TRANSCRIEREA genetică PK + EK

TRADUCEREA informației genetice

CODUL GENETIC

14 mai 2018 Secția Biochimie anul II

EXPRESIA GENELOR
Fluxul informaţiei genetice

traducerea
transcriere procesarea informatiei
genetică transcriptului genetice
genă transcript primar peptid
ARN mesager
(ADN) (ARN)

ARN ribozomal

ARN de transfer

ARN antisens
inhibarea transcrierii

Prima etapă în exprimarea genelor = transcrierea genetică a genelor

 Transcriere genetică (TG)
Drumul de la ADN → proteine Este de fapt ADN → ARN → proteine
TG = procesul de sinteză a moleculelor de ARN ca urmare a citirii informaţiei codificată în moleculele ADN

TG “seamănă” cu replicarea, dar se sintetizează o catenă ARN şi nu ADN;

deci, în mod similar, este citită o catenă ADN (=catenă matriţă),
iar catena nouă este sintetizează pe bază de complementaritate cu matriţa

Prin TG se sintetizeaza toate tipurile de ARN proprii celulelor: ARNm, ARNr, ARNt, ARNhn

- molecula ARN rezultata prin transcriere, inainte de orice alta procesare se numeste transcript primar

Nucleotide pe catena ADN Nucleotide pe catena ARN

matriţă transcript
G C
C G
T A
A U
 TG este catalizată enzimatic de enzime denumite ARN polimeraze
PK – 1 specie moleculară de ARN pol / celulă
EK – 3 specii moleculare de ARN pol / celulă

În contrast cu ADN polimerazele, ARN polimerazele nu necesită primer,

pot ataşa şi primul nucleotid de pe catena nouă
Transcrierea genetică se desfăşoară în bucla de transcriere – zonă unde desface dublul helix ADN

5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’

buclă de transcriere ARN transcript

Catena ARN ce se sintetizează prin transcriere - nu rămâne ataşată la matriţa ADN pe toată lungimea ei,
ci doar pe un segment scurt, de ~ 15 nucleotide
- restul moleculei ARN “iese” din hibridul ARN : ADN

5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’

buclă de transcriere ARN transcript

5’ 3’
3’
3’ 5’

ARN transcript
buclă de transcriere

5’
În ansamblu, deşi procesul de transcriere este suficient de corect (corectitudinea se referă la
complementaritatea ribonucleotidelor din catena ARN faţă de deoxiribonucleotidele din
matriţa ADN), este totuşi mai puţin acurat decât procesul de replicare.

Mecanismele de proofreading sunt mai puţin eficiente în transcriere, comparativ cu replicare

Transcriere – 1 nucleotid “greşit” / 10.000 nucleotide
Replicare – 1 nucleotid “greşit” / 10 milioane nucleotide

În replicare este copiat tot genomul

În transcriere este copiată informaţia doar de pe o singură catenă ADN,
şi doar din anumite regiuni ADN, denumite gene

Genă = regiune din ADN a cărei informaţie este copiată în ARN

ORF = Open Reading Frame = cadru deschis citirii = zonă ADN ce este transcrisă
Ce regiuni din ADN se transcriu ?

G E N Ă
Zonă din ADN care codifică pentru o proteină / ARN
Zonă din ADN căreia îi corespunde o copie ARN

Promotor G E N Ă Terminator

O zonă din ADN cuprinsă între un promotor şi un terminator poartă numele de unitate de transcriere
Catena folosită ca matriţă ptr sinteza unui transcript este complementară cu el şi = catenă antisens
Catena ne-matriţă este denumită catenă codificatoare sau catenă sens

Transcrierea începe de la un PROMOTOR şi se termină la un TERMINATOR

La EK fiecare genă are un promotor şi, respectiv, un terminator.

La PK, unele gene au promotor şi terminator, alte gene nu au promotor propriu (sunt transcrise mai
multe gene pornind de la un acelaşi promotor)
Ce regiuni din ADN se transcriu ?

G E N Ă
Zonă din ADN care codifică pentru o proteină / ARN
Zonă din ADN căreia îi corespunde o copie ARN

Promotor G E N Ă Terminator

O zonă din ADN cuprinsă între un promotor şi un terminator poartă numele de unitate de transcriere
Catena folosită ca matriţă ptr sinteza unui transcript este complementară cu el şi = catenă antisens
Catena ne-matriţă este denumită catenă codificatoare sau catenă sens

Transcrierea începe de la un PROMOTOR şi se termină la un TERMINATOR

La EK fiecare genă are un promotor şi, respectiv, un terminator.

La PK, unele gene au promotor şi terminator, alte gene nu au promotor propriu (sunt transcrise mai
multe gene pornind de la un acelaşi promotor)
Pe o aceeaşi moleculă ADN, unele gene sunt transcrise folosind o catenă drept matriţă,
iar alte gene sunt transcrise folosind cealaltă catena ca matriţă.
Acest lucru este determinat de modul în care se aşează ADN pol pe molecula ADN

ARN pol

5’ 3’
Promotor catena antisens
3’ 5’
3’
5’
transcript ARN

ARN pol
transcript ARN
3’ 5’

5’ 3’
catena antisens
rotomorP
3’ 5’
Convenţii internaţionale de notare

Orice regiune ADN dc cu secvenţă cunoscută se poate lista doar pe o singură catenă,
cealaltă fiind cunoscută prin complementaritate
Astfel, se scrie doar secvenţa catenei 5’  3’, de ex.: 5’-ATTGCCAATGGA-3’
Mai mult chiar, de foarte multe ori nu se mai scriu şi cifrele 5’, 3’

Pentru fiecare regiune ADN transcrisă, nucleotidele se numerotează astfel:

gena 2 ..... +5 +4 +3 +2 +1 -1 -2 -3

-4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5 .....
gena 1
situs
START

+1 Primul nucleotid din catena ADN matriţă care este citit şi căreia îi corespunde primul
nucleotid în transcriptul ARN; acest prim nucleotid citit mai este numit şi SITUS START

+2 ... +n Următoarele nucleotide din catena ADN matriţă citite, aflate în aval (downstream) faţă
de primul nucleotid citit

-1 ... -n Nucleotidele de pe catena matriţă aflate în amonte (upstream) faţă de cadrul de citire,
importante ptr gena considerată
La EK, majoritatea genelor au promotor propriu şi sunt transcrise în unităţi distincte, procesul fiind denumit
transcriere monocistronică
La PK, unele gene (mai ales cele reglatoare) au promotor propriu şi sunt transcrise monocistronic;
foarte multe gene însă, nu au P propriu, ci sunt cotranscrise prin transcriere policistronică

O unitatea de transcriere = 1 genă Transcriere monocistronică

(A) Transcriere monocistronică
P gena A t
transcriere

3’ ARN transcript
5’ monocistronic
traducere

un singur
A polipeptid

O unitatea de transcriere = mai multe gene Transcriere policistronică

(B) Transcriere policistronică

P gena B gena C gena D t

transcriere

5’ 3’ ARN transcript
policistronic
traducere

B C D
mai multe polipeptide
ARN polimeraze
= enzime ce sintetizează molecule ARN, prin formarea legăturilor fosfodiesterice între ribonucleotide, în direcţie 5’  3’
Spre deosebire de ADN polimeraze, ARN polimerazele NU necesită primer – pot ataşa şi primul nucleotid
Se ataşează la molecula ADN, la secvenţe de tip PROMOTOR

ARN polimeraza de la PK PK

1 singură specie moleculară de ARN polimerază ~ 7000 molecule / celulă

Sintetizează toate speciile moleculare de ARN celular: mesager (ARNm), ribozomal (ARNr), de transfer (ARNt) etc

Este formată din 4 tipuri de subunităţi, codificate de gene diferite, cu formula generală : 2α−β−β’−σ

asamblarea subunităţilor ARN polimerazei α-CTD

α (alpha) se ataşează la regiunea UP din promotori (α-CTD) = linker flexibil
funcţionează ca dimer α-NTD

β (beta) formarea legăturilor fosfo-diesterice dintre ribonucleotide

β’ (beta prim) afinitate chimică ptr ADN, se ataşează situs-nespecific

recunoaşte specific regiunile promotor şi se ataşează la ele

desface dublul helix ADN, fără intervenţia helicazei
σ (sigma)
după terminarea fazei de iniţiere a transcrierii, se desprinde,
iar restul subunităţilor desfaşoară elongarea şi terminarea transcrierii
Etapele transcrierii genetice la PK
începe de la regiuni numite PROMOTORI
Atât la PK, cât şi la EK, un ciclu de TG -
continuă şi se desfăşoară pe regiuni deschise citirii
se termină în regiuni numite TERMINATORI
La toate tipurile de organisme, un ciclu de transcriere este format din 3 etape: iniţiere, elongare, terminare

Iniţierea transcrierii la PK

Regiunile promotor = regiuni unde ataşează ARN polimerazele şi, respectiv,

unde are loc deschiderea dublului helix ADN
unde se formează bucla de transcriere

Structura promotorilor la PK include secvenţe consensus, recunoscute de subunităţi ale ARN polimerazelor
Start
Situsul UP Hexamerul -35 Hexamerul -10
30-60 b 15-20 b 5-10 b
UP // 5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’

Structura promotorilor la PK

La PK secvenţele consensus recunoscute de subunităţi ale ARN pol sunt:

hexamerul -35 = o secvenţă hexamerică (formată din 6 pb) localizată în poziţia -35 TTGACA recunoscut de σ

hexamerul -10 = o secvenţă hexamerică (formată din 6 pb) localizată în poziţia -10 TATAAT recunoscut de σ

situsul UP = o secvenţă de ~ 20 pb, cu localizare variabilă -40 ... -80 pb de situsul +1 recunoscut de α-CTD
Schema ARN polimerazei de la procariote şi ataşarea acesteia la regiuni promotor
La PK, iniţierea transcrierii se desfăşoară în 3 stadii: Promotor închis I / Promotor închis II / Promotor deschis

I. ARN polimeraza, respectiv, subunitatea σ, se ataşează la hexamerul -35 Promotor închis I

II. ARN pol se aşează pe ADN, cuprinzându-l; se ataşează şi la hex -10

Dar cei 2 hexameri nu sunt orientaţi optim faţă de situsurile de ataşare la σ
Promotor închis II
Ptr a se ataşa stabil la cei 2 hexameri, σ distorsionează molecula ADN
Ca urmare, ADN-ul este curbat şi torsionat între cei 2 hexameri
III. Tensiunea torsională este eliberată prin deschiderea dublului helix, 15-20 pb,
regiune ce cuprinde şi situsul start +1; Promotor deschis
se formează astfel bucla de transcriere

La organismele procariote, primul ribonucleotid ataşat în transcript este ATP/GTP

După sinteza a 8-10 ribonucleotide, σ se desprinde din complex, miezul enzimei ARN polimerază desfăşoară în
continuare singur reacţia de polimerizare, cu formarea legăturilor fosfodiesterice dintre ribonucleotide.
Elongarea transcrierii la PK
Molecula de ARN creşte în direcţia 5’  3’, reacţia fiind catalizată de subunitatea β

- bucla de transcriere se deplasează pe molecula de ADN

- transcriptul ARN nu este menţinut în hibrid pe toată lungimea lui, ci doar pe aprox. 12 b

După ce ARN pol a trecut de regiunea promotor, acesta se închide, iar la el se poate ataşa o altă moleculă de ARN pol

ARN pol de la E.coli are o rată de polimerizare de aprox. 30-40 nucleotide / secundă la 37oC

În faza de elongare, ARN pol de la PK desfăşoară şi activitate de proof-reading, prin 2 mecanisme:

► editare pirofosforolitică : ARN pol îndepărtează un ribonucleotid încorporat incorect

► editare hidrolitică : ARN pol se deplasează înapoi pe transcript cu unul sau mai multe
ribonucleotide, taie o porţiune de transcript, îndepărtează regiunea cu
eroare şi reia apoi procesul de sinteză; în această reacţie, ARN pol este
asistată de proteina Gre

În transcrierea multor gene de la PK, în etapa de elongare participă un set de proteine cu rol de factori de elongaţie,
dintre care cel mai important este proteina NusG , careNusG
creşte procesivitatea ARN polimerazei (rol similar cu cel al
peptidului β – sliding clamp în procesul de replicare).
ADN
3’
5’

buclă de transcriere

3’

5’
ARN transcript

3’

5’ bucla de transcriere se deplasează pe ADN

3’

5’

bucla de transcriere se închide,iar transcriptul ARN este expulzat

ADN

3’

5’ ARN transcript
Terminarea transcrierii la PK

ARN polimeraza se deplasează pe molecula ADN şi transcrie până ajunge in regiunea unui terminator.
O secvenţă ADN de tip terminator este formată din :

- 2 copii poli-GC repetate invers, ce prezintă complementaritate intracatenară

- 4-10 adenine, ce formează un aşa-numit semnal de terminare;
legăturile de H dintre A de pe matriţa ADN şi U de pe transcriptul ARN sunt extrem de slabe

În molecula de ARN regiunea formată din cele 2 copii poli-GC  o structură în ac-de-păr (hairpin)
care blochează înaintarea ARN pol

ARN pol staţionează

Legăturile de H din regiunea hibridă A ...U sunt instabile transcriptul este expulzat din bucla de transcriere

bucla se închide
şi
ARN polimeraza se deprinde de pe molecula ADN

În acest mod este terminată transcrierea genetică

Se constată deci că, deşi regiunile terminator sunt definite pe molecula ADN, funcţia de terminare a transcrierii o are
transcriptul ARN
Funcţie de gradul de complementaritate intracatenară, la PK au fost descrise două clase de terminatori :

terminatori Rho-independenţi - complementaritatea intracatenară este perfectă

 structura hairpin este stabilă fără intervenţia vreunei proteine
5’– …………………………………………….. – U – U – U – U – U – U – U – 3’
….
G …. C
….
G …. C
G ….
…. C
Structură ac-de-
Structură în ac- păr, cu rol în
de-păr, G ….
…. C
terminarea transcrierii genetice ….
G …. C
….
G …. C
….
G …. C

terminatori Rho-dependenţi - cele două copii poli-GC nu prezintă o complementaritate intracatenară perfectă
structura hairpin este instabilă  stabilizată de proteina Rho
(de la litera grecească ρ)
5’– …………………………………………….. – U – U – U – U – U – U – U – 3’
G ….
…. C
G ….
…. C
Proteina Rho
G ….
…. C
A ….
…. C
G ….
…. C
G ….
…. U
G ….
…. C
TRANSCRIEREA GENETICĂ LA EK
În fiecare celulă EK există cel puţin 3 specii moleculare de ARN pol ce transcriu tipuri diferite de gene
În afară de ARN pol, în transcrierea la EK intervin multe alte proteine denumite factori de transcriere = TF
Factorii generali de transcriere (GTF) funcţionează în majoritatea proceselor de transcriere

Factorii specifici de transcriere (STF) funcţionează doar în transcrierea anumitor gene

ARN polimerazele de la EK În nucleu există 3 specii moleculare de ARN pol, cu structură şi funcţii diferite

Denumire Localizare Produs

ARN pol I (Pol I, Pol A)
ARN pol II (Pol II, Pol B)
ARN pol III (Pol III, Pol C)
nucleol ARN ribozomal - ARNr 28S, 18S, 5,8S
ARN mesager - ARNm
Majoritatea ARN nuclear mic - ARNsn
nucleu
ARN de interferenţă - ARNi
microARN - ARNmi
nucleu şi ARN de transfer – ARNt
interfaţa nucleol ARN ribozomal 5S – ARNr 5S
– nucleu Unele specii moleculare de ARN mic–ARNsn U6, SRP ARN

La plante au fost descrise încă 2 specii moleculare de ARN polimeraze

ARN pol IV, ARN pol V → ARNi
ARN pol I Transcrie toate genele ptr ARNr, cu excepţia genelor ptr ARN 5S
Genele ptr ARNr sunt organizate într-o singură unitate de transcriere
Transcriere policistronică → un singur ARN transcript conţine informaţia de la mai multe gene
ARN precursor este procesat → 3 molecule Arn: ARN 18S, 5,8S, 28S
Transcrierea genelor ptr ARNr are loc în nucleol, unde apoi ARNr este combinat cu proteine ribozomale → ribozomi

ARN pol II Transcrie toate genele ptr ARNm

Transcrie şi unele gene ptr ARNsn, ARNsi şi toate ARNmi
Transcriere monocistronică → un ARN transcript comţine infomaţia de la o singură genă
ARN transcript = ARN pre-mesager → este procesat → ARNm iese prin porii membranei nucleare în citoplasmă

ARN pol III Transcrie toate genele ptr ARNt

Transcrie şi genele ptr ARNr 5S, ARNsn U6, SRP ARN, ARN TER
Toate cele 3 ARN pol de la EK au structură complexă, fiind formate din 14, 12 şi, respectiv, 17 subunităţi, din care
unele sunt similare cu subunităţile ARN pol PK
Structura promotorilor la EK
La EK, promotorii au structură multi-modulară şi sunt regiuni mult mai complexe decât P de la PK

La EK, nu ARN polimerazele recunosc promotorii (P), ci factorii de transcriere (TF) :

mai întâi se ataşează TF la P, iar acest complex este apoi recunoscut de ARN polimeraze

Fiecare din cele 3 ARN polimeraze recunosc TF diferiţi care se ataşează la P cu structură diferită

Factorii de transcriere se notează diferit, funcţie de ARN polimerază :

ARN pol I recunoaşte clasa I = TFI

ARN pol II recunoaşte clasa II = TFII
ARN pol III recunoaşte clasa III = TFIII

Promotorii ptr cele 3 ARN polimeraze diferă nu doar ca structură, ci şi ca localizare faţă de gena de transcris :

- majoritatea promotorilor ptr ARN pol I şi II sunt upstream faţă de situsul start
- promotorii ptr ARN pol III au multe module downstream faţă de start
Structura de bază a unui P ptr ARN pol II
Ptr ca o singură genă să fie transcrisă de ARN pol II, este necesar ca seturi întregi de proteine (factori de transcriere – TFII)
să se ataşeze la multiple regiuni din ADN :
- regiuni de tip promotor
- regiuni cu funcţii reglatorii (enhanceri, silenceri, insulatori) vor fi discutate în alt curs
promotor primar
Majoritatea genelor transcrise de ARN pol II au mai multe regiuni de tip promotor : promotor proximal
promotor distal
Promotorul primar (core promoter) ptr ARN pol II = 80 pb: -40 ... +40
- are structură multi-modulară
- la fiecare modul / regiune se ataşează un factor de transcriere - TF
- majoritatea modulelor sunt upstream, dar există şi unele downstream
- există şi un modul exact peste situsul start

În esenţă, un P primar ptr ARN pol II este format din următoarele regiuni/module :

+1
-33 -25 +5 +15 +30

BRE TATA Inr DCE I DCE II DCE III

upstream downstream
Parte din genele transcrise ARN pol II, au o structură puţin diferită - în loc de modul TATA au DPE

+1
-20 +5 +15 -25 +30

BRE Inr DCE I DCE II DPE DCE III

upstream downstream

P cu TATA P fără TATA

BRE BRE
TATA -
Inr Inr
DCE I, II, III DCE I, II, III
- DPE
 +1
-33 -25 +5 +15 +30

P cu TATA BRE TATA Inr DCE I DCE II DCE III

upstream downstream

+1
-20 +5 +15 -25 +30

P faraTATA BRE Inr DCE I DCE II DPE DCE III

upstream downstream

P cu TATA P fără TATA

BRE BRE
TATA -
Inr Inr
DCE I, II, III DCE I, II, III
- DPE
 +1

BRE TATA Inr DCE I DCE II DPE DCE III

upstream downstream

Situsuri upstream

BRE - TFIIB Recognition Element = octamer (8pb), bogat in GC : GGGCGCCC

TATA - cutia TATA = heptamer (7 pb), bogat in AT: TATA AAA/TAT

Situsul Inr - Initiator: YYCAYYYYY ( Py2CAPy5 ) , Py = orice pirimidină, de obicei A = nucleotidul +1

Situsuri downstream

DCE I/II/III

DPE - Downstream Promoter Element, la P fără TATA

 Situsuri upstream Situsuri downstream

Inr

Pozițiile situsurilor

Secvențele
situsurilor

Variații de
secvență
În afară de P PRIMAR, cu toate regiunile lui, transcrierea genetică la EK
este influenţată şi de alte regiuni ADN:

Promotorul PROXIMAL

- upstream faţă de P primar, la 250 pb de situsul start

- conţine regiuni reglatorii primare
- la acestea se ataşează factori de transcriere specifici

Promotorul DISTAL

- upstream faţă de P primar, la > 250 pb de situsul start

- conţine regiuni reglatorii, dar influenţa este mai slabă decât a P proximal
- la acestea se ataşează tot factori de transcriere specifici
Factorii de transcriere = Transcription Factors = TF
Temă ptr seminar: clase structurale de TF
Sunt proteine cu structură tipică ptr ataşare la ADN
Se notează cu I, II şi III, funcţie de ARN polimeraza pe care o recrutează (ARN pol I, II sau III)

Din punct de vedere funcţional se clasifică în :

Factori de transcriere GENERALI – General Transcription Factors ( GTF ), se ataşează la P primar
Factori de transcriere SPECIFICI – Specific Transcription Factors ( STF ), se ataşează la P proximal şi la cel distal
Factorii generali de transcriere ptr ARN pol II sunt : TBP, TFIIB, TFIID, TFIIA, TFIIF, TFIIE şi TFIIH
GTF
TBP = TATA-binding protein secvența TATA

TFIIB secvența BRE = TFIIB recognition element

TFIID = TAFs = TBP-Associated Factors secvențele Inr, DCE, DPE

TFIID

TFIIB TBP TAF TAF TAF TAF TAF

Doar TFIID şi TFIIB se leagă la molecula ADN (la regiunile specifice din P primar);
restul se leagă la TFIID sau la TFIIB sau la ARN pol II
 TFIID

TFIIB TBP TAF TAF TAF TAF TAF

+1

BRE TATA Inr DCE I DCE II DPE DCE III

upstream downstream
 TFIID

TFIIB TBP TAF TAF TAF TAF TAF

+1

BRE TATA Inr DCE I DCE II DPE DCE III

upstream downstream
Etapele transcrierii genetice la EK Pre-iniţiere, Iniţiere, Elongare, Terminare

Pre-iniţiere
- ataşarea factorilor generali de transcriere GTF la P primar formarea complexului de preiniţiere
- ataşarea GTFs la P primar are loc într-o anumită ordine setul complet de GTF
= ARN pol
- formarea acestui complex începe de la elementul TATA

1. TBP TATA Molecula ADN se îndoaie cu 80o = semnalul ptr ataşarea în cascadă a celorlalte proteine

2. TFIIB BRE TFIIB stabilizează complexul TBP-TATA şi recrutează ARN pol II

3. TFIID TAF Inr

4. TFIID TAF DCE I, II, III

5. TFIIF + ARN pol II TBP TFIIF face legătura dintre TBP ataşat la TATA şi ARN pol

6. TFIIE ARN pol II TFIIE recrutează TFIIH

activitate ATPazică (ptr desfacerea d.h. şi formarea buclei de transcriere)

7. TFIIH ARN pol II TFIIH are
activitate protein kinazică (ptr fosforilarea capătului C al ARN pol II)
Datorită faptului că molecula ADN este complexată cu histone (nucleozomi),
pre-iniţierea / iniţierea transcrierii genetice necesită şi intervenţia altor proteine = complex mediator

Complexul de preiniţiere
TFIID-TBP
TFIIB
TFIID-TAF Formarea buclei de transcriere
ARN pol II
TFIIA, F, E, H

Desfacerea dublului helix ADN Formarea buclei de transcriere

Procesul e mediat de TFIIH cu hidroliză ATP
Iniţiere =
Ataşarea primelor ribonucleotide în transcriptul ARN
Elongarea
- această etapă începe atunci când ARN pol părăseşte promotorul
- la trecerea dintre Iniţiere şi Elongare, factorii de transcriere sunt înlocuiţi cu alte proteine :
FACTORI DE ELONGARE (EF)
TFIIS - are rol în activitatea de proof-reading a ARN pol, similar cu proteina Gre de la PK

SPT5 - are rol în procesivitatea ARN pol II, similar cu sliding clamp
= un EF similar cu NusG de la PK
NusG/SPT5 = singurul TF conservat universal la toate cele 3 domenii – Bacteria, Archaea, Eukarya

Proteine de DEZASAMBLARE / ASAMBLARE a NUCLEOZOMILOR

FACT Facilitates Chromatin Transcription
- dezasamblează nucleozomii în faţa ARN polimerazei II, ptr ca aceasta să poată transcrie
- asamblează nucleozomii în zonele deja transcrise

ARN transcript

FACT

FACT
Proteine de PROCESARE a TRANSCRIPTULUI
Dacă la PK, traducerea ARN transcript începe chiar în timp ce acesta este sintetizat, la EK transcriptul ARN este
procesat înainte de a fi tradus.
I. Un prim mecanism de procesare a transcriptului = adăugarea unei guanine metilate la capul 5’ al ARN = CAPPING
- procesul are loc în timpul fazei de elongare a transcrierii
- enzima care realizează transferul unei guanine metilate = guanilil-transferaza
- această enzimă se ataşează iniţial la domeniul carboxi-terminal al ARN polimerazei,
apoi enzima se ataşează la capul 5’ al transcriptului şi realizează transferul unei G metilate

ARN

II. Cronologic, un al doilea mecanism de procesare a transcriptului = adăugarea cozii poli(A) la capul 3’ al ARN
- procesul are loc la terminarea transcrierii, dar parte din proteinele necesare se ataşează la ARN pol II în faza de elongare
- proteina care se ataşează în faza de elongare = proteina ce taie ARN = PT (Procesare Transcript)

PT = proteina ce taie ARN

PAP = proteina ce adaugă ~ 200 adenine = poli-A-polimerază
 ARN

Ataşarea proteinelor de procesare a transcriptului la ARN pol II în faza de elongare a transcrierii

 Terminarea transcrierii la EK (la genele transcrise de ARN pol II)

La EK, terminarea transcrierii este declanşată de ajungerea ARN pol II în regiunea denumită secvenţă semnal poli-A:
- proteina PT (Procesare Transcript) trece de pe ARN pol II pe transcriptul ARN, în regiunea semnal poli-A de pe acesta
- proteina PT clivează molecula ARN în această regiune
- restul moleculei ARN, ce nu are Met-G la capul 5’, este digerată de o RNază
- bucla de transcriere se închide, ARN pol II se desprinde de pe ADN
PROCESAREA ARN mesager
PK EK

Genă Genă
secvenţă codificatoare secv codif secv necodif secv codif

Transcriere genetică Transcriere genetică

ARN mesager ARN pre-mesager

Traducere genetică Procesare transcript

Proteină ARN mesager

Traducere genetică

Proteină

La EK, transcriptul iniţial este mai întâi procesat :

La PK, traducerea informaţiei genetice a transcriptului
ARN începe chiar înainte de terminarea ARN pre-mesager → ARN mesager
transcrierii
Apoi acesta iese din nucleu spre citoplasmă

În citoplasmă începe traducerea informaţiei genetice

La PK traducerea este cvasi-simultană cu transcrierea La EK, traducerea NU este simultană cu transcrierea

 Etapele procesării transcriptelor pre-mesager

1. CAPPING = adăugarea unei guanine metilate la capul 5’ al ARN - în timpul fazei de elongare a transcrierii

- enzima guanilil-transferaza (GT) transferă o guanină metilată la capul 5’ al ARN

- GT se ataşează iniţial la domeniul carboxi-terminal al ARN polimerazei,
apoi enzima se ataşează la capul 5’ al transcriptului şi realizează transferul unei G metilate

ARN

2. Coada poli-A adăugarea cozii poli(A) la capul 3’ al ARN

- procesul are loc la terminarea transcrierii, dar parte din proteinele necesare se ataşează la ARN pol II în faza de elongare
- proteina care se ataşează în faza de elongare = proteina ce taie ARN = PT (Procesare Transcript)

PT = proteina ce taie ARN

 După ce transcriptul este tăiat de proteina PT,

se ataşează proteina poli-A polimerază (PAP) la capul 3’

PAP = o ARN polimerază specială

PAP adaugă ~ 200 adenine

Pe măsură ce PAP adaugă adenine,

la coada poli-A se ataşează nişte proteine specifice – PABP
(poly-A Binding Protein)
 3. Splicing
La EK, multe gene ce codifică ptr proteine sunt formate din regiuni codificatoare ce alternează cu regiuni necodificatoare
Aceste gene au structură “mozaicată”

regiuni codificatoare = regiuni ADN ce sunt transcrise şi apoi traduse (au echivalent în secvenţa de aminoacizi din proteine)
EXONI

regiuni necodificatoare = regiuni ADN ce sunt transcrise, dar nu sunt traduse

(nu au echivalent în secvenţa de aminoacizi din proteine)
INTRONI

EXON INTRON EXON INTRON EXON

ADN reg. codif. reg. codif. reg. codif. reg. codif. reg. codif.

TRANSCRIERE GENETICĂ

EXON INTRON EXON INTRON EXON

ARN
pre-mesager
SPLICING (eliminarea intronilor)

EXON EXON EXON

ARN mesager

TRADUCERE GENETICĂ

Proteină
Numărul de introni per genă variază de la genă la genă, de la specie la specie

Şi dimensiunea intronilor variază; uneori, intronii sunt chiar mai mari decât exonii
Mecanisme de splicing
Introni grup 1 – self splicing ribozyme
Introni grup 2 – spliceosomi – snRNPs

Secvenţe din ARN pre-mesager implicate în splicing-ul intronilor de grup II

exon intron exon
5’ GU.........................................A(Py)10..............AG
situsul 5’ splice situsul branch situsul 3’ splice
Dpdv biocimic chimic, splicingul se realizează în mai multe etape :
1. Clivaj la situsul 5’ splice
exon 1 3’ 5’ intron exon 2
5’
GU.........................................A(Py)10..............AG 3’
situsul branch situsul 3’ splice
2. Capul 5’ al intronului se ataşează prin transesterificare la A din situsul branch

exon 1 intron lariat exon 2

5’ 3’
A(Py)10 AG 3’

3. Clivaj la situsul 3’ splice

exon 1 3’ intron lariat 3’ 5’ exon 2
5’ 3’
A(Py)10 AG

4. Capul 3’OH al exonului 1 se ataşeaz la capul 5’OH al exonului 2

A(Py)10 AG exon 1 exon 2

5’ 3’
intron lariat
ARN mesager
SPLICEOSOM = complex ribonucleoproteic (RNP) ce realizează eliminarea intronilor din grupul II = 5 RNP
1 proteină
1 RNP = 1 ARN

Cele 5 molecule ARN = ARNsn (small nuclear = nuclear mic, 100-300b): U1, U2, U4, U5, U6

U1 + proteină  U1-snRNP
U2 + proteină  U2-snRNP U1-snRNP
U4 + proteină  U4-snRNP U2-snRNP
U5 + proteină  U5-snRNP
SPLICEOSOM U4-snRNP
U6 + proteină  U6-snRNP U5-snRNP

U6-snRNP
 U5-snRNP

exon 1 U1-snRNP intron U2-snRNP exon 2

5’ GU.........................................A(Py)10..............AG
situsul 5’ splice situsul branch situsul 3’ splice
•RNA Polymerase I and RNA Polymerase III terminate transcription in response to specific termination
sequences in either the DNA being transcribed (RNA Polymerase I) or in the newly-synthesized RNA
(RNA Polymerase III).

•RNA Polymerase II terminates transcription at random locations past the end of the gene being
transcribed. The newly-synthesized RNA is cleaved at a sequence-specified location and released
before transcription terminates.

The termination of transcription is different for the three different eukaryotic RNA polymerases.
The ribosomal rRNA genes transcribed by RNA Polymerase I contain a specific sequence of basepairs (11 bp long in
humans; 18 bp in mice) that is recognized by a termination protein called TTF-1 (Transcription Termination Factor for
RNA Polymerase I.) This protein binds the DNA at its recognition sequence and blocks further transcription, causing
the RNA Polymerase I to disengage from the template DNA strand and to release its newly-synthesized RNA.

The protein-encoding, structural RNA, and regulatory RNA genes transcribed by RNA Polymerse II lack any specific
signals or sequences that direct RNA Polymerase II to terminate at specific locations. RNA Polymerase II can continue
to transcribe RNA anywhere from a few bp to thousands of bp past the actual end of the gene. However, the transcript
is cleaved at an internal site before RNA Polymerase II finishes transcribing. This releases the upstream portion of the
transcript, which will serve as the initial RNA prior to further processing (the pre-mRNA in the case of protein-
encoding genes.) This cleavage site is considered the "end" of the gene. The remainder of the transcript is digested by
a 5'-exonuclease (called Xrn2 in humans) while it is still being transcribed by the RNA Polymerase II. When the 5'-
exonulease "catches up" to RNA Polymerase II by digesting away all the overhanging RNA, it helps disengage the
polymerase from its DNA template strand, finally terminating that round of transcription.
In the case of protein-encoding genes, the cleavage site which determines the "end" of the emerging pre-mRNA
occurs between an upstream AAUAAA sequence and a downstream GU-rich sequence separated by about 40-60
nucleotides in the emerging RNA. Once both of these sequences have been transcribed, a protein called CPSF in
humans binds the AAUAAA sequence and a protein called CstF in humans binds the GU-rich sequence. These two
proteins form the base of a complicated protein complex that forms in this region before CPSF cleaves the nascent
pre-mRNA at a site 10-30 nucleotides downstream from the AAUAAA site. The Poly(A) Polymerase enzymewhich
catalyzes the addition of a 3' poly-A tail on the pre-mRNA is part of the complex that forms with CPSF and CstF.
Transcription termination by RNA Polymerase II on a protein-encoding gene.
RNA Polymerase II has no specific signals that terminate its transcription. In the case of protein-encoding genes, a protein
complex will bind to two locations on the growing pre-mRNA once the RNA Polymerase has transcribed past the end of
the gene. CPSF in the complex will bind a AAUAAA sequence, and CstF in the complex will bind a GU-rich sequence (top
figure). CPSF in the complex will cleave the pre-mRNA at a site between the two bound sequences, releasing the pre-
mRNA (middle figure). Poly(A) Polymerase is a part of the same complex and will begin to add a poly-A tail to the pre-
mRNA. At the same time, Xrn2 protein, which is an exonuclease, attacks the 5' end of the RNA strand still associated with
the RNA Polymerase. Xrn2 will start digesting the non-released portion of the newly synthesized RNA until Xrn2 reaches
the RNA Polymerase, where it aids in displacing the RNA Polymerase from the template DNA strand. This terminates
transcription at some random location downstream from the true end of the gene (bottom figure).
The tRNA, 5S rRNA, and structural RNAs genes

The tRNA, 5S rRNA, and structural RNAs genes transcribed by RNA Polymerase III have a not-entirely-
understood termination signal. The RNAs transcribed by RNA Polymerase III have a short stretch of four to
seven U's at their 3' end. This somehow triggers RNA Polymerase III to both release the nascent RNA and
disengage from the template DNA strand.
TRADUCEREA INFORMAŢIEI GENETICE
Traducerea informaţiei genetice = complexul proceselor biochimice prin care informaţia genetică reprezentată de
secvenţa de nucleotide din ARN mesager este tradusă în secvenţă de
aminoacizi în proteine

transcriere traducere
ADN ARNm Proteine

Rezultatul transcrierii = ARN transcript primar

Rezultatul procesării transcriptului primar (la EK) = ARN mesager (matur)
Rezultatul traducerii = proteine

La traducerea informaţiei genetice participă mai multe tipuri de molecule :

ARNm - conţine informaţia genetică ce trebuie tradusă

ARNt = ARN de transfer, aduce aminoacizi la locul biosintezei proteice

ribozomi
= organite celulare, formate din ARNr şi proteine ribozomale, mediază sinteza proteinelor
 ARNm
Doar o porţiune din secvenţa ARNm este decodificată în secvenţă de aminoacizi
Informaţia în ARNm este tradusă începând de la capul 5’  3’, în seturi de câte 3 nucleotide = CODON
Deşi procesul de traducere a informaţiei genetice este similar la PK şi EK, există diferenţe în structura moleculelor de ARNm

PK
Multe molecule ARNm sunt policistronice (conţin informaţie de la mai multe gene)
Pentru fiecare secvenţă codificatoare (genă), ARNm de la PK conţine câte o secvenţă RBS, la care se
ataşează câte un ribozom, fiecare secvenţă codificatoare fiind tradusă separat.
RBS = ribosome-binding site = secvenţă Shine-Dalgarno
- este complementară cu o secvenţă din ARNr 16S

EK
Majoritatea moleculelor ARNm sunt monocistronice (conţin informaţie de la o singură genă)

La moleculele ARNm de la EK nu există secvenţă SD,

ribozomul se ataşează la capul Met-G-5’
 Coadă
Cap Secvenţă codificatoare
Met-G 5’ UTR Start Stop 3’ UTR poli-A

5’ 3’
Structura tipică a unui ARNm uman
( UTR = Untranslated Region = regiune netradusă )
Codul genetic
Legătura logică între secvenţa de nucleotide din ARNm şi secvenţa de aminoacizi din proteine
Codon = set de 3 nucleotide din ARNm ce sunt traduse într-un AA
Caracteristicile codului genetic
1. Codonii sunt citiţi în direcţie 5’  3’

2. Codul genetic este nesuprapus

Codonii din ARNm sunt citiţi la succesiv, nu au nucleotide comune

3. Codul genetic nu are semne de punctuaţie

- Informaţia din ARNm (secvenţa de nucleotide) este citită continuu
- Nu există nucleotide care să semnifice pază, punct, virgulă etc

4. Codul genetic este universal

- Acelaşi codon codifică un acelaşi AA la toate organismele

Excepţii: în mitocondrii (UGA = Trp), în anumite microorganisme PK, EK

5. Codul genetic este degenerat

Mai mulţi codoni pot codifica acelaşi AA

Codoni START / STOP

UAG, UGA, UAA = codoni STOP
AUG = cel mai frecvent codon START = Met (EK) / fMet (PK) (codoni nonsens)

La anumite organisme GUG / UUG = START

ARNt = molecule adaptor între codoni şi AA

- Molecule mici: 70-100 b

- Au 22 n în anumite poziţii (poziţii fixe), ce nu variază la majoritatea ARNt cunoscute

- Conţine o serie de baze modificate: dihidro-uridina (DHU)

ribosil-timina (rT) = 5-metil-uridină (U metilat)
pseudo-uridina (Ψ)
inosina (I) = G dezaminata
- Toate moleculele ARNt au la capul 3’ secvenţa de nucleotide CCA = Capul acceptor (capul CCA)

- Structura secundară a moleculelor de ARNt = Frunză de trifoi

3 bucle m.c.: bucla D - are 2 DHU în poziţii fixe

bucla Ψ - are 1 Ψ în poziţie fixă
bucla anticodonului - nucleotidele din poziţiile 34, 35, 36 = Anticodon
4 regiuni d.c. = braţe
1 buclă variabilă, adiţională, de dimensiune mică
- Structura terţiară a moleculelor de ARNt = Litera L întoarsă
 Fiecare moleculă ARNt ataşează covalent la capul CCA-3’ un AA

Reacţia de încărcare a unui AA la o moleculă de ARNt = aminoacilare aminoacil-ARNt-sintetaze (AAS)

1. AA + ATP Aminoacil-AMP + PPi

2. Aminoacil-AMP + ARNt Aminoacil-ARNt + AMP

Funcţionarea moleculelor ARNt ca adaptor întrer codoni şi AA, se bazează în primul rând pe faptul că fiecare
specie moleculară de ARNt ataşează un anumit AA
- Există câte 1 specie moleculară de AAS (şi, de regulă, numai una) ptr fiecare AA
- Fiecare specie moleculară de AAS are o asemenea conformaţie moleculară, încât poate lega un singur tip de AA
doar cu anumite tipuri de ARNt

Fidelitatea traducerii informaţiei genetice se bazează pe :

- aminoacilarea corectă a unui ARNt
- împerecherea corectă codon – anticodon
Etapele traducerii genetice

Iniţierea

- Ataşarea subunităţii ribozomale mici (30S) la secvenţa SD din ARNm

- Codonul AUG este adus în situsul P al subunităţii rbz mici

- Se ataşează fMet-ARNtMet şi se codonul AUG din ARNm cu anticodonul CAU din ARNtMet

- Aceste etape sunt coordonate de 3 factori de iniţiere – IF1, IF2, IF3

- Se ataşează subunitatea rbz mare (50S)

- După ataşarea subunităţii 50S, cei 3 IF se desprind

- Sinteza lanţului peptidic începe de la capul NH2

Factori (proteine) de iniţiere

IF1, IF2, IF3
Elongarea
- Traducerea informaţiei de pe ARNm se face în direcţia 5’  3’
- Adiţia fiecărui AA se realizează prin reacţii complexe ce se repetă ptr fiecare AA

- AA2-ARNt  situsul A

- Se împerechează codonul din ARNm cu anticodonul din ARNt

- Atac nucleofilic al NH2 din AA2 asupra COOH din fMet Formarea primei legături peptidice
(peptidil-transferază prezentă în 50S)
- Rezultă un peptidil-ARNt: aMet-AA2-ARNt

- Rbz se deplasează pe molecula ARNm cu un codon

- peptidil-ARNt sare din situsul A în situsul P Situsul A este acum liber pentru ataşarea unui AA3-ARNt

Factori (proteine) de elongare

EF-Ts, EF-Tu, EF-G
Terminarea

- Codonii STOP: UAG, UGA, UAA

- După ataşarea ultimului AA, peptidil-ARNt este in situsul A al rbz

Factori (proteine) de terminare
- peptidil-ARNt este translocat din situsul A în situsul P
RF1, RF2, RF3
- Legătura dintre peptidil şi ARNt este hidrolizată

- Sunt eliberaţi: Catena peptidică

Ultimul ARNt

- Ribozomul se disociază de ARNm, apoi 70S  50S + 30S

Proteinele sunt sintetizate numai în direcţie N  C

Ribozomii se deplasează pe ARNm începând cu capul 5’ al acestuia
Fiecare ribozom sintetizează un singur polipeptid
(pe moleculele ARNm policistronic se ataşează mai mulţi ribozomi)
Alfabet grecesc

Literă mare Literă mică Se citeşte Literă mare Literă mică Se citeşte

Α α alfa Ν ν niu

Β β beta Ξ ξ ksi

Γ γ gama Ο ο omicron

∆ δ delta Π π pi

Ε ε epsilon Ρ ρ rho (ro)

Ζ ζ zeta Σ σ sigma

Η η eta Τ τ tau

Θ θ theta Υ υ ipsilon

Ι ι iota Φ φ phi (fi)

Κ κ kappa Χ χ chi (hi)

Λ λ lambda Ψ ψ psi

Μ µ miu Ω ω omega