Sunteți pe pagina 1din 108

FIZIOLOGIA BACTERIILOR.

METABOLISMUL MICROBIAN.
CULTIVAREA BACTERIILOR.
EXAMENUL BACTERIOLOGIC.
Fiziologia bacterian studiaz viaa i
activitile bacteriilor nutriia,
metabolismul, creterea i multiplicarea,
condiiile de cultivare a bacteriilor.
Metabolismul bacterian reprezint
ansamblul de reacii biochimice care au loc
n celula vie.
- Catabolism reacii chimice de
descompunere a substanelor complexe n
elemente simple, nsoit de degajarea
energiei (metabolism energetic)
- Anabolism reacii chimice de sintez a
substanelor complexe din elemente simple,
necesit energie (metabolism constructiv, de
sintez)
Particularitile metabolismului bacterian:
1. Este un metabolism necompartimentat , toate
procesele metabolice se desfoar intr-o singur
celul
2. Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci
metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la
condiiile mediului)
3. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)
4. Produsele intermediare din procesele catabolice
pot fi utilizate direct n calitate de precursori
pentru reaciile anabolice (amfibolism)
n toate reaciile metabolice intervin catalizatori
proteici specifici - enzimele
Enzimele bacteriene. Caractere generale:
- Substane proteice
- Active n limite largi de temperaturi (0-65C)
i de pH (2-9)
- Specificitate de substrat i de aciune
(reacioneaz cu un substrat cataliznd un
tip de reacie)
- Specificitatea este determinat de centrul
activ al enzimei, complementar cu
receptorul de pe substrat
- Nu se modific n cursul reaciei
Clasificarea enzimelor bacteriene
I. Constitutive (permanente)
II. Inductive (adaptive), se sintetizeaz n prezena
substratului (ex.: lactaza)
III. Represive, sinteza lor este inhibat de
acumularea n exces a produsului reaciei
catalizate
Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)
Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze,
hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
Dup impactul asupra ma/o
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de
modificri patologice ale esuturilor, celulelor
ma/o : hialuronidaza, colagenaza,
plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, etc.
Importana practic a studierii enzimelor
1. Rol n identificarea i clasificarea
bacteriilor (enzimele determin activitatea
biochimic specific a bacteriilor)
2. Unele substane chimice, antibiotice
interfereaz cu activitatea unor enzime,
inhibnd creterea bacteriilor (tratament)
3. Determinarea mecanismelor patogenezei
infeciilor (unele enzime sunt responsabile
de producerea leziunilor n esutul gazdei)
4. Aplicarea industrial a enzimelor
NUTRIIA BACTERIAN

Nutriia modalitile prin care bacteriile


asimileaz din mediu substanele necesare
pentru metabolism.
Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv.
Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa
MCP pentru a fi antrenate n metabolismul
celulei. Se obin din alimente prin solvire (sruri
minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil
(proteine, polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelular (la
bacteriile G- i n spaiul periplasmic)
Nutrienii servesc n calitate de material
de construcie i surs de energie
pentru sinteza compuilor i meninerea
vieii bacteriei.
Transportul transmembranar

1. Difuzie simpl, pasiv (conform


gradientului de concentraie, fr
consum de energie): O2, CO2, acizi grai,
nutrieni liposolubili
2. Difuzie facilitat (conform gradientului de
concentraie) permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport specifice
integrate in MCP - permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de
concentraie, necesit energie). Particip
permeazele i alte proteine de transport
/fixare specifice. Nutrienii nu suport
modificri.
4. Translocaie substratul este modificat
chimic (ex.: fosforilat) n timpul transportului
membranar; necesit energie
Substanele care au ptruns n citoplasm
sunt descompuse de ctre enzimele
bacteriene conform cilor metabolice proprii
fiecrei specii bacteriene (ex.: Embden-
Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine
energie i precursori care vor fi antrenai n
biosintez (anabolism).
Excreia metaboliilor difuzie, proteine de
transport, liza bacteriei
Necesitile nutritive ale bacteriilor
- Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n
cantiti importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K n
cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo.
Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i realiza
integral sinteza metaboliilor eseniali.
- Necesiti specifice. Bacteriile auxotrofe
solicit suplimentar compui organici
preformai (factori de cretere), care nu pot fi
sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice,
pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul
de cultur este indispensabil creterii acestor
bacterii.
Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon
Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic
surs de carbon (nepatogene)
Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din
compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli,
etc)
- Bacteriile care utilizeaz materia organic
moart sunt saprofite (reciclarea materiei
organice)
- Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc
pe contul organismelor vii, aducndu-le
prejudicii
- Bacteriile patogene reprezint parazite care
afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau
moarte.
Surse de azot
- AA sau acizi nucleici
- Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic

Surse de substane minerale:


- S - din AA, sulfuri, sulfai;
- P - din fosfai;
- K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale;
- Zn, Cu, Mn, Mo din ap
Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie
Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar
(fotosint)
Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din
reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un
substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat
acceptor de hidrogen. n transfer particip
transportori intermediari de electroni (lanul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
- Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o
substan anorganic
- Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o
substan organic (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe
Mecanismele de obinere a energiei la
chemoorganotrofe n funcie de acceptorul
final de H :
Respiraie aerob. Acceptorul final este
oxigenul gazos (agent oxidant extern). Implic
lanul respirator de transport al electronilor
asociat MCP. Produs final H2O sau H2O2 .
Respiraie anaerob. Acceptori finali
compui anorganici (nitrat, sulfat, S).
Transportul de electroni prin lanul respirator.
Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura
(n prezena O2 H2O2).
Fermentaie. Substratul organic este
metabolizat fr intervenia unui agent
oxidant extern. Const n procese de ox-red
care realizeaz numai o oxidare parial a
substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind
substane organice. Astfel se ajunge de la un
substrat mai redus la o molecul mai oxidat
(ex.: fermentare lactic, fermentare
alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc).
Fermentaia se poate desfura n prezena
O2, dar fr intervenia acestuia.
Conservarea energiei
O parte din energia eliberat se pierde sub
form de cldur sau poate fi utilizat direct
sub form de energie electro-chimic (fpm-
forta proton motrice) la nivelul MCP (ex.:
rotaia flagelilor, transport transmembranar)
sau stocat n compui chimici macroergici
bogai n energie: ATP (sintetizat prin
fosforilare oxidativ sau fosforilare la substrat),
fosfoenol-piruvat, acetilfosfat i acetil-CoA.
n procesele de respiraie se elimin mai mult
energie dect din fermentaie (n glicoliz dintr-un
mol de glucoz - 38 moli ATP, prin fermentaie - 2
moli ATP). n procese de fermentare se formeaz
deeuri rejetate de ctre celul.
Clasificarea bacteriilor dup
sursele de energie i carbon
I. Bacterii fotoautotrofe (energie solar,
CO2)
II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol.,
subst.org)
III. Bacterii chemoautotrofe
IV. Bacterii chemoheterotrofe
(chemolitoheterotrofe,
chemoorganoheterotrofe)
CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR

Creterea mrirea coordonat a masei i


volumului structurilor bacteriene ca rezultat al
proceselor de sintez
Multiplicarea creterea numrului de celule pe
o unitate de suprafa sau de volum
- Diviziune binar
- nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)
Ciclul celular procesele care au loc de
la formarea celulei pna la urmtoarea
diviziune
1. Faza C replicarea ADN

2. Faza G de laten, segregarea


cromozomilor
3. Faza D de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critic a


celulei, iar separarea cromozomilor i
diviziunea intervin n momentul cnd
celula atinge o lungime - limit
Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul
(perioada) de generaie (TG).
Durata TG depinde de specie i de condiiile de
cretere (condiii optime vitez maxim)

TG in vitro
Bacteria TG in vivo (ore)
(min)

Escherichia coli 20-40 5

Staphylococcus aureus 40 3-5

Vibrio cholerae 10 2-3

Mycobacterium
tuberculosis
120-240 24-48
CULTIVAREA BACTERIILOR
Creterea bacteriilor n laborator cultivare.
Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din
medii naturale (prelevate patologice,
alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. Testarea sensibilitii lor fa de antibiotice
3. Obinerea unor produi de biosintez
(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni
steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,
etc), producerea vaccinurilor, eubioticelor...
Pentru cretere bacteriile au nevoie de
nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate.
Condiiile (principiile) de cultivare
- Surs nutritiv adecvat

- Surs de energie

- Ap

- Temperatura potrivit

- pH adecvat

- Concentraie optim a oxigenului i a CO2

- Presiune osmotic adecvat


Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime
de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu
temperatura optim deosebim:
1. Bacterii psichrofile t optim 10-20 C.
Cresc i la 0 C.
2. Bacterii mezofile optimum 30-37 C
(limite 15-45 C)
3. Bacterii termofile optimum 50-60 C
(pn la 95 C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C)
pH
1. Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele
patogene) pH 6-7,5
2. Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)
3. Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas,
Vibrio)
Presiunea osmotic
1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc
n concentraii reduse de NaCl (mediu
izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o
patogene
2. Bacterii halofile prefer concentraii mari de
NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio
parahaemolyticus)
Oxigenul
1. Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2
molecular. Obin energia prin respiraie aerob
2. Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse
de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie
sau fermentaie (Neisseria, Brucella,
Campylobacter)
3. Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O2.
Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie
anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2,, a
radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care
anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei,
superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium,
Bacteroides
4. Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n
prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed
peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)
5. Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii,
obin energia prin respiraie sau fermentaie
Mediile de cultur soluii sau substrate solide
care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice
necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea
sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul
culturilor bacteriene.
Cerinele fa de mediile de cultur
- S asigure necesitile nutritive i energetice ale
bacteriilor
- Umiditate optimal
- pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de
tampon)
- Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi -
rH2<5, aerobi rH2>10)
- S fie izotonice (0,5% NaCl)
- S fie sterile i transparente
CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR
Dup provenien
1. Empirice, naturale. Au la baz produse de
origine animal sau vegetal (snge, ser,
lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord,
creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia
lor chimic precis nu poate fi controlat
2. Sintetice includ ingrediente chimice pure,
compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate
3. Semisintetice
Dup consisten
1. Medii lichide (bulion) utilizate pentru
obinerea biomasei bacteriene i a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3%
agar-agar (polizaharid extras din alge roii,
t topire 80-100C, solidificare 42C).
Placa de geloz n cutii Petri este utilizat
pentru izolarea culturilor pure, geloza
nclinat (n pant) pentru acumularea
culturilor pure
3. Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se
utilizeaz pentru studierea activitii
biochimice sau a mobilitii bacteriilor.
Dup compoziia chimic (complexitate) i
destinaie
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Ap peptonat (ap + 1% pepton + 0,5%
NaCl)
2. Bulion peptonat BP (extract apos din carne
+ 1% pepton + 0,5% NaCl)
3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor
nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min
B. Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu
adaos de componente care permit creterea mi/o
exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-
snge streptococi, neisserii; ser coagulat
corinebacterii, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de
componente sau cu condiii fizico-chimice particulare
care stimuleaz creterea unor specii i inhib
creterea altor specii (geloza salin - stafilococi,
geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev -
Salmonella, Shigella, etc)
Mediile de mbogire reprezint medii selective
lichide, utilizate pentru mbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-
un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
Etap premergtoare nsmnrii pe medii
selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
pentru Salmonella
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de
briliant) Salmonella
- Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
- Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat)
pentru anaerobi
III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit
diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii
lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice,
de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem:
Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor zaharolitice
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Levine (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev / SS agar (geloz+lactoz+rou
neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe
Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) medii
cromogene
Studierea proprietilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella
(colonii negre reducerea sulfitului n sulfura
de Bi)
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de
K) pentru Corynebacterium diphtheriae
(colonii negre)
Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu
lecitinaz formeaz un halou opac n jurul
coloniei
Studierea proprietilor hemolitice
Geloza-snge (geloza+5-15% snge
defibrinat)
n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o
zon clar
Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure
i identificare preliminar
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la
modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n
galben.
n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n
coloan-glucoza (fermentare).
Producerea H2S nnegrirea mediului
Medii DD pentru identificarea final
a culturii pure
- irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir
de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite
glucide i indicator.
Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A)
i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)
- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i
indicatori
IV. Medii speciale pentru izolarea unor
anumite bacterii (Finn, Popescu,
Loewenstein-Jensen pentru agenii
tuberculozei, Sabouraud fungi)
V. Medii de transport destinate transportrii sau
stocrii unui material (prelevat), care va fi
examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, fr a favoriza
multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerin 30%

- Soluie tampon-fosfat

- Soluie NaCl 3%

- Mediul Cary-Blair

- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de


Na, albastru de metilen) pentru anaerobi,
neisserii, etc
Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic
de material ce conine bacterii (inoculum) se
ntroduce ntr-un mediu de cultur
(nsmnare, inoculare), care ulterior va fi
incubat n termostat (pentru asigurarea
temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile
cresc i se divid, formnd o cultur
bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate
prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore
Cultur pur format din bacterii de
aceeai specie (indispensabil identificrii)
Cultur mixt compus din bacterii de
specii diferite
Tulpin populaie microbian constituit
din descendenii unei singure izolri n
cultur pur, care va fi studiat ulterior.
Clon populaie care rezult din
multiplicarea unei singure celule
Manifestarea creterii i multiplicrii
bacteriilor
n mediu lichid

- Turbiditate uniform
- Formarea unei pelicule la suprafaa
mediului (vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment

la fundul tubului sau pe perei


(streptococi, Bacillus anthracis)
n mediu solid formarea coloniilor
Colonie o aglomerare de bacterii care
se dezvolt dintr-o singur celul sau
un grup de celule (UFC - Unitate
Formatoare de Colonii) pe suprafaa
unui mediu solid
Fiecare specie bacterian formeaz
colonii specifice (caracter util n
identificare)
Caracteristica coloniilor
Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-
2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) regulat/neted, ondulat, zimat,
lobat, dantelat, etc
Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat,
etc
Form circular, filamentoas, neregulat
Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc
Densitate opac, transparent, etc
Consisten cremoas, untoas, uscat,
mucoid
Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede,
lucioase
Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa
uscat, rugoas
Colonii M (mucoase) mari, bombate, lucioase,
caracteristice bacteriilor capsulate
Caracterele de cultur ale bacteriilor
reprezint exigenele nutritive (medii,
temperatur, pH, aerare, etc), timpul
apariiei culturii i manifestarea creterii
pe medii lichide i solide
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor


bacteriene se disting:
- Culturi discontinue/periodice

- Culturi continue

- Culturi sincrone

Culturile discontinue se obin la cultivarea


bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de
culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul
microbiologic
Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue
I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile
mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n
dimensiuni, dar nu se divid.
Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea
bacteriei, condiiile mediului, etc
II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu
vitez maximal constant, curba evolueaz
exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la
ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea
sensibilitii la antibiotice).
Durata 8-10 ore
III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic
scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant
mai multe ore.
Cauza consumarea nutrienilor, acumularea
metaboliilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata
10-12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor
progresiv
Cultura continu se realizeaz cnd mediul
de cultur este continuu rennoit i mbogit
cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de
cultur. Se realizeaz n chemostate sau
turbidostate, cultura aflndu-se permanent n
faza exponenial. Se utilizeaz n
microbiologia industrial.
n intestin culturi continue.
Culturi sincrone culturi n care bacteriile se
divid n acelai timp
EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Examenul bacteriologic const n inocularea
(nsmnarea) prelevatelor pe medii de
cultur pentru izolarea culturilor pure de
bacterii (tulpini) care vor fi ulterior identificate,
testate la sensibilitate vis-a-vis de antibiotice,
eventual conservate.
Examenul bacteriologic const din cteva
etape succesive, de la prelevarea (recoltarea)
probelor biologice pn la remiterea
rezultatelor.
Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului!!!)
Prescrierea investigaiei (n funcie de datele
examenului clinic i paraclinic). n ordonan se
fixeaz identitatea medicului, a pacientului,
scopul analizei, manifestrile patologice, data
apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu
antibiotice, graviditate, etc.
Prelevarea probelor
- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare,
locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale
agentului patogen) i momentul prelevrii
Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni:
- Secreii rino-faringiene, bronice

- Sput

- Puroi

- Exsudate, transsudate

- Snge

- LCR

- Urin, secreii genitale

- Mase fecale, bil, suc duodenal

- Bioptate, punctate

- Material cadaveric, etc


Materiale de examinat din mediul extern:
- Ap

- Alimente

- Sol

- Aer

- Lavaje

- Vectori, etc
- Modul de prelevare (recoltare)
- n recipiente sterile
- Respectnd regulile de autoprotecie
- La debutul bolii
- Pn la administrarea antibioticelor
- Cantitate suficient
Transportarea
- Imediat sau utiliznd medii de transport, cu
respectarea condiiilor speciale dup necesitate
- n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- n fia de nsoire s fie indicat identitatea
pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data,
ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU
CULTURILE AEROBE
- Prelevatul este supus examenului
macroscopic (modificarea aspectului, a
mirosului, etc) - orientare n diagnostic
- Dup necesitate, probele sunt supuse
pregtirii pentru investigaie (diluare,
omogenizare, centrifugare, etc)
- Examinarea microscopic (preparate
native, Gram, Ziehl-Neelsen, Loeffler...)
prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-.
I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE
Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-
un melanj de celule bacteriene sau dintr-un
produs patologic. O colonie separat
constituie o cultur pur.
Tehnici utilizate:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei
din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele,
nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv
pe trei cutii).
2. Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n
geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...),
apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.
Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie
de TG).
Metode speciale de izolare n culturi pure:
- A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a
prelevatului 80 C 20 min
- A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabil
cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar
cu o baz
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:
mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd
medii de mbogire
- A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la
cultivare: inocularea la animalele de laborator
sensibile
II etap ACUMULAREA CULTURII PURE
- Examinarea macroscopic a coloniilor crescute
(form, culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n
pant (nclinat) pentru acumularea culturii
pure
- Termostat, 37 C, 18-24 ore
III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE

- Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)


- Identificarea culturii pure const n evidenierea unor
caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o
familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultur
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice
STUDIEREA ACTIVITII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR
1. Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea
laptelui, etc)
2. Activitatea proteolitic
- Degradarea proteinelor native (lichefierea
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui, etc)
- Evidenierea enzimelor ce intervin n
degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele
finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol,
etc
Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de Fe
de culoare neagr n mediile multitest Kligler,
Olkeniki, etc; utilizarea benzilor de hrtie de filtru
mbibate cu acetat de Pb care se prind ntre dopul
eprubetei cu BP n care crete cultura studiat
(formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei
triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid
oxalic. n prezena indolului indicatorul vireaz n
roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol
se coloreaz n albastru.
Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)
(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat
apariia bulelor de gaz)

Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei


din lanul respirator)
Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau
rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% -
formarea unui halou opac n jurul coloniilor

Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n


jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)
Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n
jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h
Identificarea rapid
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde
(economie de timp, spaiu, material)
Sistemul API o galerie din plastic format
din numeroase alveole care conin fiecare
un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,
etc). Alveolele sunt inoculate cu o
suspensie bacterian testat i incubate.
Ulterior la necesitate se adaug reactive
pentru detectarea metaboliilor particulari.
Lectura peste 4-18h conform unui cod de
cifre sau computerizat
IV etap EVALUAREA
REZULTATELOR, FORMULAREA SI
ELIBERAREA RSPUNSULUI
- Compararea rezultatelor obinute cu
caracterele speciilor bacteriene
cunoscute pentru a gsi asemnri.
- Exemplu de rspuns: Din proba
examinat a fost izolat tulpina de
Corynebacterium diphtheriae, biovar
gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la
.....
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU
CULTURI ANAEROBE
(clostridiene, neclostridiene)
Condiia principal cultivare n absena
oxigenului
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi
regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu
vazelin; nsmnarea n geloz n coloan)
2. Crearea condiiilor de anaerobioz
- Metoda fizic utilizarea anaerostatului
- Metoda chimic n exicator se ntroduc
substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz);
utilizarea gas-pachetelor
- Metoda biologic Fortner cultivarea
concomitent a aerobilor i anaerobilor
Recoltarea cu precauie, evitnd contactul
cu aerul (n seringi, utiliznd medii
speciale)
I etap MBOGIREA ANAEROBILOR
- nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu
mediul Kitt-Tarrozzi regenerat
- nclzirea unui tub la 80 C, 20 min
distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc
multiplicarea anaerobilor)
II etap - IZOLAREA CULTURII PURE
DE ANAEROBI
- Studierea caracterelor de cultur tulburarea
mediului, descompunerea bucilor de ficat,
etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda
Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul
K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat
consecutiv). Incubarea n
anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h
- Metoda Weinberg diluii succesive ale
culturii n geloz glucozat lichefiat i
aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise
ermetic. Incubarea n termostat, 24 h
III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopic a coloniilor
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte
- Repicarea n mediul K-T regenerat pentru
acumularea culturii pure
- Incubarea n termostat, 24 h
IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII
PURE DE ANAEROBI
- Verificarea puritii culturii pure (frotiu
Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate
(cu respectarea condiiilor de
anaerobioz)

V etap - EVALUAREA REZULTATELOR,


FORMULAREA I ELIBERAREA
RSPUNSULUI
Sistemul VITEK 2 Compact are ca obiect de activitate identificarea
bacteriilor i a fungilor i testarea sensibilitii bacteriilor cu efecte
semnificative din punct de vedere clinic.
Sistemul include aparatul VITEK 2 Compact, un computer (o staie de
lucru) i o imprimant.

Este disponibil un sistem Advanced Expert System (Utilizare Clinic)


pentru asigurarea online a validrii sistematice a rezultatelor i a
interpretrii fenotipurilor rezistente identificate n cursul testelor de
sensibilitate.
Aparatul VITEK 2 Compact este un sistem
integrat care combin operaiile de inoculare a
cardului de testare, incubare a cardului de
testare i citire a rezultatelor.
ETAPELE:
1. Izolarea culturii pure

2. Pregatirea probelor (a suspensiei bacteriene)

3. Introducerea cardurilor de testare i a

eprubetelor cu probe n casetelor corespunztoare.


4. ncrcarea casetei n Staia de umplere
(umplerea celulelor cardurilor de testare).
5. Transferarea casetei n staia de ncrcare a casetei
6. Procesarea cardurilor de testare (citirea codului de bare,
sigilarea tubului de transfer, incubarea si citirea cardurilor de
testare)

VITEK 2 Compact realizeaz analizele de identificare i de


sensibilitate prin monitorizarea continu a creterii i a activitii
microorganismelor din interiorul celulelor din cardurile de testare.
Sistemele optice de transmisie utilizeaz lumina vizibil pentru
msurarea direct a creterii microorganismelor. Aceste sisteme
optice se bazeaz pe o citire iniial a luminii de la nivelul unei
celule nainte de nceperea unei creteri semnificative.
Determinrile transmisiei luminii la nivelul aceleiai celule la
fiecare 15 minute msoar creterea microorganismelor n
funcie de ct de mult este mpiedicat lumina s traverseze
celula.
7. Ejectarea cardului
Durata analizei 2 10 ore