Cromatografia

Noțiuni generale
Cromatografia (chroma – culoare și graphein – a scrie) este o metodă fizico-chimică de
analiză care se bazează pe separarea constituenților unui amestec (soluți) prin antrenarea
acestora sub acțiunea unei faze mobile (lichide sau gazoase) de-a lungul unei faze staționare
(solide sau lichide), datorită re(partiției) selective a soluților între cele două faze. Fiecare
substanță dizolvată este așadar supusă unei forțe de retenție (exercitată de faza staționară) și
unei forțe de deplasare (exercitată de faza mobilă).

Istoric
Prima cromatografie a fost efectuată în 1906 de către botanistul rus Mikhail Tswett și a
constat în separarea pigmenților din frunză de spanac (Tswett, 1906). Tswett a observat
separarea coloranților vegetali, inclusiv a clorofilelor, la trecerea extractului vegetal obținut în
eter de petrol pe o coloană de carbonat de calciu. În aceste condiții, au fost observate, zone de
culoare verde și galbenă, corespunzătoare clorofilelor și carotenoizilor din frunză. Tswett a
remarcat: „La fel ca razele de lumină ale unui spectru, diferitele componente ale unui amestec
de coloranți se separă pe coloana de carbonat de calciu conform unei legi și pot fi analizate
calitativ și cantitativ”.

Clasificarea metodelor cromatografice după natura fizică a fazelor staționară și mobilă

Faza mobilă (eluentul) este reprezentată de un fluid, deci poate fi fie un lichid, fie un
gaz, fie un fluid „supercritic”. Faza staționară este reprezentată de un solid sau de un lichid.
Combinația dintre aceste posibilități conduce la diferite tipuri de cromatografie:
 cromatografie lichid ‒ solid (LSC sau LC)
 cromatografie lichid ‒ lichid (LLC sau LC)
 cromatografie gaz ‒ solid (GSC sau GC)
 cromatografie gaz ‒ lichid (GLC sau GC)
 cromatografie cu fluid supercritic (SFC)
SFC reprezintă un tip intermediar între cromatografia de lichide și cromatografia de
gaze, fluidele supercritice având proprietăți la limita dintre cele ale lichidelor și cele ale gazelor.

Clasificarea metodelor cromatografice în funcție de mecanismele de separare

Factorii implicați în partajarea moleculelor care trebuie separate între fazele fixă și
mobilă sunt: solubilitatea într-un solvent lichid, mărimea (forma), polaritatea, sarcina
electrică, prezența grupărilor de atomii care formează situri caracteristice. Diferitele tipuri de
metode cromatografice rezultă din faptul că efectul unuia dintre acești factori este dominant,
dar exclusivitatea unui mecanism nu este niciodată totală în timpul unei separări
cromatografice.
o Cromatografia de partiție
Cromatografia de partiție este o cromatografie lichid-lichid. Faza staționară este un
lichid fixat pe un suport inert, iar faza mobilă un lichid nemiscibil/parțial miscibil cu faza
staționară. Această cromatografie este numită astfel deoarece se bazează pe partiția diferențiată
a substanței de analizat (solutului) în cele două faze lichide. Soluții se deplasează mai mult sau
mai puțin rapid în funcție de partiția lor în cele două faze descrise mai sus. Cu cât partiția lor
este mai mare în faza staționară, cu atât mai mare este retenția lor și invers. Partiția fiecărui
component în faza staționară depinde de solubilitatea sa în această fază și de polaritatea sa.
Interacțiunile care apar între solut și cele două faze sunt: van der Waals, punți de hidrogen,
dipol-dipol etc.

faza mobilă faza mobilă faza mobilă

probă pentru
analiză

faza staționară

Cromatografia în strat subțire (CSS)

Definiție și echipament
Cromatografia în strat subțire (CSS) este o cromatografie de tip lichid-solid bazată în
principal pe fenomene de adsorbție și pe principiul capilarității. Aceasta presupune existența a
două faze:
1. faza staționară – un strat subțire de material absorbant (de obicei silicagel, oxid de
aluminiu sau celuloză) fixat pe o placă de sticlă sau pe o foaie semi-rigidă din
material plastic sau aluminiu;
2. faza mobilă (eluent) – un solvent sau un amestec de solvenți care se deplasează de-
a lungul fazei staționare. După ce proba de analizat a fost depusă pe faza staționară,
sub acțiunea fazei mobile, substanțele migrează cu viteze diferite care depind de
structura lor și de natura solventului.
Elementele principale ale unei separări cromatografice în strat subțire sunt:
 cuva cromatografică: un container de obicei din sticlă, de formă variabilă, închis
etanș de un capac;
 faza stationară: un strat de silicagel de aproximativ 0,25 mm sau alt adsorbant fixat
pe o placă de sticlă cu ajutorul unui liant cum ar fi sulfatul de calciu hidratat (amidon
de Paris), amidonul sau un polimer organic;
 proba: proximativ un microlitru (μL) de soluție diluată (2-5%) a amestecului de
analizat, depus într-un punct pre-stabilit, situat deasupra suprafeței eluentului;
 eluent: un solvent pur sau un amestec de solvenți care migrează încet de-a lungul
plăcii, antrenând componentele probei.
Principiul tehnicii
Când placa pe care a fost depusă proba este plasată în cuvă, eluentul urcă de-a lungul
fazei staționare, în esență prin capilaritate. În plus, fiecare component al eșantionului se
deplasează cu viteză proprie în spatele frontului solventului. Această viteză depinde, pe de o
parte, de forțele electrostatice care rețin componentele pe placa staționară și, pe de altă parte,
de solubilitatea componentelor probei în faza mobilă. Prin urmare, compușii se deplasează
alternativ între faza staționară și faza mobilă, acțiunea de retenție a fazei staționare fiind
controlată în principal prin fenomene de adsorbție. În general, în cromatografia în strat subțire,
substanțele cu polaritate scăzută migrează mai repede decât cele polare.
Identificarea aminoacizilor prin cromatografie în strat subțire

Aminoacizii sunt elementele de bază ale proteinelor. Aceștia sunt molecule bifuncționale care
conțin o grupare amină (primară) grefată pe carbonul care conține gruparea carboxil, cunoscut
sub numele de carbon α.

A. Aminoacizi monoaminomonocarboxilici
 Aminoacizi alifatici

 Aminoacizi aromatici

 Aminoacizi hidroxilici
  Aminoacizi cu sulf

B. Aminoacizi monoaminodicarboxilici

C. Aminoacizi diaminomonocarboxilici
 D. Aminoacizi heterociclici

Clasificarea aminoacizilor în funcție de polaritatea lanțului lateral R la pH neutru

În funcție de interacțiunile aminoacizilor cu mediul lor (legături electrostatice,
hidrogen, interacțiuni hidrofobe), aceștia au fost clasificați după cum urmează:

 aminoacizi polari
o neionizabili - neîncărcat la pH neutru: serină, treonină, tirozină, hidroxiprolină,
cisteină, asparagină și glutamină
o ionizabili
 încărcați negativ la pH neutru : acid aspartic (aspartat), acid glutamic
(glutamat)
 încărcați pozitiv la pH neutru : ornitină, lizină, arginină și histidină
 aminoacizi nepolari (nepolari sau hidrofobi): glicină, alanină, valină, leucină,
izoleucină, metionină, fenilalanină, triptofan și prolină.
Aminoacizii polari sunt hidrofili, în timp ce aminoacizii nepolari sunt hidrofobi.
Principiul metodei
CSS, cromatografia în strat subțire, permite separarea aminoacizilor (AA) pe un suport
poros (o placă de silicagel). Un solvent organic migrează prin capilaritate pe placa-suport și
solubilizează AA care se deplasează mai mult sau mai puțin rapid în funcție de proprietățile lor
(dimensiune, polaritatea radicalilor). După revelarea cromatogramei, se obțin pete colorate (se
utilizează ninhidrina, colorant specific pentru radicalii de AA terminali). AA din proba de
analizat, de exemplu un hidrolizat proteic, sunt identificați comparând coeficienții de retenție
(Rf) ai componenților cu coeficienții de retenție ai aminoacizilor martor (standard sau control).
Pentru a limita numărul de AA de control, sunt aleși AA cu proprietăți contrastante (de
exemplu: glicină, prolină, lizină, histidină, valină).
Materiale
o cuva cromatografică
o uscător de păr sau etuvă
o microtuburi 1 - 2 mL cu suport
o micropipete 1 - 10 µL
o flacon pulverizator
o hotă de aspirație
Consumabile
o placă CSM (celuloză sau silicagel pe suport de plastic sau de aluminiu)
Reactivi
o Probă: hidrolizat proteic sau alt amestec de AA.
o Eluent: 100 mL solvent de irigare (butanol: acid acetic: apă, 70:18:12, v/v/v) într-
un flacon închis ermetic.
o Standarde: soluții de AA: 2 - 5 mg de AA (glicină, prolină, lisină, histidină, valină)
dizolvați într-un mL apă distilată, plasate în microtuburi.
o Soluție de revelare: soluție de ninhidrină 5 % în acetonă, într-un pulverizator cu
pereți opaci (ninhidrina nu este stabilă la lumină).
Tehnica
Pregătirea cuvei
o Sub nișa chimică, se introduce solventul în cuvă până la înălțime de 1 cm. Se închide
cuva etanș și se păstrează sub hota cu aspirație (pentru a evita inhalarea vaporilor de
solvenți organici). Atmosfera rezervorului se va satura cu vapori în 15 minute.
Prepararea revelatorului
o Se prepară o soluție de ninhidrină 5 % în acetonă, cu cel puțin 24 de ore înainte de
utilizare și se introduce într-o sticlă pulverizatoare opacă.
Pregătirea plăcii
o La aproximativ 2 cm de marginea plăcii cromatografice se trasează linia de start cu
un creion de grafit. Plăcuța se introduce timp de 30 de minute într-o etuvă la 100
°C pentru activare prin deshidratare.
Depunerea probelor
o Pe placa cromatografică se depun succesiv diferite substanțe care urmează a fi
separate cromatografic (amestec de AA și AA de control (martori). Se manipulează
placa cromatografică fără a atinge degetele de faza staționară.
o Pe linia de start, se marchează cu creionul de grafit punctele în care se vor depune
probele. Se notează cu atenție (pe o parte a plăcii CSS) poziția și ordinea probelor
depuse.
o Amestecul de AA și martorii se depun cu ajutorul micropipetelor. Pentru fiecare
soluție se vor efectua 2 până la 3 depuneri succesive (pentru a avea o concentrație
suficientă de probă). Diametrul spotului nu trebuie să depășească 2 mm. Se lasă cel
puțin 5 mm între spoturi.
o Se usucă placa (în etuvă sau cu uscător de păr).
Eluarea și uscarea:
o După uscare, placa CSS se introduce rapid în cuvă. Linia de start trebuie să fie
deasupra solventului. Se lasă să migreze 30 de minute. Se scoate placa atunci când
solventul este la 1 până la 2 cm de marginea superioară. Se marchează în creion,
limita de migrare, numită frontul solventului. Se evaporă solventul prin plasarea
acestuia într-o etuvă 60 °C sau folosind uscătorul de păr sub hota de aspirație.
Plăcuța trebuie să fie necolorată.
Revelarea
Revelarea evidențiază AA separați între linia de depunere și frontul eluentului.
1. Revelarea vizuală
o Se expune placa la raze ultraviolete. Atenție! Expunerea la lumina UV este
dăunătoare și poate deteriora ochii și pielea atunci când acestea nu sunt protejate.
Nu porniți și/sau nu utilizați lampa fără filtru de siguranță!
2. Revelarea chimică
o Pulverizați ninhidrina pe placa de cromatografie. Folosiți o mască și mănuși sub
nișa chimică. Atenție! Ninhidrina este iritantă pentru ochi, pentru căile
respiratorii și piele. Ninhidrina va fi pulverizată, când cromatogramele sunt
sub nișa chimică. În caz de inhalare: respirați aer curat. În cazul contactului
cu pielea, spălați cu multă apă.
o Uscați plăcuța (5 minute) într-un termostat sau cu uscătorul de păr. Se
finalizează uscarea la temperatura camerei, spoturile colorate apar încet.
o Se analizează cromatograma obținută: AA separați sunt vizualizați sub formă de
pete colorate (albastru, purpuriu sau galben) și identificați prin compararea
valorilor Rf cu valorile Rf ale AA de control (martori).
Interpretarea rezultatelor
Aminoacizii aromatici absorb radiații ultraviolete pe domeniul 260 - 280 nm.
Ninhidrina reacționează și cu AA primari, producând o colorație violet Ruhemann și
cu aminoacizi secundari (Pro și Pro-OH), producând o colorație galbenă.
Fiecare component migrează pe o anumită distanță, caracteristică fiecărui AA, numită
raport frontal, retenție frontală sau coeficient de retenție (Rf):
 Frontul solventului

D
d

Linia de start

d (distanța între centrul spotului și linia de start)

Rf =
D (distanța între frontul solventului și linia de start)

Raportul Rf este caracteristica comportamentului unei specii chimice între un eluent dat și o
fază staționară.

TLC animatie https://www.youtube.com/watch?v=rMGQavOMAmc

TLC aminoacizi analiza calitativa : https://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0

AA pe hartie: https://www.youtube.com/watch?v=8wmQ_xWqZbo

Amrita: https://www.youtube.com/watch?v=Kwx5vB8DL60

HPLC – pentru micotoxine din ulei de canabis: https://www.youtube.com/watch?v=MRPXtE5wTvY

Micotoxine din cereale prin HPLC : https://www.youtube.com/watch?v=Oct0uSPipZQ

Determinarea a 11 tipuri de micotoxine prin LC MS:

https://www.youtube.com/watch?v=P_OWaF4SngA