S7 - 16.04.

2018
Familia Enterobacteriaceae
Genuri:
• Escherichia – specia Escherichia coli
• Salmonella
• Shigella
• Enterobacter
• Klebsiella
• Proteus
• Serratia
• Yersinia

Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de germeni din familia Enterobacteriaceae

I. Diagnosticul bacteriologic
• consta in izolarea si identificarea germenilor potential patogeni din produsul recoltat de la pacient
1. Recoltarea produselor patologice
- se folosesc materiale si instrumente sterile si tehnici aseptice de lucru
- se respecta normele generale si specifice de recoltare
- se aleg produsele patologice recoltate in functie de localizarea infectiei
2. Transportul probelor la laborator
- se face cat mai rapid, maxim 1-2h; daca nu este posibil, se pot folosi medii de transport
- se respecta cu strictete normele de protectie microbiologica
- se asigura identitatea probei pe durata transportului
- in cazul suspiciunii infectiei cu Salmonella, se recomanda utilizarea unui mediu de imbogatire lichid =
bulion azid de sodiu
3. Examenul macroscopic
- consta in examinarea cu ochiul liber a produsului recoltat
- uneori, produsele patologice pot avea caracter purulent sau muco-purulent
- uneori, aspectul materiilor fecale poate fi orientativ sau chiar patognomonic  de ex.: in dizenteria
bacilara:
• produsa de specii din genul Shigella
• scaunul are aspect de „scuipat rectal”  este in cantitate mica (pentru ca sunt 20-30 scaune/zi), cu
mucus, uneori puroi si cu striuri sangvinolente
4. Examenul microscopic direct
- consta in examinarea unui frotiu colorat Gram din produsul patologic, pe care se pot observa caracterele
morfo-tinctoriale ale germenilor din familia Enterobacteriaceae:
• dimensiunea: lungime 2-3 µm, grosime 0.5-0.6 µm
• forma: bacili rotunjiti la capete
• mod de grupare: izolati de obicei
• capsula: nu prezinta, cu exceptia tulpinilor din genul Klebsiella, care sunt incapsulate pe frotiurile din
produse patologice (nu din culturi)
• spori: nu formeaza
• localizarea: extracelulara
• tinctorialitatea: Gram negativi  rosu pal
- frotiurile se efectueaza din produsele patologice normal sterile sau care ofera informatii sugestive privind
existenta caracterului inflamator al produsului (pe baza raportului dintre celulele epiteliale si
polimorfonucleare neutrofile = PMN-uri)
- frotiul are un rol orientativ
5. Cultivarea in vitro
- enterobacteriile sunt germeni nepretentiosi nutritiv, care se dezvolta cu usurinta chiar si pe medii uzuale -
- in practica se utilizeaza urmatoarele medii de cultura:
• geloza-sange
• mediu selectivo-diferential pentru bacili Gram negativi
- mediile insamantate cu produsul patologic se incubeaza in urmatoarele conditii:
• aerobioza (dar cresc si in anaerobioza, fiind germeni aerobi, facultativ anaerobi)
• 24h la 37°C
- pe geloza-sange:
* enterobacteriile formeaza colonii de dimensiuni mari, gri-albicioase, mucoide/mucoase, vascoase sau
gelatinoase, uneori (de ex.: Escherichia coli) pot fi beta-hemolitice, dar acesta este un caracter inconstant si
nu poate fi utilizat ca si un criteriu de identificare
1 / LP 7  M
 * aspecte particulare:
• Klebsiella species:
- coloniile sunt foarte mari si au tendinta de confluare ca picaturile de miere
- aceasta cultura este foarte aderenta, elastica si prezinta cameleonaj pe medii cu anumite
compozitii (= isi schimba culorile)
• Proteus species:
- bacterie foarte mobila
- poate prezenta pe mediile solide turnate in placi Petri, fenomenul de migrare = consta in
extinderea culturii sub forma unor valuri concentrice pe toata suprafata mediului de cultura (geloza-sange)
- fenomen particular = fenomenul Dienes: daca pe aceeasi placa cu geloza-sange se insamanteaza
2 sau mai multe tulpini de Proteus, acestea vor migra sub forma unor valuri concentrice, dar fara a se
suprapune  vor pastra intre ele o linie de demarcatie = linia Dienes
- pe mediul selectivo-diferential pentru bacili Gram negativi:
• exista 3 feluri de medii, cu grade diferite de selectivitate: slab selectiv, moderat selectiv si inalt selectiv
• in absenta mediilor cromogene, se recomanda utilizarea de rutina a 2 medii selectivo-diferentiale: unul
slab selectiv si unul moderat selectiv  de ex.:
 mediul MacConkey:
* turnat in placa Petri
* culoare roz
* agentul selectiv = cristal violet
* agentul diferential = lactoza
 mediul Istrati-Meitert:
* turnat in placa Petri
* culoare verde
* agentul selectiv = saruri biliare
* agentul diferential = lactoza
 mediul AABTL = agar albastru de brom timol lactoza:
* turnat in placa
* culoare verde
* agentul selectiv = albastru de brom timol
* agentul diferential = lactoza
 mediul ADCL = agar dezoxi colat lactoza:
* turnat in placa
* culoare roz
* dezoxi colat  sare biliara
 mediul EMB = Levine = eozin metilen blue
 mediul CLED
• mediile inalt selective se utilizeaza rar, cand este necesara depistarea unui purtator de un anumit
germen patogen sau se cauta tintit in produs un anumit germen  de ex. se utilizeaza un mediu inalt
selectiv pentru Salmonella tiphy, in cazul unei epidemii de febra tifoida sau pentru monitorizarea si
sterilizarea purtatorilor de bacili tific dupa boala
• caractere fermentative: lactoza reprezinta zaharul care permite diferentierea bacililor Gram negativi in
2 categorii:
 lactoza pozitivi: fermenteaza lactoza, determinand schimbarea culorii coloniilor si a mediului din
jur – ex.: Escherichia coli (80% din tulpini), Klebsiella, Enterobacter (90% din tulpini)
 lactoza-negativi: nu fermenteaza lactoza, coloniile sunt incolore si imprumuta culoarea mediului –
ex.: Proteus, Salmonella, Shigella
* pe medii roz: coloniile lactoza pozitive sunt rosii, iar coloniile lactoza negative sunt roz
* pe medii verzi: coloniile lactoza pozitive sunt galbene si ingalbenesc mediul din jur, iar coloniile
lactoza negative sunt verzi
6. Identificarea
- se poate duce pana la nivel de gen, pe baza testelor biochimice manuale
- specia se poate stabili de obicei numai prin metode moderne: sisteme automate de bacteriologie sau
galerii API (pentru bacili enterici)
* observatie: in unele situatii se poate utiliza, pe langa identificarea biochimica, si identificarea serologica,
pentru stabilirea unui sero-grup sau sero-tip  identificarea serologica se bazeaza de obicei pe reactii de
precipitare sau aglutinare

2 / LP 7  M
- testele biochimice manuale:
a) testul TSI = triple sugar iron:
- mediu multi-test = putem sa vedem mai multe proprietati ale bacteriei pe acest test
- este o eprubeta cu un mediu turnat inclinat
- culoare rozalie
- tehnica:
• se inteapa mediul pana in profunzime, in zona dreapta
• se disperseaza cultura de jos in sus prin miscari de zig-zag pe suprafata inclinata
• se acopera cu dop steril de vata
• se incubeaza 24h la 37°C
 interpretare:
- daca se ingalbeneste mediul in zona dreapta (la fundul tubului)  bacteria fermenteaza glucoza
(toti germenii din familia Enterobacteriaceae fermenteaza glucoza, fiind numiti bacili Gram negativi
fermentativi)
- daca din fermentarea glucozei apar bule de gaz sau mediul este dislocat si urcat in tub  bacteria
produce gaz din glucoza
- daca mediul se ingalbeneste pe zona inclinata  bacteria fermenteaza lactoza (sau zaharoza)
- daca bacteria produce H2S (hidrogen sulfurat), apar zone negre in mediu – ex. de H2S pozitiv:
Proteus si Salmonella
b) mediul MIU = mobilitate indol uree:
- mediu multi-test
- mediu turnat drept in eprubeta
- este solid
- culoare maronie deschisa
- tehnica:
• se insamanteaza prin intepare pana in profunzime cu ansa ac incarcata cu cultura de testat
• se introduce in tub o banda de indol cu capatul galben impregnat cu reactiv in jos, fara a atinge mediul
• se fixeaza banda cu un dop de vata steril
• se incubeaza 24h la 37°C
 interpretare:
- daca bacteria este imobila, va creste numai de-a lungul liniei de insamantare
- daca bacteria este mobila, mediul se tulbura sau bacteria se extinde
- daca bacteria produce indol, zona galbena a benzii se inroseste
- daca bacteria produce ureaza, tot mediul se inroseste
* ex:
• bacterii mobile: Proteus
• bacterii imobile: Klebsiella, Shigella
• bacterii ureaza-pozitive: Proteus, Klebsiella
• bacterie indol pozitiva: Escherichia coli (singura)
c) mediul Simmons cu citrat de sodiu:
- mediu solid
- turnat inclinat
- culoare vernil
- se insamanteaza prin intepare, de jos in sus si se incubeaza 24h la 37°C
 reactia pozitiva = mediul devine albastru
• ex. de bacterie citrat pozitiva: Klebsiella
• ex. bacterie citrat negativa: E. coli
- proprietate: bacteria poate folosi citratul de sodiu ca sursa de carbon
d) mediul cu malonat de sodiu:
- mediu lichid
- turnat in eprubeta
- culoare vernil
 reactia pozitiva = devine albastru
- proprietate: poate folosi malonatul de sodiu ca sursa de carbon
e) reactia rosu-metil:
- se utilizeaza o eprubeta cu un mediu lichid galbui = mediul Clark-Lubs
- tehnica:
• se insamanteaza
3 / LP 7  M
 • se incubeaza 24h la 37°C
• se adauga a 2-a zi o picatura de reactiv rosu-metil
 reactia pozitiva = apare un inel rosu persistent
 reactia negativa = se consuma in mediu, dispare
f) reactia Voges-Proskauer:
- se foloseste un alt tub cu mediul Clark-Lubs
- tehnica:
• se insamanteaza
• se incubeaza
• se adauga a 2-a zi in tub o picatura de solutie cupro-amoniacala (solutie bleu)
• se incubeaza inca 30 minute
 reactia pozitiva = aparitia unui inel rosu persistent la suprafata lichidului  inseamna de fapt ca
bacteria produce acetoina
g) reactia lysin-decarboxilazei:
- se folosesc 2 eprubete, amandoua cu un lichid violet (arata la fel, dar nu sunt la fel):
• primul = test  contine substratul enzimei = lisina
• al doilea = martor  nu are lisina
- ambele se insamanteaza si se incubeaza, a 2-a zi:
 reactia pozitiva = testul este violet, iar martorul este galben
 reactia negativa = ambele tuburi sunt galbene
h) testul fenil-alanin-dezaminaza:
- se foloseste un mediu solid, incolor, transparent, turnat inclinat
- se insamanteaza de jos in sus, se incubeaza
 reactia pozitiva = inverzirea mediului
7. Antibiograma
- este obligatorie, mai ales in cazul tulpinilor izolate in spital
- tulpinile ESBL = extended spectrum beta-lactamases: produc beta-lactamaze cu spectru extins care
anihileaza aceasta clasa de antibiotice
II. Diagnosticul serologic
- consta in detectia anticorpilor in serul pacientului
- se practica in cazul febrei tifoide  se pun in evidenta antigenele specifice Salmonella tiphy

4 / LP 7  M