IZOLAREA DE ADN

GENOMIC UMAN
Extracția de ADN uman din sânge total
• Limfocitele din sângele total sunt separate prin lizarea celulelor sanguine roșii
utilizând un tampon hipotonic (bicarbonat de amoniu și clorură de amoniu)
cu efect de lizare minim asupra limfocitelor. Pentru aceasta, într-un tub
Eppendorf, la proba de sânge total se adaugă trei volume de tampon de liză
pentru celulele sanguine roșii și se amestecă energic prin vortexare și
răsturnarea repetată a tubului, timp de 5 minute.
• Se centrifughează timp de 10 minute la 20.000 rpm.
• Se îndepărtează supernatantul, se adaugă (la sediment) 3 volume de tampon
de liză pentru celulele sanguine roșii, se vortexează și se centrifughează din
nou timp de 10 minute la 20.000 rpm. Această operație se poate repeta de 2-3
ori, până se obține un supernatant clar și un sediment alb curat.
• Se varsă tot supernatantul, iar sedimentul este resuspendat în 500 μl de soluție
salină de tampon fosfat (PBS), după care se adaugă 400 μl de tampon de liză
celulară [Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 50 mM, SDS 10%, pH 7.5]
și 10 μl de proteinază K (din soluție stoc 10 mg/ml).
• Proba este vortexată pentru dizolvarea completă a sedimentului și incubată
timp de 2 ore la temperatura de 56°C, într-o baie de apă, pentru liză.
• Se adaugă un volum egal de fenol (echilibrat cu Tris, pH 8) și se amestecă
bine prin răsturnarea repetată a tubului timp de 1 minut.
• Se centrifughează tubul la 10.000 rpm, timp de 10 minute, la temperatura de
4°C, după care supernatantul este transferat într-un alt tub (steril), în care se
adaugă volume egale (1 : 1) de fenol și cloroform : alcool izoamilic (24 : 1).
• Se amestecă conținutul tubului Eppendorf prin răsturnarea repetată timp de
1 minut, și apoi se centrifughează timp de 10 minute la 10.000 rpm (la 4°C).
• Se transferă supernatantul în alt tub (steril), se adaugă 10 μl dintr-o soluție de
RN-ază 10 mg/ml, și se incubează timp de 30 minute la temperatura de 37°C.
• Se adaugă un volum egal de cloroform și alcool izoamilic (24 : 1), se
amestecă prin răsturnarea repetată a tubului timp de 1 minut și se
centrifughează la 10.000 rpm, timp de 10 minute, la temperatura de 4°C.
• Se transferă supernatantul în alt tub, se adaugă un volum dublu de alcool etilic
absolut și se amestecă ușor prin răsturnarea de câteva ori a tubului, după care
se răcește la -20°C și se centrifughează timp de 20 minute la 10.000 rpm
(4°C).
• Se decantează supernatantul și se adaugă 250 μl de alcool etilic 70%, pentru
dizolvarea sedimentului.
• Se centrifughează timp de 10 minute la 10.000 rpm, iar supernatantul este
decantat ușor.
• Sedimentul este uscat la aer într-o hotă cu flux laminar de aer steril, iar apoi
sedimentul uscat este resuspendat în 50 μl de tampon TE (amestec de 1 x 10
mM Tris-HCl și 1 mM EDTA), pH 7.6, și răcit la -20°C sau -80°C (pentru
stocare).
Extracția de ADN uman din celule din mucoasa bucală

• Probele de mucoasă bucală sunt suspendate într-un tub Eppendorf în 500

μl de tampon de liză [Tris 10 mM (pH 8.0), EDTA 10 mM, SDS 2.0%]
și 50 μl SDS 10%, după care sunt tratate cu 5-10 μl de proteinază K 20
mg/ml.
• Probele sunt incubate 1-3 ore la 56°C, după care ADN este extras cu un
volum egal de soluție de fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1)
prin amestecarea ușoară și răsturnarea repetată a tubului, timp de 3
minute.
• Probele sunt centrifugate timp de 10 minute la 10.000 rpm și la
temperatura de 4°C, după care supernatantul este transferat într-un alt
tub Eppendorf (steril).
• Se adaugă 10 μl dintr-o soluție de RN-ază 10 mg/ml, și se incubează
timp de 30 minute la temperatura de 37°C.
• Se completează până la 1.5 ml cu un amestec în volume egale de
cloroform și alcool izoamilic și se centrifughează din nou la 10.000 rpm,
timp de 10 minute, la temperatura de 4°C.
• Se transferă supernatantul într-un tub steril de microcentrifugă, se adaugă
un volum dublu de alcool izopropilic răcit și 1/10 volum de acetat de
sodiu 3 M, și se răcește la -20°C, timp de 1 oră, pentru precipitare.
• După o oră, proba este centrifugată la 10.000 rpm timp de 10 minute.
• După decantarea supernatantului, se adaugă 250 μl de alcool etilic 70%,
pentru dizolvarea sedimentului. Amestecul este centrifugat apoi timp de
10 minute la 10.000 rpm, iar supernatantul este decantat ușor.
• Sedimentul este uscat la aer într-o hotă cu flux laminar de aer steril, iar
sedimentul uscat este resuspendat în 50 μl de tampon TE (amestec de 1 x
10 mM Tris-HCl și 1 mM EDTA), pH 7.6, și răcit la -20°C sau -80°C
(pentru stocare).