L2 Cromatografia de Excluziune Sterica

Metodele cromatografie de permeaţie pe gel şi cromatografia de excluziune sterică au fost

dezvoltate ca variante ale cromatografiei în fază lichidă, ambele metode căpătând în ultima perioadă
o importanţă deosebită ca metode de studiu a polidispersităţii polimerilor şi de determinare a
curbelor de distribuţie moleculară.
1. Masa moleculară medie numerică (aritmetică ), definită prin relaţia (1):

n M
Mn  i i
 n M (1),
n
i i
i

în care ni este fracţia numerică a macromoleculelor de masă Mi;

Masa moleculară medie gravimetrică (ponderată), definită prin relaţia (2):

Mw 
n M
i i
2

  wi M i (2),
n M
i i

în care wi este fracţia ponderată a moleculelor de masă Mi;

Mw
IPD  (3)
Mn

M
GP  (4).
M mer

Principiul metodei. Cromatografia pe gel permeabil şi cea de excluziune sterică au la bază

fenomenele care apar la trecerea soluţiei unui polimer polidispers printr-un strat de umplutură cu
pori de anumite dimensiuni, în pori fiind reţinute macromoleculele de dimensiuni adecvate (mai
mici decât diametrul mediu al porilor) iar cele de dimensiuni mai mari ies din coloan odată cu
solventul - figura 1.
Detecţia poate fi realizată cu ajutorul unui detector de tip UV-VIS, RI, fluorescenţă sau
conductometric. În cazul ambelor tipuri de metode, mecanismul principal de reţinere este acela de
excluziunea sterică, dar în cazul cromatografiei de permeaţie pe gel, în literatura de specialitate se
menţionează faptul că, concomitent cu reţinerea sterică (datorată dimensiunilor macromoleculelor)
au loc şi interacţiuni de natură electrică, mai ales pentru că în general cromatografia pe gel
permeabil este practicată cu utilizarea unor soluţii apoase ale unor acizi, baze, săruri sau soluţii
tampon de diferite tării ionice.

1
 Figura 1. Ilustrarea principiului de separare a polimerilor prin CPG şi CES
http://www.separations.eu.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/SizeExclusion/
http://www.viscotek.com/the-gpc-sep.htm
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat
ion#
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/Org
anicSolublePolymers/Hhr/TSKgelGMHhr-Mmixedbed.htm
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat
În cazul cromatografiei de excluziune sterică reţinerea are loc „pur” datorită excluziunii
sterice, aceasta fiind practicată cu utilizarea unor solvenţi aprotici: dioxan, tetrahidrofuran etc..

Rezervor
solvent de
eluţie
(fază mobilă)

Sistem de detecţie
Sistem de injecţie

Colector de fracţiuni

2
 Figura 2. Componenţa unui sistem de CPG sau CES
Cu cât dimensiunea particulelor este mai redusă cu atât va fi necesar un volum mai mare de
solvent pentru eluţia de pe coloană – numit şi volum de retenţie V R. Curba tipică sau de distribuţie a
polimerilor obţinută prin CPG sau CES se caracterizează prin: volumul de eluent care a trecut prin
coloană din momentul injectării probei (VR) şi lărgimea curbei măsurată la jumătatea ei W1/2.
Factorii care influenţează separarea prin cromatografie pe gel permeabil şi respectiv forma
curbei obţinute sunt: natura şi caracterisiticile fazei staţionare, natura polimerului, caracteristicile
fazei mobile şi condiţiile de operare.
Natura şi caracterisiticile fazei staţionare joacă un rol important în obţinerea unor
cromatograme corespunzătoare, în principal prin mărimea şi distribuţia porilor, aspecte care
dictează şi intervalul de separare. În plus faza staţionară trebuie să fie stabilă şi să îşi menţină stabile
proprietăţile pe o durată cât mai ridicată de timp, să nu interacţioneze cu faza mobilă sau cu
componenţii probei.
Natura polimerului. În condiţiile în care dimensiunile porilor fazei staţionare rămân
neschimbate (constante) cu cât dimensiunea macromoleculelor este mai redusă cu atât va fi necesar
un volum mai mare de solvent pentru eluţia de pe coloană – numit şi volum de retenţie V R. Volumul
de retenţie variază liniar şi cu concentraţia polimerului. Caracteristicile fazei mobile determină
volumul hidrodinamic al macromoleculelor în timp ce condiţiile de operare determină în unele
cazuri lăţimea cromatogramei.
Etalonarea coloanelor de cromatografie pe gel permeabil/excluziune sterică.
Cromatografia pe gel permeabil/excluziune sterică nu este o metodă absolută (este realativă), fiind
necesară calibrararea (etalonarea) cu etaloane de masă moleculară cunoscută. Procedeul uzual
implică utilizarea unor soluţii de polimeri cu masă moleculară cunoscută şi distribuţie îngustă
IPD=1, în domeniul de mase moleculare de interes. Practic, calibrarea implică trasarea unei drepte
lgM=f(VRi). Determinarea volumelor VRi de eluţie se realizează prin injecţia în coloană a unor
polimeri sau amestecuri de polimeri de masă cunoscută.
Deoarece materialul de umplutură utilizat este unul poros pentru început este necesară
determinarea volumul liber al sistemului V0 = V0P (volumului liber al porilor) V0t(care se adaugă şi
volumul este necesară introducerea unei corecţii prin raportarea volumelor de eluţie V Ri la volumul
V0. În acest caz, ecuaţia dreptei de etalonare va fi o funcţie lgM=f(V Ri/V0). Pentru determinarea V0
este necesar să se realizeze o eluţie a unui compus (polimer) cu masa moleculară peste limita
superioară de separare a umpluturii coloanei.

3
 Figura 3. Cromatograma HPSEC GPC a unui amestec de proteine
Determinarea distribuţie de masă moleculară prin cromatografie de excluziune sterică de
înaltă performanţă (high performance size exclusion chromatography) necesită, de cele mai multe
ori în cazul polimerilor naturali modificarea chimică a probei prin derivatizare.

Modul de lucru
Se porneşte sistemul de cromatografie HPSEC şi se aşteaptă o perioadă de cel puţin 30
minute pentru stabilizarea acestuia. Eluentul utilizat în cazul de faţă este tetrahidrofuranul (THF) Se
utilizează o coloană cu umplutură din polistiren-divinil-benzen (domeniu de separare 10 3-105 )
înseriate. Deoarece în cazul polimerilor naturali (lignina) în structura acestor regăsim un număr
mare de grupe hidroxilice este necesară blocarea acestora prin modificare chimică. Scopul
modificărilor este reducerea sau înlăturarea completă a interacţiunilor dintre grupelor funcţionale
prezente în structura polimerilor naturali (grupele - OH) şi umplutura din care este realizată
coloana. Un efect secundar pozitiv al derivatizării este creşterea solubilităţii în solvenţi organici
aprotici. Principalele metode de derivatizare: acetilarea, metilarea, sililarea.

Trasarea curbei de etalonare-exemplu

Se trasează curba log M = f (Ve) utilizând datele din cromatograma de mai jos şi tabelul 2.
Pentru etalonarea coloanelor de HP SEC se utilizează un amestec de polimeri (standard), de
mase moleculare cunoscute, la alegerea căruia trebuie să se ţină seama de domeniul de separare al
coloanei. Se reprezintă grafic distribuţia da masă moleculară în coordonate Abs (probă) funcţie de
lg.
Se realizează calculul masei moleculare medii Mw sau Mn se poate, prin integrarerea curbei
de distribuţie şi însumarea valorilor fiMwi.

4
 În cazul sistemului de CPG se utilizează standarde (etaloane) de polistiren-sulfonat de sodiu
cu mase cuprinse în intervalul 1000- 100000 Da. Valorile Mw, Mp şi Mw/Mn sunt prezentate în
tabelul 1.

PSS3_B
0.20 Base1_basey

5.93867

5.12667
0.15
6.87267

Absorbata
0.10

4.312

0.05

0.00
3 4 5 6 7 8 9
Volum de elutie, mL

Tabel 2 Valorile obţinute pentru standardul utilizat pentru calibrare

Lg Lg Lg Ve te
Mp Mw Mn IPD Mp MW Mn (mL)