PRECIPITAREA PROTEINELOR

LA PH IZOELECTRIC. IZOLAREA
CASEINEI DIN LAPTE
• Proteinele sunt macromolecule organice constituite din lanţuri de
aminoacizi uniţi între ei prin legături peptidice.
• Proteinele se caracterizează printr-o organizare spaţială complexă,
fiecare lanţ polipeptidic având o structură tridimensională specifică, în
funcţie de secvenţa de aminoacizi constitutivă.
• Separarea şi purificarea unei proteine dintr-un amestec biologic
constituie una dintre cele mai importante părţi din cercetarea
biochimiei proteinelor.
Caseina
• Caseina reprezintă principala proteină din lapte (aproximativ 35 g/l).
• Ea este constituită din lanţuri polipeptidice cu resturi seril esterificate
cu ortofosfat (este o fosfoproteină).
• Datorită acestor grupări fosfat, încărcate negativ, această proteină are
pH-ul izoelectric (pH-ul la care suma sarcinilor electrice negative este
egală cu suma sarcinilor electrice pozitive din întreaga moleculă, iar
sarcina totală electrică este nulă) situat în domeniul acid.
• Caseina din lapte formează complexe micelare care se găsesc
dispersate în faza apoasă a laptelui.
Structura unei micele de caseină
Principiul metodei

• Caseina are pH-ul izoelectric la 4,8 unităţi de pH.

• În prezenta lucrare principiul de lucru constă în precipitarea acestei
proteine la pH-ul ei izoelectric.
• Deoarece caseina este insolubilă în etanol, proteina obţinută se spală
cu etanol, lipidele putând fi astfel uşor îndepărtate.
Materiale

• Soluţie tampon acid acetic/acetat de sodiu 0,2 M pH = 4,6.

• A – soluţie acid acetic 0,2 M (11,55 mL acid acetic se aduc la 1000 mL cu
apă distilată)
• B – soluţie acetat de sodiu 0,2 M (16,4 g sare anhidra sau 27,2 g sare
cristalizată cu 3H2O se dizolvă în 1000 mL de apă distilată)
• 25 mL soluţie A se amestecă cu 24,5 mL soluţie B şi se aduce la 100 mL
cu apă distilată
• Eter etilic
• Etanol absolut
• Lapte
Mod de lucru

• Într-un pahar de 200 mL se toarnă 50 mL lapte şi se încălzeşte la 40C.

• Se adaugă sub agitare 50 mL soluţie tampon şi se aduce totul la 40C.
• Se verifică pH-ul şi se ajustează, la nevoie, la 4,8 cu ajutorul soluţiilor A sau B
(componentele soluţiei tampon).
• Se răceşte suspensia la temperatura laboratorului şi se lasă să stea 5 minute, după care
se filtrează prin mai multe straturi de tifon.
• Precipitatul se spală cu mici volume de apă de 2-3 ori.
• Se reia apoi în 15 mL etanol.
• Urmele de solvent din preparat sunt îndepărtate prin presarea caseinei între două
bucăţi de hârtie de filtru.
• După uscarea preparatului, caseina este cântărită şi se calculează randamentul
separării, ţinând seama că 100 mL lapte conţin, teoretic, 6 g caseină.
Problemă-întrebare
În ce domeniu de pH s-ar putea situa pH-ul izoelectric al unei proteine
care are în catenele sale polipeptidice mulţi radicali provenind de la
aminoacizii: lizină, arginină, histidină?