Biocel lp 7

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
1.Ce sunt?
•Studiul fenomenelor biologice la nivel molecular
•Metode de cercetare fundamentală care investighează comportamentul celular în relaţie cu nivelul
de expresie sau gradul de activare a unei anumite molecule.
2.La ce folosesc?
Studiul unor:
•Gene de interes
•ARN (de regulă ARNm, dar, mai recent, frecvent şi microARNuri)
•Proteine
De ce să studiem gene, dacă: – genomul uman a fost cartografiat şi stim ce gene avem şi unde sunt
localizate pe cromozomi – sunt aceleaşi în toate celulele fiecărui organism – unele nici măcar nu se
mai exprimă (traduc în proteine) după perioada embrionară
3.De ce studiem gene? Pentru că:
- Multe boli sunt generate de mutaţii pe care leam achiziţionat în perioada adultă
- Unele gene nu sunt mutate/deletate ci pur şi simplu supraexprimate
- Aflăm din ce în ce mai mult că diverse tipuri de cancer exprimă gene din perioada embrionară

De ce studiem ARNm?
• ilustrează gradul de exprimare a unei gene (gena oricum există, dar este ea tradusă în proteină?) –
dacă ştim oricum că gena este tradusă, ne poate spune dacă în patologie este tradusă mai mult sau
mai puţin decât în situaţia normală – uneori ne interesează să evidenţiem ARNuri virale

De ce studiem microARNuri?
– pentru că ele blochează ARNm şi împiedică finalizarea expresiei proteinei codificate de acesta

De ce să studiem proteinele?
–Pentru că ele sunt, în marea majoritate a cazurilor, efectorii a ceea ce numim noi „răspuns celular”:
• Diviziune celulară
• Semnalizare şi comunicare celulară
• Migrare, contracţie
TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ sunt:
•Calitative:molecula de interes există sau nu – Temă după pauză: sunt utile metodele calitative în
studiul genelor?
•Semi-cantitative: se pot folosi numai în studii tip situaţie experimentală vs. control; rezultatul va fi
exprimat ca raport între cele două situaţii
•Cantitative: rezultatul este unul cuantificabil, ex: nr copii (gena X), conc.proteina X (ng/ml)
Acizi nucleici
• Secvenţiere genică
• PCR şi RT-PCR
•Electroforeză
• Microarrays
Proteine
• Electroforeză şi imunoblotare
• ELISA
• Multiplexarea şi microarrays
• Spectrometria de masă
Transfecţiile atat pentru acizi nucleici, cat si pentru proteine
TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARA
Se bazează pe reacţii specifice de recunoaştere:
 acizi nucleici: reacţie între nucleotide pereche
- De ex: cautăm o genă ţintă cu ajutorul unei secvenţe pereche (denumită primer – secvenţă de
nucleotide care poate iniţia transcrierea)
- Gena: ATTCG
- Primer: TAAGC
 proteine: reacţie specifică Ag-Ac

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

• Metodă folosită pentru obţinerea unui număr mare de copii ale unei anumite secvenţe de ADN
Etape:
• denaturarea ADN şi separarea catenelor complementare
• adaugarea primerilor (secvenţe ADN complementare secvenţei-ţintă)
• sinteza de noi secvenţe de ADN dc sub acţiunea Taq-polimerazei
RT–PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE–PCR)
- Metodă foarte sensibilă de detectare şi cuantificare a ARNm
- Iniţial din ARN-ul ţintă se sintetizează secvenţa cADN, apoi urmează etapele PCR
- Utilizată în diagnosticul unor boli genetice, cuantificarea expresiei diverselor gene prin
determinarea cantităţii de ARNm
ELECTROFOREZA
• PRINCIPIU: particulele încărcate electric migrează într-un mediu vâscos, sub acţiunea unui câmp
electric.
• Aplicaţii practice: studiul proteinelor şi al acizilor nucleici.
Electroforeza acizilor nucleici
• Foloseşte, de regulă, geluri de agaroză, sau geluri de poliacrilamidă la concentraţii mici (până în
5%), care asigură spaţii largi de migrare
• Se foloseşte pentru vizualizarea rezultatelor de PCR, pentru controlul şi validarea unor rezulatate
de biologie moleculară
Secvenţierea genică
• Metodă care permite descifrarea secvenţei de nucleotide care intră în structura unei gene
• Iniţial s-a folosit metoda Sanger; în prezent se lucrează prin metode de nouă generaţie (Next
generation sequencingNGS), în care se folosesc nucleotide cuplate cu fluorocromi
Microarrays
• Metodă de analiză a transcriptelor genice într-o cultură celulară sau produs biologic
• Permite determinarea simultană a prezenţei a sute de gene transcrise/ARNm într-o probă (de ex. o
cultură celulară)
Principiu: Hibridizare specifică între un oligonucleotid (un fragment de ADN monocatenar) şi
fragmentul complementar de ADN (ADNc)
Utilizări: •Detectarea unor modificări în expresia genică •Detectarea duplicaţiilor/deleţiilor genice
•Detectarea mutaţiilor – necesită plăci speciale, pe care oligonucleotidele matrice sunt de fapt
variaţii cu diferite mutaţii ale aceleaşi gene
Tehnici de studiu al proteinelor
• Electroforeze şi transferuri pe membrane
• ELISA
• Multiplexarea şi microarray-urile
• Spectrometrie de masă
ELECTROFOREZA PROTEINELOR
PRINCIPIU: particulele încărcate electric migrează într-un mediu vâscos, sub acţiunea unui câmp
electric.
a. unidimensională, când migrarea se realizează în gel într-o singură direcţie
b. bidimensională, când migrarea se realizează succesiv în două direcţii
Tipuri de electroforeză unidimensională:
SDS – PAGE
Focalizarea izoelectrică
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
• realizează separarea proteinelor dintr-un amestec pe baza greutăţii moleculare, ca singur
paramentru care influeneţază migrarea.
FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ
Definiţia: separarea electroforetică a proteinelor dintr-un amestec pe baza punctului lor izoelectric.
Electroforeza bidimensională
• migrarea proteinelor în două direcţii:
1. prima direcţie – FOCALIZARE IZOELECTRICĂ
2. a doua direcţie – SDS-PAGE
Rezultatele se prezintă sub forma unei hărţi cu proteinele separate în planul gelului.

Western Blot
Utilizări:
- determinare semicantitativă de proteine
- oferă informaţii legate de modificarea de exprimare a proteinelor, sau de starea lor de activare în
decursul diferitelor procese celulare

ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay

Reacţie de tip antigen-anticorp prin care se urmăreşte cuantificarea unei anumite proteine
– frecvent pentru markeri tumorali
– se foloseşte şi pentru detectarea prezenţei unui anumit anticorp (care să indice o infecţie, de regulă
virală)
Multiplexarea
• Asemanătoare array-ului pentru materialul genetic
–Array - înşiruire ordonată
• Permite identificarea simultană a mai multor proteine într-o singură probă (de ex –serul unui
pacient)
Multiplexare Luminex
1.se adaugă microsfere cu anticorpi primari ataşaţi
2.se adaugă proba
3.se adauga al doilea tip de anticorpi
4.se adaugă fluorocromii
5.se sortează microsferele din amestec în funcţie de culoare – fiecărei proteine corespunzându-i o
culoare
Transfecţiile
• Metodă de introducere a unor acizi nucleici în celulă
• Tranzitorii – cu plasmide bacteriene care nu se integrează în genomul celulei
• De lungă durată – cu virusuri, care se integrează în genomul celulei
• După transfecţie, celula va exprima proteina codificată de materialul genetic respectiv
Aplicaţii practice
• PCR: determinarea încărcăturii virale pentru virusuri ADN, ori RT-PCR pentru virusuri ARN
• ELISA – evaluarea existenţei unui răspuns imun la un anumit virus; dozarea cantitativă a unor
markeri tumorali pentru urmărirea evoluţiei bolii
• Transfecţiile: producţia de insulină (în drojdie sau E. coli, transfectate cu o secvenţă recombinantă
de hormon uman)