DIAGNOSTICUL MOLECULAR

AL BOLILOR GENETICE
UMANE
Metode utilizate pentru diagnosticul molecular
al bolilor genetice umane

• Southern blotting
• Hibridizarea in situ cu fluorescență (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH)
• Hibridizarea genomică comparativă (Comparative Genomic Hybridization –
CGH)
• Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție (Restriction Fragment Length
Polymorphism – RFLP)
• Reacția de polimerizare în lanț (Polymerase Chain Reaction – PCR)
• Sistemul de amplificare refractară a mutațiilor (Amplification-Refractory Mutation
System – ARMS)
• ARMS-PCR
• Analiza migrării heteroduplexurilor
• Analiza polimorfismului conformațional al monocatenelor (Single-strand
Conformational Polymorphism Analysis – SCPA)
• Electroforeza în gel cu gradient de denaturare (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis – DGGE)
• Analiza denaturării prin cromatografie de înaltă performanță (Denaturing High
Performance Liquid Chromatography – DHPLC)
Indicații ale diagnosticului molecular

• Boli monogenice (cauzate de mutații într-o singură genă)

• Anomalii cromozomiale (numerice și structurale)
• Boli cu determinism multifactorial
• Cancere
• Boli cauzate de mutații ale ADN mitocondrial
 Principiile tehnicilor
de diagnostic molecular
În ultimii ani au fost imaginate numeroase metode de diagnostic
molecular, fiecare având propriile avantaje, dezavantaje şi limitări.
În marea lor majoritate, ele se adresează în mod specific unui
anumit tip de leziuni ale ADN şi, de aceea, decelarea modificărilor
patologice ale materialului genetic presupune, cel mai adesea,
utilizarea conjugată a mai multor tehnici / metodologii.
Recursul la diagnosticul ADN, interpretarea rezultatelor şi
evaluarea corectă a gradului de confidenţă a acestora impune,
aşadar, cunoaşterea exactă a principiului şi a potenţialului fiecăreia
din tehnicile moleculare intrate în uzul curent al medicinii, întrucât
metodele de analiză a structurii şi expresiei genice folosite în scop
diagnostic combină – de regulă – proceduri făcând parte din două
sau mai multe dintre principalele tehnologii ale ADN recombinat –
şi anume:
 hibridizarea acizilor nucleici,
 fragmentarea şi separarea moleculelor de ADN,
 amplificarea şi secvenţierea fragmentelor.
Hibridizarea acizilor nucleici
O proprietate naturală a moleculelor de acizi nucleici (ADN și ARN),
exploatată în investigaţiile moleculare, este aceea a capacităţii de hibridizare.
ADN extras din celule se află în forma sa nativă, dublu catenară. Încălzirea în
soluţie apoasă la o temperatură apropiată de 100°C sau expunerea la valori
înalte de pH (>13) determină desfacerea legăturilor de hidrogen dintre
nucleotidele complementare, urmată de separarea celor două catene
(denaturare). Procesul invers (renaturare) se produce spontan în condiţiile
răcirii lente până la temperatura de 65°C. Renaturarea nu depinde de sursa
catenelor prezente în soluţie, ci numai de gradul lor de complementaritate
(omologie). De aceea, introducerea deliberată în mediul de renaturare a unor
catene ADN sau ARN provenind din surse diferite va fi urmată de formarea de
heteroduplexuri ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN.

Stabilitatea heteroduplexurilor este direct proporţională cu gradul de omologie

a secvenţelor: omologia perfectă conferă stabilitate maximă.

Asocierea pe baza complementarităţii a unor secvenţe nucleotidice diferite ca

origine se numeşte hibridizare.
Monocatenelor ADN sau ARN introduse deliberat în mediul de renaturare li
se poate ataşa sau încorpora un marker. În această situaţie ele capătă
denumirea de sonde.
Lungimea sondelor variază între 14 şi câteva mii de nucleotide. Marcarea
sondelor poate fi realizată izotopic (prin încorporare de 32P, 35S, 125I, 3H), sau
nonizotopic (prin incorporare de biotină sau digoxigenină).
Detectarea marcajului radioactiv se face, de regulă, autoradiografic;
vizualizarea marcajului non-izotopic comportă cuplarea sondei cu un agent
decelabil prin metoda fluorescenţei sau prin colorimetrie.
Sensibilitatea şi selectivitatea reacţiilor de hibridizare sunt deosebit de înalte.
O sondă îşi poate recunoaşte ţinta chiar dacă aceasta se află în amestec cu
alte 10.000 de secvenţe diferite, sau dacă, într-o celulă, ţinta este prezentă în
doar un singur exemplar. Prin ajustarea corespunzătoare a condiţiilor de
hibridizare, o sondă poate fi făcută să se asocieze stabil cu ţinta ei numai dacă
între secvenţe există o corespondenţă perfectă; diferenţele la nivelul unui
singur nucleotid sunt în măsură să determine eşecul hibridizării.
 Aplicațiile hibridizării
în diagnosticul molecular
Hibridizarea sondelor oligonucleotidice specifice alelelor
(allele specific oligonucleotide – ASO ).

ASO reprezintă o metodă puternică de diagnostic al bolilor

monogenice produse de mutaţii a căror bază moleculară este
cunoscută.
Metoda utilizează ca sonde două sau mai multe oligonucleotide
sintetice (cu lungime de 15-20 de baze), dintre care unul
corespunde (în sensul complementarităţii bazelor) secvenţei
genice normale, iar celelalte – secvenţelor alterate mutaţional.
Nucleotidul prin care diferă sondele este plasat în porţiunea lor
mediană. În condiţii de stringenţă maximă, hibridizarea se
produce exclusiv între secvenţele (de nucleotide) perfect
omoloage.
Hibridizarea cu sonda specifică alelei patologice (cauzatoare a
bolii) este confirmatorie pentru diagnostic.
Hibridizarea in situ.

Este o tehnică moleculară în care, după hibridizarea cu secvenţele specifice

din moleculele ADN sau ARN, sondele marcate cu fluorocromi sunt
vizualizate direct pe preparatele celulare sau cromozomiale.
Cea mai cunoscută tehnică de hibridizare in situ este FISH (fluorescence
in situ hybridization).
FISH este o tehnică de citogenetică moleculară relativ simplă şi nu foarte
costisitoare, care poate fi aplicată pe preparate arhivate, timpul de procesare
şi analiză este scurt şi – foarte important – nu alterează morfologia celulelor.
În plus, tehnica FISH poate fi folosită în conjuncţie cu tehnicile de
imunofenotipare şi cu citometria în flux (combinaţie numită FICTION),
cu rezultate foarte bune în diagnosticul bolilor neoplazice.
Tehnicile FISH îşi găsesc un câmp larg de aplicabilitate. Ele sunt utilizate,
printre altele, la detectarea deleţiilor cromozomiale submicroscopice.
Pierderile de material genetic răspunzătoare de producerea unora dintre
sindroamele de microdeleţie cromozomială au fost detectate pentru prima
dată prin metoda FISH. Astfel, lipsa semnalului fluorescent la nivelul
regiunii proximale a braţului lung al unuia dintre cromozomii 15 a fost
asociată cu sindroamele Prader-Willi şi Angelman. Similar, lipsa semnalelor
în regiunile 22q11 şi 11p13, denotând pierderi submicroscopice de material
genetic, a fost asociată cu apariţia sindroamelor velo-cardio-facial, DiGeorge
şi respectiv tumora Wilms.
În prezent, FISH este tehnica de citogenetică moleculară utilizată în
mod obișnuit pentru diagnosticul sindroamelor de deleție / microdeleție
cromozomială.
Tehnica FISH prezintă o importanţă specială pentru investigarea aspectelor
moleculare ale neoplaziilor, deoarece ea s-a dovedit a fi în măsură să
contribuie substanţial la: stabilirea localizării genomice şi la analiza
activităţii genelor implicate în patogeneza cancerului; detectarea anomaliilor
cromozomiale numerice şi structurale în celulele interfazice.
Fragmentarea ADN cu enzime de restricţie

Enzimele de restricţie (ER) sunt endonucleaze bacteriene care scindează

moleculele ADN la nivelul unor zone strict specifice, generând fragmente de
lungimi variate; acestea sunt denumite fragmente de restricţie (FR).
O caracteristică esenţială a enzimelor de restricţie o constituie specificitatea
acţiunii lor: o enzimă de restricție îşi exercită activitatea endonucleazică
numai asupra unei anumite secvenţe nucleotidice (a cărei lungime este
cuprinsă între 4-8 p.b.) şi care este denumită situs de recunoaştere sau situs
de restricţie (SR).
Tehnica digestiei cu ER face posibilă izolarea oricărei regiuni genomice.
În prezent sunt disponibile câteva sute de ER care pot fi utilizate în diferite
combinaţii pentru obţinerea fragmentului dorit. Lungimea şi implicit
numărul fragmentelor depind în mare măsură de dimensiunile situsului de
restricţie: cu cât acesta este mai mic, cu atât frecvenţa lui în genom va fi mai
mare.
Separarea şi identificarea fragmentelor de restricţie

Tehnica Southern blotting

Cele câteva zeci sau sute de mii de fragmente de restricţie care rezultă din
digestia cu ER a genomului uman (de exemplu, enzima EcoRI generează peste
700.000 de FR) pot fi separate prin metoda electroforezei în gel. Moleculele
ADN au o încărcătură electrică negativă, datorită grupărilor fosfat din scheletul
glucidofosforic; ca atare, ele vor migra către anod, rata deplasării fiind invers
proporţională cu greutatea lor moleculară.
Analiza structurii şi conţinutului genetic al fragmentelor rezultate prin digestie
cu ER se realizează prin metoda marcării radioactive a ADN, cunoscută sub
numele de Southern blotting. Se procedează la denaturarea chimică a
fragmentelor ADN incluse în gel, după care monocatenele sunt transferate prin
capilaritate pe o membrană de nailon sau de nitroceluloză (blotting – pătare,
amprentare); se obţine atfel o replică a modelului de benzi din gelul de agaroză.
Moleculele ADN de pe membrană sunt expuse unor sonde ADN sau ARN
marcate radioactiv, complementare cu secvenţa urmărită. Sondele vor forma
complexe dublu-catenare stabile în zonele membranei în care se află secvenţele
omologe. Sediul hibridizării e detectat autoradiografic.
Aplicațiile tehnicii Southern blot

 Identificarea (detectarea) delețiilor și inserțiilor;

 Identificarea (detectarea) mutațiilor punctiforme și a polimorfismelor
mononucleotidice (single nucleotide polymorphisms - SNPs);
 Identificarea (detectarea) rearanjărilor structurale;
 Determinarea greutăților moleculare ale fragmentelor de restricție;
 Confirmarea prezenței unei anumite secvențe de nucleotide într-o
probă de ADN.
Unul dintre domeniile de aplicaţie clinică a analizei Southern blotting este
cel al diagnosticului ADN direct al bolilor produse prin rearanjări şi deleţii
genetice ample. Diagnosticul direct e condiţionat de disponibilitatea
sondelor specifice sau, altfel spus, este posibil numai în situaţii în care alela
normală a genei a fost identificată şi clonată.

Importanţa majoră pentru medicină a analizei Southern blotting rezultă din

capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii fragmentelor de restricţie
şi prin aceasta, de a funcţiona ca instrument de diagnostic ADN indirect.