LP 7

1. Tehnici de cultivare
2. Examinarea caracterelor de
cultura
 Cuvinte cheie

• Colonii S, M, R
 IN MEDIU LICHID

SE URMARESTE:
• Suprafata lichidului
• Culoarea
• Miros caracteristic
• Formarea de depozite (turbiditatea)
 ASPECTUL MEDIULUI LICHID IN CRESTERE
BACTERIANA
• Creștere de tip S (smooth/neted):
– tulburarea/opacifierea uniforma a mediului-
– Ex: stafilococ, majoritatea bacteriilor
• Tulburarea si pelicula la suprafata mediului (b. piocianic)
 ASPECTUL MEDIULUI LICHID IN CRESTERE
BACTERIANA
• Crestere de tip R (rough/rugos)
– Tulburare neomogenă
– Mediu clar cu văl la suprafata mediului
• Peliculă fină: Proteus spp.
• Văl subțire: Vibrio cholerae
– Mediu clar cu membrană uscată la suprafață
• Ex: Bacillus subtilis
– Mediu clar cu membrane groase,rugoase,incretite la supraf
(b. tuberculos)
– Mediu cu flocoane
– Mediu clar cu depozit grunjos/ floconos/sedimente
aderent la fundul tubului Ex: B. antrax, streptococul
Aspectul culturilor pe medii lichide
 Pseudomonas
aeruginosa-pigmentogeneza
CRESTEREA BACTERIANA IMPRIMA MEDIULUI
UN ANUMIT MIROS
-ex. - aromat (flori de tei)- bacilul pioceanic
- de con ars bacilul tetanic etc.
 Mediul tioglicolat- aerob/anaerob

1. Strict aerob
Tioglicolatul de sodiu consumă 2. Strict anaerob
oxigenul din mediu... Concentrație în 3. Aerob facultativ anaerob
scădere de la suprafață spre bază 4. Microaerofil
5. Anaerob tolerant
Mediul tioglicolat- aerob/anaerob
 Mediul tioglicolat- aerob/anaerob

1.Strict A 2.A facultativ NA 3.NA tolerant 4.strict NA

Aspectul culturilor pe medii solide
 ASPECTUL COLONIILOR PE MEDII SOLIDE
• COLONIA – totalitatea bacteriilor provenite din multiplicarea
unei singure celule
• Colonie- clona bacteriana
• Se descriu pe mediu solid:
- forma coloniei; culoarea
- marimea; consistenta
- suprafata; emulsificabilitatea
- margini; mirosul culturii
COLONII S (SMOOTH)
COLONII R (ROUGH)
COLONII M (MUCOIDE)
• Forma Criterii
– Dimensiune
– Culoare
– Suprafata
– Transparenta
 Dimensiunea
• Mari > 2 mm
– Staphylococcus spp.
– K. pneumoniae
– levuri
• Medii/ mijlocii 1-2 mm
– Streptococcus,Proteus
• Mici < 1 mm
– Streptococcus viridans,
– Haemophilus, Brucella, Bordetella
• Foarte mici-stereomicroscopie
– Mycoplasma spp.
– Ureaplasma spp.
 Forma

• punctiformă,
• circulară,
• neregulată,
• dendritică,
• filamentoasă,
• lenticulară
• Elevatie
 Elevatie/ Relief
• plat,
• acuminat,
• convex,
• bombat,
• ombilicat,
• papilat
Margini
• regulate,
• neregulate, • circulare,
• ondulate,
• lobate,
• întregi, • filamentoase,
• erodate, • zimţate,
• acoperite cu miceliu pufos,
• invadând mediul în valuri
Margini

Bacillus subtilis

Proteus spp
 suprafaţa
• netedă,
• umedă, lucioasă,
• mată, uscată,
• granulară,
• rugoasă,
• papilată,
• zbârcită,
• mucoidă,
• pufoasă
Mycobacterium tuberculosis culture
• Culoarea
– pigmentate, (la nivelul coloniei sau al
mediului),
– nepigmentate
• consistenţa, aderenţa la mediu
(examinate de ex. cu ajutorul ansei
bacteriologice)
– untoasa
– friabila (b. tuberculos)
– mucoasa (Klebsiella)
TRANSPARENTA SAU OPACITATEA
-Hipertransparente - vibrion holeric,
-Transparente - Haemophillus, Shigella,
-Translucide/semitransparente-Salmonella,
Proteus
-Opace - Stafilococ, E.coli
Colonia S (smooth/neted)
• Suprafaţă: bombată, netedă, umedă,
lucioasă, strălucitoare
• Elevație: convexe
• Margini: regulate, circulare
• Consistența: untoasă
• Tulpini virulente și tinere Candida albicans
– structura antigenica-pastrata
– Virulenţa: conservată
– nu aglutinează spontan cu SSF
• Cele capsulate păstrează capsula
• Majoritatea bacteriilor/levurilor
Colonia R (rough)
• Suprafaţa: rugoasă, aspră, uscată,
mată
• Elevație: plată
• Margini: crenelate (zimţate)
• Consistență: friabilă
• Tulpini avirulente
– Structura antigenică- Nu
– Capsula -Nu
– Virulenţa- Nu
Exc: B. anthracis, M. tuberculosis, C. Mycobacterium balnei
diphteriae
COLONII DE TIP R
GENUL CORYNEBACTERIUM
CORYNEBACTERIUM
“FLOARE DE
MARGARETA”
coloniilor în “cap de meduză” / “coamă de leu”,
• Bacillus anthracis;
• Colonii mari, alb-cenuşii,
• de tip “R”,
• la periferia coloniei: prelungiri ondulate
colonii pufoase,
mediu Sabouraud, 28-30° C, 7 zile,
Coccidioides immitis-> miceliu aerian,
iniţial albe->galben-maronii;
Mycobacterium spp. Mediu?
Colonia M (mucoid)
• mare,
• Suprafață: netedă,
umedă, strălucitoare,
• Consistență: mucoasă.
• ”picătura de miere”
• pastreaza capsula
(ex: Klebsiella
pneumoniae).
 KLEBSIELLA
GELOZA-SANGE
COLONII MUCOASE
 KLEBSIELLA
ADCL
COLONII MUCOASE
 Aspecte particulare- Motilitatea
• fenomenul de “invazie”, Ex: Proteus spp ;
– de la locul însămânţării cultura se “dezvoltă în valuri
concentrice” (se întinde din aproape în aproape) pe toată
suprafaţa mediului;
• fenomenul “liniei de demarcaţie”, Ex: tulpini din
genulProteus;
– 1 placa/ 2 tulpini diferite/ 2 puncte opuse -> o “linie de
demarcaţie” (1-2 mm);
– dacă tulpinile nu sunt diferite->“creşterea în valuri” fără
“demarcaţie” -> “pânze continue” de cultură
• fenomenul de “căţărare”, Ex: Proteus; cultivarea
unui produs patologic în lichidul de condens al unui
– 1 tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală->
“valuri suprapuse”
 Pigmentogeneza bacteriilor cromogene
• dependentă de condiţiile de cultivare.
• utila pentru identificare (Pseudomonas aeruginosa/
Staphylococcus spp.).
• După localizarea pigmentului,
– cromofore – in citoplasmă
– paracromofore
• în perete/în stratul mucos,
• Ex: pigmentul auriu la S. aureus, pigmentul galben-citrin
la S. Saprophyticus
• Pigmentate: auriu (S. aureus), alb (S. epidermidis), citrin (S.
saprophyticus)
– cromopare
• pigmentul albastru, galben-verzui, de altă culoare difuzibil în
mediu
• Ex: Pseudomonas aeruginosa.
Pigment
Mucegaiuri- culori foarte variate
Fungi
Ex: Candida albicans-culoare albă.
Hemoliza/ Producerea unor hemolizine
– Alpha hemoliza: incompletă
• zona de culoare verzuie: Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae
– Alpha prim
• “2 zone”, halou de hemoliză incompletă înconjurat de o zonă de
hemoliză completă: unele tulpini Streptococcus spp.
– Beta hemoliza: completă- zona clara
• ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria
monocytogenes, Haemophilus ducreyi
– Gamma hemoliza: fără
• Ex: Staphylococcus spp
Identificarea speciei - testul la bacitracină

Streptococcus pyogenes (SGA)

insamantare de 3 - 4 colonii beta
hemoliotice pe geloza sange

Geloză sânge
Hemoliză ß
SGA sunt inhibati de bacitracina
Martor pozitiv – S. piogen

Cp bacitracina
0.04U – orice diametru
0.1U – diametru>11mm
 Testul sensibilităţii la bacitracină/ beta
Str
• Principiu: Bacitracina (Bacillus
licheniformis)→ inhiba
multiplicarea streptococilor de
grup A
• Obs. < 1% Streptococcus
pyogenes= rezistente la
bacitracină.
• Streptococ beta-hemolitic:
• Grup A Streptococcus
pyogenes/ Grup B
Streptococcus agalactiae
• Test +: inhibitie a cresterii
bacteriene- Streptococ grup A-
Streptococcus pyogenes

Dr. Mara Mihai

Identificarea speciei: Testul la optochin

Streptococcus pneumoniae (sus) - sensibil la

Streptococcus pneumoniae
optochin, nu creste
Geloză sânge
Streptococcus grup viridans (jos) - rezistent la
Hemoliză alfa
optochin, creste fara probleme
Identificarea speciei - testul la optochin- zona
Geloză sânge
de inhibitie cu diametru >14mm
a. Testul sensibilităţii la optochin/ alpha Str.

• Principiu:
• Optochin
(ethylhydrocupreine
hydrochloride)
→detergent-like
• Streptococcus spp. →alpha
hemoliza
• Streptococcus pneumoniae/
Streptococcus spp. flora
normala
Test +: zona de inhibitie ≥14mm

Dr. Mara Mihai

Glucoza= principala
sursă de energie
• enzime zaharolitice,
Fermentarea
inulinei
• Diferenţiere
Str. pneumoniae
de Str.
viridans (există
tulpini de S.
viridans care
fermentează
inulina).
• Mediu: inulină +
Dr. Mara Mihai
indicator de pH.
 Testul bilolizei (Neufeld)
Principiu: bila/ săruri biliare →
activare enzime autolitice→
liza Streptococcus
pneumoniae capsulaţi
Scop: Streptococcus
pneumoniae/Streptococcus
spp.
Sol: dezoxicolat de sodiu 10%
Test+ : suspensie clara în tubul
în care am adăugat
dezoxicolat

Dr. Mara Mihai

 b. Testul CAMP- Grup B
• Principiu: Streptococii de grup
B→ factor CAMP (substanţă
extracelulară proteică)
• Staphylococcus aureus
→b-lizina.
• Sinergie factor CAMP/ b-lizina
• Metoda: cultivare Staf. a./
Streptococcus spp . în striuri
perpendiculare (fără să se
atingă)
• Test +: in zona de invecinare - (1)Enterococcus faecalis
(2)Streptococcus salivarius
hemoliză lărgita în “vârf de
(3)S. agalactiae
săgeată” (vârful spre tulpina de (4)E. durans.
stafilococ) Dr. Mara Mihai
• Catalaza
– Neutralizează metaboliții toxici de oxigen
– Neutalizează efectul bactericid al H2O2
– C+ S. aureus, strict aerobi, facultativ anaerobi,
Enterobacteriaceae
– C- Steptococcus spp., anaerobi
– Inocul bacterie, 1 pic H2O2 sol3%
Testul producerii de
catalază
 Identificarea speciei: Testul catalazei
Se urmărește
producerea de
catalază de către
bacterii; catalaza
descompune peroxidul
de hidrogen in apa si
oxigen
Interpretare
test pozitiv -
eliberare de
oxigen
(efervescență)
test negativ - lipsa stânga - bacterii catalazo-negative
efervescenței dreapta - bacterii catalazo-pozitive
 Diagnosticul de gen-Testul
catalazei
Scop: diferentiere coci Gram+ Staphylococcus spp./Streptococcus spp.

• Do it yourself!
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/catalase/Catalase
_Test/catalase.html
Dr. Mara Mihai
 Precauții
1. Nu folosiți ansa de metal + H2O2...oxidare
2. Să nu prelevăm Streptococcus de pe mediu
agar sânge- o bucățică de mediu conține
hematii care produc catalază... Reacție fals
pozitivă
3. Unele bacterii produc alte enzime care pot
descompune H2O2 după 20-30 secunde- fals
pozitiv
Identificarea speciei:Testul oxidazei
Se urmărește
producerea de
enzime oxidative
de către bacterii
Interpretare
test pozitiv - culoare
mov închis
test negativ - lipsa
modificării de
culoare
Sol 1% tetra metil p-fenilendiamina stânga - bacterii oxidazo-negative
dreapta - bacterii oxidazo-pozitive
• Mediul Chapman Mannitol Salt Agar
Tip: Selectiv si diferential
Scop:
• Selecteaza Staphylococcus spp., care cresc in medii bogate
in sare (7-10% NaCl);
• Diferentiaza Staphylococcus aureus de alte specii de
stafilococi
Escherichia coli
Neinsamantat
Nu creste-mediu selectiv

Dr. Mara Mihai

S. aureus (SCP) S. epidermidis si alte specii (SCN)
Galben=fermenteaza manitolul = nu fermenteaza manitolul

Dr. Mara Mihai

Mediul Chapman
 Testul coagulazei
• Staphylococcus CP/CN
• Coagulaza
– Fibrinogen solubil Fibrină
– Forma legată
• ”clumping factor” testul pe lamă
• 1 pic plasma, 1 pic ser control, suspensie bacterie...10
sec...aglutinare
– Forma liberă- testul în tub
• Factor de reacție la coagulază CRF- trombină-like
• Suspensie bacterie+plasmă..incubație 37 grade...4
ore...cheag
DNase AGAR
• Mediu diferential
• Contine acid dezoxiribonucleic (ADN)
• S.aureus produce dezoxiribonucleaza-depolimerizarea ADN-ului
• La adaugarea de HCl, apare o zona clara acolo unde s-a produs
depolimerizarea ADN.

Dr. Mara Mihai

 Caractere biochimice
• Reprezinta modificari ale componentelor unor medii de
cultura speciale, traduse prin schimbari de culoare,
detereminate de germeni
• Fermentarea zaharurilor in medii lichide si solide
– in medii lichide
• fermentarea glucozei, lactozei,
• esculinei (R+verde inchis)
• manitei (un zahar inclus in mediu Chapman) cu indicator rosu fenol
R + culoare galbena
– in medii solide fermentarea glucozei, lactozei,
zaharozei pe mediu TSI R+ vireaza in galben
 Geloză lactozată (CLED agar)
Mediu diferențial
• CLED= cystine lactose electrolyte
deficient
• Abs. electoliților: inhibă Proteus
spp.
• Lactoză: +
• Indicator: bromtimol albastru
• Izolarea, enumerarea și
identificarea prezumptivă a
bacteriilor urinare (susp infecție
urinară).
• Cultivarea și izolarea
neselectivă a enterobacteriilor.

Dr. Mara Mihai-LP5

• Mediul CLED (cystine,
lactose, electrolyte
defficient medium)
• S.aureus fermenteaza
lactoza

Dr. Mara Mihai

Testul utilizării citratului ca unică sursă
de carbon (Simmons)

Principiu: Anumite enterobacterii-

citratul= unică sursă de carbon.
Metoda: un mediu citrat+ indicator
de pH → alcalinizarea
mediului→ identificare
enterobacterie
Test +: 1 cultura bacteriana de-a
lungul striului + modificarea
Uninoculated control
culorii (albastră) Escherichia coli (negative)
Ex: Klebsiella pneumoniae Pseudomonas fluorescens (positive)

Enterobacter cloacae
 Identificarea speciei: Mediu TSI: triple sugar iron
Se urmărește
fermentarea Glucozei,
Lactozei, Zaharozei
producerea de gaz
producerea de hidrogen
sulfurat (H2S)
Mediu contine g,l,z si rosu neutru (indicator de pH)

Interpretare
în coloana dreaptă (jos)
- fermentarea G

în coloana înclinată (sus)

- fermentarea L și Z

la mijloc
- producerea de H2S G+, L+, Z+, H2S-
G+, L-, Z-, H2S- G+, L-, Z-, H2S+
 Identificarea speciei: Mediu MIU:
mobilitate indol uree

Mobilitate - Ureeaza +
Mobilitate +

Mediul contine: uree, triptofan, rosu fenol si neinoculat este de culoare galbena
 Identificarea speciei: Mediu cu uree
Se urmărește
producerea de
urează de către
bacterii
Interpretare
înroșirea mediului
= producere de
urează
U- U+
 Identificarea speciei: Mediu Simmons
(cu citrat)
Se urmărește
metabolizarea
citratului de către
bacterii
Interpretare
mediu albastru =
bacteria este
capabilă să
metabolizeze
citratul
mediu verde = bacteria
nu este capabilă să
metabolizeze
citratul, și nu crește citrat -
pe mediu Citrat +
DR. Mara MIHAI
 MacConkey
• săruri biliare
• cristal violet
• lactoză
• roşu neutru

DR. Mara MIHAI

Mediu Salmonella Shigella
• săruri biliare +verde briliant +lactoză +roşu neutru +săruri de fier

• E. coli : culoare roz (lactozo+, H2S-)

• Salmonella: colonii incolore cu centrul negru (lactozo-, H2S+)
• Shigella: incolore (lactozo-, H2S-).

DR. Mara MIHAI

• H2S:precipitat negru
• Fermentare Glu: rosu->galben baza
• Fermentare Lac/ Sucroza: totul devine galben
DR. Mara MIHAI
DR. Mara MIHAI
DR. Mara MIHAI
Agar XLD
xiloză+ lizină+dezoxicolat
Salmonella-produce H2S + fermenteaza Xyl- mediu galben+ colonii negre central
Shigella- nu fermenteaza Xyl- culoare roz/rosu mediu
Enterobacterii- fermenteaza Xyl-> culoare galbena a mediului XLD

Shigella

DR. Mara MIHAI

 Mediul multitest MIU (mobilitate
indol uree)
• Principiu:
– uree
– triptofan
– roşu fenol (indicator de pH)
• Geloza moale -> mobilitatea microorganismului
• hidroliza ureei -> alcalinizare mediu
(culoarea virează de la galben la roşu);
• producerea de indol din triptofan va fi indicată
de înroşirea reactivului Ehrlich
Testul ureazei
Uree→producere amoniac → alcalinizare
urina → cristale → litiaza

Proteus- microorganisme ITU ureazo+

(rapid)
Helicobacter pylori...biopsie
Indicator: roșu fenol (galben portocaliu
pal... Roz intens)

DR. Mara MIHAI

Testul ureazei
 Testul esculinei
• Scop: Streptococi de grup D, Enterococcus spp.
• Multe bacterii pot hidroliza esculina, dar
puține pot să o facă în prezența sărurilor
biliare 4%
• Esculina...glucoza+esculetina...+ ioni
fier...culoare neagră mediu
• Control +: Enterococcus spp.
• Control negativ: Streptococcus viridans
• Testul ureazei-hidroliza ureei de catre ureaza
secretata de anumiti germeni:
- ureazo pozitiv - vireaza in rosu aprins (dat rosului
fenol),
- Ureazo negativ - culoarea este galbena
• Producere de indol-se evidentiaza pe MIU care
contine triptofan-R+ banda de indol rosie
• Producerea de H2S se vede pe mediu TSI
TSI, MIU, Citrat Simmons
TSI, MIU, Citrat Simmons

Escherichia coli on TMC

(Glu+, Gas+, H2S-, Lac+, Motility-, Ind+, Urea-, Cit-)
TSI, MIU, Citrat Simmons

Proteus mirabilis
Glu+, Gas+, H2S+, Lac-,Motility+, Ind-, Urea+, Cit+)
• Salmonella spp. on TMC
(Glu+, Gas+, H2S+, Lac-, Motility+, Ind-, Urea-, Cit+)
• Testul utilizarii citratului ca
unica sursa de
carbon(Simmons)
• Testul MIU
(mobilitate,indol,uree)
• TSI(triple sugar iron):la niv.
Coloanei prod de gaz,de
H2S,fermentarea glucozei
-la niv pantei fermentarea
zaharozei|lactozei
Proteus,salmonella,schigella,yersinia