LP 22.

Identificarea bacililor gram pozitivi

Obiective. La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să descrie:

- etapele de identificare a principalelor specii din genul Bacillus şi să diferenţieze
B. anthracis / bacili antracoizi;
- etapele de identificare a principalelor specii din genul Clostridium;
- etapele de identificare a speciei Corynebacterium diphtheriae şi să cunoască etapele
diagnosticului de laborator al anginei difterice.

Bacili gram pozitivi:

- sporulaţi: Bacillus spp., Clostridium spp.
- nesporulaţi: Corynebacterium spp., Listeria spp., Erysipelothrix spp.

Genul Bacillus

Reprezentanţi: - specie înalt patogenă: Bacillus anthracis

- specii oportuniste (bacili antracoizi) ex. B. cereus
- alte specii ex. B. subtilis, B. megatherium, B. thuringiensis, B. licheniformis

Caractere microscopice:
- bacili gram-pozitivi mari cu extremităţile tăiate drept
A) în frotiuri din cultură incubată în aerobioza (nu pot fi diferenţiate speciile de Bacillus):
 sunt aşezaţi în lanţuri lungi
 prezintă spori ovali, centrali, cu dimensiuni mai mici sau egale cu diametrul bacilului (nu
deformează corpul bacilului)

Frotiu cultura colorat Gram Frotiu produs pathologic colorat albastru de metilen

B) în frotiuri din produs patologic:

 sunt aşezaţi în perechi sau scurte lanţuri
 B. anthracis prezintă capsulă
 în coloraţia Gram apare ca un halou incolor în jurul bacteriilor
 în coloraţia cu albastru de metilen policrom, capsula se colorează metacromatic în roz
Caractere de cultivare:
- aerobi, facultativ anaerobi
- nepretenţioşi nutritiv,
- se dezvoltă la temperaturi între 12°- 40ºC
- formă de cultură R
1
 - B. anthracis:
→ în bulion nutritiv cresc sub aspectul unui depozit floconos, fără a tulbura mediul;
→ pe medii agarizate – colonii cenuşii, aplatizate, rugoase, cu aspect de sticlă pisată şi contur
neregulat,
-colonii R, nehemolitice pe geloză sânge
- B. cereus:
→ colonii R, hemolitice pe geloză sânge
→ produce lecitinază - formează colonii înconjurate de precipitat alb pe mediul Nagler
(mediu suplimentat cu gălbenuş de ou)

Cultură B. cereus pe mediul Nagler

Caractere de diferenţiere B. anthracis / bacili antracoizi

Bacillus anthracis bacili antracoizi (B. cereus)

- imobil - mobili
- colonii nehemolitice pe geloză-sânge - colonii β-hemolitice pe geloză-sânge
- sensibil la penicilină - rezistenţi la penicilină
- patogen pentru şoarecele alb - nepatogeni pentru şoarece

Cultură B. anthracis pe geloză sânge Cultură B. cereus pe geloză sânge

2
 Genul Clostridium

Reprezentanţi: Clostridium botulinum, C. difficile, C. septicum, C. perfringens, C. tetani

Caractere microscopice
- bacili gram-pozitivi sporulaţi
- sporii au diametrul mai mare decât corpul bacilului, pe care il deformează
 C. tetani – spor sferic terminal, cu aspect de „băţ de tobă”
 C. perfringens – nu sporulează în cultură – îi observăm pe frotiuri din cultură ca bacili
gram-pozitivi mari, nesporulaţi
 Clostridium spp. – spori ovalari, centrali, paracentrali sau subterminali, cu aspect de
„suveică”, „rachetă de tenis”

Frotiu cultură C. tetani Frotiu cultură C. perfringens Frotiu cultură Clostridium spp.

Caractere de cultură
- bacterii anaerobe (atmosferă de hidrogen sau azot cu 10% CO2)
- nepretenţioşi nutritiv
- pe geloză-sânge majoritatea clostridiilor produc colonii hemolitice
- cele mai multe clostridii coagulează şi acidifică laptele turnesolat
C. perfringens
→ pe geloză-sânge: detemină o dublă hemoliză – o zonă internă, îngustă, β-hemolitiză şi o zonă
externă, largă, α-hemolitiză

3
→ pe mediu cu gălbenuş de ou: cultura este înconjurată de o arie albă de precipitare = producerea
de lecitinază
→ testul de neutralizare a lecitinazei evidenţiază absenţa precipitatului alb in jumătatea de mediu
Nagler inundată cu ser ce conţine anticorpi anti- lecitinază

Identificarea Corynebacterium diphtheriae

 Caractere microscopice: bacilli gram pozitivi, fini, granulari, mǎciucaţi (în frotiul din produs
patologic sau de pe mediul de cultură Löeffler), aşezaţi izolat sau în perechi, sub forma
literelor unghiulare, litere chinezeşti si palisade

 Caractere de cultivare:
- pretenţios nutritiv;
- izolare din produsul patologic pe medii cu sânge sau ser
 mediul Tinsdale (mediu selectiv prin adaos de telurit de potasiu): colonii negre
înconjurate de un halou brun;
 mediul Löeffler (mediu electiv pentru bacilul difteric): creştere caracteristică în 10 –
18 ore de la însǎmânţare - colonii albe, lucioase, bombate (“picǎturi de
spermanţet”).
 Identificarea biochimicǎ: - diferenţierea C. diphtheriae de alte specii Corynebacterium;
4
 Demonstrarea toxigenezei:
1. in vitro testul Elek
2. in vivo: testul de neutralizare
3. toxicitatea pe culturi de celule;
4. PCR pentru gena tox.

Diagnosticul de laborator al anginei difterice

I. Prelevare:
- 3 tampoane cu exsudat faringian (TF);
- un tampon cu exsudat nasofaringian.
II. Examen microscopic
 TF – 1: frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen alcalin Löeffler
III. Cultivare:
 TF – 2: însămânţare pe:
- mediu Tinsdale - după 24 ore coloniile negre se repică pe mediul Löeffler (mediu electiv pentru
bacil difteric) pentru a obtine cultura pură
- geloză sânge: - evidenţiază calitatea prelevării (colonii α-hemolitice ale streptococilor orali)
- prezenţa de colonii β-hemolitice de S. pyogenes (uneori angina streptococică poate
evolua cu false membrane mimând angina difterică sau poate fi asociată acesteia).
 TF – 3: însămânţare pe:
- mediul Löeffler (mediu neselectiv care favorizează cultivarea bacilului difteric cu morfologia
caracteristică),
- mediul de îmbogăţire O.S.T. (ou – ser – telurit);
 tamponul nasofaringian se descarcă pe O.S.T.- dupa 24 ore se repică pe Tinsdale iar
coloniile negre se vor repica pe mediul Löeffler
IV. Identificarea bacteriei izolată în cultură pură pe mediul Löeffler (frotiu colorat Gram şi
identificare biochimică)
V. Demonstrarea toxigenezei

În sală se găsesc:
- frotiuri din cultură Bacillus spp., Clostridium spp., C. tetani, C. perfringens, C. diphtheriae
colorate Gram
- frotiuri din produs patologic cu B. anthracis colorate Gram şi albastru de metilen policrom
- cultură de B. cereus pe geloză nutritivă, geloză sânge, mediu Nagler şi în bulion
- tuburi Weinberg inoculate cu C. histolyticum şi C. sporogenes
- test de neutralizare a lecitinazei in vitro (C. perfringens)
- foto cu testul Elek