APRECIEREA EFICIENŢEI DECONTAMINĂRII AERULUI ŞI A

SUPRAFEŢELOR PRIN TESTE MICROBIOLOGICE

CALITATIVE ŞI CANTITATIVE

Se urmăreşte eficienţa decontaminării suprafeţelor şi eficienţa

decontaminării aerului. Se poate executa în laboratoare uzinale sau în laboratoare
acreditate de stat sau private.
1. Eficienţa decontaminării suprafeţelor se apreciază prin teste: chimice,
bacteriologice, micologice şi biologice (TAS- Testul cu animale santinelă).
1.1. Testele chimice determină prezenţa urmelor de substanţe decontaminante pe
suprafeţele supuse decontaminării, la anumite intervale de timp de la efectuarea
acesteia. Aceste teste se recomandă pentru verificarea efectuării corecte a
decontaminării şi a uniformităţii de dispersie a substanţei decontaminante.
Testele de sanitaţie vor fi executate numai după expirarea timpului optim de
contact, desigilarea spaţiului supus decontaminării fiind efectuată doar în
momentul testului de către o persoană investită cu această responsabilitate.
Prelevarea probelor (manipularea materialelor) se va face numai în condiţii de
sterilitate (flacăra unei lămpi cu spirt). Alegerea locurilor de prelevare a probelor
va respecta normativele în vigoare (baremul minim de sanitaţie - suprafața de pe
care se face recoltarea probelor trebuie să fie cel puțin 1/10000 din suprafața totală
supusă decontaminării.), cel puţin 70% din probe să fie recoltate de pe suprafeţele
care vin în contact direct cu animalele, iar 30% de pe suprafețele cele mai greu
accesibile operațiunilor de sanitație.
Recoltarea probelor se face din minimum zece zone, în cazul adăposturilor
de tip gospodăresc şi din cel puţin 20 de suprafeţe în cazul adăposturilor de mare
capacitate din complexele zootehnice.
Recoltarea probelor poate fi făcută în funcție de scopul urmărit de:
proprietari, medicii veterinari oficiali, medicii veterinari de liberă practică
împuterniciți sau de persoane instruite împuternicite de aceștia.

1.2. Testele bacteriologice pot fi grupate în două mari categorii: calitative şi

cantitative. Testele calitative sunt directe şi indirecte. Testele bacteriologice
urmăresc decelarea microorganismelor patogene de pe suprafaţa supusă
decontaminării prin însămânţări pe medii de cultură speciale sau prin tehnici de
colorare complexe. Pentru caracterizarea capacităţii bactericide a unor substanţe
cât şi pentru controlul curent al eficienţei decontaminării de necesitate se folosesc
microorganisme de referinţă (test-organisme): Staphilococcus aureus,
Streptococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium avium, Candida
1
albicans, Bacillus subtilis respectiv oochişti de Eimeria tenella şi ouă
neembrionate de Ascaris suum.
Aprecierea eficienţei decontaminării profilactice se face prin teste
bacteriologice indirecte, care evidenţiază prezenţa unor bacterii cu semnificaţie de
indicatori sanitari sau reducerea numărului de microorganisme de pe suprafeţele
supuse decontaminării (teste bacteriologic cantitativ).

Testul coli- urmăreşte punerea în evidenţă a prezenţei bacteriei Escherichia

coli pe mediul Levine. Acest test nu reflectă îndeajuns eficienţa decontaminării,
deoarece colibacilii sunt sensibili la acţiunea substanţelor decontaminante şi sunt
distruşi înaintea altor germeni patogeni (bacilul tuberculozei, bacilul
paratuberculozei, bacterii sporulate, virusuri fără pericapsidă).
Materiale necesare
În vederea recoltării probelor, se pregătesc tampoane de sanitaţie (Ts).
Tamponul se face din vată sau tifon răsucit pe o tijă de aluminiu, introdus în
împreună de 180/18 pe această tijă se confecţionează un dop din vată hidrofugă. În
eprubetă se introduc 10 mL soluţie fiziologică şi apoi se sterilizează prin
autoclavare.
Un număr egal de eprubete conţin câte 10 mL soluţie neutralizată
corespunzătoare substanţei decontaminante:
- 1% amoniac (pentru formaldehidă)
- 0,1% acid acetic (pentru soda caustică, soda calcinată şi var)
- 1% hiposulfit de sodiu (pentru varul cloros)
- Tween 80 soluţie 3% sau lecitină din ou soluţie 0,3% (pentru sărurile de
amoniu cuaternar).
Soluţiile neutralizante se introduc în eprubete cu acelaşi calibru cu a Ts, se
închid cu dop de cauciuc şi se sterilizează prin autoclavare.
Recoltarea probelor se face din punctele cele mai suspecte sub raporul
curăţeniei mecanice, reprezentative pentru adăpost (jgheaburi, adăpători,
pardoseală, grătare, pereţi, stâlpi, etc.). La flacără se scoate tamponul din eprubeta
cu soluţie fiziologică şi se şterge timp de 1-2 minute o suprafaţă de 100 cm 2,
delimitată de un şablon pătrat cu latura de 10 cm. După ştergerea suprafeţei,
tamponul se introduce în eprubeta cu soluţie fiziologică. În laborator, se
omogenizează energic şi se însămânţează prin inundare pe mediu Levine repartizat
în plăci Petri. Excesul de lichid se aspiră cu pipeta Pasteur, iar plăcile se incubează
48 ore la 37°C. Decontaminarea este apreciată ca fiind corect executată dacă pe
mediul Levine nu se dezvoltă colonii de Escherichia coli (violet închis cu reflexe
metalice aurii-verzui). Prezenţa coloniilor de E.coli din unele probe impune
2
refacerea decontaminării parţial, iar dacă probele pozitive provin din locuri diferite
se va reface decontaminarea în totalitate.

Testul bacteriilor coliforme modificat (TBCM)

Se însămânţează în condiţii aseptice 1 mL din proba de sanitaţie într-un tub
de fermentare (Durhan). Incubarea tuburilor însămânţate se face la 37°C, timp de
48 ore. Este considerată pozitivă proba care a produs cel puţin 1/10 gaz din
volumul tubului de fermentare, iar mediul s-a tulburat. Acest test se aplică în
decontaminările profilactice generale.
Pentru verificarea eficienţei decontaminării de necesitate în tuberculoză,
febră aftoasă şi alte boli, produse de germeni mai rezistenţi decât E.coli, se
recomandă testul stafilococilor (T.S.).

Testul stafilococilor- recoltarea probelor de sanitaţie din adăposturi se va

efectua după cel puţin două şi cel mult 24 de ore de la efectuarea decontaminării.
Probele recoltate se transportă la laborator în cel mult două ore, iar însămânţările
se execută în aceeaşi zi. Astfel, cu ajutorul unei pipete sterilizate se agită şi se
presează tamponul de vată din eprubeta cu soluţia fiziologică din care se aspiră 1
cm3 de suspensie şi se introduce într-o placă Petri sterilizată. Agarul Chapman se
răceşte la temperatura de 42-43°C şi se toarnă în plăcile însămânţate. Plăcile se
introduc în termostat la 37°C, 24 ore şi apoi se examinează. Coloniile se stafilococi
de la suprafaţa mediului sunt mici, rotunde, opace, cu marginile perfect netede, iar
cele din profunzimea mediului sunt discoidale, fără excrescenţe. Dacă aspectul
morfologic nu este suficient de clar examenul cultural se poate asocia cu un
examen bacterioscopic utiliz-nd coloraţia Gram.
Se consideră că decontaminarea a fost eficientă dacă pe mediul Chapman nu
au crescut colonii de stafilococi.
Dacă decontaminarea nu a fost corespunzătoare se recomandă repetarea
acesteia după refacerea curăţeniei mecanice, insistându-se asupra suprafeţelor de
unde s-au recoltat probele pozitive.
Testul enterococilor
Acest test este recomandat pentru aprecierea eficienţei decontaminării
adăposturilor de pui broileri. Recoltarea probelor de sanitaţie se face în aceleaşi
condiţii ca la testul coli. În acest scop se foloseşte agar-glucoză-azidă de sodiu-
trifenil tetrazol clorură (agar Slanetz-Bartley) repartizat în plăci Petri. Se fac
dispersii cu tamponul de sanitaţie în striuri, pe sectoare, pentru obţinerea de colonii
izolate. Cutiile Petri însămânţate se incubează la 44°C timp de 48 de ore. Coloniile
de enterococi sunt rotunde, cu marginea regulată, cu aspect mucos, deculoare roz,
3
roşu închis. Mediul Slanetz s-a dovedit a fi 100% selectiv pentru enterococi,
deoarece coloniile nu sunt invadante.
Pentru testul enterococilor se poate utiliza şi geloza cu citrat-azidă de sodiu-
bilă esculină.
Decun şi Oprin (1989); Decun şi col. (1991) au realizat un mediu de cultură
deshidratat, cu însuşiri selective faţă de enterobacterii, recomandat pentru controlul
microbiologic al eficienţei decontaminării în condiţii de fermă cât şi pentru
aprecierea eficienţei decontaminării apei, denumit test microbiologic de teren
(T.M.T.). Mediul conţine: peptonă, extract de carne, fosfat dipotasic, tiosulfat de
sodiu, săruri biliare şi citrat de fier, ingrediente care permit evidenţierea
enterobacteriilor care produc hidrogen sulfurat din metabolizarea aminoacizilor cu
sulf (Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Salmonella, unele tipuri de E.coli).
evidenţierea acestora semnifică o contaminare de natură fecală. Mediul are
capacitatea de a neutraliza clorul rezidual din apa clorinată. Mediul deshidratat şi
îmbibat în hârtie de filtru, este introdus în eprubete în condiţii aseptice. Recoltarea
probelor de sanitaţie se face cu o compresă de tifon sterilizat, umectat cu ser
fiziologic, de pe o suprafaţă de 50 cm2, apoi se introduce în eprubeta cu mediu
deshidratat. Se toarnă apă distilată în eprubetă, astfel încât să depăşească înălţimea
hârtiei de filtru. Eprubetele se incubează la temperatura camerei (20-26°C) sau la
termostat (37°C) 24 ore. În cazul probelor pozitive se înnegreşte conţinutul
eprubetei şi are spect tulbure.
Pentru a se evidenţia dezvoltarea bacteriilor coliforme fecale, fără a fi
asociate cu enterobacteriile producătoare de hidrogen sulfurat, se foloseşte
reactivul Ehrlich-Kovacs, pentru identificarea producţiei de indol. Testul
microbiologic de teren poate semnala o poluare fecală ridicată a apei.
Testul numărului total de germeni aerobi (N.T.G.M.A.) şi a numărului
total de micromiceţi (N.T.M.) se execută după protocolul indicat de Direcţia
sanitar-veterinară din M.A. pentru controlul eficienţei decontaminării halelor
pentru păsări. Recoltarea probelor se face la 18-24 ore după decontaminare,
folosind tampoane sterilizate, ţinute în eprubete, care înainte de folosire se
umezesc prin introducerea în fiecare eprubetă a câte 1 cm 3 soluţie fiziologică
sterilizată. Se recoltează minimum 50 de probe: câte 10 probe de pe adăpători,
hrănitori şi eleveuzeşi câte 5 probe de pe pereţii laterali, guri de admisie, aeroterme
şi pardoseală. Recoltarea se face prin ştergerea unei suprafeţe de 100 cm 2 din
punctele alese, apoi tamponul se introduce în eprubetă, care se individualizează
prin numere. Paralel pe un caiet se consemnează locul recoltării, corespunzător
fiecărui număr.

4
 Însămânţarea probelor se execută prin ştergerea tamponului pe suprafaţa
gelozei Plate Count repartizată în plăci Petri pentru determinarea NTGMA, apoi pe
suprafaţa gelozei Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol) pentru micromiceţi. Pe
o placă Petri se pot însămânţa 6 probe, după delimitarea a 6 zone triunghiulare,
înscriind cu un creion dermatograf numărul probei pe sectorul însămânţat.
Incubaţia se face timp de 24-36 ore la 37°C pentru NTGMA şi 4-5 zile la
temperatura de 25-30°C pentru micromiceţi. După incubaţie se numără coloniile
corespunzătoare fiecărei probe.
Eficienţa decontaminării pentru locul recoltării se apreciază astfel:
Pentru NTGMA:
- decontaminare corespunzătoare:- absenţa coloniilor
- 1-50 colonii
- decontaminare necorespunzătoare: - peste 50 colonii
- colonii numeroase
- colonii confluente
- cultură în gazon
Pentru NTM:
- decontaminare corespunzătoare: - absenţa coloniilor
-1-10 colonii
- decontaminare necorespunzătoare: - peste 10 colonii
- colonii numeroase
- colonii confluente
- cultură în gazon
Eficienţa decontaminării pe hală se apreciază astfel:
 dacă numărul probelor necorespunzătoare nu depăşeşte 30% inclusiv,
atât pentru NTGMA cât şi pentru NTM, decontaminarea halei
corespunde normelor admise;
 decontaminarea este necorespunzătoare dacă numărul probelor pozitive
depăşeşte 30% indicând aceeaşi situaţie pentru întreaga hală. În acest
caz se impune repetarea decontaminării parţiale, când probele
necorespunzătoare privesc numai ustensilele din hală, sau refacerea
decontaminării întregii hale, când probele necorespunzătoare se
repartizează pe toate suprafeţele supuse decontaminării.
 Dacă se dezvoltă colonii de Escherichia coli, Pseudomonas sau
Salmonella, se repetă decontaminarea şi controlul eficienţei acesteia.

Aprecierea calităţii decontaminării finale în unităţile

asanate de tuberculoză bovină
5
 Testul de sanitaţie pentru evaluarea decontaminării finale în tuberculoza
bovină are trei etape:
- Testul stafilococic (T.S.)
- Testul bacililor acido-alcoolo-rezistenţi (T.B.A.A.R.)
- Biotestul pe cobai (B.T.C)
Testul stafilococic (T.S.) se foloseşte după fiecare decontaminare finală din
cadrul celor 3-4 decontaminări finale şi pentru toate obiectivele închise.
Tampoanele de sanitaţie recoltate după ultima decontaminare finală se păstrează la
frigider.
Testul bacililor acido-alcoolo-rezistenţi (T.B.A.A.R) se practică dacă testul
stafilococic este negativ după ultima decontaminare finală.

2. Eficienţa decontaminării aerului

Acest test are valoare relativă şiconstă în expunerea plăcilor Petri cu medii
de cultură, în spaţiul supus decontaminării, atât înainte de practicarea acesteia, cât
şi după expirarea timpului de contact. În acest scop se foloseşte tehnica
sedimentării Koch, care recunoaşte următoarea desfăşurare: plăcile Petri cu medii
de cultură adecvate (agar simplu pentru bacteriile mezofile, aerobe, respectiv
Sabouraud sau cu extract de cartof pentru miceţi) sunt expuse fără capac în locuri
diferite şi la înălţimi variabile în spaţiul supus decontaminării. După 2-10 minute,
ele sunt acoperite cu capace şi incubate la termostat timp de 24-48 de ore la 37°C
în cazul bacteriilor sau 3-5 zile la temperatura camerei (22-24°C) în cazul
miceţilor. Se numără apoi coloniile de pe fiecare placă, iar numărul acestora se
raportează la m3 de aer, folosind formula stabilită prin calcule de Omelianski:

Nr. UFC/ m3 = N x 63662 / D2 x t

în care:
N= media aritmetică a numărului de colonii din fiecare placă expusă
63662= constanta lui Omelianski;
D= diametrul plăcii;
t= timpul de expunere a plăcilor deschise în minute

Se face media încărcăturii microbiene a aerului înainte de decontaminare şi

de după practicarea acesteia şi prin raportarea celor două valori se poate aprecia
eficicenţa operaţiunilor de decontaminare, stabilindu-se de câte ori s-a redus
încărcătura microbiană pe unitatea de volum. Metoda este considerată relativă
pentru că nu oferă posibilitatea de a aaprecia distrugerea în totalitate a germenilor
cu semnificaţie patogenă.
6
7