ANALIZA CARIOTIPULUI UMAN

Analiza cariotipului este indispensabilă şi obligatorie pentru

diagnosticul sindroamelor cromozomiale.
Conform primei definiţii, propusă la conferinţa internaţională pentru
studiul cromozomilor umani de la Denver (1960), cariotipul reprezintă
“aranjarea sistematică a cromozomilor unei singure celule, preparaţi
prin desenare sau fotografiere, în înţelesul lărgit conform căruia
cromozomii unei celule pot reprezenta cromozomii unui individ sau
chiar ai unei specii”.
În prezent este general acceptată definiţia propusă de D.T. Hughes
(1966): “Prin cariotip se înţelege o aranjare sistematizată a
cromozomilor unei celule mitotice sau meiotice, implicând
numărul, forma, mărimea, sau orice altă caracteristică care poate
fi reprezentativă pentru complementul cromozomial al unei
varietăţi celulare, individ sau specie”.
Faza mitozei în care este posibilă numărarea şi identificarea
cu uşurinţă a cromozomilor este metafaza, când aceştia ating
maximum de contractare şi de colorabilitate.

Metafaza mitotică este aşadar singurul stadiu al diviziunii

celulare în care lungimea cromozomilor este constantă pentru o
pereche de cromozomi dată, oferind posibilitatea studiilor
citogenetice comparative.
Principalii parametri utilizaţi în mod curent pentru identificarea
cromozomilor sunt:
 
Lungimea fiecărui cromozom raportată la lungimea totală a
complementului haploid normal.

Raportul braţelor cromozomiale (lungime braţ lung / lungime

braţ scurt).

Indexul centromeric, exprimat prin raportul procentual dintre

braţul scurt şi lungimea totală a cromozomului (lungime braţ
scurt / lungime totală cromozom x 100).
Alcătuirea cariotipului
 
Definirea poziţiei centromerului şi a tipurilor morfologice de
cromozomi care rezultă din localizarea sa, reprezintă o condiţie
primară pentru realizarea unui cariotip.
Poziţia centromerului, una dintre caracteristicile cele mai
constante ale cromozomilor, poate fi exprimată prin relaţiile:

d = l – s; sau r = l / s
în care:
 
l = lungimea braţului lung;
s = lungimea braţului scurt;
d = diferenţa dintre braţul lung şi braţul scurt;
r = raportul dintre braţe.
În raport de localizarea centromerului, conform nomenclaturii
standardizate propusă de Levan şi colab. (1964), cromozomii
umani se încadrează în unul dintre următoarele trei tipuri:

(1) metacentrici (cu centromerul în regiunea mediană

şi raportul braţelor cuprins între 1.0 şi 1.70);

(2) submetacentrici (cu centromerul în regiunea

submediană şi raportul braţelor cuprins între 1.71 şi 3.0);

(3) acrocentrici (cu centromerul în regiunea terminală

şi raportul braţelor cuprins între 7.01 şi )
Alcătuirea cariotipului se realizează în trei etape:
 
1) Alegerea metafazelor
 
2) Studiul cromozomilor
 
3) Fotografierea metafazelor şi prelucrarea fotografiilor
pentru alcătuirea cariotipului.
Alegerea metafazelor

Dintre zecile sau sutele de metafaze observate într-un preparat,

trebuie alese metafazele îndeplinesc două cerinţe de bază:

să nu prezinte cromozomi suprapuşi, sau numărul celor

suprapuşi să nu fie mai mare de 1-2 (această excepţie se
admite în cazul speciilor cu număr mare de cromozomi);

celulele să nu fie sparte, sau (dacă sunt sparte) cromozomii să

nu fie împrăştiaţi pe o suprafaţă foarte mare, caz în care este
dificil de stabilit dacă ei aparţin unei singure celule.
Studiul cromozomilor

Are ca scop principal determinarea numărului de cromozomi şi

identificarea cromozomilor pe baza morfologiei lor şi a modelului
de benzi cromozomiale (cel mai adesea benzi G).

Numărarea se poate face direct prin observarea la microscop a

plăcilor metafazice, sau după fotografierea metafazelor.
Fotografierea metafazelor şi prelucrarea fotografiilor
pentru alcătuirea cariotipului.

Interpretarea corectă a cariotipului unui pacient depinde în

mare măsură de calitatea fotografiilor reprezentând plăci
metafazice.
Se recomandă ca numărul metafazelor fotografiate să fie de
minim 10% din numărul celor examinate microscopic.
Se fotografiază numai metafazele clare, în care sunt vizibili în
acelaşi plan toţi cromozomii, iar suprapunerile lipsesc sau sunt
foarte puţine.
Existenţa mai multor linii/clone celulare (mozaic cromozomial)
impune analiza unui număr mai mare de metafaze (minimum
30) pentru aprecierea cât mai corectă a procentajului fiecărei
linii.
 Primul criteriu de aranjare a cromozomilor în cariotip este cel al
lungimii totale. Cromozomii se aranjează în ordinea descrescătoare
a lungimii, măsurate de-a lungul axelor individuale ale ambelor
cromatide, incluzând în măsurătoare regiunea centromerică, dar
exceptând sateliţii.
 Al doilea criteriu al aranjării cromozomilor în cariotip este acela al
morfologiei lor. Cromozomii sunt dispuşi pe grupe morfologice
(notate cu litere mari, în ordine alfabetică), fiecare grupă incluzând
două sau mai multe perechi de cromozomi care sunt greu sau
imposibil de identificat prin mijloacele obişnuite ale analizei
citogenetice.
 Al treilea criteriu este acela al omologiei cromozomilor. Plecând de
la premisa că omologia morfologică constituie reflectarea omologiei
genetice, cromozomii cu aceeaşi morfologie sunt dispuşi în perechi.
Aranjarea cromozomilor în perechi se face pe baza a doi parametri
de importanţă majoră: lungimea şi raportul braţelor.
Identificarea cromozomilor omologi este facilitată
considerabil de folosirea tehnicilor de bandare. Deoarece
fiecare pereche de cromozomi prezintă un model
caracteristic de benzi, care ocupă aceeaşi poziţie, au aceeaşi
grosime şi aceeaşi intensitate a fluorescenţei (benzile Q) sau
de colorare (benzile G), împerecherea cromozomilor pe baza
identităţii modelului de benzi exclude sau reduce la maxim
erorile de alcătuire a cariotipului.
Analiza cariotipului este folosită pe o scară tot mai extinsă
pentru evidenţierea aberaţiilor numerice şi structurale, atât a
celor constituţionale (cele cu care un individ se naşte), cât şi
a celor dobândite (cele care apar ca modificări secundare
asociate cu diferite maladii, cum ar fi cancerul).

Caracterizarea cariotipului individual (al unui pacient) se face

frecvent prin compararea idiogramei “construite” pentru
acesta, cu idiograma standard. O analiză citogenetică
completă implică compararea “bandă cu bandă” a fiecărui
cromozom cu omologul lui.
Pentru alcătuirea şi studiul cariotipului se pot folosi programe
(PC software) pentru preluarea imaginilor microscopice cu o
cameră foto digitală, stocarea imaginilor, detectarea
automată a metafazelor, identificarea cromozomilor,
separarea cromozomilor încrucişaţi sau suprapuşi,
împerecherea lor, analiza numerică şi structurală (de
exemplu, VideoTest Karyo 3.1 sau BioView’s Karyotyping).
Cariotipul uman normal
 
Cariotipul uman normal este reprezentat prin 7 grupe distincte de
autozomi şi o pereche de heterozomi (XX la femei şi XY la bărbaţi).
În cele 7 grupe, notate cu litere de la A la G, cromozomii sunt
aranjaţi după mărime, în ordine descrescătoare.
Pe baza caracteristicilor lor morfologice şi în conformitate cu
hotărârea adoptată în anul 1971 la Conferinţa Internaţională pentru
Standardizarea Nomenclaturii Cromozomilor Umani, cromozomul X
este inclus în grupul C alături de perechile 6-12 de autozomi, iar
cromozomul Y este inclus în grupul G alături de perechile de
autozomi 21 şi 22.
Cromozomii care alcătuiesc cariotipul uman se încadrează, prin
morfologia lor, în trei tipuri: metacentric (perechile 1, 2, 3, 6, 7, 8,
11, 16, 17, 18, 19, 20), submetacentric (perechile 4, 5, 9, 10, 12 şi
cromozomul X) şi acrocentric (perechile 13, 14, 15, 21, 22 şi Y).
Pentru descrierea cromozomilor umani şi caracterizarea cariotipului
se folosesc simbolurile şi codificarea propuse şi acceptate
internaţional la Conferinţele de la Chicago (1966) şi Paris (1971).

Principalele simboluri şi codificări utilizate în analiza citogenetică

umană sunt următoarele:
 
A–G grupul de cromozomi
1 – 22 numărul perechii de cromozomi
X, Y cromozomii sexului
/ separă liniile celulare la descrierea mozaicismelor
? indică o identificare discutabilă a cromozomului sau
structurii cromozomiale
+ sau – aşezat după numărul perechii de cromozomi sau după
litera care desemnează grupa de cromozomi, indică
absenţa acelui cromozom sau prezenţa sa în plus
→ de la – la
„:„ ruptură fără reunire
„ :: „ ruptură şi reunire
ace acentric
arr detectat prin folosirea array-CGH
cen centromer
chi himeră (genetică)
del deleţie
der cromozom derivativ
dic cromozom dicentric
dn de novo
end endoreduplicaţie
fra situs fragil
h constricţie secundară sau regiune cu coloraţie
negativă
i izocromozom
ins inserţie
inv inversie
ins inserţie
ish detectat prin utilizarea FISH
mar cromozom marker
mat cromozom de origine maternă
mos mozaic cromozomial
pat cromozom de origine paternă
p braţul scurt al cromozomului
q braţul lung al cromozomului
r cromozom inelar
rcp translocaţie reciprocă
rec cromozom recombinat
rob translocaţie robertsoniană
t translocaţie
tan translocaţie în tandem
ter terminal sau capăt
(pter = capătul braţului scurt, qter = capătul
braţului lung)
tri cromozom tricentric
sa satelit
st constricţie secundară