Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Introducere
Calitatea vieţii este un interes general în toata lumea. Aceasta este guvernata de câțiva
factori cum ar fi controlul bolilor, dezvoltarea industriei farmaceutice, curățenia mediului
înconjurător sau consumul de alimente crescute in mod natural. Biosenzorii joaca un rol
important in creşterea calităţii vieţii, datorita noilor cercetări in aceste domenii. In general un
biosenzor este un dispozitiv analitic de identificare si dozare care este format dintr-un element
biologic de recunoaştere a analitului si de un traducător de semnal. Elementul biologic de
recunoaştere este cel responsabil de specificitatea metodei analitice, iar traducătorul de
semnal converteşte recunoaşterea biochimica intr-un semnal măsurabil, optic sau electric.
Datorita avansării in biologia moleculara si in imunochimie in construcţia
biosenzorilor se folosesc o gama foarte variata de elemente de biorecunoaștere. Cele mai
folosite dintre acestea sunt: enzime, anticorpi, peptide, ADN, celule întregi, sau anumiţi
receptori, fiecare dintre ei având avantajele si dezavantajele lor pentru detecţia analiților.
Proprietăţile de recunoaştere a acestor elemente dau biosenzorului specificitate si mare
sensibilitate in diferitele aplicaţii. In funcţie de tipul de element de recunoaştere pe care îl
folosesc, biosenzorii pot fi:
- biosenzori ce folosesc enzime
- biosenzori care folosesc celule
- imunosenzori etc.
Imunosenzori – principiu
Imunosenzorii sunt unii dintre cei mai avansaţi biosenzori deoarece folosesc reacţii
antigen-anticorp. Aceste reacţii sunt de o foarte mare specificitate, antigenul reacţionând doar
cu anticorpul său specific, asemenea unei chei care se potriveşte intr-un singur lacăt. Aceste
dispozitive se folosesc atât pentru identificarea analitului cat si pentru dozarea lui, cu ajutorul
unui traducător de semnal adecvat.
Un imunosenzor poate fi utilizat fie pentru identificarea si dozarea anticorpului, fie
pentru identificarea si dozarea antigenului. In general analitul se găseşte in soluţie iar
partenerul sau complementar va trebui sa fie fixat pe un electrod. Daca reacţia este pozitiva
înseamnă ca cei doi parteneri sunt cuplu antigen-anticorp. De aceea proprietăţile de la
suprafaţa electrodului, acolo unde a avut loc reacţia, se schimba datorita formarii
complexului antigen-anticorp si datorita creşterii stratului dielectric. Daca se măsoară o
anumita mărime fizica cum ar fi potenţialul, absorbanta, conductivitatea, indice de refracție se
va observa o diferenţa intre măsurătoarea făcuta in absenta analitului si cea făcuta in prezența
acestuia, fapt care demonstrează influenta reacţiei asupra acestor mărimi. S-a demonstrat
faptul ca diferenţa dintre cele doua măsurători se afla in strânsă legătură cu cantitatea de
analit. Aceest lucru determina capacitatea de dozare a imunosenzorilor. Relaţia dintre
diferenţa de semnal si concentraţia de analit poate sa fie liniara sau logaritmica, de direct sau
invers proporţionalitate, in funcţie de semnalul pe care îl măsuram.
R
E
C TRADUCTOR Semnal Circuit
E electric electronic
P (I, V) de
T (DISPOZITIV amplificare
O ELECTRONIC)
R
Substanţe
purtătoare de
diverşi liganţi
Schema unui imunosenzor
Metode imunologice
Metodele imunologice se clasifică în: omogene și heterogene. În cele heterogene
anticorpul sau antigenul este imobilizat pe suportul transductorului si interactiunea cu un
analit care are loc la suprafață este monitorizată de un senzor de răspuns. În cazul celor
omogene, reacția biochimică are loc doar în soluție.
Metodele imunologice sunt clasificate în continuare în funcție de metodologia de
detecție aleasă, lucru care depinde de natura analitului, proba de analizat, sensibilitatea
instrumentului analitic sau a aplicatiei dorite. Cel mai des se folosește detecția directă, metoda
sandwich, metoda prin înlocuire și metoda indirectă competitivă.
Metoda directă:
În metoda directă anticorpii sunt imobilizați pe suprafața senzorului și puși să
reacționeze cu analitul de interes. Legătura formată între antigen si anticorp va determina o
schimbare a proprietății măsurate în funcție de concentrația analitului dozat. Chiar dacă este
ușor de aplicat, această metodă poate fi folosită doar în dozarea moleculelor mari cu o
greutate moleculară mai mare de 10 kDa deoarece moleculele mici au o masă prea mică
pentru a determina o schimbare detectabilă.
Metoda sandwich:
Metoda sandwich constă în doi pași de recunoaștere. In prima etapă anticorpul
imobilizat pe suprafața transductorului este pus să reacționeze cu analitul. În etapa a doua, un
al doilea anticorp este adăugat pe suprafața senzorului pentru a se lega cu analitul capturat
anterior. Cele două etape măresc sensibilitatea si specificitatea imunosenzorului. Cel mai
important aspect în această metodă este că analitul trebuie să se lege de doi anticorpi simultan.
Prin urmare, poate fi folosită pentru detecția moleculelor mari (mai mari de 5000 Da) care au
mai mulți epitopi1 cum ar fi proteine, bacterii sau virusuri.
Cu toate acestea, marcarea celui de-al doilea anticorp este preferată în cele mai multe
cazuri si prin urmare utilizează și metode chemiluminiscente si fluorescente de detecție. Ar
trebui menționat că moleculele mici sau moleculele cu epitopi cu formă asemănătoare sunt în
general greu de dozat prin această metodă.
Clasificarea imunosenzorilor
Popularitatea imunosenzorilor a crescut remarcabil in ultimele doua decenii datorita
limitelor de detectie foarte joase si datorita marii selectivitati pentru unii analiti in matrici
complexe cu ajutorul unor dispozitive si metode relativ simple. Se considera ca un
imunosenzor ideal ar trebui fie capabil sa identifice si sa dozeze anticorpul sau antigenul din
matrici complexe, sa fie capabil sa detecteze legatura formata fara adaugare de alti reactanti si
sa permită măsurători repetate.
In functie de traducatorul de semnal imunosenzorii se pot clasfica in:
Imunosenzori piezoelectrici
Imunosenzori electrochimici
Imunosenzori optici.
La imunosenzorii piezoelectrici traducatorul de semnal intra in rezonanta cu un câmp
electric alternativ exterior, iar variatia de masa care apare datorita reactiei antigen-anticorp
duce la o schimbare a frecventei de oscilatie a undei electromagnetice, fapt care este corelat
cu concentratia analitului.
Imunosenzorii electrochimici se impart in mai multe categorii in functie de semnalul
masurat. Ei pot fi potentiometrici, amperometrici, conducometrici, impedimetrici, voltametrici
etc. Imunosenzorii potentiometrici se bazeaza pe masurarea unei diferente de potential indus
de reactia antigen-anticorp de pe suprafata senzorului, iar la cei amperometrici este masurat
curentul generat de speciile electroactive care fie se oxideaza, fie se reduc la un potential fix.
Imunosenzorii conductometrici se bazeaza pe o descrestere a conductivității intre o pereche de
electrozi de platina datorita reactiei de la suprafata electrodului. Imunosenzorii impedimetrici
se bazează pe faptul că grosimea si proprietatile dielectrice ale suprafetei electrodului
contribuie la impedanța sistemului.
Imunosenzorii optici se considera a fi una dintre cele mai promitatoare alternative ale
imunosenzorilor treditionali atat in diagnostice clinice cat si in analize ale mediului. In ultimii
ani s-a apelat din ce in ce mai mult la aceste dispozitive datorita numeroaselor avantaje ale
acestora: utilizarea radiatiei vizibile, rapiditatea metodei, dar si faptul ca este o metoda
nedistructiva. Ei se bazeaza pe masurarea radiatiei absorbite sau emise de catre imuno-
reactanti. Interactiunea dintre lumina si imunoreactanti poate fi masurata ca si o diferenta in
absorbanta, luminescenta, polarizatie, sau unghi de refractie.
Imunosenzori optici
Fluorescenta.
Reflectanța
Reflexia totala atenuata este o forma de spectroscopie de reflexie interna (IRS) in care
energia luminoasa absorbita de la o unda tranzitorie este monitorizata ca si o atenuare a razei
de lumina interne reflectate. Un film absorbant optic se gaseste la sprafata unui senzor IRS ,
rezultand o structura cunoscuta sub numele de configuratia Kretschmann. Lumina incidenta
directionata spre spre suprafata superioara este absorbita de acest film, si intesitatea luminii
atenuate este masurata in functie de lungimea de unda incidenta. Aceasta tehnica a fost
aplicata pentru monitorizarea interactiilor biologice in infrarosu, visibil si ultraviolet. Reflexia
totala atenuata a fost aplicata studiului interactiilor antigen-anticorp.
Elipsometrie
Fenomenul de rezonanță
plasmonică de suprafață a fost prima
dată observat în 1902 și este acum bine
documentat. Aranjamentul optic pentru
SPR are configurația Kretschmann.
Aceasta diferă de cea descrisă pentru
IRS prin încorporarea unui strat adițional
– un film subțire de metal – între prismă
și probă. Filmul de metal caracteristic
pentru SPR este de obicei constituit din
aur sau argint. Liganzii specifici pot fi
imobilizați pe suprafața superioară a
dispozitivului (senzorului) pentru a
interacționa direct cu biomoleculele din
probă. Tehnologia SPR se bazează pe
excitarea suprafetei plasmonice prezente
în filmul de metal al senzorului.
Plasmonii de suprafață sunt electroni de
la suprafața unui metal (precum aur sau
argint) care se comportă diferit decât cei
din interiorul metalului. Acest fenomen
poate fi asemănat cu cel de tensiune
superficială, în care legăturile dintre
moleulele de la suprafața unui lichid
diferă de cele dintre moleculele din
interiorul soluției. Dintre cele două tipuri
de plasmoni existenți – radiativi si non-radiativi – cei din urmă sunt cel mai adesea folosiți
pentru aplicațiile biosenzorilor. Plasmonii non-radiativi sunt excitați de lumina direcționată
către filmul de metal printr-o prismă de sticlă. Când sunt excitați, plasmonii de suprafață, care
oscilează la o frecvență diferită decât a celor din interiorul filmului de metal, absorb o parte
din energia undei de lumină pentru a genera o undă tranzitorie. Această undă penetrează
stratul de proba cu o aplitudine care descrește exponențial – condiție cunoscută ca SPR.
În sistemul SPR, lumina polarizată este direcționată într-un singur plan prin prismă,
care are un indice de refractie mai mare decât a stratului de metal. Când unghiul de reflexie a
luminii este mai mare sau egal cu unghiul critic lumina este total reflectată înapoi în interiorul
prismei. La unghiul de rezonanță (θ), SPR este inițiat; absorbția energiei luminii de către
suprafața de plasmoni în timpul rezonanței cauzează o descreștere bruscă a intensității luminii
reflectate, care este monitorizată pe parcursul intercațiunii biomoleculare.
Unda tranzitorie nu se propagă paralel cu interfața prismei în SPR, dar e redirecționată
în sus în stratul de metal. Aceasta permite sesizarea suprafeței metal-probă (suprafața
senzorului). Unghiul de rezonanță este determinat de lungimea de undă și de starea de
polarizarea a undei incidente, precum și indicele de refracție al prismei, metalului si stratului
de probă al sistemului. Când toți ceilalți factori sunt menținuți constanți, unghiul de rezonanță
măsoară indicele de refractie de la suprafața sistemului SPR. Astfel, modificările unghiului de
rezonanță au loc când biomoleculele se atașează de liganzii specifici de la suprafața
senzorului și modifică unghiul astfel încât are loc scăderea bruscă a intensității luminii.
Monitorizarea continuă a intensității luminii reflectate și a unghiului de reflexie determină un
profil direct al modificărilor indicelui de refractie de la suprafața senzorului și se poate
urmării analiza în timp real a formării legăturilor implicate în reacție.
Raporturi privind aplicarea fenomenului SPR în domeniul biosenzorilor au demonstrat
că o scară largă de molecule pot fi analizate în această manieră, de la peptide mici la analiți
mai mari precum si particule de viruși și anticorpi. SPR a fost comercializat ca un biosenzor
cunoscut ca BIAcore (Biosensor, Uppsala, Suedia), care este capabil să analizeze interacții
biologice în timp real fără utilizarea unui marker; folosirea unui software integrat care să
faciliteze evaluarea cinetică a reacției a făcut această tehnică utilă în multe arii cum ar fi
ingienria biomoleculară, design-ul de medicamente, și caracterizarea monoclonală a
anticorpilor.
O noua descoperire în cadrul imunsosenzorilor SPR a fost introducerea de markeri
pentru a mări sensibilitatea. Combinarea marcarii fluorescente cu SPR pentru a produce teste
SPR fluoroimunologice a fost utilizată cu succes pentru testarea hCG din ser. Particulele de
latex au fost utilizate pentru a spori sensibilitatea unui test pentru detecția antigenilor, test
cunoscut ca Enhance Surface Plasmon Resonance Inhibition Test (ESPRIT). Acest test
consistă din doi pași, un pas de inhibiție și un pas de sporire. În pasul de inhibiție, anticorpul
este amestecat cu un antigen liber de concentrație necunoscută la suprafața senzorului SPR de
care a fost imobilizat deja un antigen. Antigenul liber impiedică legarea anticorpului de
suprafața cu antigene ale senzorului, și creșterea concentrației de antigen liber va reduce
proporțional semnalul SPR. În cel de-al doilea pas, sunt introduse particule de latex filmate cu
antigen; acestea se leagă de anticorpii de la suprafața senzorului și astfel determină sporirea
semnalului SPR. În acest fel, detecția antigenilor este independentă de masa moleculară, ceea
ce sporește posibilitatea sesizării moleculelor cu masă moleculară mică (<5 kDa) în
concentrații mici.
Ghiduri de fascicol
Ghidurile de fascicol
pot fi construite sub formă
de fibre: miez cu indice de
refracție mare, cilindric din
sticlă, quarț sau polimer
placat cu un material cu
indice de refracție mai mic.
Lumina este direcționată
către vârful fibrei și se
produce o reflexie totală la
contactul dintre miez și
mediul probei, generând o
undă tranzitorie. Legarea sau
absorbția are loc între
biomoleculele imobilizate și
analitul din probă în raza
câmpului tranzitoriu din
partea neplacată a fibrei.
Această reacție poate fi
monitorizată măsurând
semnalul luminii reflectate odată ce se întoarce din regiunea neplacată a fibrei în regiunea
placată. Ghidurile de fascicol cu fibră optică au fost dezvoltate cu succes pentru imunosenzori
și măsurători colorimetrice. Imunosenzorii bazați pe fibre optice s-au dovedit a fi utili în
special pentru analize de mediu și probe clinice care conțin materiale periculoase; fibra lungă
poate fi inserată în containere închise, prevenind astfel contaminarea operatorului sau a
componentului optic.
Un exemplu de astfel de dispozitiv este un imunosenzor creat pentru detecția toxinei A
de Clostridium botulinum. Fiind proiectat ca un imunotest de tip sandwich, această tehnică
implică legarea covalentă a anticorpului de o fibră optică conică; când aceasta este adusă în
contact cu amestecul de reacție care conține proba și un amestec de anticorpi marcați cu
rodamină, unda tranzitorie excită molecula fluorescentă cuplată de anticorpul imobilizat în
prezența toxinei, dar are o influență minimă asupra fluorescenței din miezul amestecului de
reacție.
Interferometrul
SPR si interferometria
S-a incercat construirea unei noi forme de biosenzor optic care combina tehnologia
ghidului de fascicol cum ar fi interferometrul, cu tehnica SPR. Acest mecanism este similar cu
cel al unui SPR din punct de vedere structural, dar stratul metalic este înlocuit cu un strat
dublu electric de rezonanta cu un indice de refracție ridicat. Acest strat este format în general
din titan (RI=2) si este separat de prisma de sticla (RI=1.64) de un strat de cuplare format din
Si cu un indice de refracție scăzut (RI=1.46), care este destul de subțire pentru ca sa lase
lumina sa intre in rezonanta printr-un camp tranzitorie. Aceste modificari produc un aspect de
„sandwich” format din 3 straturi cu indice de refractie crescut-scazut-crescut, deasupra carora
se gaseste un strat de dextran care foloseste la imobilizarea ligandului necesar pentru dozare.
La interfata dintre prisma si stratul de cuplare se trimite un fascicol de lumina laser
care are o reflexie totala, unghiul de incidenta fiind mai mare decat unghiul critic calculat in
prealabil (θ). Cand se atinge unghiul de rezonanta(θ), o parte din fascuicol se cupleaza in
stratul de cuplare si este trimis spre stratul de rezonanta prin campul alternativ. La interfata cu
proba apare din nou reflectia totala si porneste un alt camp temporar care se descompune
exponential in proba, aceasta fiind conditia de rezonanta. Unda se propaga de-alungul
suprafetei aproximativ 1mm inainte sa se cupleze (coupling) inapoi in dispozitiv. Spre
deosebire de sistemele SPR unde rezonanta este observata ca o descrestere in intensitate a
razei reflectate, in aceasta metoda nu se observa aproape nici o modificare in intensitatea razei
reflecatate.Totusi in acest caz exista o schimbare de faza a luminii reflectate la rezonanta,
aceasta fiind proprietatea utilizata in aceasta metoda se dozare.
In aceste metode sunt urmarite separat polarizatiile TE (unde sagital polarizate) si TM
(unde tangential polarizate). Inainte sa se ajunga la rezonanata, cele doua sunt in faza, si sunt
de tip sinus. Pe masura ce sistemul ajunge la rezonanta se raza reflectata are o intarzaiere
datorata cuplarii luminii in stratul de rezonanta. Aceasta duce la o schimbare de faza de 360º a
luminii. Fascicolul de lumina rezultant este tot in faza, dar unghiul de rezonanta (polarizatia
TE fata de cea TM) se schimba cu 180º. Cand se intampla acest lucru polarizatia finala a
luminii se schimba cu 90º fata de fascicolul initial, si acesta nu va mai fi in faza. Schimbarea
de unghi in polarizatia luminii poate fi moniorizata cu ajutorul unui polarizor bine orientat.
Ambele polarizatii
incidente (TE si TM) pot prezenta
rezonanta si pot fi detectate in mod
simultan, deoarece unghiurile lor
de rezonanta sunt total diferite.
Polarizatia TE are insa un varf de
rezonanta mai ascutit decat cea de
ti TM si de aceea este mai
sensibila la schimbari ale
unghiului de rezonanta sau ale
indicelui de refractie. Un astfel de
sistem optimizat foloseste ca si
semnal unghiul de rezonanta TE,
dar foloseste unghiul de rezonanta
TM ca si unghi de referinta.
Schimbarile indicelui de
refractie care apar la sprafata, sau
la o distanta foarte mica de
suprafata, datorita adsorbtiei
moleculelor, sunt in regiunea de
unda tranzitorie si de aceea
modifica pozitia unghiului de rezonanta pentr TE. Aceasta modificare a unghiului este
masurata de-a lungul experimentului, ea furnizand o interpretare a indicelui de refractie si
astfel si o interpretare a schimbarilor de masa ce intervin la supratafa aparatului.
Interferometria si metodele SPR difera prin 2 lucruri: in primul rand nu exista o
variatie pronuntata a intensitatii luminii, insa, o parte din lumina sufera o schimbare de faza,
care se observa ca si un pic al intensitatii unghiului de rezonanta. De asemea, materialul
dielectric ce cuprinde stratul de rezonanta al metodeleor interferometrice absoarbe mai putina
lumina decat stratul de metal folosit in SPR.
Aplicatii clinice
Schimbarea curbei de
adsorbtie a proteinei G tiolate
este prezentata in figura
urmatoare.
Variatia curbei de
adsorbtie a proteinei G de pe
stratul de Au.
Datorita proteinei G,
unghiul de reflexie se va
shimba semnifiativ: din
43.002±0.02 la 43.257±0.015 º.
In principiu metoda SPR este
foarte sensibila la compozitia stratului de substante de la suprafata. Adsorbtia duce la o
schimbare in rezonanta plasmonica si permite monitorizarea cantitatii de substanta cu o mare
acuratete. De aceea schimbarea unghiului de rezonanta demonastreaza ca moleculele de
proteina au fost legate de stratul de Au.
Prin microscopie atomica se poate face o comparatie intre o foita de aur, si o foita de
aur de care este legata proteina. Se poate observa ca proteina G este adsorbita pe suprafata de
Au imaginea fiind asemanatoare cu un nor, fata de cea unde foita de Au este pura. Din aceste
rezultate putem sa ajungem la concluzia ca protaina G a fost legata corespunzator.
Schimbarile
unghiurior de
incidenta
datorate reactiilor imunologice dintre Mab si diferite bacterii dintr-o mostra de apa
contaminata.
S-au facut masuraturi ale inghiului de reflectie pentru proteina G legata de
transductor(a), pentru reactia anticorpului (numit Mab) cu antigenul de salmonela(b), si pentru
Salmonella paratyphi singura(c), si s-a demonstrat ca modeficarea unghiului de incidenta este
Bibliografie
Claire L. Morgan, David J. Newman, Christopher P. Price, Immunosensors:
technology and opportunities in laboratory medicine, Clinical Chemistry 42, No. 2,
1996, p 193-209
Hua Wang, Guoli Shen, Ruquin Yu, Aspects of recent development of
immunosensors, Academic Press 2008, p 237-260
Dhesingh Ravi Shankaran, K. Vengatajalabathy Gobi, Norio Miura – Recent
advancement in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small
molecules of biomedical, food and environmental interest – Sensors and Actuators B
121, 2007, p 158-177
Byung-Keun Oh, Woochang Lee, Young-Kee Kim, Won Hong Lee, Jeong-Woo Choi
– Surface plasmon resonance immunosensor using self-assembled protein G for
detection of Salmonella paratyphi – Journal of Biotechnology 111, 2004, p 1-8