Imunosenzori

Introducere
Calitatea vieţii este un interes general în toata lumea. Aceasta este guvernata de câțiva
factori cum ar fi controlul bolilor, dezvoltarea industriei farmaceutice, curățenia mediului
înconjurător sau consumul de alimente crescute in mod natural. Biosenzorii joaca un rol
important in creşterea calităţii vieţii, datorita noilor cercetări in aceste domenii. In general un
biosenzor este un dispozitiv analitic de identificare si dozare care este format dintr-un element
biologic de recunoaştere a analitului si de un traducător de semnal. Elementul biologic de
recunoaştere este cel responsabil de specificitatea metodei analitice, iar traducătorul de
semnal converteşte recunoaşterea biochimica intr-un semnal măsurabil, optic sau electric.
Datorita avansării in biologia moleculara si in imunochimie in construcţia
biosenzorilor se folosesc o gama foarte variata de elemente de biorecunoaștere. Cele mai
folosite dintre acestea sunt: enzime, anticorpi, peptide, ADN, celule întregi, sau anumiţi
receptori, fiecare dintre ei având avantajele si dezavantajele lor pentru detecţia analiților.
Proprietăţile de recunoaştere a acestor elemente dau biosenzorului specificitate si mare
sensibilitate in diferitele aplicaţii. In funcţie de tipul de element de recunoaştere pe care îl
folosesc, biosenzorii pot fi:
- biosenzori ce folosesc enzime
- biosenzori care folosesc celule
- imunosenzori etc.

Imunosenzori – principiu

Imunosenzorii sunt unii dintre cei mai avansaţi biosenzori deoarece folosesc reacţii
antigen-anticorp. Aceste reacţii sunt de o foarte mare specificitate, antigenul reacţionând doar
cu anticorpul său specific, asemenea unei chei care se potriveşte intr-un singur lacăt. Aceste
dispozitive se folosesc atât pentru identificarea analitului cat si pentru dozarea lui, cu ajutorul
unui traducător de semnal adecvat.
Un imunosenzor poate fi utilizat fie pentru identificarea si dozarea anticorpului, fie
pentru identificarea si dozarea antigenului. In general analitul se găseşte in soluţie iar
partenerul sau complementar va trebui sa fie fixat pe un electrod. Daca reacţia este pozitiva
înseamnă ca cei doi parteneri sunt cuplu antigen-anticorp. De aceea proprietăţile de la
suprafaţa electrodului, acolo unde a avut loc reacţia, se schimba datorita formarii
complexului antigen-anticorp si datorita creşterii stratului dielectric. Daca se măsoară o
anumita mărime fizica cum ar fi potenţialul, absorbanta, conductivitatea, indice de refracție se
va observa o diferenţa intre măsurătoarea făcuta in absenta analitului si cea făcuta in prezența
acestuia, fapt care demonstrează influenta reacţiei asupra acestor mărimi. S-a demonstrat
faptul ca diferenţa dintre cele doua măsurători se afla in strânsă legătură cu cantitatea de
analit. Aceest lucru determina capacitatea de dozare a imunosenzorilor. Relaţia dintre
diferenţa de semnal si concentraţia de analit poate sa fie liniara sau logaritmica, de direct sau
invers proporţionalitate, in funcţie de semnalul pe care îl măsuram.

Construcţia unui imunosenzor

Anticorpii sunt o familie de glicoproteine cunoscute sub numele de imunoglobuline,

(IgA, IgG, IgM, IgD si IgE) dintre care cea mai abundenta este IgG, aceasta fiind si cea mai
utilizata in imuno-analiza. Asa cum se vede din figura alaturata, IgG este o molecula in forma
de “Y” care are doua tipuri de lanturi polipeptidice. Greutatea moleculara a lantului mai scurt
este de aproximativ 25000 Da, iar a celui mai lung este de 50000 Da. In fiecare molecula de
IgG exista două lanțuri scurte si
doua lanturi lungi de polipeptide,
legate intre ele de punti
disulfurice.
Fiecare dintre cele 4
lanturi e divizat intr-o parte
constanta (C), care este aceeasi
pentru toate imunoglobulinele G,
si o parte variabila (V) care este
diferita in functie de anticorp.
Lanturile scurte au o singura parte
variabila (V1) si o singura parte
constanta (C1), iar cele lungi au 3
parti constante (Ch1, Ch2, Ch3) si
o singura parte variabila (Vh).
Intr-o alta ordine de idei,
IgG este constituită dintr-o parte
care conține situsul de legare
pentru antigen si o parte de care
antigenul nu se poate lega.

In ceea ce priveste reactia

antigen-anticorp, cea mai
importanta parte a anticorpului este partea care variaza deoarece in functie de aminoacizii care
se gasesc in această porțiune anticorpul se va lega de un anumit antigen, dând specificitate
reactiei. Este estimat ca pornind de la aceasta structura de baza a imunoglobulinei G se pot
forma 10 8 anticorpi specifici, si fiecare anticorp va recunoaste un singur antigen, deși uneori
sunt posibile si reactii incrucisate.
Afinitatea dintre antigen si anticorp este in general descrisa de o reactie de echilibru
pentru care se poate deduce constanta de achiliblu K:
[ Ac  Ag ]
K 
[ Ac ][ Ag ]
Pentru ca sa nu se formeze reactii incrucisate trebuie ca K  10 8 . Aceasta este si
conditia pentru ca reactia sa poata fi utilizata in dozarea cu ajutorul imunosenzorilor.
De asemenea, pentru ca reactia sa se poată desfășura pe suprafata electrodului
anticorpul trebuie sa fie imobilizat pe aceasta într-o poziție care să lase libere situsurile de
legare a antigenilor.
 Un imunosenzor este alcătuit in mod obligatoriu dintr-un electrod la suprafaţa căruia
se va desfăşura reacţia antigen-anticorp, dintr-un traducător de semnal, si dintr-un
amplificator de semnal.

R
E
C TRADUCTOR Semnal Circuit
E electric electronic
P (I, V) de
T (DISPOZITIV amplificare
O ELECTRONIC)
R

Substanţe
purtătoare de
diverşi liganţi
Schema unui imunosenzor

Pentru ca semnalul sa poată fi captat de către electrod, reactantul (anticorpul sau

antigenul) trebuie sa fie fixat de suprafaţă, acest detaliu fiind un factor foarte important in
construirea imunosenzorului.

Imobilizarea elementelor imunoactive

Din moment ce imunosezorii masoara de regula semnale rezultate din imunoreactii

specifice dintre analit si anticorpii sau antigenele imobilizate este evident ca procedurile de
imobilizare ale antigenelor sau anticorpilor pe suprafata transductorului reprezinta o etapa
importanta in constructia imunosenzorilor. Se folosesc numeroase proceduri pentru diversi
imunosenzori cum ar fi: adsorbtie electrostatica, captare, cross-linking, si legare covalenta.
Aceste metode se impart in metode bazare pe interactii non-covalent si metode bazate pe
interactii covalente.
În general, o imobilizare ideală ar trebui să aibă următoarele caracteristici:
- un număr suficient de antigeni sau anticorpi activi pe suprafața transductorului
- antigenii sau anticorpii imobilizați să fie stabili în timpul măsurătorilor
- procesul de imobilizare să nu aibă nici o influență asupra comportamentului de
detectare a transductorului și a abilității de recunoaștere
 Capacitatea de disociere a legăturii antigen-anticorp și regenerarea anticorpului cu un
cost redus este de interes practic în aplicațiile reale ale imunosenzorilor

Proceduri de imobilizare bazate pe interactii non-covalente

Acest tip de imobilizare a speciilor imunoactive se bazeaza pe interactii non-covalente
intre moleculele de anticorp sau antigen si substratul transductorului, si in general se refera la
interactii hidrofobe, interactii electrostatice, forte van der Waals si legaturi de hidrogen. Se
poate observa ca pe langa adsorbtii fizice sunt prezente si interactii chimice slabe. Interactiile
non-covalente pot varia in funcție de substratele transductorilor. Pentru substratele sensibile
nepolare moleculele de anticorp sau antigen pot fi adsobite prin interactii hidrofobe si forte
van der Waals in moment ce pentru substraturile polare se folosesc interactii de tip
electrostatic. Tehnica de autoasamblare strat-pe-strat de imobilizarea a biomoleculelor a atras
atenția în mod deosebit. O metoda de imobilizare a anticorpilor prin legaturi electrostatice
este imobilizarea pe o suprafata încarcata pozitiv, PPF (plasma-polymerized film) printr-un
strat cu mai mulți electroliții (polyelectrolyte-mediated). Imunosenzorii cu o astfel de
structura au o sensibilitate deoarece actiunea electrostatică nu perturbă activitatea
anticorpului. Suprafețele PPF pot fi regenerate in mod repetat prin schimbarea pH-ului
solutiilor tampon pentru a indeparta stratul de electroliți.
Antigenele sau anticorpii pot fi captați (entraped) fizic in filme de polimeri organici
sau materiale anorganice (with streo meshy structures). Dintre aceste tipuri de imobilizare,
imobilizarile sol-gel au atras in mod deosebit atentia datorita capacitatii lor de a incapsula
biomolecule la temperatura scazuta, (physical tenability), transparenta optica, rigiditate
mecanica si reactivitate chimica scazuta. Majoritatea metodelor de imobilizare sol-gel s-au
folosit in principal pentru imunosenzorii optici si cei electrochimici. Imobilizarile bazate pe
interactiile fizice mentionate mai sus se pot aplica simplu si rapid. Cu toate acestea,
stabilitatea imobilizarii poate fii influentata de suprafata metalului sau de factori externi
(temperatura, pH, forta ionica a solutiei) rezultand o pierdere a bioactivitatii si o denaturare a
proteinelor. In plus, elutia repetata a proteinelor adsorbite fizic poate aparea in timpul
dozarilor analitice care poate aduce o scadere a sensibilitatii si o scadere a reproductibilitatii.
In ultimii ani nanomaterialele (metale nobile, oxizi magnetici, nanoparticule de
carbon, nanotuburi) cu proprietati fizice si chimice unice au fost aplicate cu succes pentru a
modifica interfata imunosensibila, pentru a atinge o imobilizarea a antigenelor si anticorpilor
mult imbunatatita. Unele cercetari arata ca includerea unui strat de nanoparticule de aur pe
electrod ar duce la o crestere substantiala a suprafetei disponibile pentru adsorbtia directa a
entitatilor biologice oferind astfel o creștere semnificativă a sensibilitatii analitice.
Nanoparticulele magnetice au fost de asemenea obiect de studiu pentru a imobiliza anticorpii.
Comparativ cu metodele traditionale de imobilizare, imobilizarile pe baza de magnetism
prezinta avatajul de a fi usor de manipulat, cost redus si regenerare multiplă.

Proceduri de imobilizare bazate pe legături covalente

Procedurile de imobilizare bazate pe interacțiuni covalente, prin metode tipice de
(cross-linking), sunt cele mai populare metode de imobilizare pentru fabricarea diverselor
tipuri de imunosenzori. Din cauza lipsei de situri active de legare a anumitor materiale
utilizate la confecționarea transductorilor (ex. metale, semiconductori sau fibre optice) în
general este necesară învelirea transductorului de bază cu un filme subțiri pentru a lega
covalent anticorpi sau antigene, utilizând reactivi funcționali cum sunt glutaraldehida,
carbodiimidat de succinimidă, maleinimidă și periodat. Multe materiale tradiționale de învelit,
ca polietilenimina, (γ-aminopropil) trimetoxisilan și copolimeri ai hidroxietil- și metil-
matacrilat, sunt adesea folosiți ca straturi intermediare pentru imobilizarea moleculei
imunoactive. În ultimele decenii, totuși, au fost introduse noi tehnici de învelire sau
funcționalizare a filmelor în acest domeniu. Self-assembled monolayers (SAMs) oferă filme
funcționale promițătoare pentru imobilizarea antigenilor sau anticorpilor. Atomii de sulf
puternic coordinați sau substratele de metale nobile (Au, Ag, Pt), numeroase molecule de
învelire ca disulfuri (R-S-S-R), sulfuri (R-S-R) și tioli pot forma variate SAMs funcționale de
construcție foarte compactă și organizată. Aplicațiile tehnicilor SAM în imobilizarea
biomoleculelor au fost mult studiate. Amestecuri de SAMs, compuse din lanțuri lungi de tioli
cu grupe carboxilice și hidroxilice sunt de asemenea utilizate pentru a menține o interfață cu
afinitate specifică și stabilă a imunosenzorilor.
Filmele Langmuir-Blodgett (LB) sunt o altă alternativă folositoare pentru straturile de
mediere tradiționale. Filmele LB, care sunt de obicei preparate prin transferarea monostratului
pe un substrat solid, au un mare potențial, ajutând la controlul orientării și densității
anticorpilor. În plus, în ultimii ani s-a asistat la apariția de filme polimerice ultra-subțiri,
plasma-polymerized film (PPF), care au fost folosite cu succes în diferite modele de
imunosenzori. PPFs, care sunt în general preparate prin utilizarea de descărcare lumioasă și
plasmă de vapori organici (glow discharge or plasma of organic vapors) sunt extrem de
subțiri, omogene și stabile din punct de vedere mecanic și chimic, cu aderare puternică de
substrat. Aceste tipuri de filme funcționale pot oferi o alternativă promițătoare în design-ul
interfeței imunosenzorilor cu diferiți transductori. În ultimii ani, s-au descoperit a fi
folositoare diferite nanomateriale, în combinație cu procedurile de imobilizare bazate pe
legături covalente pentru imunosenzori. Nanotuburile de carbon (CNTs), de exemplu au fost
recunoscute ca fiind esența materialelor de mărimi de ordinul nanometrilor încă de la
descoperirea lor în 1991. Aceste nanotuburi sunt acum funcționale chimic pentru imobilizarea
entităților biologice pentru diferiți biosenzori.
Procedurile bazate pe interacțiuni covalente permit de obicei ca proteinele imunoactive
să fie imobilizate cu o mare stabilitate și pot favoriza detecția mai redusă a zgomotului de
fond. Totusi, marea problemă a acestor imobilizări prin legături covalente este scăderea
capacității de legare a anticorpilor (antigenelor). Acest fenomen este datorat pierderii
anumitor situri imunoactive și orientării aleatorii a moleculelor de anticorpi legate pe
suprafața transductorului. Mai mult, (cross-linking) poate produce o matrice tri-dimensională
pluristratificată care crează bariere de difuziune și transport ceea ce va duce la un timp lung
de reacție și la o sensibilitate redusă. Este de înțeles că imobilizarea orientată a anticorpilor
are o mai mică influență asupra activității lor imunologice si aceasta a fost demonstrată ca
fiind de 2-8 ori mai mare decât a anticorpilor imobilizați aleatoriu. Prin urmare, s-a acordat un
interes deosebit dezvoltării de tehnici de imobilizare cu orientare controlată pentru anticorpi,
adesea prin intermediul proteinelor A sau G care leagă specific anticorpii astfel încât situsurile
de legare rămân libere.
În plus, în ultimii ani, s-a dezvoltat o altă metodologie de imobilizare a anticorpilor
prin intermediul grupărilor tiol (-SH) native, care sunt eliberate după despicarea moleculei
intacte de IgG în două fragmente de anticorpi. S-a observat că imobilizarea anticorpilor prin
această procedură a arătat o capacitate de legare de 20-30 de ori mai mare decât absorbția
nespecifică a anticorpilor intacți, folosită în mod tradițional.

Metode imunologice
Metodele imunologice se clasifică în: omogene și heterogene. În cele heterogene
anticorpul sau antigenul este imobilizat pe suportul transductorului si interactiunea cu un
analit care are loc la suprafață este monitorizată de un senzor de răspuns. În cazul celor
omogene, reacția biochimică are loc doar în soluție.
Metodele imunologice sunt clasificate în continuare în funcție de metodologia de
detecție aleasă, lucru care depinde de natura analitului, proba de analizat, sensibilitatea
instrumentului analitic sau a aplicatiei dorite. Cel mai des se folosește detecția directă, metoda
sandwich, metoda prin înlocuire și metoda indirectă competitivă.

Metoda directă:
În metoda directă anticorpii sunt imobilizați pe suprafața senzorului și puși să
reacționeze cu analitul de interes. Legătura formată între antigen si anticorp va determina o
schimbare a proprietății măsurate în funcție de concentrația analitului dozat. Chiar dacă este
ușor de aplicat, această metodă poate fi folosită doar în dozarea moleculelor mari cu o
greutate moleculară mai mare de 10 kDa deoarece moleculele mici au o masă prea mică
pentru a determina o schimbare detectabilă.

Metoda sandwich:
Metoda sandwich constă în doi pași de recunoaștere. In prima etapă anticorpul
imobilizat pe suprafața transductorului este pus să reacționeze cu analitul. În etapa a doua, un
al doilea anticorp este adăugat pe suprafața senzorului pentru a se lega cu analitul capturat
anterior. Cele două etape măresc sensibilitatea si specificitatea imunosenzorului. Cel mai
important aspect în această metodă este că analitul trebuie să se lege de doi anticorpi simultan.
Prin urmare, poate fi folosită pentru detecția moleculelor mari (mai mari de 5000 Da) care au
mai mulți epitopi1 cum ar fi proteine, bacterii sau virusuri.
Cu toate acestea, marcarea celui de-al doilea anticorp este preferată în cele mai multe
cazuri si prin urmare utilizează și metode chemiluminiscente si fluorescente de detecție. Ar
trebui menționat că moleculele mici sau moleculele cu epitopi cu formă asemănătoare sunt în
general greu de dozat prin această metodă.

Metoda prin înlocuire

Metoda prin înlocuire este în general utilizată cu anticorpi sau antigene marcate. În
această metodă este introdus analit marcat în exces marcat în exces peste un anticorp
imobilizat pe suprafață pentru a ocupa toate siturile de legare ale anticorpului. După
adăugarea analitului nemarcat, acesta va înlocui analitul marcat și se va măsura concentratia
de analit prin metode chemiluminiscente sau fluorescente.

Metoda indirectă competitivă

Datorită dificultăților asociate cu
toate metodele descrise anterior în detecția si
cuantificarea moleculelor cu greutate mică
s-au căutat noi metode de dozare. În ciuda
introducerii de noi metode care folosesc
mecanisme de traducere fără markeri, cum
sunt QCM sau imunosenzorii SPR,
imunosenzorii fabricați au fost capabili să
detecteze doar molecule cu greutate
moleculară mare, cum ar fi proteine si
microorganisme. În 1992, o metodă simplă
pentru detecția metanphetaminei din urină a
fost pusă la punct pe baza principiului
metodei indirecte competitive.
O simplă schemă a principiului este
dată în figura alăturată. Principiul se bazează
1
Epitop = regiune din antigen care determină sinteza anticorpilor de un singur tip (monoclonali). Epitopul se
combină cu paratopul, regiune de pe suprafața anticorpului.
pe imobilizarea de molecule cu greutate moleculară mică (antigeni) pe suprafața senzorului.
Aceasta se face în general prin utilizarea unui complex analit – proteina carrier. Analitul este
apoi amestecat cu anticorpul corespunzător si introdus peste analitul imobilizat pe suprafața
transductorului. Concentrația anticorpului este păstrată constantă pentru ca variația
răspunsului să fie proporțională cu cantitatea de analit amestecată cu anticorpul. O modificare
a semnalului apare atunci când complexul antigenul – proteină imobilizat se leagă cu
anticorpul. Totuși, cand amestecul echilibrat al anticorpului cu analitul ajunge pe suprafața
transductorului, doar anticorpul liber din amestec se poate lega de antigenul imobilizat si va
determina o modificare observabilă. Astfel, răspunsul măsurat este invers proporțional cu
cantitatea de analit din soluție.
Această metodă este una promițătoare pentru detecția moleculelor cu masă moleculară
mică.

Clasificarea imunosenzorilor
Popularitatea imunosenzorilor a crescut remarcabil in ultimele doua decenii datorita
limitelor de detectie foarte joase si datorita marii selectivitati pentru unii analiti in matrici
complexe cu ajutorul unor dispozitive si metode relativ simple. Se considera ca un
imunosenzor ideal ar trebui fie capabil sa identifice si sa dozeze anticorpul sau antigenul din
matrici complexe, sa fie capabil sa detecteze legatura formata fara adaugare de alti reactanti si
sa permită măsurători repetate.
In functie de traducatorul de semnal imunosenzorii se pot clasfica in:
Imunosenzori piezoelectrici
Imunosenzori electrochimici
Imunosenzori optici.
La imunosenzorii piezoelectrici traducatorul de semnal intra in rezonanta cu un câmp
electric alternativ exterior, iar variatia de masa care apare datorita reactiei antigen-anticorp
duce la o schimbare a frecventei de oscilatie a undei electromagnetice, fapt care este corelat
cu concentratia analitului.
 Imunosenzorii electrochimici se impart in mai multe categorii in functie de semnalul
masurat. Ei pot fi potentiometrici, amperometrici, conducometrici, impedimetrici, voltametrici
etc. Imunosenzorii potentiometrici se bazeaza pe masurarea unei diferente de potential indus
de reactia antigen-anticorp de pe suprafata senzorului, iar la cei amperometrici este masurat
curentul generat de speciile electroactive care fie se oxideaza, fie se reduc la un potential fix.
Imunosenzorii conductometrici se bazeaza pe o descrestere a conductivității intre o pereche de
electrozi de platina datorita reactiei de la suprafata electrodului. Imunosenzorii impedimetrici
se bazează pe faptul că grosimea si proprietatile dielectrice ale suprafetei electrodului
contribuie la impedanța sistemului.
Imunosenzorii optici se considera a fi una dintre cele mai promitatoare alternative ale
imunosenzorilor treditionali atat in diagnostice clinice cat si in analize ale mediului. In ultimii
ani s-a apelat din ce in ce mai mult la aceste dispozitive datorita numeroaselor avantaje ale
acestora: utilizarea radiatiei vizibile, rapiditatea metodei, dar si faptul ca este o metoda
nedistructiva. Ei se bazeaza pe masurarea radiatiei absorbite sau emise de catre imuno-
reactanti. Interactiunea dintre lumina si imunoreactanti poate fi masurata ca si o diferenta in
absorbanta, luminescenta, polarizatie, sau unghi de refractie.

Imunosenzori optici

Masurarea radiatiei electromagnetice absorbita sau emisa fie de reactanti fie de

produsii unui sistem biologic a devenit extrem de populară in design-ul imunosenzorilor, acest
grup fiind cel mai mare si probabil cel mai promitator grup de transductori. Transductorii
optici pot fi construiti sa raspunda la radiatii din domeniul ultraviolet sau vizibil sau sa
raspunda la producerea de bio- si chemoluminescenta si pot fi adaptati pentru dispozitivele ce
functioneaza pe baza de fibra optica. Primele sisteme optice erau bazate pe spectrofotometrie,
enzime imobilizate pe o coloana si masurarea absorbantei produsului. Mai tarziu enzimele
erau imobilizate pe spirale de nylon si sistemul era legat de (flow-injection) sau (bubble
analyzers). In efortul de a reduce marimea dispozitivelor s-a introdus tehnologia fibrelor
optice; faza reactiva era imobilizata pe o singura fibra optica sau pe un mănunchi de astfel de
fibre, in acest fel modificarile proprietatilor optice ale fazei reactive corespunzatoare
analitului puteau fi monitorizate. Aceste dispozitive, cunoscute acum sub numele de optrode
sunt folosite la scara larga si ofera cateva avantaje suplimentare fata de electrozi. Mai mult,
fibrele optice pot fi folosite in domenii variate cum ar fii aplicatiile clinice, monitorizari in
vivo, si determinari de materiale periculoase.
Transductorii optici pot fi folositi pentru detectie cu sau fara markeri, adica sunt
senzori care folosesc reactivi marcati pentru detectie, de exemplu o enzima care sa produca
semnalul care urmeaza sa fie detectat. Acest proces are nevoie de o aparatura sofisticata
datorita luminii detectate la nivele foarte joase. Senzorii optici directi, care nu implica
utilizarea markerilor, constituie o proportie substantiala a imunosenzorilor disponibili. Acestia
includ (attenuated total internal reflection), elipsometrie, rezonanta plasmonică de suprafată si
(monode dielectric waveguides). In alte cazuri markerii au fost incorporati in imunosenzori
pentru a le creste sensibilitatea.

Detectie optica cu ajutorul markeri-lor.

O enzima poate fi folosita ca si un marker pentru a genera o serie de produsi care

absorb lumina sau genereaza fluorescenta sau luminescenta, ultimele avand o sensibilitate
avansata. Biosenzorii au fost construiti sa monitorizeze fluorescenta, bioluminescenta (lumina
emisa intr-o reactie biologica) sau chemoluminescenta (lumina emisa intr-o reactie chimica).
Spre deosebire de alti biosenzori optici in acest caz nu este nevoie de o sursa de lumina fapt
ce simplifica mult constructia instrumentului. Senzorii bioluminescenti de fibra optica au fost
dezvoltati prin imobilizarea luciferazei pe o fibra optica pentru a detecta ATP si NAD(P)H.
Intre sistemele chemoluminescente se gaseste si sistemul luminol – peroxid care s-a aplicat la
numeroase reactii ale oxidazelor care implica producerea de peroxid de hidrogen.
Chemoluminescenta adaptata pentru imunosenzorii cu fibra optica a facilitat determinarea a
numerosi antigeni de exemplu estradiolul, α2 –interferon, hCG, IgG si antigene pentru virusul
gripal. Problemele asociate cu senzorii de luminescenta includ regenerarea reactivilor: pentru
ca oxidarea ireversibila a substratului sa aiba loc, compusul luminescent trebuie sa fie in
exces. Acest lucru se poate realiza prin imobilizarea enzimei pe fibra optica si adaugarea de
coreactanti cu eliberare lenta. Asa cum a fost descris anterior, senzorii cu fibra optica nu au
nevoie de volume mari pentru a sustine o operatie in timp, din aceasta cauza dimensiunile lor
pot fi minimizate.

Senzori optici directi

Dezvoltarea tehnicilor optice pentru monitorizare directa a modificarilor minuscule in

absorbtia, fluorescenta sau a indicelui de refractie la suprafata unui senzor este o arie extrem
de promitatoare in tehnologia imunosenzorilor. Transductorii optici bazati pe reflexie,
elipsometrie, SPR si (waveguides) au fost descrisi pentru acest scop. In aceste sisteme lumina
care intra in dispozitiv este directionata spre suprafata sensibila si apoi reflectata inapoi in
afara. Lumina care iese din dispozitiv este apoi monitorizata pentru a determina informatii
legate de evenimentele fizice aparute la suprafata sensibila a senzorului.
Principiile care se aplica acestor senzori optici directi sunt derivate din (internal
reflectance spectroscopy) care a fost decoperita la sfarsitul anilor 60 inceputul anilor 70.
Acest dispozitiv consta in doua materiale cu indice de refractie diferit: un strat cu indice de
refractie mare care adesea este reprezentat de o prisma de sticla, si un strat cu indice de
refractie mai scazut care contine proba. Un fascicol luminos este directionat prin stratul cu
indice de refractie mai ridicat spre suprafata de separare a celor doua medii. Cand unghiul
razei incidente depaseste unghiul critic, lumina este reflectata in totalitate inapoi in interiorul
aparatului. In materialul cu indice de refractie mai scazut, se genereaza un camp
electromagnetic de inalta frecventa cunoscut ca si unda (evanescent). Acesta unda avaseaza
de-a lungul axei x in planul de incidenta si intra in mediu probei (adica de-a lungul axei y) pe
o distanta scurta (aproximativ o lungime de unda) cu o descrestere exponentiala a
amplitudinii. Biomoleculele prezente in proba care au fost adsorbite la suprafata sau se gasesc
in contact cu suprafata senzorului interactioneaza cu unda (evanescent) si cauzeaza o reducere
a intensitatii razei reflectate. Aceasta descrestere distinctiva a intensitatii luminii denota deci o
schimbare in indicele de refractie de la suprafata senzorului si este in relatie directa cu masa
(si concentratia) biomoleculelor adsorbite din proba. Ca o alternativa la masurarea intensitatii
luminii, interactiunea optica poate fi monitorizata si ca o schimbare de faza a luminii
polarizate care se intoarce de pe stratul sensibil. Aceasta proprietate a fost aplicata cu succes
in cativa (waveguide sensors).
Senzorii optici directi prezinta un avantaj major fata de tehnicile indirecte reprezentat
de instrumentatia mai putin sofisticata insa s-au intalnit probleme de legare nespecifica si
sensibilitate scazuta la molecule mici. Din aceasta cauza in unele cazuri s-au combinat cele
mai bune calitati ale acestor doua tehnici pentru a imbunatatii sensibilitatea de exemplu
folosirea SPR cu markeri fluorescenti si particule de latex.

Fluorescenta.
 Fenomenul de monitorizare a reactiilor ce apar la interfata dintre doua straturi cu
indice de refractie diferit a fost adaptat pentru analiza fluorescentei. Un exemplu de astfel de
tehnica este fluorescenta de reflexie interna folosita pentru a masura caracteristiciile de
fluorescenta a unui compus de interes. In fluorescenta de reflexie interna totala raza incidenta
excita moleculele din apropierea suprafetei senzorului care mai departe produc o unda
(evanescent) fluorescenta. Aceasta reintra (into the waveguide) si flourescenta rezultata este
detectata. Imunosenzorii care monitorizeaza fluorescenta au fost dezvoltati sa detecteze
lumina emisa de un anticorp marcat fluorescent legat de antigenul de interes la suprafata
dispozitivului.
Un alt exemplu de imunosenzor de fluorescenta este dispozitivul de fluorescenta
capilara (fluorescence capillary fill device), (a planar evenescent system). In FCFD doua placi
de sticla paralele sunt amplasate de 0.1 mm distanta. Toti reactivii necesari testului sunt
continuti in dispozitiv-fie legati covalent de placa inferioara, care functioneaza ca si (an
optical waveguide), fie dozati pe placa superioara in asa maniera incat sa se dizolve in
prezenta probei. Deoarece intra intre cele doua placi prin capilaritate, volumul probei este
controlat de dimensiunile dispozitivului. Lumina provenita de la sursa este focusata pe placa
inferioara. Antigenii din proba concureaza cu antigenii marcati fluorescent pentru a se lega de
anticorpii imobilizati pe placa de jos. Lumina directionata (into the waveguide) genereaza o
unda (evenescent) la suprafata sensibila si fluoroforul devine excitat. Cand unda paraseste
(the waveguide) lumina trece printr-o fanta si ajunge pe un fotodetector care monitorizeaza
intensitatea luminii emise de antigenul marcat fluorescent. Fanta functioneaza in asa fel incat
sa nu lase sa treaca lumina provenita de la antigenii marcati fluorecscent nelegati, aceasta
lumina avand alt unghi, astfel la fotodetector ajunge doar lumina de la antigenii legati de
anticorpi. Culoarul ingust dintre cele doua placi permite realizarea testelor in timp scurt
doarece rectivii trebuie sa difuzeze pe o distanta mica. Din aceasta cauza durata testelor
depinde doar de cinetica legarii antigenului de anticorp si nu si de timpul de difuzie. De
exemplu un test pentru estron-3-glucuronida in urina a atins echilibrul in 5 minute de la
adaugarea probei. Rezultate incurajatoare s-au obtinut prin FCFD si pentru masuratori ale
anticorpilor antirubeola din ser cu o sensibilitate de 4.5 x 10-11 .
Avantajele unei operatii simple, fara a fi necesara masurarea volumului introdus,
intrumentar cu cost scazut si reactivii cu o durabilitate de 6 luni chiar si la 45 o C,
demonstreaza ca FCFD are mult potiential ca un imunosenzor comercial.

Reflectanta

Reflexia totala atenuata este o forma de spectroscopie de reflexie interna (IRS) in care
energia luminoasa absorbita de la o unda (evenescent) este monitorizata ca si o atenuare a
razei de lumina interne reflectate. Un film absorbant optic se gaseste la sprafata unui senzor
IRS , rezultand o structura cunoscuta sub numele de configuratia Kretschmann. Lumina
incidenta directionata spre spre suprafata superioara este absorbita de acest film, si intesitatea
luminii atenuate este masurata in functie de lungimea de unda incidenta. Aceasta tehnica a
fost aplicata pentru monitorizarea interactiilor biologice in infrarosu, visibil si ultraviolet.
Reflexia totala atenuata a fost aplicata studiului interactiilor antigen-anticorp.

Elipsometrie

În elipsometrie, este monitorizată schimbarea de stare a luminii polarizate cauzată de

reflexia dintr-o structură planară stratificată. Această metodă nu a generat un interes deosebit
timp de mulți ani de la prima observare, iar miniaturizarea si fabricarea ieftină s-a crezut a nu
fi realizabilă pentru această tehnologie. Totuși, elipsometria a devenit mai populară în special
pentru studiul legării proteinelor de suprafață. Odată reflectată de pe suprafața, lumina
polarizată poate da două tipuri de informații: acestea sunt converite în schimbări de
amplitudine și respectiv în schimbări de fază a luminii. Aceste proprietăți sunt modificate
când molecula este absorbită pe suprafață și pot fi datorate modificării unghiului de reflexie
sau a grosimii stratului, de unde poate fi calculată concentrația analitului legat. Un exemplu
este elipsometrul Isoscope (Sagax Instruments) care a fost folosit pentru studiul reacției
receptor-ligand. Ca imunosenzor, a fost folosit cu succes în determinarea interferonului
gamma și a albuminelor din serul uman și pentru investigarea activității imunoglobulinelor
imobilizate pe suprafețe solide.

Rezonanța plasmonică de suprafață

Fenomenul de rezonanță
plasmonică de suprafață a fost prima
dată observat în 1902 și este acum bine
documentat. Aranjamentul optic pentru
SPR are configurația Kretschmann.
Aceasta diferă de cea descrisă pentru
IRS prin încorporarea unui strat adițional
– un film subțire de metal – între prismă
și probă. Filmul de metal caracteristic
pentru SPR este de obicei constituit din
aur sau argint. Liganzii specifici pot fi
imobilizați pe suprafața superioară a
dispozitivului (senzorului) pentru a
interacționa direct cu biomoleculele din
probă. Tehnologia SPR se bazează pe
excitarea suprafetei plasmonice prezente
în filmul de metal al senzorului.
Plasmonii de suprafață sunt electroni de
la suprafața unui metal (precum aur sau
argint) care se comportă diferit decât cei
din interiorul metalului. Acest fenomen
poate fi asemănat cu cel de tensiune
superficială, în care legăturile dintre
moleulele de la suprafața unui lichid
diferă de cele dintre moleculele din
interiorul soluției. Dintre cele două tipuri
de plasmoni existenți – radiativi si non-radiativi – cei din urmă sunt cel mai adesea folosiți
pentru aplicațiile biosenzorilor. Plasmonii non-radiativi sunt excitați de lumina direcționată
către filmul de metal printr-o prismă de sticlă. Când sunt excitați, plasmonii de suprafață, care
oscilează la o frecvență diferită decât a celor din interiorul filmului de metal, absorb o parte
din energia undei de lumină pentru a genera o undă evanescentă. Această undă penetrează
stratul de proba cu o aplitudine care descrește exponențial – condiție cunoscută ca SPR.
În sistemul SPR, lumina polarizată este direcționată într-un singur plan prin prismă,
care are un indice de refractie mai mare decât a stratului de metal. Când unghiul de reflexie a
luminii este mai mare sau egal cu unghiul critic lumina este total reflectată înapoi în interiorul
prismei. La unghiul de rezonanță (θ), SPR este inițiat; absorbția energiei luminii de către
suprafața de plasmoni în timpul rezonanței cauzează o descreștere bruscă a intensității luminii
reflectate, care este monitorizată pe parcursul intercațiunii biomoleculare.
 Unda evansecentă nu se propagă paralel cu interfața prismei în SPR, dar e
redirecționată în sus în stratul de metal. Aceasta permite sesizarea suprafeței metal-probă
(suprafața senzorului). Unghiul de rezonanță este determinat de lungimea de undă și de starea
de polarizarea a undei incidente, precum și indicele de refracție al prismei, metalului si
stratului de probă al sistemului. Când toți ceilalți factori sunt menținuți constanți, unghiul de
rezonanță măsoară indicele de refractie de la suprafața sistemului SPR. Astfel, modificările
unghiului de rezonanță au loc când biomoleculele se atașează de liganzii specifici de la
suprafața senzorului și modifică unghiul astfel încât are loc scăderea bruscă a intensității
luminii. Monitorizarea continuă a intensității luminii reflectate și a unghiului de reflexie
determină un profil direct al modificărilor indicelui de refractie de la suprafața senzorului și se
poate urmării analiza în timp real a formării legăturilor implicate în reacție.
Raporturi privind aplicarea fenomenului SPR în domeniul biosenzorilor au demonstrat
că o scară largă de molecule pot fi analizate în această manieră, de la peptide mici la analiți
mai mari precum si particule de viruși și anticorpi. SPR a fost comercializat ca un biosenzor
cunoscut ca BIAcore (Biosensor, Uppsala, Suedia), care este capabil să analizeze interacții
biologice în timp real fără utilizarea unui marker; folosirea unui software integrat care să
faciliteze evaluarea cinetică a reacției a făcut această tehnică utilă în multe arii cum ar fi
ingienria biomoleculară, design-ul de medicamente, și caracterizarea monoclonală a
anticorpilor.
O noua descoperire în cadrul imunsosenzorilor SPR a fost introducerea de markeri
pentru a mări sensibilitatea. Combinarea marcarii fluorescente cu SPR pentru a produce teste
SPR fluoroimunologice a fost utilizată cu succes pentru testarea hCG din ser. Particulele de
latex au fost utilizate pentru a spori sensibilitatea unui test pentru detecția antigenilor, test
cunoscut ca Enhance Surface Plasmon Resonance Inhibition Test (ESPRIT). Acest test
consistă din doi pași, un pas de inhibiție și un pas de sporire. În pasul de inhibiție, anticorpul
este amestecat cu un antigen liber de concentrație necunoscută la suprafața senzorului SPR de
care a fost imobilizat deja un antigen. Antigenul liber impiedică legarea anticorpului de
suprafața cu antigene ale senzorului, și creșterea concentrației de antigen liber va reduce
proporțional semnalul SPR. În cel de-al doilea pas, sunt introduse particule de latex filmate cu
antigen; acestea se leagă de anticorpii de la suprafața senzorului și astfel determină sporirea
semnalului SPR. În acest fel, detecția antigenilor este independentă de masa moleculară, ceea
ce sporește posibilitatea sesizării moleculelor cu masă moleculară mică (<5 kDa) în
concentrații mici.

Ghiduri de undă (waveguides)

 Există o mare similitudine între waveguides și sistemele SPR; în ambele cazuri, este
generată o unda de evanescență la suprafața dispozitivului. În SPR, plasmoni de la suprafața
stratului de metal devine excitată; în waveguides, unda de lumină însăși este excitată într-un
strat dielectric. Fenomenul de dielectricitate (the phenomenon of dielectrics), care a fost mult
utilizat în design-ul de imunosenzori, este descris în altă parte. Waveguides consistă dintr-un
film dielectric cu un indice de reflexie mare situat între două materiale dielectrice cu un indice
de reflexie mai mic. Alegerea materialelor este importantă; de obicei se folosește sticlă,
silicon, polimeri, III-IV compounds, și litium niobate, carea au RI diferite și proprietăți optice
diferite. Miniaturizarea acestor senzori i-a făcut extrem de populari pentru integrarea în
biosenzori, fenomen cunoscut drept integrated optics (IO). Exemple de sisteme waveguide
adaptate pentru biosenzori IO șunt fibrele optice, interferometrii, grating couplers și de curând
dispozitivele IAsys (Fision Applied Sensor Technology, Cambridge, UK)

Fiber-optic waveguides

Waveguides pot fi
construite sub formă de
fibre: miez cu RI mare,
cilindric din sticlă, quarț sau
polimer placat cu un material
cu RI mai mic. Lumina este
direcționată către (the tip of
the fibre) și se produce o
reflexie totală la contactul
dintre miez și mediul probei,
generând o undă
evanescentă. Legarea sau
absorbția are loc între
biomoleculele imobilizate și
analitul din probă în raza
câmpului evanescent din
partea neplacată a fibrei.
Această reacție poate fi
monitorizată măsurând
semnalul luminii reflactate
odată ce se întoarce din
regiunea neplacată a fibrei în
regiunea placată. Fibre-optic
waveguide a fost dezvoltat
cu succes pentru imunosenzori și măsurători colorimetrice. Imunosenzorii bazați pe fibre
optice s-au dovedit a fi utili n special pentru analize de mediu și probe clinice care conțin
materiale periculoase; fibra lungă poate fi inserată în containere închise, prevenind astfel
contaminarea operatorului sau a componentului optic.
Un exemplu de astfel de dispozitiv este un imunosenzor creat pentru detecția toxinei A
de Clostridium botuluinum. Fiind proiectat ca un imunotest de tip sandwich, această tehnică
implică legarea covalentă a anticorpului de o fibră optică conică; când aceasta este adusă în
contact cu amestecul de reacție conținând proba și un amestec de anticorpi marcați cu
rodamină, unda evanescentă a probei de fibră optică (conectată de un laser cu argon) excită
molecula fluorescentă cuplată de anticorpul imobilizat în prezența toxinei dar are o influență
minimă asupra fluorescenței din miezul maestecului de reacție.

Interferometrul
Interferometrele pot fi folosite pentru măsuraea indicelui de reflacție (RI), a deplasării sau a
platitudinii suprafeței și a fost adaptat cu succes pentru biosenzori IO peantru a efectua
analize ale fenomenelor de legare a biomoleculelor fără utilizare de marker. Un exemplu este
interferometrul Fabry-Pérot, un singur (monomode channel waveguide) în acest sistem,
lumina intră în dispozitiv cu un anumit unghi și este reflectată înainte și înapoi (prin reflexie
totală internă) de mai multe ori între două oglinzi situate în fiecare capăt; de fiecare dată când
lumina este reflectată, o parte iese din interferometru. Razele de lumină care apar înterferă
una cu alta și formează un model de undă caracteristic.
Unele interferometre, cum este
interferometrul Mach-Zehnder, împart
raza emergentă în două unde parțiale:
câmpurile magnetice electrice(TE și
respectiv TM) ale unei singure unde de
lumină polarizată. În acest
interferometru, cele două componente
sunt reflectate între oglinzi diferite din
interiorul dispozitivului. Una interferă cu
proba și suferă o schimbare de fază astfel
încât, când cele două polarizări sunt
recombinate la ieșire, modelul de
interferență se modifică.
Interferometrul de diferențiere
este bazat pe two-mode interferometric
thin-film waveguide, similar cu modelul
Mach-Zehnder. Acesta are aplicații ca un
imunosenzor direct pentru studierea
interacțiunilor dintre biomolecule, așa
cum este reacția antigen-anticorp, cu o
limită de detecție de 2  10 13 mol / L
pentru antigenul de suprafață al hepatitei
B din ser. Componenta moleculară de recunoaștere (ligandul) este imobilizat pe suprafașa
senzorului, și o undă laser polarizată este direcționată prin capătul waveguide, astfel excitând
polarizările TE și TM. Un câmp evanescent este pus la punct printr-un film subțire dintr-un
material (waveguiding) (cu un RI mare) la suprafața senzorului; pe măsură ce câmpul se
propagă peste suprafața senzorului în partea opusă, interacționează cu ligandul imobilizat. O
celulă de probă conținând analitul curge peste suprafața senzorului și orice adsorbție sau
interacțiune de ligand în câmpul de penetrare al undei evanescente de la suprafața senzorului
va altera indicele de refracție efectiv al TE sau TM. Când ambele polarizări ies din dispozitiv,
ele interferă; monitorizând continuu schimbările în fazele relative ale TE și TM ă o măsură a
concentrației moleculare de pe suprafață (care determină modificări de RI). Interferometrul
diferențial a fost utilizat cu succes penstru monitorizarea foarte sensibilă pentru o serie de
biomolecule și capacitatea sa de a efectua măsurători în timp real îl face un instrument valoros
în caracterizarea proceselor specifice, cum este de exemplu legătura antigen-anticorp.
Imunosenzorii planar waveguide interferometric au fost utilizați pentru studierea
imunoreactivității anticorpilor imobilizați pe o suprafață cum este anticorpul anti-hCG.
Grilajul de cuplare (grating coupler)

Un grilaj de cuplare este format

dintr-o serie fina de ondulatii
gravate pe (waveguide) ghidul de
unda. Incorporarea unui astfel de
grilaj de cuplare pe un (waveguide)
optic pentru a produce un senzor ce
detecteaza indicele de refractie a
fost prima data propusa de
Tiefenthaler si Lukosz. Acest
mecanism monitorizeaza unghiul
de cuplare atat al laserului de
intrare, cat si at razei de iesire din
imunosenzor, ambele fiind
proporionale cu indicele de
refractie al campului de la suprafata
aparatului. Grilajul este plasat intre
substratul cu indice de refractie mic
si un (waveguiding film) cu un
indice de refractie mai ridicat.
Lumina polarizata intre prin aparat,
iar grilajul cauzeaza lumina (to
couple=sa se cuplze) sa intre in
rezonanta? inauntrul si inafara
ghidului de unda (waveguide).
Diferenta dintre indicele de refractie al ghidului de unda (waveguide) si cel al substratului
denota o crestere a campului temporar? (evanescent) si astfel o crestere a activitatii fata de
schimbarea indicelui de refractie de la suprafata.
SPR si interferometria

S-a incercat construirea unei noi forme de biosenzor optic care combina tehnologia ghidului
de unda (waveguide) cum ar fi interferometrul, cu tehnica SPR. Acest mecanism este similar
cu cel al unui SPR din punct de vedere structural, dar stratul metalic este inlocuit cu un strat
dielectric de rezonanta cu un indice de refractie ridicat. Acest strat este format in general din
titan (RI=2) si este separat de prisma de sticla (RI=1.64) de un strat de cuplare format din Si
cu un indice de refractie scazut (RI=1.46), care este destul de subtirepentru ca sa lase lumina
sa intre in rezonanta printr-un camp temporar (evanescent). Aceste modificari produc un
aspect de „sandwich” format din 3 straturi cu indice de refractie crescut-scazut-crescut,
deasupra carora se gaseste un strat de dextran care foloseste la imobilizarea ligandului necesar
pentru dozare.
La interfata dintre prisma si stratul de cuplare se trimite un fascicol de lumina laser
care are o reflexie totala, unghiul de incidenta fiind mai mare decat unghiul critic calculat in
prealabil (θ). Cand se atinge unghiul de rezonanta(θ), o parte din fascuicol se cupleaza in
stratul de cuplare si este trimis spre stratul de rezonanta prin campul alternativ. La interfata cu
proba apare din nou reflectia totala si porneste un alt camp temporar care se descompune
exponential in proba, aceasta fiind conditia de rezonanta. Unda se propaga de-alungul
suprafetei aproximativ 1mm inainte sa se cupleze (coupling) inapoi in dispozitiv. Spre
deosebire de sistemele SPR unde rezonanta este observata ca o descrestere in intensitate a
razei reflectate, in aceasta metoda nu se observa aproape nici o modificare in intensitatea razei
reflecatate.Totusi in acest caz exista o schimbare de faza (the phase) a luminii reflectate la
rezonanta, aceasta fiind proprietatea utilizata in aceasta metoda se dozare.
In aceste metode sunt urmarite separat polarizatiile TE (unde sagital polarizate) si TM
(unde tangential polarizate). Inainte sa se ajunga la rezonanata, cele doua sunt in faza, si sunt
de tip sinus. Pe masura ce sistemul ajunge la rezonanta se raza reflectata are o intarzaiere
datorata cuplarii luminii in stratul de rezonanta. Aceasta duce la o schimbare de faza de 360º a
luminii. Fascicolul de lumina rezultant este tot in faza, dar unghiul de rezonanta (polarizatia
TE fata de cea TM) se schimba cu 180º. Cand se intampla acest lucru polarizatia finala a
luminii se schimba cu 90º fata de fascicolul initial, si acesta nu va mai fi in faza. Schimbarea
de unghi in polarizatia luminii poate fi moniorizata cu ajutorul unui polarizor bine orientat.

Ambele polarizatii
incidente (TE si TM) pot prezenta
rezonanta si pot fi detectate in mod
simultan, deoarece unghiurile lor
de rezonanta sunt total diferite.
Polarizatia TE are insa un varf de
rezonanta mai ascutit decat cea de
ti TM si de aceea este mai
sensibila la schimbari ale
unghiului de rezonanta sau ale
indicelui de refractie. Un astfel de
sistem optimizat foloseste ca si
semnal unghiul de rezonanta TE,
dar foloseste unghiul de rezonanta
TM ca si unghi de referinta.
Schimbarile indicelui de
refractie care apar la sprafata, sau
la o distanta foarte mica de
suprafata, datorita adsorbtiei
moleculelor, sunt in regiunea de
unda temporara si de aceea
modifica pozitia unghiului de
rezonanta pentr TE. Aceasta modificare a unghiului este masurata de-a lungul experimentului,
ea furnizand o interpretare a indicelui de refractie si astfel si o interpretare a schimbarilor de
masa ce intervin la supratafa aparatului.
Interferometria si metodele SPR difera prin 2 lucruri: in primul rand nu exista o
variatie pronuntata a intensitatii luminii, insa, o parte din lumina sufera o schimbare de faza,
care se observa ca si un peak (varf) al intensitatii unghiului de rezonanta. De asemea,
materialul dielectric ce cuprinde stratul de rezonanta al metodeleor interferometrice absoarbe
mai putina lumina decat stratul de metal folosit in SPR.

Aplicatii clinice

Din pacate nu toate aceste tehnologii de cuantificare imunologica si-au gasit uz in

analiza practica a probelor biologice. Metodele cele mai sensibile pot sa ajunga la o limita de
detectie de ordinul 2*10^-13 mol/L pentru dozarea antigenului de hepatita B din ser.
 Pentru detectatea antigenului specific de prostata s-a ajuns la o limita de detectie de
3.3*10^-12 mol/L.
Mari sume de bani au fost investite de catre companiile de diagnostic in dezvoltarea
unor imunosenzori viabili in acest domeniu. Mecanismele care se gasesc la aceasta ora pe
piata au suprafata acoperita cu dextran carboxilat. Acestea s-au dovedit a avea o mare
specificitate in legarea antigenului din matricea probei, si de asemenea si o buna limita de
detectie, insa ele au reusit sa revolutioneze metodele de dozare prin rata de miscare in analiza
a intercatiilor biomoleculare. Astfel, prin dozarile in timp real al analitilor, aceste metode
ocupa primul loc in biotehnologie, diagnostic si in industria farmaceutica.
Desi potentialul imunosenzorilor este recunoscut in intreaga lume, ele umplu mai mult
paginile de literatura de specialitate decat laboratoarele de analiza, datorita dificultatilor de
fabricare si costurilor ridicare.

Detectarea bacteriei Salmonella paratyphi cu ajutorul imunosenzorilor

Pentru a doza aceasta bacterie vom imobiliza anticorpii specifici pe suprafata

imunosenzorului. Au fost propuse cateva metode prin care sa fie imobilizati anticorpii in asa
fel incat orientarea lor sa fie corecta pentru a se putea desfasura reactia antigen-anticorp.
Metoda optima pe care au gasit-o specialiștii in aceasta problema este cea care foloseste
tehnica autoasamblarii. Aceasta consta in imobilizarea unei alte substante care va avea
afinitate doar pentru unul din capetele anticorpului, formandu-se la final un strat de molecule
de anticorpi in pozitii paralele si care vor fi capabili sa lege antigenul.

Pentru a ajunge la sensibilitatea de care se bucura metoda de rezonanta plasmonica de

suprafata trebuie ca distanta dintre suprafata transductorului si anticorpi sa fie extrem de mica,
in asa fel incat stratul de substanta care va lega antigenul sa fie monodimensional. De
asemenea si anticorpul legat va trebui sa se disitribuie pe un singur strat.
Aceasta metoda de auto-asamblare foloseste in general interactiunea dintre un tiol si
moleculele de aur. Pentru a construi o suprafata de anticorp bine definita si cu o orientare
optima, se foloseste asa numita proteina G, o proteina din peretele celular a celor mai multe
specii de Streptococi. Din moment ce proteina G interactioneaza cu partea de IgG care nu
interactioneaza cu antigenul, aceasta parte ramane libera pentru reactia de identificare. Ca
rezultat, anticorpul imobilizat cu ajutorul proteinei G poate sa duca la o eficienta maxima a
imunosenzorului.
Salmonella are o semnificatie majora ca microorganism patogen in intoxicatii
alimentare, cauzand diaree, febra si dureri abdominale. In SUA sunt estimate aproximativ 76
milionae intoxicatii alimentare datorate bacteriilor patogene, si numarul a crescut de mai mult
de 5 ori in ultimii ani. De aceea detectia mancarii contaminate cu Salmonella este un proces
de maxima importanta pentru protectia sanatatii publice. Metodele microbiologice
conventionale care folosesc culturi de bacterii sunt foarte laborioase, au nevoie de mult timp,
pana la cateva zile, iar uneori timpul este factorul principal pentru a putea preveni o
contaminare in masa.
Multe tehnici imunologice dau rezultatele dorite in detectia bacteriilor, dar ele au un
pret ridicat, iar proba necesita proceduri complete de pregatire. Un exemplu tehnica (ELISA),
acesta fiind cel mai frecvent utilizata in detectarea patogenilor. El are limite de detectie intre
10^4 si 10^6 celule pe ml, iar timpul in care face o masuratoare este intre 16 si 24 h. De aceea
s-au incercat noi metode detectarea patogenilor cu o mare sensibilitate si intr-un timp scurt. S-
au incercat mai multe tipuri de imunosenzori insa imunosenzorii cu rezonanta plasmonica de
suprafata (SPR) ce folosesc proteina G pentru a creste sensibilitatea imunosenzorului prin
controlarea orientarii anticorpilor imobilizati prin eliberarea siturilor de legare ale antigenilor
din molecula anticorpilor s-a dovedit a fi cea mai buna medota de dozare a bacteriilor
Salmonella paratyphi.
Analiza morfologiei de suprafata a proteinei G pe sprafata de particule de Au a fost
facuta cu ajutorul unui mictroscop de forta atomica (AFM). Complexul de proteina G si Au
format si legarea in serie a acestuia cu anticorpul si antigenul au fost fost confirmate de
spectroscopia de rezonanta plasmonica de suprafata, si de asemenea a fost cercetata si limita
de detectie a imunosenzorului.
Proteina G folosita este un monomer proteic sarac in cisteina dar bogata in lizina.
Daorita faptului ca proteina nu are cisteina ea nu poate fi legata de foita de aur. De aceea a
fost nevoie de inlocuirea lizinei, aminoacid pe care il contine din abundenta, cu alte grupari
functionale cum ar fi cea de tiol (-SH). Doar in cazul in care gruparea tiol a fost inserata pe
molecula proteinei cu ajutorul compusului 2-iminothiolane, proteina G poate sa se lege de
stratul de Au.

Schimbarea curbei de adsorbtie

a proteinei G tiolate este
prezentata in figura urmatoare.

Variatia curbei de adsorbtie a

proteinei G de pe stratul de Au.

Datorita proteinei G, unghiul

de reflexie se va shimba
semnifiativ: din 43.002±0.02 la 43.257±0.015 º. In principiu metoda SPR este foarte sensibila
la compozitia stratului de substante de la suprafata. Adsorbtia duce la o schimbare in
rezonanta plasmonica si permite monitorizarea cantitatii de substanta cu o mare acuratete. De
aceea schimbarea unghiului de rezonanta demonastreaza ca moleculele de proteina au fost
legate de stratul de Au.
Prin microscopie atomica se poate face o comparatie intre o foita de aur, si o foita de
aur de care este legata proteina. Se poate observa ca proteina G este adsorbita pe suprafata de
Au imaginea fiind asemanatoare cu un nor, fata de cea unde foita de Au este pura. Din aceste
rezultate putem sa ajungem la concluzia ca protaina G a fost legata corespunzator.

Imagini de microscopie de forta atomica a)foita de Au; b) Au + proteina G legata

Comparand diferenta de unghi de incidenta al imunosenzorului datorita interactiunii
dintre antigen si anticorp atunci cand imobilizarea anticorpului a fost facuta cu ajutorul
proteinei G si atunci cand s-a incercat imobilizarea anticorpului direct pe suprafata
transductorului, se observa ca diferenta de unghi este mai mare in cazul folosirii proteinei,
ceea ce determina o crestere a eficientei de detectie a antigenului. Aceasta se explica prin
faptul ca proteina este capbila sa lege anticorpul in asa fel incat siturile de legare a antigenului
sa ramana libere.
Este foarte important pentru detectarea salmonelei sa folosim anticorpul cel mai
specific pentru antigenul bacterian. Pentru a determina daca antigenul ales (Mab) este specific
pentru Salmonella paratyphi si nu interactioneaza cu alti antigeni s-a facut un experiment
bazat pe enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in care s-a testat reactia dintre Mab si
alti antigeni aflati in apa contaminata. Experimentul a demonstrat faptul ca Mab are o mare
specificitate pentru Salmonella pratyphi si nu a reactionat cu alti antigeni, antigenul
salmonellei fiind singulul care a tereminat o schimbare a unghiului de incidenta in metoda
SPR.
Schimbarile unghiurior de incidenta datorate reactiilor imunologice dintre Mab si diferite
bacterii dintr-o mostra de apa contaminata.
S-au facut masuraturi ale inghiului de reflectie pentru proteina G legata de
transductor(a), pentru reactia anticorpului (numit Mab) cu antigenul de salmonela(b), si pentru
Salmonella paratyphi singura(c), si s-a demonstrat ca modeficarea unghiului de incidenta este

semnificativa si suficienta pentru a putea determina cantitativ antigenul.

S-au determinat mai multe masuratori la concentratii diferite de antigen. Dupa cum se
observa si in reprezentarea grafica de mai jos, modificarea de unghi este direct proportional cu
concentratia de antigen, prezentandu-se o relatie liniara intre analit si semnal. Limita de jos de
detectie s-a demonatrat a fi 10^2 CFU/ml ( celule formatoare de colonii), aceata metoda fiind
de 4 ori mai sensibila decat metoda ELISA
 S-a dovedit astfel ca metoda SPR este o metoda eficienta pentru a monitoriza
Salmonella paratyphi.

Bibliografie
 Claire L. Morgan, David J. Newman, Christopher P. Price, Immunosensors:
technology and opportunities in laboratory medicine, Clinical Chemistry 42, No. 2,
1996, p 193-209
 Hua Wang, Guoli Shen, Ruquin Yu, Aspects of recent development of
immunosensors, Academic Press 2008, p 237-260
 Dhesingh Ravi Shankaran, K. Vengatajalabathy Gobi, Norio Miura – Recent
advancement in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small
molecules of biomedical, food and environmental interest – Sensors and Actuators B
121, 2007, p 158-177
 Byung-Keun Oh, Woochang Lee, Young-Kee Kim, Won Hong Lee, Jeong-Woo Choi
– Surface plasmon resonance immunosensor using self-assembled protein G for
detection of Salmonella paratyphi – Journal of Biotechnology 111 (2004), p 1-8
