FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

GENUL ESCHERICHIA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR

Bacteriologie si Imunologie , Curs universitar, Anda Baicus , Ed. Universitara „ Carol Davila”

Specia principala : E.coli

Specia Diagnostic de laborator

E.coli Produs patologic: urina, materii fecale, sânge, puroi, exsudate
Urina recoltată înaintea începerii tratamentului antibiotic, din porțiunea mijlocie a jetului după
toaleta organelor genitale externe.
Materiile fecale recoltate cu sonda Nelaton sau din scaunul emis spontan-(produsul
suspensionat în ser fiziologic steril sau în mediul Carry Blair)
Frotiu: examen microscopic din urina centrifugată, sedimentul examinat ca preparat
proaspăt lamă–lamelă (evidențiază mobilitatea, elementele celulare, sărurile, leucocitele)
sau frotiu fixat și colorat Gram
Examenul macroscopic: nu dă informații asupra cantitații de germeni, turbiditatea poate fi
urmarea precipitării unor substanțe din urină (fosfați, urați)
Cultivare pe medii de cultură la cel mult 1h de la recoltare și după o prealabilă agitare
(UROCULTURA)
UROCULTURA - cantitativă: determinarea nr. germeni/ml urină
a. Metoda diluțiilor seriate în placi; b. Metoda ansei calibrate; c. Test Uricult
a. diluții zecimale în ser fiziologic:1/10; 1/100; 1/1000; din fiecare diluție se pun 0,1 ml
pe suprafața a 2 plăci Petri cu geloza sânge și Mac Conkey-incubate 37°C, 18-20h. A
doua zi se numără coloniile izolate dezvoltate pe mediile de cultură
calcularea nr. germeni/ml urină=nr. colonii izolate x diluția x 1/ volumul de urina
depus pe placa, se face media pentru fiecare tip de mediu; rezultatul=media cea mai
mare obținută pe mediul fără inhibant (geloza-sânge)
b. 2 anse
– volumul încarcat de o ansă=0,01ml urină, ϕintern al ansei=5mm
– volumul încarcat de a 2 a ansă=0,001ml, ϕ intern al ansei =2,5mm
aceeași placa servește pentru cele două diluții- pe o jumătate se descărcă ansa încarcată cu
0,01ml iar în cealaltă jumătate ansa cu 0,001ml
nr. germeni/ml urina=nr. colonii izolate x100 pentru ansa de 5mm sau cu 1000 pentru
ansa de 2,5mm; se face media celor doua diluții
INTERPRETARE:
- 0-10 000 bacterii/ml-contaminare în timpul recoltării
- 10-100 000 bacterii/ml infecție probabilă
- >100 000 bacterii/ml (10 5 UFC/ml) infecție sigură
c. Uricult-lama de sticlă cu mediu de cultură uscat (geloza sau geloză lactozată) care se
umezește cu urina pe fiecare față.
Interpretarea se face in funcție de intensitatea culturilor în raport cu etalonul
Identificare
- caractere morfotinctoriale—bacili Gram-
- caractere de cultură - bulion: crestere de tip S cu tulburarea uniformă a mediului, geloza
simplâ: colonii S rotunde, bombate, opace; medii diferențiale: colonii lactozo+: AABTL-colonii
galbene; Mac Conkey-colonii roșii
- caractere biochimice: medii MIU, TSI, Simmons- fermentează: glucoza, lactoza,
zaharoza cu producere de gaz; indol+, H2S-, urează-, citrat-, oxidazo-, tulpinile responsabile
de infecțiile intestinale sunt mobile si cele responsabile de infecțiile extraintestinale sunt
imobile având capsulă polizaharidică
Identificare serologica - serogrup/serotip cu seruri anti O, H, K
Tratament in funcție de severitatea bolii in cazul infecțiilor urinare, ampicilina, biseptol; in
cazul infecțiilor intraspitalicesti, cefalosporine, fluorochinolone, aminoglicozide,
 carbapeneme
EHEC Cultivare pe Mac Conkey ce conține sorbitol; tulpinile EHEC nu fermentează sorbitolul dar
există și O157 care fermentează;
Cultivare pe Mac Conkey urmată de identificarea toxinei
Nu se recomandă tratament antibiotic ci numai suportiv deoarece ar putea prelungi portajul
intestinal și predispune la complicații (SHU)

GENUL SALMONELLA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR

Specii principale : Salmonella enterica (serotipuri typhi,. paratyphi A, B, C) și Salmonella bongori

Specia Diagnostic de laborator

Produs patologic, materii fecale:
-la bolnavi- din scaunul emis spontan (nu se administrează purgativ-crește riscul
perforației intestinale)
-la purtători- după administrare de purgativ salin (MgSO4) - din al doilea scaun
dacă însamanțarea nu se face în max 2 h se folosește mediul de transport Cary-
Blair
Îmbogațirea obligatorie- concomitent 2 medii: cu selenit acid de sodiu și tetrathionat
Însamantarea pe medii selective- înalt: Wilson- Blair; moderat: ADCL, SS,IM, slab:
Mac Conkey, EMB ( eosin methylene blue agar), Hektoen enteric agar*, mediul
cromogen SM2**
Identificarea: repicarea coloniilor lactozo- de pe mediile selective pe mediile multitest
TSI, MIU, Simmons
- caractere morfologice: bacili Gram-, cu cili peritrihi, necapsulați, nesporulați
- caractere de cultură: se dezvoltă bine pe medii simple- în 6h în mediile lichide și 24h
pe medii solide, creștere de tip S
- medii de îmbogațire – selenit acid de sodiu: Muller- Kauffmann
- geloză-sânge- nu produc hemoliza
- medii selective lactozate ADCL, AABTL: colonii S lactozo-, în culoarea mediului
Salmonella -Istrati–Meitert IM, la 48 h colonii cu margini semitransparente, bombate și centrul negru
-geloza Wilson – Blair, la 48h colonii negre opace cu suprafața rugoasă, margini
neregulate cu halou și luciu metalic
- caractere biochimice: fermentează glucoza+gaz; H2S+; indol-; lactoza-; zaharoza-;
oxidaza-
- identificare serologică: aglutinare pe lama-seruri de grup și tip (anti O, H, Vi)
Tratament
-în cazul afectării sistemice: fluorochinolone (ciprofloxacin); aminoglicozide; tetraciclina;
cloramfenicol; biseptol
-în cazul gastroenteritelor, nu se administrează antibiotic deoarece crește perioada
portajului intestinal
Lizotipia

*Mediul Hektoen enteric agar – selectivo diferențial conține săruri biliare și inhibitori pentru creșterea bacteriilor Gram pozitive:
coloniile produse de bacterii care fermenteaza lactoza, zaharoza, salicinul, apar galben roz; coloniile produse de bacterii care
nu fermenteaza zaharurile apar verzi transparente, cele care produc H2S ( Salmonella) formeaza precipitate negre pe colonie

** Mediul cromogen SM2 detecteaza activitatea enzimatica a esterazei, coloniile de Salmonella apar roz pal pana la mov,
mediul conține inhibitori pentru bacterii Gram pozitive și fungi și asigură diferențierea altor bac
 FEBRA TIFOIDA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Tip Febră tifoidă/ Săptamâna de boală
determinare
S. Typhi
S1 S2 S3 S4 Convalescenți Purtători
cronici
hemocultura +++ ++ + +/- - -
coprocultura + ++ +++ + +/- +/-
urocultura - +/- + + +/- +/-
bilicultura nu se nu se nu se nu se +/- +/-
recomandă recomandă recomandă recomandă
medulocultura + + + +/- nu se recomandă nu se
recomandă
Dg. -la bolnavi/ convalescenți/ purtători cronici- evidențierea Ac anti O/H/Vi și stabilirea titrului
serologic -reacții de aglutinare în tub (titrul anticorpilor se urmărește în dinamică) - grunji de aglutinare
mici și stabili (aglutinare O/Vi); mari și instabili (aglutinare H)
Ac anti O apar primii în cursul bolii- titrul semnificativ>1/160
Ac anti H apar în cursul bolii- titrul semnificativ >1/160
Ac anti O și H se determină prin analiza serică calitativa (ASC)
Ac anti Vi apar târziu la sfârșitul bolii persistând luni/ani- titrul semnificativ>1/40 folosit la
diagnosticul retrospectiv al stării de purtător
ASC +/- ++ +++ +++ +++ nu se
recomandă
Vi nu se nu se nu se nu se +++ +
recomandă recomandă recomandă recomandă

GENUL SHIGELLA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR

4 specii importante enteroinvazive si care se multiplică in enterocit: S. dysenteriae (10 serotipuri,
serotipul 1, bacilul Shiga), S. flexneri (6 serotipuri + subtipuri), S. boydii (15 serotipuri), S. sonnei

Specii Diagnostic de laborator

Shigella Recoltare: înaintea începerii tratamentului antibiotic
-din scaunul emis spontan (dizenteria acută)
-sonda Nelaton nr. 16-18 din colonul sigmoid pe o distanță de 15-20 cm la adult și 10-
15cm la copil/ rectosigmoidoscopie (dizenteria atipică/bolnavi/purtători cronici)
Coprocitograma-evidențierea >75%PMN pe frotiu - diagnostic infecție cu
enterobacterii invazive
Cultivare medii selectivo diferențiale: IM, SS, ADCL, Mac Conkey, AABTL, CLED
Identificare
- frotiu din cultură: bacili Gram-
-caractere de cultură: creștere S, colonii Ф 1-2mm lactozo-
-caractere biochimice: glucoza+ fără gaz; lactoza-; zaharoză-; H2S-; urează-; citrat-;
indol variabil; oxidază-; imobil
-identificare serologică de grup si tip: aglutinare seruri polivalente/monovalente (A,
B, C, D)
Tratament: ciprofloxacin, azitromicin, trimetoprim, sulfametoxazol
 GENULYERSINIA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Specii principale:Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica și Yersinia pseudotuberculosis

Specii Diagnostic de laborator

Y. Produs patologic: puroi din bubon, sânge, spută, fragmente de organ
pestis Morfologie: bacil Gram-, capsulați, cu capete rotunjite, colorați bipolar (frotiu din
produs patologic colorat Wright-Giemsa, Wayson), nesporulat, imobili la 37°C
Cultivare: se dezvoltă pe medii uzuale: bulion, geloză nutritivă, medii triptozate cu
sânge (Y. pestis), medii lactozate (ADCL, Mac Conkey)
Identificare:
frotiu; bacil Gram-, imobil, scurt, gros, colorație bipolară
-pe medii solide – colonii mici translucide cu margini regulate, prin incubare prelungită
crește diametrul coloniei și devin opace
Y pestis–colonii M cu consistență mucoasă datorită materialului de înveliș.
-geloză-sange - colonii nehemolitice
-ADCL, Mac Conkey colonii S, lactozo -
-medii lichide- tulbură uniform mediul cu depozit la fundul eprubetei
-caractere biochimice: TSI, MIU, Simmons: glucoza+, fără gaz; lactozo -, zaharoza+,
urează -, imobil, oxidaza -
Identificare serologică: aglutinare cu ser specific anticapsular
- coagulaza +
Tratament: streptomicina, doxiciclină
Diagnostic de urgență: se incepe tratamentul inaintea confirmarii bacteriologice,
masuri de protectie specială
Y.enterocolitica - mobile la 22 -30°C datorită cililor polari și peritrihi, imobile la 37°C
- se multiplica la temperaturi de refrigerare
- mediu cefsulodin-irgasin-novobiocin (CIN) – colonii cu centru roșu și margini
transparente, incubare 48 h, 25°C

Y. pseudotuberculosis Produs patologic: materii fecale, sange

-mobile la 22 -30°C datorită cililor polari și peritrihi, imobile la 37°C
- urează +, oxidază –
Tratament: cefalosporine, aminoglicozide, cloramfenicol, tetracicline

GENUL KLEBSIELLA - DIAGNOSTIC DE LABORATOR

Specii principale: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozenae, K. rhinoscleromatis

Specii Diagnostic de laborator

Klebsiella Produs patologic: sputa, exsudat nazal, urina, secreție de la nivelul leziunii
granulomatoase
Cultivare medii lactozate, ADCL, AABTL, Mac Conkey
Identificare
- cocobacili Gram –
- colonii mucoide M
-biochimică: TSI, MIU, Simmons: glucoza+, lactoza+, imobili, oxidaza -, citrat+, indol -,
exceptie K. oxytoca: indol +
-serologică: reacția de umflare a capsule (80 serotipuri)
-inoculare la șoarece- septicemie (amprenta ficat/splina, colorate albastru de metilen,
bacili înconjurați de halou luminos care evidențiază prezența capsulei)
Tratament: multe specii sunt producatoare de β lactamaze cu spectru extins (ESBL)
- se utilizeaza carbapeneme si fluoroquinolone
 GENUL PROTEUS - DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Speciile principale: P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri

Specii Diagnostic de laborator

Produs patologic : urina, puroi, exsudate purulente, materii fecale, lichid de vărsătură,
aliment suspectat
Cultivare: ADCL, Mc Conkey, bulion, geloza 2%, IM
Proteus Caractere de cultura
-dezvoltare rapidă pe medii peptonate lichide cu degajare de miros caracteristic de
putrefacție, tulbură uniform bulionul
- pe mediile gelozate 2% fără inhibitori – apare fenomenul de invazie sau cațărare (de la
locul însamanțării cultura se extinde pe toată suprafața plăcii/ tubului sub forma de valuri
succesive); dacă pe placa se însamânțează în locuri diferite 2 tulpini de Proteus care
migrează, la locul de întâlnire apare o linie de demarcație, fenomenul Dienes
- pe mediile slab și moderat selective (ADCL, Mac Conkey) - colonii izolate lactozo-, S
- pe IM , ADCL coloniile pot avea uneori centrul negru - aspect de ochi de pisica
-caractere biochimice: MIU/TSI/ Simmons: fermentează glucoza+ gaz; lactoza-; H2S+;
ureaza+, indol- (P. mirabilis), indol + (P. vulgaris); oxidaza - (caracterele biochimice
subdivizează genul în 4)
Tratament - se folosesc asocieri cotrimoxazol, gentamicina, kanamicina

GENURILE ENTEROBACTER, CITROBACTER, SERRATIA,

MORGANELLA- DIAGNOSTIC DE LABORATOR

Specii Diagnostic de laborator

Enterobacter Produs patologic: puroi, sputa, urina
E. aerogenes Identificare
- biochimică: glucoza+, lactoza+, H2S-, mobil, citrat +
E. cloacae
C. aerogenes – decarboxileaza lizina nu arginina
E. cloacae - decarboxileaza arginina nu lizina
Tratament : carbapeneme
Speciile sunt rezistente la cefalosporinele de prima generatie si dezvolta rapid rezistenta
la a doua si a treia generatie .
Citrobacter Produs patologic: sputa, urina
Cultivare medii lactozate, ADCL, AABTL, Mac Conkey
Identificare
-biochimica: glucoza+, lactoza- dar poate fermenta tardiv lactoza, mobil, citrat pozitiv,
hidrolizeaza lent ureea
C. freundii: H2S+, poate fi confundat cu Salmonella datorita reactivitatii
incrucisate cu antigenul O
Tratament: carbapeneme, quinolone, aminoglicozide
C. freundii este producatoare de β lactamaze mediate cromozomial AmpC
Serratia Identificare
-biochimica: colonii pigmentate roz/rosu, lactozo-, mobile, H2S-,citrat +
marcescens
Tratament: carbapeneme, amikacin, piperacilin-tazobactam
Rezistenta la colistin
Morganella identificare
-biochimica: indol +, mobila, hidrolizeaza ureea
morganii
Tratament: carbapeneme
Fig.11.1a Frotiu din cultură pură colorat Gram, bacili Gram negativi, cultură pură Klebsiella
pneumoniae, colonii de tip M pe: 1b geloză simplă; colonii lactozo pozitive pe: 1c AABTL, 1d
MacConkey, 2a cultură pură de E. coli, colonii lactozo pozitive pe MacConkey, 2b. colonii lactozo
pozitive si lactozo negative pe MacConkey

1a 1b

1c 1d

2a 2b
Fig.11.3a Proteus, fenomenul de invazivitate pe geloză sange, 3b Proteus, fenomenul de demarcație,
Dienes, pe geloză sange, 3c cultură pură, colonii lactozo negative pe AABTL, 3d cultură pură, colonii
lactozo pozitive pe AABTL, 4 Salmonella, cultură pură colonii tip S, lactozo negative cu precipitate
negre datorita producerii de H2S, pe AABTL 5 colonii de Salmonella si colonii galbene lactozo pozitive
pe mediul Hektoen enteric agar

3a 3b

3c 3d

4 5
Fig. 11. 6. Salmonella pe mediul cromogen SM2** , 7.Colonii de Salmonella pe geloza sange, 8
Shigella, cultură pură pe CLED, 9 Shigella, cultură pură pe geloza sange, 10 Yersinia, cultură pură,
colonii lactozo negative pe AABTL, 11. Yersinia, colonii lactozo negative pe MacConkey

6 7

8 9

10 11
Fig. 11.12. Yersinia pe mediul cromogen YER, 13. Serratia marcescens pe geloza sange, 14. Serratia
marcescens pe AABTL dupa 24h de incubare la 370C, 15. Serratia marcescens pe AABTL dupa 48h
de incubare la 370C, 16. antibiograma difuzimetrica , Serratia marcescens, 17. antibiograma
difuzimetrica, tulpina producatoare de ESBL
12 13

14 15

16 17
Fig.11.8. Teste biochimice: a) TSI; 1a) glucoza +, lactoza -, H2S+, 2a) glucoza +, lactoza +, H2S -, b)
mediul Simmons (testează utilizarea citratului ca unica sursă de carbon), 1b) negativ, 2b) pozitiv, c)
mobilitate, indol, ornitindecarboxilaza, 1c) imobil, indol -, ornitindecarboxilaza -, 2c) mobil, indol +,
ornitindecarboxilaza+, d) MIU; 1d) imobil, indol +, ureaza +, e) API test

1a 2a 1b 2b 1c 2c 1d

Interpretare teste:
TSI (triple sugars iron): glucoză, lactoză, roșu fenol, citrat feric)
- glucoza+, lactoza+: culoarea roșie virează spre galben; H2S+: culoare neagră în porțiunea dreaptă
a tubului; producere de gaz: mediul este deplasat în sus sau apar fragmentări ale mediului
Producere de hidrogen sulfurat: evidentiaza descompunerea aminoacizilor cu sulf sub actiunea
cistein desulfhidrazei
Mediul Simmons - testează utilizarea citratului ca unica sursă de carbon
MIU (mobilitate, indol, urează)
- imobil, creșterea sub forma unui con cu varful în jos pe traiectul de însamanțare
- mobil, creștere în toată masa mediului, aspect difuz
- indol+, hârtia de filtru umezită cu reactiv Kovac devine roșie
- ornitindecarboxilaza +, culoarea mediului devine mov
- ureaza+ , culoarea mediului se intensifica
Testul idol: triptofanaza prezenta la unele bacterii (E.coli) scindeaza triptofanul in indol, acid piruvic si
amoniac
Testul ureazei: ureaza scindeaza ureea din mediu in amoniac si CO2
Evidentierea L si D fenilalanindezaminazei: enzime care scindeaza L si D alanina in acid fenil piruvic
care in prezenta clorurii ferice da o culoare verde

Identificare enterobacterii – Sistem API 20E/NE

*Sistemul API 20E / NE de identificarea rapidă, combină unele teste convenționale și permite
identificarea unui număr limitat de bacterii Gram-negative, enterobacteriaceae sau non-
enterobacteriaceae. Sistemul de testare contine 20 de tuburi mici de reacție, care includ substraturi
deshidratate pentru detectare: ONPG: beta-galactozidaza, ADH: Arginin DiHidrolaza, LDC: LizineDeCarboxilaza,
ODC: Ornitine DeCarboxilaza, CIT: utilizare Citrat, H2S: producere de Hidrogen sulfurat,URE: Ureaza, TDA:
Triptofan DeAminaza IND: producere Indol, VP: producere acetoina (Voges Proskauer), GEL: Gelatinaza, GLU:
fermentare / oxidare (Glucoza), MAN: fermentare / oxidare (Manitol), INO: fermentare / oxidare (Inozitol), SOR:
fermentare / oxidare (Sorbitol), RHA: fermentare / oxidare (Ramnoza), SAC: fermentare / oxidare
(Saccharose/Zaharoza) MEL: fermentare / oxidare (Melibiose), AMY: fermentare / oxidare (Amygdalin), ARA:
fermentare / oxidare (Arabinoza).
Interpretare : ONPG: pozitiv galben , negativ clar; LDC: pozitiv galben, negativ rosu; CIT: pozitiv
albastru; URE: pozitiv rosu, GEL: lichefierea gelatinei (pozitiv negru), fermentarea glucozei (GLU),
manitol (MAN), inozitol (INO), sorbitol (SOR) și ramnozei (RHA) (pozitiv galben, negativ albastru).
 FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE. DIFERENTIEREA BIOCHIMICĂ A SPECIILOR DE INTERES
MEDICAL

Enterobacter
Edwardsiella

Providencia
Escherichia

Morganella
Salmonella

Citrobacter

Klebsiella

Ewingella
Yersinia
Shigella

Serratia

Proteus
Testul/ substratul

Glucoza-gaz TSI + - + + + + + d + D d - -
Zaharoza d D - - d + + + D d - D -
Lactoza + D - D d D d D - - - +
Citrat (Simmons) - - - + + D + + d + - - +
H2S/TSI - - + + D - - - + - - - -
Indol + d + - D D - - D + + D -
Lizin decarboxilaza d - + + - D D + - - - -
Ornitin
d D + + D - D + D - + D -
decarboxilaza
Fenilalanina
- - - - - - - - + + + - -
deaminaza
Ureaza - - - - D D D - + D + D -
Mobilitate -
d - + + + - + + + + + +
37OC

+ reacție pozitivă, - reacție negativă,d: reacții pozitive variind intr-o proporție de 10-90% la speciile din
genul respectiv, D : reacții diferite date de speciile din cadrul genurilor