza acidului 2-ceto-L-gluconic (2-KLG) se poate realiza pe două căi Figura nr; 34 Fluxul tehnologic la transformarea biochirnică
.. ~-_._-
diferite. Unele bacterii, cum sunt Acetobacter, Gluconobacter, Erwinia, pot
.. _--_.' ~.
a D-sorbitolului in L-sorboză
 164 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
Ili5
transforma glucoza în .acid 2,5o_d.iceto-O-gluconic (2,5-0KG), iar altele ca Brevi­
COOH
bacterium, c;;;:ynebacte;r~m,Arthrobacter, ce posedă enzima 2,5-0KG reduc-
~-fermentativă
taza, transfo~ă 2,-5-DKG in 2-KLG.
- Această biosinteză :::-~:.-
. .. -.'. --------=-. I
C=-O
în două etape ar putea fi îmbunătăţită prin
~?.-_fe_r!~entar~amicroorganismelor. Procesul de co-ferrnentaţie ridică însă o serie
HO--
I
C--H
de probleme: cele două microorganisme pot avea tempejarurj şi pH-uri optime
de creştere diferite, o compoziţie diferită a mediului de cultură necesar dezvoltării,
ceea ce-poâ'feduc~ la j~ea sau pie.rderea unuia dintre microorganisme.
I
H-C-----OH
În figura nr. 35 (după B. R. Glick, J.J. Pasternak, 2(03) este prezentată
această metodă. Glucoza este transformată în 2,5-0KG, folosind tulpi!li.!TIutante
I
C'=O
de Erwinia.sp., după care acidul 2,5-diceto-D-gluconic (2,5-0KG) este trans-
~~
format în 2-KLG de către tulgj_ni mutante de Corvnebacterium sp. O metodă
similară foloseşte tulpini de B~ciii~sthi;rillgie;;;;·s. .'-
E""n;a sp. /. L,OH ~ Corynebaclerium sp

~~~ ••~AIllo'ftt~I~;;"
/ aCld2,5 -dlceto-D-gluconic ~
C
ate genetic de Erwuua nertucota, ce
CHO COOH
. conti!!~~zill!~.~~ n~ce~~_r~_ c~L<!r dou~ ~pe ?tV~Qrm.i!r;:
Construirea acestei tulpini modificate genetic de Erwinia herbicola se face
H--'-C--OH
I C-=-O
I
prin clonate .. G~ corespunzătoare ~B.:!mei 2,5-0KG reductaza este i~ din
Cju::YJ.le.bacleriwn sp. şi exprimată în celulede Erwinia herbicola, Astfel, tulpinile I
HO'--- C· __ · H ErYlinia sp, HO·--·C·----H
I
~ş~gi~cJ!ţi genetic . d~. -~r~;jlli~·_21.i:.~J~a·{o .~u~!.. ~~pah~I~_s~ .. .!ran~T2L~~!
O-glucoza În acid kceto~kgluconjc (2-KLG) (figura 11f. 35).'
~nzil~ereeiidoge-ile'alecelulelor de Erwinia herbicola localizate În periplasmă
3.
I
H·---- C-·_- OH
modificate genetic
-)00- I
H ---. C· -- OH
tram-f~~i{6-=-g~.9~2iaîn 2,5~OKG, iar 2,5-0KG reductaza clonată, localizată în
citoplasmă, catalize~ză trâ~sformarea 2,5-DKG în 2-KLG. Acest microorganism H-C'---OH
I HO--C--'-
I H
recombinant este capabil să facă transtor~~area f~tr-o ;i~;gură etapă a O-glucozei
în acid 2-ceto-L-gluconic. Mecanismul transformării O-glucozei este prezentat În
I
CH 0H
2
I
CH 0H 2
figura nr. 36 (după B.R. Glick, J.J. Pasternak, 2003).
O-glucoză acid z-ceto. L-gluconic
I J\~=:.:.t~:!::::I2~.~?nic obtinut prin două etape ferrnentative, sau printr-o
f singură etapă de fermentatie este ulterior transformat în vitamina C printr-un
t ----.
I e.:. oces catalitic.
Figura nr, 35 Obtinerea vitaminei C prin metode fennelllative
Fiecare etapă de obtinere a vitaminei C are un randament mediu de 90%, .1 ;;
t~\olutia.,~ este pre-puriticată prin adsorb[ie pe schirnbători de ioni ;
randamentul global al întregului proces de transformare a glucozei în vitamină C ~
(~. solutia p.!:!.!:.iţ~.tăeste concentrată sub vid, când vitamina C se separă prin
fiind de 60%. ':"-,'.
- cristalizare, În mediu acid, la temperatură joasă.
Separarea şi purificarea vitaminei necesită etape dificile, ce au consumuri 'f
Întl:~câ[ vitarnina C este instabilă în soluue apoasă, fiecare etapă necesită
mari de materiale şi energie. Solutia finală contine multi compuşi secundari, însă
timpi scurti de lucru, ceea ce măreşte dificultatea procesului.
acidul 2-ceto-L-gluconic este cel mai important şi în cantitatea cea mai mare.
Ţinând cont de aceste dale, s-a studiat separarea selectivă a vitaminei C de
În metodele fermentative într-o singurăetapă sau în două etape, transformarea
acidul 2-ceto-L-gluconic dintr-o solutie apoasă prin extractie reactivă cu Amber­
se
aciduhji2::-ceto~CgJu~~nic realizează fără separarea din mediul de fermentatie.
~._
S~p;-~-;:-~~
.. _ .. ",.-.
'şrPu~iti~a~e~i!aminei c se r~ali~~;ză în 2 etape:
.- . .• __:::;-._
lite LA-2 dizolvat În acetat de butil, pentru a stabili, conditiile optime pentru o
separare seleclivă superioară. La un pH acid gradul de extraC{ie poate ajunge la
 ".

166 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 167

. ~ O-glucoză Aşa cum se desprinde dintr-un studiu al lui Matthew Chervenak publicat În
2006, per total, producătorii chinezi obţin aproximativ 60.000 tone/an de vitamină
C (cantitate raportată În 2005), 80% din această cantitate exportând-o În ţările
~ UE şi În America, asigurând astfel 60% din piata internaţională de vitamină C.
În 1995, În Europa, vitamina C se vindea cu un pret de 15 $/kg. Din 1995, în
l acid O-gluconic China, s-a mers pe ferrnenraţia sorbitolului la acid 2-ceto-L-gluconic transformat
în final în vitamină C, cu preturi de producţie de 4-5 $/kg. La ora actuală (În
I 2007) pretul de vânzare al vitaminei C, obţinută de companiile chineze, este de
3,5 $/kg (mai scăzut decât pretul de productie).

~_ acid 2-oelo-
1--- 0- gluconic 1 V.2. Vitaminele liposolubile

(§) TV.2.1. Biotehnologia ergosterolului

L_ 2,S-OKG sin: provitamina D~

C2BH440
---- 2,S-DKG .••
--___j Mr= 396,65

28
4
21 ~H3
H3C. __ 22 26
~. _ ..-)0- 2-KLG _.( )o- 2-KLG ··-·-·--1-·-----)0-
18CH.3 20 ~
23 21
24'-",.-/" CH3

't ti
19 17
MI ME
Citoplasrră Periplasmă Mediu 2~r3 -: t6 27 CH3
Figura 111'. 36 Transformarea Dvglucozei În 2-KLG
folosind tulpini modificate genetic de Erwinia herbicola
A )''-;1 ' 14- --"'15

Legendă : E" E2• E~. E. - enzime : MI - membrană internă ; ME - membrană externă:

2.5-DKG - acid 2.5-diceto-D-gluconic; 2-KLG - acid 2-ccto-L·gluconic. HO / 5~ 7
4 6

90%, iar la adăugarea unui tensioactiv (e.g. 2-octanol), randamentul de extracţie

creşte cu 6-23 %.
În ultimii ani au rămas pe piaţă doar marii producători de vitamină C, mai ales
datorită pătrunderii producătorilor chinezi, care au preturi mult mai mici ca
rezultat al politicii lor nationale. Astăzi există 4 producători chinezi (Northeast
General Pharrnaceuticals Factory, NCPC Group, Shijiazhuang Pharma, Jiangshan
Pharmaceutical), care alături de firme europene ca BASF, OSM şi Hoffmann-La
Roche satisfac cererea mondială de vitamină C.
În 1650 Francis Glisson, regius professor la Universitatea din Cambridge, a
descris .. boala englezească", care nu era altceva decât rahitismul. Mult mai
târziu, în 1906. EG. Hopkins a demonstrat că rahitismul se datorează unei
nutriţii necorespunzătoare, demonstratie confirmată În 1919 de E. Mellanby şi
E. Y. McCollum prin utilizarea unturii de peşte în vindecarea câinilor cu rahitism.
Între anii 1924-1925 unii cercetători au arătat că () serie de alimente vegetale şi
animale devin active în tratarea rahitismului după iradierea cu raze UV. În 1926
 168 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
r
.0,

I
.

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
J69
A. Windaus, A. F. Hess, o. Rosenheim şi T.A. Webster au arătat că ergosterolul, 9H3
prin iradiere cu raze UV, trece într-o substanţă care are proprietăţi antirahitice. 9H3
H,c ..
Acest sterol s-a identificat şi în în drojdia de here, cornul de secară (Claviceps
Ţ /'CH3 H ,C.
CH3

purpureeaş, ciuperci parazite etc. Încă din 1889 C. Tanret izolează ergosterolul
din scleroţii de Claviceps purpureea, hoala determinată de cornul de secară -
/ CH3

ctr
ergotism - dând numele substanţei.
Ergosterolul este un sterol (stereos (gr.) = solid) izolat din plante, sau dintr-o
serie de micro-alge şi microorganisme, unde este alături de alti steroli: zimo­
sterol, fungisterol etc.
HO""--- d ,,1
Ergoslerol
""~hv
HO""---
I
~
I 2 CH3
=

Vilamha 02
Face parte din categoria vitaminelor Iiposolubile, având o structură ciclopen­
tano-perhidrofenantrenică, ce contine 4 cicluri (A, B, C, O) şi o catenă laterală, 9H3
întreaga structură având 28 atomi de C. Are o grupare -OH în poziţia 3 a ciclului H3C .J/'--_.)"'/CH3
A, două duble legături conjugate(5-6, 7-8) în ciclul B, câte o grupare -CHJ la CJO
şi CI3 şi un lant lateral de 9 atomi de C anat în pozitia 17 a ciclului O.

Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice

Ergosterolul este o sUQşţl!l1~solidă, de culoare aibă, cu p.t. = 168°C. Cristalizează
r'-=--J CHJ

în forme diferite i"~ funcţie d-~-~~;l;~-~i-:--âce-Iilgroscopicedin eter, cristale-mlcişi

incoToreclIT'-,wlecuÎăâpă -de--cristalizare din alcool. Cea mai bună formă ,,(yCH2

cristalizată are 1/2 H20 de cristalizare. Îndepărtarea completă a apei de crista­
lizare nu se poate realiza, obţinându-se o masă amorfă cu un p.t. ce variază între
valorile 166-1830C. Nu este solubil În apă, este soluhil în eter la cald, în
cloroforrn la cald, În alcool la cald:-Ni'i-este siâ6lfiîlpreze'ijţăaerUTiiişwuminii,
când se transformă într-o substanţă de culoare galbenă. În prezenta oxigenului se
formează peroxizi, iar în prezenta hidrogenului se formează polihidrocornpuşi.
Cu acizii acetic, palmitic, stearic, formează esteri.
Prin iradierea ergosterolului cu raze UV are loc transformarea:
ergosterol --t lumisterol --t tahisterol --t ergocalciferol
În continuare, la temperaturi mai mari, se obtin suprasterine şi toxisterine.
S-a constatat că şi razele catodice, curenţii de înaltă fracvenţă, emanatiile de radiu,
pot să transforme ergosterolul în vitamina O2 (ergocalciferol) (figura nr, 37).
Procedeul industrial presupune iradierea ergosterolului în solutie de eter,
alcool, uleiuri vegetale, trietanolamină, benzen, în raport de I : 5. Solutia benze­
nică de ergosterol (se preferă benzenul pentru că are risc mai mic de aprindere)
se supune iradierii într-un reactor prevăzut cu manta dublă de răcire, timp de
10 ore la temperatura de 25-30oC. Ca sursă de radiaţii UV (256-313 nm) se
foloseşte o lampă cu mercur. La sfârşitul procesului se distilă benzenul şi se
cristalizează vitamina D2. Rata de transformare a ergosterolului În vitamină O2
HO' ~
Figura nr, 37 Transformarea ergosterolutul
prin iradiere este de 60%, prezenţa unor substante fotosensibilizante mărind
proportia de transformare. Ergosterolul netransformar se recirculă.
M!jo~~~~,:__~tamin~!_p_~~_:~~ră
organisn~~!_~~:_"~.?.~~~~~ă î~:.E~le _prin
expunere la soare, când 7-dehidroco!este-r<TtiTTunsteroid endogen) se tranSformă
-111 co~ol. Ergoslerolul, conţinut de rnucegaiuri şi fungi formează prin
iradiere ergocaJciferol. Calciferolii se absorb din intestin în prezenţa bilei.
Cea mai importantă actiune a vitaminei Do este mentinerea homeostaziei
calciuli:iTŞ'iatOsfatfio-;::-'-;'sig-;ând ~~tinerea- concelrtratiilor IO;fiziologiZ;
"'Xceasiâ"sc"'reallzează'-prTil'favo-riiărea--absmbIId"'~âkr~iQT şia--t~&wI'y';""J.i.!1
intestinul subtire, mobil~~area lor din oase şi scăderea eli~J.~ăriL~nal~.:_ De
asemenea, intluentează metabolismul celular şi activează erocesele resQiratorii
.~'; celulare. _.. - - -_ -. --- .. '''_'_'--_''-'---' -"- - .. ---- - -_ ..
Se utilizează în Ql:Qti-'-~Il5ia__şi t.r.~~<l,!!!ţ!1!l!lL'!hiţ~gml.!gLla_.(;Qpii şi a osteomalaciei
.. .Ja adulti. '. '. -.' - .
Se comercializează atât produse farmaceutice ce contin vitamină O2 cât şi 03,
În continuare, sunt prezentare doar produsele farmaceutice ce contin vitamina D2
(1 UI ergocalciferol = 0,025 ug).
 ~1.i
"

170 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 171

Industrial s-ar putea obtine din cornul de secară şi culturi de Aspergillus niger,
Produse farmaceutice: Penicillium notatum etc. Initial se extrag lipidele totale care se supun saponificării
ERGOCALClFEROL (Lab. Renaudin - Franta) şi din partea nesaponiticabilă se extrage ergosterolul prin recristalizare din alcool
fiole, 600.000 UI (prin separare pe coloană cu alu mină, sau prin condensare cu aldehidă citra­
STEROGYL (Roussel - Franta) conică), Izolarea rentează din punct de vedere industrial dacă ergosterolul se
găseşte în extract În concentraţie de 4-5 %.
sol. orală 0,5 mg/rnl
fiole 15 mg/l,5ml Cel mai adesea se obtine ind..lJ_ş.!.ti?.Ldin_~t!:9jg.@.de_Q~Jţ~_.Q.in_l2Q_,kg_drQjdie
VITAMlNA D2 (Biofarm - România) ~ătă s~_~~~.~Q_O~ PE,?~it~Il:i.!~~._Q2.(e!$.9.~_~~!~ll._.P..m.~!!-!f.!@..rli']Qjptluentată
sol. buvabilă 600.000 Ulfml de conditiile de fermentatie, se obtin cantităţi mari de ergQş~er.ol dacănjediu! de
cultură: - .-.- ---.-.-- ---
sol. injectabilă 600.000 UI/ml
VITAMINA D2 (Sicomed - România) - este mai aerat , existând o dependenţă liniară' între concentrat ia ox.igenului în
sol. buvabilă 600.000 UI/3 mi . -medlu)ei'e(;ultură şi biosinteza ergosterolului ;
sol. injectabilă 400.000 UI/lml - ~r_<:.__~ţi.~c.i_9;
- este bogat în surse de carbon;
Tehnologia de biosinteză a ergosterolului - este-i;ăi-ac"Îlisurse a-e'aiot.
Ergosterolul se găseşte, raportat la pulberea de miceliu uscată, în proportii diferite
} ~[ie _g_~__~allqillle (zaharoză,
Drept surse de carbon se _fol~~~_:;_t:_~(!~~I~2...JL.
în rnicroorganisme. Drojdiile contin aproximativ 0,2-0,3 % ergosterol. Speciile sucroză), sau chiar etanol (care creşte producţia de ergosterol cu 10%). Prezenta
de fungi contin ergosterol în proportie de maxim 0,6%, unele dintre ele având şi
în mediu a~~~2!~A~ilities~ţ_Q~l_I_trt1..<;;;U~9_slmt;z._ţj.
ac.eştj<,l.fiillct.P_(ţcllc:iori.pe.u;~
cantităţi mai mari, exemplificare în tabelul nr. 26 Încilecula ergosterolului.
Tabelul nr, 26 U,îeie-studin'patent japonez. 1981) au demonstrat că în cazul ferrnemaţiei
Cantitatea de ergoslerol În unele specii microbiene tulpinii de Saccharontyces uvarum UFOI264, adăugarea de izopentenol (0,90%)
. . - . _., ..
_
şi de politosfari sodici (0,3 %) în mediul de cultură duce la creşterea cantităţii de
','C;ti;J!l!~\~~i~'~~~~i~~~I;{<%~;' ergosterol biosinretizată,
0,4 Fermentatia tulpinii de Saccharomyces cerevisiae se realizează în conditii
2. 0,4 aero~-:-I,-,_I~~J_duPă4 zile de fermentatie acumulându-se o bio-illasă de jCj:::40
3. 0,4 gceluÎ~/1 mediu de cultură. La sfârşitul bio~intezers'~ obtl~IJ aproxliiiatiY 3-4 g
4. 0,4 ergosterol/I mediu de cultură.
5. 0,4 Au fost studiate şi alte tulpini producătoare: Saccharomyces carlsberg ensis,
6. 0,4 Candida tropicatis, Fusarium spp.. Trichoderma spp., care produc însă cantităţi
7. 0,4 mai mici de ergosterol.
8. 0,2-0,3
Ergosterolul s~.!!~_le_gat__de.partea al.hum_LTJ.9l_dică~_ membrane: celulare a
9. 0,2-0,3
10. 0.2-0,3
drojdiei ae_-Der~.~ a fun.:.g_~?'!_~~pf:lşi fermentaţie]. Prin hidroliză acidă sau
bazldi-see-lIberează ergoste ro lui, dupăcare-se"HiireaziCb,llIriâSă--pent'rii-lnOepar_
Il. 2,4 ta:r~~feshirÎJ()rcelulirre:-'-'- -,. ---- ... ---.. -.... -- -- - -.-_ . . -..-------- .... ---.- . ---- .. --.... -
12. 3,9
13. 2,7 Filtrarea- poatefiiTIgreunată datorită caracterului alburninos al miceliului şi al
14. 2,2 resturilor ceh.irire~-5e aceea~-se- practlcă'-şThTdruiIza--enzlmiltică'(âUtoITZa)' a

Drojdia de bere are cea mai mare cantitate de ergosterol. Pe lângă ergosterol
,.Ii·
-----
-miceliului, la pH ;':-6,5 şi'TaT~;r50C;-care-al'e aviiiihijuriinennii'ăITtiJai l!.Ş_9are şi
~-.-.-._--_.----------
mai eficiente a bi~E!!~~i_,_ Pt:._q_te'l.f.~_e.s~Qti_m!J~_de. drl~cj_i_<I.J:k_Q.er~.. dis.trug._sub-"
sunt prezenti şi alti steroli, rata ergosterol : alti steroli tiind de 8 : 2.
__ . _- ----------- _-
stanţele ăh-îtiiiiiîiOase ale membranei celulare şi pUII În libertate ergosterolul.
- ---~- -._--------~------
 .,;f

172 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 173

Drojdia se autolizează, iar adăugarea de alcool duce la coagulareasubstanţelor

albuminoase. . N.2.2. Biotehnologia p-Carotenului
Din filtrat se extrage ergosterolul cu solvenţi selectivi (dicloretan, diclormetan,
eter etc). După o ser-ie de cO;lce~t~ă;L evaporări, situ adsorbtie pe răşini şi eluţii, C40H56
cristalizează ergosterolul. Aceste procese de separare şi cristalizare se realizează M, = 536,87
cu randamente de 85-90 % .
17"
Cererea mică de vitamină D2, comparativ cu vitamina DJ, corelată cu pretul H3C
18 19 20
relativ scăzut al ergosterolului, au făcut ca studiile de îmbunătăţire a proceselor CH3 CH3 CH3 16
biotehnologice de obtinere a ergosterolului să nu aibă prioritate şi deci să nu fie I - I H3C-
impulsionate. 4 5"""'L7~~~1~·14~13~_r"'~Ya~7_
Întrucât cererea de vitamină D3 este mai mare, la sfârşitul anilor '70 s-au făcut 6 16 r
1_---CH3 -.
eforturi pentru a obtine prin biotehnologie un precursor al vitaminei DJ. O serie 17 20CH3 19CH3 18·CH3
de cercetători (L Avruch şi colab., 1976) au sugerat inhibarea 24-metiltran­ CH3
sferazei, o enzimă responsabilă de metilarea C24, caracteristică ergosterolului.
Cultivând tulpini de Saccharomyces cerevisiae in prezentă de 25,aza-24,2S dihi­ încă de acum 3500 de ani, În papirusul "Ebber" este semnalată hemeralopia,
drozirnosterol În concentrarii de 1,3 J.-lM, este posibil să se inhibe reactia de iar în antichitate se ştia că ingestia de ticat este favorabilă vederii.
transmetilare fără a fi afectată creşterea şi dezvoltarea tulpinilor de Saccharomyces În 1857 W_ Mackenzie a descris boala "hikan" din Extremul Orient ce se
cerevisiae . in aceste conditii se formează putin ergosterol, Însă se obtin cantităţi caracteriza prin umtlarea pleoapelor. opacifierea corneei şi suprainfecţii, simp­
considerabile din ceilalti steroli : zirnosterol , celesta 5,7 ,22,24(25)-tetraenoL tome ce duceau in final la orbire. W_ Mackenzie a stabilit că boala se datorează
unor deficienţe alimentare.

~<" <,
În timpul primului război mondial boala a fost semnalată la populatia din
Danemarca. care nu consuma unt (aliment bogat în vitarnina A), ci margarină.
Ulterior, afecţiunea a fost denumită xeroftalmie (hipovitaminoza A). E. Y. Mc
Collum şi M. Davis au arătat în 1914 că xeroftalmia se datorează lipsei factorului
de creştere, care este solubil în grăsimi. Acest factor de creştere a primit

HoD colestatetraenolul
Colestatetraenolul este considerat un substituent pentru 7-dehidrocolesterol
(provitamina DJ), care este mult mai scump. Prin iradierea cu radiaţii UV a
colesratetraenolului se obtine colecalciferol (vitamina Dj)'
Totuşi, nu există Încă aplicarii industriale pentru obtinerea prin biotehnologie
a acestui precursor pentru vitamina D)"
denumirea de ,,factor A liposolubil". În 1916, J.c. Drummond denumeşte acest
factor" vitamina A". Mai târziu, in 1931, P. Karrer şi colah. izolează vitamina A,
Îi stabileşte structura, iar in 1937 ii pune la punct sinteza chimică.
În toate ţesuturile vegetale există o serie de caroteni, ce diferă prin raportul
dintre carbon şi hidrogen. '
Încă din 1831 H. Wakenroder izolează din morcovi caroteni, sub formă de
cristale roşii-rubinii, cărora le-a dat denumirea de "carotină".
.În 191J, botanistul rus Mikhail Tsvet a reuşit separarea pigrnenţilor galbeni din
plante prin cromatografie pe coloană, dând numele acestora de caroteni. Rolul
lor, de provitamine, a fost stabilit în 1938 de către P. Karrer şi H_ von Euler.
Cercetările dintre anii 1928-1930 au dus la determinarea structurii [I-carotenului,
pentru ca în 1952 să se realizeze sinteza acestuia de către cercetătorii de la F.
Hoffrnann-La Roche (G. MacKinney, 1952).
Provitaminele A, se găsesc în regnul vegetal, iar vitamina A în regnul animal.
Omul şi unele specii animale nu pot sintetiza vitamina A, dar pot transforma unii
 '1,

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 175

CĂTĂLIN A DANIELA STAN
174
Tabelul nr, 27
caroteni în vitamina A activă. Astfel, necesaul zilnic de vitamină A pentru om se Continutul in caroteni al unor al"
asigură exogen din plante (prin caroteni) şi din animale (prin vitamina A). • ,-.'1
' .

Carotenii au o structură poliizoprenică, cu un număr variabil de atomi de

Nr. ~rl. Surse ~e ~to~~ni ' . .Cai1!itatea de carotenl (Iil~%)

carbon şi o culoare de la galben-portocalie până la roşu-violet, în raport cu 1. Ardei 25-35

2. Gogoşari 25
numărul dublelor legături conjugate. Apar sub formă de hidrocarburi, sau sub
3. Morcovi 7-18
formă de carotenoide (xantofile) ce conţin şi oxigen. Prezintă În structură cicluri
4. Salată 3-6
de l3-iononă, sau a.-ionona. Există mai mulţi caroteni şi carotenoide cu functie de 5. Mazăre 0,2-0,4
provitamină A, aceştia tiind: 6. Fasole 0,1-0,2
• o.-caroten, l3-caroten; y-caroten; criptoxantina; izocriptoxantina; zeaxan­ 7. Roşii 6,5-12
8, Spanac 13-14
tina; izozeaxantina; cantaxantina; astaxantina etc. 9. Pepene verde 3-4
Pentru a ti provitamine carotenii trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: 10. Banane 7-8,5
_~ ~~. __ .-- ••• _ •• _~., • 0-- •• 0 ,, • _ •.• _ •• --_ •. _ •••••••• _._--_, -,,~ •• _._ •• ~ ••• _' •• - •••• __ A_'_'_ --_._
••••••••••
-_ ••

Il. Caise 1,2-4,5

_ să conţină cel puţin un ciclu 13.:\~nQ!}.Îc .lle;:.Sl\Q.SlllUit ; 12, Citrice 0,1-0,5
_ ~sjfg::!i.~iişfgrm~~in-~[t:ru~1ioă,A ; 13. Cireşe 0,1-0,5
_ să resP<?C,te ~aractt!risticile la!li~l':li pgI!izoprel,lic; 14, Mere, pere, struguri 0,1-0,5
_ să se găsească în conformaţia all-trans (naturală), excepţie tăcând doar v-caro- 15. Ficat de bovine 2 mg/kg
- __ . .•. - ..... _~. _---- .. --
, ,.. ..~." . .. .... ,"
16. Lapte de vacă 0,07
ienul. 17. Ouă de păsări 1-4
Carotenii se găsesc în plantele verzi alături de c1orotiIă, în fructele col(Jrate,
În polen,-i'ar'î"nalg,e-'sunt lo-calltidlţi mai. mici:-carot~~;;i dil; -regn~î-;I~i·~al sunt Omul procură l3-carotenul din vegetale, nefiind capabil să-I biosintetizeze.
'de' origiri-e;vegetaIă, .. .... -' Absorbţia ~-carotenuÎi.li· se tace la nivelul'intes'tir~ului SUbţire În prezenţa bilţ'!i.
Surse naturale de ca~:<?_ţ~.!'l_:;~ţ}L:"_~~~~_I?.~I~'p"~~.~P..~!~.!.t~~<:~ţ:!e
C2..'lPlS..P2lenul, Girc_ullCîll._gjZl!.T!~m 'legat-de. p;:Qt~'i neie -pf~SI1:iiti~~:' .. . . .
~e!:~:'!~~;.:...I?,~~t.t;:1e)J,!_~.'H\:I1_prO~l!Selelactate,ouăle, etc, În tabelul nr. 27 este În organismul uman, dintr-o moleculă de l3-caroten se obtin 2 molecule ele
prezentat continutul în caroteni al unor alimente (adaptat după L. Enescu, N, N, v itan1lnă7\-:-jr-Carote-llui ·se'traÎls"t'or"ina:·îo'·6rgăilisÎ11i.ii ·i.ilnao·'îil vitam ină 'X·sub
lrifluelil~meicarotenoxigenaza (carorenaza), existentă la nivelul peretelui
OiIă, 1990),
intestinal. De fapt, Într-o primă fază are loc oxidarea dublei legături centrale la
Proprietăţi fizice, chimice, fannacologice retinal , iar În a doua fază, retinalul se reduce la retinol (vitamină A).
I3-Carotenul este folosit drept colorant În alimentaţie (margarină, produse de
p-Carotenul are 40 atomi de carbon, o moleculă simetrică, 2 cicluri de l3-iononă,
patiserie, băuturi răcoritoare şi alcoolice, crustacee etc.) şi ca provitamină A în
9 duble legături În lanţul izoprenic şi izomerie all-trans.
industria farmaceutică,
Se prezintă sub formă de cristale prismatice hexagonale de culoare violet
Ca provitamină A se utilizează în diverse produse farmaceutice cu administrare
închis (cristalizate din benzen/metanol), sau sub formă de plăcute cu luciu metalic
orală, cel mai adesea în stări carenţiale, preventiv dar şi curativ,
(cristalizate din eter de petrol), Este o substanţă optic inactivă. Are p. t. = 1 83°c_
În suplimentele nutritive l3-carotenul este condiţionat sub formă de capsule (ce
Este solubil în sulfură de carbon, benzen, cloroform, moderat solubil în eter, eter
contin o suspensie, o soluţie apoasă, sau uleioasă), ori sub formă de comprimate.
de petrol, uleiuri vegetale, grăsimi, foarte greu solubil în metanol şi etanol. Este f3-Carotenul se păstrează În recipiente perfect închise, în absenta luminii şi la
insolubil în apă, acizi şi alcali. Solutiile diluate sunt de culoare galbenă. Este temperatură scăzută,
foarte instabil În prezenţa acizilor, a oxigenului şi a luminii, După gradul de I UI vitamină A = 0,6 ug p-caroten (USP)
puritate, atât În stare cristalină cât şi În soluţie, se autooxidează, mai repede sau 1 g caroten cristalizat = 1.670,000 UI
mai Încet, formând un produs lipsit de culoare şi inactiv, datorită ruperii catenei I ug ~-caroten ~ 0,16 ug vitamina A,
laterale.

il
!'fi
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 177
CĂTĂLlNA DANJELA STAN
176
NATURKAPS LYCOPENE + VITAMINS (HASCO-LEK S.A. - Cehia)
cps., ~-caroten 6,67 mg + Iicopen 83,3 mg + vitamina E 5 rng - supliment
Produse farmaceutice: NATURAL MIXED CAROTENOIDS (Nature's Way - SUA)
BETA-CARafENE (Nature's Way - SUA) pulbere 2,5 %; 7,5 % carotenoide - supliment
cps. gelatinoase ~-caroten 25.000 Ul solutie uleioasă 2,5 %; 4 % - supliment
VITAVISION (Walmark - Cehia) BIOMINERALE PĂR UNGHlI - BIOLINE (AC HELCOR - România)
cp., ~-caroten 6 mg cp., ~-caroten 15 mg - supliment
NATURKAPS BETA CARafENE (HASCO-LEK S.A. - Cehia) SUPER BRONZ - CAPSULE PENTRU BRONZARE RAPIDĂ (Parapharm­
cps., ~-caroten 6,67 mg România)
ARKOPHARMA AZINC MENOPAUZA (Arkopharma Lab. Pharm. - Franta) cps., J3-caroten 1,30 mg - supliment
gelule, 13-caroten 6 mg
ACTIVAL 50+ (Beres Pharmaceuticals Ud. - Franta) Tehiiijlogia de biosinteză a J3-!:arotenului
cp. filrnate, ~-caToten 1,8 mg Specia f.p~!faTţe1la.~plih'tPS·ftiguranr. 38), din genul Dunaliella, clasa Chloro­
BETABRONZ (Walmark - Cehia) phyceae, famiTla-Ouna1iellaceae, este o micro~~lgă v~rde unicel~~elată,
cp., ~-caroten 10.000 UI ce cr.~!e în.jlpe hipeq;aline., pe care' le colorează _~I!._E9.i~~. Aiga . acumulează
BETA-CARafEN (Walmark, Cehia) Intra-celular cantităţi mari de -i::arotenoide'~ 'prîil'ii--e"'care: B-caroten, a-caroten,
cps. gelatinoase, ~-caroten 10.000 UI zeaxantill'ă, cftptoxaiitiÎ1(lute'lna, licopen:- .
CENTRUM MATERNA de la A la Z (Rottendorf Pharma - Germania) Date despre folosirea a~~stei algeSiillt regăsite În scrierile lui Plinius, care se
cp. filmare, ~-caroten 2 mg referă la .flos salis" = tloarea sării, foarte utilizată de către romani În parfumerie
CENTRUM SILVER cu LUTEINA (Wyeth Lederle - Italia) pentru culoarea sa, dar şi pentru calităţile de solvent ale glicerolului (biosintetizat
cp. filmate, vitamina A (50% ca ~-caroten) 800 ug de către algă).
BIO-CARafEN + E (Pharma Nord - Danemarca)
cps.. vitamina A (din care ~-caroten, 6 mg) 1000 mg + vitamina E 10 rug
BETA-CARafEN (S.C. Biofarrn S.A. - România)
cps. moi, vitamina A (13-caroten) 750 ug + vitamina E 0,56 mg
HARMONY LINE - BETA CAROTEN (Ivax Corporation - Cehia)
cps., 13-caroten 6 mg (12.000 UI) - supliment
PROPOLIS PLUS - PROVITA (Mark Pharruaceutics - România)
cp., ~~-caroten 6 mg + vit C 50 mg + vit E 20 mg + tinctură de propolis
11 ,5 mg
PRENATAL (Tishcon Corp. - SUA)
cp., vitamina A + p-caroten 4000 UI
ANTIOXIDANTI (Tishcon corp. - SUA)
cp., ~-caroten 2500 U 1+ vitamina C 50 mg + vitamina E 25 mg + seleniu 25
ug - supliment
MULTIVITAMINE+MULTIMINERALE (Tishcon Corp. - SUA)
cp., vitarnina A + ~-caroten 5000 UI (100%) - supliment
Figura nr. 38 Alga Dunaliella salina
PHYCOTENE MICROCLUSTERS (ROYAL BODY CARE - SUA)
cps., vitamina A (~-caroten) 7240 UI + vitamina E 43 UI + seleniu 3 ug
- supliment
 MEDICAMENTE DE 1310SlNTEZĂ 179
CĂTĂLlNA DANIELA STAN
178
şi procedeele de fermentatie discontinuă în sistem "batch", în conditii de salin.itate
Cultivarea controlată a micro-alge: s-a realizat prima oară de către ruşi III mică (ce favorizează creşterea algei) şi apoi ÎI) condiţii de salinitate crescută (ce
1966, aceştia punând la punct metodologia de obţinere a p-carotenului. La ora favorizează carotenogeneza), sau procedeele semicontinue Într-o singură fază În
actuală, cultivarea algei Dunalielia sa lina În scopul obţinerii p-carotenului este o conditii de salinitate medie. Cercetările au demonstrat că salinitatea mare a
poveste de succes comercial. Aiga se cultivă atât În lagune neamenajate, cât şi În mediului de cultură favorizează carotenogeneza, Însă ş~ de~ iar
bazine unde condiţiile de dezvoltare sunt atent controlate (figura nr. 39). ~alil1itatea mică a mediului favorizează cresterea şi dezvoltarea algei, dar scade
carotenogeneza.
Mediul de cultură conţine:
- surse de~: Q22' HCOJ';

-&S~ai
-
sursă de azot: NaNOI,
K2HP03 0,02 J..lgll ;
,a . 20-30% (v/v) (de 10 ori mai mare decât salinitatea apei mării) ;
- surse de Mg, Na, S04'. .
'---=' - -
Schema tluxului tehnologic la obţinerea p-carotenului prin cultivarea algei
Dunaliella salina este prezentată În figura nr. 40.
j)-Carotenul (ce este un amestec de izorneri cis-trans) se. acumuleaz!{Iitffi?

Figura I1r. 39 Lagune de creştere a algei ounaueua salina

Alături de Q-caroten alga secretă şi cantităţi mari de glicerol, ca mecanism de
protecţie Împotriva presiunii osm;;tice a mediUÎui hipersalin În care se dezvoltă.
in ultima vreme sunt încercări de obţinere a glicerolului din Dunalie/la salina .
recent (2005) dovedindu-se că din punct de vedere tehnic acest lucru este posibil,
deşi din punct de vedere economic fezabilitatea procesului este mică.
Dacă p-carotenul de sinteză se vinde cu 300-500 $/kg, costurile de producţie
pentru obţinerea lui prin cultivârea algei Dunaliella sa lina ajung la 50-100 $/kg.
Procedeul de obţinere a p-carotenului din această algă s-a pus la punct in anii
'85 şi este aplicat În Australia, Israel, SUA, China etc.
r _J'ţ)./I"; Alga e~!,C:: ~J!!'y,,!ţ1!..JQ_,J2.!:~~,~JlillkLJ!LQ_tem[ler!!!~răoI2tinllLd~J2-40?C,
~ În funcţie de tulpina folo~~_l~tensitaţ_e.!i_.J~IEi~~ii,_!I2~.9!uţii hipersaJine,
" ~ 'într::Uil"ille~@=Of~,~}Iui(deficitar În surse de azot şi_ill . .llJl.p-l:t=ll Toate acestea
____ sunt condiţii de str~~:.. ~!!'~U~~Jl..!....'!.!.&~"seg~ţ?_c.~~lţi~.ţi_.!p.~!:L9.e_
~:.c1!f.Qţ~}, _\.:_C<.JlYt
ajuIlge''ta i4%"'dfn pulberea uscată de al ă.
Cultivarea algei se face Îl fotobi eactoare tip eleşteu. deschise, unde se
controi;;a-ză s;li~liwea-şi-'Zc;~';;entraţianutrienţilor. -~pot utiliza""fotobio­
'fea'ct6âi:e·-tubiJiare [ncare se c'uidviCp~~~~dii de agar-agar, celule mqdificate şi
'P1Ujill sub formă de picături uleioase in stroma clor~pla~t~_I~:~~~i;_!:-a.~ţ~I:~~ul
procesuTiliOe' ct.ilfivare-rreouie "izclătdiri 'c-elU1â'algei şi în final puri ficat.
--'Fiitrar~a Gioni<i'sei ŞI e-x-iract!aCuSt;lvenţiselectivi ;iuru fazele cele mai costi­
sitoare ale procesului.
~~~c.~~ul,de!iltrare sau de S$Dtrifu€are a biomasei duce la deteriorarea
celulelo!:, aV~!1g_s_a re:?l,!!ta.tpierderi ue ~{-caroten prin oMigre. De asemenea, alga
se acumulează masiv, astfel încât există o densitate mare de celule în mediul de
cultură, deci biomasa e Weu dtj filtrat. Celu_l~e_:'!:I~!~li.!g!tre~,Q.!:i_l}_f!..!.lli;.le ce
~ll__~t)~ic,u diametrul < 10 um. D~ aceea, cel mai eficient ~ste ca gi~n!flS<;l să se"
.m:~SO!~1~Ptrj&,i:?fI!J.Jf~I~:a,:,săse realizeze cu "a.~i~i~~tide tipul p",~J}!~rlJR~.~e
~L
Biornasa filtrată este uscată şi poate fi comercializată ca supliment nutritiv
bogat 'InJ-:'car()!~-il pentr'O'UZ- um1l:Wşr~âii'l;jiril~î3'lOifîâS::[de Dunaliella salina
conţine - 3 % p-caroten.
~:'tl~~l~rp~~"arot~I}!J.l,l},i. .?!,~ _bi~I1~~s~ r~!r.tas~, du.!?!,.f~!tr.~~e,s.e reaIizea_~_ă .:u_
sş.~y'~ior&anic.i ~elestl~~, cu ~~.Ll!lj,'y'~~~l~, ori cu li~hi.9~H.P.!~~.,
--=- A fost dezvoltată o nouă metodă de producere a j)-carotenului (R.H. Hejazi
et ai., 2(04), prin cultivarea algeiDuilciliella~;aliiiâ în cOliaitii'normale (luminozitate
"
scăzută) şi apoi lfânsferanEă'ceTillt:lor într-un""tfo";eactof,u~l(i~sitat~;i~-~;-'
-Este mareTcondltll e stres). Prin urmare, ~u ivarea al~i în bioreactoare unde
~.-- __ ••••. ._____ '" __ ._. __ ••
----- __.-----~----.-, ••• ,__ ••"'l('--~.••.•• ~-.--

selectionate la nivel de laborator prin mutageneză, însă costurile procesului sunt luminozitatea este mare duce la creşterea concentraţiei de p-caroten. In acest
. .. _. --.-------.------- ..-.' -' _" .. ,. f:.~ . :p;'q~".~- .. ~'!ţ_-. __ o ---'-- -'.

mai mari. rnC{l::e~t_~~~ J~.. !>i()E~3.cţ2.~·o1tiţza org;misa bioc61ii.patiW,!~:(e.g. octanol,

Cultivarea algei în fază staţionară, într-un mediu cu salinitate 25% (v/v), În dodecan). Faza organică este continuu recirculată prin faza apoasă În care sunt
decurs de 5 zile, duce la obţinerea a 260 mg p-caroten/g celule. Se mai pot utiliza ~--'---y
j:j
"l!

H
ili
Ii ,
 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 181
180

inocul _ nUI!i_<;_!l_Ii__ cultivate celulele algei. În acest fel B-carotenul este extras continuu, iarq!lyl~le
NaCI
~i fortate sfhQntetÎzeze nOl-cantităti de-;11~tabolit ~-~cu;;'ciar,- ~d-ică de p-caroten.
-Utilizarea fâi.eTof~ranice, hiocOll:1patibi'Iă cu cea apoasă, f~ce ca rai-ei d'~ supra­
vieţuire a algei să ajungă, În condiţii de luminozitate mare, la 47 de zile. Totuşi,
Bioreactor tip eleşteu (50 Ha)

I . '--1 creşterea celulelor algei este mai lentă.

A itarea mediului pe parcursul ferrnentatiei se face prin recircularea fazei
orgaruce - 70 tuni/mTi1Ţ-În tiguui-nr:'41 Taoapfâfa-âtTpă--"R-:rr H~azl ,"i{"'1'r.
Wi.lffelS,'2004) este reprezentat schematic bioreactorul în două faze utilizat la
:, L_ Fi~re I obtinerea p-carotenului din alga Dunaliella salina, unde faza organică este
I
-_.- recirculată continuu prin faza apoasă.

I
Î-~
,--, r+:
: [ Mediu de cultură Biormsă
(saramură)
r----- 4=.~~tr=--I_j-- --(
I
---[=l 1
i,--------:-l
Aer I I I I

-T_j
[ Uscare

-.= l' ~~=---

L_Extracţia ~-carotenulLri_l -.. -·-----l--t---' . --t-·-------· +--~,
Solvent ~
-'--'-'---'--'-'--'--l 1

~~"T~,en)
Pulbere de algă Concentrare
1 -~-----_._-
[ -j--------~~-----+--'-
j ~l---.\oo o : ~~i'"
[----
- .-- ------J
T----
Purificare
~., Mediul o 000 j O o
- [~~J~~~~nare 1 oo O o
1)00-0 1-

j. _
-~-J
-r-
~~~~ţir;--l //_' ~~_ o o 001/

jre Figura nr, 41 Schema bioreactorului -În 2 faze utiliza: la obţinerea f:l-carolenului
din alga Dunolietla salina

r~-CarolenlJl produs de Dunaliella sa/in a se găseşte în globulele uleioase din

cloroplastele algei. EI este eliberat din aceste globule prin alterarea membranei,
[-~ţ~ datorită prezentei solventilor organici selectivi. -
Folosind această metodă,(!}W.ll1ai e necesar să s<:...!B!reze biomasa în vederea 1"
Figura nr. 40 Fluxul tehnologic la obtinerea B-carolenului din alga Dunaliella salina extracţiei f3-carotenului, deci celulele algei nu se mai distrug. Mai mult, purifi-
-_ ~ :d
r;~;
,iilo!
I.,.~
!!,:ful
 :r;,~~·

MEDICAMENTE DE BIQSINTEZĂ 183

182 CĂTĂLIN A DANIELA STAN

~Ee~ produs.ului = ~1ll?Iă şi .se rea.lizează prin ~x:.racJ!~_'jE-,ectivă~l

p-carotenuiul se realizeaza ~ontll1uu 9'-I!~a 2rgaru~_a. .. , ,.; IV.2.3. Biotehnologia carotenoidelor
Rata de extracţie este cu ·;;tâlffiai mare cu cât rata de recirculare a fazei
Pentru productia de carotenoide se folosesc o serie de fungi, drojdii şi micro-alge.
organice este mai mare (200 ml/rnin). Eficienţa extracţiei este de -55 %, iar
Drojdiile nu sunt producători performanţi de carotenoide, din punct de vedere
productivitatea procesului de 2,45 mg/m2/zi.
economic. În ce priveşte fungii, multi dintre ei nu produc deloc carotenoide, iar
În ultimii ani, o serie de cercetători s-au preocupat de găsirea altor producători
alţii produc doar un singur carotenoid. Aigele sunt, teoretic, producători prolifici
de p-caroten. Unele studii (S. Rabbani et al., 1998) au evidenţiat că şi alte tulpini
de Dunaliella, cum este Dunaliella bardawil, acumulează cantităţi mari de
de carotenoide, dacă sunt respectate unele condiţii optime de cultivare. ° serie de
microorganisme producătoare de carotenoide .sunt prezentate în tabelul nr. 28
l3-caroten, însă acestea nu sunt Încă folosite la scară industrială drept producători
(adaptat după E.J. Vandamme, 1989).
de l3-caroten.
Pentru obţinerea l3-carotenului se pot folosi şi tulpini ale unor fungi de tipul Tabelul nr. 28
Phycomyces blakesteeanus . Blakeslea trispora , Neurospora crassa , ce conţin în Producători de carotcnoide
principal trans p-caroten. Ferrnentaţia, ÎI) cazul acestor tulpini se realizează la ..
260C, pe un mediu de cultură ce contine extracte de graminee, uleiuri vegetale, : . Nr,crt.· - Jjen~lr~ hi1.croOr&_~~l
hidrocarburi, acetaţi, leucină şi alti aminoacizi. Cercetătorii de la Eli Lilly au 1. Pliycomyces blakesleeanus
raportat obţinerea a peste 2 mg j3-caroten/g pulbere uscată de miceliu, în cazul 2. Phaffia rhodozvma
cultivării tulpini lor de Phycomyces blakesleeanus . Studii ulterioare, pe tulpini 3. Choanephora cucurbitarum
modificate genetic de Phycomyces blakesieeanus, au demonstrat posibilitatea 4. Blakeslea trispora
obţinerii, În anumite condiţii (Ia nivel de laborator), a 25 rng ~-carotenfg pulbere 5. Neurospora crassa
uscată de miceliu. În cazul tulpini lor de Neurospora crassa, prezenta în mediul 6. Aspergillus giganteus
de cultură a unor agenţi tensioactivi şi utilizarea unor raţii corecte de C/N duc la 7. Penicillium spp.
obţinerea a 2-5 mg p-caroten/g pulbere uscată de miceliu. 8. RhodOJporidil.lln diobovatum
În Europa se utilizează industrial fungi de tipul Blakeslea trispora , obţinân­ 9. Rhodotorula aurea
10. Rhodotorula minute
du-se aproximativ 200 kg l3-caroten pur/an, dar şi alte carotenoide (compania
DSM Gist Brocades, Elvetia).
Producţia industrială foloseşte 2 tipuri de micelii, de sexe diferite, modificate G. Frengova et (/1. prezintă pentru prima dată, în 1997, obtinerea unui complex
genetic, ce sunt cultivate la 26°C, timp de 3 zile, pe un mediu lichid (extracte de caroten-proteină din tulpini de Rhodotorula glutinis 22P crescute în zer de
de porumb, bumbac, uleiuri vegetale, sucuri de citrice. tiarnină, kerosen, anti- brânză, un substrat natural care contine lactoză. Rhodotorula glutinis nu poate
asimila lactoza În schimb asimilează glucoza, galactoza şi acidul lactic, astfel că,
oxidanti).
Cele două tulpini sunt cultivate separat şi succesiv înainte de inoculare pe un prin cultivarea alături de bacteria lactică homoferrnentativă Lactobacillus helve­
mediu ce conţine: extract de porumb, KH2P04, MnS04, tiamină. Sunt inoculate ticus 12A, se creează un mediu optim de asimilare a lactozei pentru Rhodotorula
la 260C şi supuse fermentaţiei timp de 40 ore (mediul de cultură este agitat şi glutinis . .În culturile amestecate de Rhodotorula glutinis 22P + Lactobacillus
',o
aerat corespunzător). Mediul de cultură obţinut după această primă fermentatie ?- helveticus 12A bacteria lactică homofermentativă transformă lactoza În glucoză,
galactoză şi acid lactic. În acest fel, tulpina de Rhodotorula glutinis 22P, care nu
se reinoculează în alt mediu ce conţine ulei din seminţe de bumbac, ulei de soia, ~
extract de porumb, kerosen, tiamină. Această a doua fermentaţie se realizează la '"."
poate asimila lactoza creşte viguros şi sintetizează carotenoide. Separat, creşterea
26°C, timp de 185 de ore. i bacteriei este stimulată cu ajutorul vitaminelor şi a aminoacizilor produşi de
Prin ace stă tehnologie (metoda Rhone-Poulenc în 2 paşi) se obtin aproximativ ."i
drojdie.
Când sunt crescute pe substraturi care contin mono- şi di-zaharide sintetice,
30-39 rng p-carotenfg biomasă, sau 3 g/I mediu.
aceste tulpini sunt capabile să sintetizeze carotenoizi ca şi atunci când sunt
cultivate pe substraturi natura le (e.g. melasa),
ll'
':!
;1"
i,!II,
. ,
 .""! I
I
I
t·

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
182 CĂTĂLlNA DANIELA STAN 183

~~e!! produs.ului est~ simflă şi .se rea.liz~ază prin ~x:racji~. selectivă:E_al

l3-carotenulUi se realizează continuu din faza orgaruca. .---z,.- N.2.3. Biotehnologia carotenoidelor
Rata de extractie este c~·ătât ;;~i .~-:;;-~ ~u cât ~ata de recirculare a fazei
organice este mai mare (200 ml/min). Eficienţa extracţiei este de -55%, iar Pentru producţia de carotenoide se folosesc o serie de fungi, drojdii şi micro-alge.
productivitatea procesului de 2,45 mg/m2/zi. Drojdiile nu sunt producători performanţi de carotenoide, din punct de vedere
În ultimii ani, o serie de cercetători s-au preocupat de găsirea altor producători economic. În ce priveşte fungii, multi dintre ei nu produc deloc carotenoide. iar
altii produc doar un singur carotenoid. Aigele sunt, teoretic, producători prolifici
de l3-caroten. Unele studii (S. Rahbani et al., 1998) au evidenţiat că şi alte tulpini
de Dunaliella, cum este Dunaliella bardawil, acumulează cantităţi mari de de carotenoide, dacă sunt respectate unele condiţii optime de cultivare. °
serie de
l3-caroten, însă acestea nu sunt Încă folosite la scară industrială drept producători microorganisme producătoare de carotenoide sunt prezentare în t.abelul 11r. 28
de l3-caroten. (adaptat după E.J. vandarnme, 1989).
Pentru obtinerea l3-carotenului se pot folosi şi tulpini ale unor fungi de tipul
Tabelul nr, 28
Phycomyces blakesleeanus, Blakeslea trispora, Neurospora crassa, ce conţin În
Producători de carotenoide
principal trans 13-caroten. Ferrnentaţia , În cazul acestor tulpini se realizează la
- ".- ... ", .. , ..• _ ..
26oC, pe un mediu de cultură ce conţine extracte de graminee, uleiuri vegetale, ; . ·.N17,crt. " Denumire nJi~r9"Qţ.~anisin
hidrocarburi, acetaţi, leucină şi alţi aminoacizi. Cercetătorii de la Eli Lilly au
1. Phvcomvces blakesleeanus
raportat obţinerea a peste 2 mg 13-caroten/g pulbere uscată de miceliu, în cazul
2. Phaffia rhodotyma
cultivării tulpini lor de Phycomyces blakesleeanus, Studii ulterioare, pe tulpini
3. Choanephora cucurbitarum
modificate genetic de Phycontyces blakesleeanus. au demonstrat posibilitatea 4. Blakeslea trispora
obtinerii, În anumite conditii (Ia nivel de laborator), a 25 mg l3-caroten/g pulbere 5. Neurosporo crassa
uscată de miceliu. În cazul tulpini lor de Neurospora crassa , prezenţa în mediul 6. Aspergillus giganteus
de cultură a unor agenţi tensioactivi şi utilizarea unor raţii corecte de C/N duc la 7. Penicillium spp.
obţinerea a 2-5 mg [3-caroten/g pulbere uscată de miceliu. 8. Rhodosporidium diobovatum
În Europa se utilizează industrial fungi de tipul Blakeslea trispora, obţinân­ 9. Rhodotorula aurea
du-se aproximativ 200 kg l3-caroten pur/an, dar şi alte carotenoide (compania 10. Rhodotorula minuta
DSM Gist Brocades, Elveţia).
Producţia industrială foloseşte 2 tipuri de rnicelii , de sexe diferite, modificate G. Frengova et al. prezintă pentru prima dată, în 1997, obţinerea unui complex
genetic, ce sunt cultivate la 26oC, timp de 3 zile, pe un mediu lichid (extracte de caroten-proteină din tulpini de Rhodotorula glutinis 22P crescute În zer de
de porumb, bumbac, uleiuri vegetale, sucuri de citrice, tiamină, kerosen, anti­ brânză, un substrat natural care conţine lactoză. Rhodotorula glutinis nu poate
oxidanţi). asimila lactoza În schimb asimilează glucoza, galactoza şi acidul tactic, astfel că,
Cele două tulpini sunt cultivate separat şi succesiv înainte de inoculare pe un prin cultivarea alături de bacreria lactică homoferrnentativă Lactobacillus helve­
mediu ce conţine: extract de porumb, KH2P04, MnS04, tiamină. Sunt inoculate ticus 12A, se creează un mediu optim de asimilare a lactozei pentru Rhodotorula
la 260C şi supuse ferrnentaţiei timp de 40 ore (mediul de cultură este agitat şi glutinis. În culturile amestecate de Rhodotorula glutinis 22P + Lactobacillus
aerat corespunzător). Mediul de cultură obtinut după această primă fermentatie helveticus 12A bacteria lactică homofermentativă transformă lactoza În glucoză.
se reinoculează în alt mediu ce conţine ulei din seminţe de bumbac, ulei de soia, galactoză şi acid lactic. În acest fel, tulpina de Rhodotorula glutinis 22P, care nu
extract de porumb, kerosen, tiarnină. Această a doua fermentaţie se realizează la poate asimila lactoza creşte viguros şi sintetizează carotenoide. Separat. creşterea
26oC, timp de 185 de ore. bacteriei este stimulată cu ajutorul vitaminelor şi a aminoacizi lor produşi de
Prin acestă tehnologie (metoda Rhone-Poulenc În 2 paşi) se obţin aproximativ
~:~ drojdie.
,1 ~~

30-39 rng l3-caroten/g biomasă, sau 3 g/l mediu. Când sunt crescute pe substraturi care contin rnono- şi di-zaharide sintetice,
.,~
aceste tulpini sunt capabile să sintetizeze carotenoizi ca şi atunci când sunt
cultivate pe substraturi natura le (e.g. melasa).

fji
"~~ !
Cţ~~
-,®.".",
 'AI!;
'~."
.•• >.
CĂTĂLINA DANlELA STAN
184
Culti vând Rhodotorula glutinis 22P + Lactobacillus helveticus 12A într-un
bioreactor MBR AG (Zurich, Elvetia), parametrii de creştere în culturile de
organisme, descrişi de G. Frengova sunt:
• temperatura de incubare, 30oC;
• pH-ul initial, 6,0 (nu se ajustează În timpul procesului de creştere) ;
• aeraţia, 0,55 I de aer/I mediu/min. ;
• agitarea, 220 rot/min. ;
• timpul de fermentatie, 7 zile.
Cea mai mare concentraţie de carotenoizi în celule, s-a înregistrat în faza
stationară a procesului de creştere (263 rng/g celule în substanţă uscată, ziua a
6"), în timp ce producţia de celule (30,9 g/I) şi sinteza de polizaharide (8,2 g/l)
a atins punctul maxim în a 4" zi de creştere a drojdiilor.
Cercetările din ultimii ani au fost efectuate privind selecţia şi productia de
tulpini mutante producătoare de carotenoide, pentru a găsi şi dezvolta noi surse
natura le de carotenoizi.
Unele din aceste lucrări sunt menţionare în acest capitol, dar rezultatele
obţinute în această directie sunt insuficiente. Relativ putine metode de selectie au
fost dezvoltate, incluzând utilizarea de antimicină, 13-ionone, a citometriei de
flux, a celulelor de sortare, expunerea la lumină şi prezenta colorantului Rose
Bengal. Mai mult, metodele pentru selectarea mutanţilor carotenoid-producători
baza te pe activitatea lor de protecţie nu au reuşit. Aceşti mutanţi carotenoid­
-producători s-au dovedit a fi mai sensibili la antimicină, tionil-trifluoro acetonă,
H202' cianură, lumină ultravioletă, toate acestea fiind legate de radicalii de
oxigen. G.H. An a arătat că rnutanţii producători sunt mai sensibili la fotosinteză
decât tulpinile sălbatice. Acest lucru se datorează partial activităţii scăzu te a
enzimei superoxid disrnutaza.
Creşterea cantităţii de carotenoide biosintetizate se realizează prin inserarea şi
exprimarea genelor responsabile de carotenogeneză în tulpini de drojdii (Saccha­
romyces cerevisiae).
Gene de la speciile Erwinia, de la bacteria marină Agrobacterium aurantiacum
şi de la tulpini din specia Alcaligenes , responsabile pentru sinteza de carotenoizi ,
inclusiv de licopene, [3-caroten si astaxantină, au fost izolate şi rolurile lor
elucidate.
Tulpina de Saccharomyces cerevisiae, transportatoare de gene ale carotenoi­
delor care apartin bacteriei Erwinia uredovora, a fost folosită pentru obtinerea de
licopen şi [3-caroten, dar cantităţi le produse de aceste microorganisme sunt de
numai 0,1 mg de licopen/g celule (substanţă uscată) şi respectiv de 0,1 mg de
[3-caroten/g celule (substanţă uscată).
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 185
Folosind calea izoprenoidelor, o serie de cercetători au îmbunătăţit producţia
de caroteni cu ajutorul tulpinilor de Escherichia coli.
Supraexprimarea unor gene în Escherichia coli şi intoducerea unui set de gene
din Erwinia uredovora ce codifică geranil-geranil-difosfat sintetaza şi fitoen
sintetaza, cuprinse într-o plasmidă, inclusiv ADN" ce codifică fitoen denaturaza
din Xanthophyllomycesdendrorhous, au avut ca rezultat acumularea de licopene
şi zeaxantine în tulpina transformată. A crescut acumularea de carotenoide de
10,8 ori, comparativ cu microorganismele lipsite de supraexprirnare, astfel că,
acele colonii au acumulat cantităţi mari de licopene (1333 rng/g substanţă uscată)
şi zeaxantină (592 mg/g substanţă uscată). În timpul unei perioade de Il zile,
aceşti cercetători au observat că numărul coloniilor producătoare de zeaxantină a
crescut de două ori mai repede decât cele care produceau licopene.
Ce-expresia unor gene a dus la creşterea obţinerii de licopen de la 160 rng/g
substanţă uscată la 1106 mg/g de substanţă uscată, dar şi la creşterea productiei de
zeaxantină de la 186 la 526 mg/g de substanţă uscată.
Sinteza unui anume carotenoid necesită prezenta de gene care pot fi combinate
cu o singură plasrnidă, sau pot ti incluse Într-o serie de plasmide. Este disponibilă
o gamă largă de gene care pot sintetiza carotenoidele C4Q' ° serie de gene din
Erwinia sunt întotdeauna exprimare în Escherichia coli pentru sinteza primei
componente din calea C41), Un număr de gene pot fi selectate pentru a obtine
molecule ciclice de licopen cu inele r.) si e. De asemenea, pot fi găsite gene pentru
introducerea grupărilor funcţionale (e.g. grupări ceto- sau hidroxi-) în moleculele
carotenoidelor, în inelele şi În lanturile liniare.
G. Sandrnann el al .. au exprimat în Escherichia coli o serie de gene ale
carotenoidelor de la Erwinia uredovora şi de la două specii de Rhodobacter
cuprinse în plasmide compatibile, ceea ce a făcut posibilă sinteza a opt hidroxi­
-derivaţi din diferite carotenoide pe lângă alti carotenoizi ciclici.
Fungii produc. În conditii normale, cantităţi mici de carotenoide. Prin mutatii
genetice s-au obtinut tulpini ce produc cantităţi de 500 ori mai mari decât tulpinile
originale, putându-se ajunge astfel la 25 mg carotenoid/g pulbere uscată de
miceliu. Acest lucru se realizează prin transformarea eficientă a tulpinilor unor
fungi (Phycomyces blakesieeanus) prin introducerea de ADN exogen, astfel încât
să crească productivitatea tulpini lor respective.
Creşterea productivităţii procesului de obţinere a carotenoidelor se poate
realiza şi dacă tulpini le producătoare sunt cultivate în prezenţa luminii de culoare
albastră. Totuşi, această opţiune nu este valabilă în cazul tuturor fungilor, tulpinile
de Blakeslea trispora nefiind influentare de această lumină. Cantităţile de caro­
tenoide obţinute prin cultivarea în prezenta luminii a unor tulpini de fungi sunt
redate În tabelul nr. 29 (adaptat după E.J. Vandarnme, 1989).
,.,.
1~
j!j
 '~r
186 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Tabelul nr. 29
. Carotenoide obţinute prin cultivarea unor fungi în prezenta luminii
1. Aspergillus giganteus
:~ ~~~i~l;~ţlr~l~~:~~t~~:: )., .
170 (13-caroten)
2. Pliycomyces blakesleeanus 550 (13-carott:n)
3. . Rhodosporidium diobovatum 700 (fJ-carotcn)
Au fost cercetati şi alţi producători de carotenoide, pentru mulţi dintre aceşti
existând date la nivel de laborator sau chiar de staţie pilot. Însă, nici unul nu a
fost dezvoltat pentru productia industrială până în acest moment, deşi rezultatele
obţinute sunt foarte încurajatoare. Astfel de producători sunt:
• bacterii de tipul: Flavobacterium multivarum, Altermonas spp., Flexibacter
spp. şi alge ca: Neospongiococcum excentricum, Dunaliella salina care produc
cantităţi importante de zeaxantină ;
• fungi de tipul: Phaffia rhodozyma. şi bacterii ca: Corynebacterium spp.,
care produc cantităţi importante de cantaxantină ;
• fungi de tipul: Phaffia rhodotyma, Xantophyllontyces dendrorhous, alge ca:
Hematococcus pluvialis, plante superioare ca: Adonis aestivalis care produc
cantităţi importante de astaxantină ;
• alge verzi ca Muriellopsis sp, care produc cantităţi importante de luteină,
Fungii de tipul Phaffia rhodozyma sunt producători importanti de astaxantină.
Studii americane recente (US Patent, 1998) au arătat că tulpini modificate
genetic ale acestui fung produc în anumite conditii de fermentatie (260C, O2, 16 h)
peste 600 ug astaxantină/g pulbere uscată de miceliu.
Temperatura scăzută şi sensibilitatea fată de lumină pot fi folosite ca agenţi de
selectare a mutanţilor carotenoid-producători. La 2rPC, tulpina mutantă Aru-l de
Phaffia rhodozyma produce de 3,2 ori mai multe carotenoide (960 mg carotenoide/g
de tulpină, comparativ cu tulpina sălbatică 11f. 67-385, care produce doar 300 mg
carotenoide/g tulpină).
J.C. Paraj6 et al. au obţinut carotenoizi prin cultivarea tulpini lor de Phaffla
rhodozyma.într-un mediu format din substrat hemicelulozic hidrolizat de Eucalyptus
globulus . Aceşti cercetători au produs soluţii de zahăr din lemn dulce ca mediu de
fermentatie pentru Phaffia. Bazati pe descoperirile din celelalte experimente şi cu
scopul de a studia creşterea dinamică şi obţinerea de caroteni din Phaffia, studiile
asupra ferrnentării au fost efectuate prin optimizarea mediului de cultură. După
neutralizarea cu sodă caustică, detoxifierea cu cărbune activ şi suplimentarea cu
3 g peptone/l mediu, s-a demonstrat că acesta este un mediu adecvat de creştere
I
I MEDICAMENTE DE B10SINTEZĂ 187
a fungilor şi de obtinere a carotenilor. Totalul de carotenoizi a atins 12,9 mg/I şi
cel de astaxantină a crescut până la 10,4 mg/l. Cele mai mari concentrarii de
carotenoizi au fost obţinute folosind 29-40,8 gzahăr/l mediu de cultură.
Alături de microorganisme au fost cercetate şi o serie de alge, pentru a se
stabili dacă sunt producătoare prolifice de carotenoide.
Astfel, alga Dunaliella salina poate fi cultivată în anumite conditii (lumi­
nozitate scăzută), care permit obtinerea unor cantităti crescute de carotenoide,
eventual numai a unui singur carotenoid în cantitate mare, ce poate fi separat
ulterior. În aceste conditii speciale de cultivare, în 2003 (E. Jin el al., 2003) s-a
raportat biosinteza a 6 mg zeaxantină pentru fiecare gram de algă, comparativ cu
doar 0,2 mg zeaxantină cât se găseşte în mod natural în aceasta.
J.A. Del Campo el al. au studiat productia de luteină de către algele verzi,
unicelulare din specia Muriellopsis . Experimentul a fost efectuat timp de un an,
folosind un fotobioreactor tubular plasat în atmosferă liberă, srudiindu-se pe tot
parcursul anului efectele ratei de diluţie, de amestecare şi a ciclului zilnic al
soarelui, asupra producţiei de luteină şi de biomasă. Cea mai mare productivitate
pentru luteină a fost obţinută în luna mai (aproximativ 180 mg/nr'zzi).
O creştere rapidă a continutului În luteină a fost observată la specia Muriellopsis
ca răspuns la radiatiile din primele ore ale zilei, mai ales la prânz (6 mg/g
substanţă uscată), urmată de un declin constant în rata productiei. O înmulţire a
celulelor de creştere a fost observată după ce a fost stabilit raportul luteină/
clorofilă, arătând că luteina poate avea rol de agent de fotoprotecţie ..
Cercetări recente (C.D. Kang el (II., 2008) au demonstrat că şi alte micro-alge
pot sintetiza carotenoide. Astfel, Hematococcus pluvialis s-a dovedit o sursă mai
importantă de carotenoide decât Dunaliella salina.
O serie de cercetători au investigat complexele de carotenoide formate în
timpul creşterii algei Haematococcus. I3-Carotenul, luteina , violaxanrina si neo­
xantina au fost găsite în celulele vegetale, în timp ce, mai mult de 90% din
carotenoizii găsiţi În aplanospori corespund astaxantinei mono- şi bi-ester,
Aiga produce şi acumulează cantităţi importante de astaxantină, de până la 4-8 %
din pulberea uscată de algă. Cultivarea acesteia este însă mai complexă, iar produc­
tivitatea procesului de obţinere este mai mică decât în cazul algei Dunaliella salina.
Separarea astaxantinei se realizează fără filtrarea biomasei, mediul de cultură
tiind amestecat cu uleiuri vegetale În vederea extracţie: directe. Astaxantina, ce se
găseşte intracelular, a fost extrasă în faza uleioasă prin interactiune hidrofobă cu
aceasta. Extractul uleios a fost ulterior separat folosind forta gravitaţională.
Randamentul procesului de extractie ajunge la 88 %.
Extracţia, concentrarea şi purificarea sunt etapele cu costurile cele mai mari,
motiv pentru care, deocamdată, utilizarea acestei alge ca sursă de carotenoide nu
este fezabilă din punct de vedere economic.
.'!
::j
.:'f,
;!i,
 ~~'
\'f
188 cĂTĂLINA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 189

Nu au fost făcute multe în ceea ce priveşte îmbunătăţirea tulpini lor pentru

optimizarea productiei de astaxantină, O variantă putin probabilă este aceea de a
folosi gametogeneza şi hibridizarea sexuală. Mutanţi rezistenti la inhibitori ai
biosintezei de carotenoizi au fost obtinuti prin intermediul hibridizării prin
fuziunea protoplastelor, obţinându-se celule cu grad Înalt de ploidie, cu un
conţinut crescut de carotenoizi. N. Chumpolkulwong el al. au demonstrat În 1997
că mutantii de Haematococcus rezistenti la compactină (mevastatină), un inhibitor
al hiciroximetil-glutaril-CoA reductaza (o enzimă importantă care intervine În
biosinteza izoprenoidelor), acumulează de la 1,4 ori până la 2,0 ori mai multă
astaxantină decât tulpina sălbatică.
Studii de biologie moleculară ale genelor şi enzimelor implicate În biosinteza
de astaxantină dezvăluie constatări interesante.
Un număr de carotenoizi, printre care p-carotenul şi unele carotenoide cu
grupări cetonice, au fost găsi te În bacterii din genul Eubacteria (e.g. Flavo­
bacterium, Brevibacterium, Erwiniaş, precum şi Într-o serie de bacterii din regnul
Archaebacteria (bacteria halofilă Halobacteriumţ,
Genele carotenilor din Erwinia uredovora au fost introduse şi exprimate În
bacterii lipsite de caroteni, inclusiv În bacteria Escherichla coli,
S. Kajiwara el al. şi T. Lotan el al, au folosit tulpina de Escherichia coli
pentru a clona gene ale Haematococcus pulvialis care codifică p-caroten aldolaza,
obţinându-se astfel o tulpină de Escherichia coli capabilă să exprime şi să
sintetizeze cantaxantină.
Extrapolând. este posibil să se obţină astaxantină cu ajutorul celulelor de
Escherichia coli manipulate genetic.
Ţinând cont că piata astaxantinei este de 2500 euro/kg, fată de 750 euro/kg cât
este in cazul B-carotenului, cercetările În vederea optimizării obtinerii astaxantinei
au un viitor sigur.
Creşterea cererii pentru coloranti naturali şi provitamine, precum şi o înţele­
gere mai profundă a beneficiilor terapeutice date de caroteni, au condus studiile
de cercetare către obtinerea acestora din microorganisme.
Au fost obţinute prin inginerie genetică tulpini foarte productive, care produc
o gamă largă de carotenoide cu activitatea biologică dorită. Randamentele de
obţinere ale acestor compuşi sunt şi ele supuse studiului. Cuplarea acestor căi
este o strategie de succes, care a fost urmată cu scopul de a elucida şi a Îmbunătăţi
sinteza acestor carotenoide.
Provocarea de azi este de a produce tulpini capabile să sintetizeze compuşi
stabili la factorii externi, cum sunt lumina, pH-ul etc., dintre care unii ar fi foarte
dificil de obtinut prin sinteză chimică.
._\
Bibliografie
1. Amar E.C., Kiron Y., Satoh S., Watanabe T., Fislt SlteLljislt Immunot., 2004,16:
527-537 ;
2. An G.H., Appl. Biochem. Biotechnol .. 1997, 66: 262-268;
3. Andreas O.L., Norris K.C., Coburn r.w.. el aI., N. Ellgl. J. ue«, 1989,321 :
274-279 ;
4. Andreasen A.A., Atier T.J.B., .1. Cell. Physio!., 1953,41: 23-36;
5. Andr ieş A. A., Lupuleasa O" Oteleanu O., Zuchi Gh., Hincu L., Nilă S.,
Cazacincu R., Procese tehnologice de obţinere industrială a 111101' substanţe [arma­
ceuticc . Ed. Universitară ,.Carol Davila ", Bucureşti, 2006, 331-351;
6. Archer 0.13., Connerton I.F.. MacKenzie O.A., Adv. Biochem. Engin/Biotechno!.,
200R, .III: 99-147:
7. Arnau J., Murillo F.J .. Torres-Martinez S., Ma/ee. Gen. Genct ., 1988, 212:
375-377 :
8. Ausich R. L., Pure & Appl. Chem.; 1997, 69( II): 2.169-2173:
9. Avalos J., Cerdă-Olmedo E" Phytochem.; 1986, 25: 1837-1841;
10. Avruch L" Fischer S., Pierce H.O .. Oehlschlager A.C., CaII. J. Biochem .. 1976.
54: 657-665:
Il. Baer C .. Williams B.R" Clinica! Pharmacology and Nursing , Ed. Springhouse,
1996:
12. Bailley R .. el (/1., Europeean Patent, nr. 20060748522, 2007:
13. Bedcleanu D.D .. Manta 1., Biochimie medicală şi farmaceutică, voI. 1, Ed. Dacia,
Cluj-Napoca , 1985;
14. Beers M. H" Berkow R. (eds), Manualul Merck de Diagnostic şi Tratament,
(traducere R. Chirculescu), Ed. Bic AII. Bucureşti, 2002;
15. Bejarano E.R. el al, Archs Microbiol.; 1988, 150: 209-214:
16. Bejarano E.R., Cerda-Olrnedo E., Phytochem., 1989,28: 1623-1626:
17. Bejarano E.R., Govind N.S., Cerda-Olmedo E" Phytochem., 1987,26: 2251-2254:
1 Il. Ben-Amotz A .. J. Appl. Phyco!., 1995. 7: 65-68;
19. Borowitzka L.J" ,.Algal growth media sources of algal cultures., În: Micro-algal
Biotechnology , Borowitzka M .A. & Borowitzka L.J. (eds) , Cambridge University
Press, Cambridge. 1988, 456-465 :
20. Borowitzka L.J .. Borowitzka M.A., .. [I-caroten production with algae" În: Biotech­
nologv of vitamins. pigments aud growth [actors, Vandamme E.J. (ed), Elsevier
uo..
Science Publishers NY. SUA, 1989, 15-26;
21. Borowitzka M.A., J. Appl. Ptiyco!., 1992,4: 267-279;
22. Borowitzka M.A., J. Biotechnol .. 1999,70: 313-321;
;;. 23. Bramley P.M., Mackenzie A., Curr. Topics Cell Reglll., 1988,29: 291-343; ,I.
24. Briuon G .. Liaaen-Jensen S., Pfander H. (eds.), Carotenoids, 1995, voI. 1 B,
Birkhauser Verlag. Basel, Germany ;

)J~ :1,11

r~
.[:1
11;'rr
190 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 191

25. Carswell S., .Vitamin D in thc nervous system: act ion and therapeutic potential" 54. Gershoff S.N., Nutr. Rev., 1993,51: 313-326;
În: Vitamin D, Feldman D., Glorieux F.H., Pike J.w. (eds), Academic Press, San 55. Glick Il R., Pasternak J. J., Molecular biotechnology. Principles arul applications
Diego, CA, 1997, 1197-1212; of recombinant DNA, 3'd edition, ASM Press, Washington OC, 2003, 344-348;
26. Caşcaval D., Galaction A.I., Chem. Ind. l., 2004, 58(9), 375-386; 56. Gokce N., Keaney J.F. Jr., Frei 8., I-Iolbrook M., Olesiak M., er.al., Circulation ,
27. Caşcaval D., Oniscu C., Galaction A.L, Inginerie biochimică şi biotehnologie. 1999, 99: 3234-3240;
3. Procese de separare, Ed. BIT, lasi, 2004; 57. Grecn R., MillerJ.W., Semin. Hemntol.; 1999,36: 47-64;
28. Caşcaval D., Oniscu C., Hung, l. tna. Chem., 2000, 28(2): 99-105; 58. Grozav A., Trandafirescu C., Şoica C., Gogonea v., Ciubotariu O., Noţiuni de
29. Caşcaval D., Tudose R., Oniscu C., Hung . 1. II/d. Chem., 1998,26(2): 141-146: chimie farmaceutică, Ed. Mirton, Timişoara, 2001 ;
30. Cerdă-Olrnedo E., "Carotenc" În: Phycomyces, Cerdă-Olruedo E. & Lipson E.D. 59. Grung M., O'Souza F.M.L., Borowitzka M., Liaaen-Jensen S., 1. Appl. Phycol..
(eds), Cold Spring Harhor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1987, 199-222; 1992, 4: 164-171;
31. Cerda-OlmedoE., Meth. Enzymoi., 1985, IlO: 220-243; 60. I-Iarker L.A., Curr. Opin. Hemato!., 1999,6: 127-134;
32. Cerdă-Olmedo E., Production of carotenoids with fungi" În: Biotechnology of 61. Hejazi M.A., Andrysiewicz E., Trarnper J., WijtTels R.I-l., Biot echnol , Bioeng.;
vitamins, pigments and growth [actors, Vandamme E.J. (ed), Eisevier Sciencc 2003, 84(5): 591-596;
62. I-lejazi M.A., de Larnarliere C., Rocha J.M .. S., Verrnue M., Tramper J .. Wijffels
Puhlishers Ltd., NY, SUA, 1989,27-42;
33. Chapuy M.C., Arlot M.E., Duboeuf F., et.al., N. Engl. 1. Med., 1992,327: R.I-I., Biotechnol. Bioeng., 2002, 79(1): 29-36;
1637-1642 ; 63. Hejazi M.A., I-Iolwerda E., Wijffels R.I-I., Biotechnol. Bioeng; 2004, 85(5):
475-481 ;
34. Chapuy M.C., Arlot M.E., Eisman A.V., et.al., 1. Clin. Endocrinol . Metab.,
1990, 71: 836-841 ; 64. Hejazi M.A., Kleinegris O.. Wijffels R. H., Biotechnol. Bioeng., 2004.88: 593-600;
35. Chervenak M., II/d. Biotechno!., 2006, 2(3) : 174-176; 65. Hejazi M.A., WijtTels R.H., Biomoi, Eng., 2003, 20(4-6): 171-175:
66. I-Iejazi M.A., Wijffels R.H., Trends Biotechnoi.; 2004, 22(4): 189-194:
36. Chumpolkulwonk N., Kakizono T., I-Ianda T., Nishio N., Biotechnol. Leu., 1997,
67. Himizu S., "Vitamins arid related cornpounds : Microbial Production" În: Bio­
19: 299-302;
technologv Second, Completeiy Revised Edition, Rehm 1-1.1., Reed G., Puhler A.,
37. Ciorănescu E., Medicamente de sinteză, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1966;
Stadler P. (eds.), vol. 10, Special Processes, Rehm H.J. (ed.), Wiley-VCH Verlag
38. Coman M., Boia C., Pop c., Biotehnotogii farmaceutice, Ed. Medicală Universitară
GmbH., Wcinheim, Germania, 2001, 320-340;
"Iuliu Hatieganu". Cluj-Napoca, 2004, 139-156;
68. Hirsch A., .Vitamin O" În: Kirk Otmer's Encyclopediaof Chemical Technology,
39. Curtain C.C., West S.M., Schlipalius L., Aust . 1. Biotechnoi., 1987, 1: 51-57;
3'd edition, voi. 20, Wiley-Iruerscience. New-York, 1984, 186-213;
40. Dawson-Hughes B., Horris S.S., et. al. , N. Engl. 1. Med., 1997, 337: 670-676;
69. Horst R.L., Reinhardt T.A., "Vitamin O metabolism" În: vitamin D, Feldman O.,
41. De la Concha A., Murillo F.J., Planta, 1984, 161: 233-239;
Glorieux F.I-I., Pike J.w. (eds), Academic Press, San Oiego, CA, 1997, J3-32;
42. DcI Campo J.A., Rodrîguez H., Moreno J., Vargas M.A., Rivas 1., Guerrero
70. Hsu w.J., Yokohama H., Coggms C.W .. Phytochem., 1972, 11 : 2985-2990:
M.G., 1. Biotechnol., 2001, 85: 289-295; 71. Jin E., Feth B, Melis A., Biotechnol Bioeng , 2003, 81 (1): 115-124;
43. Delic v., Sunic O., Vlaăic O., "Microbial reactions for the synthesis of vitamin C" 72. Johnson E.A., An G.H., Crit . Rev. Biotechnol.; 1991, 11: 297-326;
În: Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors. Vandarnme E. J. (ed),
73. Jusko W.J., Levy G., "Ahsorption, protein binding and eliminauon ofriboflavin'
Eisevier Science Publishers Ltd., NY, SUA, 1989,299-336; În: Riboflavin , Rivlin R:S. (eu), Plenum Press, New York, 1975,99-152;
44. Dobrescu O., Farmacoterapie practică, vol. 1, II, Ed. Medicală, Bucureşti, 1989: 74. Kajiwara S., Kakizono T., Saito T., Kondo K., Ohtani T., Nishio N., Nagai S ..
45. Dulaney E.L., VS Patent, Preparation of ergosterol containing yeast , 2817624,1957; Misawa N., Plallt MoI. Biol., 1995,29: 343-352;
46. Dulaney E. L., Stapley E.O., Simpf K., Appl. Microbiol., 1954, 2: 371-379; 75. Kallner A., Harunann O., Hornig D., 1111. J. Yitam. Nutr. Res., 1977,47: 383-388;
47. EI-Jack M., Mackenzie A., Bramley P.M., Planta, 1988, 174: 59-66; 76. Kang C.O., Sirn S.Y., Biotechnot, Letters, 2008, 30(3): 441-444;
48. EI-Refai A.E.M., EI Kady I.A., 1. Bot. VAR, 1969, 12: 55-66; 77. Kleinl-l.P., Eaton N.R., Murphy s.c., Biochem. Biophys. Aua, 1954, 13: 591-596;
49. Enescu L., Oită N.N., Bazele vitaminoterapici , voI. 1, Ed. Junimea, laşi, 1990; 78. Klein H. P., 1. Bacterioi., 1955, 69: 620-627;
50. Fairfield K.M., Fletcher R.I-I., lAMA, 2002, 287: 3116-3126; 79. Kobayashi M., Hirai M., I-lirai N., Kurimura Y., Ohigashi 1-1., Tsuji Z., Plant
51. Frengova G.,Simova E., Bcshkova O., J. Ind. Microbiol . Biotechnol .. 1997, 18: Growtli Reg., 1997, 22: 79-85;
272-277 ; 80. Koizumi S., Yonetani Y., Maruyama A., Teshiba S., NipPollllogeikagaku _ kaisiti ,
52. Fryberg M., et al, J. Am. Chem. Soc., 1973, 95: 5747-5757; 1996,70: 286;
53. Fujita T., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1992, 199: 394-399; 81. Kragballe K., 1. cat.
Biochem., 1992,49: 46-52;
192 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 193

82. Kutsal T., Ozbas M.T., "Microbial production of vitamin B2" În: Biotechnology of
vitamins, pigments and growth factors, Vandamme E. 1. (ed), Elsevier Science
Publishers Ltd., NY, SUA, 1989, 149-166;
83. Lee Y.K., Ding S.Y., J. Phycol., 1994,30: 445-449;
84. Levine M., Cantilena C.C., Dhariwal K.R., World Rev. NUlr. om.. J 993, 72:
114-127;
85. Lorenz R.T., Cysewski G.R .. Trends Biotechnoi., 2000, 18: 160-167;
86. Lotan T., Hirscheberg , FEBS Letts., 1995,364: 125-128;
87. Marcus R., Coulston A.M., "The vitarnins" În: Goodmanâ.Gilman's The Pharmaco­
logica! basis oftherapeutics . tenth edition, Hardrnan J.G. Limbird L.E., Goodman
Gilman A. (eds), McGraw-I-Iill Cornpanies II1l:., SUA, 2001, 1745-1793:
88. Margalith P., "The biotechnology of ergostcrol", În: Biotechnologv of vitamins.
pigments (//1(/ growth }(/ClOr5, Vandamme E. J. (ed), Elsevier Science Publishers
Ltd., NY, SUA, 1989,81-94;
89. Margalith P., Steroid Microbiology. C.C. Thomas. Illinois, 1986;
90. Margalith P.Z., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999,51: 431-438;
91. McCormick D.B., Physiol. Rev., 1989,69: 1170-1198;
92. Mincu 1., Impactul am-alimentaţie , Ed. Medicală, Bucureşti, 1993, 81-149;
93. Misawa N., Nakagawa M., Kobayashi K., Yamano S., Izawa Y., Nakamura K ..
Harashima K., 1. Bacteriol., 1990, 172: 604-612;
94. Misawa N., Yamano S., Ikenaga 1-1., Appl. Environ. Microbiol., 1991,57: 1847-1849;
95. Misawa N., Yamano S., Linden H., de Felipe M.R., Lucas M., Ikenaga 1-1 ..
Sandrnann G., P!anl J., 1993,4: 833-838;
96. Mogoşan C., "Vitamine" În: Tratat de Farmacologie , editia 1, Cristea A.N. (ed),
Ed. Medicală, Bucureşti, 2005, 805-838;
97. Moulton T.P., Borov L.l., Vincent D..I .. Hydrobiologia, 1987, 151/152: 99-105;
98. Nearnţu G., Substaţe nuturale bio!ogic active. 1. Vitamine, Ed. Ceres, Bucureşti,
1996 ;
99. Nelson H.A., US Patent 28747!-Recovery of ergosterol . 1959;
100. Nes W.R .. Sekula B.C., Nes W.D .. Adler 1.H., 1. Biol. Chem., 1978, 253:
6218-6225 ;
101. Nimitan E., Biotehnologii microbiene, Ed. Univ. "AI.I.Cuz.a", laşi, 1992;
102. Padayauy S.1., Levine M .. CMAJ, 2001,164(3): 353-355;
103. Parajo 1.C., Dominguez H., Dominguez 1. M., Bioresource Technology, 1998, 66 :
25-40 ;
104. Perkins 1. B., SIom3 A., Hermann T., Theriault K., Zachgo E. el al .. 1. Ind.
Microbiol, Biotechnol ., 1999, 22: 8-18;
105. Powtongsook S., Kittakoop P., Menasveta P., Wisessang S., J. Appl. Phycol.. 1995,
7(1): 75-76;
106. Prentice A. M .. Bates C.l .. Br. J. Nutr., 1981. 45: 37-52;
107. Pulz O., Scheibenbogen K., Adv. Biochem. Eng, Biotechnol., 1998, 59: 124-152;
108. Qureshi A.A. el al. J. Nutr., 1980, 110: 1014-1022;
109. Qureshi A.A., Burger W.C., Prentice N., Bird H.R., Sunde M.L., 1. Nutr., 1980,
110: 1014-1022;
110. Rabbani S., Beyer P., Lintig J., Hugueney P., Kleinig H., Plant Physio!., 1998,
116: 1239-1248;
III.Rang H.P., Dale M.M., Riuer 1.M., Phannacologv, Ed. Churchill Livingstone,
1999;
112. Rebouche C.1., Am. J. Clin. Nutr., 1991,54: 1147S-1152S;
113. Reichl H., Koeffler H.P., Norman A.W., N. Engl. 1. Med., 1989, 320: 980-991 ;
114. Schoenen J., Jacquy 1., Lenaens M., Neuro!ogy, 1998, 50: 466-470;
115. Schuegerl K .. Solvent Extraction in Biotechnology, Springer- Verlag, Berlin, 1994,
261-264 ;
116. Scmenko Y.E., Abdullaycv A.A., Fiziol. Rast., J980, 27: 31-41 ;
117. Smirnoff N., Nature Biotechnologv , 2003, 21(2): 134-136;
118. SpaJla C., Grein A., Garofano L., Temi G., "Microbial production of vitamin B l'
În: Biotechllology of vitamins, pigmeuts and growth [actors, Vandamme E. 1. (ed),
Elsevier Science Publishers Ltd., NY, SUA, 1989, 257-284;
119. Stan C. D., Stefanache A., Dumitrache M., Protire L .. "Vitarnin C obtaining
methods cvolution - lrorn chemical synthesis to biotcchnology", 3"{ lnternational
Colloquim for the Historv of Pharmacy , 26-28 September 2008, Târgu-Murcş,
Romania, 90-94;
120. Stroescu Y., Bazele formacologice ale practicii medicale, editia a VII", Ed. Medicală,
Bucureşti, 2001, 689-699:
121. Suărez T., Eslava A.P., Molec. Gen. Genet., 1988. 212: 120-123;
122.11mi Y., .Algal and microbial production of vitarnin F" În: Biotechnologv (lf
vitamins, pigments und growth factors, Yandarnme E.J. (ed), Elscvier Scicnce
Publishers Ltd .. NY, SUA, 1989, 105- I 22 ;
123. Ting H.H., Tirniui F.K., Haley E.A., et.al., Circulation, 1997,95: 2617-2622;
124. Ţărmure C .. Biochimie structurală şi metaboiică, vol. 1, Ed. Dacia, Cluj-Napoca,
1996 ;
125. Weasl R.C., Handbook of Chemistry and Phvsics, 54'" edition, CRC Press. Cle­
veland, 1974;
126. Wilkinson I.B., Mcgson I.L., Macf.allum 1-1 .. et.al.. 1. Cardiovasr. P/lClrlllaco!.,
1999,34: 690-693;
127.Will O.H., el al ., CUlT. Microbiol .. 1984,10: 57-64;
128. Xue Yan Lv, Dai Rong Qiao, Yan Xiong, Hui Xu, Fang Fang You. Yu Cao, Xuan
He, Yi Cao, FEMS Microbiology Lett ers, 2008, 283( 1): 42-46.
 ~I '
Capitolul V • lipoproteinele cu densitate mare - HOL (high-density lipoprotein).
BIOTEHNOLOGIA HIPOLIPIDEMIANTELOR
Afecţiunile vasculare responsabile de afectarea creierului, cordului, rinichilor,
reprezintă cauza majoră a decese lor în lume. Decesele provocate de bolile
vasculare sunt de două ori mai multe decât cele provocate de cancer şi de 10 ori
mai multe decât cele rezultate în urma accidentelor (conform unui studiu realizat
în SUA în 1994).
Ateroscleroza este cea mai frecventă şi mai serioasă boală vasculară. Plăcile
de aterom se formează datorită creşterii nivelului plasmatic al LDL-ului, care
penetrează peretele arterial conducând la acumularea lipidelor în celulele muscu­
lare netede şi În macrofage. Placa de aterom creşte lent, se calcifică cu timpul şi
produce o stenoză severă, sau o blocare arterială totală. Vasele aterosclerotice au
o elasticitate redusă, o expansiune sistolică redusă şi o propagare anormală a
undelor.
Unul din factorii de risc ai aterosclerozei îl reprezintă nivelul serie anormal al
lipidelor, de aceea reducerea lipidelor plasmatice prin dietă intârzie aparitia
aterosclerozei. Utilizarea medicamentelor ce reduc asimilarea lipidelor de către
organism, combinată cu dieta, scade mortalitatea datorată atecţumilor cardio-
vasculare.
Principalele lipide plasmatice sunt :
• colesterolul;
• trigliceridele.
Aceste lipide plasmatice nu circulă liber În plasmă, ci sunt legate de proteine
şi transportate sub formă de complexe macromoleculare, numite Iipoproteine.
Lipoproteinele sunt particule sferice cu nucleu hidrofob (ce conţin esteri ai
colesterolului şi trigliceride), acoperite de un strat monomolecular de colesterol
şi fosfolipide. La suprafaţa lor sunt legate proteine specifice numite apolipo-
proteine.
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 195
Principalele lipoproteine sunt :
• chilomicronii;
• lipoproteinele cu densitate foarte mică - VLDL (very low-density lipo­
protein) ;
• lipoproteinele cu densitate intermediară - IDL (intermediate-density lipo­
protein) ;
• lipoproteinele cu densitate mică - LDL (Iow-density lipoprotein) ;
Această clasificare tine cont de proprietăţile lor fizice-chimice şi anume de
migrarea diferită prin ultracentrifugare (separarea diverselor fractii lipoproteice
pe baza densităţii lor).
Chitomicronii contin 85-90% trigliceride, fosfatide, colesterol, acizi graşi
liberi şi 1% proteine, tiind cele mai voluminoase lipoproteine. Sunt formate din
trigliceride exogene, provenite din dietă. Chilornicronii transportă trigliceridele
din intestin În sistemul vascular. Aici sunt desfăcute de lipaze în acizi graşi liberi,
care pătrund în adipocite şi celule musculare, fiind folosite pentru obţinerea de
energie, sau pentru a ti stocate. Au densitatea cea mai mică dintre lipoproteine şi
migrează cel mai putin. în mod normal, la 12-24 ore de la ingestie, chilomicronii
sunt absenti din plasmă.
Lipoproteinele VLDL contin 60% trigliceride + 12% colesterol + 18%
fosfolipide. Se formează în ficat din acizii graşi liberi şi se catabolizează rapid În
IDL, ce se degradează ulterior în LDL. Deci lipoproteinele VLDL sunt principala
sursă de LDL în plasmă. VLDL transportă trigliceridele endogene de la ficat in
adipocite ş.i celule musculare pentru stocare sau utilizare.
Lipoproteinele lDL se catabolizează rapid (în 2-6 ore) la LDL. Ele însă nu
sunt izolate în mod normal din plasmă.
Lipoproteinele LDL conţin 50% colesterol + IO% trigliceride, reprezentând
carrier-ul major pentru colesterol. Se formează prin catabolizarea intravasculară
a VLDL. Nivelul plasmatic crescut al LDL duce la aparitia aterosclerozei.
Lipoproteinele HDL contin 25 % colesterol + 50% proteine. Ele transportă
colesterolul de la ţesuturi către ficat (transport invers), procesul fiind activat de
Iecitin-colesterol aciltransferază (LCAT).
Metaboiismullipoproteinelor plasmatice (calea lipidelor exogene şi endogene)
se poate observa în figurile nr. 42 şi nr. 43.
Există 6 tipuri de hiperlipoproteinemii, fiecare cu tratamentul său specific, În
funcţie de fracţiile lipoproteice anormale (tabelul nr. 30).
 ~I'

196 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDtCAMENTE DE BJOSJNTEZĂ 197

. '.. lipcprotciu-lipazu .. .. . HipercoJesterolemia se produce prin:

Lipide cxogcne-­
(din dietă)
Intestin _ Ch'[""""""'TA"" graşi [,b",_
- producerea excesivă a VLDL (în obezi tate, diabet, consum de alcool, sindrom
nefrotic, afecţiuni genetice) ;
Chilomicronii rămaşi __ Ficat - tulburări de eliminare a VLDL (afecţiuni gene ti ce) ;
- creşterea conversiei VLDL în LDL.
__ adipocite,
celule musculare Există numeroase studii epidemiologice care relevă legătura dintre nivelul
crescut al colesterolului În plasmă şi aparitia afectiunilor ischemice cardiace.

1
- obţ i nere de energic
Prin urmare, scăderea nivelului plasmatic al colesterolului
importantă În tratamentul hipercolesterolemulor
este măsura cea mai

- stocare Colesterolul este de provenienţă exogenă (cu un aport de 0,3-0,5 g/zi) şi

emlogenă (biosinteză de 1- J,2 g/zi), Reducerea concentraţiei de colesterol se
Figura nr, 42 Calea lipidclor exogcne realizează abordând trei strategii majore:

• inhibiţia absorbţiei colesterolului - j3-sitosteroli ;

• inhibiţia reabsorbţie i acizi lor biliari - colestiramina;
LDL hepaiic • inhibiţia biosintezei colesterolului endogen - statine.

l
lipoprotein-Iipaza
Ficat ---.,.. VLDL --;,-----. IDL ----- / Cum 70% din cantitatea totală de colesterol este de provenienţă endogenă, se

1
Acizi graşi liberi
"-LD:~:,,:, ~[i, ~DL consideră că reducerea biosintezei ele colesterol
eficientă pentru tratarea hipercolesterolemiuor.
endogen este rnodaliratea cea mai

Biosinteza endogenă a colesterol ului pleacă de la acetil CoA, care parcurge 20

de etape enzimatice pentru a se transforma În colesterol. Una din enzimele
LCAT importante ale biosintezei colesterolului este 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reduc­
raza (HMG-CoA reductaza), care catalizează reducerea HMG-CoA la mevalonat
Figura nr, 43 Calca lipidelor endogene (figurile nr. 44 şi nr. 45).
legendă; LeAT - lecitin-colesterol aciltransfcraza
CH3 o
1 I HMG-CoÂ
Tabelul nr, 30
Tipuri de hipertipoproteinemii
OOC --CH2---- C-CH2---C -- SCoA + 2 NADPH + 2H+ __ _-_.--.
--reduc.•..raza
1
HO

Y~~~i:I·~'[~~~r~!:~l~~:~,I·:;~.po:p;~~:fc~:~;:~: :'t~I,~i~~;1"~-:',il,g~l~ţ~ro~.w IIMG-CoA

1. I 1 I chilomicroni crescute uşor crescut

2. I !Ia I LDL norrnale foarte crescut CH3
3. I lIb I LDL, VLDL uşor crescute foarte crescut
1
VLDLlLDL compozitie
4. I III crescute crescut OOC -CHz----C -CH2- CH2 - OH + CoA + 2 NADP+
anormală
1
5. IV VLDL moderat crescute I normal-screscur
HO
6. V VLDL, chilomicroni foarte crescute uşor crescut mcvalonat
Figura I1f. 44 Reacţia catalizată de HMG-CoA reductaza
 T'
I

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 199

CĂTĂLlNA DANIELASTAN
198

acetil-CoA V.l. Statinele

1
acetoacetil-CoA
I II
Statinele sunt inhibitoare ale HMG-CoA reductazei, enzimă heparică ce intervine
în biosinteza colesterolului endogen.
În 1971 s-a început screening-ul pentru găsirea de inhibitori ai HMG-CoA în
mediile de cultură ale unor microorganisme, utilizând sisteme enzimatice izolate

1 din ficat de şobolan. Astfel, în 1975, cercetătorii de la Sankyo (Japonia) au

descoperit şi izolat mevastarina (ML-236B) din mediul de cultură al micro­
3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
(HMG-CoA) ",
"MG-COA (-_) , .
I organismului Penicillium citrinum. Acest compus a jucat un rol important în
obţinerea premiului Nobel pentru medicină de către J.L. Goldstein
Brown în 1985, cei doi cercetători care au elucidat mecanismul metabolismului
şi M .S.

_-- Statiile

1
mevalonat
reductaza

I
receptori lor LDL.
Independent de ei. Ia doi ani după patenta rea mevastatinei
Sankyo, cercetătorii de la Beecham Pharrnaceuticals
de către firma
au izolat compactina, sta­

j
bilind că este un antibiotic antirnicotic slab. Ulterior, s-a constat că este identică
structural cu mevastatina celor de la Sankyo (de aceea mevastatina se mai numeşte
şi compactină).
squalen Deşi a demonstrat că are o foarte bună activitate inhibitorie asupra HMG-CoA
reductaza in vitro, totuşi, rnevasratina nu a arătat o activitate hipocolesterolemiantă
la şoareci şi şobolani, animale de experienţă utilizate initial în studiile preclinice.

1
desmosterol
Abia mai târziu (după trei ani), s-a arătat că mevastatina are specificitate
specie. Totuşi, mevastatina nu se utilizează În terapie, pentru că determină alterări
de

ale morfologiei intestinale. Ea se utilizează doar ca materie primă pentru obţinerea

pravastatinei.

Colesterol
1 Ulterior s-au scanat şi alţi compuşi, s-au modificat prin semisinteză unii şi s-a
stabilit că dintre toţi cornpuşii cercetaţi, pravastatina este un candidat terapeutic
pentru dezvoltarea clinică. În 1981 pravastatina a fost aleasă pentru dezvoltarea
farmaceutică, iar în 1984 au început testările clinice. A fost aprobată pentru
Figura nr, 45 Biosinleza colesterol ului endogcn şi locul de acţiune punerea pe piaţă în 1989 şi lansată ca MEYALOTIN în Japonia. Licenţa pentru
al medicamentelor din clasa siatinclor acest produs este a firmei Bristol-Myers Squibb, care comercializează pravastatina
în aproximativ 50 de state ale lumii.
Activitatea enzimei HMG-CoA reductaza, respectă regula feed-back-ului :
Pravastatina se obţine în două etape fermentative :
"
enzima este activă până când se ating concentrarii suficiente de colesterol în f~ • obtinerea mevastatinei prin cultivarea tulpinilor de Penicillium citrinum ;
organism, după care activitatea enzimei este inhibată automat.
lnhibiţia acestei enzime cu medicamente duce la inhibiţia biosintezei de • p-hidroxilarea mevastatinei cu tulpini de Streptomyces carbophilus.
I
'-, colesterol endogen. Medicamentele inhibitoare de HMG-CoA reductază sunt Pravastatina (figura nr. 46) este singura statină activă ca atare, nefiind prodrug
) agenţi hipocolesterolemianţi utilizaţi în tratamentul hipercolesterolemiilor (are actiunea cea mai rapidă, pic-ul plasrnatic atingându-se după 1 h), adrninis­
I, farniliale. trându-se sub formă de sare de sodiu a r~-hidroxiacidului respectiv.
 '1· ·

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 20.1

200 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Tabelul nr. 31
Na+-OOC~ ."OH Siatine utilizate În terapie
HOOCy . . "OH
o ,/ O HO- J -: 'MiU!' ~esctiperii:il . '.

~ Nr;' , -: '$ti.tiQ~ Mbdaiitate~ jle . ;rr~duse .

H3C/"'~ "y.·'H ert. obţtnere şi .C()îD pai}ia tarlhircf,!utjce
5
!
I 9 H 1. Mevastatina hiosinteză 1975, Sankyo ncintrodusă pe piară
MEVACOR.
CoA ./ /CH3
CH3d MEVINACOR,
1980. Merck
(> MEVLOR.
HO,/' # #' 2, Lovastatina biosinteză (introdusă pe piaţă În
LOVALlP,
1987 În SUA)
SIVLOR,
1-IMG-CoA Pravastat ina MEDOSTATIN
L1POSTAT.
Figura nr. 46 Stuctura unor stati ne MEVALOTlN.
PRAVACHOL,
Celelalte statine de biosinteză şi semisinteză sunt prodrug-uri , devenind active PRAVASTIN.
tarmacodinamic după metabolizarea la nivelul ficatului, când prin hidroliză se ELlSOR.
transformă în P-hidroxiacizi (figura nr, 47). 3. Pravastarina biosinteză 1981. Sankyo VASTEN.
SELECTIN.
0y: . OH oy ,OH °Y~)"" OH SELIPRAN,
L1PREV1L,
~ 0,--
~ O~<H HJC~ ("'H
OLIPREVIN.
PRAVASELECT
H'C~'-- H 1 9
HJCI'~9 H _/CH, HJC CH CHJI~·~CHJ
ZOCOR,
îl • CH)
CHJ , ' SINVACOR.
pV ,
6
H1C/ ~ HJC~/ 4. Simvastatina sernisinteză 1981. Merck SIVASTIN.
SIMOVIL,
!Ă',';lstatillil
Mcvnstatiuu
(1~ln1l1
~iln\!asll1tIJ111
!;u;tollidL ele pro-drug )
(forun tactotucă de JlIU-thll!!-l L1PONORM
tH;tonkll)
(limn:1
LlPAXAN.
PRIMEXIN.
II I 5. Fluvastatina sinteză 1984. Sandoz
LESCOL
1989. Bayer retrasă de pe piară În
o HOOC/j .OH I HO~iC/'-. OH 6. Cerivastatina sinteză (introdusă pe piată În august 2001 de
1997 in SUA) FDA şi EMEA
HO'~
SORTIS.
HlC_./""---..)l "H
HJC »<: ~ H 1 9 L1PITOR,
" ~ O 1991.
H,C CHJ' H
/CHJ CH, ('I,)/CHJ 7. Atorvastatina sinteză TOTALlP,
Warner-Larnbcrt

HJC/ V' #
H)C~#

l ovusuuinn
august 2003 introdusă pe
TORVAST,
XARATOR

SirlN,lSll1lillil
(!"nnna activă Ianmcodinanuc i
(!"tllim ill;liv:. l:lll'lU.;odillarl1k) 8. Rosuvastatina sinteză piaţă, CRESTOR
AstraZeneca
Figura nr , 47 Structura unor statine de biosinteză şi semisinteză
iulie 2003 introdusă şi
comercial izată pe piata
În acest moment, doar statinele prezentate În tabelul nr. 31 sunt aprobate ca 9. Pitavastatina sinteză
japoneză, L1VALO
inhibitori de HMG-CoA reductază. Aceste substanţe se aseamănă structural având Kowa ce. ue.
structuri lactonice.
202 CĂTĂLINA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 203

Statinele naturale sunt izolate, în principal, din tulpini de Aspergillus terreus, Inhibitorii de HMG-CoA reductază sunt foarte utilizaţi, în lumea întreagă, în
Monascus sp., Penicillium sp., Doratomyces sp., Eupenicillium sp., Gymnoascus sp., terapia hiperlipidemiilor, datorită unor proprietăţi importante ale lor:
Hypomyces sp., Paecilomyces sp., Phoma sp., Trichoderma sp. şi Pleurotus sp. .:. mecanismul prin care se realizează scăderea colesterolului este foarte bine
De asemenea, au fost izolate şi caracterizate o serie de substante înrudite cunoscut;
structural cu lovastatina, cum ar fi : .:. determină scăderea vizibilă a valorilor LDL colesterolului ;
-/ monacolin X şi monacolin M, cu o catenă laterală În pozitia 8 a nucleului, .:. au o eficacitate foarte bună;
diferită de a lovastatinei, ce au fost izolate din tulpini mutante de Monascus .:. prezintă tolerabilitate foarte înaltă.
ruber, de către A. Endo el al. în 1985 ;
-/ monacolin J şi monacolin L, care au în pozitia 8 a nucleului o grupare -OH,
respectiv -H, ce au fost izolate din tulpini mutante de Monascus ruber, de
VI .1. Biotehnologia mevastatinei
către D. Komagata el al. În 1989.
sin: cornpactină, 6-demetilmevinolin, ML-236B
Aceste substanţe înrudire structural cu lovastatina nu s-au materializat încă În
C23H3405
produse farmaceutice, dar sunt caracterizate şi cunoscute. Structurile lor se pot
M, = 390,51
observa În figura nr. 48.
.' "OH
... ,OH 0y "OH

o
O"
"" H
H
. H H3C~9
r~/'-...fCH3
CH3 CH3
H3C/~
H3C
Monacolin J Monacolin L

Este prima statină izolată din mediul de cultură al fungilor din specia Peni­
O cillium citrinum, de către A. Endo în ]975.
..... OH
O~
HO o )) ",OH
În 1976, A.G. Brown izolează mevastatina din mediul de cultură al speciilor

HF'/'-~l
o, de Penici llium brevicompactum .

Y 9
o, "'H
H~~~~'

CH3 H
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
Se prezintă sub formă de cristale, atunci când cristalizează din soluţie apoasă
CH3 CH3 ~ /CH3
alcoolică, de culoare aibă, cu p.l. = 1 52°C. Este insolubilă în apă.
H3C/~/ / Nu se utilizează în terapie, Întrucât pe parcursul cercetărilor c1inice s-a
H3C/ _d.emonstJ:at.că..proiiUCe_~lkiiii.!!Jţ:~iii;:;~fuî()i
fenrltestlîlale:._, --- .. _- - --
MonacolinX Monacolin M Se .lI.ti '. i~.!.~ d"<:!~I:_~':lprec~T..s.-()L~12·_~.~as!~tiD
..e.~_;;L~~I_t.2E ~~~t~l:_~.~_~~!n isi nteză
ce au utilitate terapeutică .
Figura nr, 48 Compuşi de biosinteză inrudiţi structural cu lovastatina
. _---_.--~-.__,.-.-

:1
;i
i'
li
204 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
,TehoologhJ;de blosinteză a mevastatinej,'
În 1975 A. Endo a reuşit să izoleze mevastatina (ML-236B) din culturi de
Penicillium citrinum, alături de alţi doi compuşi notaţi ML-236A şi ML-236C.
Dintre aceştia, doar mevastatina s-a dovedit a fi cea mai activă.
Au fost cercetate şi alte tulpini producătoare de mevastatină, cum ar fi:
Penicillium brevicompactum, Paecilomyces sp., Trichoderma pseudokonigi, Tricho­
derma longibrachiantum, Hyphomyces sp., Doratomyces sp., Gymnoascus sp.,
Pleurotus sp., Eupenicillium sp. Totuşi, -tulpina de Penicillium citrinum produce
cele mai mari cantităţi de mevastatină, motiv pentru care a fost dezvoltată pentru
producţia industrială.
Tulpinile originale produceau cantităţi foate mici de meastatină, motiv pentru
care nu puteau ti utilizate la nivel industrial. Pentru a le creşte productivitatea,
acestea au fost modificate genetic, prin mutageneza spori lor cu radiaţii UY. S-au
selectat tulpinile cele mai productive şi au fost supuse Ierrneruaţiei Într-un mediu
propice. Recent s-a raportat obtinerea unor rnutanţi de Penicillium citrinum care
au o productivitate crescută (5 gll rnevastatină), comparativ cu tulpina originală
(40 mg/l rnevastatină),
În 1993 M. Hosobuchi el al. au raportat o serie de date referitoare la conditiile
pe care trebuie să le îndeplinească tulpinile modificte genetic de Penicillium
citrinum , precum şi condiţiile de cultivare ale acestora pentru ca producţia de
mevastatină să tie maximă.
Pe măsură ce are loc ferrnentaţia .Wlpil),ilor imbunătăţite genetic, acestea
eliberează o serie de cOlllpJş(u!eioşC~ar~ st;)p~ază producerea de mevastatină.
A'ceşîC"compuşi uleioşi se ataşează de suP·J:~t~lta.· iniceliului blocând utilizarea
oxigenului de către tulpina producătoare 'şi deci impiedicând formarea meva­
statineCOe aceea, pe p'ar~ursul ferrnentaţiei, se adaugă în mediul de cultură
surfactanţi care dizolvă aceste substante uleioase. Adăugarea acestor surfactanţi
c"reşte"p;'oduqia de )';evastatină cu 30 %. .
Acelaşi grup de cercetărori, conduşi de M. Hosobuchi, a stabilit că Q,\~:!,?!~~gia
miceljilor Penicillium citrinum influenţează reologia mediului de cultură şi implicit
prăd~~iia metabolitului secundar un~lărit·."Âtunci ~â;ld miceiiul este sub formă de
p(;!Jeţ~, producţia de mevastatină este influenţată favorahil.
Când se supun ferrnentaţiei formele de pelete 'ale tulpinii producătoare, mediul
de cultură va avea o vâşcozitate scăzută, iar oxigenul dizolvat poate ti menţinut la
valori mai mari de 3 ppm, când productia de rnevastatină creşte la 76 UimI. Dacă
se utilizează formeletila~le.ntoase ale tulpinii de Penicillium citrinum, vâscozitatea
mediului de cultură este foartemare, iar concentraţia oxigenului dizolvat scade
spre O ppm, ceea ce duce la o productie a mevastatinei de mai putin de 10 UimI.
MEDICAMENTE DE BJOSINTEZĂ
205
Atunci când se inoculează mediul de cultură cu 9,2 x 105 micelii Iibere/ml,
morfologia acestora va ti de pelete, ce au un diametru de 60- 100 urn, iar productia
de mevastatină va ti de 47 UimI.
B. Metz a raportat în 1977 că, morfologu, miceliilor.este influenţată tie :
• agitarea -,mediului de cultură (- 550 rot/rnin.) ;
• concentraţia mediului de cultură (este factorul cel mai important);
adaosul de_şl,!rt.~<;,tan~i ;
• rata de creştere
........•.• a", miceliilor.
'
Fermentatia tulpinilor de iJ'enicitLiufn,.cittinllm! este influenţată de valoarea
pH-ului. Procesul fermentativ se realizează la valori de pH ce descresc gradual,
în funcţie de faza de dezvoltare a miceliului.
Iniţial, pH-ul are valoarea de 6,1-6,2 care descreşte până la valori de aproxi­
mativ 5,2-5,0 după 30 de ore de fermentatie (faza II de dezvoltare). După 50 de
ore de fermentatie (faza III de dezvoltare) valoarea lui este de 4,3-4.0 (În
fermentaţiile conveni iona le aceste valori se ating în 150 de ore). După 80 de ore
de fermentatie (faza IV de dezvoltare) valoarea pH-ului este de 3,8-4,0. pl-l-ul
este controlat şi mentinut la valori stricte cu ajutorul proceselor automate de
control. În acest fel s-a stabilit că valoarea optimă de pH pentru obtinerea
mevastatinei este de 3,7-3,9.
Productia de mevastarină, in aceste procese controlate automat. care utilizează
tulpini modificate genetic, este cu 50 % mai mare decât În procesele fementative
convenuonate.
Există mai multe retele ale mediului de cultură. fiecare având diverse compo­
nente în anumite proporţii, ce sunt alese în funcţie de tulpina supusă fermentaţiei,
de aparatura utilizată şi de capacitatea de producţie
Atunci când ferrnentaţia se realizează cu tulpini de Penicitlium citri num
L-18065, compozitia mediului de cultură este:
• glucoză (40 g/I) ;
• făină de soia (8 g/l) ;
• extract de proteine (6 g/I) ;
• azotat de sodiu (0,5 g/I);
• MgS04 :7HP (0,5 g/l) ;
• Triton X-100 (1,5-2 g/l) tSoy~ţt@t).
-"; ~:::;.:.-~~"}.".
La aceste concentrarii ale componentelor mediului de cultură s-a observat că
se obţin cantităţi sporire de mevastatină.
(-- Mediul de cultură se sterilizează la 121uC şi la 1,2 atm timp de 20 de minute.
d inainte de sterilizare, mediul de cultură este ajustat la pH =6,5.
!
 '1

I
206 CĂTĂLlNA DANtELA STAN Gu-- (U~"~V;:ţ . MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 207
/ -,,:~~'()C'~C:D~r

lnoculul este transferat într-un bioreactor tip "aer-Iift~, unde se realizează o

cultivare în slste-iu'conffiiiili, ia-2·5oc:;şr-â:~~r(\tiţ. de 20-30 % ~.~_~e~ i;TIboi!îifCU Na+-oocq ",OH
-oxlg,'ei1:---" .- .. , .... _.._-_.....
--=---pf@~!gati?!ax.~)~c:_!ll.. ~~I~.!r.ţ:l!.!!.ete şi.ct.l:!~~(\~~.!().?:!le. Pe parcursul ferrnen-
taţiei pH-ul mediului de cultură se menţine între valorile de 6-6,5, iar la final
ptr-=itGlii~g~j~:~y~l()~r~~·.<!e:3 ,8-4',O~"Lâ "sfârşitul' celor 'in zTle de f;;'r,nf:Tltaţie, H3C~
O
Il 'o HO
. ""H
mevastatina se găseşte în mediu În concentraţie de aproximativ 1200 mg/l.
Biomasa se separă prin filtrare, iardin filtrat se izolează ulterior mevastatina.
j ~ H
CH3~' 1 .
Mevastatina se transformă În sare de sodiu, prin adăugarea în mediu a unei
soluţii de NaOH, utilizându-se în continuare la obţinerea altor statine.
I
(,--/CH 3

HO' /' ,~"-J:'

/J
Y.i.2. Biotehnologia pravastatinei
sin: eptastatină, 3 l3-hidroxicompactină
Pravastatina sodi că

C23H3607 Forma lactonică a pravastatinei (C2/I3406), se prezintă sub formă de cristale

M, = 424,53 plate, incolore, insolubile în apă, cu p.l. = 138-142oC.
/ <, <,
."OH Pravastatina este activă ca atare (nu este necesară hidroliza hepatică), motiv
HOOC' 1 pentru care are cea mai rapidă actiune dintre statine.
HO~ Se utilizează sub formă de sare de sodiu, ÎIl tratamentul hiperlipidemiilor În
care LDL-colesterolul şi trigliceridele au valori crescute.
" 'H
Se indică la pacientii diabetici, sau la cei care au boli renale cronice.
Se prescrie şi profilactic pentru prevenirea bolilor cardiovasculare ischemice
la pacientii care au valori crescute ale colesterolului şi pentru prevenirea riscului
/CH3 de accidente vasculare cerebrale la pacienţii care alt avut lIll infarct miocardic,
angină etc .
. ,..,;:::/.
Produse farmaceutice:
LlPOSTAT (Bristol-Myers-Squihb - SUA)
Pravastatina cp., 10, 20, 40 mg
APO-PRAVASTATIN (Apotex Europe - Anglia)
cp. 10 mg, 20 mg, 40 rng
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice PRAVAIDR (Ranbaxy - UE)
Pravastatina se prezintă sub formă de pulbere cristalină, de culoare aibă spre cp. 20 mg, 40 mg
incoloră, fără miros. PRAVACHOL (Bristol-Myers-Squibb - Anglia)
Ca sare de sodiu (formă utilizată În terapie) este solubilă În apă şi metanol. cp. 10 mg, 20 rng , 40 mg
Este greu solubilă în izopropanol şi insolubilă în acetonă, acetonitril, cloroform,
eter. Este higroscopică.

"i
d
 r~

208 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ

209

Timpul maxim de fermentatie este de 140 de ore, pentru o productivitate de

_tt;hrt61ogHi ;iJe:biosiilte2;ă a pravastattnet 7,5 gll.
Pravastatina se obtine În ct~P.~ >eJeP~J~r~:n~~ţatiyţ : Cei doi ~~~L~~ll). ai procesului de P-hidroxilare sunt:
• obtinerea !l!~Xe,~~atiflei prin cultivarea tulpinilor de 'Pefiic.itli/!,rn citrinum i, .:. c.2!l!!:Qll;JL.~t \!!~~!!!}lli~i.de ~~~.::as!!!!0.~ în mediul de cultură;
• p-hidroxilarea mevastatinei cu tulpini de_,ş_ţ!ltllj!lI!»,ces"'carb_gp'liil;YS;:' .:. m~~.Q'~es carbophilus,
.~ ',.-.e"~~:'~~.-:-,~.~, .... -:._'''''''-'~~~~~~

Prima etapă este descrisă în detaliu în capitolul V. 1. I .
A doua etapă presupune int ducerea grupării .. -OH În pozitia_fi__a nucleului.
-proceaE~IE~~_S.!!:!~~~~:~~.~l__ Eg~L aI<~ SJ1Jjji]f~JG1iYQ~!~~ţi~eiSefealizează cu
costuflmari, motiv pent~~ ~are metoda nu este fezabilă din punct de vedere
economic.
Această ~-hidroxilare se poate realiza însă cu ajutorul a câtorva genuri şi
Întregul proces industrial este controlat automat şi permite obtinerea unei
productivităţi În pravastatină de 3 ori mai mare decât În cazul controlului manual
al alimentării mediului de cultură cu rnevastatină (figura nr. 49, adaptată după
W.R. Strohl (ed), 1997).
--------1

___lJ
specii de fungi, actinomicete, dar şi cu unele bacterii din genul Nocardia .
În caz~li~ apar o serie d;-~ întrucât aceştia@
tolerează cantităţi ~ În mec!jul de cultură (probabil datorită J-'- HI'LC
~nifungice a mevastatinei). Dintre aceştia, Mucor hiemalis SANK 36372
s-a dovedit a fi un microorganism eficient pentru biorransforrnarea mevastatinei,
C'=~~~
procesul real izându-se cu o rată de conversie de 30-90 % .
În cazul ~, cele mai bune 'rezultate le dau diferite specii din genul ·-·--r---- '----J-- 5
~ Acestea 'biotransformă rnevastatina În pravastatina cu aceeaşi rată de
conversie ca şi În cazul utilizării fungilor din specia Mucor. ~
lor este faptul că tolerează cantităţi cre~e
utilizării
mevastatină (concentraţia meva­
I
; --- --- -c=J'2
[_-=-..I~ J L~if _.
~ _r _J'1
__
statinei ca sare de' sodiu, În mediul de cultură, poate ti de 0,2%).
Cele mai utilizate' tin micete sunt cele din clasa Streptomyces. Unele dintre
ele fusii-;;i~te-di;;'-pro e de sol austrafi~-;:;--:--SÎrepiomyces'(lan:vinensis, Strep-
tomyces roseochromogenus, Streptomyces cact(lceu!j_l.._2.'~~ptolllyces .!!:!!.E!!.f!_~I!!.. US.
Dintre aceste tulpini cea mai productivă s-a dovedit a fi Streptomyces carbophilus,
care a şi fost dezvoltată industrial.
' ~- ~_/
- -~_~-~-~~~--~f~I~4-----'--- r ["",' '::J
6

A 'a cun;_,!JP'ătat T. Matsuoka et al. în 1989, aceste tulpini er.t~f).~_e..!.1J:J.!:ug_

, ;8,~~~QI care realizează i::_onversia mevast'!!.iDei în p~~~~~I).~ă. Această
~.~:::~
1 sohqic,. " .. 1
enzimă este de fapt un complex de proteine, ceea ce face ca manipularea ei
genetică (cu scopul de a creşte productivitatea) să fie dificilă, motiv pentru care 7
pravastatina este scumpă.
Figura nr, 49 Schema sistemului automat de alimentare cu rncvastaună sudică
_Pr_(!~_es.IJ!_.l~l~u~_~~iaJ __ de... I:~~I_~~~I:?xil_are se _~e.<l:I.~z~(1~~.JJl fermentatoare care_se
Legendă: I - fcrmeutator ; 2 - filtru: J - pompă; 4 - valvă de injeqie; 5 _ coloană de
alimentează continuu u solutie de meva:' 'nă s . ,r, concentraţia acesteia tiind
I tPLC: 6 - calculator ce procesează datele ; 7 - vas de stocare pentru solu!ia de mevastatinn
de 7,5 ±0,2 Uimi pentru o convers maxima (Ia concentraţii ale mevastatinei de sod ică ; 8 - pompă.
10 Uimi procesul de p-hidroxilare este inhibat).
Când glucoza s-a consumat În totalitate.şi valoarea H- . înce e să crească, Pe parcursul ferrnentaţiei, parte din biomasă se filtrează, iar o cantitate
la_~f>:_~x.i_I~~:~V 12ol:e de la inoculare, î~a>c~iuti.e-de n~evastatină cunoscută de'1iTirăÎ se tre-ce prrntr=-ocololmiÎ HPLC-lă- iiilli-;;:'-ite' inter~i~--;;n-
~, până se ati[ige,~l de 7,5 U/ml şi se ment0$- la~c~~~tă ~entralia ,d~ ~le~~~at;"~.ăsod-ică,,-~l~ş,lli;'i'ă.Q~:fQl_ana_He.DC: la ·~~.:tiIi.!lU!iiH.fu..,nif!t
valoare. un calculator, ce procesează datele oblil~!:It(!~ ŞLf.eJC:!l..le.ază.);;g~_q_~_;~hIlJ~ntare a
.',.. ••••••• _. __ •••• ",.-........ "0 ._~,..~,_._.. • •• __ ••••
 T:;

210 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 211

fermentatorului <;:J:l_!!Q!!!ti~_c:1<un~_statinăJ\QQică.În acest fel se menţine concen­ tratează cu o soluţie apoasă alcalină (sudică), când pravastatina ca acid liber se
.:i~~tLa d~ m~va~t:at~?_.!'.QQ!.<:.ăconstantă Î!~_~~d_i_u_1d~I~.!".!!.l.~lltaţie. . transformă în sare sodică.
La sfârşitul ferrnentaţiei, pravastatina se izolează din mediul de cultură prin Se purifică ulterior prin adsorbţie pe răşini, când se obtine pravastatina de
diverse metode: ... -.---------. puritate minim 99,5%.

o® Rrecipit;;
e~tracţie cu solvenţi selectivi (acetat de etil sau butanol), urmată de ~
. ~.0-uiprin distilare;
Y.l.3. Biotehnologia lovastatinei
(3 I~tode cromatografice :
• cromatografie pe strat subţire; sin: mevinolin, 6 a-metilcompactină, monacolin K
cromatografie pe coloană, utilizând o matrice din aluminiu sau gel de C24H1605
siliciu, urmată de eluţie ; M, = 404,54
• cromatografie HPLC.
Randamentul de izolare-purificare al pravastatinei sare de sodiu din lichidul de
0y . . "OH

biosinteză este de minim 60%.

În general, costurile de producţie pentru pravastatină (materii prime şi energie)
se ridică la 350 euro, la un pret al mevastatinei de 140 euro/kg.
° 0,
.'" H
În 1998, M. Manzoni el al. a reuşit ca, prin selecţia tulpinilor şi utilizarea H3C~9 H
unui substrat adecvat, să obţină pravastatina prin biosintetiza ei alternativă de
către tulpinile de Aspergillus şi Monascus . Pravastatina se acumulează direct În
cultură, ca produs final de fermentatie. Ea se găseşte atât în rniceliu cât şi în C)J3 )._. /----....___/
CH 3

filtrat, pentru ambele tulpini.

Studii mai recente (J.W. Park el aI., 2003) au evidentiat şi alte tulpini de
Streptomyces, cum ar fi Streptomyces sp. Y-J10, ce sunt izolate din sol şi care pot
ti utilizate la obţinerea pravastatinei. S-au obţinut cantităţi de 340 mg/l prava­
statină, plecând de la 750 lllg/1/24 h rnevastatină.
Cercetătorii de la Metkinen Oy din Finlanda au obţinut un nou mutant de
Streptomyces, ce rezistă la o concentraţie de 3 g/l mevastatină şi care are o rată
de conversie în pravastari nă de 80 %.
În alte studii sunt prezentate diverse sisteme utilizate la P-hidroxilarea meva­
statinei, De exemplu, A.L. Demain el al. a raportat În 2003 utilizarea tulpini lor
de Actinomandura ATCC 55678 pentru obtinerea pravastatinei. Acestea contin o
hidroxilază citocrom P 450 independentă, care este stimulată de prezenţa ATP-ului,
a acidului ascorbic şi a ionilor MgH .
În 2004, A. Jekkel el al. a raportat utilizarea tulpini lor filameruoase ale
fungilor Mortierella maculata NCAIM (P)F 001266, ce pot p-hidroxila meva­
statina. EI a cultivat tulpini le pe un mediu de cultură format din glucoză, fructoză
şi glicerină (ca surse de carbon), făină de soia, peptonă, cazeină, extract de
drojdie şi de carne (ca surse de azot) şi săruri minerale. Fermentatia a avut loc la
25-30oC şi la un pH = 6,3-6,7.
Biomasa se filtrează, iar filtratul se aduce la pH = 3,5-3,7 după care se extrage
cu solvenţi organici (e.g. acetat de etil, acetat de i-butil). Faza organică se
H3C ~~~
Lovastatina a fost prima statină aprobată de FDA (În 1987) pentru piata
farmaceutică.
A fost obţinută initial din tulpini de Monascus ruber (de aici şi numele de
monacolin K) de către A. Endo el al. În 1979, iar în 1980 de către cercetătorii de
la CIBE Laboratoires Spania din tulpini telurice de Aspergillus terreus.
Mai târziu a fost izolată din 17 tulpini diferite din genul Monascus, în special
din: Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus,
Monascus pubigerus, Monascus anka .
Biocon este prima companie farmaceutică indiană ce a primit, în ianuarie
2001, aprobare de la FDA pentru realizarea şi comercializarea lovastatinei gene­
rice, după expirarea patentului pentru această substanţă în iunie 2001.
Este folosită ca atare, dar şi ca precursor pentru obtinerea simvastatinei, o
statină de semisinteză cu actiune foarte puternică (ZOCOR).
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
Lovastatina se prezintă sub formă de pulbere cristalină, aibă, sau aproape aibă,
cu p.t. = 174,5°C.
212 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE UfOSINTEZĂ 213
r:
La temperatura camerei este solubilă în proporţii diferite, în funcţie de solvent : ( Mediul de cultură cuprinde surse de carbon, surse de azot, microelemente etc.
350 mg/rnl în cloroforrn, 90 mg/rnl în N,N-dimetiltormamidă, 47 mg/ml în Sursele de carbon (glucoza, fructoza, glicerolul) şi cele de azot sunt În concentrarii
acetonă, 28 mg/rnl în acetonitril, 28 mg/ml În metanol, 20 mg/rnl în /-propanol, ) relativ mici, pentru a nu inhiba biosinteza lovastatinei.
16 mg/ml în etanol, 14 mg/ml În r-butanol, 11 mg/ml în n-propanol, 7 mg/ml în j Oxigenul este un factor hotărâtor pentru biosinteză, cantitarea de Iovastatină
n-butanol, 2 mg/ml În n-octanol, 0,4 x IO·J rng/rnl în apă. I formată crescând de 4 ori atunci când se utilizează aer îmbogăţit cu până la 80%
Este un prodrug, care se hidrolizează la nivelul ficatului, când se transformă \gxigen (J.L. Casas L6pez et al., 2004).
În f3-hidroxiacidul corespunzător, ce este forma activă a lovastatinei.
Se utilizează În hiperlipoproteinemia familială poligenică (tip Ha) şi în hiper­
°serie de cercetări recente (M. Bizukojc et ai., 2007) au demonstrat că un rol
important în biosinteza rnetabolitului îl au şi vitarninele din grupul B (nicoti­
lipoproteinemiile de tip multiplu (tip IJb). Se poate asocia şi cu alte substante namida, pantotenatul de calciu, piridoxina), pe lângă cel al oxigenului dizolvat.
hipolipidemiante. Procedeul industrial de obtinere a lovastatinei, pus la punct încă din 1980,
Are reactii adverse minore şi trecătoare (cefalee, dureri abdominale, diaree, utilizează tulpini ~1~P.~~"8.Ujf:!.L!!.!!:!!!1·. EI presupune .~~rire..~2.!:ri~~_.~~_
greaţă, erupţii cutanate), în general tiind bine suportată de organism. Totuşi, se parametri de fermentatie, pentru obtinerea unei productivităţi maxime :
impune controlul rransarninazelor la un interval de 2-3 luni. ;.;.-. ~;~~ogenităt;~;~~·di~~i-d~- cultură-;'-.-- .. -- -'------- -- -. _.
Produse farmaceutice: ~ alegerea judicioasă a unor surse de carbon;
)- alegerea unor valori optime de pH ;
MEVACOR (Merck-Sharp & Dohme - Olanda)
1 :r aeraţia ;
cp., 20 rug, 40 mg
MEDOSTATIN (Medochernie Ltd. - Germania)
! ).. .
, agitarea mediului.
cp. 20 mg Utilizarea unor tulpini mutante, controlul strict al pl-l-ului şi utilizarea surselor
LOVASTATIN BIOGALENICA (Lab prof dr. Morait SRL - România) de carbon (în special glicerolul) într-o concentraţie mică duce la creşterea
cp. 20 mg productivităţii în lovastatină de 5 ori (aproximativ 200 unităţi/I).
LOVASTATIN (Laborrned Phanna - România) Un factor limitant al biosintezei de lovastatină este vâscozitatea crescută a
. cp. 20 mg, 40 mg me_4LLJE!T!110]v·]>eîiti·ucare·agltărea bioillase-i serealize"âzăcu agitatoa:re·perto~·-
mânteilip..iinpelef).···· .. ., - .. _.- --..-.- .. -_. -.- - -'.
Tehnologia de biosinteză a lovastatinei
Compania indiană Biocon utilizează în productia de lovastatină fermentatoare
Lovastatina este produsă de o serie de fungi ca: Penicillium citrinum, Monascus de capacitate mare, cu matrice solidă, ce au avantajul unui substrat solid şi a unei
ruber, Aspergillus terreus . Aceştia excretă În mediul de cultură lovastatina sub fermentaţii submerse, perrniţând astfel reducerea problemelor legate de separarea
formă de p-hidroxiacid, numit acid mevinolinic. lovastatinei din mediul de cultură.
Tulpinile de Monascus ruber şi Aspergillus terreus au o productivitate de Atunci când se utilizează ca tulpină producătoare Aspergitlus terreus ATTe
aproximativ 10-40 mg/l lovastatină. Prin mutatii genetice s-au obţinut tulpini de 20542, mediul de cultură are următoarea compozitie (J. L. Ca sas Lopez et al.,
200 de ori mai productive decât tulpinile clasice de Aspergillus terreus. 2003) :
Inoculul şi conditiile de sporulare au o mare importantă în obtinerea unor
cantităţi superioare de lovastatină. • lactoză: 20 g/I ;
Cercetările realizate de J.L. Casas L6pez el al. în 2004, pe tulpinile de • extract de drojdii: 8 g/l ;
Aspergillus terreus, au demonstrat că acestea sunt foarte productive dacă se ~ (: • KH2P04: 1,51 g/l ;
cultivă sub formă de pelete. Peletele de Aspergillus terreus ATCC 20542 cu • MgS04·7Hp: 0,52 g/I :
diametrul initial de 1200 urn scad în dimensiune până la 900 um, atunci când • NaCI: 0,4 gll ;
există o agitare a mediului de 600 rot/min. Dacă viteza de agitare este mai mică • ZnS04·7HzO: 1 mg/l ;
(300 rot/min.), se obtin pelete cu diametru mai mare de 2500 um, care produc • Fe(NOJ)J·9Hp: 2 mg/l :
cantităţi maxirne de lovastatină. 1n aceste conditii se poate ajunge până la 230 mg/ • biotină: 0,04 mg/I ;
I lovastatină. • alte rnicroelernerue (8, Mn, Mo, Cu): 1 mlll mediu de cultură.
 214 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
La nivel de laborator s-a obtinut o productivitate de 8,1-9 g/llovastatină pentru
o fermentaţie de 240 de ore (aproximativ 10 zile), la 26-28°C, la un pH =5,8-
6,3, o aeraţie de 1 I aer/I mediu de cultură şi o agitare a mediului de 500 rot/rnin.
./·-----'Forma lactonică a iovastatinei nu este solubilă în apă şi este localizată în
miceliu, în timp ce forma de ~-hidroxiacid este prezentă În mediul de cultură sub
formă de sare de sodiu, solubilă În apă.
\ 1986b, 39: 1609-1610:
) La sfârşitul ferrnentaţiei mediul de cultură se acidulează, când lovastatina sare
"\ de sodiu se transformă în lovastatină ca ~-hidroxiacid, greu solubilă În apă, care
, se fixează pe miceliu. Ulterior, biomasa se supune extractiei cu solvenţi organici,
În faza organică se extrag ambele forme ale lovastatinei , dar şi alţi compuşi
hidrofobi (pigmenţi, grăsimi etc.). Sub influenta temperaturii, Întreaga cantitate
de lovastatină se lactonizează şi trece în forma de ~-hidroxiacid.
\ 26. Gunde-Cimennan
Bibliografie
1. Alberts A.W., Chen 1., et (/1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980,77: 3957-3961 :
2. Beers M.H., Berkow R. (eds.), Manualul Merck de diagnostic şi tratament (Ira-
ducere), ediţia a XVlIa, Merck & Co. Inc., New Jersey, SUA, 1999, 200-216:
3. Bizukojc M., Ledakowicz S., J. Biotechnol., 2007, 130: 422-435:
4. Bizukojc M., Ledakowicz S., J. Biotechnol.; 2005, 2(2): 25-36:
5. Bizukojc M., Ledakowicz S., Proc. Biochem., 2006, 41: 1063-1071;
6. Bizukojc M., Pawlowska B., Ledakowicz S., J. Biotechno!., 2007, 127: 258-268;
7. Bradford R.H., Sher c.L., Chremos A.N. el (/1., Areli. Intern. Meâ., 1991,151:
43-49 ;
8. Brown A.G., Smale TC., King TJ., Hasenkam R., Thompson R.H., 1. Chem.
Soc. Perkin Trans, 1976, 1: 1165-1169:
9. Casas Lopez J.L., Rodriguez Porcel E.M., Vilches Ferron E.M., Sanchez Perez
J.A., Fernandez Sevilla J.M., Chisti Y., J. lnt, Microbiol. Biotechno!., 2004,31:
48-50 ;
10. Casas Lopez J.L., Sanchez Perez J.A., Fcrnandez Sevilla J.M .. Acien Fcrnandez
EG., Molina Grima E., Chisti Y., Enryme Microb. Technol.; 2003, 33: 270-277:
II. Casas Lopez J. L., Sanchez Perez J.A., Fernandcz Sevilla J. M., Acien Fernandez
EG., Molina Grima E., Chisti Y., J. Chem. Techllol. Biotechnol.; 2004, 79(10):
1119-1126 ;
12. Casas Lopez J. L., Sanchez Perez J. A., Fernandez Sevilla J. M., Rodriguez Porcel
E.M., Chisti Y., J. Biotechno!., 2005, 116: 61-77:
13. Chisti Y., "Shear sensitivity" În: Encyclopedia of Bioprocess Technology : Fermen­
tation, Biocatalysis, and Bioseparation , Flickinger M.C., Drew sw., (eds), 1999,
vot. 5, Wiley, New York, 2379-2406:
14. Couch R.D., Gaucher G.M., J. Biotechno!., 2004, 108: 171-178;
15. Dernain A.L., Peng Y, Yashphe J., Davis J., US Patent 6566120, 2003:
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 215
Djavakhia V. v., Voinova T M., "Optirnization of fermentation conditions for high
16.
lovastatin producing mutam" În: Biotechnology (I/l{1 industry, Zaikov G.E. (ed) ,
2004, Nova Science Inc., New York, 2004, 80-87 ;
17. Endo A., Hasumi K., 1. Antibiot . (Tokyo), 1985,38: 321-327;
18. Endo A., Hasumi K., Neigishi S., J. Antibiot . (Tokyo), 1985a, 38: 420-422;
19. Endo A., Hasumi K., Yamada A., Shimoda R., Takeshirna H.,J. Antibiot. (Tokyo),
20. Endo A., J. Antibiot . (Tokyo), 1979, 32: 852-854;
21. Endo A., J. Antibiot, (Tokyo), 1980, 33: 334-336:.
22. Endo A., J. Antibiot. (Tokyo), 1985b, 38: 328-332:
23. Endo A., J. Med. Chem., J985a, 28: 401-405;
24. Endo A., Komagata D., Shimada H., J. Antibiot . (Tokyo), 1986a, 39: 1670-.1673;
25. Endo A., Neigishi 5 .. Iwashita T., Mizukawa K., Hirarna M., J. Antibiot. (Tokyo),
1985b, 38: 444-448;
N., Friedrich J., Cimerman A., Benicki A., FEMS Microbiol.
LeII .. 1993,203-206;
27. Hajjaj H., Niederberger P., Duboc P., Appl. Env. Microbiol., 2001, 67: 2596-2602;
28. Hendrickson L., Davis C.R., Roach C .. Nguyen D.K., Aldrich T, McAda p.e,
Reeves C.D., Chem. Biol., 1999, 6: 429-439:
29. Hirama M., Uei M., J. Am. Chem. soc..
1982, 104: 4251-4253;
30. Hosobuchi M., Fukui F, Suzuki T, Yoshikawa H., 1. Ferment, Bioeng; 1993,76:
482-489 :
31. Hosobuchi M., Kurosawa K., Yoshikawa H., Biotech. Bioeng.; 1993,42: 815-820:
32. Hosobuchi M., Ogawa K., Yoshikawa H., J. Ferment. Bioeng., 1993,76: 470-482;
33. Hosobuchi M., Shiori T, Ohyarna J., Arai M., Iwado S., Biosci. Biotech, Biochem ..
1993,57: 1414-1419;
34. Hsu eT, Wang N.Y, Latirner L.H., Sih c.J., J. Afli. Chem. Soc., 1983, 105:
593-601 ;
35. 11Iingworth D.R., Toben J.A., cu« Ther., 1994, 16: 366-385;
36. Jekkel A., Konya A., Barta 1., Ilkoy E. et III., US Patent 09/497805, 2004;
37. Juzlova P., Maninkova 1., Kren v., J. 11Il1. Microbiol., 1996, 16: 163-170;
38. Kimura K .. Komagata D., Murakawa S., Endo A., J. Antibiot . (Tokyo), 1990,43:
L
;'i
1621-1622 :
J~ 39. Komagata D., Shimada H .. Murakawa S .. Endo A., J. Antibiot. (Tokyo), 1989,42:
407-412 ;
40. Lai LS., Pan C.c., Tzeng B.K., Proc, Biochem.: 2003, 38: 1317-1326;
41. Lai L.S., Tsai TH., Wang TC., Cheng TY, Enzyme Microb. Technot., 2005, 36:
737-748 ;
42. Lupaşcu D., Profire L., Tauşer R.G., Aspecte chimico-farlflacelllice În unele clase
terapeutice : medicamente indicate În afecţiuni hematologice, alergice, digestive.
respiratorii şi metabolice, Ed. Junimea, laşi, 2006, 179-185:
43. Manzoni M., Bergomi S., Rollini M., Cavazzoni V., Biotechnol. LeII., 1999,21 :
253-257 :
44. Manzoni M., Rollini M., Appl. Microbiol. Biotechno!., 2002, 58: 555-564:
 '1'
:r. ~::,"'
.1; •

216 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

45. Manzoni M., Rollini M., Bergorui S., Cavazzoni V., Biotechnol. Tech, 1998,12:
529-532 ;
46. Matsuoka T., Miyakoshi S., Tanzawa K., Nakahara K., Hosobuchi M., Serizawa
N., Eur. 1. Biochem., 1989, 184: 707-713:
47. Metz 8., Kossen N.W.F, Biotechnol. Bioeng., 1977, 19: 781-788;
48. Metz B., Kossen N.W.F, Van Suizdurn LC., Adv. Biochem. Eng., 1979, 11 : 103-107:
49. Monaghan R.L., Alberts A.W., Hoffinan C.H., Albers-Schonberg G., US Patent, Hypo-
cholesterolemic [ermentation products and process of prepara/ion, 4231938, 1980:
Capitolul VI
50. Nara F., Watanabe 1., Serizawa N., Curr. Genet., 1993,23: 134-140;
51.
52.
Nara F, Watanabe 1., Serizawa N., Curr. Genei., 1993,23: 28-32;
Negishi S., Cai-Huang Z., Hasumi K., Murakawa S., Endo A., J. Ferment. Eng.,
BIOTEHNOLOGIA IMUNOSUPRESOARELOR
1986,64: 509-512;
53. Novak N., Gerdin S., Berovic M., Biotechnol . Leu., 1997, 19: 947-948;
54. Okazaki '1'., Enokita R., Miyaoka H., Otani H., Torikata A., AIlIlU. Rep, Sankvo Organismele pluricelulare trebuie să facă faţă invadatorilor (rnicrobii), sau
Res. Lab., 1989,41: 123-126; celulelor canceroase, lăsând intacte celulele norrnale. Acest lucru se realizează cu
55. Okazaki '1'., Serizawa N., Enokita R., Torikata A., Terahara A., 1. Antibiot., 1983, ajutorul sistemului imun.
36: 1176-1183: lrnunitatea este un ansamblu de mecanisme biologice care permit organismului
56. Park J.W., Lee J.K., Kwon '1'..1., Yi D.H., Kim Y.J., Moon S.H., Suh H.H., Kang
să-şi menţină integritatea prin eliminarea agresorilor externi, sau a celulelor
S.M., Park Y. 1., Biotechnol . uu., 2003, 25(21): 1827-1831:
proprii alterare structural.
57. Peng Y., Dcmain A.L., 1. Ind. Microbiol . Biotechnol.; 1998, 20: 373-375;
58. Peng Y., Yashphe J., Dernain A. L., J. Antibiot. (Tokyo), 1997, 50: 1032-1035: Sistemul imunitar este o reţea formată din mai multe tipuri de componente
59. Rodriguez Porcel E.M., Casas Lopez J.L., Vilches Ferron E.M., Sanchez Percz solubile şi celule care protejează organismul fată de agentii infecţioşi , fală de
J.A., Garcia Sanchez J.L .. Chisti Y., Bioproc. Biosys. Eng., 2006, 29: 1-5: celulele tumorale, celulele transplantate şi alte toxine. Pentru a ti funcţional,
60. Schimmel T.G., Coffrnan A.D .. Parsons S.J., Appl. Environ. Microbiol., 1998, sistemul imun trebuie să facă diferenta între "sine (self)" şi "non-sine (non-seif)".
64: 3707-3712; Antigenul este orice moleculă exogenă sau endogenă recunoscută ca non-self,
61. Schirnmel TG., Parsons S.J., Biotechnot. TecII., 1999, 13: 379-384: capabilă să declanşeze Ull răspuns imun specific umoral (anticorpi), sau celular
62. Serizawa N., Hosobuchi M., Yoshikawa H .... Biochemical aud fermentation tehno­
(celule efectorii).
logical approaches to production of pravastatin, a HMG-CoA reductase inhibitor"
Când un organ este transplantat, sistemul imun îl recunoaşte ca un corp străin
În: Biotechnologv of antibiotics . second edition, Strohl W. R. (ed.), Taylor &
Francis Group, Boca Raton, SUA, 1997,779-805: ' (non-seif), prin urmare îl atacă şi îl distruge. În acest fel organul transplantat este
63. Serizawa N., Matsuoka '1'., Biochim. Biophvs. Ac/a, 1991, 1084: 35-40; rejetat. Pentru a împiedica acest lucru se realizează un tratament cu medicamente
64. Serizawa N .. Nakagawa K., Hamano K., Tsujita Y., Terahara A., Kuwano H., J. imunosupresoare, care previne distrugerea organului transplantat, inducând starea
Antibiot.: 1983, 36: 604-607: de toleranţă fată de acel transplant (lipsa răspunsului imun fată de un antigen este
65. Serizawa N., Serizawa S., Nakagawa K., Furuya K., Okazaki '1'., Terahara A., 1. cunoscută ca "toleranţă"). Trata.mentul cu imunosupresoare se începe imediat
Antibiot ., 1983, 36: 887-891; după realizarea transplantului şi durează luni, sau ani de zile.
66. Shiao M.S., Don H.S., hac. Neal. Sci. COUIIC. B, 1987, II: 223-231 :
Rejetul unui transplant este indus de celulele T, care atacă şi distrug orice
67. Sitaram Kurnar M., Jana S. K., Senthil V., Shashanka v., Vijay-Kumar S., Sadhukan
element perceput ca non-self. Celulele T funcţionează ca celule .Jielper" citolitice
A. K., Proc. Biochem., 2000, 36: 363-368;
68. Suryanarayan S., Mazurndar K., U.S. 'Patent, 6.197.573, 2001 : şi supresoare. Odată activate de antigeni specifici, celulele T eliberează mediatori
69. Sutherland A., Auclair K., Vederas J.C., Curr. Opin. Drug Discov. Dev., 2001,4: (citokine, limfokine) ce acţionează ca efectori şi reglatori ai răspunsului imun.
229-236 ; I~upres.ia_e.s.tto_..I?J:..~ltA! de ÎIU.I2iedicare. pe cale artiţ}.ciaIă, 3!lli9j..!!~~0i.
70. Szakăcs G., Morovjăn G., Tengerdy R.P., Biotechnol . Leu., 1998,20: 411-415; răspunsului imun al organismului cu ajutorul agenţilor imunosupresivi neselectivi
71. Terahara A., Tanaka M., U.S. Patent, 4.346.227,1982: şi~icorpi0i:~~~c.ffici. .----------------.---- ... -.-.- ..
72. Watanabe 1., Nara F., Serizawa N., Gene, 1995, 163: 81-85. ;:"; ;:1
Ii
'~ I! i
·,i!'
Iiii
.1.",i
 '~"r,

218 CĂTĂL1NA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 219

Imunosupresoarele sunt medicamente care deprimă răspunsul imun in cazul

transplantului de organe sau tesuturL-cârl(rse-'pi-evfÎireac1iiTe]~!.~lti!l_g_ere a VI. 1 .1. Biotehnologia ciclosporinei A
i!-efelor, precwnşi încazulbOTflorlnfiamatoriicrăiiICeşi-~toi111une, pentru
~~~!i9i.~i~:~§!!!!~~~-a~~a~eai~r~_, - .' .- "_ C62HIliNIIOl2
Astăzi, pentru reuşita transplanturi lor se administrează: Mr = 1202,61
H3C
• glucocorticoizi ; H CH3
• inhibitori ai calcineurinei ;
• agenti antiproliferativi.
OH
---H
Terapia este pe termen lung iar supresia este nespecifică, expunând pacientul
la un risc considerabil de a dezvolta infectii sau afectiuni tumorale, Întrucât se
manifestă la nivelul Întregului sistem imun.
Inhibitorii calcineurinei şi glucocorticoizii sunt substante nefrotoxice şi dia­
[ M,L",-- MeVal-N-
i H3
--:
I --o ~ C --_ Abu--- MeGly--
betogene, lirnitându-se astfel utilizarea lor, deşi sunt cele mai eficiente irnuno­
supresoare,
Anticorpii monoclonali reprezintă o terapie adjuvantă ce asigură un "target"
selectiv şi deci un tratament mult mai specific. -MeLeu--D-Ala- Ala-- -- MeLeu--" Val- MeLeu,-_j
Mai recent au apărut tratamentele cu medicamente ce acţionează asupra
factorilor metabolici de creştere şi care asigură o toleranţă crescută.

VI.l. Ciclosporinele
(
Ciclosporinele sunt metaboliţi secundari ai câtorva fungi irnperfecţi şi a câtorva
actinomicete. Reprezintă o clasă de oligopeptide ciclice, nepolare, neutre, formate
din II aminoacizi alifatici hidrofobi,
Sunt substante cu diverse actiuni: antifungică, antiparazitară, antiinflamatoare
./

I
H 3 C "-....N ~)~ o---N
•

:G_- Il
HO'{r
N,
"o

: II -N/
H
S~_O-~- L-
I
CH3

I I I H I --'_o=-O
şi imunosupresivă.
Până În acest moment au fost izolati aproximativ 30 de compuşi din clasa
ciclosporinelor.
1. ~
O
N--CH,
~,O

_
CH3 O

O
CH3 O

CH, O
O

O I
N--CH3
Prin procedee fermentative se obţin amestecuri de diverse ciclosporine. În
aceste complexe, ciclosporina dorită este într-o proportie mai mare, alături de
alte ciclosporine, prezente în cantităţi mult mai mici.
O
~Ă~/~'~N-yJL"
, I ;
~-ty)- J~--"----l
7 H 6 , /.____ \
- O, / -,

,1 ~\

Ciclosporina A a fost izolată initial ca antibiotic antifungic, iar activitatea

.J_ imunosupresivă a fost demonstrată mai târziu.,

1
i_~'.ţ·

iiilf,.
 ._~' f'("

220 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BlOSINTEZĂ 221

Se comercializează din 1983 pentru prevenirea respingerii transplantului de Ciclosporina A este princ~lull1letabolit ce suprirnă proliferarea Iimfociteţor
rinichi, iar astăzi se utilizează şi în bolile autoimune. .T,_fără a afecta alti:fi~~llij!!!ll!!QiQgi.(;e,·do~edii1d
seIecUV:---'- că'este-.-'_'--"'" _.- . _._-_._-
piToluiiinunosupresiv

Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice '-"-'Ciclosporina A formează un complex cu cicJofilina, un receptor proteic
Ciclosporina A se prezintă sub formă de ace prismatice albe, cu p.t. = 148-15IuC. plasmatic prezent În celula ţintă. Acest complex se leagă de calcineurină şi inhibă
Este solubilă în metanol, etanol, acetonă, eter, c1oroform şi greu solubilă în apă defosforilarea cornponentului citozolic al NFAT (Nuclear factor of activated
şi hidrocarburi saturate. T-cells - factor de activare al celulelor T). Astfel, transcripţia genelor nu este
Ciclosporina B (C6IH1U9N 11°12' Mr = 1188,58) (sin. alanin! ciclosporina) este o activată, iar lirnfocitele T nu răspund stimulării antigenului respectiv. Deci, se
pulbere aibă cu p.t.=149-152°C. inhibă activitatea enzimatică a calcineurinei, ce este importantă pentru producerea
Ciclosporina C (C62Hnl N nOIJ' M, = 1218,61) (sin. treonin? ciclosporina) este de lirnfokine (interleukina 2) (figura nr. 50). În acest fel are loc depresia
sub formă de ace prismatice incolore, cu p. t. = 152-1550C. Are o so1ubi1itate răspunsului imun. Ciclosporina A are totuşi efecte slabe asupra măduvei.
asemănătoare cu a ciclosporinei A.
Ciclosporina A
CicJosporina D (C6JH IIJN 11°11' M, = 1216,63) (sin. valirr' ciclosporina) este
sub formă de cristale prisrnatice incolore, cu p. t. = 148-151°C.
Cidofilina-l
Ciclosporina G (Cr,)HIiJNnOI1' Mr= 1216,63) (sin. 7-L-norvalin2ciclosporina)
se prezintă sub formă de cristale poliedrice incolore, cu p. t. = 196-197°C.
Ciclosporinele au un r~-hidroxi-a-aminoacid nesaturat, Cll un schelet de 9 Complexul
atomi de C. Sunt formate din II aminoacizi alifatici hidrofobi, din care 4 sunt ciclosporină-ciclofilină
leucine, iar 3 nu apar În proteinele mamiferelor. Cei 3 aminoacizi neproteinogenici
ai ciclosporinei A sunt: Celule T
• D-alanina în pozitia 8 ; t. ~_./
Calcineurină --x--~ \
• acidul L-2-aminobutiric În pozitia 2 ;
• aminoacidul Bmt în pozitia 1. (fosfatază proteică) j Prezenta.'
antigenului
Aminoacidul Bmt [ (4R)-4-[(E)-2-buteniIJ-4-metiI-L-treonina] este un amine­
acid unic, descris în literatura de specialitate doar ca element component al cielo­
sporinei A.
Activarea
Fiecare ciclosporină diferă de cealaltă prin variaţia a unu sau doi aminoacizi
celulelor T
-------,._ Interleukina-2
constituenţi. Cea mai mare diversitate apare în poziţia 2, ce poate ti ocupată de: .>:

•
•
acidul L-2-aminobutiric (în cazul ciclosporinei
L-alanina (în cazul ciclosporinei B) ;
A) ; l.. _._ . _
• L-treonina (în cazul ciclosporinei C) ;
• L-valina (în cazul ciclosporinei D);
• L-norvalina (În cazul ciclosporinei G).
Din cele II legături peptidice, 7 legături sunt N-metilate. Aceste legături
N-metilate conferă moleculei de ciclosporină stabilitate la nivel digestiv şi stabi­
L~ .~,# Proliferarea
litate fată de proteazele sistemice. De aceea, ciclosporinele se absorb relativ bine ,~t;~ tf celulelor Ţ
digestiv, când se administrează pe cale orală, dar au şi concentrarii plarnatice ~ii~ Figura 111'. 50 Mecanismul de actiune al ciclosporinei A

II,
înalte şi de durată. legendă; X .. inhibare
 ~.

222 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 223

Se absoarbe relativ Încet din intestin (capsulele gelatinoase orale au o biodis­ Capsulele se conservă la temperaturi mai mici de 300C În ambalajul original.
ponibilitate de 20-50%), absorbtia fiind incompletă şi diminuată de prezenta Solutiile cu administrare parenterală (i. v.) se diluează cu ser fiziologic sau
alimentelor În intestin. glucoză 5 % şi se păstrează maxim 48 h la temperatura camerei, ferite de lumină.
S-au obtinut o serie de microemulsii cu biodisponibilitate mai bună, ce au fost Emulsiite lipidice sunt la fel de stabile, se pot dilua cu ser fiziologic, pre­
aprobate de FDA pentru comercializare Încă din 1995. paratele fiind stabile maxim 8 h.
Se utilizează, În asociere cu corticosteroizi, pentru prevenirea rejetului alogre­ Sub formă de pastă este stabilă 31 de zile, fiind condiţionată În tuburi de
felor din transplantul de organe (rinichi, ficat, inimă, plămân etc.) şi măduvă aluminiu păstrate la 2-37oC.
osoasă. De altfel, era modernă a transplanturi lor a devenit posibilă doar după Toate produsele farmaceutice se conservă În tlacoane închise etanş, protejare
aparitia ciclosporinei. de lumină şi care nu sunt din pvc.
Ciclosporina A are rol important şi În chimioterapia cancerului, restabilind
sensibilitatea celulelor tumorale la agentul anticanceros. Este utilă şi în terapia Produse farmaccutice:
SJDA, când acţionează prin inhibiţia selectivă a replicării HIV-l. SANDIMMUN-NEORAL (Novartis - Elvetia)
Alte utilizări ale ciclosporinei A includ tratamentul diverselor afectiuni auto­ cps. gelatinoase moi, 25, 50, 100 mg
imune la care tratamente le conventionale nu au dat rezultate. Au fost obţinute sol. orală 100 mg/rnl
beneficii terapeutice în tratamentul: sol. injectabilă 50 mg/rnl
.:. artritei reumatoide ; CONSUPREN (Galena Opava - Cehia)
.:. psoriazisului sever cronic generalizat; sol. orală 100 mg/ml
.:. sindromului nefrotic idiopatic (hipoalbunernie) ; GENGRAF (Abbott - SUA)
.:. sindromului ocular acut (boala Behcet) ; sol. injectabilă 50 mg/rnl
.:. uveitelor autoimune ; NEORAL (Novartis - Anglia)
.:. dermatitelor atopice ; sol. injectabilă 50 rng/rnl
.:. anem iei aplastice ; microernulsie orală 100 mg/ml
.:. diabetului insulino-dependenl. cps. gelatinoase moi, 25, 100 mg
SANDIMMUN (Novartis - SUA)
Reactiile adverse severe (disfuncţiile renale) ale ciclosporinei A apar la doze
cps. gelatinoase moi, 25 mg
foarte mari, dar pot fi reduse prin monitorizarea atentă a posologiei. Alte reacţii
adverse ce pot apărea sunt : Tehnologia de biosinteză a ciclosporinei A
;;. infectii virale şi bacteriene ;
La Începutul anilor '70 au fost izolate din mediul de cultură al unor fungi
;.- aparitia diabetului ; imperfecţi ciclosporina A şi cantităţi mai mici de ciclosporină B şi C. Aceşti
)i- hipertensiune arterială ; fungi sunt Cylindrocarpon lucidum Booth NRRL 5700 şi Tolypocladium inflatum
;.- hiperlipidemie;
Gams NRRL 8044 (clasificat initial ca fiind Trichoderma polysporum Rifai).
)i- alopecie;
Cele două tulpini au fost izolate din mostre de pământ colectate din Wisconsin­
;;. complicatii tromboemholice ; SUA şi respectiv Hardanger Vidda-Norvegia.
)i- hepatotoxicitare ;
De la descrierea iniţială, genul Tolypocladium a fost revizuit şi extins, În mod
)i- risc Crescut de carcinogenitate (Iim foame, carcinoame, cancere ale pielii) etc. particular tulpinile producătoare de ciclosporină A tiind clasificate ca To{ypo­
Se administrează oral, parenteral (i. v.) şi pulmonar (aerosoli cu nebul izator), cladium niveum de către J. Bissett. Totuşi, această clasificare a fost ulterior
Formulările orale (capsule gelatinoase, solutii uleioase, microemulsii, solutii considerată improprie, majoritatea autorilor vorhind de Tolypocladium inflatum.
apoase) existente pe piaţă diferă Între ele prin biodisponibilitate. Mai târziu, J .A. von Arx (1986) a propus unirea genului Tolypocladium cu
Solutiile orale se conservă la temperaturi mai mici de 300C şi se utilizează În Beauveria , confuzia fiind şi mai mare, spunându-se că ciclosporina A este
."!
termen de 2 luni de la deschiderea flaconului. biosintetizată de specii de Beauveria nivea . Astăzi, s-a propus ca tulpinile de ,1
,1
"
j.i
i:1
Iii·
,.·,1
 ·"f'~

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 225

224 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Tabelul nr. 32
fungi NRRL 8044, producătoare de ciclosporină A, să fie denumite Tolypocladium
Ciclosporine izolate din mediul de fermentatie
inflatum NRRL 8044.
Această tulpinăJfolYP9dl1_ditlJ1P'tJ.!flg~a~rnNRRL 8044, creşte pe un~ :(;icţit. .- ,:~'., ,:, ..• =, :, .;,;> -- '<Po~il~~~hO~c~dUilii .....,' .' ",' . ~\'.', ::'"

format din extr~~t de !~1alţ, e~ct de drojdÎj şi agar, la o t~ă optimă de spor~ o· ;.: .••. _, .~ • r

2~ (până "Jaj3dC). In aceste condiţii, după 12-=I4 zile de fermentaţie, se atinge 9, 10 lf

(Cy). 1 . i' 3 '." 5' ~ ':6 '.7 ,~,
concentraţia maximă de ciciosporină A.
Me- Me Me (D)- Me Me Me
Tulpina de S;ylill_(!rQ(,.;grporLl.uci4um,NRRL 5760, ce produce ciclosporina A Cy A Abu Sar Val Ala
Bmt Leu Leu Ala Leu Leu Val
doar în cultură'statică de suprat~ă, este TT_1ai puţin t~los~~ la nivel industrial.
Me- Me Me (D)- Me ·Me Me
Pe lângă tulpinile origmale e Tolypocladium inflatum şi Cylindrocarpon Cy B Ala Sar Val Ala
Bmt Leu Leu Ala Leu Leu Val
lucidum au fost identificate şi alte microorganisme, aparţinând diverselor genuri
de lungi, ca fiind producători de ciclosporină A (dar şi B, C). Aceste ciclosporine Me- Me Me (0)- Me Me Me
Cy C Thr Sar Val Ala
se biosintetizează în concentrarii mici, de l ~ 10 mg/l. Astfel de tulpini sunt: Bl11t Leu Leu Ala Leu Leu Val
Trichoderma viridae , Fusarium sp., Neocosmopora sp., Acremonium sp., Beau­ Me- Me Me (D)- Me Me Me
Cy D Val Sar Val Ala
veria sp.. Chaunopycnis sp. Brut Leu Leu Ala Leu Leu Val
Prin tehnici de inginerie genetică şi prin manipularea genelor responsabile de Me- Me Me (D)- Me Me
Cy E Abu Sar Val Ala Val
sinteza ciclosporinelor se pot obţine mutanţi capab!!) să biosintetizeze ~o­ Bun Leu Leu Ala Leu Leu
sporine, sau c~e ale ciclosporiuelor deja CWlo~e ca metaboliti minori. deoxi-
Me Me (D)- Me Me Me
Cel mai adesea, pentru qQ1i.!~ unor ca,.ntităti mari de ciclosporin~. ~., se Cy F Me- Abu Sar Val Ala
Leu Leu Ala Leu Leu Val
selectează~?in tulpinile originale ~e 72}1p_~cladiulll il1f!atl~//1 prin Bmt
tratarea cu radiaţII UV, sau cu ş'_ll.h.g__a.!!Vhunlce de tipul Nvmetil-N -nuro­ Me- Me Me (D)- Me Me Me
Cy G Nva Sar Val Ala
-N-nitrozoguarudină. Aceşti mutanti se dezvoltă în cultură submersă aerobă. Bmt Leu Leu Ala Leu Leu Val
Medi.!}Jc,qS;..F1~)ţ.l!ră conţine: - --e::s =- (0)-
Me- Me Me (0)- Me Me
.:. glucoză, ca sursă de carbon; Cy 1·1 Abu Sar Val Ala Me
Bmt Leu Leu Ala Leu Leu
.:. c~zeinăşi peptonă, ca surse de azot; Val
.:. ioî1tdeZn, Mn. Cu, Fe; Me- Me Me (D)- Me Me
Cyl Val Sar Val Ala Leu
.:. ~ tiamină, biotină, piricloxină. Bmt Leu Leu Ala Leu Val
deoxi-
În urma ferrnentaţiei compusu~este c~, c.elelalte cicl?­ Me Me (D)- Me Me Me
Cy K Me- Val Sar Val Ala
sporine (ciclosporinele B~Z) biosintetizându-se în concentratii mai mici. In Leu Leu Ala Leu Leu Val
BlIIt
tabelul nr. 32 (adaptat după H. Kleinkauf, H. Von Di:i~n (eds) , 1997) se pot
Me Me (D)- Me Me Me
observa diversele ciclosporine izolate din mediul de cultură. Cy L IJIII! Abu Sar Val Ala
Pe parcursul fermentaţiei tulpinii de Tolvpocladlum inflatum se formează ~ Leu Leu Ala Leu Leu Val
25 de c~losRorine, unele dintre ele apărând în cantităţi extrem de mici în mediu. Me- Me Me (D)- Me Me Me
Cy M Nva Sar Nva Ala
In unele cazuri, concentraţiile de ciciosporină pot fi crescute prin adaosul de Bmt Leu Leu Ala Leu Leu Val

~ninoacizi ~ifici.
Biosinteza ciclosporine! A e~.ţe d!p_~~1de_~tăde aportul exol!;~n..cle~m
.~: Cy N
Me-
Bmt
Nva Sar
Me
Leu
Val
Me
Leu
Ala
(D)-
Ala
Me
Leu
Leu
Me
Val
:,~
ce au rol de~ Adaosul de aminoacizi specittci în exces duce la modi­ Me Me Me (D)- Me Me Me
~~~ CyO Nva Sar
Leu
Val
Leu
Ala
Ala Leu Leu Val
ficarea proportiilor diverselor ciciosporine ce se vor biosintetiza, influenţând Leu
specific pozitia 2. De exemplu, adaosul !cidul~i •.2L<4.~WW_uobutiric_._~ Me Me (D)- Me Me Me
Cy p HlIIt Thr Sar Val Ala
~ unor c~e, iar procesul se orientează s~ spre Leu Leu Ala Leu Leu Val
cidosporina A, aceasta fiind aproape singura ciclosporiuă biosintetizată .
. .------ --.--

;
 -~~p"'
'~I -. ~~ :1"'

226 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 227

Productia de ciclosporină este monitorizată cu ajutorul Hl?ll:;:-uluit.iar după

"i~9,~~if~,~~IPM:k:',~:'U<~;;~~~":':C;~i"ţ;:~;,~,:; {~;:;~.:',[;~~~~~~l::~~~:~~';:,,: . '.•,cC;',,:'-' ,t".;'J .'; :• .(:','.') . . ;.- : ,'::'_ :. 14 zile 4~ie~me,~t~ti~ se"'ămige coMiimr.Irfa~:optiinT'd~ 2i'clospor-iîîi(Â _-'
,ifwrJyttt,+i,~~IK~~!I!,~~$Li; li~:,;4${)lb~'§:\t~~I: i,;!fh# ,:.t~;, I:.- ••?,,_,. (io-S f"~H;:;:' Se -~xtr,!ge:-clcTisp~-ri~~--A-~~udă c~-soÎ~enti'o;:gâ;;i~;(c;':i:-ăce-tai' de etil), iar
amestec-~I~es{e-separăt-p~leto(fe crăl1'i<jt9~<,tfj!;:ft~mar fi, filtrarea pe gel
Me- Abu S
ar V
al V I
a Me I
a (D)- Me Me Mc S~,e~~~~_ de's-tIid~_Ş_ţ,l!J_ <;~Olliij8gr~t}~"Qe,~~·ităp-ie~§ie, -~-'~--~"" ." , -
Cy Q A
BOlt Leu Ala Leu Leu Val
. ~:Se izolează iniţial
.. --N.U:::--"-"i·:,-·--r~.··~ .... ''''_''_'
un amestec de ciclosporină A şi C, care sunt ~__În. cantitate
-'7' . ..•.. _ .. __ ~
mai
,Me- Me (D)- Me Me 'ou ,,_. •.••• __ .••. 0•••• _." __ ,' _~.-, ••• _ ,'u : ••

Cy R Abu Sar Val Leu Ala Leu ~la~~m i~e~,lll_! ~e cultură, şi apoi s~_ i~olează ciclosp.9rirl~!~ !?!_ D, E. Ciclospoflna
Bmr Leu Ala Leu Val
q_,se găseşte uzuaiîri cailtiiărT mici (urme] în' mediul de cultu~ă, dar se poate
Me- , Me (D)- Me Mc Me ~!r.. ~:C"''''''"1I'''-''-

Cy S B Olt 1hr Sar Val Val Leu Ala Leu Le'U VaI biosintetiza în cantitate foarte mare prin adaosul exogen de Lenorvalinâ.
Ala
'!J1'SC;-opul obtinerii ~~oi ciclosporine (analogi ai~~l1ei A cu
Me- Mc Me (D)- Me Me
Cy T B mi Abu Sar Leu Val Le'U Ala Le'U Leu VaI proprietăţi terapeutice imbunătăţite), s-au realizat o serie de biosinteze termen­
Ala
tati ve cu precursori, o serie de semisinteze şi sinteze noi, care nu s-au concretizat
Me- Me (D)- Me Me Me
Cy U Abu Sar Le Val Leu Ala până la acest moment Într-un produs farmaceutic.
BOlt u Ala Leu Leu Val
Me- Ab S Me V I Me t (D)- Me Me Me
Cy V Bmt u ar Leu a Leu A lU Ala Leu Leu Val
Me- Me Me (D)- Me Me VI.2. Biotehnologia rapamicinei
Cy W B mt Thr Sar Leu Val Leu Ala' A Ia Le'U Le'U Val
Me- Me Me (D)- Me Me sin: sirolimus, rapamune, RAPA, RPM
Cy X BOlI Nva Sar Leu Val Leu Ala Ala Leu Leu Val
C"H79NOIJ
Me- Me (D)- Me Me Me M, = 914,17
Cy Y Bmi Nva Sar'Le ru Val Leu Ala AIa Le u Le u VaI
Me Ab S Me V I Me I (D)- Mc Me Mc
Cy Z u ar a Aa
Aoa Leu Leu Ala Leu Leu Val
Mc- Me Me (D)- Me Me Me
Cy 26 Nva Sar Leu Ala
Bmr Leu Leu Ala Leu Leu Val

Cy 27 Bmt Val Sar

Me
Le.u Val
Me
1.eu Ala
(D)-
AI a
Me
Leeu
Mc
Leeu
Me
Va I H3C,,~
I
",H
OCH3 O
~
'N
r>.J
Me S Me V I Me (D)- Mc Mc Mt:
Cy 2 8 Abu 'ar a Ala
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val

1
Me- Me Mc (D)- Me Me Me
H", !:2--3
Cy 29 Abu Sar Val Ala
BOlI I1e Leu Ala Leu Leu Val 21 ...
O I '-',
C y 30
Me
Leu
Val
S
ar
Me
Leu
V I
a
Mc
Leu
Aa
I (D)-
Ala
Me
Leu
Mc
Leu
Mc
Val
: a H
Me Mc (D)- Me Mc Me
H3C'",. 22 o QH 33~36 /
O
-""''''__CH3
Cy 31 Leu Val Sar I1e Val Leu Ala A la Leeu Leeu VaI
1

Cy 32
Me
Val Gly !le Val
Me
Ala
(0)-
S el'
Me
Le u
Me
Leu
Mc
V aI
2B'-,~0/ ~ CH3
"'aH
Leu Leu 1 . a 41
Me Me (0)- Mc Me
FR 901495
Leu
Thl' Gly Ile Leu
Leu
Ala
Ser
Le
li
Leu V I
li
CH3 aCH3 CH3 CH3
 ~pw
I

CĂTĂLlNA DANIELA STAN

I
228 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 229

Rapamicina a fost descoperită, de către cercetătorii canadieni de la Ayerst

Rapamicina
(acum denumit Wyeth Laboratories Research lnc.), ca metabolit secundar al
bacteriei Streptomyces hygroscopicus, în mostre de pământ din Insula Paştelui.
Insula este cunoscută de către localnici sub numele de .Rapa Nui", de aici venind
şi numele rapamicinei.
FKBPI2 ---J
Complexul
Iniţial (1972) s-a dezvoltat ca agent antifungic, însă ulterior s-a sesizat poten­
tialul său imunosupresiv. Ţinând cont de priorităţile de la acea dată ale companiei, rapamicină-FKBP 12
laboratorul din Montreal s-a închis, iar cercetările pentru dezvoltarea rapamicinei
au fost abandonate. A fost redescoperită atunci când, la insistentele doctorului
Suren Sehgal (1987), s-au reluat cercetările pentru dezvoltarea rapamicinei ca
imunoosupresiv. Astăzi, rapamicina valorează miliarde de dolari pentru compania FRAP
Wyeth-Ayerst. (fosfatidil-inozitol kinaza
Studii mai recente (H. Nishida el al., 1995) au demonstrat că rapamicina este
produsă şi de Actinoplanes sp.
La ora actuală se comercializează de către compania americană Wyeth-Ayerst
(RAPAMUNE), tiind aprobată de FDA pentru utilizarea ca imunosupresant, din sep­
tembrie 1999. Pe piaţă există şi un produs utilizat în terapia cordului, comercializat ~._.~

de compania Cordis sub numele de CYPHER (sirolimus-eluting coronary stent). Interleukina-2

Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice

Rapamicina se prezintă ca o pulbere cristalină de culoare aibă sau slab galbenă, Proliferarea
higroscopică. Este sub formă de cristale incolore atunci când cristalizează din celulelor T
eter. Are un p.t. = 183-J 8SuC. Este solubilă în DMSO (SO mg/ml), când formează
Figura ur, 51 Mecanismul de actiune al rapamicinei
solutii incolore, dar este solubilă şi în eter etilic, acetonă, cloroform, metanol şi
Legendă: X - inhibare
DMFA. Este greu solubilă în hexan şi eter de petrol şi insolubilă În apă. Se ,
conservă la temperaturi joase, În absenta luminii şi a umezelii.
.:
Structura raparnicinei a fost confirmată prin cristalografie cu raze X şi studii
de spectroscopie. Este un inel rnacrolidic cu 3S de atomi, cu 3 duble legături :l
'i
conjugate, care prezintă un heterocicIu ce este un rest de Lspipecolat. '::i
Spre deosebire de tacrolimus şi ciclosporină, rapamicina nu este un inhibitor .'f:
-/ 11i~
al caIcineurinei. Ea inhibă răspunsul la interleukina-Z (IL-2) şi deci blochează i:t
activarea celulelor T şi B. '1

Rapamicina blochează răspunsul imun prin programarea morţii celulelor, sau ,:iili
prin apoptoza celulelor T. Ea penetrează membrana celulelor T şi se leagă de ·'',",.:·1
receptorii intracelulari FKBP 12 (FKS06-Binding Protein 12) şi ulterior de FRAP ·;'11
(FKBPI2-Rapamycin Associated Protein), interferând astfel cu ciclul celular (aşa "I
IJ.
cum se poate observa în figura nr. SI). :::Il:;!
(If,)
FKBP 12 este o proteină format din 107 aminoacizi ce catal izează legarea de
substrat. În figura nr. S2 (sursa este www.schreiber.chem.harvard.edu/home/
, r :j 1 ~i
structure.html) se poate observa cum rapamicina se fixează între receptorii FKBP12, '. 'il
' :; 1'1 ~Il;

reprezentati cu albastru, şi receptorii FRAP, proteina reprezentată cu roşu. Figura ur, 52 Complexul FRAP-rapamicină-FKBP 12
I':(:1;1,".11.1:~
~r ~j !;;'
'p·ll,
':i
11;
;i-:~
230 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 231

Legarea de receptorii FKBP12 se realizează prin intermediul legăturilor de
hidrogen, la nivelul anumitor resturi de aminoacizi din FK8P12. Modul de
realizare a legăturilor se poate observa în tabelul nr. 33.
Tabelul nr. 33
Legăturile de hidrogen dintre rapamicină
. '. '. hl" ~ -.., ~.. ~-,- -.. diţllilp-:pWcjnă.
Nr, crt~. â>.GruP'lU"~
~.. ~.~:~C~~;t;rl d;-ă~g~~id ţI!n .f$rU .
~~.y... ~.~ .. ~ ..~
Alte reacţii adverse ce pot apărea sunt: trombocitopenie, scăderea hemoglo­
binei, anemie, hipertensiune, creşterea nivelului serie al colesterolului şi a
lipidelor, întârzierea vindecării rănilor, diaree, acnee ere. Datorită acestor reactii
adverse se utilizează de regulă la câteva săptarnâni sau luni de la transplant.
Cornprimatele se stochează la temperatura camerei, in absenta luminii şi a
şi receptorii FKBP 12 umezelii.

. '.'~ '._ ,,~,,;' ", .

-- - -""- ." - ' , ,
Produse farmaceutice:
1. I C, carbonil Ile-56 NH RAPAMUNE (Wyeth Lederle Pharrna - Germania)
2. I Cx carbon il Tyr-820H cp. filmare I mg , 2 rng
3. Ou hidroxil Asp-37 carboxil sol. orală 1 mg/rnl
4. Cy carbonil Tyr-26, Phe-36, Phe-99 H CYPHER (Cordis - SUA)
5. Cl. hidroxil Glu-54 carbonil stern-uri acoperite cu raparnicină
6. C", hidroxil Gln-53 carbonil
Tehnologia de biosinteză a rapamicinei

Astfel, rapamicina opreşte replicarea celulei în faza de tranzitie G1, stopează
proliferarea celulelor T, iar apoptoza este indusă. Prin inducerea apoptozei,
rapamicina este capabilă să reducă tendinta organismului de respingere a trans­
planturilor, perrniţându-i să dezvolte o toleranţă faţă de organul transplantat.
Rapamicina acţionează doar asupra celulelor activate, lăsând restul sistemului
imun să lupte cu infecţiile. În acest fel reactiile secundare ale rapamicinei sunt
mult mai reduse.
Se utilizează ca imunosupresant in prevenirea respingerii grefelor din trans­
plantul de organe (in special in transplantul renal), în asociere cu ciclosporina şi
corticosteroizii. Fată de celelalte imunosupresoare, rapamicina oferă o acceptare
a transplantului pe o durată mai mare de timp.
Poate ti utilizată şi În tratamentul unor tipuri de cancer (sarcom Kaposi,
limfoame) în asociere cu antitumorale ca doxorubicina, ciclofosfamida etc.
Ţinând cont de efectul ei antiproliferativ se poate utiliza şi pentru prevenirea
restenozării arterelor coronare după angioplastii. Rapamicina se înveleşte intr-un
polimer (stent-uri cu rapamicină)[CYPHER (Cordis - SUA)] ce permite eliberarea
controlată a principiului activ de-a lungul perioadei de vindecare.
Se indică şi în tratarea bolii autosomale polichistice renale, când rapamicina
reduce volumul rinichiului. Recent s-a constatat, în studii pe animale, că rapa­
micina creşte speranta de viaţă cu 38 %.
Are avantajul, fată de inhibitorii calcineurinei, că prezintă reactii adverse mai
reduse (toxicitatea renală este mai redusă). Totuşi, din octombrie 2008, FDA a
aprobat etichetarea tlacoanelor cu rapamicină cu atenţionarea privind riscul
diminuării functiei renale.
Rapamicina se obţine, la nivel industrial, prin cultivarea submersă a tulpinilor de
Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253. Au fost descrise şi sinteze chimice
(K.C. Nicolaou, 1993), care insă nu se aplică pe scară industrială, nefiind economice.
A fost izolată şi o altă tulpină, Streptomyces hygroscopicus AY 8-1206, ce
produce cantităţi mai mari de raparnicină şi cantităţi mult mai mici de dernetoxi­
-rapamicină.
Macrociclul se construieşte din 6 resturi de acetar şi 7 resturi de propionat, iar
grupările metoxi provin de la metionină. Restul de acid pipecolic provine de la
L-lizină. Formarea macrociclului este catalizată de trei complexe rnultienzirnatice.
Pentru obţinerea inoculului tulpina producătoare este cultivată pe agar, având
ca sursă de carbon D-glucoza, D-manitolul, inozitolul şi glicerolul. Cultivarea se
realizează la un pl-l =6-8 şi o temperatură de 25-27oC. Sporii se obţin după 14
zile de cultivare. Inoculul se suspendă intr-un mediu sterilizat la 1200C timp de
25 minute, ce contine glucoză, extract de soia, (NH4)2S04' CaCO, şi apă distilată.
Ca urmare a cercetărilor intense din domeniu (1. Kojirna et al. 1995, YR.
Cheng et al., 1995) s-a reuşit stabilirea formulei mediului de cultură care permite
elaborarea unor cantităţi mari de rapam icină. Acesta poate avea următoarea
compozitie:
• surse de carhon: Dvfructoză-Zf) g/l şi manoză-5 g/I ;
• surse de azot: aspartat-I ,5 g/I, arginină-O,5 g/I, hisudină-O.S g/l, L-lizină­
IO g/l, acid shikimic-lO g/I;
• săruri minerale: K/IP04-1,7 g/l, NaCl-5 g/I, ZnS04'7H20-60 mg/l, MgS04'
7HP-2,5 rng/l, MnS04-12 mgll, FeS04'7Hp-IOO mg/l, săruri de Mo-18
mg/l, săruri de Co-IO mg/l, săruri de Cu-IO rng/I;
 'i

1"
':-:'ţ; ,.~ ţ~."
!',

232 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

I MEl)ICAMENTE DE B10SINTEZĂ 233

• solutii tampon;
• antispumanţi. VI.3. Biotehnologia tacrolimusului
Mediul odată preparat se sterilizează la 12IoC timp de 25 de minute, după care
se răceşte la 27oC. Se ajustează pH-ul la 6,5 cu ajutorul unei solutii de NaOH, sin: FK506, fujimicin
după care se aduce inoculul. C44H69NOI2
Ferrnentaţia se realizează în fermentatoare de oţel de capacitate mare (800- M, = 804,018
10001) şi se conduce la un pH =6-7, la o temperatură de _27oC şi o saturaţie în
oxigen de 50%. După aproape 85-90 ore se opreşte fermentaţia.
Rapamicina se elaborează ca metabolit intracelular, deci la sfârşitul termen­
H'C:"°O 1 CH,:
taţiei se va găsi preponderent în masa celulară.
Izolarea din miceliu a rapamicinei se realizează cu dificultate datorită concen­
traţiei mici în biornasă. Procesul se realizează prin extracţie cu solvenţi organic:
30
H3C/ 27'-//25
/C'- "'" <, .:»: 2.1/1/-°-<'

şi purificare pe coloane cromatografice cu gel de siliciu.

Extracţia rapamicinei din miceliu se realizează cu ajutorul unui solvent organic
(J ~ OH t" ';?~C'H,
miscibil cu apa (e.g. acetonă, i-propanol, n-propanol), care se adaugă peste toată
biomasa. În acest fel se reduce ce-extracţia alcoolilor alifatici şi a cetonelor, ce
interferă separarea ulterioară. Aceşti solvenţi extrag rapamicina din miceliu şi o
trec în faza lichidă, iar miceliul este separat prin filtrare sau centrifugare. O 9
'0;-- 19
/;::7 ~8~O .
17' "'CH3
-'CH
3

Faza lichidă este supusă extracţiei cu un solvent organic nemiscibil cu apa ca : HO-ia' O 15 CH
toluen, xilen, diclormetan, dicloretan, eteri etc. Se preferă tolueuul , deoarece se H3C - II 14)<' "'0// 3
recuperează În final mult mai uşor. Aceşti solventi nerniscibili cu apa extrag doar 13/ ....• H
rapamicina. Extractul organic obţinut se evaporă sub vid, iar reziduul se reia cu \
0-· 'CH3
toluen.
Pentru purificare, soluţia toluenică se trece peste coloanele cromatografice cu Tacrolimusul a fost descoperit în 1984. de către o echipă de cercetători formată
gel de siliciu, utilizând ca fază mobilă toluenul polarizat cu acetonă. din T. Goto, T. Kino şi H. Hatanaka , În mediul de fermentatie al tulpini lor de
Fracţiile ce contin rapamicină sunt concentrare şi cristalizare dintr-un solvent Streptomyces tsukubaensis. Această actinomicetă a fost identificată În probe de
organ ic, rezu I tând raparn icina cristal izată. sol japonez. Tacrolimus derivă de la japonezul "Tsukuba", numele unui vechi
În literatură sunt descrise şi fermentaţii pe substrat solid, în sistem fed-batch, oraş japonez.
ale tulpinilor de Streptomyces hygroscopicus. Totuşi, aceste ferrnentatii au o serie După cercetări clinice intense, a fost patentat de Fujisawa Healthcare Co .. iar
de dezavantaje (substraturile solide nu sunt bine standardizate, procesul are un În 1994 FDA l-a aprobat (PROGRAF/PROGRAFT) pentru utilizarea În transplan­
grad mare de eterogenitate. transferul de oxigen este inconsistent etc.), iar turile de ficat şi ulterior în cele de rinichi. inimă, pancreas. plămâni, trahee,
productivităţi le obţinute nu sunt mai mari decât cele raporta te in anii anteriori. cornee. măduvă osoasă, membre.
Din acest motiv, aceste fermentaţii pe substrat solid nu sunt aplicare industrial. EMEA a acordat o autorizatie de introducere pe piaţă pentru ADVAGRAF În .1\
aprilie 2007. ";j
, I
'1'
Proprietăţl fizice, chimice, farmacologice
Tacrolimusul se prezintă sub formă de cristale prisrnatice incolore, atunci când '.)il
cristalizează din acetonitril, Este cristalizat cu o moleculă de apă de cristalizare 'j'i;:i
:·: :d
(C 44H69NO 12' HP)·
i :!)/i l
.
:::
e:
; ii+!1
'. :i'll,~
:,!ii:1
ţ',!jll~ll.
 ·1I;1·"F#
'1 '
234 CĂTĂLlNA DANIELA SfAN I MEDICAMENTEDE B10SINTEZĂ 235

Substanta monohidratată are p.t. = 127-1290C. Este solubil în metanol, etanol, Se indică pentru prevenirea rejetului transplanrurile alogene de organe, În
acetonă, acetat de etil, cloroform, dletil-eter, este greu solubil în hexan, eter de asociere cu corticosteroizi. Se administrează imediat după realizarea transplan­
petrol şi insolubil în apă. tului de ficat, rinichi, inimă, pancreas, plămâni, trahee, cornee, măduvă osoasă,
Acţionează prin reducerea activităţii celulelor T şi a interleukinei-Z (JL-2). membre. Tacrolimusul are acţiune similară ciclosporinei, dar este mult mai potent
Reduce activitatea peptidil-pirolil izomerazei prin legarea de imunofilina FKBP12 (unele studii arată că este de 100 de ori mai potent).
(FK506 binding protein 12). Complexul tacrolimus-FKBPl2 inhibă calcineurina Se utilizează şi topic în tratamentul derrnatitelor ce nu răspund la alte trata­
şi astfel sunt inhibate celulele T şi IL-2. Mecanismul de actiune este asemănător mente: dermatite atopice severe, uveite severe, vitiligo.
ciclosporinei (figura nr. 53). Mai recent a Început să fie utilizat în supresia inflamaţiei asociată cu colitele
ulcerative.
Reactiile adverse pot fi severe şi putem enumera: afecta re hepatică şi reanală,
Tacrolimus
hipertensiune, trernor, diabet, neuropatii, diaree, senzatie de arsuri, simptome
asemănătoare gripei, dureri de cap, potential risc de a dezvolta cancere şi infecţii.
FKBPI2--~1 Pacientii trebuie să evite expunerea la soare pe durata tratamentului, pentru a
minimaliza riscul aparitiei cancerului de piele.
Complexul Capsulele se stochează la 250C, iar fiolele cu solutie injectabilă la temperaturi
tacrol imus-FKBP 12 cuprinse între 5-250C. Solutia injectabilă se diluează cu ser fiziologic sau
dextroză.
, Celule T Unguentele se conservă la temperatura camerei (nu la rece şi nici la cald).

t --------\ Produse farmaceutice:

Calcineurină --x-­
Prezenţa PROGRAF (Astellas Pharma lnc. - SUA)
(f05fat371\ proteică) cps., 0,5 rng , I mg, 5 mg
antigenului
sol. injectabilă i.v., 5 mg/rnl
unguent 0,03 %. O, 1%
PROGRAFT (Astellas Pharma Inc, - SUA)
Activarea - ~ Interleukina-2 cps., 0,5 rug, 1 mg, 5 mg
celulelor T _/_ sol. injectabi lă i. v., 5 mg/rnl
PROTOPIC (Astellas Pharma Inc. - SUA)
1__ - r unguent 0,03%. 0, 1%
ADVAGRAF (Astellas Pharma Europe - UE)
cps. cu eliberare prelungită 0,5 mg, l rng. 5 rng

1 Tehnologia de biosinteză a tacrolimusului

Tehnologia de fermentatie a fost dezvoltată de către specialiştii de la Metkinen
Proliferarea Oy, din Finlada, aceştia fiind astăzi principalii producători de tacrolirnus, Biosin­
celulelor T teza se realizează cu tulpini mutante de Streptomyces tsukubaensis şi are o
productivitate de 0,5-0,7 gll tacrolimus.
Figura nr, S3 Mecanismul de acţiune al tacrolimusului
În 1994, A. Shafiee a descoperit un alt microorganism producător de tacro­
Legendă: X - inhibare
limus, Streptomyces sp. MA 6858 care biosintetizează, în anumite conditii de
cultivare, 37,8 mg/l tacrolimus.
 'j;'-1~
-:~: . ~2~
'r'"
236
CĂTĂLlNA DANIELA STAN
I
Există studii ale cercetătorilor de la Ranbaxy (Patent, 2007) care arată că
tacroJimusul se poate obtine şi cu ajutorul tulpinilor mutante de Streptomyces
glaucescens MTCC 5lJ5. Tulpina naturală a fost izolată din probe de pământ din
regiunea Narnaul, Haryana, India. Microorganismul produce cantităţi suficiente
de tacrolirnus (5-10 ug/rnl după aproximativ 300 h de fermentatie) iar compuşii
secundari sunt în cantitate mică.
Alti cercetători (I-f.S. Kim, Y.I. Park, 2008) au arătat că producători de
tacrolimus sunt şi tulpinile mutante de Streptomyces clavuligerus CKD 1119 (tulpina
naturală fiind izolată din mostre de pământ din Koreea), cu ajutorul cărora au
obtinut concentrarii de 58 mg/I tacrolimus În biornasă.
Procesul se realizează prin fermentatie fed-batch, subrnersă, În conditii de
aeraţie foarte bună, cu o tulpină Înalt productivă de Streptomyces tsukubaensis
ATCC 55098.
Mediul de cultură contine surse de carbon, surse de azot organic, săruri
minerale, tampon fosfat şi antispumanţi ca: ulei de silicon, ulei de parafină, sau
uleiuri vegetale.
Compoziţia mediului de cultură poate fi :
:.- dextroză 25 g/l, dextrină 80 g/l, gficerol 10 g/l, polietilenglicol 12,5 g/I;
);- extract de seminte de bumbac 10 g/I, extract de soia 10 g/l , peptone din soia
10 g/l ;
);- CaC03 1,5 g/l ;
)..- soluţie tampon fosfat 0,5-1,5 g/I ;
»- antispumanţi.
Mediul odată preparat se sterilizează la 121 Uc timp de 25 minute. Fermentaţia
se conduce la un pH =7,0-7,5 timp de 190-280 h, la o temperatură cuprinsă între
22-350C şi o agitare de 240 rot/rnin. Mediul se aerează cu 2,0 v/v/m oxigen.
Cantitatea de miceliu acumulată la sfârşitul fermentaţiei este de 50-60%
din volumul final, iar tacrolimusul se găseşte in biornasă În concentra tie de
300-310 rng/l.
La sfârşitul ferrnentaţiei se centrifughează biomasa cu ajutorul unei centrifuge
tiltrante timp de 10 minute la 4000 rot/rnin.
Separarea tacrolimusului se realizează destul de dificil, ţinând cont că majo­
ritatea tulpinilor producătoare biosintetizează În paralel ascomicină şi alti compuşi
inrudiţi structural (e.g. tsucubarnicina B). De asemenea, concentrat ia finală a
tacrolimusului în biornasă este mică, tiind prezent atât în rniceliu cât şi în faza
lichidă.
Pentru ca procesul să tie economic se realizează filtrarea biomasei cu separarea
miceliului de filtrat. Ulterior, masa celulară şi liltratul sunt prelucrate separat
pentru izolarea şi purificarea tacrolirnusului.
'J.; ';!
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 237
Filtratul se acidulează la pH =4, după care se extrage de două ori cu acetat de
etil şi se concentrează la 400C sub vid. Urmează o purificare prin tehnici
cromatografice (HPLC cu sistem de faze inverse, dar care are dezavantajul de a
favoriza izomerizarea tacrolimusului În tautornerii săi), după care se cristalizează.
Tulpina de Streptomyces tsukubaensis produce o multitudine de proteine,
oligozaharide şi compuşi cu structuri asemănătoare tacrolimusului. Pentru a nu
impur.ifica produsul final de biosinteză toate aceste impurităţi trebuie îndepărtate
prin extractie directă cu acetonă. Extractul obtinut se purifică succesiv cu rezi ne
puternic adsorbante şi pe coloane cromatografice cu gel de siliciu, urmate de
recristalizarea din soluţie apoasă de acetonitril, când se obtine tacrolimusul
monohidratat.
Pentru a evita izomerizarea cis-trans a tacrolimusului În coloanele crorna­
tografice, acestea se Încălzesc la 500C şi se adaugă o soluţie de Brij-35 ca diluant
(rata de epimerizare este dependentă de concentratia apei din solutie), sau se
folosesc geluri de siliciu modificate cu săruri de argint.
Extractia din miceliu se realizează prin adăugarea unui solvent organic rniscibil
cu apa În mediul de fermentatie. Astfel. tacrolimusul trece în totalitate în faza
lichidă. Miceliul este ulterior Îndepărtat, iar filtratul obtinut se tratează cu un
solvent nemiscibil cu apa. Extractul organic obtinut este partial evaporat, concen­
tra tu I puriticându-se prin crornatografie pe gel de siliciu modificat cu o sare de
Ag, pentru a evita epimerizarea tacrolimusului În coloana cromatografică. Frac­
ţiunile ce conţin tacrolimus sunt concentrare, iar reziduul este cristal izat dintr-un
solvent organic propice, când se obtine tacrolimus cristalizat pur.
Tacrolirnusul se mai poate izola din biomasa obţinută în urma Iermeruaţiei şi
printr-o extracţie directă din mediul de fermentatie cu solvenţi organici miscibili
cu apa (acetonă, propanol. izopropanol etc.). Se Îndepărtează prin filtrare masa
celulară, iar filtratul obtinut se tratează cu solvenţi nemiscibili cu apa. Extractul
organic rezultat se evaporă parţial, iar concentratul se purifică pe coloane crorna­
tografice cu gel de siliciu modificat cu săruri de Ag.
Fracţiunile obţinute se supun cristalizării, când se obţine tacrolirnus cristalizat
de 95,8% puritate (cu 0,7% ascomicină, maxim 0,1% tsucubamicină B şi 1 %
tautorneri ai tacrolirnusului).
ld
 'rI ~'
I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 237
236 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Există studii ale cercetători lor de Ia Ranbaxy (Patent, 2007) care arată că Filtratul se acidulează la pH =4, după care se extrage de două ori cu acetat de
tacrolimusul se poate obţine şi cu ajutorul tulpinilor mutante de Streptomyces etil şi se concentrează la 400C sub vid. Urmează o purificare prin tehnici
glaucescens MTCC 5115. Tulpina naturală a fost izolată din probe de pământ din crornatografice (HPLC cu sistem de faze inverse, dar care are dezavantajul de a
regiunea Narnaul, Haryana, India. Microorganismul produce cantităţi suficiente favoriza izomerizarea tacrolimusului în tautomerii săi), după care se cristalizează.
de tacrolimus (5-10 ug/rnl după aproximativ 300 h de fermentaţie) iar compuşii Tulpina de Streptomyces tsukubaensis produce o multitudine de proteine,
secundari sunt în cantitate mică. oligozaharide şi compuşi cu structuri asemănătoare tacrolimusului. Pentru a nu
Alţi cercetători (H .S. Kim, Y. I. Park, 2008) au arătat că producători de impuritica produsul final de biosinteză roate aceste impurităţi trebuie îndepărtate
tacrolimus sunt şi tulpini le mutante de Streptomyces clavuligerus CKD 1119 (tulpina prin extractie directă cu acetonă. Extractul obtinut se purifică succesiv cu rezine
naturală fiind izolată din mostre de pământ din Koreea), cu ajutorul cărora au puternic adsorbante şi pe coloane cromatografice cu gel de siliciu, urmate de
obţinut concentratii de 58 mgll tacrolimus în biomasă. recristalizarea din soluţie apoasă de acetonitril, când se obţine tacrolimusul
Procesul se realizează prin fermentatie fed-batch, submersă, în conditii de monohidratat,
aeraţie foarte bună, cu o tulpină înalt productivă de Streptomyces tsukubaensis Pentru a evita izomerizarea cis-trans a tacrolimusului în coloanele croma­
ATCC 55098. tografice, acestea se încălzesc la 500C şi se adaugă (l soluţie de Brij-35 ca diluant
Mediul de cultură conţine surse de carbon, surse de azot organic, săruri (rata de epimerizare este dependentă de conceruraţia apei din solutie), sau se
minerale, tampon fosfat şi antispurnanţi ca: ulei de silicon, ulei de parafină, sau folosesc geluri de siliciu modificate cu săruri de argint.
uleiuri vegetale. Extractia din miceliu se realizează prin adăugarea unui solvent organic miscibil
Compozitia mediului de cultură poate fi : cu apa în mediul de fermentatie. Astfel, tacrolimusul trece în totalitate În faza
~ dextroză 25 g/l , dextrină 80 gll, glicerol 10 gll, polietilenglicol 12,5 g/l ; lichidă. Miceliul este ulterior îndepărtat, iar filtratul obtinut se tratează cu un
~ extract de seminţe de bumbac 10 g/l, extract de soia 10 g/l, peptone din soia solvent nemiscibil cu apa. Extracrul organic obtinut este partial evaporat, concen­
10 g/l; tratul purificându-se prin crornatografie pe gel de siliciu modificat cu o sare de
y CaCO} 1,5 g/l ; Ag, pentru a evita epimerizarea tacrolimusului în coloana crornatografică. Frac­
~ soluţie tampon fosfat 0,5-1,5 g/l ; ţiunile ce contin tacrolimus sunt concentrate, iar reziduul este cristalizat dintr-un
;.... antispumanţi. solvent organic propice, când se obţine tacrolimus cristalizat pur.
Tacrolimusul se mai poate izola din biomasa obţinută În urma ferrnentaţiei şi
Mediul odată preparat se sterilizează la 121 "C timp de 25 minute. Fermentaţia
printr-o extracţie directă din mediul de fermentatie cu solvenţi organici miscibili
se conduce la un pH =7,0-7,5 timp de 190-280 h, la () temperatură cuprinsă Între
cu apa (acetonă, propanol, izopropanol etc.). Se îndepărtează prin flltrare masa
22-350C şi o agirare de 240 rot/min. Mediul se aerează cu 2,0 v/v/m oxigen.
celulară, iar filtratul obtinut se tratează cu solvenţi nemiscibili cu apa. Extractul
Cantitatea de miceliu acumulată la sfârşitul ferrnentatiei este de 50-60%
din volumul final, iar tacrolimusul se găseşte în biomasă în concentraţie de organic rezultat se evaporă partial, iar concentratul se purifică pe coloane cr0111a­
300-310 mg/l. tografice cu gel de siliciu modificat cu săruri de Ag.
La sfârşitul ferrnentaţiei se centrifughează biomasa cu ajutorul unei centrifuge Fracţiunile obţinute se supun cristalizării, când se obtine tacrolimus cristalizat
filtrante timp de 10 minute la 4000 rot/min. de 95,8 % puritate (cu 0,7% ascomicină, maxim O, I % tsucubamicină B şi 1 %
Separarea tacrolimusului se realizează destul de dificil, ţinând cont că majo­ tautorneri ai tacrol imusului).
ritatea tulpini lor producătoare biosinretizează în paralel ascornicină şi alţi compuşi
inrudiţi structural (e.g. tsucubarnicina B). De asemenea, concentraţia finală a
tacrolimusului în biomasă este mică, fiind prezent atât în rniceliu cât şi în faza
lichidă.
Pentru ca procesul să fie economic se realizează filtrarea biomasei cu separarea
miceliului de filtrat. Ulterior, masa celulară şi filtratul sunt prelucrate separat
pentru izolarea şi purificarea tacrolimusului.

.
,
,
~
 t~~~

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 239

238 cĂTĂLINA DANIELA STAN

p.t. = 159-164°C. Produsul are o puritate de cel putin 95% (izomeri ai ascomicinei
.mai putin de 5%,0,02% metale grele), având o umiditate de 3%.
VI.4. Biotehnologia ascomicinei Se conservă la 200C în absenţa luminii.
Acţionează prin legarea de imunotiline, în special de macrotilina-12 (FKI3P 12).
sin: imunomicina, FR-900520, FK520 Acest complex inhibă calcineurina şi suprimă producerea de citokine: IFN,
C4JH69NOl2 IL-2, IL-4, IL-IO.
M, = 792,01 Are proprietăţi imunosupresoare puternice, putând ti indicată în prevenirea
rejetului de organe după transplant, În tratarea bolilor autoimune şi a celor de
HO'" piele. Recent au fost tăcute publice date (s-au obtinut şi patente), care arată
eficacitatea ascornicinei, atunci când este aplicată topic, În tratarea blefaritelor.
H3C"O CH3 Deşi există numeroase studii cu privire la actiunea ascomicinei, precum şi
studii de formulare pentru obtinerea unor forme farmaceutice, totuşi până la
această dată nu există produse farmaceutice introduse pe piaţă.
H3C' 27 _ 25
36
Tehnologia de biosinteză a ascomicinei

0N' _y 8 n O
0 OH /21··, /CH3

19"C H3
35 Prin ferrnentaţia tulpinilor de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus
ATCC 14891 se obtine ascomicina şi analogul său FK523 (ce are În pozitia 21 a
macrociclului lactonic o grupare metil). Acest compus trebuie separat din biomasă,

O »<>
9 17""CH3
Întrucât prezenta sa în produsul final duce la scăderea activităţii irnunosupresoare
a ascomicinei.
O serie de studii (B. Junker, 1998, 1999 ) au arătat că adăugarea val inei în
HO--!:-O
10 mediul de fermentatie optimizează formarea compusului FK523, astfel Încât
H3C- II concentraţia acestuia să fie mai mică de 5 %. Totuşi randamentul In ascomicină
este mai mic cu 20%, decât în fermentaţiile la care nu se adaugă valină.
O--CH3 Separarea compusului FK523 este dificilă, datorită asemănării structurale cu
ascomicina şi a solubilităţii celor două substanţe în solventi identici, aşa Încât nu
se poate ajunge la o îndepărtare totală a FK523.
Ascomicina este un analog macrolidic natural al tacrolimusului (derivatul său Utilizând tulpini mutante Înalt productive, controlând conditiile de fermentaţie
etilic). A fost izolată initial În 1962, ca antibiotic antimicotic. După aproape 25 de
şi corectând compozitia mediului de cultură se poate limita producerea compusului
ani, ca urmare a unui screening pentru noi imunosupresoare, a fost redescoperită
FK523, astfel Încât prezenta sa ca impuritate a ascomicinei să fie cât mai mică.
ca imunosupresor. lnoculul se obţine prin incubarea tulpinii producătoare timp de 48 de ore la
Se obtine industrial prin ferrnentaţia tulpini lor de Streptomyces hygroscopicus
28oC, pe un mediu nutritiv optim.
var. ascomyceticus ATCC 14891. Se poate biosintetiza şi de către Streptomyces
Mediul de cultură pentru fermentaţia propriu-zisă poate contine:
hygroscopicus var. yakushiaensis MA6531.
Au fost descrise şi o serie de sinteze chimice (K.C. Nicolaou, 1993), care nu ).;- dextrină 140 g/l ;
se aplică la scară industrială, fiind neeconomice. ):- extract de seminte de bumbac 14 g/l ;
).;- extract de soia JO gll ;
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice ,_ gl icerol 10 g/l ;
).- peptone din soia 10 g/l ;
Se prezintă sub formă de pulbere de culoare albă, solubilă În DMSO (dizolvată În
a ):- polietilenglicol 12,5 g/I;
proportie de 10 rng/rnl formează soluţii clare şi incolore), metanol, etanol. Are un
11
1~,
~((

i!'oir.
 ,~~.
I
240 CĂTĂLIN" DANIELA STAN
I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 241

~ K3P04 0,8 gll ; 17. Chan S., Br. J. Cancer., 2004, 91 (8): 1420-1424;
);- CaC03 1,5 gll ; 18. Chen T.S., Arison B.H., Wicker L.S., Inamine E.S., Mouaghan R.L., J. Antibiot.
(Tokyo), 1992, 45: 118-123:
Mediul se sterilizează la 1210C timp de 30 de minute. 19. Cheng YR., Fang A., Demain A.L., Appl. Microbiol. Biotechno!., 1995, 43:
Fermentaţia decurge În fermentatoare de otel de capacitate mare, la un pH = 1096-1098 ;
7,6-7,8, timp de 180-240 h la 28°C, viteza de agitare a mediului fiind de 2,0- 20. Cheng Y.R., Hauck L., Demain A.L., 1. Ind. Microhiol., 1995, 14: 424-427:
2,4 m/s. 21. Chun G.T., Agathos S.N., J. Biotechno!., 1989,9: 237-254;
În aceste conditii de fermentatie se obtine o productivitae de 350-400 mg/l de 22. Diumann 1., Lawen A., Zocher R., Kleinkauf H., Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990,
ascomicină, iar compusul secundar format, FK523, se acumulează Într-o pro­ 371 : 829-834; •
23. Diumann l., Wenger R.M., Kleinkauf H., Lawen A., J. Biol. Chem., 1994,266:
portie de cel mult 4,7%.
10739-10742 ;
Ascomicina se poate izola direct din mediul de fermentatie prin extracţie
24. Dreyluss M.M., Chapela I.H., "Potential of fungi in the discovery of novel,
selectivă, urmată În final de cristalizare. low-molecular weight pharrnaceuticals", In: The discovery of natural products with
Se mai poate realiza separarea ascomicinei după filtrarea biomasei, când therapeutical potential, Gullo V. P. (ed), Buucrwonh-Heinernann. Boston, 1994,
izolarea se realizează atât din miceliu cât şi din filtrat, urmată de cristalizarea 49-80 ;
ascornicinei. 25. Dreyfuss M.M., Gams W., Taxon, 1994,34: 660-661:
26. Dreyfuss M.M., Harri E., Hofmann 1'1., Kobel H., Pache W., Tscherter H., Ellr. J.
Appl . Microbio!., 1976, 3: 125-133;
Bihliografie 27. Dreyfuss M.M., Schreier M.H., Tscherter 1'1., Wenger R., European Patent,
0296123 A2, 1988;
1. Abou-laoude M.M., Naim R., Shaheen l., Naufal N., Abboud S., AIHabash M., 28. Durnont F.l., Byrne K.M., Sihgal N.H .. Kaplan L., el al ., European Patent,
Darwish M., Mulhcm A., Ojjeh A., Almawi W.Y, Transplantation Proceedings, 0323865, 1989;
2005, 37: 3025-3028; 29. Dumont F.l., Staruch M.1., Koprak S.L., Melino M.R., Sigal N.H., 1. 1111/1/11/101 .•
2. Aggarwal D., Fcrnandez M.L., Soliman G.A., Metabolism, 2006, 55 (6): 794-802; 1 990b, 144: 251-258;
3. Akashi T., Nefuji T., Yoshida M., Hosoda 1., 1. Pharm. Biomed. Anal., 1996, 14: 30. Ehninger O .. Han S .. Shilyansky C., el al ., Nat. Meâ., 2008, 14 (8): 843-848;
339-346 ; 31. Fang A., Demain A.L., FiJ!io Microbio!., 1995,40: 607-610;
4. Alberg D.G., Schreiber S.L., Science, 1993,262: 248-250: 32. Fukatsu S., Fukudo M., Masuda S .. Yano 1., Katsura T., Ogura Y. Oike F, Takada
5. Aparico l. F., Molnăr 1., Schwecke T., el al., Gene, 1996, 169 (1): 9-16; Y., Inui K., Drug. Metab. Pharmacokinet.; 2006. 21 (2): 122-125;
6. Arai T., el al ., J. Antibiot . (Tokyo), 1962, 15: 231-235; 33. Ge L., lakovou 1., Cosgrave J.. Chieffo A .. Montorfano M., Michev 1., Airoldi F,
7. Arai T., U.S. Pat 1'11 1, 3,244,592,1996: Carlino M .. Melzi G., Sangiorgi G.M., Corvaja N., Colombo A .. Circulation,
8. Baker H., Sidorowicz A., Sehgal S.N., Vezina C., 1. Antibiot . (Tokyo), 1978,31 : 2004, i09: 2732-2736:
539-545 ; 34. Goodfellow M., Mantio G.P., Chun l., "Towards a practicat species concept for
9. Baurngart D.C., Mac Donald l.K., Feagan B.G., Cochrane Database Syst. Rev., cultivablc bacteria " În: The units of biodiversity-species in practice, Claridge
2008, 16: CD007216; M.F., Dawah H.A., Wilson M.R., (edsl.Chapman and HalI. London, 1997,25-59:
10. Baumgart D.C., Pintoffl l.P., Sturrn A., Wiedenmann B., Dignass A.U., AIIl. 1. 35. Graziani E.I., NoI. Prod, Rep., 2009,26 (5): 602-609;
Gastroenterot., 2006, 101: 1048-1056: 36. Gregory M.A., Gaisser S., Lill R.E., eloi .. AI/gew. Chem. 11/1. Ed. Eng!., 2004,
II. Billich A., Zocher R., 1. Biol. Chem., 1987,262: 17258-17259; 43 (19): 2551-2553:
12. Bisseu L, CaII. J. BOI., 1983,61: 1311-1329; 37. Gregory M.A., Hong H., Lill R.E., el al ., Org. Biomol. Chem., 2006, 4 (19):
13. Buchta M., Cvak L., Satke 1., Blatny P., U.S. Patent, 19,540456; 3565-3568 ;
14. Byrne K.M., Shafiee A., Nielsen1., Arison B., el ai., Dev. Ind. Microbiol., 1993, 38. Griftiths C.E., Br. 1. Dermato!., 2001, 144(4): 679-681;
32: 29-45; 39. Hanifin l.M., Paller A.S . , Eichenfield L, Clark R.A., Korman N., Weinstein G.,
15. Cannon P.F., Microbiol. Sci., 1986,3: 285-287; Caro 1., Jaracz E., Rico M.J., J. Am. Acad. Derm .. 2005, 53(2 suppl 2): S 186-194 ;
40. Harrison D.E., Strong R., Sharp Z.D., el a!., Nature.; 2009, ;
16. Caroni P., Rothenfluh A., McGlynn E., Schneider C., 1. Biol. Chem .. 1991,269:
2841-2846 : 41. Hatanaka H., 1'101.,1. Antibiot . (Tokyo), 1989,42: 620-622;

~.
,;,,,~,
 '.

242 CĂTĂLlNA DANIELA SlAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 243

42. Hatanaka H., Iwami M., Kino T., 1. Antibiot . (Tokl'o), 1988,41: 1586-1591;
43. Hatanaka H., Kino T., Asano M., el al., J. Antibiot. (Tokyo), 1988, 41: 1592-
-1599 ;
44. Hayward C. M., Yohannes D., Danishefsky S.J., J. Am. Chem. Soc., 1993, II 5 :
9345-9349 ;
45. Higgens C.E., Kastner R.E., Int . J. Syst . Bacteriol.: 1971,21: 326-331;
46. Hoffmann K., Schneider-Scherzer E., Keinkauf H., Zocher R., ./. Biol. Chem.,
1994, 269: 12710-12714;
47. Hong L., Tang X., Miao C., Wang Y., Kangshengsu . 1984, 9: 5-15;
48. Jegorov A., Buchta M., Cvak L., Satke J., Blatny P., U.S. Patent, 546207, 2008;
49. Jegorov A., Matha V., Sedmcra P., el ai., Pytochem., 1995,38: 403-407;
50. Jiang X., Yeung R.S., Cancer Res., 2006, 66 (10): 5258-5269;
51. Jong S.c., Edwards M.J. (eds), Catalogue of [ilamentous [ungi, American Type
Culture Collection, 181h edition, J 991. 75-76;
52. Junker B., Marin Z., Gailliol P., Byrne K., Wilson J., Biotechnol. Bioeng.; 1999,
60(5): 580-588;
53. Junker B., Reddy.l., Olewinski R., Gailliot P., Byrne K., Gbewonyo K., Biotechnol.
Bioeng.; 1998, 59(5): 595-604;
54. Kahan B.D., Lancet , 2000. 356: 194-202:
55. Kallen J .. Mikol V., Quesniaux v.F.J., Walkinshaw M.D .. Schneider-Scherzer E.,
Schorgendorfer K., Weber G., Fliri H., "Cyclosporins : Recent Developmems in
Biosynthesis, Pharmacology and Biology, and Clinical Applications" În: Biotech­
nology , vol. 7, second edition, Rhem H.J., Reed G. (eds), Kleinkauf H., von
Dohren H. (eds. pentru vol. 7), VCI-l Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. 1997.
535-591 ;
56. Kawai M .. el (/1., Bioorg. Med. Chem. LeII., 1998,8: 935-939;
57. Kawai M., el al., FEBS LeII., 1993,316(2): 107-113;
58. Kerkar N., Dugan C., Rurnbo c.. Morotti R.A., Gondolesi G., Shncider B.L.,
Emre S., Am. 1. Transplant., 2005, 5 (5): 1085-1089;
59. Kino T., Hatanaka H., Hashimoto M., Nishiyama M., GOIO T., Okuhara M.,
Kohsaka M., Aoki H .. Imanaka H.,./ Antibiot, (Tokyo), 1987,40 (9): 1249-1255;
60. Kobel H., Traber R., Eur.. ./. Appl. Microbio!., Biotechnol., 1982. 14: 237-240;
61. Kojima 1., Cheng Y., Mohan V., Demain A.L., J. Ind. Mlcrobiot., 1995, 14:
436-439 ;
62. Komagata K .. Suzuki K., "Lipids and cell-wall analysis in bacterial sysrernatic" În:
Chemicat methods in bacterial systematics, Goodfellow M., Minnikin D.E.(cds),
Academic Press, London, 1987, 267-287;
63. Kuhnt M., Bitsch F.. France J., Hufmann H., Sanglier J.J., Traber R., J Antibiot .
(Tokyo), 1996,49: 781-787;
64. Kwon YS, Kim JC., Exp. Moi. Med., 2006, 38 (2): 173-179;
65. Lawen A .. Traber R .. Reuille R., Ponelle M., Biochem . ./., 1994, 300: 395-399;
66. LeeJ., AgathosS.N.,App/. Microbiol. Biotechno!., 1991,34: 513-517;
67. Liu 1., Farmer J., Lane W., Friedman J., Weissman 1., Schreiber S., Cel/, 1991.
66(4): 807-815 ;
68. Liu Y., Kidney lni., 2006, 69 (Il): 1925-1927;
69. Locci R., "Streptomyces and related genera" În: Bergey's manual of systematic
bacteriology, Garrity G. (ed.), vol. 4, Williams & Wilk ins Company, Baltimore,
1989,2451-2508 ;
70. McAlpine J.B., Swanson S.J., Jackson M., Whittern D.N., J. Antibior, 1991,44:
688-690 ;
71. McCauley J .. Slide Set Series OII Analyses of Imntunosuppressive Therapies , 2004,
Medscape. http://www.meclscape.com/viewarticle/474429;
72. Meadows R.P., el at., Biochemistry, 1993,32: 754-759;
73. Mercalli A., Sordi V., Ponzoni M, Marti P, De Taddeo F, Galli G, Servida p,
Bernardi M, Bcllio L., Bertuzzi F., Secchi A., Bonifacio E., Piemonti L., Am . ./.
Transptant., 2006, 6 (6) : 1331-1341 ; .
74. Meyer S.D., Miwa T., Nakatsuka M .. Schreiber S.L., 1. Org . Chem., 1992,57:
5058-5060 ;
75. Meyer S.D., Romo O .. Johnson D.D., Schreiber S.L., 1. Am. Chem. Soc.; 1993,
115: 7906-7907; .
76. Mollison K.W., Fey T.A .. Krause R.A., Thomas V.A .. Mehta A.P., Luly J.R.,
AIIII. N. Y Acad. Sci .. 1993,685: 55-57;
77. Morisaki M., Arai T.,./. Antibiot (Tokyo), 1992,45(1): 126-128;
78. Mrowietz U .. Eur. J. Dermatol., 1999, 9(5): 346-351;
79. Nakajima H., Harnasaki T., Tanaka K .. Kimura Y., Udagawa S., Horie Y., Agrie.
Bial. Chem., 1989.53: 2291-2292;
80. Nakimi y, el al ., Chromatographia . 1995,40: 253-258;
81. Nicolaou K.C., Chakraborty T.K., Piscopio A.D., Minowa N .. Bertinato P.,./. Am.
Chem. Soc., 1993. 115: 4419-4424;
82. Nishikawa T. el al .. Phurm. Res .. 1993. 10: 1785-1789;
83. O'Grady J.G .. Burroughs A., Hardy P., Elbourne D .. Truesdale A , Lancet , 2002,
360: 1119-1125;
84. Okuno S., CIIn: Opin. Oncol .. 2006. 18 (4): 360-362;
85. Omura S., Tsuzuki K., Tanaka Y., el 0/ .. 1. Antibiot. (Tokyo). 1983,36: 614-616;
86. Paiva N.L., Roberts M.F., Demain A.L., J. lnd. Microbiol.. 1993, 12: 423-428;
87. Patcheu A.A .. While R.F., Goegelman R.T., U K Poieni, BG 2206119A, .1988;
88. Paul C., Graeber M .. Stuerz A., Expert Opin. lnvestig, Drugs, 2000. 9(1): 69-77;
89. Pcarson S.D .. Trissel L.A., Am. J. Hosp . Pharm., 1993,50: 1405-1409;
90. Peces R., Pcces C., Perez-Duenas v; el al., NDT Plus (Oxford Journals), 2009, 2
,;~.; (2): 133-135;
91. Plalh K.E., el al ., cun. Exp, AI/ergy., 2003, 33: 342-347;
92. Popescu F., Popescu F.D .. "Sistemul irnunitar, Imunofarmacologic" În: Tratat de
farmacologie, editia a Il", Cristea A.N. (ed.), EcI. Medicală, Bucureşti, 2005,
839-864 ;
93. Priichard D.I., Drug Discovery Today . 2005, 10(10): 688-691 ;
94. Quatresooz P.. el al., Re". Med. Liege., 2003, 58: 168-173;
 \0't!!f"

244 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 245

95. Reynolds K.A., Dernain A.L., "Rapamycin, FK506, and ascomycin-related com­ 123. Von Arx J.A., Mycotaxon, 1986,25: 153-158;
pounds" În: Biotechnologv of antibiotics , Strohl W.R. (ed), Taylor & Francis 124. Wallact K.K., Reynolds K.A., Koch K .. McArthur H.A.I., Brown M.S., Wax
Group, Boca Raton, SUA, 1997,497-520; R.G., Moore 8.S., 1. Am. Chem. Soc., 1944, 1I6: 1160()-1I601;
96. Romo D~, Johnson D.D., Plamondon L., Miwa T., Schreiber S.L., J. Org. Chem., 125. Webster A.C., Lee v.w., Chapman J.R., Craig .I.c., Transplantation., 2006,81
1992, 57: 5060-5063; (9): 1234-1248;
97. Sangwon Jung, Sunghyun Moon, Kyungsun Lee, Youn-Je Park , Sewang Yoon. 126. Wellington K., el al .. Drugs, 2002. 62: 817-820;
Young Je Yoo, J. Ind. Microbiol. Biotechnol.; 2009, 36: 1467-1471; 127. Wendel H.G., De Stanchina E .. Fridman J.S .. et al., Nature, 2004, 428 (6980):
98. Sawai K., Okuno T., Terada Y., Harada Y., Sawamura K., Sasaki 1-1., Takao S., 332-337 ;
Agic. Biol. Chem., 1981, 45: 1223-1228; 128. Yu L., et al., J. Magn. Reson., 1994, B 104: 77-81 ;
99. Schreiber S.L., et al., Ace. Chem. Res., 1993, 26( 8): 413-416; 129. Zocher R., Nihira T., Paul E., Madry N., el al., Biochem., 1986.25: 550-553;
100. Schwecke T., Aparicio J.F., Molnăr 1., el (II., Proc. Nall. Acad. Sci. V.S.A., 1995, 130. Zuberbier T., Chong S. U., Grunow K. ~ GlIhl S., Welker P" Grassberger M., Henz
92(17): 7839-7843; B.M.,1. Allergy cu». 11Il1fI1i/lO/., 2001,108(2): 275-280.
101. Sedrani R., el al, Bioorg. & Med. Chem. LeII., 1999. 9: 459-462;
102. Sehgal S.N., 8aker H., Vezina c., J. Antibiot .. 1975,28: 727-731;
103. Sehgal S.N., Molnar-Kimber K., Ocain T.D .. Wciclunan 8.M., Med. Res. Rev.,
1994, 14: 1-22;
104. Seibutsu-Kogaku Kaishi, 1. Biosci. Bioeng., 2008, 105(4): 418-421 ;
105. Shafiee A., Chen T., Arison 8.S., Dumont F.J., Colwell L., Kaplan L., 1. A ntibiot.
(Tokyo), 1993,46: 1397-1405;
106. Shafice A., Motamedi H., Chen T., Eur. J. Biochem .. 1994.225: 755-764;
107. Shuchman M., N. Engl. J. Med., 2006,355 (19): 1949-1952;
108. Silverberg N.8, Lin P., Travis L., Farley-Li J., Mancini A.J., Wagner A.M.,
Chamlin S. L., Palier A.S., JOI/mal of Ilie American Academy al Dermatologv;
2004, 51(5): 760-766;
109. Smolewski P., Anticaucer Drugs., 2006, 17(5): 487-494 ;
110. Stackebrandt E., Goebel 8.M., Int . J. Syst. Bacteriol ., 1994,44: 846-849;
III. Steiner D., 8runicki N., Bachar-Lustig E .. Taylor P.A., Blazar 8.R., Reisner Y.,
Exp, Hematol., 2006, 34 (6) : 802-808 ;
lI2. Strom T.8., Turka L.A .. el al, Nature Medicine , 1999.5(11): 1298-1302;
lI3. Strom '1'.8., Wclls A.D., el al, Nature Medicine , 1999.5(11): 1303-1307;
114 . Sun S.Y., Rosenberg L.M., Wang X., el al., Cancer Res.• 2005, 65(16): 7052-7058;
lI5. Tanaka H .• Kuroda A., Marusawa H., Hatanaka H., Kino T., Koto T., Hashirnoto
M., Taga T., J. Am. Chem. Soc., 1987, 109: 5031-5033;
116. Traber R .. "8iosynthcsis of cyclosporins" În: Biotechnology of antibiotics, Strohl
W.R. (ed), Taylor & Francis Group, Boca Raton, SUA, 1997,279-314;
117. Traber R., Hofmann H., Kobel H., J. Antibiot.; 1989,42: 591-597;
118. Traber R., Hofmann H., Loosli H.R., Ponelle M., von Wartburg A., Helv. Chim.
Acta, 1977, 60: 1568-1578;
119. Traber R., Loosli H.R., Hofmann H., Kuhn M., von Wartburg A., HeI!'. Chim.
Acta, 1982,65: 1655-1677;
120. Van Duyne G.D., Standaert R.F., Schreiber S.L., Clardy J .• 1. Am. Chem. Soc.,
1991, 1I3: 7433-7434; ,
121. Vasquez E.M., Am. J. Heallh-Sysl. Pharm.; 2000.57: 437-451;
122. Vezina C., KlIdelski A., Sehgal S.N., J. Antibioi., 1975,28(10): 721-726;
 r
MEDICAMENTE DE BIOSJNTEZĂ 247

Amicomi
lnhibirori dc monoclonali
Illhibllttri (It: rcverslmnscripwtfl
IMI' dchidrm.~e:la7J\" ~--.--, Intcrtcroni

luhihiton
de protcuză

lnbibinn i de IlIhihllllll (Il·

Capitolul VII Inhibiluri de ncunnninidazn Af)N f"!olilllcml{

AIJN pohllu:ra/fl
'lIhihiluli al luhihitori de
BIOTEHNOLOGIA ANTIVIRALELOR fUZIUlll1 I tv1 l' dchidrt'1;Cllill11

1',1'10 2004

Adnotare : aria fiecărei clase este proporţională cu numărul de medicamente aprobate (4

medicamente În 1990 şi 40 medicamente în 2004)
Obtinerea medicamentelor antivirale nu a avut un succes atât de mare, ca În
cazul antibioticelor, Întrucât distrugerea virusuri lor (ce sunt paraziti intracelulari) . Figura n r, 54 Medicamente antivirale aprobate de FOA in 1990 şi 2004
nu se poate realiza fără a afecta şi celula gazdă. De aceea, descrierea pentru
prima dată (de către A. Jsaacs şi J. Lindenmann În 1957) a interferonilor umani genetice (ARN~ADN~ARN~proteine). În figura Ilf.55 (adaptată după L.
ca posibile substante antivirale a reprezentat piatra de temelie În dezvoltarea Profire, 2002) se poate observa ciclul de replicare al virusului HIV şi enzirnele
viitoarelor substante active din această clasă. Ulterior, interferonii au fost dezvol­ implicate În acest proces.
tati pentru tratarea hepatitei B şi mai recent a hepatitei C (interferoni PEG-ilati Celula ga7.<J[,

---------------------:-~4" QD
asociati cu ribavirina).
Mai târziu, a fost dezvoltat primul analog nucleozidic - idoxuridiua (8.
Prusoff, 1959), care inhibă o serie de virusuri ADN, În special HSV (herpes 6

simplex virus).
I
rcccpnu

J
»> ! ~~": !
'.-
>- 1
Q-r
Până în 1990, erau utilizate ca antivirale doar câteva substante active (arnan­ .,/
.". I\J{N

tadina , ribavirina, aciclovirul şi derivaţii săi, azidotimidina), ce erau indicate în \'11"111

tratamentul infecţii lor virale cu virusul influenza, v irusul RSV (respiratory AliN
vlrill
CllIl1plc\
I\RN-AON 1,.' proviral
. . __! .••••. _- •.
pn1lCII1C
\'Irllk:
7 x
syncytial virus), virusul HSV (herpes simplex virus) şi virusul HJV (human IIiV ARNIII

immunodeficiency virus).
De atunci şi până astăzi Încă aproximativ 35 de medicamente antivirale au fost
aprobate, pentru combaterea infecţiilor virale. O diagramă a descoperirii acestor
antivirale se poate observa în figura nr. 54 (adaptată după R. Rappuoli, 2004).
Datorită incidenţei din ce în ce mai mari a infecţiilor cu virusul HIV, cercetările
s-au Îndreptat spre descoperirea de antivirale active În tratamentul SIDA.
Virusul HIV este responsabil de sindromul imunodeficienţei dobândite umane
- SJDA - afecţiune ce se caracterizează prin supresia cronică a funcţiilor imune
_--
vnul
Figura IIf. 55 Ciclul de replicare al virusului HIV
l.egendă : RT = revers transcriptază ; RN·aza = ribonucleaza ; J-<lza = inregraza ;
P-aza = proteaza : 1._- _~.Qpr:!!!~t;A_Yi.rul;uJ_l!i_!-IIV la membrana cdulei gaztl.ă; 2 - ~~a
capsidei : 3.4 .::-~'il.mcza..AD1'J..:..l_I.l~i_pr<!vir?J_r~r.i.!!.~~.llii!!!:~.Iic: 5 - Pl!Jrun_Qc;!~t:l!.~DN-ului
provir:;tl in nucleul celulei gazdă; 6 - integrarea ADN-ului provirul în cromozomul gazdă;
7 -:: 'Iriiri~~Ci"iplia ADN.:umTfrroviral 8 - Trmlsii,\i"ii7\RNiii-vifITriiq5lOleTffi:--vTralc;'-CŢ-=-maturarea

şi creşterea concomitentă a susceptibilităţii aparitiei infecţiilor oportuniste şi a _._.~~-_. _._.-_-_

vin.isiiTliT;-Rt:-elibefiire;ivÎrusuilii din 'ceiula'gazd~-:aPtP-eniru~i1iifectaiirte-ct:lule. --.----.- .
. .. - .. _ .• __
..__ ._---- .'--".-. .'--
tumori lor.
Virusul HIV este un retrovirus, care infectează limfocitele T4 helper, macro­ După pătrunderea virusului în celula gazdă, AR.,N-uJ y_iral va servi ca model
_!~eIe--şT <:~uieÎe_.5!:!_ldr~ilce.~lUItipl!care~~iUsutl1Îeste-depell0EntlCde'- I:-~~ers­ pentru sinteza unui ADN complementar dublu catenar (ADN-'proVifall-;-"suo
-transcripază (RT) , o enzimă capaoi"!a-să aSiguretli.ixil]-iI1Versa1--mformaliei ăqiUI-;-ea'~nziI~ei RT. Îr;~~.!!!a.· tra~~iQJieC_şUnlnslaiI~l_~estui ADN proviral
._-._----.- _- .. _-_._- -_._.~'. ---.---._--------,_ i . -- ------------.-

i:
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 247

Anticorpi
lnhibitori de mouoclouuli
lnhibitcri de revcrstrunscriptază

lulubitori de luhihitori de
Af)N pnJillll!lir/.!
Capitolul VII Inhibitor! de
AI)N polimcrnză
tnhibitori lnhibnori de

BIOTEHNOLOGIA ANTIVlRALELOR 1990

fuziutui IMi> dchidrogcnază

2(I(J4

Adnotare: aria fiecărei clase este proporţională cu numărul de medicamente aprobate (4

medicamente În 1990 şi 40 medicamente În 20(4)
Obtinerea medicamentelor antivirale nu a avut un succes atât de mare, ca În
cazul antibioticelor, Întrucât distrugerea virusuri lor (ce sunt paraziti intracelulari) Figura nr, 54 Medicamente antivirale aprobate de FDA În 1990 şi 2004
nu se poate realiza fără a afecta şi celula gazdă. De aceea, descrierea pentru
prima dată (de către A. Isaacs şi 1. Lindenmann În 1957) a interferonilor umani genetice (ARN~ADN~ARN~proteine), În figura nr. 55 (adaptată după L.
ca posibile substante antivirale a reprezentat piatra de temelie în dezvoltarea Proflre,'i002) se poate observa ciclul de replicare al virusului HJV şi enzimele
viitoarelor substanţe active din această clasă. Ulterior, interferonii au fost dezvol­ implicate în acest proces.
taţi pentru tratarea hepatitei B şi mai recent a hepatitei C (interferoni PEG-ilali Celula gazda

asociati cu ribavirina).
Mai târziu, a fost dezvoltat primul analog nucleozidic - idoxuridina (B. ._----------------".
Prusoff, 1959), care inhibă o serie de virusuri ADN, În special HSV (herpes
simplex virus).
receptor .>: ee'I:~I~~~:'~"~I,\
5.i
~_6_ •.)_
. .1",,,
1 ,':"":'1' ,,
1 .10 fŢ")
".L.J
I I ~
f'.., r.,," • / •. -... ' •
1 J V ~ ,..l ,\RN
Până În 1990, erau utilizate ca antivirale doar câteva substante active (am an­ r-, / 3 I·,w' ~ .'UN ",,1
tadina, ribavirina, aciclovirul şi derivaţii săi, azidotimidina), ce erau indicate în
tratamentul infecţiilor virale cu virusul intluenza, virusul RSV (respiratory 05virus
2
. _- .•.•• : ,
V
"',

',.\'
:
... _.....-

AltN
ItT
_.... •
eumpb
-_
It 1
ItN·",", ~
?< ---
ADN
"",,,,,1
- R.
~ '''''''',,'
»«'1-,~
~~d,
AI:~, 7
• __ ._

AI'Nm
! ~
k
l)nlICIlIC
,,,.,
./

<... .____~---_._-, ---------~

' "",,1 ARN ,\LlN, I "",,1 __...-/
syncytial virus), virusul HSV (herpes simplex virus) şi virusul HIV (hurnan III\'

immunodeficiency virus).
De atunci şi până astăzi încă aproximativ 35 de medicamente antivirale au fost
aprobate, pentru combaterea infectiilor virale. O diagramă a descoperirii acestor
antivirale se poate observa În figura 11f. 54 (adaptată după R. Rappuoli, 2004).
Datorită incidenţei din ce În ce mai mari a infecţiilor cu virusul HIV, cercetările
s-au Îndreptat spre descoperirea de antivirale active în tratamentul SIDA.
Virusul HIV este responsabil de sindromul imunodeficienţei dobândire umane
- SIDA - afecţiune ce se caracterizează prin supresia cronică a funcţiilor imune
şi creşterea concomitentă a susceptibilităţii aparitiei infecţiilor oportuniste şi a
----
Figura nr. 55 Ciclul de replicare al virusului HIV
Legendă: RT = revers transcriptază ; RN-aza = ribonucleaza : l-aza = integraza :
P-aza = proteaza ; l_- i~~I!!'!.r~Slllui HIV la meml~rana cclu_!<!i gazdă; 2 - <!_t:.!la.~a
capsidei ; 3.4 .=.şint.aa.AD.li:..l!.!0_~r()~il:~_p-r.\~1.~~ţ.rstra~!i~0c: 5 - Pi~Y:..l!!~~I~_!-DN.ului
'proviral în nucleul celulei gazdă; 6 - integrarea ADN·ului proviral În cromozomul gazdă:
7 ., iranscfip\iaADN='lilwpfovirat 8 - t';:mlsfaTIilARNiiî-vifi'l] 'îîfffroTeiîfc"vifâl-e-;-9--;:-maturarea
virusiitw; -ilr::: 'cliberarc:lvirusufiii din ceTul~-gizdri:aiJlij'emru3inlecraaTrndule, -
_.- •..... - __ . __ ._--_ ~ _.. ~~ -_._ _---_ _.~-----------_._--_._-~..

tumori lor.
Virusul I-IIV este un retrovirus, care infectează limfocitele T4 helper, macro­ După pătrunderea virusului în celula gazdă, ARN-lll viral va servi ca model
fage le ŞI c-eîufefe dendrltlce. NlUltl pI1carelr-v1t1fsUlrrIeSte"ctepen(feÎltâ"de' ~e'V-ers­ pentru sinteza unui ADN complementar dublu catenar (AON-'pf(')viralrJUD
',Ii
----=-tra-riscrlp·ază-(RfY:-o'enzimă-c'apaoITă'să aSigure t1uxliTlilvers~t-infonrraliei act[u~-ea-'e~2:ilnei RT.l~ _~~iJ1~.~t~i~~~~fPi~L~Lt~ir;lat~e" acestui
_ ... _- ."_. ....ADN
.•. proviral _
" __ . '--'~-' .. .. ~.-._
' ~._._~ . -~. _- __ . -._----_. __ .-.. __ .-_
- -. il
,i i~

::11 1
1,1;:!11
 TI "r
I

248 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

I MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 249

complementar ~~ ţorme~~ ~gl':L~~~~!_ŞLQr_Q~~~~_~i@le. Virusul_:;~_~ază

sub'acihinea prot~a!:t?L~!~ste eliberat din celula gazdă, fiind apts~ i.J1f(!.c:~z~.alte
-celiiÎe~'-"'-'" .---..- - - -.. - - -- '.. " .--.'- - __ . , ~~~.\!~i.:~~ ~r~~~; , . ;:;:~~~~,'~,I 'iH~~~:;ţr~ • AniJ~ puner_ii pe "
I < <::i"p~~~?"';"
---Terapia antiretrovirală se realizează a~t~zi cu inhibitori ai RT, ai proteazei, ai lnhibitori de reverstranscriptază
inregrazei etc., şi este eficientă în raport cu p;"oce~rt~Tşi duratainhibă~iir~pllcării Lamivudina şi Zidovudina Combivir I GlaxoSmithKline I septembrie 1997
virale. Monoterapia c~~a~?__!_~istentă şi pierderea eficacităţii, datorită uriaşei Abacavir sulfal Ziagen I GlaxoSmilhK.line I decembrie 1991:l
încărcături vii-ale, a timpului scu'1deihjiilliă'iÎÎflrearvirusuluişipredispoziţiei de Didanosina
a genera mutatii. Recomandările actuale sunt de a administra concomitent trei Videx EC [Bristol Myers-Squibbl octombrie 2000
(cp, enterice acoperite)
medicamente antiretrovirale, care pot produce o inhibare completă şi durabilă, Abacavir, Zidovudina şi
deşi gravele efecte adverse ale acestor asocieri sunt cauza majoră a eşecului Trizivir GlaxoSmithKline noiembrie 2000
Lamivudina
terapeutic. Tenofovir disoproxil
Cercetările pentru descoperirea de medicamente selective antiretrovirale antiHIV Viread Gilead Sciences octombrie 200 1
fumarat
s-au axat pe studiul enzimelor ce intervin în replicarea virală. Cea mai cercetată
Emtricitabina Emuiva Gilead Sciences iulie 2003
enzimă ca ţintă pentru viitoarele medicamente este reverstranscriptaza_(B-J)._.ţ.l}Zima
Abacavir şi Lamivudina Epzicom GlaxoSmithK.line august 2004
_este-ne-c.e..ş1lr..[.r~pli~ij_r..ii
virusului HIV, catalizând conversia ARN vinil intr-o c~p;e
~Dt-LQ!:'.~l!:l.,_C:~ţ~mară.--- '- ,,--.--.-. -- - --"- -------------------- -~-- Tenofovir disoproxil
Truvada Gilead Sciences august 2004
fumarat şi Emtricitabina
Dintre inhibitorii replicării virusului H1V, ce au ca ţintă RT virală, sunt:
azidotimidina (zj9..Q.y'uilina); didanosina; stavudina; abacavirul; lamivudina etc. Non-inhibitori de reverstranscriptază
_împl:ţ!!!!~~.j.!!l_ll,9itQIjj,p~ote~_zei'(saquinavir,' indinavir, rilonavir,-';l~i'fi;~vir, Nevirapina Virarnune Boehringer Ingelheim iunie 1996
amprenavir, lopinavirj.jcu ceiai f!l_zi.unii(enfuvirtida), cu cei ai intrării în celulă Delavirdina Rescriptor Pfizer aprilie 1997
(maraviroc) şi cu cei ai integrazei (raltegravir), inhibitorii revers-transcriptazei Elavirenz Sustiva Bristol Myers-Squibb septembrie 1998
marchează un nou pas în terapia SlDA, ajutând astfel la scăderea incidenţei Etravirina I lruelence I Tihotec Therapeutics I iunie 2008
acestei maladii.
Pincipalele medicamente antiretrovirale , active asupra virusului HIV, existente [ Inhibitori de protează I
pe piata farmaceutică, sunt prezentate în tabelul nr. 34 (adaptat după S. Broder, 2010), Saqumavrr mesuat mvirase IlolTmann-La Roche decembrie 1995
Ritonavir Nurvir Abbou Laboratories martie 19%
Tabelul nr. 34 lndinavir Crixivan Merck martie 19%
Medicamente antiretrovirale utilizate în terapia SIDA
Agouron
Nelfinavir mesilat Viracept martie 1997
" Pharmaceuticals
'Dentiinire" " ,', Companili' .- ,. ~ An!ll, puneril pe
." .~n~e -spbstantă
. , ":>:.~ ~ . .' 'C?~'ţr~ia~ă, ,~. prod,Ui:.iiJ~~!~'·:·, ':::1):/:;
piată ~, ,
Amprenavir Agenerase GlaxoSmithK.line aprilie 1999
y:
.~'I:'~'
Lopinavir şi Ritonavir Kaletra Abbou Laboratories septembrie 2000
Inhibitori de reverstranscriptază Atazanavir sul fat Reyataz Bristol-Myers Squibb iunie 2003
Fosamprenavir calciurn Lexiva GlaxoSmithKline octombrie 2003
Azidotimidina Retrovir GlaxoSmithKline I martie 191:l7
Tipranavir Aptivus Boehringer Ingelheirn iunie 2005
Didanosina Videx Bristol Myers-Squibb] octombrie 1991
Darunavir Prezista Tibotec lnc. iunie 2006
Zalcitabina
(nu se mai comercial izează Hivid Hoffrnann-La Roche I iunie 1992 lnhibitori ai fuziunii
din decembrie 2006) Hoffmann-La Roche
Stavudina Zerit Bristol Myers-Squibb iunie 1994 Enluvirtida Fuzeon martie 2003
şi Trirneris
Lamivudina Epivir GlaxoSmithKline noiembrie 1995
1
I>~

"

I~
r
,.d,",~,
 "il
I
250 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 251

Are o biodisponibilitate orală bună (85 %), o acţiune de lungă durată (T 1/2 în
limfocitele din sângele periferic este de 10-15 ore) şi o eliminare renală sub
formă nemodificată. Prezintă reactii adverse mai slabe decât ale altor anti­
Inhibitori ai intrării (antagonişti ai co-receptorilor CCR5) retrovirale, care apar la doze mari (tulburări gastro-intestinale, cefalee, astenie,
erupţii etc.), Nu determină afectarea măduvei osoase, reactie adversă observată la
alte antiretrovirale .
Inhibitori ai integrazei ../'Lamivudina a fost aprobată de către FDA, În noiembrie 1995, pentru utilizarea
in
}
tratamentul adultilor
,
şi copiilor infectaţi cu virusul HIV, alături de zidovudină
~-:şi/sau abacavir. In aceste combinaţii întârzie apariţia rezistenţei la zidovudină la
Asocieri din clase diferite . pacientii ce nu au luat tratament antiretroviral anterior.
Efavirenz, Emtricitabina, Este activă şi În tratamentul hepatitei cronice B, tiind utilizată ca EPIVIR-HVB.
Bristol-Myers Squibb Este comercializată de compania Glaxo Wellcome, căreia i-a expirat patentul
Tenofovir disoproxil Atripla iulie 2006
şi Gilead Sciences pentru lamivudină În august 2009. De la lansarea sa În 1995 lamivudina a
fumarat
reprezentat cel mai bine vândut medicament din lume pentru terapia SIDA, având
vânzări de sute de milioane dolari/an (430 milioane dolari ÎlI 1996).
VII.1. Antivirale active asupra virusului HIV
Produse farmaceutice:
vn .1.1. Biotehnologia lamivudinei ZEFIX (Glaxo Wellcome - Anglia)
cp., 100 mg
sin: 3TC sol. uz intern 5 mg/rnl
EPIVIR (Glaxo Wellcome - Anglia)
C8H"N303S
cp., 150 mg
Mr = 229,26

l'1
w~
sol. uz intern 10 mg/rnl
EPIVIR-HVB (Glaxo Wellcome - Anglia)
cp., 100 rug. 150 mg
COMBIVIR (Glaxo Wellcome - Anglia)
~'N/I cp. filmate 150 mg lamivudină + 300 rng zidovudină
TRIZIVIR (Glaxo Group Ltd. - Anglia)
HO/""(o): cp. filmate 150 I11g larnivudină + 300 mg zidovudină + 300 mg abacavir
KrVEXA (Glaxo Group Ltd. - Anglia)
s-- cp. filmate 300 mg lamivudină + 600 rng abacavir sulfat

Proprietăţi fizice; chimice, farmacolgice ,Ţehnologi'll}a€l5iimnleză a lamivudioei

Se prezintă ca o substanţă cristalină (cristale obţinute din etanol), cu p.t. = 160-
162oC. Este solubilă în apă, în proportie de 70 mg/rnl la 200C. Prezintă izomerie
optică, enantiomerullevogir (-) având activitate terapeutică mai mare şi toxicitate
mai mică.
Este un analog nucleozidic al citidinei, care se activează hepatic prin fosforilare,
formând 5' -trifosfatul, metabolit ce inhibă RT virală. lnhibă şi ADN-polimeraza viru­
sului hepatitic B, având Însă afinitate redusă pentru ADN-polimeraza celulelor gazdă.
Amestecul racemic de lamivudină (BCJ-[ 189) a fost sintetizat la sfârşitul anilor
'SO de către compania BioChem Pharma Inc. din Laval, Quebec, Canada, după o
schemă prezentată în figura nr. 56. Acest compus s-a dovedit a fi un inhibitor
selectiv si potent ,II virusului HIV.
-- În 1990 au vândut licenta acestui compus racernic companiei Glaxo Wellcome.
Studiile ulterioare ale cercetători lor de la Glaxo Wellcome au evidentiat că
enantiomerul "nenaturar1!i-L-(-) allamiv3este mai puţin toxic şi m~

i
.
./~ L.
 252 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 253

NH2 notată E. coli 3732E, capabilă să biosintetizeze cantităţi de enzimă de zeci de ori
mai mari decât tulpina naturală. -­
~N -AceSt mutant de E. coli se cultivă În ferrnentatoare, pe un mediu a cărui
. . __::-. --
lNAO compozrţie este:

efoy H
3 etape ehi micc
.-----------)00- HO~(:J s
BCH .189
I
i •
•
surse de carbon 40 g/I ;
pep~l~ 40 g/l ;
j,---, • NaCI 5 gll ;

/
I
I •
--

--
glicerol 50 g/l.
Fermentaţia are loc la 37uC, iar după 24 de ore se filtrează biomasa În scopul
benzoi I-oxi -acetaldehida (amestec racemic) { i~I~~ij-enzim~ ce~~e ~~_t:.§ (lliraceJul!\r)~.~ if.~j-şl!~!~ b.i?~!~!~~ei. -"'- .. ' ... -.-...
Pasta de biomasă celulară rămasă pe filtru (aproximativ 4 kg) se aduce Într-un
Figura nr. 56 Obţinerea amestecului racernic de lamivudină
omogenizator şi se suspendă în 20 litri de solutie cu pH =7,5 ce va liza mem~ana

_._-_-
decât enantiomerul "natural" 1:D-( +) al lamivudinei. Prin urmare, s-a impus
izolarea enantiomerului P-L-(-) şi utilizarea lui ca principiu activ terapeutic. Din
celulară (KH2P04 50 mM, ~
a~c
lmM,J2!! (ditiotreitol) 1 mM, ţ_~u.Lt;_'fiIk.aJ
500 ppm). Suspensia obţinută se centrifughează, iar
~ ~~ obţinut se S2JlC.entrează. Solutia rezultată se c~din nou
1995 Glaxo Wellcome comercializează acest enantiomer al Iamivudinei.
prin centrifugare timp de 1 h, după care se imobilizează en~~~la.
Separarea enantiomerilor se realiza~~ilia~~utor,!1 HPLC-ului, Însă metoda Prin prelucrarea celor 4 kg de masă celulară se obtin aproximativ 150.000
nu permitea obtinerea unor cantităţi mari de P-L-( -) lamivudină şi nu putea ti unităţi de citidin dezaminază (1 unitate = cantitatea de enzimă necesară dez­
aplicată la scară industrială. aminării a 1 umol de citidină/minut, la 25°C).
În urma cercetărilor intense (M. Mahmoudian el al., 1993) s-a pus la punct o La nivel industrial se poate renun a la cele două .!:_!'!Q.e de cla~ prin
tehnologie ce utilizează o enzimă s ecitică care poate realiza separarea enantio- centrifugare, extractul crud fiind direct imo ilizat, când se obtine un preparat
.,.....,.- _ __.,. --
merilor prin" e--I;1I11arearaeemicuitinfigura·-nr. 57). .. .. . . . :;:::s enzimatic suficienr de stabil. - ,."""",,,., . "~"''''''
Enzima se imobilizează pe un suport solid, robust şi stabil de ~Ei.Îpi&ifQ.
1:
lNAO citidin ~)
NH 2

i
("NH
I'NAO
Granulele de Eupergit C au dimensiuni de 150 um, sunt hidrofili& ŞI contin
grupări reactive epoxidice, care vor !~ga covalent citidin dezarninaza.
Extractul ce contine enzima se aduce peste granulele uscate de Eupergit C
(100 mg proteine/g polimer) şi se Iasă în contact la temperatura camerei, la
dcz..aminază pl-l =7,5 agitând din când În când. În primele 48 de ore se imobilizează cea mai

HO\~j -----_ ... _~

(E ,.• ,1;) HO/" (o '
s-.)
+
HO\__) O~
mare parteaJi1e~zuilă:-li1Sr;unt necesare 140 de ore (timp total) pentru o
irnobilizare completă.
BOI I H9 După ce imobilizarea este completă, granulele de Eupergit C sunt spălate cu
IH.-(·) lamivudină (+) annlogul uridinic
(amestec raccmic) o solutie complexă (TJis=l:lQ (c1orhidrat de hidroximetil-aminometan) 100 mM +
EDTA I mM + DTI I n~M + esterul etilic al acidului p-hidroxibenzoic 500
Figura nr. 57 Dezarninarea amestecului racernic al larnivudinei -- .--- .---.------- ·-·"---·-c----~~_·,·_·_~ _....
ppm) care conţine şi 0,5 M ~şi are pH=7. Prin spalare este îiidepărtată
enzima ce nu s-a imobilizat ~rămas În supernatant. Granulele ce contil~~~~
Enzima,~ezamiDâ;!l se obtine prin fer~entaţia submersă a unor tulpini
imobilizată se păstrează la~~intr-o sol!:!.t.k ce are compozitia celei cu care se
~utante ddjEfi./ţ]lf€JjfiitfQUf{ =-. -- u_._~ ~~ima imobilizată, fără adaos d~NaCI.
Enzima este produsă În mod natural de o serie de bacterii enterice ca: Esche­ Separarea enalltiomeI_il0L~.<; realizează industrial În fermentatoare de 780 de
tichia coli, Salmonella typhimurium etc. Pentru a obţine c~mă litri""în care se 'aduc :' - -. _.. " '.- - 7"_,.
s-a realizat v~ şi ~lJJ2~ea ~:! r~sponsabi~~~J:>~~a citidin , ~ 3 kg de amestec racemic de larnivudină ;
dezaminazei şi s-a inserat În E. coli, obţinându-se astfel o tulpină recombinantă,
--------- ",
.;

r
:, I~
,1l.:dr&,
 '?)T"!{!f

254 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 255

);> 30.000 unităţi de ~a imobilizată pe granule de E~ergit C IFcrmenlaţia tulpinilor deE. coli

);>
(obţinută prin fermentaţia tulpinilor mutante de E. colI3732E);
500 litri de ~1J2lex~ ce are pH =7 (menţinerea pH-ului constant se
L 370C,24h

realizează prin adaos de solutie de acid acetic 20% v/v).

Procesul de dezaminare şi deci de ~re a enantiomerilor are loc la 320C şi Izolarea enzimei citidin dczaminaza
începe imediat.~deră a fi terminat atunci când se atinge un gruade pH = 7,5, sol. complexă
~all3-L-(-)~ei acceptabil, adică ee >99,5% (sau când se
constată o alcalinizarea a mediului datorită eliberării arnoniacului).
~zima .imobilizată se ~~ă prin filtrare şi este r~ă de aproximativ 15
ori. Intre două cicluri de utilizare, enzima imobilizată se păstrează la~
___ c·
Imob~li_:area enzimei pe EUpergit-~
J
Iniţial, când activitatea enzimei este maximă, separarea enantiornerilor durează
aproximativ 35 de ore, însă timpul creşte până la 70 h odată cu scăderea activităţii
[
---------r---.- -· --
pll-7.5, l. cam., 140 h __

tă du ă se ararea enzirnei se aduce la p~~u ~ şi se ~iocon~rsia rac~~;~~~~:lui de lamivlIdină-l

J
trece peste o coloană cu răsini schin1bătQcU:e de ioni tip Duolite AI13. Analogul
uridinic (+) este retinut pe c()io~iC ia~amivudinâ} rămâne .în solulk şi
se colectează la partea inferioară a coloanei.
S~-) lamivudină se aduce la pH=7,5 cu H2S04 concentrat şi se
------r=-- --.- ---
l__ pl-l = 7, 32 (le 35-70 h

--·- -- -r--·---~
trece peste o altă coloană cu răşl!lă tip XAD16:carel'ixeaz[[ţ=(::) lamivudina. ~;OI<U·~~-;~~rificarea fl-L-( - )-laJl~ivl.ldinei
Se ~ cu un amestec 33% v/v as:_etonă În ~. L (pH = 10,:')
Fracţiile ce conţin I3-L-( -) lamivudina se concentreaza într-un evaporator cu peli­
culă, după care se ~pentru a cristaliza co~ ~~uspensia sub vid.
Astfel se pot obţine aproximativ 1,15 kg I3-L-(-) lamivudină (EPIVIR), de
puritate peste 97% şi ee=99,8%, cu un randament global de 76%.
Fluxul tehnologic de obtinere a 0-L-(-) lamivudină poate fi observat în figura Duolite AI13
nr. 58.
l-·-
VII.] .2. Biotehnologia abacavirului
~GH = 7,5

C14HI~N60

HN?
M, = 286,33 XADI6

lYN ------r---·--
~"--------:'I
1_~oncel1trnre şi cristalizar:J

I3-L-( -)-Lamivudina

Figura nr. 58 Fluxul tehnologic la prepararea f:l-L-(-) lamivudinei (EPIVIR)

,:l
~~. \\:
 '.-;;

"r"
I
256 CĂT'\UNA DANlELA SlAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 257

A fost aprobat de FDA în decembrie 1998, tiind cel de-al 15-lea medicament
antiretroviral. Este comercializat de compania GlaxoSmithKline, căreia i-a expirat Tehnologia de biosinteză a abacavirului
patentul pentru abacavir în decembrie 2009. Ca urmare a cercetărilor intense ale cercetători lor de la Glaxo (M. Mahmoudian,
2000), obtinerea abacavirului se poate realiza prin parcurgerea a câtorva etape
Proprletăţi fizice, chimice, farmacolgice chimice. Sinteza pleacă de la o y-lactamă N-substituită, ce este un amestec
Pulbere solidă, aibă, cristalizată din acetonitril, cu p.t. = 1650C. La 250C şi racemic, din care se izolează enantiomerul (-) (1 R, 4S) ce se va transforma
pH =7 este solubilă În apă În proportie de 80 mM. Într-un amina alcool care parcurge alte 7 etape chimice, la finalul cărora se obtine
Din punct de vedere structural este un analog nucleozidic carbociclic ce are În abacavirul (figura nr. 59).
pozitia 6 a nucleului purinic un radical ciclo-propil-amino, iar componenta
glucidică este substituită cu un radical ciclopentenil.
Este un analog al guanozinei (nucleotidă purinică), ce acţionează prin inhibarea
enzimei RT.
Administrat oral are o biodisponibilitate bună (83%), se metabolizează hepatic
O~~70COc(CH3)3

4S,,=_) IR
câteva etape
chimicc....
\01
HO

4S =' IR
NH2
câte "a etape
chimice ••..
are T1/2= 1,5 ore. Se elimină renal (84%) şi prin fecale (16%), mai ales sub formă
de metaboli ti. (-) (IR.4S) tcrţ butiI3-oxo-2-azabiciclo
Este bine tolerat, principala reactie adversă tiind hipersensibilizarea, care apare (2.2.1.)hcpt-S-2-c<u·b()xilat arnino alcool
la la % din populatie şi poate fi severă, chiar fatală. De aceea, FDA a recomandat
în iulie 2008, realizarea unui screening pre-terapeutic, care să evidenţieze pacientii }~~
cu risc de a dezvolta hipersensibilizare la abacavir. Această pre-testare se reali­ HN
zează printr-un screening farmacogenetic al variatiei genetice umane cunoscută
sub denumirea de HLA-B*5701. Prezenta acestor alele este asociată cu hiper­ N_ .l,
sensibilizarea la abacavir, deci acei pacienti nu vor putea primi abacavir.
Se indică în tratamentul infecţiilor cu HIV, doar în asociere cu alte anti­
HO
""î
< N---
-l '"A N

retrovirale. Este un medicament de linia a 2a, utilizat la pacientii care nu mai pot
beneficia de antiretrovirale de primă alegere.
l------ --...,J N 'NH2
\'" -1
Produse farmaceutice:
(-) abacavir
ZIAGEN (GlaxoSmithKline - Anglia)
cp. filmare, 300 mg Figura nr, 59 Schema reactiilor de obtinere a abacavirului
sol. orală
TRIZIVlR (Glaxo Group Ltd. - Anglia) Racemicul I (± j-terţ-butil 3-oxo-2-azabiciclo(2. 2.1. )hept-5-ene-2-carboxilatJ
cp. filmare 300 mg abacavir + 300 mg zidovudină + 150 mg lamivudină este o y-lactamă N-substituită. Cu ajutorul unor enzime hidrolitice specifice se
KIVEXA (Glaxo Group Ltd. - Anglia) poate obtine enantiomerul (-) (1 R, 4S) al y-Iactamei N-substituite, de la care se
cp, filmate 300 rug larnivudină + 600 mg abacavir sulfat pleacă în sinteza abacavirului (figura nr. 60).
EPZICOM (Glaxo Group Ltd. - Anglia) Acest enantiomer se obtine cu ajutorul unor acilaze ce hidrolizează enantioselec­
cp. tilmate 300 rng lamivudină + 600 mg abacavir sulfat tiv legătura lactamică, eliberând astfel enantiomerul dorit. Astfel de enzime sunt:
./ subtilisin carlsberg, comercializată de compania Altus;
./ endoproteaze serinice izolate din tulpini de Bacillus sp. (Neutrase, Novozyme
243, Alcalase, Savinase, comercializate de companiile Altus sau Novo) ;
 .,,_

258 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 259

°"a0COc(CIIJ)3cnZim~

-
-"d~D~'
iw~ltă
C~lI-;-ltlUl-'-·
Baciţtns sp.
dTc-'
-~ 4SOIIl
o~rOCOc(CH3)3
+
VII.2. Antivirale active asupra virusurilor gripale

VII.2.1. Biotehnologia zanamivirului

(+ ,ter!-butil J-oxo-2-azabiciclo (-) (1 R, 4S) terţ blltiI3-oxo-2-a;'1lbiciclo
(2.2.I.)hcpt-S-cnc-2-carboxilat (2.2.1.)hcpt-5.2-carboxilal
sin: GG-167, GR-121167X
Hooe_ !'I0COC(CIJ3)J
C12H2UN407
;'RO~~ Mr = 323,31

t1
HO
----""",:--1OHH
Figura nr. 60 Transformarea biochimică a amestecului racemic
de v-Iaciamă N-subslituită
HO" "o .. ·0 O
j"
HN- --C
./ lipaze-CE obţinute din culturi de Humicola lanugiuosa, comercializate de Amano; H3C ---C/ .__ 'OH
./ proteaze-M obţinute din culturi de Aspergillus sp., comercializate de Amano ; ~
./
./
acilaze obţinute din culturi de Aspergillus sp., comercializate de Sigma;
esteraze extrase din ficat de porc, comercializate de Altus ; ° NH
I
./ lipaze pancreatice porcine, peptidaze (Flavorpro-192), glutaminaze (Flavor­ HN"""C--- NH2
pro-373); endopeptidaze (Promod-TP), comercializate de Biocatalysts;
../ PEG-lipaze izolate din glande salivare de vitel, comercializate de Amana. Compania Biora (Australia) a initiat un program de dezvoltare a agenţilor
Se lucrează preferenţial cu endoproteaze serinice (Savinase - Novo), întrucât antivirali prin design-ul rational (rational drug design). Ca urmare a acestor
acestea realizează o conversie foarte bună a racemicului În enantiomerul dorit, iar cercetări s-a descoperit în 1989, de către M. von ltzstein (Victorian College of
procesul se poate aplica industrial având randarnerue superioare. Pharrnacy, Universitatea Monash, Melhourne, Australia), În colaborare cu cerce­
Enzirna se obtine prin ferrnenraţia subrnersă a speciilor alcalofile de Bacillus tătorii de la Glaxo, zanamivirul. Este primul inhibitor de neuraminidază desco­
sp., după care se imobilizează pe suporturi solide pentru a putea fi refolosită. perit, fiind un analog al acidului sialic (acid N-acetil neurarninic - NANA).
Tulpinile de Bacillus sp, sunt modificate genetic, pentru a avea randamente Biota fiind o companie mică nu a putut suporta costurile de punere pe piaţă,
superioare În enzimă.
prin urmare zanamivirul a fost patentat de către GlaxoSmithKline În 1990. În
Hidroliza enantioselectivă a racemicului de y-lactarnă N-substituită (1 mg/l) şi 1999 FDA a aprobat punerea pe piaţă a zanamivirului, care a reuşit să acapareze
formarea enantiomerului (-) (IR, 4S) al y-Iactamei N-substituite se realizează la doar 25 % din piata antiviralelor utilizate În tratamentul şi profilaxia gripei de tip
30oC, în prezenta unui tampon rasfat (pl-l =8) şi a unui mediu format din apă şi
A şi B (oseltamivirul având un succes comercial mai mare).
tetrahidrofuran în proportie de 50% v!v. Raportul enzimă: substrat este de 25: 1,
Zanamivirul este cornercializat sub licenta lui GlaxoSmithKline, care plăteşte
ceea ce Înseamnă o concentraţie finală a enzimei de 25 mg/ml.
companiei Biota 7 % din vânzări, pentru contribuţia la dezvoltarea substanţei
Procesul enzimatic durează aproximativ 2 zile, iar după o conversie de 51 %,
active.
se filtrează amestecul pentru izolarea enzimei. Filtratul clarificat se aduce la
pH=9, iar enentiomerul (-) (IR, 4S) al v-lactarnei N-substituile se extrage de
Proprietăţi fizice, chimice, farmacolgicc
două ori cu ciclohexan,
După evaporarea solventului se obtine enantiomerul (-) (1 R, 4S)-teq butil Se prezintă sub formă de cristale incolore, cu p.t. =256°C. La pH fiziologic este
3-oxo-2-azabiciclo[2.2.I]hept-5-ene-2-carboxilat, ca o pulbere de culoare albă, un zwitterion. Are o solubilitate în apă de 18 mg/1111, la 20°c_
ce se utilizează În continuare la obtinerea abacavirului. Este un analog al acidului sialic, ce se leagă de neuraminidază şi Împiedică
Procesul decurge cu un randament de 85 %, iar enantiomerul este de puritate eliberarea virusului din celula gazdă precum şi răspăndirea lui de la o celulă la
optică ee>99,8%. alta. De asemenea inhibă replicarea virusului atât in vivo cât şi in vitro .

10
1)
~-'::;-':=-=-'""='"~-'-'~"'='"=-~""'"""~~---'-----~
 TI
260 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEI)ICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 261

Are o biodisponibilitate orală mică (2 %), administrându-se doar inhalator sub

formă de pulbere uscată. Se acumulează în proportie de 15% la nivelul tractului
respirator, are un T 112 =2,5-5,1 ore şi se elimină pe cale renală.
Se indică în tratamentul şi profilaxia gripei cu virus A şi B. Recent s-a arătat
H01}-
HO'···· O
.
__~
OH cpimcrizarc
. . .-
HO~
HO'"
-O
\ OH
piruvat
aldolaza

că tulpinile virusului gripal H5N 1 rezistente la oseltamivir, sunt sensibile la

I ····NH
HO NH
HO /
zanarnivir, ceea ce demostrează avantajul zanamivirului fată de oseltarnivir. I o=C",
CH3
O=C
/
Este bine tolerat, nu trece în circulaţia sisternică şi nu a determinat Încă "'CH3
apariţia tulpinilor rezistente de virus gripal. Are rar reactii adverse, deşi s-au I N-accl i I-D- gl ucozami na Nvacct il-Dvmanozarni na
raportat unele probleme respiratorii la pacienţii cu astm sau afectiuni pulmonare i (NAG) (NAIVI)
obstructive cronice.

Produse farmaceutice:
RELENZA (GlaxoSmithKline - Anglia) OH HO---""'-..
pulbere pentru aerosoli , 5 mg

.: (-O
HO~ ... _/ H

Tehnologia de biosinteză a zanamivir-ului HO C P HO"t

H-
>~ O
OH
~
9
.') clape HN- ",OH
~N- _)- "'OH
Acidul sialic (acid N-acetil-D-neuraminic - NANA) este cheia sintezei zanamiviru­ H3C ---c\ chimice H3C-""'_C/ --~OH
~._--_. __._-
lui. Schema reacţiilor de obtinere a zanamivirului se.poate observa În figura nr. 61. O NH I HO
NANA se poate izola din materii organice (lapte, ouă, peretele celular al unor
I O
microorganisme etc.), dar cantitătile izolate sunt mici, iar purificarea este dificilă. HN/?c---- NH2
Sinteza chimică a acidului sialic este posibilă, dar presupune o serie de etape acid N-ilcctil-I)-ncurarninÎc
complexe de protejare şi deprotejare şi nu oferă cantităţi mari şi ieftine de Zananuvir (NANA)
NANA.
Figura nr, 61 Schema obţinerii zanamivirului plecând de la N-acctil-D-glucozamină
Cel mai simplu, ieftin şi uşor se obtine cu ajutorul aldolazei, o enzimă produsă
de câteva bacterii. Biomasa obţinută se tratează cu bisulfit de sodiu cu scopul complexării şi
Enzima se obtine prin fermentaţia submersă a unor tulpini mutante de E. coli. îndepărtării excesului de aldolază. Complexarea se realizează în coloane cu
sau Clostridium perfringens. Se preferă tulpinile mutante de E. coli care pot schimbători de ioni în formă de HSO,. Coloanele Se regenerează prin spălare cu
supraexprima aldolaza. La sfârşitul ferrneruatiei se separă enzima (ce este un apă caldă şi încărcare cu ruerabisuttit de sodiu. Îndepărtarea excesului de enzimă
metabolit intracelular) şi se imobilizează pe granule de Eupergit-C. Enzima se mai poate realiza şi prin nanofiltrare (folosind membrane cu diametrul porilor
imobilizată se poate refolosi de cel puţin 10 ori (l0 cicluri de reactii). de 0,55 nm)(W.R. Bowen el al .. 2004). Enzima odată separată se poate reutiliza.
Obţinerea NANA se realizează În fermentatoare cu membrană, de capacitate Pentru a separa NANA se trece filtratul peste coloane tip Duolit A fl3 Plus.
mare. Se aduce în fermentator un amestec de N-acetil-D-glucozamină (NAG) şi Prin eluarea coloanelor NANA trece în soluţie, după care se cristalizează prin
N-acetil-D-manozamină (N AM) în raport de 4 : 1 şi un exces molar de enzimă (de adaos de acetonitril.
5-7 ori). Echilibrul reactiei este îndreptat spre obtinerea NANA, astfel Încât Tot cercetătorii de la Glaxo (M. Mahmoudian, 2006) au dezvoltat o altă
peste 90% de NAM se biotransforrnă În NANA. Procesul decurge la 20oC, la un variantă a procesului enzimatic, care foloseşte un exces rnolar mic de aldolază
pH aproape de neutralitate, timp de 36 h. imobilizată (doar 1,5 %) şi un exces mare de NAM (20% v/v). Procesul enzimatic
La sfârşitul procesului enzimatic se obtin aproximativ 21 g/l de NANA şi mai are loc la 20oC, la un pH =7,5 şi în fermentatoare de capacitate medie.
rărnân netransforrnaţi aproximativ 2 g/I de NAM şi 65 g/I de NAG. Cantitatea de La sfârşitul fermentaţiei se obtin aproximativ 155 g/I de NANA şi rărnân
aldolază rămasă este de aproximativ 56 g/I (M. Mahmoudian el al., 1997). netransforrnaţi aproximativ 13 g/I NAM şi 24 g/l NAG.
 f<."
;
·1'··';
I
262 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 263

Enzima imobilizată se îndepărtează prin filtrare, iar filtratul se concentrează.
Acidul sialic (NANA) se cristalizează direct în filtrat prin adăugarea a 6 volume
de acid acetic. NAG-ul recuperat se poate reutiliza în epimerizare.
Se obtin aproximativ 200 gll acid sialic, care se transformă ulterior prin
metode chimice În zanamivir.
Analogii structurali ai nucleozidelor acţionează ca antirnetaboliţi, perturbând
sinteza acizilor nucleici virali şi deci multiplicarea virusurilor.
Sub actiunea enzimelor celulare vidarabina se fosforilează la 5' -trifosfatul
corespunzător, ce este metabolitul activ in vivo. Sub această formă inhibă ADN­
-polimeraza virală şi o serie de enzime, blocând astfel sinteza ADN-ului viral şi
replicarea virusuri lor. Are un T JI2 =60 minute.
Este activă asupra:

VII.3. Antivirale active asupra virusurilor herpetice );- HSV-I (herpes simplex virus 1);
);- HSV-2 (herpes simplex virus 2) ;
VII.3.I. Biotehnologia vidarabinei ).- VZV (varicella zoster virus) ;
);- EBV (Epstein-Barr virus) ;
sin: arabinoziladenina, adenin arabinozid,· spongoadenozina, ara-A, vira-A );- CMV (citomegalic virus).

C1oHuNP4· H20 Unguentul aplicat dermic se indică în tratamentul keratoconjunctivitelor acute

Mr = 285,26 şi al keratitelor superficiale recurente deterrninate de HSV- 1 şi HSV-2. Se indică
şi În tratamentul herpesului zoster la pacienţii cu SIDA.
Este hine tolerată, dar la doze mari pot apărea reactii adverse de tipul:

NI'
(/l>
-N
anemie, leucopenie,

Produse farmaceutice:
trombocitopenie, neurotoxicitate.

HO~OJ
VIRA-A (Parke-Davis - SUA)
unguent oftalmie 3%
sol. injectabilă 200 mg/ml

p OH
Tehnologia de biosinteză a vidarabinei
În 1950 s-au izolat 2 nucleozide din bureţi recoltaţi din Marea Caraibelor
Tethya crypta - spongotimidina şi spongouridina ce contin o arabinozidă. Aceste
nucIeozide au permis obţinerea unei noi generaţii de analogi nucleozidici anti­
-

virali: vidarabina, citarabina etc.

În 1964 a fost descrisă vidarabina, de către M. Privat de Garilhe şi J. De
Rudder, ca fiind primul analog nucleozidic suficient de netoxic pentru a putea fi
administrat sistemic. Astfel, au putut fi tratate herpesul zoster la pacientii irnuno­
supresati, encefalita herpetică, precum şi infecţiile herpetice ocazionale ale
nou-născuţi lor.
Astăzi, vidarabina se obtine prin cultivarea submersă a unor mutanţi înalt
productivi de Streptomyces antibloticus NRRL 32338. Tulpina originală a fost
izolată din probe de pământ recoltate din Boscotrecase, regiunea Campania,
provincia Napoli, Italia.
Mutanţii sunt cultivati aerob, submers, într-un mediu ce conţine:

• surse de carbon: glucoză, maltoză, laetoză erc., în concentraţie de 0,5-5 % ;

Proprietăţi fizice, chimice, farmacolgice • surse de azot organic: peprone, extracte de grarninee, hidrolizate de proteine,
Vidarabina este o pulbere cristalină aibă, cu p.t. =257-257 ,50C. Are o soluhilitate în concentraţie de 1-2 % ;
limitată în apă (0,45 mg/rnl la 25°C). Se conservă în recipiente bine închise. • surse de azot anorganic: nitraţi, săruri de amoniu etc., în concentraţie de 6 % ;
Din punct de vedere chimic este un analog al nucleozidelor puriniee (ade­ • săruri minerale şi microelemente:
Cu, Zn, Fe în concentratie de 0,1-1 % ;
NaCI, NaHC03, MgSO;, săruri de Co,
.,
nozina), în care componenta glucidică este p-D-arabinoza.

i·
:;1
...·'."1:,'
 ·~'W1';
I
264 CĂTĂLIN A DANIELA STAN
• CaCO) pentru mentinerea pH -ului În limite normale, în concentraţie de 0,25 % ;
• antispumanţi : uleiuri minerale cu mono- şi digliceride.
Mediul de cultură odată preparat se sterilizează la 12loC timp de 30 minute, se
răceşte şi se trimite În fermentatoare ce au o capacitate de câteva sute de litri.
Se inoculează mediul cu suspensia de spori şi se realizează ferrnentaţia la o
temperatură cuprinsă Între 33-40oC, la un pH = 7 ,5, o aeraţie de 12 J aer/mediul
min., o agitare de 200 rotim in. , timp de aproximativ 7 zile.
Microorganismul secretă o enzimă - adenozin dezarninaza (ADA) - care
catalizează dezaminarea vidarabinei pe parcursul ferrnentaţiei şi duce la pierderea
unor cantităţi importante de vidarabină. Pentru a împiedica această dezaminare se
adaugă în mediu pentostatină (2' -deoxicoforrnicin), un inhibitor de adenozin
dezaminază, care permite obtinere-a unor cantităţi mari de vidarabină.
La sfârşitul ferrnentaţiei se separă miceliul prin filtrare sau centrifugare.
Filtratul, în care se găseşte vidarabina, se concentrează sub vid şi se răceşte la
50C pentru un număr de ore (48-72 h), când cristalizează vidarabina brută.
Se purifică prin recristalizări succesive din apă fierbinte.
Se mai poate izola din mediul de fermentatie prin adsorbţie pe cărbune, care
se adaugă direct în mediu (0,1-0,6%) şi se agită timp de 1-3 ore, sau se trece
filtratul peste coloane cu cărbune activ. Cărbunele este eluat cu o soluţie apoasă
de acetonă, iar eluatul se evaporă sub vid.
Vidarabina cristalizată se purifică prin recristalizări din apă fierbinte.
Bibliografie
1. Aisaka K., Uwajima T., Appl . Environ. Microbiol., 1986, 51 : 562-565;
2. Albrechtsen B., Mal. Microbiol .. 1989.3: 1385-1390;
3. Allen F.H., Kennard O., Watson D.G., Bramrner L., Orpen A.G., Taylor R.1.,
Chem. Soc. Perkin Trans., 1987,2: SJ-SI9;
4. BeachJ.W.,JeongL.S., AlvesA.J. et ol ., 1. Org. Chem., 1992,57: 2217-2219;
5. Becke A.D., 1. Chem. Phvs.. J993, 98: 5648-5652;
6. Becke A.D., Phys. Rev., 1988, A38: 3098-3100;
7. Beers M.H .. Berkow R. (eds.), Merck Manual, l7u, cdition, (versiunea În limba
română), Merck & Cu. Inc .. Witehouse Stat ion. New Jersey, 2002, 1127-1128;
8. Bernstein J., Davis R.E., Shimoni L., Chang N.L., Angew. Chem. 1/1/. Ed., 1995,
34: 1555-1573;
9. Blayer S., Woudley J.M., Dawson M.J., Malcolm D. LilIy M.D., Biotechnol.
Bioeng.; 1999,66(2): 131-136;
10. Boehme R.E., Bereford A., Hart G.J., Angier S.J. el al., Antiviral Res., 1994, 23 :
97-98 ;
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 265
Il. Borthwick A.D., Crame A.J., Exall A.M., Weingarten c.a., Mahmoudian M.,
Tetrahedron LeII., 1995, 36: 6929-6932;
12. Bowen W.R., Cassey B., JOI1I!S P., Oatley D.L., J. Membrane Sci., 2004, 242(J-2):
211-220 ;
13. Broder S., Antivi rai Res., 2010. 85( 1): 1-18;
14. Cameron J.M., Collis P., Daniel M .. Storer R., Wilcox P.• Drugs Future , 1993,
18: 319-323:
15. Chang C.N .. Doong S.L., Zhou J.H., Beach J.w. el al ., J. Biol. Chem., 1992.
267: 13938-13942;
16. Chu C.K .. Babu J.R., Beach J.w., Ahn S.K. el al., 1. Org. Chem .. 1990. 55:
1418-1420;
17. Chu C.K., Bcach J.W .. Jeoug L.S., Chui W.B., Corrner F.L, Alves A.J., Schinazi
R.F .. J. Org. Chem., 1991, 56: 6503-6505;
18. Clay P.G., cu«. Ther.. 2002, 24: 1502-1514;
19. Coates J.A.V., Camrnack N .. Jenkinson H.1., Muttun J.M. el 111 .• Antimicrob.
Agents Chemother., 1992. 36: 202-205;
20. ColI ins P.1., Haire L.F., Lin Y.P., Liu J .. Russell R.1 .. Walker PA., Skehel J.J ..
Martin S.R., Hay A.J .• Gamblin S.J., NOII/re, 2008, 453(7199): 1258-1262:
2J. Cousins R.P.C., Mahmoudian M., Youds P.M., Tetruhedron A.\Y/JIII/., 1995. 6:
393-396 ;
22. Dawson M.1., Mahmoudian M., Wallis C.1 .. US Patent, 6340587,2002:'
23. De Clercq E. el al .. Nature , 1986. 323: 464-467;
24. Du Q.S .. Wang S.Q .. Chou K.C., Biochemical and Biophysical Research Com­
munications . 2007, 362(2): 525-531.;
25. Elion a.B. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1977,74: 5716-5720;
26. Exall A.M .. Jones M.F., Mo C.L. el al ., J. Chem. Soc. Perkin. Trans. (1), 1991,
2467-2477 ;
27. Ezzitouni A. et al .. J. Chem. Soc. Perkin Trans .. 1997. L: 1073-1078;
28. Field H.1 .. De Clercq E., Microbiology Today. 2004, 31 : 58-61 :
29. Garcia-Sosa A.T., Sild S., Maran U .. 1. Chem. /J((. Model .. 2008, 48(10):
2074-2080 ;
30. Gray N.M., Marr C.L .. Penn C.R., Carneron J.M .. Beihell R.C .. Biochem.
Pharmucol, 1995. 50: 1043-1051:
31. Hayden F.G., Philosophical Transactions of the Royal Societv of London. Series B,
Biologica! Sciences, 2001, 356(1416): 1877-84:
32. Hervey r.s . Perry C.M., Drugs . 2000. 60(2) : 447-79;
33. Hethcrington S .. Hughes A.R .. Mosteller M. el al ., Lancet, 2002.359: 1121-1122;
34. Hoong L.K., StnlllgeL.E .. LiouaD.C. et ai.i J, Org . Chem., 1992,57: 5563-5565;
35. Hosono H., Kuno S .• J. Biochem., 1973.74: 797-803;
36. Howells J.D., Ryder A., U.S. Patent, 3,616,208. 1971:
37. Humber D.C., Jones M.F., Payne J.1., Ramasay M.V.J. el al .. Tetrahedron LeII .•
1992. 33: 4625-4628;
38. Hutchinson D.W., T1BTECH, 1990,8: 348-353;
39 . .Iasinski J.P., Butcher R.J., Yathirajanl-l.S., Mallesha L., Mohana K.N .. Narayana
B., J. Chem. Crystallogr., 2009. 39( 12): 864-869; ,,'O
)ltl
 266 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

40. leong L.S., Alves A.l., Carrigan S.w., Kim H.O. et al ., Tetrahedron LeII., 1992,
r MEDICAMENTE DE BIQSINTEZĂ

69. Rossi A., Vecchio E., Pizzocaro R., Bedeschi A., Pall!lll_EP 1857458, 2007;
267

33: 595-598; 70. Schinazi R.F., Chu C.K., Peck A. el al., Antimicrob, Agents Chemother., 1992,
41. Jurcoane ŞI. (coord.), Tratat de biotehnologie, voI. II, Ed. Tehnică, Bucureşti, 36: 672-676;
2006, 488-492; 71. Secrist l.A., Montgomery J.A .. Shealy Y.F., O'Dell A., Clayton S.1., J. Med.
42. Katagiri N. el al., Tetrahedron LeII., 1989,30: 1645-1648 ; Chem., 1987,30: 746-749;
43. Kawai N., Ikematsu H., Iwaki N. el al ., Clin. Infect, Dis., 2009, 48:996-997; 72. Sheldrick G.M., Acta Cryst., 2008, A64: 112-122;
44. Kiijoa A., Sawangong P., Mar. Drugs , 2004, 2: 73-82; 73. Sidwell R.W. el al., Science , 1972, 177: 705-706;
45. Kragl U., Kittlemann M., Ghisalba O., Wandrey C., Alin. NY Acad. Sei .. 1995.
750: 300305;
l' 74. Soundararajan V., Tharakaraman K., Raman R., Raguram S., Sasisckharan V.,
Sasisekharan R., Nature Biotechnology, 2009, 27(6): 510-513;
46. Lee 1.0., Yi 1.K., Lee S.G. el al., Enzyme Microb. Techno!., 2004, 35: 121-125; 75. Storer R., Clemens I.R., Lamont B., Noble S.A. el ai., Nucleosides Nucteotides .
47. Lee Y.C., Chien H.C., Hsu W.H., 1. Biotechnol., 2007, 129: 453-460; 1993, 12: 225-236;
48. Mahmoudian M., "A decade of biocatalysis al Glaxo Wellcorne". În: Biocatalysis 76. Tabara K., Koizumi S., Endo T. el al ., EIlZYlI/e Microb. Technol.; 2002, 30:
in the pharmaceutical and biotechnotogy industries, Ramesh N. Padel (ed.), CRC 327-333 ;
Press, Boca Raton, SUA, 2006, 53-104; 77. Taylor S.l.C. el al., Tetrahedron Asymmetrv; 1993,4: 11I7-112il:
49. Mahmoudian M., Baines B.S., Drake C.S. el al., Enzyme Microb. Technoi., 1993, 78. van ltzstein M., Nat. Rev. Drug Discov., 2007. 6: 967-974;
15: 749-755; 79. von ltzstein M .. Wu w.Y., Kok G.B., el al., Nature, 1993,363: 418-423;
50. Mahrnoudian M., Biocatalysis and Biotransformatian, 2000, 18(2): 105-118; 80. Wang Z., Prudhomrne D.R., Buck J.R., Park M., Rizzo C.J .. J. Org. Chem.:
51. Mahrnoudian M., Dawson M.J., "Chernoenzymatic production of the antiviral 2000, 65(19): 5969-5985;
agent Epivir" În: Biotechnology of antibiotics, Strohl W. R. (ed), Taylor & Francis 81. Whitley R.l. el al, N. ElIgI. J. Med., 1976,294: 1193-1199;
Group, Boca Raton, SUA. 1997.753-777: 82. Wilson L.J., Lioua D.C., Tetrahedron LeII., 1990.31: 1815-1818;
52. Mahmoudian M., Lowdon A., Jones M., Dawson M., Wallis C., Tetrahedron : il3. Xu P., Qiu J.H., Zhang Y.N .et al ., Adv. SYllliI. Catai., 2007. 349 : 1614-1618;
Asymetry, 1999, 10(6): 1201-1206; 84. Zucman D., de Truchis P., Majerholc C. el al ., .1. Acquir 1IIIIIIIII1e Defic. Svndr.,
53. Mahmoudian M., Noble M.D., Drake C.S., Middleron R.F., Monrgornery D.S., 2007,45: 1-12;
Piercey 1.E., Ramlakhan D., Todd M .. Dawson M.J .. J. Enzyme Microb. Techno!., 85. *** http : //www.fda.gov/cdcr/drug/lnfoSheels/HCP/abacavirHCP.htm. Alertă FDA
1997, 20: 393-396: pentru abacavir. iulie 2008 ;
54. Mallal S., Nolan D., Witt c., Lancet, 2002. 359: 727-732; 86. *** hup : //www.cdc.govlnu/weckly/wecklyarchives2008-2009/weekly32.hlm. Fiu
55. Mallal S., Phillips E., Carosi G. el al ., N. Engl. 1. Med .. 2008, 358: 568-579; Activity & Surveillance , august 2009;
56. el-Mansi E.M., Nimmo H.G., Holms W.H., 1. ce« Microbio!., 1986, 132: 797-K06; 87. *** http : //www.fda.govlDrugslDrugSafcly/PublicHcalthAdvisorics/ucm052240.hllll,
57. Maru 1., Ohnishi J., Olua Y. et al., Carbohydr. Res., 1998, 306: 575-578; Public Health Advisories (Drugsş, aprilie 2009.
58. Maru 1., Ohnishi 1., Ohta Y. el al .. 1. Biosci. Bioeng ., 2002, 93: 258-265;
59. Medrano Ruperez 1., Carnpon 1., EIÎas Rius L., Berenguer Mairno R. ,_Palent EP
1939196, 2008:
60. Mcindl P., Bodo G., Palesc P., Schulrnan .1., Tuppy H., Virology, 1974, 58(2):
457-463 ;
61. Monger G., Varlashkin P., Powder Di/(racl., 2005, 20: 241-245;
62. Moscona A., New Eng. 1. Med., 2005, 353(13): 1363-73;
63. Munch-Petersen A., Nygaard P., Hammer-Jespersen K., Fiii N., Eur. 1. Biochem.,
1972,27: 208-215;
64. Pauwels R. el al., Nature . 1990, 343: 470-474;
65. Profire L., Chimie farmaceutică. Medicamente antimicotice, antivirale şi antitumo- I
mie, Ed. Junimea, Iaşi, 2002, 118-140;
66. Rappuoli R., Nature Medicine , 2004, IO( Il): 1177-1195; I
67. Rauch A., Nolan O., Martin A., Clin. Infect. Dis., 2006,43(1): 99-102;
68. Roshevskaia L.A., Barai V.N., Zinchenko A.I., Kvasiuk E.I., Mikhailopulo L.A ..
I
Antibiot . Med. Biotekhnoi., 1986,31(3): 174-178;

,
•
 "-~r;z

MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 269

printr-o serie de desaturări şi elongări, astfel Încât se obtin acizii graşi poline­
saturaţi - PUFA (Polyunsaturated fatty acids), aşa cum se poate observa şi în
figura nr. 62 (după C. Ratledge, B. Kristiansen (eds.), 2006).

16:0

Capitolul VllI
!
acid pahuitic

clongaza

'_18:I(d9) L\12 _.c;:_ 1!l:3(N),12.15)

18:0~ 18:2(~9.12)
BIOTEHNOLOGIA ACIZILOR GRAŞI acid stcaric acid olcic •• acid linolcic acid u-Iinolcnic

POLINESATURA ŢI !66 166

18:2(66.9) 18::1(66,9.12) 1 X:4(~(l.9,12.15)
acid octudccadicnoic acid y-linolcnÎ( acid octadccatctracnoic

VIlI.l. Acizii graşi 1 clougaza 1 dongaza 1 clongaza

20:2(68.1 1) 20:3(M,11.I4) 20:4(~lU 1.14.17)

acid eicosudicuoic adu dihomo-v-Iinclcnic acid cicosatcrrucuoic
Acizii graşi sunt acizi alifatici cu o catenă ce variază ca lungime Între CI2 şi Cn
atomi de carbon (deşi se cunosc şi acizi graşi cu catenă mai scurtă de J 2 atomi de
1
65
1 L\5 ! 65
carbon, sau mai lungă de 22 atomi de carbon). La majoritatea speciilor (micro­ 20:3(L\5.B.II) 20:4(~5.K.II.14) ~ 2():5(~5.8.11.14.17)
ucid uruhidouic ucid cicosapcutacuoic

!
organisme, plante şi animale) predomină acizii graşi cu lanturi de C 16 şi CI8 atomi acid cicosuu-ieruuc

de carbon. Acizii graşi pot ti saturaţi sau nesaturaţi , cu una sau mai multe duble clongaza

legături. . 22:5{6 7.10.13.16.19)

Bacteriile produc acizi graşi ce au o varietate de structuri: lanturi rarnificate, acid docosupcutaenoic

inele ciclopropanice şi duble legături trans. în schimb, rnicroorganismele euca­ !64

riote, plantele şi animalele superioare biosintetizează acizi graşi cu importantă
22:6(64.7.10.13.16.19)
nutriţională sub formă de acizi cu catenă liniară şi duble legături cis . acid docosahexucuoic
Nu toate microorganismele acumulează trigliceride (TG), deşi în mod esential
toate organismele sintetizează acizi graşi. scria (1)-9 scria <.u-6 seria (1)·3

Procariotele nu produc trigliceride cu functie de depozit, ci ele tind să producă

Figura nr. 62 Schema transformării acizilor graşi după sinteza de novo
polihidroxialcanoaţi sau polizaharide, majoritatea gliceridelor lor tiind sub formă
Legendă: 6. = desaturază (c .g. ~9 este o desaturază ce introduce () dublă legătură intre C9-C '(1)
de fosfolipide.
Eucariotele biosintetizează diferit trigliceridele. Cele care acumulează TG În
proportie de peste 20% g/g din greutatea lor sunt denumite microorganisme În drojdiile oleaginoase cantitătile de acizi graşi sunt limitate, cei mai frecventi
oleaginoase, iar cele care nu acumulează cantităţi sernnificative de TG sunt acizi graşi fiind: acid oleic (18: 1), linoleic (18 : 2). palmitic (16 : O) şi palmitoleic
denumite microorganisme non-oleaginoase. ! (16: 1). Atunci când apar acizii 18: 3 sub forma izomerilor (l)-3, aceştia sunt În
Putine eucariote pot ti considerate ca tiind oleaginoase. De exemplu, din proportie de cel mult 10%.
aproximativ 600 de specii de drojdii un număr de 25 sunt capabile să acumuleze Fungii şi micro-algele oleaginoase sunt microorganisrne care produc PUFA În
mai mult de 20% g/g lipide, iar în cazul fungilor, din aproximativ 60.000 de cantităţi de peste 20% din totalul acizilor graşi. De aceea, interesul comercial s-a
specii mai putin de 50 de specii pot acumula mai mult de 25 % g/g lipide. I axat pe dezvoltarea acestor fungi şi micro-alge drept producători prolitici de PUFA.
La majoritatea organismelor, biosinteza acizilor graşi culminează cu obtinerea Initial PUFA se obtineau din diverse surse vegetale şi animale. La ora actuală,
acizi lor graşi saturati CI6 sau C18• Aceşti acizi graşi saturaţi sunt ulterior modificati
I se pot obţine pe cale fermentativă, însă procesele se realizează, încă, cu costuri

t
l'
hi
 I

!'
270 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 271

foarte mari, comparativ cu extractia din surse vegetale şi animale. Din acest Tabelul nr. 35
motiv doar câţiva PUFA se obtin pe cale fermentativă (acidul y-linolenic, acidul Structura şi nomenclatura acizilor graşi
arahidonic, acidul docosahexaenoic), aceştia având preturi de vânzare foarte mari.
Ţinând cont de aceste date, cercetările de astăzi se axează pe utilizarea diver­
selor subproduse din industria alimentară drept subsrraturi pentru fermentaţia micro­
'I>~:~~~, 1" i .i';S~~ctllra Deri~m~rea's1steriJ'aţic~'J'~~~;i:'
organismelor producătoare de PUFA, astfel încât preturile de productie să scadă. Acid ...Q.almitic Clb(CH~),.COOH Acid hexadeca.noic 16:0
O altă directie importantă de cercetare (ce va avea aplicabilirate într-un viitor Acidul y­ CHJ(CI-b).(CI-1 =CH 'CI-12)J Acid aII cis-6,9,
18: 3«(J)-6)
mai Îndepărtat) este obtinerea de PUFA din plante modificate genetic (plante Iinolenic (CI'b)JCOOH 12- octatrienoic
transgenice). Nici o plantă nu produce În mod obişnuit PUFA cu catenă mai mare CHJ(CI-h)4(CH = CH· CI-Il)' Acid aII cis-5,R,1I,
Acid arahidonic 20: 4(w-6)
de CIH, deci e nevoie de manipularea lor genetică. (CI'h),COOH 14- eicosatetraenoic
Acidul CI-bClh(CH =CH ·CI·h)" Acid aiI cis-4,7,I0,13,16,
Genele ce codifică enzimele cheie, ce contribuie la sinteza acizilor graşi 22: 6(0)-3)
docosahexaenoic CI·hCOOH 19- docosahexaenoic
polinesaturari cu catenă foarte lungă, au fost izolate din diverse surse microbiene
Acidul ClhCI-h(CH =CII·CH,), Acid aii cis-5,8,11,14,
şi clonate în plante. Deşi sunt disponibile o serie de plante transgenice produ­ 20: 5«(1)-3)
eicosaperuaenoic (CI-b)lCOOH 17, - eicosapentaenoic
cătoare de PUFA, cultivarea şi utilizarea lor întâmpină rezistenţă, mai ales în
Europa. Întrucât obtinerea şi dezvoltarea plantelor transgenice producătoare de
18 17 16 15 14 1) 12 II 10 9 8 7 6 5 4 3 2 I
PUFA se realizează cu costuri foarte mari, recuperarea investitiilor se va face CH3-CH1-CH -C H -CH2-CH -CH-CH2- CH-CH'-CH1-CH1-CH1-CH1- CH2--CH1-CH1-COOH
prin pretul de cost foarte mare al PUFA. De aceea, e nevoie de mult timp de acum (1) (.1). I (J)~,2 (1) 3
încolo, pentru ca aceşti PUFA, obţinuţi cu ajutorul plantelor transgenice, să
devină un succes comercial.
acid limlcnic
.
I R3(", 3)

Nomenclatura acizilor graşi

Denumirea acizilor graşi se face prin denumire sistematică, denumire comună şi 18 17 16 15 14 1) 12 Il 10 9 8 7 6 5 4 3 2 I
CH3-CH1-CH1-CHrC H2-CH -CH-CHI -- CH -CH-CH1- CH ~C H -C Hl-CH1-CH1--CH1-COOH
denumire numerică. Aceasta din urmă are beneficiul de a explica structura acizilor 10 (1) I (1) 2 (t)- J u)··4 (o" 5 11)" (,
graşi (tabelul nr. 35 şi figura nr. 63) (după C. Ratledge, B. Kristiansen (eds.), 2006) :
acid Iimlcnic 1 K3(,O)··fi)
o primul număr indică numărul atornilor de carbon ce formează lanţul;
o al doilea număr (cel de după două puncte) indică numărul de duble legături ale Figura nr, 63 Sistemele de numerotare a acizi lor graşi
acidului gras;
o indicatiile din paranteză (e.g. w-3, (1)-6, 0)-9) arată cărei serii îi aparţine acidul
o o
gras şi indică poziţia primei duble legături (real izând numerotarea acidului de
la capătul metilenic) ; I I
H2(-O-(-RI H2(---O-( --RI
o cunoscând faptul că toate dublele legături sunt despărţite printr-un
metilenic -CH2- (i.e. -CH =CH-CH2-CH =CH-), se poate cunoaşte
radical
poziţia R2-C---O --(H2
I R2--(-0-(H2
I O
tuturor dublelor legături.
I
O
I
H (--0--( -- R3
I
O
I
H2(--0-P--OX
I
Importanţa acizilor graşi 2 I I
O OH
Majoritatea Iipidelor componente ale celulelor există sub formă de : fcsfolipidă
Irigliccridă (TCi)
trigliceride, ce au rol structural, energetic şi de protecţie contra frigului, ele
Figura nr. 64 Structura triglicer idelor şi a fosfolipidelor
nefiind active din punct de vedere fiziologic ';
Legendă: R" R,. RJ -- rest de acid gras alifatic saturat sau nesaturat; X -- H. serină, inozitol,
- tosfolipide, ce sunt componente ale membranelor celulare, având rol în menti­
etanolamină, colină, glicerol ele.
nerea şi reglarea activităţii celulare.
 l'
272 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
I MEDICAMENTE DEBIOSINTEZĂ 273

Factorul cheie În menţinerea fluidităţii mernbranelor celulare (fluiditate ce

este importantă pentru activităţile enzimatice asociate mernbranelor) este repre­
':C~'\:I ;.. ~ ti~ ~
1 C"') ("'.lN 'n
l'l~~ ~
zentat de natura resturilor de acizi graşi din structura fosfolipidelor membranare. .\- . 60""; o Vl lI'l
!")

.,$0; N"";
Cu cât lantul este mai lung şi cu mai puţine duble legături (grad mic de desaturare)
-a ~~~ ~I ,1 ,1 'II
"";..0 '"00
cu atât punctul de topire al lipidei respective este mai mare. Grăsimile animale,
ce sunt solide la temperatura camerei, au un nivel mare de resturi de acizi graşi
""I·v;. :-:"'"
?o- o '" -e­
'" '" ts
~~~ '"
N
saturaţi, iar cele vegetale, care sunt lichide la temperatura camerei, au prepon­ Q)
Cii
derent resturi de acizi graşi nesaturaţi (predomină cei dublu nesaturaţi). Compo­ .t:::
'Cii ".' "j 7: ,1 II ,1 ,1 ,1 "NI,' ,1 ,1 I
U"\
-<i
ziţia În acizi graşi a grăsimilor animale şi a uleiurilor vegetale, ce se comercia­ .~ '~" ~
'1'
lizează astăzi la nivel mondial, se poate observa în tabelul nr. 36 (modificat după Q)

H. Kleinkauf, H. von Dohren (eds.), 1997).

E
o
.-=,
u
'bN'
.,
Q)
Compoziţia în acizi graşi a uleiurilor produse de o serie de plante, animale şi o:
microorgsnisme sunt prezentare în tabelul nr. 37 (modificat după C. Ratledge, B. b1J
-'SI, I-H-H ~ 00 ,,.. .
Kristiansen (eds.), 2006). ~
'C
Acizii graşi polinesaruraţi (PUFA) au rol structural, rol de depozit şi mai ales ;:l N
rol de precursori pentru o serie de compuşi biologic activi. Astfel, acidul
'0)
::; oo~.•..
:
N rr) 21"'1"'1"'ISI~I~I~I:;!;I~I:;!;1 ~ ~ I~
.i.';
arahidonic IAA, 20: 4«(1)-6)] şi acidul eicosapentaenoic r AEP, 20: 5«(1)-3)] sunt ';;;"
precursori pentru eicosanoide, prostaglandine şi leucotriene - molecule implicare
Q)
'Cii
o-.
'"
!")

-e- ::;j:I\OI~I~I;:: :I(ClI~I~I~I~I~1 \O o-. 12

în reglarea proceselor celulare. a răspunsului intlamator al organismului, în -.c
I"'l
.5c::
ro
coagularea sângelui şi În funcţiile de reproducere. Pentru că cei doi PUFA sunt s..: ._ No-.I
biotransforrnaţi În compuşi biologic activi prin intermediul aceloraşi enzirne, ei
c:: E ,~, - - ::!:I, •.• I!")I~I''''I'''I'''IV')I .••. I'''I'''I ••. '" ,-
concurează pentru aceleaşi sirusuri enzimatice. De aceea, raportul AEPI AA are
:2•.. ~~•... 3~: ~,,.;'
.Q blJ
un impact deosebit asupra proceselor de homeostazie. ~ 25 "Q)
.Z~f ~; '" -e- IMI ,1 '1 .1-1" ,1 ,1 ,1 '1-

Şi ceilalţi acizi graşi polinesaturaţi au roluri importante în organismul uman.

Astfel, acidul docosahexaenoic [ADH, 22: 6«(J)-3)] este un acid gras esential
roo.
'g
-':,:;'~x.:I 'i::t·:"i'II,.. .1
-".;~'.: '\C. N
"<t
N ~10-.1001~1~1"'1=1""'1=1=1~ 00 1\0
'<~~;. •••.
pentru om, fiind prezent în ţesutul retinian şi cerebral, iar acidul y-linolenic 'C
o.
"~'."~'
..;,.,'CS:
r AGL, 18: 3«(1)-6)] joacă un rol important în suprimarea inflarnaţi ilor, în scăderea 1t'""I~I~1
";,;i":~;
'." .:J."I[
'" 1'"1") ,1 II II il 1) II 11_

';;;"
colesterolului sangvin şi în diminuarea eczernelor atopice. e i' 't.~.:'
00
Prin urmare, PUFA exercită câteva acţiuni biologice unice:
'N
'uro ',;lli2';'1 ~,.:;.=-. 11 •.••.
1(';:,:, !;t1~1 ti ,1'111 ,1,1,1 I

• scad colesterolul plasmatic ; 1

• previn trornboza ; ,S
• suprirnă inflamaţiile ; .~ u
'§ '3 '" .'-'
.0";:.-
• au proprietăţi anticanceroase ; o.
• sunt esenţiali în nutriţia umană. Eo
u ~> ~ o§"'.,~'El~ ~)~ lL~
~ ~v '~~~.v ~s1 '6 .c~ ~
~ ~ ~ ~
~ ~
~ c.v
~a, i~
El ~v
'2'c uo
v cu t: cu CI:;! ru C bo ;::::._
Cei mai importanţi acizi graşi polinesaturaţi sunt: "O i:"'O Q) ~ cu -c !LI
\-o
~ Q.).~ t C § ol o
:J.- v -c •... -:;j ._ -c c: 'v "O t:
"'O

:l
., ._ "'._ .,._ - ,_ !1J
<:::>
'l:l ~ '2 -c,_
~ _ ,...

v' acidul y-linolenic (AGL) ; Ul 5 :5 ::J :5 5 :5 ~ ::J :5 .S v:2 ~ ~ :5

'1)
v' acidul arahidonic (AA) ; "O ~ _. ~ ~
.~ " 5 ';j..!!::J
v' acidul eicosapentaenoic (AEP) ; 5::J
v' acidul docosahexaenoic (ADI-l).
 MEDICAMENTE DE IJIOSINTEZĂ 275
274 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Aceşti acizi graşi polinesaturaţi pot ti biosintetizaţi la nivelul organismului
,\-"l.o;; 1 'III liman din acizi graşi esenţiali aduşi prin dietă, care sunt modificaţi printr-o serie
'~t ~'"~> 111' ,1110,
N ti') ~
•..••• I ~~ I I , I I I

.," "'" I de desaturări şi elongări.

~ ·O:;'f}.L·~'
.:« tn~ În nutriţia umană există doi acizi graşi esenţiali (uneori sunt incluşi la categoria
'~"'C--;'.~
-""'~ , I N I ,1111111 • vitaminei F): acidullinoleic (AL) şi acidul n-linolenic (AAL). Aceştia trebuie să
• '" '_?7
Q',;, se metabolizeze în acizi graşi polinesaturaţi cu catenă mai lungă:
~
"".,O­
V') ~I II II II li tii I I • acidul linoleic (AL) se metabolizează la acidul y-linolenic (AGL) şi acidul
'0:;.
arahidonic (A A) ;
• acidul a-linolenic (AAL) se metabolizează la acidul eicosapentaenoic (AEP)
2:l
c::
ro şi acidul docosahexaenoic (ADH).
C5..
oi
oI)
'ii N -'~I-I""I:qI"'I~
2
I-

VIII .2. Lipidele microbiene - seo

·s I:~;:';;
u
~ ~:~ M \D I I I
. • I I I I I I • , I , I ,;:::; _ ••.••• I - (f') V
.,EI-I-
4) I ",,' t"t ~r:;; ::1 SCO (Single Cell Oils) este un eufemism folosit pentru lipidele microbiene (inclusiv
E o "l,fl'~
== acizii graşi polinesaturaţi) obţinute din microorganisme prin procese ferrnentative.
.~ ·.6 ":':'OC~
!~-; o \O lIî o ('<"')
•....• V) r-. V.-
I o V) N N ('f') V .....• 0\ V
_.......q. N _ N o -
ff')
\O
-
I 0\ I In ""'"'0'''\0
- f'I")
SCO sunt, la ora actuală, printre cele mai cercetate substanţe în biotehnologie,
of)
•... \"~
o datorită succesului comercial al produselor ce le contin,
r-
2u Ij ~~;:II~I~I"'I~I<"I:!I~lvl-H"'H~I~I"'I~I:qI:!I:!I~I~I~I;;;I:gI~I~I;;;1~ Cei mai buni producători de SCO sunt diverse specii de fungi, alge şi drojdii
~..; ·S '''"1'',
d
. ~I:'Qfl oleaginoase, ce sunt capabile să producă cantităţi mari de PUFA.
4)
;y,tHINIf""l!N'<o::tI-I- II II " '1~1r-1V)INI~IN ~1~INllI1lool""I~I"'lool~ Obţinerea SCO este astăzi o realitate economică. Deşi se cunoştea de multă vreme
-a '"4)
Q

-.o",
v
F! 2
'"::>
~ l~~='-,S
_f~~
~ '.~\l:1:: _... ....... . . .
::>

~§ +l+ că SCO reprezintă o alternativă viabilă pentru PUFA extrase din surse vegetale
sau animale, obtinerea lor pe cale industrială nu s-a realizat până în 1985.
~r i~
'CJ ' , ,~~ V') 'f') N ~ '" N ~ , , , • , , , '~V')
O­ .' .'l'l. 1 1 Pentru a obtine SCO este necesară cultivarea unor cantităţi mari de biomasă
•... .>,. ,,.
8~t~", -"'O'CJO~O"'O"'V').
r> ~ MV')1I1111 'CJO~ ~
:E :<" .~!tC. _ - 00 _ N N (""'1 ţi") •..••••..••••..••• N __ r-I N - - •....• ~ - ('f") microbiană, care acumulează intracelular lipidele (uleiurile) microbiene. De regulă,
.,
- 0\ •••••• ~ ('<"')

.
:;
::> i:i} t;,:~:~r~
"','"
.. ::k
--'.~
'.-
--
11!'5
microorganismele oleaginoase acumulează lipide în proporţie de aproximativ
50% din biomasa uscată (deşi s-au raportat şi proporţii de 70%). Întrucât prin

'uro
ro
';;;'
e
Ol)
';::j
;®~~ H
A'" .r. u
\:~r"'~'~ o ~ u ::::
/.:i{e;;{j; ~·otÎJ..:l.§ § ~ t'§~I':::;'l::~
L~~.
El .5 ~ Cv Vit: '"~ '",~ :::f;;::! ~'-"l 1:::C "'"c !--~!~- "~ ct::: C10...
'" ",, c - ",,,
,?"<;.§ g 8
"tJ''' ~ t5
L,."~Ll :s :::,_.~ ::s
~ -
~I'§§.§
:; ~
~ ~ ~,~
tL,
la'''' E: ~'" ':::'-'
s~;:l -
c
~
fermentatie nu se pot obtine mai mult de 200 g biornasă uscată/l mediu de cultură,
rezultă că pentru fiecare 1000 kg (1 t) de SCO sunt necesari peste 10.000 I de mediu
de cultură. Ferrnentatiile la această scară s-au dezvoltat abia în anii '40- '60, ceea
ce a permis cercetarea şi dezvoltarea SCO abia în anii '80. Chiar dacă s-au pus
.5 I ._"._ ''''. os '" c:;. t:: -1","
if.·:il:l~i1-;, ~ ~ := g ~ :SI ~ ::'i:: t.., (5 E Ci·§.s
'.::>it ,t: ..... '0 -E "'ts ~ .:: - .~ "':: ..:: !:: I ~ ~ :::: C ..:::
~ ~ ~- ~ ~:ţ; ~::9-1 ~c::;1 ~5 -I"~
~ ~ la punct aceste detalii tehnologice, comercializarea SCO nu a fost uşor de realizat,
ro
';::"
.;::;
,'" -~~-u . s
_;,J' "i' "l:)51no
.J~I~
:5 8:2 ~ -S t <:; :> " " '" ::: .c .=:
O.!,::! ~ ~ ~ lUa::; c ti ~ •.. ·E ~ ~11Ş
::::: E =:: ~
'f' :::: :::: ;:: '" " ~ ~ ';: ~
~:.::..:: c~ ~ •.... 19 o c
~ ~
Întrucât tehnologia era scumpă atât la implementare cât şi la exploatare.
-:Sf,'.'C?I'$·V 1.;'; ~-::::::I';::i]- is:5 ~-§ '-' 8 c'·- l::~ g Ei cJ:.::; ţ{;:S t:::; După cercetări derulate pe parcursul a aproximativ 10 ani, în 1985 s-a pus la
8- ',..... '03:-'::>
.:;'41""-
'§-"is t') \J,c:;: t') Q..c _"',,"'::
c;::">,I
6 .... <; '"::: ::_""C_-"
~ ~ < ~ U, C ~ '<::::
•.•.. .:::
" s:>'-'C-")<I
.::: Ci ;;..:; .'=:1 punct obţinerea industrială a unui ulei bogat în AGL cu ajutorul culturilor de
E ~{~, •.~:, ::; <t ~ 5<>::;1::: -.l
u
o " F ''" _"<l i:t .....• '" '!'? ~ Mucor circinelloides, Acest proces derulat cu ajutorul fungilor reprezenta o
alternativă la uleiul de luminita nopţii (evening primrose - Oenothera biennisş
}~~~ ~~ G care era scump la acea vreme. Producţia industrială a fost iniţiată de compania
'bO :o
i J .&E. Sturge Ltd., Yorkshire, Anglia (devenită Haarmann & Reirner, iar după
:~~;:;~1::1 ~ ~'" e '" c
'8' fuzionarea din 2003 a devenit Symrise din Holzminden, Germania) şi s-a derulat
s; ~~ a; el 1 pe parcursul a 6 ani, după care s-a sistat, întrucât costurile de producţie erau
.~ :'i:~tS':,~:!~

l
 rI
276
I
CĂTĂLlNA DANJELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZA 277

foarte mari. Ferrnentaţia se realiza în ferrnentatoare de otel de capacitate de 220 rrr',
biomasa se filtra şi se usca, iar uleiul extras se purifica. Uleiul obtinut cu ajutorul
acestui fung avea caracteristici fannacotehnice mai bune decât cel izolat din
luminita nopţii, inclusiv o concentraţie în AGL mai mare (18-20% comparativ cu
8 % cât avea uleiul de luminita noptii). Însă, pentru că tehnologia nu a putut ti
eficientizată din punct de vedere economic, s-a renuntat la obtinerea fermentativă
a acizi lor graşi nesaruraţi.
Pentru un timp s-a revenit la tehnologia convenţională, care era mult mai
economică, adică PUFA se izolau din uleiurile vegetale sau din peşte.
Odată cu avansarea cercetărilor şi prin achizitia celor mai noi rezultate din
domeniu s-a mers pe obtinerea prin fermentatie doar a acizi lor graşi polinesarurau
care nu se puteau obtine economic din surse vegetale sau animale.
Procesele fermentative de obtinere a PUFA sunt realizate prin fermentaţii
submerse la care s-au optimizat parametrii de fermentatie (sursele de carbon şi de
azot utilizate, conceruraţia substanţe lor minerale, temperatura, concenrraţia oxige­
nului în mediu etc.) astfel încât să se obţină cantităţi importante de ulei cu o
compoziţie optimă de acizi graşi polinesaturaţi
Au fost descrise şi procedee fermentative realizate pe substrat solid, precum şi
ferrnentaţu cu fungi imobilizati pe suporturi polimerice, conduse în ferrnentatoare
În pat fluidizat. O serie de studii recente (X. Peng, H. Chen, 2008) arată că
tulpinile de Microsphaeropsis sp. se pot utiliza la obţinerea SCO prin fermentaţie
pe substrat solid. Aceste substraturi solide pot fi reziduuri de grâu imbogăţite cu
celulază (când se obtin 80 mg SCO/g substrat uscat), sau hidrolizate din deşeuri
de roşii (când se obtin concentrarii ale uleiurilor de 40% din biomasă). Astfel, se
pot obtine SCO utilizând reziduuri ieftine şi larg disponibile din agricultură.
La ora actuală, se obţin prin biotehnologie acizii graşi polinesaturaţi cu catenă
foarte lungă, ce nu pot fi izolati din plante (care nu-i biosintetizează de novo) şi
Uleiul de peşte conţine cantităţi mari de PUFA (1)-3, Însă are cantităţi mici de
PUFA (1)-6. De aceea, uleiul de peşte se utilizează În asociere cu alte surse de
PUFA ce aduc AA. În plus, uleiul de peşte contine şi cantităţi mari de acid eico­
sapentaenoic [AEP, 20: 5«(1)-3)] ce este asociat cu intârzierea creşterii la copii şi
inhibarea elongărilor şi desaturărilor acizilor graşi esenţiali C18, ceea ce duce la
scăderea sintezei de AA. Deşi astăzi sunt disponibile pe piaţă uleiuri de peşte cu
un continut scăzut de AEP, totuşi ele au demonstrat afectarea creşterii la prematuri.
Lipidele din gălbenuşul de ou contin cantităţi mari de colesterol, de aceea sunt
preferate fosfolipidele sale. Totuşi, aceste fosfolipide contin AA şi ADH în
proporţii ce nu sunt identice cu cele din laptele matern.
SCO din alge şi fungi contin cantităţi mari de ADH sau AA, fără a fi prezent
şi AEP sau alti PUFA. Prin procese ferrnentarive se pot obţine uleiuri ce contin
doar un singur PUFA şi nu amestecuri, aşa cum se obtine prin izolarea din surse
animale. Din acest motiv, aceste SCO sunt preferate pentru a fi adaugate în
formulele de lapte praf pentru prematuri şi sugari.
În tabelul nr. 38 (după D.B. Archer el 01.,2008) sunt prezentate caruităţile de
acizi graşi polinesaturaţi obţinute prin procedee femeruative aplicate de diverse
companii.
Tabelul IIr. 38
Cantităţile de acizi graşi polinesaturaţi obţinute industrial (%)
Acidul arahidonic (AA) obţinut din tulpini de M. a/pina
18':0 11~j 1 is/î :!!6) ~~- ~
.. '. . .. "
f~
~',",

care, până de curând, se izolau doar din animale marine (peşti). 111 141 7 4 4 49 .l - _[ I

În acest fel, la Începutul anilor '90, PUFA au devenit foarte cercetaţi datorită
2 I 4 I 4 2 70 1 3· 5

importantei lor În dezvoltarea nou-născuţilor, Cei mai studiati sunt acidul docosa­
hexaenoic (ADH, 22 : 6«(1)-3») şi acidul arahidonic [AA, 20 : 4«(1)-6»), aceştia fiind Acidul docosahexaenoic (ADI-!)
necesari dezvoltării funcţiilor neuronale şi reriniene,
- , .. " . . . , " 18:~ 20:3 22,:5 ~:6
Laptele matern contine cei doi acizi graşi polinesaturari, dar laptele de vacă şi ~ 12:0. i4:0 .J~.:O 16:ţ ~8.0 .1.8:1 18:2 <<0;:3)
~ID-6) (CO_:6> <<?-~)
laptele praf pentru sugari este lipsit de cei doi PUFA. Datorită acestor incon­ . Acldul aras 2 04 15 0.6 _ _ _ 39
veniente, astăzi toate formulele de lapte praf pentru prematuri şi sugari contin Martek 4 20 18 . I 2 3 I 12 ~
adaos uri din cei doi acizi graşi polinesaturati Prin urmare, există o piaţă de Omcga'Iech - 13 2~ 1_2 : _ _ _ _ l.1 46
Nutrinova - 3 3
desfacere largă, asigurându-se vânzări În întreaga lume cu preturi care să com­
penseze costurile de productie.
Există trei surse principale pentru aceşti PUFA: Procesul de obţinere a acidului arahidonic (AA) aplicat de compania DSM se
• uleiul de peşte (ce contine in principal TG); realizează În Italia, În fermentatoare de capacitate mare (1001113), când fracţiile
• lipidele şi fosfolipidele din gălbenuşul de ou; uleioase conţinute de celule sunt de peste 40% (g/g). Întreaga producţie este
• SCO din alge şi fungi (ce conţin În principal TG). comercializată către Martek Bioscience Corp., care o asociază cu ADH în
 278 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE B10SINTEZĂ 279

proporţie de 2: 1 (v/v). Acest amestec este încorporat în formulele de lapte praf

pentru sugari (comercializat sub denumirea de FORMULAID). În anul 2003, VIII.2.1. Biotehnologia acidului v-linolenic
productia curentă a acidului arahidonic era de aproximativ 500 de tone.
Procesul de obtinere a acidului arahidonic (AA) aplicat de compania Wuhan sin: acid aII cis-G, 9, 12-octadecatrienoic, acid gamalinolenic, 18: 3(00-6)
Alking Engineering Co. Ltd., din regiunea Wuhan a Chinei, este realizat în
CIHH3002
fermentatoare de capacităţi cuprinse între 50-100 1113, iar din 2004 acest acid gras M, = 278,43
nesaturat obtinut de compania chineză este comercializat în SUA şi Europa.
Obţinerea ADH de către compania Martek Biosciences Corp. se realizează cu 18 17 16 15 11 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
CH3-CH2-CH2-CH2-CHr CH -CH-CH2- C H-CH-CH2 - C H - C H -CH2-CH2- CH2 -CH2-COOH
tulpini de Crypthecodinium cohnii ce produc fracţii uleioase de peste 40% din
biomasă. Ferrnentaţiile se realizează în fermentatoare de 100 nr'. Acest acid gras
este asociat cu acidul arahidonic şi utilizat exclusiv în formulele de lapte praf. În acidv-linolenic 18: 3«<)-6)
anul 2003 compania producea aproximativ 250 de tone de ADH.
Compania OmegaTech Inc., Boulder (acum deţinută de către Martek) obţine
H3C(CH2)~~
4 ~H2~COOH
ADI-! cu ajutorul tulpinilor de Schizochytruim sp. Fracţiile uleioase conţinute de
celule reprezintă peste 40% din masa celulei. Astăzi este folosit ca supliment
acid y-linolenic 1 ~:3«(l)-6)
alimentar în nutriţia oamenilor adulţi, deşi iniţial se utiliza în hrana păsărilor şi
a animalelor. În 2003 compania obţinea aproximativ 10 tone de ADH.
Obţinerea ADH de către compania Nutrinova Gmbl-! din Frankfurt Germania, Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
se realizează cu tulpini de Ulkenia sp., în ferrnenraroare de 80 nr'.
Se prezintă sub formă de lichid incolor, insolubil În apă, solubil în solvenţi
Toate microorganismele utilizate la obtinerea PUFA au un continut foarte
organici. Are un p. t. = -lIoC, un p. f. = 2320C la () presiune de 1 111111 col Hg şi o
bogat în acidul gras ce interesează. De exemplu, Crypthecodinium cohnii produce
densitate de nD~5=0,914.
un ulei în care ADH poate ajunge la 40-50% din totalul acizilor graşi polinesa­
Acidul v-linolenic are proprietăţi anri-inflamatoare (suprimă inflarnaţia acută
turaţi, sau chiar este singurul component al acestuia (mai poate ti prezent doar
şi cronică), scade concentraţia sangvină a colesterolului şi are efecte benefice În
acidul oleic 18: 1). În ulei urile din plante sau animale există o gamă largă de acizi
tratamentul eczemelor atopice.
graşi saturaţi şi nesaturaţi. Cum cerinţele alimentare sunt doar pentru un singur
Poate ti utilizat în tratamentul neuropatiilor diabetice, a artritelor reumatoide,
PUFA, acesta se poate obţine eficient doar din uleiurile microbiene.
a sindroamelor premenstruale, în sindromul de oboseală cronică, În colitele
În ultimii 20 de ani, aceste SCO au devenit foarte importante, tiind astăzi
ulceroase etc., Însă efectele obţinute nu sunt datorate doar acidului y-linolenic.
suplimente nutritive majore în alimenraţia sugarilor. La ora actuală sunt cercetări
Intră în compoziţia unor suplimente nutritive şi a unor extracte vegetale (ulei
imense pentru a le include şi în alimentaţia adulţilor, ca suplimente nutritive, mai
de borago, de luminita nopţii sau de coacăze),
ales ADH-ul, pentru prevenirea afecţiunilor cardiace şi a afecţiunilor degenerative
(în boala Alzheimer), dar şi în alimentaţia copiilor pentru prevenirea ADHD
Tehnologia de biosinteză a acid ului y-linolenic
(sindromul deficitului de atenţie).
Şi alţi PUFA vor putea fi dezvoltaţi la nivel industrial, atunci când vor fi ° serie de microorganisme ar putea fi cultivate pentru a obţine AGL: drojdii,
identifica te microorganisme prolifice, cu productivitate mare, care vor produce fungi, alge.
acizi graşi polinesturaţi cu costuri mai mici decât În cazul utilizării tehnologiilor Profilul acizilor graşi din lipidele drojdii lor oleaginoase este asemănător cu
convenţionale (izolarea din produse vegetale sau din peşte). cel al plantelor, motiv pentru care izolarea acizi lor graşi polinesaturaţi , inclusiv
Cunoaşterea profundă a mecanismelor de sinteză a acizi lor graşi polinesaturati a AGL, din drojdii nu este atractivă din punct de vedere comercial.
şi a posibilităţilor de dirijare a reactiilor de biosinteză, asigură un efect economic Algele pot fi producătoare de acizi graşi nesaturaţi, aşa cum au dovedit studiile
major la realizarea proceselor biotehnologice, în scopul obtinerii produselor cu de specialitate întreprinse începând cu anii '90 (D.J. Kyle, 1992 şi Z. Cohen,
continut sporit de acizi graşi polinesaturaţi. Y.M. Heimer, (992).
 I
280
CĂTĂLlNA DANIELA STAN
! MEDICAMENTE DE 1.I10S1NTEZĂ 28.1

(cianobacteriile) Spirulina platensis şi Spiru­

Algele procariote verzi-albastre
lina maxima sunt considerate potenţiale surse de PUFA. °
serie de studii au
demonstrat că aceste alge cultivate heterotrofic timp de 7 zile la 300C pot acumula
Concentraţiile
Tabelul nr, 39
de AGL obţinute prin cultivarea unor microorganisrne

aproximativ 12 mg AGL/g biomasă uscată (totalul acizi lor graşi acumulari este de tolr, . -. .. . Speciile: cultivăte " .,.' . . _ . ;·.Con«;entratia , <_ 'timpul de
maxim 5 %). Obtinerea unor linii celulare rezistente la ierbicide a permis creşterea crt «, >~G~nul . :,~. Specia' : . -_ .A(;L~ (ing/g) cwtÎyare (b)
productivităţii acestor alge în scopul obţineri i AGL (totalul acizi lor graşi este de 1. Actinomucor Actinomucor eleguns 16,27 44
4-6% din biomasa uscată, iar cantitatea de AGL este de 21-24%). Mortierella isabellina 9,97 168
Mortierella longicollis 17,54 168
Algele marine eucariote de tipul Chlorella sp. pot acumula un total de 10%
2. Mortier-elia Mortierella ramanniana var.
acizi graşi, din care 10% este AGL. Dacă sunt cultivare În condiţii de stres (mediu 11.74 192
ramanniana
alcalin), fracţiile lipidice cresc la peste 20%.
Mortierella parvispora 0,08 168
Deşi sunt rezultate Îmbucurătoare, totuşi algele nu reprezintă surse economice Mucor amphibiorum 32,99 48
de obţinere a AGL.
Mucor ardhlaengiktus 11,52 52
Fungii oleaginoşi au un conţinut de lipide ce variază Între 25-75 %, În functie Mucor azygosporus 13,18 168
de specie. Aceste lipide au un profil foarte variat ce include şi o serie de PUFA. Mucor bainieri 27,67 44
Ei produc cantităţi mai mari de PUFA comparativ cu drojdiile, motiv pentru care Mucor circinelloides
24,89 44
fungii reprezintă surse importante de obtinere a AGL (cu atât mai mult cu cât f fi. riseocyanus
fungii inferiori biosintetizează doar izomerul y al acidului Iinolenic). Mucor circinelloides
30,90 44
Screening-ul fungilor inferiori permite identificarea candidatului ideal pentru
f circinelloides
Mucor circinelloides
producţia industrială a AGL. Ţinând cont de costurile ridicate ale proceselor 24,32 44
f janssenii
fermentative, este necesară determinarea exactă a celorlalti parametri pentru a Mucor circinelloides
36,72 44
avea o productivitate mare: compoziţia mediului de cultură, densitatea masei f circinelloides
celulare, rata de creştere, rata de acumulare a lipidelor, modatirăţite de extractie Mucor circinelloides
a lipidelor din biomasă. 30,62 52
f lusitanicus
Mediul de cultură trebuie să conţină o serie de acizi monocarboxilici ce se vor Mllcorjragilis 24,95 52
transforma În acizi graşi nesaturaţi (J.L.F. Kock, A. Botha, 1998). Mucorfuscus 20,96 48
3. Mucor
Mucor hiemalis
Compozitia mediului de cultură este: 24,33 48
I. hiemalis
-/ 0,10 gll extract de drojdii; Mucor minutus 26,35 52
-/ 0,25 gll MgS04 '7HP; Mucor mousanensis 23,40 52
-/ 10,00 gll K2HP04; Mucor oblongisporus 13.10 48
-/ 0,62 gll NHJ ; Mucor plumbeus 18,85 96
-/ 0,05 gll CaCI2'2H20; Mucor prayagensis 27,78 48
Mucor recurvus var. indicus 33,63 48
-/ 333 mlll soluţie cu acizi monocarboxilici (4 gll acizi monocarboxihclj.
Mucor recurvus var. recurvus 7,09 44
Ferrnentaţia se conduce la 30IJC şi la un pl-l =5,8. La sfârşitul fermentatiei Mucor rouxii 40,20 48
mediul se filtrează, iar biomasa se usucă prin liofilizare. Acizii graşi obţinuţi se Mucor sili emis 0,73 52
analizează gaz-cromatografic şi se calculează conţinutul În AGL mg/g material Mucor subtilissmus 31,93 96
fungic liofilizat. Cantitatea de AGL obţinută depinde de durata de cultivare a Mucor tuberculosporus 18.41 144
tulpinii producătoare, adică concentraţia creşte cu timpul de cultivare până la un Mucor variabilis 33,26 44
maxim după care descreşte (vezi tabelul fir. 39). Mucor variosporus 33.42 48
MI/cor tvchae var. tychae 17,71 72

f.1
 "
~:
\
283
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
282 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
In cazul microorganismelor eucariote, acumularea lipidelor (suh formă de TG)
Nr.'··
'._ ... ~b~~~=~=;:;;;;~=:;~'i7:i:-""~~=~ nu apare în faza lor de creştere activă. Acest lucru se întâmplă doar atunci când
eN.· cel puţin unul din nutrienţi (cel mai adesea sursele de N) este diminuat, În timp
4. ce sursele de C sunt în concentraţii optime. Astfel, în cazul fermentaţiilor realizate
cu scopul producerii de SCO, apare iniţial o fază de creştere activă a microorga­
KlllZOPUS homothallicus I 19,88 I 192 nismului, ce are loc în conditii optime de mediu, când se acumulează biomasa în
Rhizopus microsporus var.
13,34 44 termentator. Ulterior, apare o fază de stopare a- creşterii microorganismului în
chinensis
momentul în care sursele de C sunt optime iar sursele de N sunt dirninuate, astfel
Rhizopus niicrosporus var.
11,77 48 încât microorganisll1ul Începe producerea de. trigliceride.
microspor.
5. Rhizopus Rhizopus mlcrosporus var. Stresul indus de elementele nutritive, împreună cu diminuarea după 13 h de
11,61 48
rhizopodiformis fermentatie a surselor de azot, au contribuit la obţinerea unei concentraţii mari de
Rhizo/JIIS orvzae 10,27 44 AGL. Dacă adăugarea de acid acetic se face intermitent şi cu viteză mică, astfel
Rhizopus stolonifer var. reflexus 16,33 96 încât concentraţia lui în mediu să nu depăşească nivelul toxic pentru microorganism
Rhlzopus stolonifer var. (10-20 g/I), atunci acidul acetic poate fi folosit cu Succes drept sursă de AGL.
17.24 72
stoioniţer Unii cercetători au Încercat să utilizeze şi alti acizi monocarboxilici drept
surse de carbon. Cultivarea tulpinilor de Mucor javanicus Într-un fermentator de
Foarte multe. studii s-au realizat folosind ca microorganism producător tulpinile 17 I la 300C cu nutrienţi şi acizi monocarboxilici duce la obtinerea unor concen­
de Mucor circinelloidesf. circinelloides (numit şi Mucorjavanicusş (1.L. F Kock , fraţii mari de AGL. Amestecul de acizi carboxilici este prezentat În tabelul nr. 41.
A. Botha, 1998). Acesta este capabil să transforme acidul acetic, folosit ca sursă
de carbon, în AGL. Microorganismul se cultivă pe un mediu a cărui compoziţie Tabelul nr. 41
este: H10-4 1; acid citric-O,5 g; NH4CI-3,2 g; MgS04 '7H20-I,6 g : KH2P(\- Compozitia in acizi monocarboxilici a mediului de cultură
6 g; CaCI2'2H20-O,1 g;. extract de drojdie-2 g; acid acetic-8 g : microele­ la ferrnentaţia lui Mucor javanicus
1-
mente-săruri de Fe, Zn. Cu' şi antispumant. Se introduce inoculul în fennentator,
<. - •• ,;- •.• ,"

. Pro pol1ia di!ll!ipeştec ({iii.n!>.

iar după aclimatizare începe ferrnentaţia, care se desfăşoară la 30oC, la un IrNr.irt. l\~hM' ~op.~fl.rbQx!iic
30
pH =5,5, cu o viteză de amestecare de 700 rot/rnin şi () aeratie de 0,5 v/v/m. 1. CI-bCOOH
C2HsCOOH 10
Cantitătile de AGL obţinute sunt prezentate în tabelul nr. 40. 2.
i-C, I-{, COOH 2,00
3.
/I-C3 1-17 COOH 4.00
Tabelul nr. 40 4. 1,00
Cantitătile de AGL obţinute prin cultivarea Mucor javanicus 5. i-u1-i9COOH
lI-ul·j.,COOH 1,00
pe mediu cu acid acetic 6.

~~:·l;~~i )i!:~ifu~:·h~t;~::&I~_ :i'M!~t:;it~i·'~l~~~a:~;i:;i~~~'

1. O 0,1 •
În acest caz mediul de cultură contine:
acizi mono-carboxilici - 1,4 % ;
2. I 13 I 2,4 • MgS04·7H20 - 0,765 g ;
3. I 20 I 4.1 9,4 18,2 13,9 • ~HP04-1,785g;
4. I 37 I 6,0 20,1 21,0 16.2 • NHJ (25%) - 20 ml ;
5. I 44 I 6,2 23,1 20,0 15.6 • H)P04 (85%) - 1,7 ml.
6. I 61 I 5,4 28,1 21,5 15,7
Fermentaţia se conduce la 30oC, pH =5,8 şi aeraţie de 2,0 mg/I 02 timp de 24
7. I 68 I 6,9 29,0 21,6 15,4
h. Biomasa se separă, se usucă şi se extrage cu hexan, Soluţiile extractive organice
8. I 85 I 7,8 31,9 19,5 16,0
se distilă şi se obţin 5,5 g fracţii de ulei crud/IOD g biomasă uscată. Aceste fractii
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 285
284 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

(ce conţin acizi graşi CI6 şi CIS) se analizează gaz-cromatografic şi se stabileşte

compoziţia în acizi graşi (prezentată În tabelul nr. 42). VIIl.2.2. Biotehoologia acidului arahidonic
Tabelul nr. 42 sin: acid aII cis-5,8,11, 14-eicosatetraenoic, 20: 4«(1)-6)
Compozitia În acizi graşi nesaturaţi a fracţiilor uleioase obţinute
după cultivarea lui Mucor javanicus C2oH3202
Mr = 304,47
. ;~.' F<;-'" -~~-~j~~- A~i~il1j' '~~~~":i~': ,:,~..,'-.';:'
Prnnn_•.. 1 ""
~tt (rţ-.
1. Acid palrnitic (CII> :0) 25 ~~J-t'~2_~H2_t'H2-t6H2-t5H-i:1i-~~2-FH-tlH-tOH2-tH-~H-ZH2-~H-tH-CH2-~H2-f.H2-~OOH
2. Acid palmitoleic (C 16: 1) 1,7 ucid arahidonic 20: 4(0)-6)
3. Acid stearic (Cis.o) 2,1
4. Acid oleic (CIX: 1) 24,6
5. Acid linoleic (C" :2) 23.6 COOH
6. Acid y -linoJenic (C, •. 3) 22,9 CH3
-
~
acid arahidouic 20: 4(".·6)
Aceste fracţii se pot distila pentru a obţine constituenţii separaţi unii de cei lai li.
Producători prolifici de AGL sunt şi fungi ca Mortierella isabellina, care
acumulează peste 5 g/l AGL atunci când sunt cultivaţi pe medii ce conţin glucoză Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
sau melasă (A.J. Kendrick, C. Ratledge, 1992).
Se prezintă ca un lichid gălbui, cu p.t. =-49,5uC. cu nj)2U= l ,481. Este putin
Se lucrează preferenţial cu următoarele genuri: Mortierella isobellina . Monierella solubil în apă, solubil În solvenţi organici ca: benzen, cloroform, alcool etilic
longicollis şi Mortierella ramanniana var. ramanniana . Mediul de cultură contine
absolut, acetonă.
acid acetic, surse de azot, fosfat, potasiu, sulf, microelernente şi cel putin un acid Acţionează ca un modulator al metabolismului fosfolipidic - fosfolipidele ce
de tipul: propanoic, butanoic, izobutiric, ll-valerianic (K. W. Sinden, 1987).
contin acest acid sunt mai stabile.
Ferrnentaţia se realizează timp de 40-120 il, la 25-32oC (preferabil la 30°C), Este precursor pentru diferite eicosanoide, prostaglandine şi leucotriene ce
cu o aeraţie de 2-2,5 mg/l 02 până când sporii se dezvoltă la stadiul de hife În sunt implicare în reglarea proceselor celulare ca: reactiile inflamatorii, coagularea
faza de creştere exponenţială. Atunci se reduc sursele de azot, proces ce duce la sângelui.,jlJillJi.j1e de reprod\lgerţ_etc. . o_o. o_·_o o ... __ 0_. ---- ------
obţinerea unor concentraţii mari de AGL. Când microorganisrnul a atins faza
Intervine .~~_?<::.zvol~a.rea ţesutulu!o!_leuronal şi ocular, fiind componentul princi­
staţionară de dezvoltare se separă prin filtrare biomasa. Aceasta se extrage,
pal. alături de ADH, al fosfolipidelor neuronale şi retiniene.
pentru recuperarea SCO, cu hexan sau cloroforrn, iar fracţiile cu solvent sunt Acidul arahidonic [AA, 20: 4((1)-6)J este un component al laptelui praf pentru
separare în părţile componente prin distilare. Reziduul de la extractia biomasei , sugari, având rol În dezvoltarea şi funcţionarea SNC-tllui la no~~;lffscutCA.stăzi
ce este bogat În proteine, poate fi utilizat in furajarea animalelor. se pr()ai.ic~:A MSC_Q:-liil-lilei Ce-COn\ine-iddarahiaollicoOţiîfarâiiYfiîÎlgi telurici
Fungul oleaginos Cunninghamella echinulata poate fi şi el cultivat pe diverse ode tipul MoLlj_b~ej/jl..qTpj!la,ce'este-litlITzattllnÎ994lIlEuropâpenrruoÎi1ioogăŢîTea
reziduuri agroindustriale pentru obţinerea AGL. când acumularea de uleiuri atinge formulelor de lapte pentru nou-născuţi. În 2001 a primit aprobare şi de la FDA
20% din biomasă.
pentru a ti utilizat in formulele de lapte pentru nou-născuţi.
Toate aceste procese ferrnentative de obţinere a AGL sunt realizate În fază pilot, FDA şi EMEA au acordat aprobare şi pentru DHASCO. un ulei bogat în acid
putând fi extrapolare la nivel industrial atunci când se vor dovedi mai eficiente din docosahexaenoic (ADH) obtinut dintr-o algă marină heterotrofă Cryptltecodinium
punct de vedere economic decât obţinerea AGL din plante. Companiile farmaceu­
cohnii .
tice arată interes pentru AGL-ul microbian, rezultatele obţinute până acum sunt ARASCO şi DHASCO sunt amestecate În proportie de 2: I şi sunt comer-
notabile, ceea ce sugerează că în viitorul apropiat se vor introduce aceste procese cializate sub denumirea de FORMULAID. Acesta este încorporat în preparatele
fermentative la scară industrială. de lapte praf pentru nou-născuţi şi prernaturi tiind comercializate in peste 60 de
 286 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTEDE BIOSINTEZĂ 287

ţări. Aproximativ 1000 de tone din amestecul celor două uleiuri, ce contin acizii
graşi polinesaturaţi corespunzători, au fost obţinute în 2004 şi comercializate.
'Tellliologia de biosinteză a acid ului arahidonic
Foarte P_ytlne._microor~nisme biosintetizează acizi graşi cu lantllri.rnai_ll~ari de
~ Prin uma;e:--Ă{ este-illult I~ai pu~in răspândit în lumea microorganismelor
d~AGL. <x>-d.. C!.f\CllOiY\>-l.lc~,"_.J
. ~ -- Jtir
glucoza, unde 1 g de celule contine aproximativ 600 mg de lipide constituire din
AA (40-70%, adică circa 13 g/I).
Cultiv!!.r~!:l ~lŢIrrs~ţu.!g_(nilor de Mortierella alpina, timp de 5-7 zile pe un
mediu ce contille tJlei de soiacre_şte c,!-n~i~a!ea de A~pr6dusă de miceli.u, la mai
-muti'cfe 5d-%~-ajttn~ la-4-8 g/l AA (S. Shilnlzu 'el ai., 1988).
Mortierella a/pina SAM2104 este un ~ derivat din tulpina sălbatică de
Mortierella a/pina I S-4 ce produce ille.iwij!nb.Qg~În PUFA .sub formă de
J~lice!.ide (K. Higashiyama et al., I 998a). Tulpinile sunt cultivare succesiv În

-
le sunt producătoare de AA, până acum dovedindu-se că un număr de
;~~42 e specn de alge marine sunt prOilucătoare de AA. Cel mai prolific producător ternl~:~re ce ajung la un volum final de 50.000 1, mediul fiind format din:
.
~ l w,) este. al a roşie Porphyridium cruentum, care acumulează peste ~ AA din
• făină de soia-3, 1% ;
totalul acizi or graşi biosintetizari. O serie de studii (Z. Cohen, Y.M. Heimer, --"-'~--
• &111~!_ă-I,8%;
1992) au confirmat posibilitatea cultivării la scară industrială a algei, În lagune
• ulei de .măs!in_e-O, I % ;
deschise. Totuşi, AA se acumulează doar în proporţie de 1,5 % din masa celulară
• ~!i,P04--0,3%;
uscată.Tn funcţie de modalitatea şi condiiţiile de cultivare a algei, se acumulează
• f\la~Ş_94-0, 1% ;
atât _~~ cât şi ~92sa~~f!Q.ii: (AEP) în proportii egale. Extractele obţinute
• CaQ-2'2Hp-0,05%;
În final se fracţionează şi se pot obtine cei doi PUFA ş~rat, AA de puritate
• Mg<;~2·6HP-0,05%.
80%, iar AEP de puritate 97%.
Deocamdată, cultivarea algelor pentru obtinerea de AA este un proces nee_C:;Q: FermetaJia fed-batch se conduce prin adaos de 3,2 % glucoză/zi, la un pH =6,0 _
!~ic, comparativ cu ob\ine"fea AA din fun~i., care acumulează 5-6% AA din­ la 24&C şi-o aeraţie de 120 m'O/I1. Pentl:~aohtine o densitate celulară maximă
masa celulară uscată şi au a~jgl că, În funcţie de conditiile de cultivare, .!!!:!. se-aTIil1entează intermitent fermentarorul cu sursele de azot. Astfel, celulele
.-------._-_---- -- ... _--_._--- ..
produc AEP, deci procesele finale de separare a celor doi PUFA nu se mai impun. fungice ..!!!LJX!ai cresc, dar continuă să asimileze sursele de carQ2P pe care le
Cei mai multi fungi nu produc AA, deşi au fost identificare tulpini de Phytium transformă în I~de, implicit În~~. O~ată (;e_~~~:nuleaz~ inbiomasă o
sp., Saprolegnia parasitica, Conidiobolus spp., Entomoplithom spp, şi Mor­ cant~a.te_suticientă_d~l1JslJg~.'_rJ~e.~i~I._~C:.:.~J!.ură se tiltreQl.ă ~~aju~<?ru_l. ~r
tierella sp. producătoare de AA. Studii recente demonstrează că un număr de '-presă ~au a centrifugelor.Jiltrante continue. Măsa-cefi.ilarii" se-spală ell ap~.~iSi:ilat.~.
aproximativ 30 de specii de fungi produc AA. _~i se ~ucă.lE 1050~ timpde--2 h. Ulte_r!9.~j~ . extrage _~lI_ t~an,~a
Nu toate aceste microorganisme au un potential biotehnologic industrial, Însă _extr~.:t!_v.a:=.s_~p'::'.l~;vaporări i pentr~~i.!!~~p.~E~<!_~1 ventul, U I~i ul.~~~!.ll:!t~_ge
unele dintre ele reprezintă ş_urse bogate de AA,_ aşa cum este~Monier~llil4ipiiul, rafi.nat, decolorat
~ ~ ----_-_şi.. dezodorizat
-_~. ,. _.. __pentru
" a Înd~ărta
= _".urmele
. '-1-c~rlaltor COll!Q~llle.n~
--- ---.-..~-- ..
un ~)teluric ce apartine clasei de Phycomycetes. -ceruiare -extrase odată cu trigliceridele ce interesează. Acest ulei contine doar
Unii cercetători (N. Totani, K. Oba, 1987) au raportat că tulpiniJe de Mortie­ AA,"I'IIi1dlipsi'i(i~ 'AEr '.s';~_~jt~-)ipi·d~~·'·· -.' . - . .. - -. - ,.._-
rella alpina acumulează până la 79% AA din totalul acizi lor graşi biosintetizaţi , Rezultă astfel un ulei de culoare ~lben-s~:~i1ucitor (datorită rernanenţei unor
care reprezintă 26% din masa celulară uscată. Pentru a obtine randamente mari, carotenoide), ce are gust şi miros plăcut şi caracteristic. Acest ulei microbian este
această tehnologie necesită o fermentatie de până la 16 zile, ceea ce duceJa foarte rezistentla-~xici~;~-:-d~t~rită prezenţei ~tât a unor compuşi antioxidanţi
creşterea costurilor. Aducându-se o serie de lrnbunărăţin, s-a reuşit ca în primele endogeni. deşI aÎcel6i' exogeni adăugail jJe parcursul prelucrării industriale.
10 zile de fermentaţie tulpinile acestui fung să crească după care, În absenta unei În final, ~lef~1 pur obtlni.lt este' ~Iei de floarea soarelu~~E~,l?_~
aeraţii şi la o temperatură mai scăzută, continutul în AA să tie de 70% din totalul centraţia stan~!!!'d ~~_4Q%.__~A, i se adaugă antioxidanţi - tocofgol (0,025 %) şi
acizi lor graşi. p~1 (0,025%) şi se cOI11t;rCl"ali~ea:~ICsub dt!I~~mirea de ARASCO.
Alti cercetători (K. Higashiyama el ai., 1999) au demonstrat că prin ferrnen­ - Acest ulei se adaugă în formulele de~~!.pentru prematuri şiYI~a.r.i.
taţia tulpinilor de Mortierella a/pina se produc aproximativ 30-60 g celulell mediu La ora actuală există cel putin trei procedee diferite deo5ţinere a AA, ce sunt
de cultură după 12-15 zile de fermentatie continuă În care se adaugă intermitent implementare în diverse colturi ale lumii:
 288 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 289

o în Europa, procedeul este realizat de compania DSM Food Specialities din este capabil să realizeze biosinteza endogenă de ADH şi AA, pornind de la acizi
Italia, care vinde AA în America de Nord sub contract exclusiv cu compania graşi drept precursori, această biosinteză endogenă este suboptimală, cantităţi le
Martek Biosciences - procesul este unul foarte productiv, iar AA obţinut de endogene fiind mici pentru necesarul de dezvoltare al nou-născutului,
această companie asigură 95 % din productia anuală de AA din lume; Laptele matern conţine ADH şi AA preforrnaţi deci, nou-născuţii alimentaţi
o în Japonia, procedeul este realizat de compania Suntory Co. Ltd ; natural au surse de acizi graşi polinesaturaţi. Pentru cei alimentaţi artificial, este
o în China, procedeul este realizat de compania Wuhan Alking Bioengineering necesar ca formulele de lapte praf să fie completate cu aceşti acizi graşi poline­
Co. Ltd. saturaţi obţinuţi pe cale fermentativă (DHASCO şi ARASCO, bogati în ADH şi
respectiv AA).
Administrat per os, odată cu laptele praf, ADH se absoarbe în proportie de
VIII.2.3. Biotehnologia acidului docosahexaenoic 80 %. Este rapid încorporat În fosfol ipidele mernbranelor celulelor retiniene şi
cerebrale. Nu a demonstrat toxicitate În studiile pe animale, sau reacţii adverse în
sin: acid ali cis-4, 7,10,13,16, 19-docosahexaenoic, acid cervonic, doconexent, studiile pe copii.
22: 6«(1)-3)
DHASCO şi ARASCO sunt uleiuri trigliceridice uşoare cu profil de acid gras.
C2zH3202 Nu conţin acid eicosapentaenoic (AEP), ce este asociat cu încetinirea creşterii la
M, = 328,49 copii. Nu sunt prezenti acizi graşi trans sau ciclici. Fracţiile sterolice sunt de
aproximativ 9,5 rng/g pulbere uscată pentru DHASCO şi 7,9 mg/g pulbere uscată
:!2 21 2fJ Il) 18 17 16 15 1'1 13 12 11 10 9 8 7 6 5 '1 3 2 1 pentru ARASCO (adică mai puţin de 1 % din masa acestui ulei). Fracţia sterolică
C H,CH,-c H-C H-C H,-CH-C H-C HrC H-C H-CH,-C H-C H-C H,-C H-( H-CH,-C H-CH-CH,-C H,-COOH
este reprezentată în principal de dinosterol pentru DHASCO şi de steroli obişnuiţi
acid docosahcxacnoic 22:6( (O.))
în cazul lui ARASCO.
Compozitia chimică a celor două uleiuri comercializate, ARASCO şi DHASCO
~COOH este prezentată în tabelul nr. 43, iar fracţiile sterolice în tabelul Ilf. 44 (după C.K.
CHJ VanPelt el ai., 1999).
ucid docosahcxacnoic 22:6(",·3)

Tabelul nr. 43
Compozitia chimică a uleiurilor DHASCO şi ARASCO ce se adaugă
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
. în formulele de lapte praf pentru copii
Se prezintă ca un lichid clar, incolor până la slab gălbui, cu miros caracteristic de
peşte, cu p. t. =-44,7 până la -44,50C, cu nD 26 = 1,5017. Este puţin solubil în apă, . ':', ;:: :::~:A~ţ'O ;;ii.;,';:?:· y ':~'., "\\'('\';:'i' \., ,'o
solubil în solvenţi organici ca: benzen, cloroform, alcool etilic absolut, acetonă. . . . ~·,~~i~ul·i~r;Y: ,,;;' ':)'% din' io~~:( ,. "'::A~l~~i ~~~t':;·~(;,
"~o
Acidul docosahexaenoic (ADH) are rol în menţinerea sănătăţii aparatului
Acid rniristic ACid mmsuc
cardiovascular prin reglarea elasticităţii pereţilor arteriali, prevenirea trombozelor, 0-2 I 10 - 20
(14: O) (14: O)
menţinerea în limite normale a nivelurilor sangvine ale trigliceridelor şi coleste­
Acid palmitic Acid palmitic
rolului. Este esenţial pentru sinteza prostaglandinelor, molecule complexe cu rol 3 - 15 I 10 - 20
(16: O) (16: O)
în apărarea organismului împotriva infectiilor. Studiile au demonstrat că adminis­
Acid palmitoleic Acid palrnitoleic
trarea de ADH poate avea efecte benefice asupra sănătăţii organismului, prin scă­ 0-2 I 0-2
(16: 1) (16: 1)
derea incidenţei evenimentelor cardiovasculare nedorite la persoanele predispuse.
Acid stearic Acid stearic
Acidul docosahexaenoic [ADH, 22: 6«(I)-3)J, alături de acidul arahidonic [AA, 5 - 20 I 0-2
(18: O) (18: O)
20: 4(0.)-6)] este principala componentă a fosfolipidelor din creierul şi retina
Acid oleic Acid oleic
umană şi se acumulează rapid în ţesutul neuronal al fătului şi al nou-născutului în 5 - 38 I 10 - 30
(18: 1) (18: 1)
timpul ultimelor luni de gestaţie şi în primele luni de viaţă. Deşi fătul şi nou-născutul
 r
I
j

290
CĂTĂLJNADANIELA STAN
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 291

;;~~{~,;:ţ(,;,~"" :;J~sS()~,S;!~.~~:i~:.~L ';,.,1:·~~lIT;~i~iGiRH1S.CO'ţ, '" Tabelul nr. 44

Fracuile sterolice identificare În uleiurile DHASCO şi ARASCO
, ,:,"'cidui:~ii4"i \'ii"\d":'~~"", '{Aci';i.J#,,~,; ("" ~in_i " .-., "-.-
Acid linoleic 4 _ 15 I Acid linoleic
Fracţiile şterollce Den'iupir~ ": ~~Umj~~ % din sterolii
(18: 2)
(18: 2) 0-5 .. ~ . '. • ~luU!iltic~ . cC)I~~un~ total]
Acid linolenic Acid arahidic - DHASCO
(18: 3) 1-5
(20: O) 0-1 I I
Acid arahidic
0-1 Acid behenic - 4a,23, 24-tri meti 1 celesta- 22 -en- 3 [i-ol 30: 1 dinosterol 31,5
(20: O) 0-1 colesta-Sc'z-dien-Jţi-ol 27: 2 dehidrocolesterol 9,6
(22: O) , i
Acid eicosatrienoic
Acid docosapeIllaenoic 4a,24-dimetil colestan-Jji-ol 29 :0 - 9,2
1-5
(20: 3)
Acid arahidonic
(20: 4)
38 - 44
(22: 5)
Acid docosahcxaCIlOic
0-]

40 - 45
II

II
I
I
4(1,23 ,24-lrimeti I colesta-S.Zâ-dien-
3P-ol
30: 2 dehidrodi nosterol 8,2

(22: 6) colesta-v-en-Ju-ol 27: 1 lanosterol 7,5

Acid behenic
Acid nervonic -- 4a,24-di rneti 1 col esta- 22 -en- 3~-ol 29: 1 - 6,4
(22 :0) 0-3 0-2
(24: 1) 4u,23,24-trimetil colesta-Zz-en-Sţl-ol 30: 1 dinosterol fi,O
Acid docosapentaenoic
0-3
-- 4a,23,24-dimetil colesta-5-en-3(3-ul 29: 1 - 4,6
(22: 5) Alti acizi 0-3
4u,23,24-trimetil colesta-24(28)-ene- 30: 1 - 4,2
Acid lignoceric
(24: O) 0-3 3p-ol
colesta-r, .r-dien-Sţi-ol * 27 :2 - 3,6
colesta-S ,24-dien- 313-01 27 :2 desmosterol 2.4
Trigliceridele, ce contin ADH şi AA, din compozitia DHASCO şi ARASCO
colesta-S-en-Bb-ol 27: 1 colesterol 1,7
sunt diferite de cele prezente în laptele matern. În laptele matern ele sunt
esrerificate În poziţile s(J)-2 şi s(0-3, În timp ce În DHASCO şi ARASCO sunt 23 sau 24-mctil colesta-5,7- 28 :2 - 1,9
esterificate la toate cele 3 pozitii hidroxilice ale trigiceridei. dien-Jţi-ol
Adăugarea celor doi acizi graşi polinesaturaţi În laptele praf se face În proportie - 27:3 - 1,3
de până la 0,5 % pentru ADH şi respectiv AA, ceea ce asigură un consum zilnic un 5,7-dien sterol 29: 2 - -
de 70-85 rng/kg/zi din fiecare acid gras polinesaturat.
ARASCO
Aceşti acizi graşi polinesaruraţi sunt adăugaţi În formulele de lapte praf pentru I I
alirnentaţia artificială a nou-născu ti lor Încă din 1994 În unele ţări europene şi din colesta-S ,24-dien- 313-01 27:2 desrnosterol 67,3
1998 în Australia şi Noua Zeelandă. În 2001 erau adăugaţi În aproximativ 17 % 24-metil colesta-5,24(25 sau 28)- 28 :2' - 14,0
din formulele de lapte praf utilizate la nou-născuţi] de până la 6 luni şi în dien-Jţi-ol
aproximativ 87 % pentru formulele utilizate la copii prematuri. 24-metil colesta-S.Zâ-dien-Sâ-ol 28:2 - 12,3

. Tehnologia de .hlnsinteză a.aciduluLdocosahexaenoic - 28 :2 - 2,1

4a .41.1, 14-trimetil-8,24-dien- 3f.l-ol 30:2 lanosterol 1,1
Deşi ADH este o componentă majoră a uleiului de peşte (de unde s-ar putea
colesta- 5 ,25-dien- 3p-ol 27: 2 - 2,0
extriiger,-eTesteinsotit"ae-~JeICOsap-entilenoicTAEP~-2lF5(w'=3JTCe scade
24, 25-meti len celesta- 5-en- 3 (3-01 28: 1 - nedetectat
~~~. 1\-0 !i-Şt. es.f(;! __afo~i~!:~u Î~rîlÎ'~~ _l?r:e~~!~llf~_cop'1 i.-;-~_rimJtlrg;;,
AEP nu trebUIe sane'prezent În formulele ClefaPte praf pentru nou-născuţi. De *x reprezintă pozitia nespecificată a dublelor legături
asemenea, 'ex is-tă"rts-cuf ca ufeiYifae'peşte să fîeirnp-uritlcat cu poluanţi tox ic'i ce
i
ajung în ficatul de peşte şi implicit În uleiul de peşte. I
I

l
 292 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
Ţinând cont de aceste neajunsuri s-a Încercat găsirea unor surse alternative şi
sigure de ADH, cum sunt algele, fungii sau bacteriile.
fungiiJ.i bacteriile(~~a_<:~.m1Ulează cantităţi suficiente de AQH pentru a putea
fi dezvoltati la nivel industrial, În schimb~c:!:Q:~!g_~.I. ~.! ce sunt eucariote hetero­
trofe, sunt producători prolifici de PUFA şi implicit de ADH.
Dintre toate micro-algele, ThraUS"iăCh)!.!riJJlllşi Schizoc/;ytriulII acumulează
cele mai mari cantităîideADH, dar au o rată de creŞteren1i~ă-şi sunt mai greu
de exploatat la nivel industrial. .. ---
Există studii (P.K. Bajpai el ai., 1991a, b; A.J. Kendrick , C. Ratledge,
1992b) care certifică faptul că cele mai mari cantităţi de ADH s-au obtinut
utilizând tulpinile de Thraustochytrium aureum ATCC 34304, ce acumulează
până la 50% ADH din totalul acizilor graşi (continutullipidelor produse de celulă
fiind de maximum 15%). Însă, În urma unei ferrnentaţii de 72 de ore s-au izolat
doar 4 g de biornasă/l mediu de cultură.
În cazul tulpinilor de Schizochytrium sp. HX-308, continutul În ADH raportat
la totalul acizilor graşi nesaturaţi este de 60% prin adaos de 4 g/I acid malic În
faza de acumulare rapidă a lipidelor. Totalul lipidelor biosintetizate este de 35 %,
adică 19 g/I, atunci când se adau&ă 40 mI alcool etilic/I În faza târzie de acumulare
a lipidelor.
Au fost studiate şi alte micro . alge (M. Hassan el al., 1994). cum ar fi
Cryptococcus curvatus , care acumulează prin fermentatie o biornasă ce contine
46% (v/v) lipide atunci când creşte timp de 35 de ore pe mediu diluat de suc de
pere acidulat. Raportul C: N din suc este de aproximativ 50 g/g. Eficienta
conversiei substratului este de 0,48 g/g pentru biomasă şi 0,22 g/g pentru lipide.
Tulpina de Cryptococcus curvatus NRRL Y-1511 (I"l.A. El-Fadaly el al ..
2009) poate fi folosită pentru producerea de ADH folosind medii ieftine ce contin
rnelase şi gluten de porumb ca surse de C (125 g/l), respectiv N (0,13 g/I).
Fermentaţia se conduce la 28oC, la pH =5.5, timp de 72 h şi o viteză d~ rotatie
a agitatorului de 220 rot/rnin, când se obtin următoarele cantităţi de acizi graşi
nesaruraţi :
-'='~ Procesul
o 30,68 % acid linoleic ;
o 22,66% acid oleic;
o 16,74% acid palmitic.
Totalul acizi lor graşi nesaruraţi (w-6) este de 58,04 %.
Cultivarea tulpinilor de Crypthecodinium cohnii (T. Lopes da Silva el al .,
"'componente celulare extrase odată cu trigliceridele ce interesează.
2006) se poate realiza mult n~~(bine pe un mediu ce contine(ii-dodecan/I % v/v),
ce este un ~$e~en, care t~~r~z.::ază_c.:~şţer!,;<L..!lli.cJ:oorganismului şi
P~Q..~~_I?!-l.După 135 de ore de fermentatie s-au găsit 6,14% ADH În
biornasă (din totalul acizilor graşi produşi, ADH reprezintă 51 %), iar rata de
producţie a fost de 9,75 rng/l/h de ADH.
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 293
ADH se poate obtine şi din tulpinile de Ulkenia sp. printr-un proces ferrnen­
tativ de tip fed-batch, la sfârşitul fermentaţiei uleiul bogat În ADH (conţine 45%
ADH din totalul de acizi graşi) se separirŞiSeSI-a6iÎ1'ZeaZă-- prin adaos de
anti9~ti (tocoferol). -- .
Dintre toate aceste tulpini de micro-alge studiate trei dintre ele au fost dez­
voltate şi implementare la nivel industrial de o serie de companii farmaceutice.
•..po.hb.(l~ ce este o dinoflagelată, este dezvoltată de
Tulpina de '.(1cypthe{;b(:lj1iJ./.!}tI,
compania americana Martek Biosciences, Columbia, tulpinile de t~chiioiyjl(tll@:
sp., ce apartin ordinului Thraustochytriates , sunt dezvoltate de compania ăme~
ricană OmegaTech Inc., Colorado, iar tulpinile de vll~~iild'' SJj,~'(izolate initial din
Oceanul Pacific), ce apartin ordinului Thraustocltytriaies; sunt dezvoltate de
compania Nutrinova GmbH din Frankfurt Germania.
U_leiurile bog?_te ÎI.~6'p_H obţinute din tulpinile de Schizochytrium sp. şi Ulkenia
sp.(ill(Sunt Încă aprQQate pentru utilizarea în tormulek;"d~_I~r"ii·QI~afj>entr~ . c_~pii,
deşi companiile poducătoare au Început demersurile pentru primirea avizelor.
Însă, ele sunt deja utiliy.ţ.te_ca
_-- ingrediente alimentare - ce se adaugă În unele produse
de panificaţie, de cofetărie, în băuturi etc., ca surse alternative de acizi graşi (1.)-3.
Celulele Întregi ale acestor microorganisme sunt utilizate şi În furajarea păsărilor,
pentru obţinerea de ouă bogate in acizi graşi (1)-3, în hrănirea peştilor etc.
~Qogat În ADH obtinut cu ajutorul tulpinilor de Crypthecodinium cohnii
este cel utilizat În formulele de lapte praf pentru nou-născuţ]. fiind comercializat
sub denumirea de DHASCo. Compania Martek produce 95 % din piata globală
de ADH.
În mod natural rnicro-alga se dezvoltă În medii cu sali nitate mare. Însă aceste
medii nu pot ti utilizate În fermentatoarele de oţel (le corodează). De aceea, s-au
obtinut prin I..~ genetice şi prin ~~.I~~lie, ţţ1JQ~.!1j de alge care. se pot
dezvolta pe medii cu salinitate scăzută ce pot fi utilizate în procesele industriale
şi care evită corodareautiiajel;;;::---- . .
de fermentatie se conduce succesiv Într-o serie de ferrnentatoare.
dupi(inodellif prezentat la obiirierea AA. Odată ce se acumulează iil b{oma"să o
cantitate suficientă de 'ul~i~~Cmed i~i de cult~~ăse-filtrează cu ajutorul centri-
_H---- - ~----.-.. c ... ~.- .-._
.._- "." _.-.~_. . ------.---.....--
fugelOrfiHrante continue, se usuca ŞI se extrage cu hexan. Uleiul obtinut este
~ .. - ~._-
l~suplisdec<.)16răm şi d'ezodorizării pe.ltru a Îndepărta urmelecelor'laltor
..•. .~
".".
'ih-filial se obtine un ~.Iei portoca~ (datorită rernanenţei unor carotenoide), cu
gust şi miros caracteristic. Este diluat cu ulei de floarea soarelui până la con­
centraţia standard de 40% ADH: (se adaugă aniioxidanti - tocoferol (0,025 %) şi
palmitat de ascorbil (O,025%) şi se c(lmerciali~~ază sub d~l1ul11irea de DHASCO.
_~
Acest ulei se adaugă În formulele de lapte praf pentru prematuri şi sugari .
.
 294 CĂTĂUNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BlOSINTEZĂ 295

°
schemă a procesului de fermentaţie şi separare este prezentată în figura
nr. 65 (modificată după C. Ratledge, 8. Kristiansen (eds.), 2006).
Proprietăţi fizice, chimice, farmacologice
Se prezintă ca un lichid incolor, cu no20= 1 ,49865. Este puţin solubil în apă,
solubil în solvenţi organici.
f..er $ur:;~ tie SUJ'!:e de Din punct de vedere biologic, acidului eicosapentaenoic (AEP) i se atribuie
:acul carbon aL,;.1 Antlsr~UI:r,an~
. ~_.! capacitatea de modelare a metabolismului celular. Acest lucru presupune biosin­
'" \ I _./~;(' adauz.1 i"1'l toate
teza eicosanoidelor, ca precursori ai prostaglandinelor, trornboxanilor şi leucorrie­
fermentatoerete nelor, includerea selectivă a acizi lor graşi în membranele funcţionale, modelarea

-:J _ .", /
j asociatiilor enzimatice în dependentă de necesităţile fiziologice a celulelor.
.~I_'vcul , -- Organismul uman conţine enzimele care asigură sinteza acidului eicosapen­
.
"',
I~ll
/
/ taenoic În cantităţi suficiente (pornind de la acidul a-linolenic), dar sub influenţa

,1 .se factorilor endogeni (afectiuni metabolice, vârsta) şi a celor exogeni (alimentaţia,

Q
consumul de alcool) activitatea enzimelor scade şi se dezvoltă o insuficienţă a
'c.::.J ..... ,--"'-'_____, . .. . . • ~.~ '" _._ eflucl·li
acestui acid. Prin urmare, apar o serie de dereglări În functionarea multor sisteme
<,
r ./ ~:"\ şi organe, fapt ce conduce la aparitia diferitelor stări patologice: afectiuni car­
i<f:>~ EX!1C&Cllt cu
diace, respiratorii, cutanate, imune, ale sistemului nervos, endocrin şi reproductiv,
hCl(aJl
Putem spune că acidul eicosapentaenoic poate fi indicat în tratamentul afec­
~~ tiunilor aparatului cardiovascular (intervine prin reglarea elasticităţii pereţilor
Figura nr. 65 Schema procesului de fermentatie pentru obtinerea ADH arteriali, prevenirea trombozelor, menţinerea în limite norma le a nivelurilor
legendă: l - fermernator inoculator; 2 - fermentaror intermediar; J - fermentator de regim ; sangvine ale trigliceridelor şi colesterolului), în tratamentul unor boli autoimune
4 - ccntrifugă filtrantă : 5 - atomizor; 6 - vas de colectare a biomasci uscate.
(prin actiunea sa antiintlamatoare), în tratamentul diverselor tipuri de cancer. în
tratamentul schizofreniei (reduce simptomele asociate cu schizofrenia).
VIII.2.4. Biotehnologia acidului eicosapentaenoic
Tehnologia de biosinteză a acidului eicosapentacnoic
sin: acid aII cis-5,8, 11,14, 17-eicosapentaenoic, icosapent, 20: 5«(.1)-3), acid tim­ Fungii conţin cantităţi importante de AEP, care apare alături de AA. Ei realizează
nodonic direct conversia AA în AEP, prin intermediul desaturazei 617, enzimă prezentă
C21l13002
în aceştia.
Mr = 302,45 Utilizarea fungilor, Mortierella alpina şi Mortierella hygrophila duce la obţine­
rea a 29 mg şi respectiv 41 mg AEP/g celule (S. Shimizu el al., 1988b). Adăugarea
21J IY 18 17 16 IS 14 13 12 11 10 9 8 7 6 S 4 3 2 1 exogenă de acid o-linolenic (18: 3 (1)-3), ce este transformat de fungi În AEP,
CHrCHcCH-CH-CHrCH-CH-CH2-CH-CH-{:H,CH-CH-CH2-CH-CH_CHîCH2-CH2-COOH
duce la creşterea randamentului, obţinându-se chiar 67 mg AEP/g celule uscate
acid cicosapentacnoic 20:5(.rJ)
(H. Yamada el al., (992).
°
= acid eicusnpcntacunic 20:5«(1)'03)
OOH

CH)
serie de cercetători (0.3. O'Brien, G. E. Senske, 1994) au raportat obtinerea
a 25 mg AEP/g celule uscate, prin cultivarea, la nivel de statie pilot, a fungilor
Pythium irregulare. După separarea cu ajutorul morilor coloidale, procesul de
obtinere a AEP a atins randamente de 96%.
Gama largă ele acizi graşi polinesaturaţi, caracteristică rnicroalgelor, precum
şi capacitatea acestora de a-şi modifica profilul Iipidic în functie de schimbările
 297
MEDICAMENTEDE BIOSINTEZĂ
296 CĂTĂLINA DANIELA Sli\N
Din biomasă se extrag lipidele cu un amestec de hexan : alcool etilic (1 : 2,5 v/v).
conditiilor de cultivare, a determinat utilizarea lor în producerea acizi lor graşi
Preparatullipidic obtinut se caracterizează printr-un continut mare de AEP, are o
polinesaturaţi. consistenţă vâscoasă, este de culoare brună şi prezintă un miros specific de ulei
Valorificând speciile de micro-alge, astăzi se cercetează căile de stimulare a
sintezei acidului eicosapentaenoic şi se elaborează tehnologiile corespunzătoare de peşte.
O schemă a separării AEP din biomasa de porfiridium se poate observa în
de obtinere a lui. Aceste tehnologi i se bazează pe modificarea bioreactoarelor, a
condiţiilor de cultivare şi a compozitiei mediului, care permit stimularea sintezei figura nr. 66.
de AEP. complex Zn-Aa 2,5 mg/I lnocul
Atunci când A. Seto el al., au anuntat în 1984 că micro-alga Chlorella
minutissima produce cantităţi mari de AEP, această algă a început să prezinte
interes pentru cercetători şi producători, ca sursă atractivă pentru acest PUPA.
l i
Mediu de cultură ~~nentaţi~--l
Alga poate biosintetiza până la 45 % AEP din totalul de acizi graşi biosinteizaţi,
~C,96ore

r--~
deşi se obtine aproximativ 2,75% AEP raportat la biomasa uscată.
Au fost identificate şi alte micro-alge ca potentiale surse de AEP, aşa cum se
poate observa În tabelul nr. 45 (după H. Kleinkauf, H. von Dohren (eds.), 1997).
Sistem de solvenţi
Tabelul nr. 45 hexan/alc Oo l, 1 :2,5 v/v Extracţia lipidelor
Microalge ce pot fi utilizate drept surse de AEP -_._-~ din biornasă
. '.~~ . '. " Conlinutul În liplţ,Je >;~titJlţcâ"de;AEP din'
...~~~.
,:: .... c) .....
~"" ,... '.; . ....IlbiOiIiaSel(%)
,.,.' .•........ , tOtâlUl
.:,'.'
dhdti ". t%)
... : .. ~."
1.
Phaeodactylum
tricornutum
15 35 1
2. Nannochloropsis oculata 14 45 [ p~ificare 1
3. Isochrysis galbena 22 26
4. Porphyridium cruentum 5,6 41
5. Chlorella minutissima 15 45
1
Extract lipidic ce conţine
Micro-alga Porphyridium cruentum este larg utilizată În biotehnologie, ca 5,19 g/llipide,AEJ> 1,23%
sursă de acid eicosapentaenoic. Există cercetări recente (L. Rudi, 2006) cu
privire la îmbunătăţirea procesului de fermentatie pentru a creşte productivitatea Figura nr, 66 Schema obţinerii AEP cu ajutorul tulpinilor
în AEP. S-a constatat că adăugarea în mediul de cultură a unor compuşi coor­ de Porphyridiwll cruentum
dinativi ai zincului cu aminoacizi stimulează lipidogeneza algei şi implicit canti­
tatea de AEP biosintetizată. Compania americană Martek Corp. Inc. a dezvoltat o tehnologie de obtinerea
Tulpina de Porphyridium cruentum acumulează în faza de creştere exponenţială a AEP cu ajutorul unor micro-alge (compania a codificat numele acestora), ce
acid arahidonic şi acid eicosapentaenoic, în proportii egale, iar în faza staţionară sunt cultivate heterotrofic, folosind drept sursă de carbon glucoza. Tehnologia
raportul acestor acizi devine 6: I în favoarea acidului arahidonic. Pentru a avea permite obtinerea unei densităţi celulare de 50 g celule uscate/l. Acestea au un
cantităţi maxime de AEP şi pentru a bloca biosinteza excesivă de AA se întrerupe continut de 50% (v/v) uleiuri, în care AEP se găseşte în proportie de 5% din
ferrnentaţia după 96 ore de cultivare. totalul acizi lor graşi. Uleiul produs de aceste microalge se separă uşor prin
La sfârşitul fermentaţiei se obtin 5,0-5,2 g/l biomasă de porfiridium, cantitatea
extractie şi nu contine alti PUPA.
de lipide extrase fiind de 5,8-6,0%, din care AEP constituie 1,20-1,23%.
 298 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 299

Compania comercializează AEP ca ulei pur. Produsul are pret de cost mai
mare decât AEP extras din ulei de peşte, dar care este În amestec cu ADH.
Ţinând cont că cererea de AEP pur, obtinut cu ajutorul micro-algelor, este
foarte mică, la ora actuală se comercializează doar AEP izolat din ulei de peşte.
Atunci când cererea de AEP pur, obtinut din micro-alge, va ti mai mare aceste
tehnologii ferrnentative se vor implementa la nivel industrial.
Bibliografie
1. Abbas K.A., Lichtman A. H., Pober J .S., Cellular and Molecular tnnnunotogv.;
W.B. Saunder'x, Philadelphia, 1994, 457-472;
2. Ackrnan R.G., "Gas-liquid chrornatography of fauy acids and esrers" În: Methods
in Enzymolog», Lowenstein J.M. (ed.), Academic Press, NY, 1969,329-381;
3. Ackman R.G., McLeod C., Rakshit S., Misra K.K., 1. Food Lipids, 2002, 9:
127-145 ;
4. Agostoni C., Riva E., Trojan S., Bellu R., Giovannini M., Lancet , 1995,346:
638-641 ;
5. Archer D.B., Connerton 1. F., MacKenzie D.A., "Filameruous fungi for production
of food additives and processing aids" În: Food biotechnotogv, Sthal U., Donalies
U.E.B., Nevoigt E. (eds.), Springer Verlag, Berlin, 2008, 100-147;
6. Asami K., Hanai T, Koizurni N., Biophvs. J., 1980b, 31: 215-228;
7. Asarni K., Yonezawa T., Biochim. Biophvs. Acra, 1995a, 1245: 99-105;
8. Bajpai P., Bajpai P.K., Wartl O.P., Appl. Microbiol. Biotechnot., 1991b, 35: 706-710
9. Bajpai P.K., Bajpai P., Ward O.P., 1. Am. Oii Chem. Soc., 1991a, 68: 509-514;
10. Barc1ay W., Weaver C., Metz J., "Developrneru of a DHA production technology using
Scnttocnytnnm. a historical perspective" În: Single Cell Oils, Cohen Z., Ratledge
C. (eds), American OiI Chernists ' Society Press, Champaign, SUA, 2005, 36-52 ;
II. Barton B.A., Iwama G .K., A 111111. ReI'. Fish ots., 1991, J : 3-26:
12. Beach D.I-I .. Harrington G.w., Gellerman J.L., Schlenk H., Holz G.G., Biochim.
Biophys. Acta , 1974, 369: 6-24 :
13. Beach D.H., Holz G.G., Biochim. Biophys. Acra, 1973,316: 56-63:
14. Beii J.G., Ashton 1., Secornbes c.i.. Weitzelb B.R., Dicka, J.R., Sargent l.R.,
Prostaglandins Leukot . Essent , Fat. Acids, 1996, 54: 173-182;
15. Beii J.G., Castel! J., MacDonald F.M., Sargent J.R., Fish Physiol. Biochem.,
1995, 14: 139-151;
16. BeII J.G., Sargent J.R., Aquaculture, 2003, 218: 491-499:
17. BeII J.G., Tocher D.R., Sargent 1.R., Biochim. Biophys. Acra, 1994, 1211 : 335-342;
18. BeII M.Y., Henderson R.J., Lipids , 1990,25: 115-118;
19. Bellou S., Makri A., Fakas S., Aggelis G., "Bioconversion of raw glycerol into
triacylglycerols rich in y-linolenic acid", l" National Mikro Siokosmos Society
Conference, 2008, Athens, Greece, 163;
20. Bigogno C.; Khozin-Goldberg 1., Boussiba S., Vonshak A., Cohen Z., Phytoche­
mistry ; 2002, 60: 497-503;
21. Bligh E.G., Dyer N.J., Can. J. Biochem. Physioi., 1959,37: 911-917;
22. Boswell K., Koskelo E.K., Cari L., Glaza S., Hensen D.1., Williams K.D., el (II.,
Food Chem. Toxicol., 1996, 34: 585-593;
23. Butle w., J. Chromatogr., 1983,261: 142-145:
24. Calder P.C., NIII. se«, 2001, 21 : 309-341;
25. Calon F., Lim G.P., Yang F., Morihara T, Teter B., Ubeda O., Rostaing P., Triller A.,
Salem N., Ashe K.H., Frautschy S.A., Colc G.M., Neuron, 2004, 43: 633-645;
26. Carlson S.E., J. Nutr., 1996, 126(supl.): 1092-1098;
27. Carlson S.E., Werkamn S.H., Rhodes P.G., Tolley E.A., Am . .1. Clin. Nutr., 1993,
58: 35-42;
28. Certik M., Andrăsi P., Sajbidor J., J. Am. Oii Chem. Soc., 1996, 73: 357-365:
29. Certik M., Shimizu S., 1. Biosci. Bioeng.; 1999,87: 1-14;
30. Cohen Z., Heimer Y. M., "Production of-polyunsaturated fatty acid (EPA, ARA,
GLA) by the rnicroalgae Porphyrium and Spirulina" În: Industria! applications of
single cell oils, Kyle D. J., Ratledge C. (eds.). American Oii Chernists' Society
Press, Champaign, SUA, 1992,243-273;
31. Cohen Z .. Ratledge C .. Sing!e Cell Oils. American Oii Chemists ' Society, Charn­
paign, SUA, 2005;
32. Craig-Schmidt M.C., Huang M.C., "Interaction of n-6 and n-3 fauy acids : irnpli­
cations for supplementation of infam formula with long-chain polyunsaturated Iauy
acids" În: Lipids in lnfant Nutrition, Huang Y.S .. Sinclair A.J. (eds.), American
OiI Chernists ' Society Press, Champaign, SUA, 1998, 63-84;
33. Crawford M.A., Costeloe K., Ghebrerneskel C., Phlacros A., Skirvin L., Stacey F.,
Am. 1. Clin. Nutr., 1997, 66: 1032S-1041 S;
34. De Swaaf M .. Pronk J.T, Sijtsma L., Appl . Microbiol. Biotechnol., 2003, 61 : 40-43:
35. De Swaaf M., Rijk TC., Eggink G., Sijtsma L., ./. Biotechnot., J 999, 70: 185-192;
36. De Swaaf M., Rijk TC., Meer P., Eggink G .. Sijtsma L., 1. Biotechnol., 2003,
103: 21-29;
37. De Swaaf M., Sijtsma L., Pronk J. T, Biotechnol. Biocng.: 2003, 81 : 666-672;
38. EI-Fadaly H.A., EI-Ahmady EI-Naggar N., EI-Sayed Marwan M., Research J.
Microbiol.: 2009, 4(8): 301-313;
39. Fakas S. Certik M., Papanikolaou S. el al .. Biores. Technol ., 2008, 99: 5986-5990:
40. Fakas S. el al ., Appl. Microbiol. Biotechnol.; 2006, 73: 676-683:
41. Fakas S., Bellou S., Makri A., Aggelis G., "Single cell oii and gamma-linolenic
acid production by Thamnidium elegans grown 011 raw glycerol" În: Mlcrobial
conversions of raw glycerol . Aggelis G. (ed.), Nova Science Publishers Inc., iew
6ork, SUA, 2009, 85-99:
42. Fakas S., Makri A., Mavromati M., Tselepi M., Aggelis G., Biores. Techno!.,
2009,100: 6118-6120;
43. Fakas S., Papanikolaou S., Aggelis G., Kornaitis M., Galiotou-Panayotou M ..
"Bioconversion of tomate wastes hydrolysate into single-cell oil ", International
Congress OII Bioprocesses in Food Industries, 2006, Patras, Greecc, Book of
Abstracta, 140;
 MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ 311

alanina 93, 220 Aspegic 103

aldolaza 188, 260, 261 Aspergillus awamori 67. 68
alogrefă 222 Aspergillus clavatus 81
alge brune 91 Aspergillus [lavus 78
alge roşii 120 Aspergillus [onsecaeus 78
alge verzi 177, 186, 187 Aspergillus giganteus 183, 186
alge verzi-albastre 2S0 Aspergitlus lanosius 78
amantadina 246 Aspergillus luchensis 78
lndex arninoacidul Blllt 220, 225, 226 Aspergillus niger 71, 73, 75, 78, 81, 82,
aminoacilaza 116. 118 85, 171
Aruinoplasmal 110.117 Aspergi 1/115 oryzae 116
A acid rnevalonic 62 Arninoster il 110, 117 Aspergillus phoenicus 7S
acid oleic 100, 269. 278, 284, 289, 292 amprenavir 248. 249 Aspergillus sai/oi 78
abacavir 248, 249, 251, 254, 256, 257, acid palmitic 168, 269, 271, 284, 289, animal transgenic 45. 46 Aspergillus 5p.71, 81. 135, 210, 258
258 292 aruicorp 21, 217, 21 S. 247 Aspergillus terreus 202,211,212.213,274
Abbou 223, 249 acid pahnitoleic 269, 284, 289 antigen 217, 221, 234 Aspergillus wentii 78. 81
Absidia sp. 78 acid p-aminobenzoic 134. 136, 137, 145 Anuoxidanti 176 Aspisol 104
ACC 200 126 acid paniotenic 134, 135, 136, 138 anlivirale 9. 19.246 Astellas Pharma 235
acetilcisteina 126. 127 acid propionic 62 Apo Pravastatin 207 Astra Zeneca 201
acetilsalicilat de lizină 103, 104 acid salicilic 62. 64 apolipoproteine 194 Atazanavir 249
aciclovir 246 acid succinic 62. 65. 71,99, 124 aquacobalamina 149 ateroscleroza 194
acid 2-hidroxi propanoic 63 acid tartric 62 Arasco 285.287.289.290.291 atornizare 76. 107, 109, 145
acid arahidonic 269, 271, 285. 290. 296 acid trans-2,3-epoxisuccinic 62 Ardeytropin 112 atorvastatina 201
acid citric 20,62.77, 124, 155.282 acid n-hidroxi propionic 63 arginina 93, 95. 231 Atrimon 112
acid diarnino-pimelic 105 acid y-linolenic 269, 270, 271. 272, 275, Arkopharrna Azinc 176 Aureobasidium pultulans 71, 74
acid docosahexaenoic 269, 285, 28S 279 A rthrobactervs , 164 autorizatie de fabrica re 24. 31, 40, 41. 51
acid eicosapcntaenoic 269, 277, 286, 294, acid o-ami nolevulinic 155 Arthrobacter ci/rus 104 aviz de fabricaţie, vezi Autorizatie de
296 Acidopeps 98 Aschochyto sp. 78 Iabricarc
acid folic 134, 136, 137, 138, 151 Acidulin 9S Ascoler 72 aviz terapeutic 30. 32, 38
acid Iolinic 134, 137 acizi graşi polinesaturati 268 ascomicina 238. 239 azidotimidina 246, 248
acid Iumaric 92, 121, 62, 120 Acremonium sp. 78, 224 Ascovit 159
acid galic 62, 145 Actinomandura sp. 210 Ashbya gossypii 142, 143, 144. 145 B
acid giberelic 62 Actinoplanes sp. 228 Asociatia Imernatională pentru
acid gluconic 62, 70, 71, 73, 81, 82 Actival 176 Armonizare 28 Bacillus coagulallsl53, 154
acid itaconic 62 activatorul tisular al plasminogenului uman Aspacardin 119 Baciilus megatherium 153. 154
acid kojic 62 recombinant 44 Aspata KI19 Bucillus sp. 135. 142,257,258
acid lactic 20,62,63,99. 107, 165, 183 udjuvant de filtrare 101, 179 asparagina 144 Bacillus subtilis 92. 113, 143
acid L-ascorbic 62, 65, 71,72, 113, 122, ADM 140. 162 aspartat de arginină 120 Bacillus thuringiensis 164
157,210 Advagraf 233. 235 aspartai de calciu 120 bacterii acei icc 71, 160. 162
acid L-aspartic 92, 93, 95. lI9. 144 Aerobacter aerogenes 105 aspartat de magneziu 119, 120 bacterii hutiricc 142
acid Lvgluramic 91, 92, 93, 94, 9, 109, agenti antiproliferativi 218 aspartat de potasiu 119, 120 bacterii Iactice 63,65,66, 142
144. 154 agenti hipocolesterolernianti 198 aspartat de zinc 120 bacterii propionice 137, 138, 155
acid linoleic 269, 275, 284, 290, 292 AGL, vezi Acid y-linolenic aspartat feros 120 BASF 140. 161, 162. 166
acid rnalic 121, 292, 62 Ajinomoto Co. 96, 125, 128, 129 aspartaza 120 Bayerl04. 201
 313
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ

312 CĂTĂLlNA DANIELA STAN

Crypl/iecodilliulII cohnii 274, 278, 285,
citrat de fier 79
Beauveria sp. 223, 224 Calciu efervescent 72 292, 293
citrat de magneziu 79. 80
Calciu granulat 72 CrypwcocCus albidus var. albidus 274
Becobion 151 citrat de sodiu 85
8eecham 199 Calcium Forte 72, 80 Cr)'plocOCCUs curvalllS 292
citrat trisodic 79
8ena Injection 151 Calcium Sandoz 72 CryplOCOCCUS sp. 170
c1or-cobalulllina 149 ClIl1l1illghall/ella echilllllala 284
Beplex Forte 151 Calibrum 152 clorhidrat de acid glutamic 97, 98
Beres Magneziu 80 Candida catenula 81 Cylindrocarpo/1 lucidum 223, 224
clorhidrat de cisteină 126, 128
8etabronz 176 Candida famata 143 Cypher 228, 230. 231
c10rhidrat de lizină 104, 107, 108
Beviplex 152 Candida flaeri 143
Ciostridium aC('lobuliliclI/II 143, 146
BioChem Pharma 251 Candida guillermondii 81, 143 D
CloslridiulII bUlilyclIJn 140
Biocon 211, 213 Candida intermedia 81
ClOSlridil//II per(rillgens 200
Biorninerale 177 Candida lipotytica 81 darunavir 249
Cobalamine 148, 149, 156
bioreactor "aer-lift" 206 Candida oleophila 81 delavirdina 249
Candida tropicalis 81, 143, 171 co-extraqie 232
biorcactor cu membrană de dializă 67 Oelgesic 104
Carbocisteina 126, 127, 128 co-fermentatic 164
bioreactor cu membrană filtrantă 67, 116 Depovit 151
B-caroten 135, 136, 173. 184 co-imobilizare 67
hioreactor cu membrană hollow fiber 67 5_dezoxiadenozilcobalamina 150
colesterol 194, 195, 197. 198, 199, 203.
Biota 259 Cebion 159 Dhasco 285, 289, 290, 291. 293
231, 272, 277. 279, 288, 295
biotina 100, 133, 134, 144, 155 celule irnobilizate 67,71.75,78, 115, 121 Diarncl 127
cerurifugă filtrantă 236. 287, 293 coloane cromatografice 68, 102, 105, 107,
Boehringer lngelheirn 249 didanosina 248. 249
114, 116, 152, 153, 156, 173,210,232,
Borago officinalis 273, 279 Centrum 152, 176 Directiva Europeană pentru Patcnte 46
Ceredopa 123 237, 254, 261. 264
Botrytis sp. 78 Dopaflex 123
brevet de invenţie 43,44,46, 71, 85, 109, cerivastaiina 201 Colvitiod 128
Dopar 123
160 certificatul de inregistrare 40, 41 Combivir 249. 251
DO/'{/Wlllyces sp. 202. 204
Brevibacteriuni amoniogenes 99 Cevitil 159 COll11llon Technical Document 30
dosar clinic 26. 32, 40, 42
Brevibacterium divaricatum 99 Chaunopycnis sp. 224 compactina 199 dosar farlllaccut ic '37. 48
Brevibacterium fiIiOr/1II1 99 chilornicroni 195, 196 COllidiobolus spp. 274, 286
dosar farmacologic pre-c1inic 37
Brevibacterium lactofermentum 92, 99, Chlorel!a minutissima 274. 296 Consupren .223 dosar toxicologic pre-clinic 37
JOI, 102, 104, 109 Chlorella sp. 135, 280 copyright 43 dosarul seriei de fabricatie 57
Brevibacterium sp. 91, 101, 104. 164, 188 Choanephora 135. 183 Cordis 228, 230, 231 dosarul tehnic al produsului 57
Brevibucterium thiogenitalis 99, 100 Chondrus crispa 120 corinoide 148 drojdii oleaginoase 209, 275, 279
Bristol Myers-Squibb 159, 199,207.248, ciancobalarnina 134, 136, 137, 138. 147. CorvllebaClerili/ll alkanotytu:u!" 99, 101
249, 250 149 COI:YllebacleriwlI ammonigenes 143
E
brom-cobalarnina 149 cianobacterii, vezi Alge verzi-albastre CorYllebacleriu/II rallunae 99
bromogl utamat de magnezi u 97, 98 CIBE Laboratoires 211 COI~Vllel}{lClerilllll glllW/IIicWII 91. 92. 97,
E. coli 92. 105, 110, III, 113, 114, 115,
Buletinul Oficial de Proprietate Industrială ciclofilina 221 99, 101. 104, [05. 106. 113, 114
117, 120, 128, 146. 185, 188, 151,
46 ciclosporina A 219, 220, 221, 223, 230 CorYllebllCleril.l111 glyciniphyllllll 92
260, 252, 253, 254, 255, 260
Burkholderia cepacia 45 ciclosporina B 220. 227 Corynebaclerilllll herculis 99
echipament de prodllqie 51. 53
ciclosporina C 220 Corynebucterium lilium 99
efavirenz 249, 250
C ciclosporina D 220, 227 CorYllebacleriwn metassecola 99
ciciosporina G 220, 227 electrodializă 85
CorYllebacleriulII sp. 91, 104. 135, 161.
ciclosporine 218 emtr icitabina 249, 250
caiet de şarjă 53, 57 164. 165, 186
cistcina 126. 128, 129 enfllvirtida 248, 249
calcineur ina 221, 228, 230, 234, 239 Crixivan 27,28,249
entitate moleculară 28, 31, 44, 50
Calciretard 120 citarabina 263 cromatogral'ie pe coloane, vezi Coloane
citidin dezaminază 252, 253, 254, 255 E1llOII1ophlhora spp. 274, 286
Calcit 79 cromatografice
Calciu 200 72 curat de calciu 79, 80, 83, 84
 315
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
314 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
inhibitori de revers-transcriptază 247,248.
enzime irnobilizate 71,120,121,253,255 fişa tehnologică a producătorului, vezi Fişa glutamat de amoniu 101
glutamat de sodiu 91, 96, 97, 98, 102 249
Epivir 248, 251, 254, 255 de fabricaţie
glutamat Ieros 65, 71, 98 Insa 103
Epzicom 249, 256 fişe de stoc zilnice 53
glutamat monosodic, vezi Glutamat de Inspectia Farmaceutică 30
Eremothecium ashbyi 142, 143, 144, 145 flavin-adenin-dinucleotid 74, 139
sudiu interfcroni 246, 247
ergosterol 134, 136, 167 Ilavin-mono-nucleotid 139
glutamolactat de magneziu 98 interleukine 234
eritromicina etil-succinat 54, 56 , Flectadol 104
International Conference on
Erwinia herbicola 92, 123, 124, 16J, 162, Iloculant 68 Glutarom 98
Gymnoascus sp. 202, 204 Harmonisation 28, 29, 30
164, 165, 184 Fluifort 127
invenţie. vezi Brevet de inventie
Erwinia uredovora 184, 185, 188 Fluimucil 127
H izoleucina 90, 111
Estival 127 tluvastatina 201
etil-succinat de eritromicină, vezi Ilux tehnologic 54, 56, 59, 76, 84, 108,
K
Eritromicina etil-succinat 163. 180,255 HDL 195, 196
etravirin 249 Formulaid 278, 285 Hepaton Plus 152
Eupenicillium sp. 78, 202, 204 formulare 24,30, 3J, 34, 35, 36, 49, 180, herpes sirnplex virus 246, 263 Kalma 112
Eurolizina 109 259 Hidonac 127 Karbocistein 127
European Patent Directive, vezi Directiva fosarnprenavir 249 hiclroxicobalamina 149, 151 Kivexa 251. 256
Europeană pentru Patente fosfolipide 100, 152, 194, 195, 268, 270, hiperlipidemie 222 Kowa Co. Ud. 201
evaporator cu peliculă 254 272, 176,277,285,288,289 hiperlipoproteinemie, vezi Hiperlipidemie
Evening primrose 273, 274, 275 fotobioreactor 187 L
histidina 90
Fujisawa Healthcare 233 HIV 27, 28, 222, 246, 247, 248, 250,
F lungi oleaginoşi 269. 275, 280 lactat de calciu 64, 66. 69, 70
251. 256
Fusarium sp. 171 HMG-CoA reductaza 197, 198, 199.200, lactat de magneziu 65
Farcovit 152 lactat de potasiu 64. 65
203
fază de fabricatie 54 G Holfrnann-La Roche 140, 160, 166, 173, lactat de sodiu 65
faza 1 clinică 26, 31, 32, 39, 40, 43 248, 249 lactat feros 64. 65. 71
faza II clinică 26, 31, 32, 39, 40 Geograf 223 Hormostin· 98 Lactobacillus (/I/Iylophilllls 66
faza III clinică 26, 31, 32, 39, 40 Gilead Sciences HPLC 209, 210. 227, 237, 252 Lactobacillus hulgarirus 66, 67
faza IV clinică 31, 32, 41 GlaxoSmithKline 249, 250 hurnan immunodel'icicncy virus, vezi HIV Lactobacillus casei 67
fază pilot 48, 49, 50 glicina 155 Lactobacillus delbrueckii 66, 67, 68
Humex 127
fenilalanina 90, 116, 117 Glubifer 98 Hycoboclerilllll tuberculosis 104 Lactobaciilus helveticus 66, 183, 184
Ferglurom 72 Glucalcium 72 HYPoIIIY('('s sp. 202
Lactobacilius I(lCI;s 66
fermentatie anaerobă 20, 67, 146. 154 gluconat de calciu 71, 72, 73, 74, 75, 76, Lactobociltus pentosus 66
fermentatie continuă 74, 80, 85, 106, IIJ. J28 Lactobocittus plantarum 66
1l6, 121, 179,181 gluconat de magneziu 72 Luctobaciltus şalivarius 66
fermentatie de suprafaţă 21, 78, 208 gluconat de potasiu 72, 73 Lalllill(/ria japonica 91. 96
ICCF Bucureşti 68, 75, 109
fermentatie Fed-batch 232 gluconat de sodiu 74, 75 lamivuclina 248, 249, 251, 254, 255
lDL 195, 196
fermentatie pe substrat solid 232, 236, gluconat de zinc 71. 73 Larodopa 123
idoxuridina 246
287,293, 213, 276 gluconat feros 65, 71, 72. 73 LDL 194. 195. 196. 199,203,207
imobilizare 67, 121,253,255
fermentator cu membrană 260 Gluconobacter oxidans 71, 73, 74, 161, L-DOPA 92, 95, 122
imunosupresoare 9. 19, 217, 218, 230.
ferrnentator În pat fluidizat 276 162 leucina 90, 155
238,239
Ferro Folgamma 151 gluconolactat de calciu 72 limlocite T4 hclper 221, 246
indinavir 28, 248, 249
filtru celular rotativ 101 Gluconolactat de calciu şi magneziu 72 lipide endogene 195, 196, 197
glucozo-oxidaza 73, 82 Infesol JIO, 117
filtru presă 73,101,156,145,287 lipide exogene 195, 196, 197
Glutamag 72, 98 lnfusarnin 128
fişa de fabricatie 57
 317
MEDICAMENTE DE BIOSINTEZĂ
316 CĂTĂLlNA DANIELA STAN
PItYlillln sp. 286
lipide microbiene 275 microorganisme oleaginoase 268, 275 I\itro-cobalamina 149
pitavastatina 201
lipoproteine 194, 195 Microsphaeropsis sp. 276 Nocardia sp. 208
placă de aterom 194
Novartis 72, 223
Lipostat 201, 207 Milgamma 152 plante transgenice 270
numărul seriei de fabricaţie 57
Iizina 90. 102, III monacolin J. L, M, X 202 Pleurotus sp. 202, 204
Nuuinova GmbH 277. 278. 293
lopinavir 248, 249 Monascus ruber 202, 211. 212 Porphyridilllll rruenturn 274. 286, 296, 297
lot 35, 49, 50, 53, 57 Monascus sp. 202, 210
Lovastatin Biogalenica 212 monoclorhidrat de L-lizină,
o Pravachol 201, 207
pravastatina 199,200,201,206,207,208.
lovastatina 200,201,202,211,212,213, vezi Clorhidrat de lizină 210. 211
Genii/ilem biennis 275
214 Mortierella alpina 274,285.286,287,295 pravastatina sodică, vezi Pravastatina
Oligovit 152
Mortierella elongata 274 OmegaTech Inc. 277, 278, 293 Pravator 207
M Mortierella hygrophila 295 precursor 62,91.92,95, 112. 113, 122,
operatie unitară 54
Mortierella isabellina 281. 284 126. 133. 134. 144. 154. 155. 171,
Optimax 113
rnacrofage 194, 246 Mortierella longicollis 281, 284 optimizare 36, 37, 42, 49 172.203,211.224,227
Madopar 123 Morticrella maculata 210 organigramă 51. 59 pre(lfI11ulare 30, 31, 33, 34
Magne B(> 65. 70 Mortierella parvispora 281 oseltamivir 259. 260 Prenatal 176
Magnevit 72 Mortierella ramanniana var. Ramanniana Osieo Guard 86 procedura de calificare 57
Maraviroc 248. 250 281, 284 procedura de validare 51. 57
Martek Biosciences Corp. 277, 278, 288, Mortierella sp. 286 p procesenzimatic71.91,93. 103,116. 120,
293, 297 Mucor alpinu 281 123.124. 125, 128. 129. 137,258.261
Mecopar 110 Mucor circinetloides 274, 275 Pacuron 113 proces koji 78, 81
Mecoret 151 Mucor circineltoides ]. Circinelloides 282 Paeei!ofllyces sp. 202, 204 prodrug 199. 200, 212
Medostatin 201, 212 Mucor hiemalis 208 Panangin 119 Prograf 233. 235
membrane lichide 85 Mucor javanicus vezi Mucor circineiioides Patent Cooperat ion Treaty 46. 47 Prograft 233
Merck 27,28, 113, 123, 162, 201,212, .f. Circinelloides patent. vezi [nventie Promelatonin 113
249, 250 Mucor piriformis 78 Penicillium brevicompoctutn 203. 204 PropionilJacterilllll jreulldellreieltii 153
metabolit cxtracelular 74, 82, 104. 105 Mucor sp. 135.208. 281 Penicilli'lli, citrinum 81, 199. 203. 204, PropiollilJaclerilllll slterlll(lIIii 45. 137. 138.
metabolit intracelular 145, 154, 155, 177, Mucosol 127 205,208,212 150. 153, 154. 155
179. 187,232.253,260,275 Mucosolvin 127 Penicillilllll crysogenlllll 140 PropiollibacleriullllechniclIlII 137. 138, 153
metilcobalamina 148, 150, 151 Mucotreis 127 Penicitlium glallculII 77 Propolis Plus 176
metionina 90, III, 116, 155 Multiglutin 98 Penicillium janthinellu/I! 78 provitamina A. vezi [3-Caroten
Mctkinen Oy 210, 235 Multivitarnine 176 Penicillium iuteum 81 provitamina D.!. vezi Ergosierol
Mevacor 201, 212 Mycobacterium sp. 91 Penici/lilllll notatum 171
Prozac 47. 48
mevastatina 199,200,201,203,204,206. Mycobacterium smegmatis 140 Penicitlium restrictum 78 Pseudotnonus dacun}we 92
208, 210 Penicillium sp. 71. 183.202 PseudollloIW.\· deni/rijicalls 150. 153. 154
micelii imobilizate 162, 180 N PenicilliulI1 SpillUlosulII 274 PseudOlllonas savastanoi 71
micro-alge 168, 178, 183,269,274,295, Penicillium westlinghi 170
PseUdO/llOIWS sp. 45, 71, 92
297 nanofiltrare 83, 85, 261 Pfizer 25, 78. 105. 249, 250 PselidulllOllas IhiazolinoplliiLllII 128. 129
Pharmaceutical lnspection Cooperation
micro-alge oleaginoase 269 nelfinavir 248. 249 Psychoverlan 98
Scheme. vezi Inspectia Farmaceutică
Microbacterium amoniophilum 99 Neocosmopora sp. 224 PUFA 16. 19, 21. 269. 270, 272, 275,
Microbacterium sp. 91, 104 Neoml223 PIIOII1Q sp. 202 276. 277, 278, 280, 286, 287. 292.
Micrococcus sp. 91, 104 Neuromed 113 PltycOlllyees sp. 135
Phycolllyces blakesleeanus 182. 183. 185, 296. 297
microorganism transgenic 45 Neuromultivit 152 Pylhiulll irregulare 295
nevirapina 249 186
microorganisme non-oleaginoase 268
 318 CĂTĂLlNA DANIELA STAN MEDICAMENTE DE 0I0SINTEZĂ 319

R Sideryl 120 studii pre-clinice 27, 30, 31. 32, 33, 42 Tri1.ivir 249, 251, 256
sirnvastat ina 200, 201 sul fat de lizină 107 Trophicard 120
raltcgravir 248, 250 Sinernet 124 sul fat-cobai amina 149 Tryptacin 113
Ranbaxy 207, 236 Siran 127 Suntory Cu. Ud 238
raparnicina 228, 229, 230, 231, 232 Sirofer 72 supraexprirnare 142, 143, 185,252,260 u
Rapamune 227, 228, 231 sistemul imun 217, 218, 230
răşini schimbătoare de ioni 68. 82, 83, 85, Solutie Ringer 65 ş Ulkenia sp. 278, 293
101, 105, 107, 114, 116, 145, 156, 165, Spartocine 120 ultrafiltrare 195
254, 261 Spirulina maxima 280 şarjă 57 Unizink 120
Redoxon 159 Spirulina platensis 274. 280 UPSA 159
reducere şi reoxidare biochimică 145, 146 spongotirnidina 263 T USAMV Bucureşti 102
reducere şi reoxidare chimică 145, 146 spongouridina 263 Ustulina vulgaris 78
rejet 217. 222, 235, 239 srarine 19.21, 197, 198. 199,200.201. tacrolimus 228,233,234.235.236, 237.
Relenza 260 202, 203, 206, 207 238 v
respiraiory syncytial virus 16, 246 stavudina 248 Takcda 140. 161
Revalid 128 Sterogyl 170 Talaromyces sp, 78 validare 51. 57
Rhinathiol 127 stimulator de biosirueză 81. 155 Ternpidorrn 113 valina 90. 116. 155,220
ribavirina 246 Streptomyces antibioticus 263 tenofovir 249, 250 Vcnopirin 104
Riboflavin Fosfat 142 Streptomyces aureofaciens 149, 153 terapie anurctrovirală 248, 251, 256 vidurabina 262. 263. 264
ribotlavina 133. 137, 138. 139, 141, 142, SI reptomyces cactaceus 208 Tethva crypta 263 Vira A 263
143. 144. 145, 146. 155 Streptomyces carbophilus 199. 208, 209 Thraustochytrium aureum 292 virus 27. 28, 246. 247. 248. 250. 251.
riboflavină 5-fusfat 142 Streptomyces clavuligerus 236 Thruustochytrium sp. 292, 293 259, 260. 262. 263
ritonavir 248, 249 Streptomyces coronojormis 104 tiocianat-cobalamina 149 Vita Rub 151
Rodilemid 128 Streptomyces cremoris 146 tipranavir 249 vitamina A 113. 133, 134. 135. 136, 173,
rosuvastatina 201 Streptontyces darwinensis 208 tirozina 123, 144 174. 175, 176
Streptomyces [radiae 149, 153 Tolypocludium inflatutn 223, 224 vitamina B, 136
s Streptomyces glaucescens 236 Torulopsis sp. 135. 170 vitamina Bll' vezi Ciancobalamina
Streptomyces griseus 149. 153 transcobalaruina II 150 vitarnina BI~" 134
Salmonella typhimurium 252 Streptomyces hygroscopicus 228, 231. 232 transplant 217. 218. 220. 222. 230. 231. vitumina BUh 134
Sandirnmun Neoral 223 Streptomyces hygroscopicus var. 233, 235, 239 vitamina B'2< 134
Sandoz 72, 201 Ascomyceticus 238, 239 trconina 90, 109, 110. III. 144, 155, 220 vitamina B12' 149
Sankyo 199, 201 Streptomyces hygroscopicus var. Trichoderma longibrachiantum 204 viuunina BI~' 149
Saprolegnia parasitica 286 vakushiaensis 238 Trichoderma POIYSPOflllIl Rilai 223 viiamina Bl' vezi Riboflavina
saquinavir 248 Streptomyces olivaceus 153, 154 Trichoderma psedokonigi 204 vitamina Bo 134, 136
Sargenor 120 Streptomyces roseochromogenus 208 Trichoderma sp. 171. 202 vitamina C. vezi Acid Lvascorbic
schema de fabricaţie 54, 55 Streptomyces sp. 210, 235 Trichoderma viridae 78, 224 vitamine D1 168. 169, 170. 171. 172
Schizochytruim sp. 278 Streptomyces tsukubaensis 233, 235, 236, Trichospora cutaneunt 104 vitamina DJ 169. 172
SCO 275,276,277,278,283,284 237 trigliceride 194, 195. 196.207,268,270. viramina E 134, 135. 136. 176. 177
secret de fabricatie 43, 78, 156 Streptomyces zymogeuus 146 271, 283, 287, 288. 289. 290, 293. vitarnina F 135. 136
Sedanoct II 3 studii clinice, vezi Faza clinică 1, Il. III 295 vitamina K 134, 135. 136
serie de fabricaţie, vezi Şarjă studii de Iarmacovigilenţă, vezi Faza IV triptofan 90, 92, 93, 95, 103. 112. 1I3, vitamina PP 133. 134. 135, 136
serină 144, 155 clinică 114, 115. 116 vitamine hidrosolubilc 134. 137
serviciul pilot, vezi Fază pilot studii de post-marketing. vezi Faza IV clinică triptolan siruetaza 113 vitamine liposolubile 134, 135, 167, 168
 320 CĂTĂLlNA DANIELA S1i\N

Vitavision 176 Wyeth-Ayerst 152, 176,228,231

VLDL 195, 196, 197
vrac 50, 52 z
w zalcitahina 248
Zantac 48
Warner-Lambert 201 Zefix 251
Wuhan Alking Engineering Co. 277, 278, Ziagen 249, 256
288 zidovudina, vezi Azidotimidina

'-..,t