Sunteți pe pagina 1din 1039

ANALIZA

MEDICAMENTULUI
OBIECT, IMPORTANŢA,
ORGANIZARE

11
Planul cursului
• INTRODUCERE
• ORGANIZAREA CONTROLULUI MEDICAMENTELOR
• NORME DE CONTROL Ale MEDICAMENTELOR
• CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL MEDICAMENTULUI
Identificarea componentelor
Cercetarea purităţii
Determinarea cantitativă
• METODOLOGIA GENERALA DE CONTROL A MEDICAMENTULUI
PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZă
CONTROLUL ORGANOLEPTIC
DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI CHIMICE
- DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII
- ASPECTUL SOLUTIEI
- DETERMINAREA INDICILOR
- SUBSTANŢE NESAPONIFICABILE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE FIERBERE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE PICURARE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE SOLIDIFICARE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
- DETERMINAREA INTERVALULUI DE DISTILARE
- DETERMINAREA APEI
- REZIDUUL PRIN CALCINARE
- DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
- PIERDEREA PRIN USCARE 22
Medicament (OMS) - “orice substanţă sau produs
utilizat, ori destinat a fi utilizat, în vederea
modificării sau studierii unui sistem fiziologic, în
interesul subiectului căruia îi este administrat”,
care reflectă cu pregnanţă importanţa dictonului
“primum non nocere“.

• Medicament (Legea 95/2006, Titlul XVIII) – orice substanta


sau combinatie de substante prezentate ca avand proprietati
pentru tratarea sau prevenirea bolilor la om si care poate fi
folosita sau administrata, fie pentru restabilirea, corectarea
sau modificarea functiilor fiziologice, fie pentru stabilirea unui
diagnostic medical.

• Specialitatea farmaceutica - un medicament prezentat intr-o


forma farmaceutica specifica, care poarta un nume specific,
este conditionat intr-un ambalaj specific, este preparat de o
entitate juridică autorizată in acest sens si poate fi administrat
la om dupa obtinerea dreptului de a fi pus pe piata.

33
Ministerul Sănătăţii clasifică medicamentele astfel:

1. Medicamente originale
a) substanţe cu structură chimică definită, necunoscute în literatura
medicală internaţională şi formele farmaceutice ale acestora
b) substanţe cu structură chimică definită, cunoscute în literatura de
specialitate, însă neutilizate până în prezent în scopuri terapeutice,
precum şi formele farmaceutice ale acestora

2. Medicament de referinta
 un medicament autorizat în Romania sau un medicament autorizat în
unul din statele membre ale UE sau în UE prin procedura centralizată

3. Medicamente de reproducere (generice)


 un medicament care are aceeaşi compoziţie calitativă şi cantitativă în
ce priveşte substanţele active şi aceeaşi formă farmaceutică cu
medicamentul de referinţă şi a cărui bioechivalenţă cu medicamentul de
referinţă a fost demonstrată prin studii de biodisponibilitate.

44
• Introducerea unui medicament în arsenalul terapeutic impune, conform
legislaţiei adoptată de Ministerul Sănătăţii, obţinerea:
1. Autorizatiei de punere pe piata.
2. Autorizatia de fabricaţie şi înregistrare.

• Cererea pentru eliberarea autorizatiei de punere pe piata trebuie să cuprindă:


 numele, domiciliul solicitantului
 denumirea medicamentului
 caracteristicile calitative si cantitative ale tuturor constituienţilor
medicamentului
 evaluarea riscurilor pentru mediu
 descrierea procedeului de fabricaţie
 indicaţii terapeutice, contraindicaţii, reacţii adverse
 posologia, forma farmaceutică, calea de administrare, modul şi perioada de
valabilitate
 explicaţii privind măsurile de precauţie şi siguranţă luate pentru depozitare,
administrare, eliminarea reziduurilor, riscurile pentru mediu
 descrierea metodelor de control

55
 rezultatele:
• testelor farmaceutice (fizico-chimice, biologice, microbiologice)
• testelor preclinice (toxicologice, farmacologice)
• testelor clinice
 descrierea sistemului de farmacovigilenţã
 declaraţia privind faptul cã studiile clinice derulate în afara României şi UE
îndeplinesc criteriile etice din Normele referitoare la implementarea regulilor
de bunã practicã
 rezumat al caracteristicilor produsului, macheta ambalajului secundar şi
primar, prospectul
 document care sã ateste faptul cã fabricantul este autorizat sã producã
medicamentul în ţara sa
 copie dupã fiecare autorizaţie de punere pe piaţã a medicamentului obţinutã
într-un alt stat însoţitã de lista statelor membre UE care examineazã cererea
 copie dupã rezumatul caracteristicilor prodului propus de cãtre solicitant
 copie a prospectului
 detalii privitoare la decizii de refuz
 dovadã cã solicitantul beneficiazã de serviciile unei persoane calificate,
responsabile cu activitatea de farmacovigilenţã
 documente şi informaţii privind rezultatele testelor farmaceutice şi preclinice
ale studiilor clinice

66
Dezvoltarea
preclinica

Dezvoltarea unui AVIZ DE FABRICATIE


medicament
Dezvoltarea
clinica

MEDICAMENT Productia Prototip


industriala

Autorizatie de punere Comercializare BOLNAV


pe piata

EFECT TERAPEUTIC

Autorizatiei de punere pe piata (valabila 5 ani)


Autorizatia de fabricatie eliberata de ANMDM (valabila 3 ani).
7
• Medicamentul, pentru a fi utilizat trebuie sa fie de calitate,
eficace si utilizat in deplina siguranta.

• CALITATEA (ISO)
– reprezinta ansamblul de proprietăţi şi caracteristici ale unei entitãţi care
îi conferã acesteia aptitudinea de a satisface necesitãţi exprimate şi
implicite şi devine unic criteriu de patrundere a unui produs pe piaţa
naţională şi de susţinere a lui la export, deci un element esenţial
pentru succesul unei intreprinderi.

• este rezultatul unei structuri organizaţionale denumită sistemul


calităţii şi a unui management specific.

8
■ Țări membre ai asociației
■ Țări corespondente cu asociația
■ Țări observatoare
■ Țări cu ISO 3166-1 care nu sunt membre la ISO

9
Reguli de buna practica de fabricatie

INTRODUCERE
ISTORICUL REVIZUIRILOR
GLOSAR

PARTEA I CERINŢE DE BAZĂ PENTRU MEDICAMENTE


CAPITOLUL 1 - MANAGEMENTUL CALITĂŢII
CAPITOLUL 2 – PERSONALUL
CAPITOLUL 3 - LOCALURILE ŞI ECHIPAMENTELE
CAPITOLUL 4 - DOCUMENTAŢIA
CAPITOLUL 5 – FABRICAŢIA

CAPITOLUL 6 - CONTROLUL CALITĂŢII


CAPITOLUL 7 - CONTRACTUL DE FABRICAŢIE ŞI DE CONTROL
CAPITOLUL 8 - RECLAMAŢIILE ŞI RETRAGEREA PRODUSULUI
CAPITOLUL 9 – AUTOINSPECŢIA

PARTEA a II-a CERINŢE DE BAZĂ PENTRU SUBSTANŢELE ACTIVE FOLOSITE CA


MATERII PRIME

10
Anexa 1 Fabricaţia medicamentelor sterile
Anexa 2 Fabricaţia medicamentelor biologice de uz uman
Anexa 3 Fabricaţia medicamentelor radiofarmaceutice
Anexa 4 Fabricaţia medicamentelor de uz veterinar altele decât cele imunologice
Anexa 5 Fabricaţia medicamentelor imunologice de uz veterinar
Anexa 6 Fabricaţia gazelor medicinale
Anexa 7 Fabricaţia medicamentelor de origine vegetală
Anexa 8 Prelevarea materiilor prime şi a materialelor de ambalare
Anexa 9 Fabricaţia lichidelor, cremelor şi unguentelor
Anexa 10 Fabricaţia medicamentelor sub formă de aerosoli presurizaţi pentru
inhalat, cu valvă dozatoare
Anexa 11 Sisteme computerizate
Anexa 12 Utilizarea radiaţiilor ionizante în fabricaţia medicamentelor
Anexa 13 Fabricaţia medicamentelor pentru investigaţie clinică
Anexa 14 Fabricaţia medicamentelor derivate din sânge şi plasmă umane
Anexa 15 Calificarea şi validarea
Anexa 16 Certificarea de către o persoană calificată şi eliberarea seriei
Anexa 17 Eliberarea parametrică
Anexa 19 Probe de referinţă şi contraprobe
Anexa 20 Managementul riscului în domeniul calităţii
11
ORGANIZAREA CONTROLULUI
MEDICAMENTELOR
• Pe baza unor situaţii alarmante, în anul 1962 s-a cerut la nivelul O.M.S.
reglementarea legislativa a fabricării, controlului şi distribuirii
medicamentului, instituirea unei autorităţi naţionale de control şi
formarea de personal calificat pentru acest domeniu.

• Conform definiţiei adoptate la Conferinţa O.M.S. de la Helsinki


(1968), “controlul calităţii preparatelor farmaceutice presupune
controlul de la un capăt la altul al procesului de fabricaţie,
începând de la materia primă până la forma finală a preparatului
farmaceutic, al purităţii, activităţii, sterilităţii, stabilităţii
medicamentului, cât şi al conformităţii acestuia cu indicaţiile
prevăzute pe ambalaj”.

• În România controlul calităţii medicamentului este asigurat printr-un


control riguros fizico-chimic, microbiologic, biologic şi clinic, reglementat
de legislaţia farmaceutică. Acest control se efectuează la următoarele
nivele:
 Agentia Nationala a medicamentului si dispozitivelor medicale (ANMDM)
 Laboratoarele de Controlul Medicamentului organizate în fabricile de
produse farmaceutice
 Masa de analiză din farmacie.
12
12
Agentia Nationala a Medicamentului si
Dispozitivelor medicale (ANMDM)

 1929 - se infiinteaza Institutului Farmaceutic - atributii administrative


si organizatorice in domeniul sanatatii publice.

 1956 - se infiinteaza Institutul pentru Controlul de Stat al


Medicamentului si Cercetari Farmaceutice (ICSMCF) - atributii in
domeniul metodologiei de control si al verificarii medicamentelor
folosite in terapeutica, precum si de sprijinire a retelei farmaceutice.

o Institutul a reprezentat un moment important in directia asigurarii


controlului medicamentului si a crearii bazei corespunzatoare pentru
cercetarea farmaceuticã.

 1960 - sarcinile Comisiei Medicamentului si ale Comitetului


Farmacopeei.
13
13
• 1973 - rolul de coordonator al retelei de farmacovigilenta,
activitate exercitatã prin Comisia Medicamentului, acesta
devenind centru colaborator OMS in problema supravegherii
reactiilor adverse la medicamente.

• 1979 - asigura Secretariatul Comisiei Medicamentului.

• 1981 - autoritate competenta de a efectua inspectiile privind


respectarea regulilor de bunã practica de fabricatie si control.

• 1984 - Centru Colaborator OMS pentru medicina traditionala.

• 1991 - cele 17 laboratoare teritoriale de control al


medicamentelor, care au apartinut fostelor oficii farmaceutice, au
fost preluate si trecute in structura organizatorica a ICSMCF.

14
14
• 1996 - România este reprezentata la Comisia Farmacopeei
Europene, din cadrul Consiliului Europei, cu statut de observator,
de un specialist din cadrul ICSMCF/ANM.

• 2003 - România a aderat la Conventia privind elaborarea


Farmacopeei Europene, din cadrul Consiliului Europei si a devenit
membru cu drepturi depline incepând din 24.09.2003.

• 1 ianuarie 1999 (OGR nr. 125/1998) - s-a infiintat Agentia


Nationala a Medicamentului (ANM), institutie publica, in subordinea
Ministerului Sanatatii, prin reorganizarea ICSMCF “Petre Ionescu –
Stoian”, care s-a desfiintat.

• 1 ianuarie 2000 (OMS nr. 802/1999) - in structura ANM a fost


inclus si Centrul pentru Controlul de Stat al Produselor Biologice de
Uz Uman.

• 30 iunie 2010 (OUG nr.72/2010) - denumirea se schimba in


ANMDM (prin fuzionarea cu Oficiul Tehnic de Dispozitivele Medicale
Bucuresti)

15
15
Misiunea Agentiei Nationale a Medicamentului si
Dispozitivelor Medicale:
contribuie la protejarea si promovarea sanatatii publice prin:

• evaluarea la cel mai inalt nivel de competenta stiintifica a


documentatiei de autorizare in vederea punerii pe piata a unor
produse medicamentoase de buna calitate, sigure si eficace

• supravegherea sigurantei produselor medicamentoase aflate in


circuitul terapeutic prin activitatea de inspectie si
farmacovigilenta

• asigurarea pentru pacienti si personalul medico-sanitar a


accesului la informatii utile si corecte privind produsele
medicamentoase autorizate de punere pe piata in Romania

• asigurarea eficacitatii si eficientei administrative a organizatiei


(ANMDM) si transparentei practicilor si procedurilor utilizate.

16
16
17
NORME DE CONTROL A
MEDICAMENTELOR
• 1. Farmacopeea Română ed. X + Suplimente
• 2. Farmacopeea Europeana
• 3. Norme interne.
• 4. Stass-uri.
• 5. Fişe analitice.
• 6. Lucrări de specialitate, etc.

Controlul medicamentului include:


• Controlul fizico-chimic
• Controlul microbiologic
• Controlul biologic şi biochimic
• Controlul produselor vegetale
• Controlul preparatelor radiofarmaceutice
• Controlul stabilităţii medicamentelor.

18
18
CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL
MEDICAMENTULUI
Controlul fizico-chimic al medicamentului cuprinde 3 faze:

• 1. Identificarea componentelor.

• 2. Cercetarea purităţii.

• 3. Determinarea cantitativă a substanţelor active.

19
19
1. Identificarea substanţelor medicamentoase

- evidenţiază încă de la început orice greşeală legată de identitatea


componentelor asociate în preparatul analizat.

- se va declara necorespunzător şi se va respinge orice medicament în


privinţa căruia există dubii asupra identităţii sale.

- se vor efectua în întregime toate testele fizice şi chimice prevăzute în


monografia/norma de calitate/fişa analitică a substanţei sau
produsului farmaceutic:
a) determinarea unor constante fizico-chimice:
Exemple:
 punct de topire - variază cu gradul de puritate, cu gradul de hidratare
şi cu starea polimorfică a produsului
 indice de refracţie - utilizat pentru caracterizarea uleiurilor volatile, a
substanţelor şi formelor farmaceutice lichide
 densitate relativă
 putere rotatorie specifică
 vascozitate cinematică.

20
20
b) reacţii chimice specifice şi sensibile
Exemple:
 microreacţiile (reacţiilor în picătură) care necesită cantităţi reduse de
probă şi de reactivi.

c) Microcristaloscopia
Exemple:
 diferenţierea izomerilor optic activi, pe baza formei variate a cristalelor
rezultate prin tratarea substanţei de analizat cu reactivi speciali.

d) metoda cromatografică
Exemple:
 separarea compuşilor medicamentoşi şi identificarea lor fie pe cale
chimică, fie prin parametrii cromatografici (Rf, VR, TR, etc.).

e) trasarea spectrelor de absorbţie în UV-VIS, IR


Exemple:
 identificarea substanţelor medicamentoase prin maximele spectrale şi
benzile de absorbţie caracteristice grupărilor cromofore sau diverselor
legături chimice

21
21
2. Cercetarea purităţii
• După gradul de puritate, substanţele pot fi grupate în:
 substanţe tehnice
 substanţe pure
 substanţe chimic pure (pro analysi)
 substanţe cu grad de puritate foarte avansat (pro chromatography, pro
spectroscopy).

• În cazul substanţelor medicamentoase se va urmări realizarea unui grad


de puritate compatibil cu:
 posibilităţile de sinteză, preparare sau extracţie
 exigenţele referitoare la acţiunea toxică şi biologică.

• Se vor lua în considerare:


 scopul în care se va folosi substanţa
 posibilele ei interacţiuni cu eventualele impurităţi
 influenţa impuritatilor asupra stabilităţii chimice, biologice, toxicologice
pe perioada de valabilitate a preparatului farmaceutic.

22
22
• Decelarea impurităţilor:
• în substanţele minerale:
 reacţii de precipitare
 reacţii de culoare
 alte tipuri de reacţii chimice, cât mai sensibile şi specifice

• în cazul substanţelor organice:


 analiza elementală
 determinarea unor constante fizico-chimice (punct de topire, punct de
fierbere, indice de refracţie, putere rotatorie specifică, constante spectrale
în domeniul UV-VIS, IR, etc.).

• Controlul purităţii substanţelor medicamentoase a impus


standardizarea metodelor de determinare. Farmacopeele, inclusiv
Farmacopeea Română, au oficializat metoda etaloanelor pentru
aprecierea gradului de puritate a medicamentului, metodă care
asigură exactitate şi precizie ridicate, concomitent cu limitarea
aspectului de subiectivism, de relativitate în determinări.

23
23
• Cercetarea purităţii substanţelor medicamentoase apelează şi la
metode instrumentale moderne:
 gaz-cromatografia - urmărirea proceselor industriale de sinteză şi de
biosinteză a medicamentelor.
 spectroscopia în UV - evidenţiază prezenţa impurităţilor puternic
absorbante care deformează spectrul normal al substanţei active.
 spectroscopia IR - decelarea impurităţilor atunci când acestea se
găsesc în concentraţii suficient de mari sau atunci când provin din
modificări structurale ale unor grupări funcţionale ori ale moleculei
active în întregime.
 polarografia, analiza termică, calorimetria diferenţială,etc.

• Controlul purităţii medicamentului trebuie să fie o permanentă


preocupare a farmaciştilor, deoarece impurităţile prezente pot declanşa
reacţii imprevizibile de hidroliză, racemizare, oxido-reducere,
polimerizare, în care să fie implicate substanţele medicamentoase şi
excipienţii preparatelor farmaceutice.

24
24
3. Determinarea cantitativă
• Supradozarea ori subdozarea principiilor active dintr-un medicament va
avea consecinţe tot atât de grave asupra stării pacientului ca şi erorile
calitative.
• Produsele medicamentoase se pot doza prin metode fizice, chimice si
fizico-chimice:
 metode clasice de analiza: (gravimetrice, titrimetrice)
 metode instrumentale (absorbţiometrice, potenţiometrice,
cromatografice, etc.).

 Metode chimice:
Avantaje:
 procedee simple si precise
 se bazeaza pe masuratori absolute
 necesita echipament simplu, accesibil si usor de intretinut
Dezavantaje:
 timp relativ mare de realizare a analizei
 precizia scade cu micsorarea cantitatii de proba
 lipsite de flexibilitate
 uneori lipseste specificitatea
 poluante pentru mediu

25
25
 Metode fizico-chimice:
Avantaje:
 determinari rapide si cu sensibilitate ridicata
 se pot analiza cantitati mici de proba
 se pot analiza probe complexe
Dezavantaje:
 necesita etalonarea initiala si continua a aparatului
 sensibilitatea si precizia depind de aparatura sau de metodele
chimice de etalonare
 costul initial si de intretinere este ridicat
 necesita uneori spatiu pentru aparatura
 implica personal cu pregatire speciala

26
METODOLOGIA GENERALA DE CONTROL
A MEDICAMENTULUI
FR X - capitolul “Monografii- Metode generale de analiză”:
• Prelevarea probelor pentru analiză.
• Controlul organoleptic
• Determinări fizice şi fizico-chimice
• Determinări cantitative
• Determinări farmacognostice
• Determinări farmacotehnice
• Determinări biologice şi biochimice
• Controlul preparatelor radiofarmaceutice

• Analiza medicamentului defineste in sens larg


examinarea partilor constituiente ale unui intreg
reprezentat de medicament, presupunand specific
determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei
si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand
strategii, metode si instrumente caracteristice.
27
27
PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZA

« Probele prelevate pentru determinarile calitative şi cantitative trebuie


să reprezinte, sub toate aspectele, caracteristicile produsului din lotul
sau seria respectiva» (FR-X)

FR-X:
• lot - o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară, din care se
obţin una sau mai multe serii de produse

• serie - totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii identice,


într-un singur ciclu de operaţii

• recipient - conţine unităţile de produs care constituie o serie, ex.


flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.

• ambalaj - conţine recipientele grupate adecvat

28
28
PRELEVAREA PROBELOR

DEPOZIT FARMACII
Laborator
Cantitate – 4p Cantitate – 3p Cantitate – 3p Cantitate – 2p
Masa de analiza Cantitate – 3p
2p proba 2p proba 2p proba 1p proba
Cantitate – 1p 2p proba
2p contraproba 1p contraproba 1p contraproba 1p contraproba
1p contraproba

Lot Serie Subst. farm. Prep. ind. Elaborate

29
29
CONTROLUL ORGANOLEPTIC

Aspect

Miros CONTROL ORGANOLEPTIC Gust

Culoare

30
30
DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI CHIMICE

DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII
• prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ
privind solubilitatea substanţelor în diferiţi solvenţi
• prevederile înscrise în cadrul altor alineate, cum ar fi
"solubilitatea în alcool", au un caracter obligatoriu, fiind
considerate teste de puritate
• Solubilitatea poate fi exprimată prin specificarea volumului de
solvent (în mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substanţă solidă
sau 1 ml substanţă lichidă, la temperatura de 20  20C.
• Verificarea solubilităţii substanţelor farmaceutice nu este
necesar să se efectueze în toţi solvenţii prevăzuţi în monografie,
ci este necesar să se controleze solubilitatea în cel puţin doi
solvenţi diferiţi.
• Dacă se constată prezenţa unor impurităţi insolubile, se verifică
solubilitatea şi în ceilalţi solvenţi prevăzuţi.

31
31
Diferitele solubilităţi pot fi exprimate şi cu ajutorul unor expresii - în
acest caz prevederile de solubilitate se referă la temperatura de 20 
5oC.

Expresii folosite Volumul de solvent (ml) necesar pentru a


dizolva 1 g substanţă solidă sau 1 ml
substanţă lichidă
foarte uşor solubil cel mult 1 ml
uşor solubil de la 1 ml până la 10 ml
solubil de la 10 ml până la 30 ml
puţin solubil de la 30 ml până la 100 ml
foarte puţin solubil de la 100 ml până la 500 ml
greu solubil de la 500 ml până la 1000 ml
foarte greu solubil de la 1000 ml până la 10.000 ml
practic insolubil mai mult de 10.000 ml

32
32
• Când se prevede solubilitatea în soluţii de acizi sau în soluţii
de baze nu se precizează volumul din soluţia respectivă,
deoarece dizolvarea are loc ca urmare a unei reacţii chimice.

• Pentru determinarea solubilităţii substanţelor solide,


substanţa fin pulverizată, cântărită cu exactitate de 10 mg, se
agită până la dizolvare cu volumul de solvent prevăzut în
monografia respectivă sau cu volumul de solvent prevăzut în
tabel la limita superioară.

• În cazul substanţelor solide care se dizolvă prin încălzire sau


la temperatura camerei după un timp mai îndelungat ("în
timp"), se procedează astfel:
 amestecul de substanţă solidă fin pulverizată şi solvent se
încălzeşte la aproximativ 500C până la dizolvare, se înlocuieşte
solventul evaporat, se răceşte sub agitare şi se verifică
solubilitatea după ce soluţia s-a ţinut la 20  20C timp de 2 ore
 când trebuie evitată încălzirea, amestecul de substanţă solidă fin
pulverizată şi solvent se agită câte 5 secunde, din 5 în 5 minute
si substanţa trebuie să se dizolve în timp de 30 de minute.

33
33
• La grăsimi, ceruri şi parafine, solubilitatea se determină
prin agitarea acestora cu solventul prevăzut, până la
dizolvarea sau topirea acestora, adăugarea solventului,
agitare până la răcire şi verificarea solubilităţii după ce
soluţia s-a ţinut la 20  20C timp de 2 ore.

• Expresia "miscibil" este atribuită substanţelor lichide care se


pot amesteca în orice proporţie cu solventul prevăzut. Când
în amestec are loc o degajare de căldură, verificarea
solubilităţii substanţelor respective se efectuează după 2 ore
de la dizolvare, timp în care amestecul este ţinut la 20  20C.

• Când se folosesc solvenţi volatili, determinările se efectuează


în flacoane cu dop rodat.

34
34
• Masa substanţei luate în lucru pentru determinarea solubilităţii se
calculează astfel încât să rezulte, de obicei, 10 - 20 ml soluţie.
• În cazul substanţelor uşor solubile, precum şi în cazul substanţelor
foarte costisitoare, se prepară numai 1 - 2 ml soluţie.

• Substanţa se consideră dizolvată când soluţia examinată cu


ochiul liber nu mai prezintă particule în suspensie.

• Nu se iau în considerare urmele de impurităţi mecanice (filamente


de hârtie de filtru, vată sau particule de praf) dacă soluţia, fără a fi
filtrată, corespunde etalonului de transparenţă şi dacă, după un
repaus de o oră, aceste impurităţi nu formează un reziduu vizibil.

ASPECTUL SOLUTIEI

• Claritatea soluţiei → LP

• Coloraţia soluţiei → LP

35
35
DETERMINAREA INDICILOR
• Indice de aciditate = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi
conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase,
balsamuri, ceruri etc.).

• Se calculează conform formulei:

5.61  V
I 
A m
în care:
- IA = indice de aciditate
- V = volumul de KOH 0.1 mol/l în apă folosit la titrare (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 5.61 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.1
mol/l.

36
36
• Indice de saponificare = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi şi a acizilor
rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat.

• Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IS 
m
în care:
- IS = indice de saponificare
- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH
0.5 mol/l în alcool.

37
37
• Indice de ester = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu
necesar pentru neutralizarea acizilor graşi rezultaţi din
saponificarea a 1 g probă de analizat.

• Se calculează conform formulei:

în care:
- IE = indice de ester
- IS = indice de saponificare
- IA = indice de aciditate.

38
38
• Indice de hidroxil = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1
g probă de analizat.

• Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IH   IA
m

în care:
- IH = indice de hidroxil
- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- IA = indice de aciditate
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5
mol/l în alcool.

39
39
• Indice de iod = numărul de grame de iod fixat de 100 g probă
de analizat.

• Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  0.01269
II  .100
m

în care:
- II = indice de iod
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 0.01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 ml Na2S2O3
0.1 mol/l.

40
40
• Indice de peroxid = numărul de mililitri de tiosulfat de sodiu
0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin
acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat.

• Se calculează conform formulei:

10  (V2  V1 )
Ip 
m
în care:
- IP = indice de peroxid
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului
(ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 10 = nr. de ml de Na2S2O3 1 mol/l necesari pentru a obtine 0.01
mol/l

41
41
SUBSTANŢE NESAPONIFICABILE
• Substanţe nesaponificabile - substanţele nevolatile la 1050 C,
obţinute din uleiuri, ceruri etc., după saponificare cu un hidroxid
alcalin şi extracţie cu un solvent organic.
5 g probă
50 ml soluţie KOH în alcool (2 mol/l)

Refluxare (60 minute)

100 ml apă de 80 oC

Palnie separare
Extractie cu eter (de 3x)
Spalare cu apa
Reactie neutra la fenolftaleină
Filtrare pe Na2SO4 anh
Distilare
Reziduu (m = ct.), raportare la 100 g P.V.
42
42
DETERMINAREA PUNCTULUI DE FIERBERE
Punctul de fierbere al unui lichid - temperatura corectată, la care presiunea
de vapori a lichidului este egală cu 101.3 kPa (760 mmHg).
• Se foloseşte:
 o eprubetă prevăzută cu un dop perforat la mijloc
introdusa într-un balon care conţine parafină
lichidă (R).
 un termometru la care se ataşează un tub capilar
închis la partea superioară

• Determinare:
 lichidul de analizat se introduce în eprubetă
 termometrul cu tubul capilar se cufundă în lichid
 se incălzeste treptat, cu 2 - 30C/minut
 la început are loc o uşoară degajare de bule de gaz
de la capătul inferior al tubului capilar
 in momentul când se ajunge la punctul de fierbere
şi în lichid apare un lanţ continuu de bule de gaz,
becul se îndepărtează
 viteza de degajare a bulelor de gaz scade şi când
degajarea acestora încetează şi lichidul are tendinţa
de a fi absorbit în tubul capilar termometrul arată
temperatura de fierbere. 43
43
• Dacă determinarea se efectuează la o altă presiune, diferită
de presiunea normală, temperaturile de fierbere citite trebuie
corectate pentru presiunea normală, conform formulei:

t1  t 2  k( p1  p2 )
în care:
- t1 = temperatura corectată
- t2 = temperatura citită
- k = factor de corecţie prevăzut în tabel
- p1 = 101.3 când presiunea barometrică este măsurată în
kilopascali sau 760 când presiunea barometrică este
măsurată în milimetri coloană mercur
- p2 = presiunea barometrică din timpul determinării.

44
44
Valoarea factorului de corecţie (k) depinde de punctul de fierbere
al lichidului de analizat:

Punct de fierbere Factor de corecţie


(0 Celsius) (kilopascali) (mm coloană de mercur)

până la 100 0.3000 0.040


mai mult de 100 până la 140 0.3375 0.045
mai mult de 140 până la 190 0.3750 0.050
mai mult de 190 până la 240 0.4125 0.055
mai mult de 240 0.4500 0.060

45
45
DETERMINAREA PUNCTULUI DE SOLIDIFICARE
• Punct de solidificare sau punct de congelare = temperatura
cea mai ridicată la care o substanţă lichidă sau o substanţă
solidă adusă în stare lichidă prin topire trec din faza lichidă în
faza solidă.

Dispozitiv:
 eprubetă cu pereţii groşi, prevăzut cu un dop
prin care trece un termometru divizat din 0.5 în
0.50C şi un tub de sticlă deschis la ambele capete,
prin care pătrunde un agitator.
 eprubeta se fixează cu ajutorul unui dop într-o
altă eprubetă exterioară cu pereţii groşi, cu
diametrul de aproximativ 35 mm, care serveşte ca
baie de aer.
 dispozitivul se introduce într-un vas înalt, cu
capacitatea de 1000 ml, care conţine apă sau un
amestec de răcire, astfel încât nivelul lichidului
din vas să se afle deasupra nivelului substanţei
din eprubetă.
 vasul este prevăzut cu un agitator şi cu un
46
46
termometru.
Tehnica de lucru:

• aproximativ 10 g substanţă lichidă sau


substanţă solidă topită la o temperatură cu
aproximativ 50C peste punctul de solidificare
presupus se introduc în eprubeta interioară şi
se fixează termometrul
• eprubeta se fixează în eprubeta exterioară şi se
introduce în apă sau în amestecul de răcire, a
cărui temperatură trebuie să fie cu aproximativ
50C mai scăzută decât punctul de solidificare
presupus
• substanţa se lasă să se răcească fără a se
agita, până când temperatura ajunge cu 1 -
20C sub punctul de solidificare prevăzut
• se agită până când lichidul începe să se
solidifice
• in timpul solidificării au loc variaţii de
temperatură.

• Se consideră punct de solidificare


temperatura cea mai ridicată observată în
cursul solidificării.

47
47
DETERMINAREA PUNCTULUI DE PICURARE
Punct de picurare = temperatura la care se desprinde prima picătură din
substanţa încălzită în aparatul Ubbelohde
Se efectuează la produsele de consistenţă solidă sau moale care prin
încălzire se topesc şi curg.
 Aparatul este format din:
 două manşoane metalice (a) şi (b)
 manşonul metalic (a) este fixat la un
termometru cu mercur.
 termometrul trebuie astfel gradat încât
intervalul care reprezintă 1oC să aibă
dimensiunea de 1 mm. Baza rezervorului cu
mercur trebuie să se găsească la nivelul
marginii inferioare a două lame (e) care strâng
manşonul metalic (b).
 Manşonul metalic (b) are un orificiu lateral (c)
care permite egalizarea presiunii şi este
prevăzut cu trei puncte de oprire (d) pentru
cupa metalică (f) de formă cilindrică.
 Cupa metalică (f) se montează în manşonul
metalic (b) până la punctele de oprire (d).
 Aparatul este menţinut suspendat în centrul
unei eprubete, cu lungimea de 200 mm şi
diametrul de 40 mm, care serveşte ca baie de
aer.
Aparatul Ubbelhode 48
48
• Cupa metalică (f) se umple cu proba de analizat
(netopită) si se fixează între cele două lame (e).
Lichidul din pahar se încălzeşte, se agită cu o
baghetă de sticlă, până când termometrul arată
o temperatură cu 100C sub punctul de picurare
presupus şi se continuă încălzirea, astfel încât
temperatura să se ridice cu 10C/minut. Se
notează temperatura când se desprinde prima
picătură din cupa metalică (f).

Se consideră punct de picurare valoarea medie a trei


determinări, între care nu trebuie să existe o
diferenţă mai mare de 10C.

49
49
DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
• Punct de topire = temperatura la care o substanţă se topeşte
complet.
• Dacă substanţa se topeşte cu descompunere, se consideră punct de
topire sau punct de descompunere, temperatura la care substanţa
îşi schimbă aspectul (se brunifică sau apar bule de gaze).

p.t. substanţe solide pulverizabile

 se efectuează în dispozitive speciale


sau într-un balon Kjeldahl cu
capacitatea de 150 - 250 ml, în care
se introduce un termometru potrivit.
 la termometru se ataşează, cu
ajutorul unui inel de cauciuc sau prin
aderenţă, un tub capilar din sticlă,
închis la un capăt.
 ca lichid de încălzire se foloseşte:
- apa distilată – p.t. < 700C
- parafina lichidă, acidul sulfuric sau
uleiul de silicon - p.t > 700C
50
50
 Determinare:
 proba de analizat pulverizată şi uscată se introduce în tubul capilar şi se tasează
pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm înălţime
 tubul capilar se ataşează la termometru
 incălzirea se efectuează astfel încât temperatura să se ridice cu 3 - 40C/minut.
 se citeşte temperatura la care substanţa se topeşte complet.
• În cazul substanţelor care se descompun prin încălzire prelungită, balonul se
încălzeşte, în prealabil, până la o temperatură cu aproximativ 100C sub punctul
de topire presupus, după care se ataşează capilarul cu substanţa şi se continuă
încălzirea astfel încât temperatura să se ridice cu 1 - 20C/minut.
• Dacă punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectuează, în
prealabil, o determinare orientativă.

51
51
În unele cazuri, specificate în monografii, punctul de topire se determină cu
un microscop special prevăzut cu un dispozitiv de încălzire.

Termomicroscopie ( microscop Boetius )


6

1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5 – sursă de lumină 5
6 – ocular
7 – mâner pentru poziţionarea probei
4

7 3
52
52
 p.t. - grăsimi, ceară, răşini şi produse asemănătoare
 un tub de sticlă deschis la ambele capete, (cu lungimea de 10 cm, cu
diametrul interior de 2 mm şi cu grosimea peretelui de 0.5 mm) se introduce,
prin presare şi rotire, în masa solidă ca atare (de exemplu unt de cacao) sau
în masa solidă topită

 tubul umplut se ţine timp de 24 de ore la gheaţă sau la o temperatură sub


150C, apoi se ataşează la un termometru cu ajutorul unui inel de cauciuc

 termometrul cu tubul fixat se introduce într-un balon Kjeldahl de 250 ml

 apa se încălzeşte, în prealabil, la o temperatură cu aproximativ 50C sub


punctul de topire presupus

 după introducerea tubului, încălzirea se continuă, astfel încât temperatura să


se ridice cu 10C/minut.

• Se consideră punct de topire, temperatura la care substanţa se


deplasează către partea superioară a tubului.

53
53
DETERMINAREA INTERVALULUI DE DISTILARE

• Intervalul de distilare al unui lichid sau al unei fracţiuni dintr-un


lichid = intervalul de temperatură corectat pentru presiunea
atmosferică normală de 101.3 kPa (760 mmHg) la care distilează
totalitatea lichidului respectiv sau fracţiunea specificată din lichidul
respectiv.

Tehnica de lucru:
 100 ml lichid de analizat se
măsoară cu un cilindru gradat şi se
introduc într-un balon de distilare
(a), în care se găsesc câteva
fragmente de porţelan poros, având
grijă ca lichidul să nu atingă gâtul
balonului şi, în special, tubul
lateral

 cilindrul (c) folosit ca recipient


pentru colectarea distilatului este
menţinut într-o baie de apă la
200C. 54
54
 balonul se astupă cu un dop străbătut de un termometru (g)
 balonul de distilare se introduce într-un dispozitiv cilindric din tablă
(e) şi (f)
 tubul lateral al balonului de distilare se fixează la un refrigerent (b)
 dacă p.f. > 1600C se foloseşte un refrigerent cu aer
 incălzirea cu becul (d) este astfel condusă încât prima picătură de
distilat să apară după 5 - 10 minute de la începutul încălzirii şi
lichidul să distileze constant cu o viteză de 4 - 5 ml/minut.

Aparat pentru determinarea


intervalului de distilare

55
55
În cazul determinării intervalului de distilare al unui lichid se citeşte
temperatura la care distilează primele cinci picături de lichid
(temperatura iniţială de distilare) şi temperatura la care distilează
totalitatea lichidului (temperatura finală de distilare).

Temperatura iniţială şi temperatura finală de distilare citite trebuie să


corespundă limitelor prevăzute în monografia respectivă.

În cazul determinării intervalului de distilare al unei fracţiuni sau al


fracţiunilor specificate dintr-un lichid, acestea se colectează între
limitele de temperatură prevăzute în monografia respectivă. Volumele
obţinute trebuie să corespundă prevederilor din monografia respectivă.

Dacă determinarea se efectuează la o presiune diferită de presiunea


normală, temperaturile de distilare citite trebuie corectate pentru
presiunea normală, conform formulei de la “determinarea punctului de
fierbere”

56
56
Pentru lichidele care distilează < 800C, încălzirea se
efectuează pe baia de apă, cu răcirea foarte activă a
refrigerentului.

• Distilarea eterului se efectuează pe baia de apă, la 54 -


580C.
• Balonul de distilare este aşezat pe o placă de azbest
perforată, astfel încât fundul acestuia să închidă complet
orificiul şi să fie cufundat în apă.
• Recipientul se închide cu un dop prin care trece o alonjă
prevăzută cu un tub lateral pentru egalizarea presiunii şi este
răcit în apă cu gheaţă.

57
57
DETERMINAREA APEI
1. Determinarea titrimetrică cu reactivul Karl – Fischer
• Metoda:
 se bazează pe reacţia dintre apă şi soluţia de dioxid de sulf, iod şi
piridină în mediu de alcool metilic absolut
 se aplică produselor care nu reacţionează cu componentele reactivului
Karl - Fischer.
 titrarea se efectuează de preferinţă într-un aparat cu circuit închis, ferit
de umiditatea atmosferică.

Metanol anhidru

Biuretă închisă
Titrare până la (I)
consumarea apei Soluţie de titrare

Probă - iod
- dioxid de sulf
- bază (ex. Py)
Titrare până la (II) în metanol anh.
echivalenţă
58
58
 sfârşitul titrării se stabileşte prin schimbarea culorii soluţiei in galben -
brun sau potenţiometric
 conţinutul în apă al probei se calculează după formula:

în care:
- V1 = volumul reactivului Karl - Fischer folosit la titrarea probei
(ml)
- V2 = volumul reactivului Karl - Fischer folosit la titrarea
martorului (ml)
- T = titrul reactivului Karl - Fischer
- m = masa probei luate în lucru (mg).

Substanţele insolubile în alcool metilic absolut se dizolvă în alcool etilic


absolut, cloroform sau acid acetic anhidru.

59
59
2. Antrenarea cu vapori de solvenţi organici

 Metoda:
 are la bază antrenarea vaporilor de apă de
către vaporii unui solvent nemiscibil cu apa
 se foloseşte în cazul unor produse lichide
sau moi şi al unor produse vegetale cu un
conţinut ridicat în ulei volatil

 operaţia durează ~ 2 ore

 se calculează după formula:

în care:
Aparat pentru determinarea apei
- V = volumul apei din eprubeta prin antrenare cu vapori de
gradată (ml) solvenţi organici
- m = masa probei luate în lucru
60
60
REZIDUUL PRIN CALCINARE
• Reziduul prin calcinare = reziduul obţinut prin calcinarea unei
substanţe anorganice sau organice.
• In cazul produselor vegetale reziduul obţinut se numeşte cenuşă.
• Calcinarea cu acid sulfuric
 după carbonizarea probei respective, creuzetul se răceşte şi se adaugă
acid sulfuric
 se încălzeşte cu precauţie pe sită până la îndepărtarea vaporilor de acid
sulfuric şi se calcinează până la masă constantă.
 limitele admise se exprimă în grame şi se calculează procentual (% m/m).
 determinarea se efectuează în creuzete din porţelan, nichel sau platină şi
este condusă după tehnica cunoscută: încălzire, calcinare, cântărire la
pondere constantă
 eventualele urme de cărbune se îndepărtează cu ajutorul apei, apei
oxigenate sau acidului nitric.
• Reziduul insolubil în acid clorhidric 100 g/l
 la reziduul obţinut după calcinare se adaugă HCl 100 g/l
 creuzetul acoperit cu o sticlă de ceas se încălzeşte pe baia de apă, se
adaugă apă caldă, se filtrează printr-un filtru fin, precipitatul se spală
până la îndepărtarea urmelor de clorură
 filtrul cu precipitat se usucă la 1050C şi se aduce în creuzetul iniţial,
calcinându-se până la masă constantă.
61
61
DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
• se bazează pe distilarea alcoolului
• se determina densitatea sau indicele de refracţie a distilatului
hidroalcoolic.

• Determinare:
 se foloseşte un aparat de distilare cu alonjă care trebuie să pătrundă în
apă
 se distilă nu mai mult de 30 minute
 se determină densitatea relativă cu ajutorul picnometrului şi se citeste
concentraţia în alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.

• se calculează dupa formula:

în care:
- c = concentraţia în alcool a distilatului
corespunzătoare densităţii relative (% m/V)
- m = masa probei luate în lucru (g).
62
62
 Dacă proba conţine:

 a. acizi volatili - se neutralizeaza cu hidroxid de sodiu şi se continuă


determinarea conform prevederilor generale

 b. baze volatile - se neutralizeaza cu acid sulfuric şi se continuă


determinarea conform prevederilor generale

 c. acizi şi baze volatile - se efectuează o primă distilare conform


punctului a, iar distilatul obţinut prelucrat conform punctului b, se
redistilă şi se continuă determinarea conform prevederilor generale

 d. iod liber - se decolorează cu tiosulfat de sodiu si se alcalinizează


pentru a reţine compuşii sulfuraţi volatili

 e. uleiuri volatile sau substanţe volatile înrudite - se adaugă clorură


de sodiu soluţie saturată, se extrage cu eter de petrol, soluţia
hidroalcoolică se distilă şi se continuă determinarea conform
metodologiei

 f. cantităţi mici de uleiuri volatile - extracţia cu eter de petrol nu se


mai efectuează. Pentru clarificarea distilatelor opalescente se foloseşte
talcul.

63
63
PIERDEREA PRIN USCARE

• procedeele si conditiile sunt prevăzute în monografie


• se stabileşte masa compuşilor volatili de orice natură din
substanţe farmaceutice, produse vegetale sau produse
farmaceutice, pierdută în anumite condiţii de temperatură,
presiune şi timp
• limitele admise se exprimă în grame şi se calculează procentual
(% m/m).

• Determinarea:
 se efectuează în fiole de cântărire al căror diametru se alege
astfel încât proba luată în lucru să formeze un strat de
aproximativ 5 mm grosime, cu excepţia produselor vegetale
(rădăcini, scoarţe, frunze etc.), la care grosimea stratului poate
fi mai mare (cel mult 2 cm)
 fiola de cântărire se aduce la masă constantă în
aceleaşi condiţii în care urmează să se efectueze
determinarea.
64
64
 proba luată în lucru, a cărei masă este prevăzută în
monografia respectivă, se pulverizează, dacă este cazul, se
uniformizează prin amestecare şi se cântăreşte la balanţa
analitică

 pulverizarea în cazul substanţelor higroscopice sau


eflorescente trebuie să se efectueze rapid

 produsele vegetale se mărunţesc până la gradul de fragmente


mici

 procedee:
- Uscarea în exsicator
- Uscarea în etuvă
- Uscarea în vid

65
65
 Uscarea în exsicator
 se efectuează în prezenţa unor substanţe deshidratante: acid sulfuric
(R), pentoxid de fosfor (R), clorură de calciu anhidră (R), silicagel
anhidru (R)

 Uscarea în etuvă
 fiola de cântărire cu proba luată în lucru se ţine în etuvă, la 1050C,
timp de 3 - 4 ore, dacă nu se prevede altfel, se răceşte în exsicator şi se
cântăreşte
 se continuă uscarea pe perioade de câte o oră, urmate de răcire în
exsicator şi cântărire, până la masă constantă

 uscarea substanţelor grase se efectuează într-o capsulă de porţelan, în


prealabil cântărită împreună cu o baghetă de sticlă
 proba luată în lucru şi 5 g de nisip (R) se cântăresc la balanţa analitică
în capsula de porţelan, se amestecă cu bagheta de sticlă şi se usucă în
etuvă, la 105oC, până la masă constantă.

Uscarea în vid
 se efectuează în etuvă sau în exsicatoare speciale,
conform prevederilor din monografia respectivă
 presiunea este de cel mult 2.7 kPa (20.3 mmHg),
dacă nu se prevede altfel.
66
66
PLANUL CURSULUI

1. SEPARAREA SUBSTANŢELOR MEDICAMENTOASE


2. EFICIENŢA SEPARǍRII
3. MECANISMELE SI FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ
PROCESELE DE SEPARARE
4. METODE DE SEPARARE

67 67
ETAPE in Analiza medicamentelor

selecţionarea probei

măsurarea probei

aducerea probei în condiţiile procesului impus:


- dizolvare
- tratamente preliminarii (pH, tampon, chelaţi etc.)

separarea componenţilor

determinarea analitică

prelucrarea si interpretarea rezultatelor


68 68
1. SEPARAREA SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE
 Formele farmaceutice sunt alcătuite din substanţe active şi
auxiliare, cu structură şi proprietăţi fizico-chimice extrem de
variate.

 Aparatura modernă de analiză instrumentală se remarcă


prin perfecţionările multiple adaptate continuu în vederea ridicǎrii
nivelului calitativ şi cantitativ.

 Cerinte:
 exactitate
 selectivitate
 sensibilitate
 rapiditate
 accesibilitate.

 Realizarea acestor cerinţe nu este posibilă fără separarea


judicioasă a tuturor constituenţilor probei, înainte de a se
proceda la identificarea şi determinarea cantitativă.
69 69
 Analiza corectă a unei probe multicomponente impune ca
înaintea determinărilor prin orice metodă, să se procedeze
la separarea constituenţilor unul de celălalt.

 Separarea = proces ipotetic de izolare a n fracţiuni distincte


macroscopic, fiecare fracţiune cuprinzând unul din cei n
componenţi care constituie amestecul de analizat.

 "ipotetic" = imposibilitatea practică de a realiza separarea


absolută a componenţilor din amestec, datorită intervenţiei
unor cauze multiple care produc interferenţe şi întrepătrunderi.

 Scopul separării = desprinderea componenţilor chimici din


proba iniţială, în medii libere de orice interferenţă,
asigurându-se astfel condiţii care să permită determinarea lor
corectă.

70 70
Schema generală a unui proces de separare:

 Prima etapă - se porneşte de la o fază omogenă la care se ajunge


printr-un procedeu fizic (aducerea în soluţie).

 A doua etapă - apare o nouă fază, se realizează un sistem eterogen


ca urmare a unor transformări chimice sau a unor procedee fizice
(adăugarea unui solvent nemiscibil cu primul).

 A treia etapă se despart fazele prin operaţii mecanice sau fizice şi mai
rar chimice.

(de multe ori etapa a doua şi a treia au loc simultan)


71 71
ECHILIBRUL INTERFAZIC

 Echilibrul = invariabilitatea proprietăţilor macroscopice ale sistemului


în timp.

 Echilibrul se consideră stabilit atunci când nu mai are loc


fenomenul de transfer interfazic, ceea ce reprezintă sub aspect
macroscopic un repaus aparent absolut.

 De fapt, în acest moment, transferurile interfazice au loc cu viteze


egale în ambele sensuri, echilibrul fiind un proces dinamic.

 Din punct de vedere termodinamic, echilibrul este atins când nu se


mai constată nici o variaţie a energiei libere în sistem, la
temperatură şi presiune constante (G)TP=0.

 În ambele faze aflate în echilibru, potenţialele chimice ale speciei i (i)


sunt egale: (i)1=(i)2.

 In funcţie de metoda de separare, fazele puse în contact notate cu 1 şi


2 au denumiri specifice:
 fază staţionară şi fază mobilă în cromatografie
 rafinat şi extractant în extracţia lichid - lichid.
72 72
 Echilibrul interfazic se exprimă prin coeficientul de distribuţie, D, definit
printr-un raport de concentraţie. Se obişnuieşte formularea lui D prin raportul
concentraţiilor molare în ambele faze, când se presupune distribuţia solutului
într-o singură formă. Astfel, pentru solutul A:

unde:
- [A] = concentraţia molară

sau:

unde:
- mA = masa solutului A
- MA = masa moleculară a solutului A
- V1, V2 = volumele fazelor.

• Raportul maselor aceluiaşi solut în cele două faze poartă numele de raport de
distribuţie sau factor de capacitate K. Acesta reprezintă o distribuţie
corectată cu volumele de fază ( = V1/V2):

K = D

 Factorul de capacitate:
 măsoară eficienţa separării
 permite optimizarea separării 73
73
2. EFICIENŢA SEPARǍRII

 Obiective:
 gradul superior de izolare a componentilor in medii libere de
interferente, care sa permita determinarea lor corecta.
 recuperarea cantitativă a tuturor componenţilor (sau numai a unor
componenţi) din proba supusă procedeului de separare

 Marimi:
 Factorul de recuperare – R
 Factorul de separare – S
 Factorul de selectivitate - 
 Factorul R – cromatografic

74 74
Factorul de recuperare (R)

 Factorul de recuperare R al unui component A:


 se exprimă prin raportul dintre cantitatea izolată QA şi cantitatea
iniţială din probă (QA)i.

 valoarea depinde de cantitatea relativă a componentului în probă:


o cantitate mare
 cantitativ - R  0,999

o cantitate mică (0,01-1 %)


 mulţumitor - R  0,990

o “urme” (10-4 -10-8 %)


 se acceptă – R  0,950

75 75
Factorul de separare (S)

 Factor de separare S:
 măsoară eficienţa separării a doi componenţi A şi B
 se defineste, de obicei, în funcţie de componentul care interferează:

76 76
Factorul de selectivitate ()

 Factorul de selectivitate 
 are semnificaţii în funcţie de tipul de metodă
 în distilare  = raportul presiunii vaporilor.
 în metodele de separare bazate pe echilibre interfazice  = raportul
coeficienţilor de distribuţie ai celor doi componenţi.

 trebuie să posede valori > 1.


 cu cât valorile sunt mai mari cu atât separarea este mai eficientă.
 Se impun două condiţii:
● produsul celor doi coeficienţi de distribuţie să prezinte o valoare cât mai
apropiată de unitate
● raportul volumelor fazelor implicate în lucru trebuie să aibă o valoare
acceptabilă.

77 77
Factorul R – cromatografic

 În cromatografie, estimarea procesului de separare se bazează pe


diferenţele între mobilităţile componenţilor din amestecul de analizat.

 Parametrul care reflectă aceste mobilităţi este factorul de întârziere R,


care este direct legat de modul de migrare al solutului în sistemul
cromatografic dat.

 Viteza de deplasare a fiecărei zone cromatografice depinde de echilibrul


interfazic, adică de competiţia între forţele de reţinere şi cele de
înaintare prin coloană, manifestate de faza staţionară şi respectiv de
faza mobilă.

 Componenţii vor migra de-alungul coloanei:


 în ordinea descrescătoare a afinităţilor lor pentru faza staţionară
 în funcţie de viteza fazei mobile.

78 78
 Fiecărui component îi corespunde o valoare R dată de
raportul dintre media vitezei de migrare a zonei şi media
vitezei de deplasare a fazei mobile:

unde:
- dz = deplasarea zonei (z)
- V = volumul fazei mobile
- AM = aria secţiunii transversale a coloanei ocupata de faza mobilă
- AS = aria secţiunii transversale a coloanei ocupata de faza staţionară
- D = coeficientul de distribuţie

79 79
 Considerând că:
 AM şi AS rămân invariabile de-alungul coloanei
 procesul cromatografic se desfăşoară liniar (D = constant)

unde:
- V = s x AM
- s = distanţa parcursă de solvent.

 Ultimele două relaţii scot în evidenţă faptul că, deplasarea


componenţilor prin coloană este diferită în funcţie de coeficienţii lor de
distribuţie.
80 80
 Astfel, două substanţe A şi B se vor deplasa prin coloana
cromatografică cu viteze diferite, potrivit valorilor proprii
corespunzătoare RA şi RB.
 Raportul lor permite aprecierea ordinii de înaintare pe coloană.

R A A M  DB A S

RB A M  D A A S

 Dacă DA > DB → RA < RB → componentul B va migra mai repede


prin coloană.

81 81
3. MECANISMELE SI FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ
PROCESELE DE SEPARARE

 Orice separare bazată pe distribuţia interfazică se explică prin


deosebirile de comportament ale componenţilor amestecului de
analizat, în raport cu cele două faze cu care vin în contact, ceea ce se
concretizează în particular prin echilibre reversibile sau ireversibile.

 Într-un proces de distribuţie interfazică intervin diverse tipuri de


interacţii:
 legături de hidrogen
 legături van der Waals
 legături ionice
 legaturi de chelatizare
 legături chimice specifice cu caracter covalent perfect reversibile sau
ireversibile
 interacţii de natură electrostatică
 fenomene de difuzie
 echilibre de ionizare, de precipitare, de solubilizare selectivă etc.

 Acestea se reflectă în valorile coeficienţilor de distribuţie interfazică.

82 82
 structura moleculelor în condiţii de coprezenţă
 polarităţile moleculelor
 forţele ce pot genera asocierile reversibile sau ireversibile care
reţin selectiv un component într-o fază, izolându-l de ceilalţi.

 Molecula unui solut este supusă unor interacţii provenite din trei
direcţii:
 interacţii cu moleculele fiecăreia din cele două faze cu care
vine în contact
 interacţii cu propriile molecule vecine.

 Natura forţelor care reţin moleculele de


solut în faze determină tipul de sorbţie.
 Modul particular al sorbţiei poate fi:
 la suprafaţa unei faze (adsorbţie);
 în interiorul unei faze (absorbţie).

 sistemul de separare = forma gazoasă,


lichidă sau solidă a celor două faze adiacente
83 83
 Recomandări pentru o separare bună:
o forma fizico-chimică cea mai convenabilă sub care diverşi componenţi
pot fi supuşi procesului de separare
o alegerea judicioasă a naturii, structurii şi compoziţiei cuplului de faze
care constituie sistemul de separare
o liniaritatea izotermelor de distribuţie a componenţilor, ceea ce
presupune valori constante ale coeficienţilor de distribuţie
o deosebiri cât mai mari între valorile coeficienţilor de distribuţie ai
diferiţilor constituenţi coprezenţi în probă
o încadrarea valorilor factorilor de capacitate între anumite limite,
favorabile pentru tot ansamblul de componenţi
o compatibilitatea capacităţii sistemului de separare cu cantitatea de
probă luată în lucru
o cantitatea de probă luată pentru analiză să fie convenabilă pentru
detecţia şi determinarea tuturor componenţilor, inclusiv a celor existenţi
în urme
o cunoaşterea factorilor favorabili şi nefavorabili care intervin în procesul
de separare
o asigurarea reproductibilităţii rezultatelor.

84 84
Legăturile interionice

 Forţele dintre ionii cu sarcină diferită sunt de atracţie, iar între


ionii cu aceeaşi sarcină sunt de respingere.

 Ruperea legăturilor ionice necesită o energie mare, din această cauză,


punctele de topire şi de fierbere sunt înalte, dar se reduc pe măsura
creşterii razelor, respectiv prin micşorarea energiei de reţea.

 Creşterea valenţei duce la apariţia unui caracter covalent şi la scăderea


punctelor de topire şi de fierbere.

 Combinaţiile ionice se dizolvă în solvenţi ce au o constantă dielectrică


mare. Conform legii lui Coulomb, aceşti solvenţi micşorează forţele
electrostatice care reţin ionii, permiţându-le să se deplaseze liber.

 Ionii din soluţie interacţionează cu moleculele de dizolvant pe baza


fenomenului de solvatare, respectiv de hidratare. Ionii pot fi dirijaţi în
câmp electric.

 Legătura ionică conferă combinaţiilor respective un ansamblu de calităţi


care sunt exploatate în multe metode de separare.

85 85
 Forţele van der Waals:
 scad exponenţial cu distanţa dintre nucleele
atomilor cei mai apropiaţi ai moleculelor considerate
 moleculele nu numai că se atrag, dar se şi resping
când distanţa dintre ele este prea mică.

 Se deosebesc trei tipuri de forţe van der Waals:


o atracţia electrostatică între molecule ce au dipol
permanent (Keesom)
o atracţia electrostatică între molecule cu dipol
permanent si indus (Debey)
o forţe de dispersie London, care apar între molecule
cu dipoli indusi.

86 86
Legăturile de hidrogen

 Legăturile de hidrogen sunt legături electrostatice de tip special,


depinzând de prezenţa unui atom de hidrogen şi de doi atomi
puternic electronegativi: F, O, N, Cl.

 Tăria acestor legături scade în aceeaşi ordine.

 Ca urmare iau naştere asociaţii moleculare cărora le corespund


proprietăţi anormale.

 Legăturile de hidrogen au un rol important în distribuţiile


interfazice în cadrul metodelor de separare.

87 87
prin volatilizare cromatografice
- Distilare

4. METODE DE SEPARARE

prin extracţie:
- lichid-lichid
- solid-lichid
- in faza solida
- cu fluide supercritice
88 88
METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE
- DISTILAREA -

 Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si


purificare a lichidelor.
 Separarea se bazează pe diferenţele dintre presiunile de vapori
ale lichidelor care compun un amestec.
 Pe scurt, distilarea presupune încălzirea lichidelor, separând
vaporii si recondensându-i pentru a obţine un nou lichid care
va fi concentrat în compuşi mai volatili.

PARAMETRII DE LUCRU ŞI EFICIENŢĂ:


 echilibrul de distributie vapori-lichid
 volatilitatea relativa
 talerul teoretic

89 89
1. Echilibrul de distribuţie vapori-lichid

 Distilarea, ca procedeu analitic, are la bază distribuţia


componenţilor conform volatilităţii lor între faza de vapori şi
o fază lichidă, ambele aflate în echilibru.

 Coeficientul de distribuţie al substanţei A, DA, între faza de


vapori şi faza lichidă având o compoziţie specificată, este
definit pentru o anumită temperatură şi presiune, prin:

DA 
 Av
Al
90 90
2. Volatilitatea relativă
 este o măsură a diferenţei dintre volatilităţile a 2 componenţi.

 indică dificultatea unei separări.

 se defineşte prin:
 raportul dintre fracţiunile molare ale unei specii în stare de vapori (x)v
şi în stare lichidă (x)l
 presiunea sa parţială raportată la fracţiunea molară din faza lichidă
(x)l.

 volatilitatea speciei A este:

 dacă volatilităţile relative dintre 2 componenţi sunt foarte apropiate


→ un indiciu că vor avea presiuni de vapori similare → vor avea
puncte de fierbere similare → vor fi dificil de separat prin distilare.

91 91
3. Talerul teoretic

 Separarea unui amestec complex prin volatilizare impune utilizarea


unor coloane de fracţionare.

 Acestea sunt constituite dintr-un număr de talere individuale, fiecare


corespunzând unei etape de evaporare-condensare.

 Asemenea coloană de fracţionare permite contactul efectiv dintre


lichid şi vapori, stabilindu-se echilibrul de distribuţie pe fiecare taler.

92 92
Legea Raoult pentru soluţii ideale
 Atunci când un sistem binar de lichide A şi B respectă legea Raoult
la orice concentraţie a amestecului, se numeşte sistem ideal.

 Presiunea vaporilor şi punctul de fierbere al sistemului este între


presiunea vaporilor şi punctul de fierbere al componentelor pure.

 Raoult a demonstrat experimental că, pentru un amestec ce conţine A


şi B, presiunea vaporilor pentru A , pA, atunci când A este într-o
cantitate foarte mare, este:

unde:
- xA este fracţia molarǎ a lui A în lichid;
- pA0 este presiunea vaporilor de A pur la o temperaturǎ datǎ.

 Atunci când A este solventul, iar B este solvitul, presiunea


vaporilor lui A este direct proporţională cu fracţia sa molară.
93 93
 Pentru o soluţie în care B este solventul, iar A solvitul,
presiunea vaporilor lui B este dată de legea lui Raoult:

Presiunea totală a sistemului

Diagrama presiunii vaporilor -


compoziţie pentru o soluţie ideală

94 94
DISTILAREA SIMPLĂ

 Distilarea simplă se utilizează pentru:

o separarea unui amestec de lichide a căror puncte de fierbere sunt


foarte diferite → distilatul obţinut nu va fi pur, compoziţia sa va fi
identică cu aceea a vaporilor la o temperatură şi presiune date şi va fi
calculată cu ajutorul legii lui Raoult

o separarea unor lichide de compuşi nevolatili → presiunea de


vapori a componenţilor este destul de diferită şi legea Raoult este
neglijată datorită contribuţiei nesemnificative a componentei mai
puţin volatile → distilatul obţinut va fi suficient de pur.

95 95
Instalaţia pentru distilarea simplă:

 sursa de incalzire
 flacon de distilare
 cap de distilare care conectează
flaconul de distilare la condensator
 termometru
 adaptor de distilare care leagă
condensatorul cu flaconul de
colectare
 flacon de colectare

96 96
 Tehnica de lucru:

 Lichidul care trebuie distilat este


plasat în flaconul de distilare şi
este încălzit până se atinge
punctul de fierbere.
 Pe măsurǎ ce lichidul fierbe,
vaporii urcă în capul de distilare,
iar lichidul condensat va picura
pe rezervorul termometrului.
 Eventualii vapori intră prin
braţul lateral al capului de
distilare şi apoi trec în
condensator.
 Odată ce vaporii sunt răciţi în
condensator cu ajutorul apei ce-l
înconjură, vaporii condensaţi se
transformă într-un lichid care
iese din condensator şi este
adunat în flaconul de colectare.

97 97
DISTILAREA FRACŢIONATĂ

Distilarea fracţionată
 se utilizează pentru separarea unui amestec de lichide
a căror puncte de fierbere sunt apropiate în cicluri
repetate vaporizare-condensare, în interiorul unei coloane
de fracţionare.

98 98
Instalaţia pentru distilarea fracţionată:

 are in plus fata de distilarea simpla


- o coloana de fracţionare inserata
între flaconul de distilare şi capul
de distilare, cu rol de a mari
suprafaţa în care amestecul poate fi
continuu vaporizat şi condensat.

 Tehnica de lucru:
 lichidul ce trebuie purificat este
încălzit
 vaporii urcă în coloana de
fracţionare
 condensează pe pereţii
condensatorului şi la suprafaţa
materialului de umplutură
 condensatul continuă să fie încălzit
de vaporii fierbinţi ce urcă şi va fi
revaporizat
 de fiecare dată rezultă vapori din ce
în ce mai concentraţi în
componentul mai volatil

99 99
 Coloana de fracţionare:
 lungimea şi materialul component influenţează numărul de
recondensări, numărul de talere teoretice, implicit separarea.
 este utilizată pentru a furniza un gradient de temperatură peste
cel necesar distilării.

 În situaţii ideale:
o temperatura în flaconul de distilare trebuie să fie egală cu punctul
de fierbere al amestecului de lichide
o temperatura de la capătul coloanei de fracţionare trebuie să fie
egală cu cel mai scăzut punct de fierbere al componenţilor.

 În realitate:
o fracţiunile de distilat trebuie să fie colectate pe măsura
desfăşurării distilării, concentraţia în compusul cu punctul de
fierbere cel mai mare fiind crescătoare
o Fracţiunile de distilat, ce sunt colectate într-un interval de
temperatură mic, vor fi mai pure.
o Alte fracţiuni trebuie colectate pe măsura schimbării temperaturii,
acestea fiind redistilate pentru a creşte gradul de puritate.

100 100
 Într-o distilare fractionată ideală, se obţin douǎ fracţiuni
diferite:
 prima - corespunde componentului cu punctul de fierbere
cel mai mic
 a doua - corespunde compusului cu punctul de fierbere
mai mare.

 O distilare fracţionată bună se caracterizează prin:


 creşterea bruscă a temperaturii între cele doua fracţiuni
 un volum foarte mic distilat la temperaturi, altele decât
punctele de fierbere ale lichidelor pure.

 În distilarea simplă se observă o creştere mult mai gradată a


temperaturii, reflectând impuritatea lichidului distilat.

101 101
Curbe de distilare

102 102
Legea Raoult pentru soluţii neideale

 Atunci când atracţia dintre moleculele celor două


componente ale amestecului este mai slabă decât cea dintre
moleculele fiecarui component, atunci când ele sunt
amestecate, volatilitatea lichidelor creşte.

 Prin urmare, creşte presiunea vaporilor şi scade punctul


de fierbere.

 Aceste sisteme prezintă o deviere mare de la legea lui Raoult.

103 103
 Punctul de fierbere al
compusului A pur este de 74oC
 Punctul de fierbere al
compusului B este de 69oC.

 In diagramă este prezentat un


amestec particular (19% A şi
81% B) pentru care compoziţiile
vaporilor şi lichidului în
echilibru sunt identice.
 Acest amestec are un punct de
fierbere de 57oC, mai mic decât
cel al compuşilor A şi B.
 La această temperatură,
Diagrama de fază a minimului de
lichidul fierbe fără a suferi
fierbere azeotrop
modificări în compoziţie.
 Acest amestec este numit
azeotrop.

104 104
DISTILAREA AZEOTROPĂ

 Majoritatea metodelor de distilare a azeotropilor şi a


amestecurilor cu volatilităţi relativ scăzute se bazează pe
adiţia unor compuşi chimici, special aleşi, care să uşureze
separarea.

 Metode de separare a amestecurilor de azeotropi:

1. distilarea azeotropă omogenă în care agentul de separare a


lichidelor este complet miscibil

2. distilarea azeotropă heterogenă (numită distilarea


azeotropă) în care agentul de separare, numit “intrus”
formează unul sau mai mulţi azeotropi cu alţi compuşi din
amestec şi determină existenţa a două faze de lichid pentru o
variaţie mare de compoziţie

105 105
3. distilarea ce foloseşte săruri ionice; sărurile disociază în
amestecul de lichid şi modifică volatilitatea relativă
suficient de mult ca separarea să devină posibilă

4. distilarea cu schimb de presiune în care se folosesc mai


multe coloane cu presiuni diferite pentru a separa
azeotropii binari care îşi schimbă semnificativ compoziţia
la o variaţie moderată a presiunii sau în care e introdus
un agent de separare ce formează un azeotrop sensibil la
presiune pentru a separa azeotropii insensibili la presiune

5. distilarea reacţională în care agentul de separare


reacţionează preferenţial şi reversibil cu unul dintre
constituienţii azeotropului; produsul de reacţie e apoi
distilat dintre componenţii nereactivi.

106 106
METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE

EXTRACŢIA LICHID – LICHID


 Extracţie = transferul unei substanţe dizolvate dintr-un solvent
în alt solvent nemiscibil cu primul.

 Distribuţia substanţei respective între cele două faze depinde de


solubilitatea acesteia în cei doi solvenţi.

 Componenţii supuşi distribuţiei interfazice manifestă preferinţe


pentru unul sau altul dintre solvenţi, participând selectiv la
procesul de transfer.

 Dacă la echilibru concentraţiile componenţilor sunt sensibil


diferite între cei doi solvenţi, procesul poate fi utilizat în scopul
separării lor.

107 107
PARAMETRII PROCESULUI DE EXTRACŢIE

 Etape in extracţia lichid – lichid:


1. formarea speciei extractibile şi punerea sa în contact cu
sistemul de solvenţi adecvaţi

2. sedimentarea

3. decantarea

4. determinarea cantitativă a componenţilor izolaţi

5. recuperarea solvenţilor

 Etapa cea mai importantă este cea de selecţionare a sistemului de


solvenţi şi stabilirea formei sub care este extrasă substanţa. Aceasta
se poate realiza prin cunoaşterea parametrilor procesului de extracţie
care sunt:
● constanta de repartiţie
● coeficientul de extracţie
● factorul de recuperare.
108 108
Constanta de repartiţie (distribuţie)

• Dacă unui amestec de două lichide nemiscibile i se adaugă o


substanţă solubilă în ambele lichide, această substanţă se
repartizează între două straturi, în aşa fel încât, dacă temperatura
nu variază, raportul concentraţiilor la echilibru rămâne totdeauna
constant conform legii de distribuţie a lui Nernst.

• În mod obişnuit, un sistem de extracţie este constituit din apă şi un


solvent organic nemiscibil cu apa.

• In solvenţii organici, caracterizaţi prin constante dielectrice mici,


speciile chimice se află în forme neionizate (molecule sau perechi
ionice), în timp ce în faza apoasă predomină formele ionizate.

• O substanţă A se repartizează în faza apoasă (aq) şi în cea organică


(o) conform echilibrului:
(A)aq ⇔ (A)o

109 109
 Prin aplicarea legii maselor rezultă coeficientul de repartiţie, D:

 Expresia este valabilă pentru:


 concentraţii mici
 tărie ionică neglijabilă
 temperatură constantă
 nu are loc nicio interactiune intre analit si solvent

110 110
Coeficientul de extracţie

 Substanţele se repartizează interfazic sub mai multe forme.

 Distribuţia unei singure specii nemodificate este măsurată prin


coeficientul de repartiţie.

 Distribuţia unui constituent, care apare în mai multe specii, se


reprezintă prin coeficientul de extracţie E.

 Coeficientul de extracţie E = raportul stoechiometric între sumele


concentraţiilor tuturor speciilor prezente în cele două faze.

 Pentru un constituent B coeficientul de extracţie este:

111 111
Factorul de recuperare

 Factorul de recuperare al unei substanţe extrase în n fracţiuni


de un solvent organic, cumulate după n extracţii, are expresia:

Randamentul de extractie

[ B]  VB
  100
[ B]  VB  [ A]  VA

112 112
SISTEME DE EXTRACŢIE
 Se clasifica în funcţie de:
o compuşii care se extrag: săruri anorganice, combinaţii complexe
formate de cationi anorganici cu reactivi organici sau compuşi chelaţi
simpli, poliacizi, perechi ionice formate dintr-un ion complex metalic
şi un ion reactiv organic etc.

o echilibrul de repartiţie: sisteme ideale care permit aplicarea legii


lui Nernst, sisteme neideale şi mixte

o natura extractanţilor: sisteme cu: solvenţi inerţi (extractanţi ai


speciilor nepolare), extractanţi acizi, extractanţi bazici, extractanţi
complexanţi, extractanţi ionici etc.

 Solventi:
 Hidrocarburi lichide: n-hexan, n-heptan, benzen, toluen, xilen
 Derivati halogenati: cloroform, tetraclorura de carbon
 Cetone: acetona, metilizobutilcetona
 Eteri: eter etilic, dioxan, terbutileter
 Alti solventi: acetonitril, dimetilsulfoxid, dimetilformamida
113 113
Avantajele extractiei lichid-lichid

 Separare selectiva, cu randamente bune

 Nu este influentata de adsorbtie, coloizi sau culoarea


solutiilor

 Echilibrele de extractie se stabilesc rapid

 Separarea fazelor nemiscibile se face rapid

 Se pot aplica atat pentru separarea unor cantitati mari de


substanta, dar si pentru concentrarea urmelor si
ultraurmelor de substante

114
PROCEDEE DE EXTRACŢIE LICHID-LICHID

 După sensul de curgere al lichidului şi după principiul


de funcţionare al instalaţiei:

1. Extracţia simplă
2. Extracţia continuă
3. Distribuţia în contracurent.

115 115
1. EXTRACŢIA SIMPLĂ

 se poate realiza în:


 contact unic
 contact multiplu

 utilizeaza o aparatură simplă - pâlnii de separare

 Multe lichide sunt nemiscibile cu apa, astfel încât la adăugarea


acesteia se vor forma 2 straturi. Stratul organic poate fi superior
sau inferior, dependent de densitatea relativă a solventului
organic şi a apei.

 Se presupune o soluţie cu 2 componenţi A şi B. La adăugarea


unui solvent organic şi după agitarea amestecului, dacă unul
dintre componenţi este mai solubil în solventul organic decât în
apă, va fi extras în solventul organic. Presupunem că, cel de-al
doilea component este solubil în apă, cei 2 componenţi au fost
separaţi în solvenţi diferiţi.

 Separarea poate fi îmbunătăţită prin creşterea numărului de


extracţii. Astfel, trei extracţii a 10 ml fiecare vor da o separare mai
bună decât o singură extracţie cu 30 ml solvent.

116 116
Extracţia simplă cu contact multiplu (extracţia în
echicurent)

 Se realizează prin introducerea cantităţii de extractant selectiv în


porţiuni mici, succesive în rafinat.
 Cantităţile de solvent adăugate pot fi egale sau nu.

Schema de principiu a extracţiei simple cu contact multiplu:


s - solvent; r - rafinat; e - extract; a - agitator; d – decantor
117 117
2. EXTRACŢIA CONTINUǍ

 se foloseste când coeficientul de


extracţie al substanţei care
interesează este mic

 se folosesc două tipuri de aparate


care se deosebesc după densitatea
extractantului: Aparate pentru extracţia continuă
o aparat Fridrich (a) - extractantul este
un solvent cu densitatea mai mică
decât faza extrasă
o aparat Wehrli (b) - extractantul este
un solvent cu densitatea mai mare
decât faza extrasă

118 118
3. DISTRIBUŢIA ÎN CONTRACURENT (Countercurrent
Distribution -CCD)

 este un procedeu de separare ce are la bază extracţia lichid-lichid a


substanţelor ce au un coeficient de separare apropiat

 “în contracurent” = cele două faze curg în direcţii opuse

 se utilizeaza tuburi sau pâlnii, două lichide nemiscibile, substanţa


găsindu-se dizolvată în una din faze.

119 119
ALTE PROCEDEE DE EXTRACŢIE

1. Procedeul Craig
2. Extracţia cu contact multiplu
3. Extracţia cu reflux
4. Extracţia diferenţială;
5. Extracţia în contracurent şi curgere bilateralǎ.

1. Procedeul Craig
 Este cel mai cunoscut şi eficient procedeu pentru realizarea
extracţiei în contracurent.
 Este denumit şi extracţie prin repartiţie fracţionată simplă.
 Aparatele moderne au peste 1000 de tuburi, procesul putând fi
automatizat.

120 120
Pâlnii (tuburi) Craig pentru extracţie în contracurent
a - de echilibrare a fazelor
b - poziţie de separare a fazelor (faza extractantă curge din 2 în 3, faza rafinat rămâne în 1)
c - poziţie finală, extractantul se deplasează din 4 în pâlnia următoare

 Când sunt prezente ambele faze, tubul se poate balansa în poziţiile a şi b.


 Când echilibrul este stabilit complet, fazele sunt separate, iar din poziţia
b faza mai uşoară poate să treacă în tubul următor.
 In final, tubul se aduce în poziţia c.

121 121
2. Extracţia cu contact multiplu

 constă în introducerea amestecului în prima unitate de extracţie, iar


a solventului în ultima

 rafinatul şi extractul organic circulă în contracurent.

Schema extracţiei în contracurent cu contact multiplu

3. Extracţia cu reflux

 se readuce în extractor o porţiune din produsele rezultate, fie numai


rafinatul sau extractul, fie ambele, cu scopul unei separări mai eficace.

122 122
4. Extracţia diferenţială
 se realizează într-un extractor constituit dintr-o coloană cu
umplutură sau dintr-un turn de pulverizare, în care unul din
lichide circulă într-un sens (faza continuă), iar celălalt este
dispersat în picături (faza dispersă) parcurgând coloana în sens
invers, ascendent sau descendent după densitate.

5. Extracţie în contracurent şi curgere bilaterală - Dual-flow


countercurrent extraction
 partea principală a coloanei este de
tip extractor.
 metoda este utilizată în special
pentru separarea enantiomerilor,
atunci când:
 există un agent de separare chiral
potrivit
 este posibilă reciclarea separatorului
chiral
 există un aparat în care se realizează
o separare continuă.
123 123
EXTRACŢIA SOLID-LICHID
Principii generale
 se aplică atunci cand este o fază solidă sau semi-solidă (material vegetal, pulberi
de forme farmaceutice solide etc.)
 implică operaţiile de extracţie de tip percolare, filtrare şi spălare.

 Are 2 etape, realizate în acelaşi aparat sau în aparate separate:


o contactul solventului cu materialul solid supus extracţiei şi transferul
constituientului solubil (solut) în solvent
o separarea sau spălarea soluţiei de reziduul solid

 Procesul complet include recuperarea solutului separat şi a solventului, prin


evaporare sau distilare.

APARATURA
 depinde de prima etapă
 termeni ce indicǎ tipul de aparat utilizat:
o “solid bed” sau “fixed bed” - se referă la orice operaţie în care prin materialul
solid fix trece solventul utilizat pentru extracţie
o “dispersed contact” - se referă la operaţiile în care particulele solide, suspendate
în fluid sunt în mişcare relativă unele faţă de altele şi faţă de solvent, în timpul
contactului solid-solvent.

124 124
1. Extractorul Soxhlet
 este un aparat de extracţie continua
 necesitǎ utilizarea unui solvent cu punct de fierbere mic
 se va acorda atenţie substanţelor extrase, labile la încǎlzire

125 125
 in extractor se pot introduce cartuşe sau “degetare” (thimles)
confecţionate din hârtie sau alte materiale

Cartuşe destinate extracţiei

 Se disting 3 etape ale extracţiei:


o difuzia solventului prin porii materialului solid
o dizolvarea solutului în solvent
o transferul soluţiei din materialul solid poros în soluţia finală.
 Cu ajutorul aparatului Soxhlet în fiecare etapă a operaţiei are loc
un contact multiplu solid-solvent proaspăt.
126 126
2. Extracţia accelerată cu solvent (Accelerated Solvent
Extraction - ASE)
 este o tehnică nouă, similară în principiu cu extracţia Soxhlet,
dar care foloseşte presiuni ridicate
 se caracterizează prin:
 reducerea timpului de extracţie (de la ore la minute)
 manipularea unor cantităţi mici de solvent.

127 127
EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA
(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)

 este un proces de separare prin care compuşii dizolvaţi sau suspendaţi


într-un amestec lichid sunt separaţi de alti compusi din amestec în funcţie
de proprietăţile lor fizice şi chimice

 poate fi folosită pentru a izola analiţii de interes dintr-o mare varietate de


matrici, inclusiv urină, sânge, apă, băuturi, sol, şi ţesuturi de origine
animală

 utilizează afinitatea substanţelor dizolvate sau suspendate într-un lichid


(faza mobilă), pentru un solid prin care proba este trecută (faza staţionară)
pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite şi nedorite

 rezultatul
 analiţii de interes doriţi sau impurităţile nedorite din proba sunt reţinute
pe faza staţionară
 partea care trece prin faza staţionară este colectată sau casată (daca
conţine analiţii doriţi sau impurităţile nedorite)
 in cazul în care porţiunea reţinută în faza staţionară include analiţii
doriţi, aceştia pot fi apoi separaţi din faza staţionară prin colectare printr-un
proces suplimentar, în care faza staţionară se spală cu un eluent
corespunzător.
128
Etapele SPE

• cartuşul (coloana de extractie) este echilibrat cu un solvent nepolar sau


uşor polar, care umectează suprafaţa si pătrunde în fază.
• suprafaţa silicei se spală cu un solvent sau cu o solutie tampon
• se aplica proba în cartuş
• când proba trece prin faza staţionară, analiţii vor interacţiona şi vor fi
reţinuţi de adsorbant, în timp ce impurităţile trec prin cartuş
• cartuşul se spală cu un solvent pentru a elimina impurităţile
• analitul este eluat cu un solvent potrivit
129
 Faza staţionară:
 se găseşte sub forma unor seringi ambalate în formă de cartuş,
placă, sondă, disc sau un dispozitiv MEPS (microextractor cu
adsorbent amabalat)
 varietatea acestora permite procesarea mai multor probe pentru
a fi extrase
 un distribuitor SPE poate găzdui 6-24 cartuşe
 cele mai multe varietaţi SPE sunt echipate cu un sistem de
vidare (măreşte extragerea probei din faza staţionară)

130
 cartuşele de extracţie in fază solidă şi discurile sunt disponibile cu o
varietate de faze staţionare din care se pot separa analiţii în funcţie de
proprietăţile chimice
 cele mai multe faze staţionare sunt bazate pe silice, pe care a fost inserată
o grupă funcţională specifică
 unele dintre aceste grupări funcţionale includ:
 lanţuri de hidrocarburi de lungime variabilă (SPE cu fază inversă)
 grupă de amoniu cuaternar sau grupe amino (schimb anionic)
 acid sulfonic sau grupări carboxil (schimb cationic).

131
SPE CU FAZĂ INVERSĂ

 separă analiţii functie de polaritatea lor


 faza staţionară a unui cartuş SPE cu fază inversă este un compus
derivatizat cu lanţuri de hidrocarburi
 reţine compuşii care au o polaritate scăzută la jumatate datorită efectului
hidrofob
 analitul poate fi eluat prin spalarea cartuşului cu un solvent nepolar,
care perturbă interacţiunea dintre analit şi faza staţionară.

132
Silicagelul şi suprafaţa polară modificată

133
SPE PRIN SCHIMB IONIC
 schimbul de ioni are loc pe baza interacţiunilor electrostatice între
analit şi grupările din faza staţionară
 pentru ca schimbul de ioni să se producă, atât în faza staţionară cat şi
în probă trebuie să fie un pH adecvat în care se face schimbul.

134
SCHIMBUL ANIONIC

 Sorbenţii schimbători de anioni:


 sunt compusi cu grupări funcţionale încarcate pozitiv care
interacţionează cu anioni incarcati negativ, cum ar fi compusii
acizii
 contin grupări de amoniu cuaternar, care au o sarcină
permanentă pozitiva în soluţii apoase, iar sorbenţii slabi au în
structura lor grupări amino care sunt percepute atunci când pH-ul
este mai mic 9.
 sorbenţii puternici sunt utili deoarece orice impuritate puternic
acidă din eşantion se va lega de absorbant şi nu va fi eluată cu
analitul de interes

 pentru a recupera un analit puternic acid trebuie să se utilizeze


un cartuş de schimb ionic slab
 pentru a se elua analitul din adsorbantul puternic sau slab, faza
staţionară este spălată cu un solvent care neutralizează sarcina
analitului, fazei staţionare sau a ambelor
 odată ce sarcina este neutralizată, interacţiunea electrostatică
între analit şi faza staţionară nu mai există şi analitul va fi eluat
din cartuş.
135
SCHIMBUL CATIONIC
 Sorbenţii de schimb cationic:
 sunt compusi cu grupări funcţionale încarcate negativ care
interacţionează cu cationii incarcaţi pozitivi, cum ar fi compusii
bazici
 sorbenţii puternici conţin grupări alifatice de acid sulfonic, care
sunt întotdeauna încărcate negativ în soluţie apoasă.
 sorbenţii puternici sunt utili deoarece orice impuritate puternic
bazică din eşantion se va lega de absorbant şi, nu va fi eluata cu
analitului de interes.

 pentru a recupera un analit puternic bazic trebuie utilizat un


cartuş slab de schimb de cationi.
 pentru eluarea analitului din adsorbantul puternic sau slab,
faza staţionară este spălată cu un solvent care neutralizează
interacţiunea ionică între analit şi faza staţionară.

136
Aplicaţiile SPE
• Determinarea unor medicamente cu caracter acid/neutru/bazic

137
alprenolol
Profilul de eluţie al
compuşilor bazici

difenhidramină

nortriptilină
138
ibuprofen
Profilul de eluţie
al compuşilor
acizi

acid nalidixic

naproxen
139
Profilul de eluţie al
compuşilor neutri –
hidrocortizon

Concluzii:

• pH-ul și % de modificator organic joacă un rol critic în determinarea


retenției și eluţiei compușilor ionizabili în SPE cu fază inversă.
• Fazele mai hidrofobe, cum ar fi C18 au o afinitate mai puternică și mai
largă pentru o gamă mai largă de compuși, permițând astfel solvenți de
spălare mai puternici. Totuşi, sunt necesari solvenți de eluţie mai
puternici, pentru a elua compușii de interes.
• In contrast, faze mai puțin hidrofobe, cum ar fi CN-SPE pot necesita
solvenți de spălare mai slabi, dar compușii pot fi eluaţi folosind solvenți
de eluare mai slabi
• Prin dezvoltarea sistematică a metodei SPE se obține o mai bună
înțelegere a comportamentului analitului în raport cu modificările
condițiilor de extracție.
• Acest lucru permite dezvoltarea şi optimizarea unei metode mai
eficiente 140
• Analiza unor
antidepresive triciclice ȋn
ser şi plasmă

Compus Timp de retenţie Recuperare RSD %


(min) %
Trimipramina 2.564 100.0 5.53
Doxepină 3.048 96.5 8.04
Amitriptilină 3.433 98.9 5.74
Imipramină 3.865 97.2 6.09
Nortriptilină 5.349 88.9 9.49
Nordoxepină 5.788 85.0 5.29
Desipramină 6.067 85.3 5.04
Protiptilină 6.467 86.3 5.39 141
Avantajele SPE

• recuperări mari

• selectivitate îmbunătățită

• specificitate și reproductibilitate

• utilizarea solvenţilor organici apoşi

• un timp mai scurt de preparare a probei

• modalitate de desfăşurare mai ușoară și posibilitate de


automatizare

142
MICROEXTRACŢIA SP (SPME)

 implică utilizarea unui strat de fibre acoperit cu o fază de


extracţie, care poate fi un lichid (polimer) sau un solid (absorbant),
care extrage diferite tipuri de substanţe (compuşi volatili şi
nevolatili) din diferite tipuri de medii, care pot fi în stare lichidă
sau fază gazoasă
 după extracţie, fibra SPME este transferată la locul de injectare
al aparatului de separare, cum ar fi un gaz-cromatograf.
 Avantaje:
 rapiditate
 simplitate
 se poate face fără solvenţi
 limitele de detecţie pot ajunge la parţi per trilion (ppt).
 are potenţial pentru aplicaţii la locul de prelevare a probelor
 se poate face chiar de către nespecialişti fără a fi nevoie de
aparatura cum ar fi un gaz-cromatograf-spectrometru de masă.
 probele pot fi analizate mai târziu în laborator (zile), fără pierderi
semnificative de substanţe volatile. 143
144 144
PRODUS
antrenare cu
vapori de apa

A Bacid tartric
pH = 4 -5
Et-O-Et
Fractiune nemiscibila Fractiune miscibila
cu apa cu apa

Esteri Aldehida formica FAZA ETERICA FAZA APOASA


Alchil-X Acid acetic
Halotan Metanol Na2CO3 2% CHCl3
Acetofenona Etanol
Etilenglicol Faza apoasa
Faza cloroformica
Glicerina NaOH
Fara N si S p H = 10 - 13
digitoxina Et-O-Et
Cu N
papaverina
resesrpina Faza eterica Faza apoasa
Faza alcalina Faza eterica Cu N si S
Cu N si S
disulfiram promazina
acidulare NaOH clorotiazid NH3
thioridazid
Et-O-Et 2N pH = 9
Fara N si S
amfetamina CHCl3 iso-Prop
Fara N si S Faza apoasa brucina
Faza eterica
acid oleic
acid stearic Fara N si S Fara N si S
acid salicilic fenol mentol
Cu N crezol testosteron Faza organica Faza apoasa
glutetimid vanilina cortison
progesteron Cu N Cu N si S
fenilbutazona Cu N pilocarpina
amobarbital salicilamida Cu N sulfamide
bromisoval nitroglicerina morfina Cu N
Cu N si S hidroxialchilamine
tiopental cloramfenicol aminoacizi
adrenalina Fara N si S
bemegrid
isoprenalina hidrati
de carbon
145 145
Cu S
acizi sulfonici
EXTRACTIA CU FLUIDE SUPERCRITICE

PRINCIPII GENERALE

 Definiţie: Extracţia cu fluide supercritice este procesul de


separare a componenţilor unei probe, utilizând fluide
supercritice ca solvenţi de extracţie.

Starea supercritică, Fluid supercritic


 Definiţii
 Fluid supercritic = o substanţă care se află deasupra
temperaturii şi presiunii sale critice.
 Punct critic = temperatura şi presiunea cea mai ridicată la care
substanţa poate exista în echilibru vapori-lichid.

147
 Curba gaz-lichid este
cunoscută drept curba de
fierbere.
 Dacă ne mişcăm ascendent
de-alungul curbei de
fierbere, temperatura şi
presiunea cresc împreună,
atunci lichidul începe să fie
mai puţin dens datorită
73.8 expansiunii termice şi gazul
începe să fie mai dens la
presiune ridicată.
 Densitatile celor două faze
converg şi încep a fi identice,
diferenţa dintre gaz şi lichid
dispare şi curba de fierbere
Diagrama presiune –temperatură se termină in punctul critic
pentru CO2 (coexistă 3 faze).
148
• Capacitatea de dizolvare - este mai mare decât aceea a lichidului
corespunzator. Poate să varieze prin modificarea temperaturii şi presiunii, cu o
influenţă mai puternică a celei din urmă, mai ales în vecinătatea imediată a
punctului critic, aşa numita regiune apropiată de critic.

 ρ 
S  1.25P 1/2
c  
 ρ liq 

unde:
o S = solubilitate
o ρ = densitatea gazului
o ρliq = densitatea lichidului

• Conductibilitatea termica - este mai mare decât în cazul lichidelor.

• Tensiunea de suprafaţă şi căldura de vaporizare dispar.

149
Parametrii critici ai unor compuşi utilizaţi ca fluide supercritice

150
DIOXIDUL DE CARBON SUPERCRITIC

 Temperatura critică (31.3o C) este destul de joasă şi presiunea


critică (72,9 bari) este uşor de realizat.

 Molecula este simetrică → putere de dizolvare mare.

Avantaje:

 Toxicitate redusă.

 Nu este inflamabil sau exploziv.

 Este bacteriostatic.

 Este inofensiv din punct de vedere fiziologic

 Nu este periculos pentru mediu.

 Este foarte accesibil.


151
Densitatea CO2 în funcţie de presiune şi densitate

Constantele fizice ale dioxidului de carbon în cele trei stări


Gaz Fluid supercritic Lichid

P = 0.1 Mpa TC, PC P = 0.1 Mpa


T = 150C T = 150C
Densitate,  (g/cm3) 0.0006-0.002 0.2-0.5 0.6-1.6
Vâscozitate Pa.s 10-30 10-30 200-3000
Difuziunea, cm2/s 0.1-0.4 0.6 x 10-3 0.2 x 10-5

152
Efecte de modificare

 Modificatori/antrenanţi :

o cresc puterea de dizolvare a gazului supercritic

o reduc presiunea de extracţie datorită creşterii solubilităţii

o volatilitatea cuprinsă între cea a solutului şi cea a fluidului


supercritic şi punctul de fierbere între 20 şi 1000C

 Exemple de modificatori:
o solvenţi tradiţionali: alcooli (metanol, etanol, izopropanol),
hidrocarburi clorurate, hexan, acetonă, apa

o amestecuri binare si ternare [C02-metanol-(apa)], [C02-etanol –


(apa); [C02-isopropanol sau (acetona)

153
APA SUPERCRITICĂ

154
Proprietăţile apei la 250
atmosfere

Diagrama de fază presiune –


densitate pentru apa
supercritică

155
METODE DE EXTRACŢIE CU FLUIDE
SUPERCRITICE
1. Extracţia lichid-fluid supercritic
o Este similară extracţiei lichid-lichid.
o Se utilizeazǎ pentru:
 creşterea concentraţiei în etanol în soluţiile apoase
 îndepărtarea alcoolului din bere.

2. Extracţia solid-fluid supercritic


o Este asemǎnǎtor extracţiei solid-lichid.
o Se aplicǎ pentru:
 decofeinizarea cafelei
 extracţia uleiurilor din petalele de trandafir

156
Exemple de plante pentru care se poate utiliza
extracţia cu fluide supercritice
Nr. Nume plantă Parte utilizată Produşi extraşi
1 Calendula flori oleorăşini
officinalis
2 Echinacea ȋntreaga plantă alkamide, polifenoli incluzând acid
purpurea cicoric, carbohidraţi
3 Eucalyptus spp frunze ulei esenţial
4 Ginkgo biloba frunze flavonoide şi terpenoide
5 Hypericum herba naftodiantone, hipericină şi
perforatum pseudohipericină
6 Levisticum rizomi uscaţi, rădăcini uleiuri esenţiale
officinale
7 Matricaria flori oleorăşini
chamomilla
8 Mentha spp. frunze uleiuri esenţiale
9 Origanum spp. herba uleiuri esenţiale
10 Piper methysticum rizomi, rădăcini kava lactone
11 Piper nigrum fructe oleorăşini
12 Saccharum spp ceară alcooli cu lanţ lung
13 Serenoa repens fructe acizi graşi liberi, fitosteroli (concentraţii
mici), alcooli graşi, TG
14 Taxus brevifolia scoarţă taxol
15 Taxus cuspidate ace paclitaxel si bacatin III
16 Vitis vinifera seminţe procianidine
17 Zingiber officinale rizom oleorăşini 157
Extractor cu fluide supercritice
pentru lichide şi solide

158
Avantajele extracţiei cu fluide supercritice:

o extracţia şi purificarea componentelor se face mult mai rapid


decât cu solvenţi convenţionali
o separarea componenţilor este mai selectivă
o proces fără reziduri de solvent şi compuşi anorganici
o se utilizeaza un solvent inert faţă de produs
o control uşor al procesului
o se realizează o extracţie continuă
o solventul se îndepărtează uşor
o se utilizează solvenţi netoxici
o componenţii cu puncte de fierbere crescute sunt separaţi la
temperaturi relativ scăzute
o pot fi realizate separări ce nu sunt posibile prin metodele
obişnuite
o se poate menţine o temperatură relativ joasă
o se poate cupla cu GC sau HPLC

159
APLICAŢIILE EXTRACŢIEI CU
FLUIDE SUPERCRITICE

160
• Industria farmaceutica:

o Obţinerea şi purificarea uleiurilor volatile (parfumuri).


o Separarea unor substante anticanceroase în vederea analizei
calitative şi cantitative (taxol, 5-fluorourcil,
azodicarbonamida, sustiva etc.).
o Extracţia alcaloizilor tropanici din plante (Datura candida,
Datura aurea, Erythroxylon coca).
o Extracţia compuşilor farmaceutici/nutritivilor.
o Curăţirea implantelor medicale.
o Uscarea aerogelurilor.
o Curăţirea caşetelor.

161
• Alimentaţie şi agricultură:

o Decofeinizarea cafelei (extracţia cofeinei).


o Studiul lipidelor din carne şi soia.
o Extracţia nicotinei.
o Extracţii din alimente.

• Industria petrochimică:

o Îndepărtarea apei din etanol.


o Extracţia polimerilor.

162
IDENTIFICAREA CHIMICA A MEDICAMENTELOR

IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR ANORGANICE

Identificarea unor cationi


Grupa analitica I – HCl

Cationi: Ag+, Hg+22, Pb+2

 Ag+
Substante medicamentoase: nitrat de argint, protargol, argint
coloidal, saruri de argint

Reactii identificare:
 HCl → AgCl
 NaOH + CuSO4 → precipitat + coloratie violeta

 Hg+22, Pb+2
 nu sunt folositi in substante medicamentoase

163
163
Grupa analitica II – H2S

Cationi: Hg+2, Bi+3, Cu+1,+2, As+3,+5, Sb+3,+5, Sn+2,+4

 Hg+2
Substante medicamentoase: HgO, saruri de mercur

Reactii identificare:
 2 HCl → HgCl2
HgCl2 + 2 KI → HgI2
HgI2 + 2KI → K2[HgI4]

 Bi+3
Substante medicamentoase: (BiO)2CO3 . 1/2H2O, Bi5O(OH)9(NO3)4

Reactii identificare:
 Bi+3 + S-2 → Bi2S3
 Bi+3 + 3I- →BiI3
BiI3 + I- → [BiI4]-
164
Grupa analitica III – (NH4)2S

Cationi: Co+2, Ni+2, Zn+2, Fe+2,+3, Cr+3, Mn+2, Al+3

 Zn+2
Substante medicamentoase: ZnO, ZnCl2, ZnSO4.7H2O

Reactii identificare:
 2 NaOH → Zn(OH)2
+ NaOH → [Zn(OH)4]-2
 Na2S → ZnS

 Al+3
Substante medicamentoase: Al(OH)3, Al2(SO4)3.18H2O

Reactii identificare:
 NaOH → Al(OH)3
+ NaOH → [Al(OH)4]-

165
Grupa analitica IV – (NH4)2CO3

Cationi: Ca+2, Ba+2, Sr+2

 Ca+2
Substante medicamentoase: CaCl2, CaCO3, gluconat de calciu,
glicerofosfat de calciu, fosfat tribazic de calciu, lactat de calciu

Reactii identificare:
 coloreaza flacara in rosu-caramiziu
 oxalat de amoniu → Ca(COO)2

 Ba+2
Substante medicamentoase: BaSO4

Reactii identificare:
 coloreaza flacara in galben-verzui
 SO4-2 → BaSO4

166
Grupa analitica V

Cationi: Mg+2, Li+, Na+, NH4+, K+

 Mg+2
Substante medicamentoase: MgO,MgSO4.7H2O, carbonat bazic de
magneziu, stearat de magneziu, glutamolactat de magneziu

Reactii identificare:
 NH4Cl + Na2HPO4 + NH3 → MgNH4PO4
 NET → coloratie rosie

 Na+
Substante medicamentoase: NaCl, NaBr, NaF, NaHCO3, cetistearat de
sodiu, ciclamat de sodiu, glicerofosfat, LSS

Reactii identificare:
 coloreaza flacara in galben
 acetat de uranil → NaUO2(CH3COO)3

167
 NH4+
Substante medicamentoase: NH4Cl, NH4Br

Reactii identificare:
 reactiv Nessler
 NaOH, t0C

 K+
Substante medicamentoase: KCl, KBr, KMnO4, tiocol, tartrat de
sodiu si potasiu, tartrat acid de potasiu

Reactii identificare:
 acid tartric → precipitat alb cristalin
 coloreaza flacara in violet (prin sticla de cobalt)

 Li+
Substante medicamentoase: Li2CO3

Reactii identificare:
 coloreaza flacara in rosu carmin
 HCl + NaOH + Na2HPO4 → Li3PO4

168
168
Identificarea unor anioni

Grupa Anionii Reacţii de identificare


analitică
I Cl-, Br-, I- + AgNO3
clorhidraţi de amilocaină, + KMnO4
cisteină, chinină, ioduri, albăstrirea hârtiei ȋmbibate cu
bromuri KI şi amidon
colorarea ȋn violet a stratului de
cloroform
II NO2-, S-2, CH3COO- inelul nitrozoferos
acetat de hidrocortizon + FeCl3 → acetat bazic de fer
III citrat, tartrat, oxalat, SO3- + CaCl2 → precipitat alb
2, BO -3, CO -2 + CH3COOH → precipitat alb
3 3

IV PO4-3, AsO3-3, AsO4-3, S2O3- + AgNO3→ precipitat galben


2 + molibdat de amoniu
V NO3-, ClO3-, MnO4-
VI F-, SO4-2
VII SiO3-2

169
169
IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR ORGANICE

TESTE DE CULOARE
 Foarte multe substanţe dau coloraţii distincte atunci când reacţionează
cu diverşi compuşi

 Reacţia de culoare poate să nu fie specifică şi să nu caracterizeze un


singur component, dar ne orientează asupra clasei din care face parte
compusul cercetat.

 Testele de culoare:
 teste generale
 “teste speciale”
- se produc coloraţii cu un singur reactiv şi sunt specifice numai unui
singur component
- aduc un aport deosebit la identificarea substanţelor, dar validarea
rezultatului trebuie confirmată după determinarea unor constante sau
caracteristici fizice, cum ar fi spectrul IR etc

 pot fi considerate drept testări micro deoarece utilizează cantitãţi de


substanţă de ordinul microgramelor.

170
170
Teste generale
 se referă la coloraţia sau coloraţiile obţinute prin tratarea unor
substanţe medicamentoase cu diferiţi reactivi de natură
anorganică.

171
171
172
172
173
173
174
174
175
175
176
176
MICROTESTE
 Foarte multe reacţii de culoare pot avea loc în condiţiile unor concentraţii scăzute
de ordinul microgramelor. Aceste reacţii se pot executa cu ajutorul unor
microcapilare sau micropipete.

1.Testul cu acid sulfuric şi formaldehida (testul Marquis)


 formează cu majoritatea substanţelor medicamentoase şi auxiliare fie o singură
culoare, fie mai multe culori.
 Culoarea obţinută depinde de cantitatea de substanţă folosită şi de puritatea sa
 Exemple:
- apomorfina, etilmorfina: negru
- clorpromazina, codeina, morfina: purpuriu - violet
- berberina, harman, propranolol: verde
- clorfenoxamina, clortetraciclina: galben - verde
- colchicina, clordiazepoxid, mepacrin, vancomicina: galben
- dipiridamol, etacridina, fentanil, tetraciclina: oranj
- flufenazina, vinblastina: roşu.

177
177
2.Testul Vitali
se aplică alcaloizilor cu
nucleu tropanic
se observa mai multe
coloraţii:
- coloraţia A se obţine după
tratarea probei cu acid nitric
concentrat
- coloraţia B se observă după
evaporarea la sec pe baia de
apă a probei tratate cu acid
nitric
- coloraţia C se obţine la
tratarea reziduului colorat B cu
o soluţie proaspăt preparată de
hidroxid de potasiu etanolic.
178
3.Testul cu molibdat de amoniu (testul Froehde)

4.Testul cu vanadat de amoniu (testul Mandelin)

5. Alte microteste:
- p-dimetilaminobenzaldehida
- clorura ferică
- paraformaldehida cu acid fosforic
- acid sulfuric
- testul taleochinic.

179
179
TESTE DE MICROCRISTAL
 sunt teste simple, rapide, sensibile şi specifice pentru identificarea unui număr
mare de substanţe medicamentoase.

 se folosesc cu succes pentru identificarea finală a unor substanţe, identificare


menită să confirme determinările provizorii efectuate prin metodele cromatografice
sau spectrofotometrice

 testul se aplică cu deosebit succes pentru identificarea substanţelor


medicamentoase bazice cu azot în moleculă, dar poate fi adaptat şi pentru
compuşii cu caracter neutru sau acid.

 In forma sa cea mai simplă testul constă în amestecarea unei picături din
soluţia substanţei de analizat cu aceeaşi cantitate din soluţia unui reactiv.

 Operaţia se execută pe o lamă de microscop şi cristalele formate se examinează la


microscop.

 Această examinare este posibilă dacă există cantitate suficientă din proba de
analizat şi dacă cristalele care trebuie să se formeze apar instantaneu sau în
foarte scurt timp.

 identificarea se face pe baza comparării cristalelor formate în urma unei reacţii


chimice dintre substanţa de analizat, respectiv substanţa etalon şi un anumit180
reactiv. 180
 Dacă cristalele apar lent şi dacă pentru mărirea sensibilitãţii se folosesc
cantitãţi mai mari de soluţie este posibil ca prin pierderea solventului să se
obţină o soluţie saturată în care să cristalizeze reactivul şi să mascheze astfel
cristalele adevărate.

 Clarke şi Williams au adus îmbunătãţiri acestui procedeu de identificare, ridicînd


sensibilitatea determinărilor de ordinul microcantitãţilor obţinute chiar de
pe o cromatogramă.

 Procedeul propus de ei constă mai întâi în obţinerea unor microcapilare de


diametrul 0,1 cm. Cand capătul unui astfel de microcapilar va atinge suprafaţa
unui lichid, după îndepărtare va purta cu sine o micropicătură aderentă. Această
cantitate reprezintă standardul folosit în toate testele de microcristal şi
microculoare şi are un volum de aproximativ 0,1 - 0,05 ml soluţie şi furnizează
astfel material pentru efectuarea a 500 de teste.

 Dificultãţi în caracterizarea cristalelor:

 impuritãţile din soluţia de testat conduc la crearea de cristale neregulate →


impuritãţile se pot îndepărta numai după o prealabilă cromatografiere.

 polimorfismul - in condiţii diferite de temperatură, presiune etc. un compus


poate cristaliza în forme foarte variate → cristalele, test probă şi standard se
obţin în condiţii identice.

 concentraţia - influenţează forma cristalelor → proba test şi cea standard să


fie de concentraţii apropiate

181
181
 Când a avut loc obţinerea cristalelor, acestea se vor observa din punct de
vedere al aspectului, poziţiei şi dispunerii lor. Pot fi de asemenea
fotografiate.

 Trebuie avut în vedere că anumite cristale sunt instabile, putând dispare într-o
oră sau într-un interval mai mic. Acestea se compară imediat sau se
fotografiază.

 Descrierea cristalelor, desenele şi fotografiile facilitează identificarea


substanţelor. Se recomandă ca identificarea finală să se facă prin compararea
cristalelor formate din proba de analizat cu cele obţinute dintr-o soluţie
cu substanţă etalon.
182
182
 Aceste descrieri nu pot fi exacte deoarece forma unor cristale
variază imperceptibil prin trecerea lor dintr-o formă în alta.

 Ac = cristal lung şi
subţire cu capetele
ascuţite.
 Lamă = formă
asemănătoare acului ce
devine plat când lungimea
şi lãţimea cresc în mod
egal şi proporţional.
 Baghetă = formă
asemănătoare unui ac
având însă capetele
pătrate.
 Tabletă = placă de grosime apreciabilă ce devine prismă când
creşte în grosime.

183
183
 Stea = rozetă cu patru sau cel mult şase colţuri, în timp ce o
cruce defineşte un cristal de această formă.
 Buchet = complex de
cristale denumite astfel
când toate sunt orientate
în aceeaşi direcţie.

 Dendritele = cristale cu
multe ramificaţii.

 Aşchiile = baghete şi ace


mici neregulate.

 Rozetă = colecţie de
cristale ce radiază dintr-o
singură încrengătură.
 Evantai sau o coamă = îngrămădire de astfel de rozete.

 Snop = coamă dublă

184
184
Reactivi

 Regulă generală = concentraţiile soluţiilor = 1 - 0,1 %.

 acidul acetic 2 N - foarte bun solvent

 acid clorhidric diluat – se formeaza numeroase cristale

 acizi minerali concentraţi: sulfuric, fosforic

 Solventul poate conţine 50 % alcool acidulat.

 Se interzice utilizarea unor concentraţii mai mari de alcool


pentru a evita precipitarea unor reactivi.

 Stabilitatea reactivilor 1-2 ani

185
185
o acid picric (soluţie saturată apoasă) pentru: acetofenazina, acetildihi-
drocodeina, ambazina, atropina, benzocaina, fenazona, fentanil,
guanetidina, ergometrina, nicotinat de benzil, primaquin
o acid picrolonic (soluţie saturată apoasă) pentru:
acetildihidrocodeină, fentermin, ftalilsulfatiazol, piperazina, proguanil.
o acid stifnic (5 % în apă) pentru: acefilina, buformin, dipiridamol,
folcodin, imipramina, propranolol, racemetorfan
o acid trinitrobenzoic (soluţie saturată apoasă) pentru: acriflavina,
azapetin, benzamin, ergometrina, etacridina, perfenazina,
racemetorfan
o bromura de aur (5 g AuBr3, 5 g NaBr la 100 ml apă) pentru:
adrenalină, ametocaina, amicarbalid, apomorfina, buformin, carbacol,
clorpromazina, feniramina, metronidazol, propranolol, oxitetraciclina
o bromura de platină (5 g PtBr4, 10 g NaBr la 100 ml apă) pentru:
alfameprolin, azapetin, dexamfetamina, metadona
o carbonat de sodiu (5 % în apă) pentru: aconitina, adrenolona,
amifenazol, antazolin, clordiazepoxid, cinconina, cinconidina,
chinidina, tetraciclina, tebaina
o cianura de aur (5 g AuBr3 şi NaCN până la redizolvarea
precipitatului în 100 ml apă): azacosterol, desipramina, mepacrina,
tioridazina
o cianura de potasiu (5 % în apă): antazolin, iohimbina, levome-torfan,
lobelina

186
186
o clorura de aur (5 % în apă) pentru: amilocaina, cafeină,
clorpromazina, cocaina, feniramina, metildopa, tiamina
o clorura mercurică (5 % în apă): acetilcolina, adrenalina, amidopirina,
benzocaina, cofeină, metadona, tebaina, vancomicina
o clorura de platină (5 % în apă): acefilina, acepromazina, aletamin,
alfameprodin, ametazol, cinconidina, droperidol, stricnina, tiamina
o clorura de zinc (5 % în apă): alfametadol, benzetoniu, imipramina,
papaverina, norcodeina, metixen
o cromat de potasiu (5 % în apă): acetofenazina, alfametadol,
desipramina, sulfanilamida
o fosfat disodic (5 % în apă): adrenalona, oxitetraciclina, sulfadiazina,
sulfametoxazol, sulfafenazol, tetraciclina
o iodura de platină (5 g PtI4, 25 g NaI în 100 ml apă): ambenoniu,
clorfeniramină, clorproguanil, efedrină, levometorfan
o iodura de plumb: bisacodil, bromfeniramina, carbamazepin, cocaina,
dipiridamol, hidralazina
o iodura de potasiu (5 % în apă): amidopirina, chinidina
o iodura de zinc (5 % în apă): alcuronium, levometorfan
o metilarseniat disodic: racemetorfan

187
187
o nitroprusiat de sodiu (1 % în apă): hidromorfon

o permanganat de potasiu: pentru aconitina, promazina

o tetraiodocadmiat de potasiu: bretilium, diazepam, etacridina,


morfina, papaverina

o tetraiodobismutat de potasiu: amidricaina, carbacol, efedrina,


etamfilina, etinamat, gentamicina, isoniazid, metronidazol

o tetraiodomercuriat de potasiu: diazepam, dionina, stricnina

o tiocianat de amoniu (5 % în apă): acriflavina, ambazona, cipro-


heptadina, droperidol

o triiodura de potasiu: acepromazina, atropina, codeina,


difenhidramina, dionina, fentanil, mepacrin, oxicodon, progesterona;

188
188
Aplicaţii specifice ale testului

 aplicabilitate mică în cercetarea generală a unui medicament


cu o structură necunoscută.
 valoarea sa este deosebită atunci când se pune problema
diferenţierii compuşilor cu structură similară ce nu pot fi
diferenţiaţi nici cromatografic, nici spectral.
EXEMPLE
 Fenmetrazina şi fendimetrazina
- analizate cromatografic au valori Rf foarte apropiate ce nu
permit diferenţierea lor,
- spectrul lor în UV este similar ceea ce face imposibilă
diferenţierea lor

testul de microcristal

- fenmetrazina + acidul picrolonic → rozete


dense
- fendimetrazina + acidul picrolonic → masă de
ace mici.
189
189
 diferenţierea izomerilor optici

 3-hidroxi-N-metil-morfinanul:
 izomerul (-) levorfanul şi racemicul racemorfanul = actiune
narcotica
 Izomerul (+) dextrorfanul = lipsit de această acţiune.

 Diferenţierea:
 racemorfanul se dizolvă în acid
clorhidric 2N şi se tratează cu
Na2CO3 → buchete de plăci mici în
30 minute

 în aceleaşi condiţii levorfanul şi


dextrorfanul → precipitate amorfe
care nu cristalizează nici după 48 de
ore.

190
190
 Pentru a diferenţia izomerii optici între ei se procedează astfel:

o picătură din soluţia de analizat


+
o picătură dintr-o soluţie etalon de levorfanol
+
o picătură din reactivul carbonat de sodiu

dacă proba conţine levorfanol →


adaosul de soluţie etalon nu va afecta
şi precipitatul format va fi amorf.

dacă proba conţine dextrorfan → la


adăugarea soluţiei etalon de levorfan
şi a reactivului se vor forma cristale
tipice pentru racemic.
191
191
 Acidul trinitrobenzoic dă rozete sau cristale cu racemorfanul şi
un precipitat amorf sau picături uleioase cu izomerii (+) sau (-).
 Tiocianatul de amoniu formează cu izomerii (+) şi (-) picături
uleioase şi cu racemicul cristale sub formă de plăci.
 Clorura de aur formează ace mici, curbate şi neregulate cu
propioxifenona racemică şi nu formează decât în timp ace mari
cu izomerii (+) şi (-).

 izomerii (+) şi (-) ai amfetaminei şi forma racemică


 soluţie 1 % de substanţă + bromura de platină

 formele (+) şi (-) - amestecuri de plăci şi


prisme romboidale, puternic polarizabile
 forma racemică - mase de plăci subţiri
neregulate, care polarizează slab.

192
192
 Atropina / hiosciamină
+
triiodura de potasiu

 cristale sub forma de


hexagoane neregulate asociate
în buchete sau snopi →
atropina

 plăci şi prisme, cristale în


formă de cruce şi capete de
săgeţi → hiosciamina

193
193
 Feniramina şi derivaţii săi halogenaţi - clorfeniramina,
dexclorfeniramina, bromfeniramina, dexbromfeniramina

o Feniramina ≠ derivaţii halogenaţi


 CH → feniramina Rf = 0,27, derivaţii halogenaţi Rf = 0,45.

o Derivaţii cloruraţi ≠ derivati bromuraţi


 în lumina UV → cei cloruraţi sunt fluorescenţi, iar cei
bromuraţi au o absorbţie puternică.

o + cu iodura de potasiu
 clorfeniramina → rozete dense
 dexclorfeniramina şi dexbromfeniramina → rozete în formă de
pană şi snopi care au proprietãţi polarizante.
194
194
PURITATEA MEDICAMENTELOR

 Substanţele medicamentoase, cele auxiliare şi cele utilizate în


scop de investigaţii şi diagnostic provin din materii prime
anorganice, vegetale, substanţe de sinteză şi semisinteză.
 Orice producător de substanţe farmaceutice caută pe cât posibil
să le aducă la un grad de puritate compatibil cu componentele unui
medicament şi cu acţiunea farmacologică.
 Aducerea unui produs la un grad înalt de puritate nu este
posibilă deoarece operaţiile de purificare necesită metodologii şi
aparatură costisitoare.
 Se ştie că heterozidele cardiotonice şi flavonice, alcaloizii şi
antibioticele de semisinteză nu pot fi izolate niciodată în stare pură,
principiile active fiind întotdeauna însoţite de compuşi fie înrudiţi
chimic, fie cu proprietăţi de extracţie şi purificare asemănătoare.
 Aceste impurităţi trebuie să lipsească cu desăvârşire sau să existe
în anumite limite care în aceste condiţii nu influenţează acţiunea
terapeutică şi nu produc efecte nedorite.
 Impurităţile îşi au originea în: materia primă, reactivi,
solvenţi, atmosferă (vapori de apă, praf, sulf, SO2). 195
195
 Impurităţile în substanţele farmaceutice = substanţe chimice
care însoţesc ingredientele farmaceutice active (active
pharmaceutical ingredients, APIs), sau cele ce apar în timpul
formulării, sau din ambele căi.

 Prezenţa acestor compuşi necunoscuţi chiar în mici cantităţi


influenţează eficacitatea şi siguraţa produşilor farmaceutici.

 British Pharmacopoeia (BP), United States Pharmacopoeia (USP),


European Pharmcopoeia, admit anumite limite de prezenţă a
acestor impurităţi în substanţele active sau formulări cu acestea.

 Conferinţa Internaţională de Armonizare (International


Conference on Harmonization, ICH) a formulat ghiduri privind
controlul impurităţilor - care, descriu diferite tipuri de impurităţi şi
originea lor etc.

 ICH publică mereu noi ghiduri asupra impurităţilor din noi


substanţe, produse şi solvenţii reziduali.

196
196
 Alte organizaţii publică cărţi ce acoperă diferite aspecte ale impuriţăţilor,
incluzând reguli guvernamentale şi ghiduri pentru identificarea şi
monitorizarea impurităţilor ce se găsesc în medicamente.

 O problemă importantă este aceea a autorizării standardelor de


identificare a impurităţilor.

 Ghiduri ICH

•1. Reglementări privind substanţele medicamentoase noi (Ghid ICH Q3A)


•2. Reglementări privind produsele medicamentoase noi (Ghid ICH Q3B)
•3. Reglementări privind solvenţii reziduali (Ghid ICH Q3C)
•4. Reglementări privind limita impurităţilor genotoxice

 Ghid ICH Q6A - impuritate: “orice component al produsului


medicamentos care nu este entitate chimică definită ca şi substanţă
medicamentoasă sau excipient în produsul medicamentos”

197
197
Clasificarea impurităţilor
 Impurităţi anorganice
 Impurităţi organice
 Solventi reziduali

Impurităţile anorganice principale sunt reprezentate prin:


ocationi: Pb2+, Fe2+, Zn 2+, Ca2+, Ba2+, NH4+, As3+, 5+;
oanioni: SO42- , Cl-, CO3-2, NO3-, PO43-.

la care se pot adăuga:

oreactivi, liganzi, catalizatori


oalte metale grele şi reziduri metalice
osăruri anorganice
omateriale (filtru, cărbune)

198
198
 Impurităţile organice:
 pot lua naştere în timpul procesului de obţinere şi/sau
depozitare
 pot fi sau nu identificate
 pot fi volatile sau nevolatile

Exemple:
o Compuşi de plecare
o Produşi secundari
o Intermediari
o Produşi de degradare
o Reactivi, liganzi, catalizatori

199
199
COMPUSI DE PLECARE
 rezultă din:
 impurităţile reactivilor
 materii prime
 produşii de reacţie (izomeri)
 compusii izolati din produse vegetale sau animale
Bupivacaina

Farmacopeea Europeană prevede ca impurităţi un număr de 6


compusi, notati de la A la F.
200
200
201
201
PRODUSI SECUNDARI

 Paracetamolul se obţine din p-aminofenol şi alături de el


poate apare un produs secundar ca urmare a esterificării
grupării OH de pe nucleul aromatic.

202
202
PRODUŞI DE DEGRADARE

• PENICILINE, CEFALOSPORINE (C6/C7)


o Penicilinele şi cefalosporinele sunt labile la atomii C6,
respectiv C7, rezultand produşi secundari (dimeri, trimeri,
aminoacid-penicilina) şi o serie de produşi de degradare. Ambii
produşi pot constitui impurităţi.

H H
S CH3 S
6 R1 C N 1
R C N 1
3
CH3 O N CH2 R2
O N N
O COOH COOH

Peniciline - structură de bază Cefalosporine - structură de bază

203
203
204
204
205
205
O CH3
H H S
R C NH C C C CH3
O C N CH COOH
Penicilina
+
H

COOH
S
CH NH CH COOH
N N C(CH3)2 -
HS C CH3 N HO
H2O
R O O CH3 R COOH
Acid penicilenic Acid penilic

H2O - CO2

S S
C(CH3)2 C(CH3)2
R CONH C CH NH CH COOH R CONH CH R CONH CH2
COOH HS C CH3 COOH N COOH N COOH
H H
CH3
Acid penamaldic Acid peniciloic Acid peniloic

CH3 +
H
H3C C CH COOH + R CONH CH CHO R CONH CH2 CHO
- CO2
HS NH2 COOH
Penicilamina Acid penaldic Peniciloaldehida

Schema de degradare a penicilinelor

206
S S
R CONH R CONH
N N
O CH2 R' O CH2OH
COOH COOH
Cefalosporina Desacetilcefalosporina

H2O Acilaza
S
R CONH
S
H2N N
N O
O CH2 R' O
COOH Beta-lactamaza O
_ Desacetilcefalosporin-
sau HO
Acid 7-aminocefalosporanic lactona

S S
R CONH CH R CONH CH
+
H HN N
' CH2 R' CH2
- H2O COOH COOH
COOH COOH
Acid cefalosporoic Acid anhidrodesacetil-
cefalosporoic

S
H2N Produsi de fragmentare si
rearanjare structurala
N
O
O
O
Lactona acidului desacetil-
7-aminocefalosporanic

Schema de degradare a cefalosporinelor

207
Ampicilina
H
6 S CH3
CH C N 1
CH3
NH2 O N
O COOH

ampicilina (produs final) CH C NH


S CH3
CH3
NH O N
O COOH
C O
S CH3
CH C NH
CH3
NH2 O N
O COOH

ampicilina dimer (produs secundar)


S CH3
CH C NH
CH3
NH2 O O C HN
COOH
OH

acid peniciloic (produs de degradare)


208
208
S CH3
CH C NH
CH3
NH O N
O COOH
C O
S CH3
CH C NH
CH3
NH O
O COOH
C O
S CH3
CH C NH
CH3
NH2 O
O COOH

ampicilina trimer (produs secundar)

S CH3
CH C NH
NH O O C N
CH3 fenilalanil ampicilina
COOH (produs secundar)
C O
CH2 CH NH2
O

NH
S CH3
ampicilin piperazina NH
(produs de degradare) CH3
O O C N COOH
209
209
Amoxicilina

Amoxicilina se degradează →
impuritate dicetopiperazin amoxicilina
(HPLC, MS)

210
210
IMPURITĂŢI ENATIOMERICE

 Ofloxacina –racemic - (50 % izomer R, 50 % izomer S)

(RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10-oxo-
4-oxa-1- azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-
11-carboxylic acid

211
211
Esomeprazol isomer
al omeprazolului

(S)-5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)
methylsulfinyl] -3H-benzoimidazole

Levalbuterol (levosalbuterol) izomer al salbuterolului


(RS)--[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2-
(hydroxymethyl)phenol)

4-[(1R)-2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2- 212
212
(hydroxymethyl)phenol
SOLVENŢI REZIDUALI
Clasa I - solvenţi ce trebuie evitaţi Clasa II - solvenţi ce trebuie limitaţi
Solvent Concentraţie Importanţă Solvent Limita de expunere Concentraţie limită
zilnică permisă (mg/zi) (ppm)
limită (ppm)
1,1,2-tricloretena 0.8 80
1,1,1-tricloretan 1500 pericol pentru
1,2-dicloretena 18.7 1870
mediu 1,2-dimetoxietan 1.0 100
1,1-dicloretena 8 toxic 1,4-dioxan 3.8 380
1,2-dicloretan 5 toxic 2-etoxietanol 1.6 160
2-metoxietanol 0.5 50
Benzen 2 cancerigen
Acetonitril 4.1 410
Tetraclorura de 4 toxic şi pericol
Ciclohexan 38.8 3880
carbon pentru mediu Clorobenzen 3.6 360
Cloroform 0.6 60

Clasa III - solvenţi cu potenţial toxic redus Diclormetan 6.0 600


Etileglicol 6.2 620
1-butanol Acetona Formamida 2.2 220
1-pentanol Acid acetic Hexan 2.9 290

1-propanol Acid formic Metanol 30.0 3000


Metil, butil-cetona 0.5 50
2-butanol Anisol
Metil, ciclohexan 11.8 1180
2-metil-1-propanol Dimetilsulfoxid N,N-dimetil acetamida 10.9 1090
2-propanol Etanol N,N-dimetil formamida 8.8 880
3-metil-1-butanol Etil eter Nitrometan 0.5 50

Acetat de butil Formiat de etil N-metil pirolidona 5.3 530


Piridina 2.0 200
Acetat de etil Heptan
Tetrahidrofuran 7.2 720
Acetat de izobutil Metil, izobutil cetona Tetralina 1.0 100
Acetat de izopropil Metil,etil cetona Toluen 8.9 890
Acetat de metil Pentan Xilen 21.7 2170

Acetat de propil t-butil,metil eter


213
213
IMPURITĂŢI LEGATE DE FORMULARE

Impurităţi formate în timpul formulării

a) legate de metodă

b) legate de mediul ambiant


 Expunere la temperaturi necorespunzătoare
 Lumina în special radiaţiile UV
 Umiditatea

c) legate de factori ai formelor dozate

214
214
Formarea impurităţilor în timp (îmbătrânire)

a. Interreacţii între ingrediente


 Nicotinamida se degradează în prezenţa piridoxinei, riboflavinei şi
tiaminei
 Interacțiunea dintre benzocaină și acetat de polivinil

b. Grupă funcţională legată de degradarea tipică


 Hidroliza esterilor

215
215
• Alte hidrolize:
o benzilpenicilina, barbital, cloramfenicol, clordiazepoxid,
lincomiycina, oxazepam

• Degradări oxidative
Compuşi susceptibili:
o Hidrocortison, methotrexat, adinazolam
o Derivaţi fenolici: cateholamine, morfină
o Diene conjugate: vitamina A, acizi graşi nesaturaţi
o Heterocicli aromatici
o Derivaţi nitrozo şi nitrici
o Aldehide

216
216
 Decarboxilare

Rufloxacina

217
217
Degradare fotolitică
• Ciprofloxacina

ciprofloxacina analog etilendiaminic


 Compuşi susceptibili fotolizei:
 ergometrina
nitroprusiat
 riboflavina
 fenotiazine

Fotodegradarea nifedipinei 218


218
Alte exemple:
Tobramicin
 antibiotic aminoglicozidic
 se obţine prin fermentaţie din actinomicetul Streptomyces
tenebrarius
 prin purificare incompletă sau degradare apar compuşi de
impurificare: kanamicina B (bekanamicina), nebramicina şi
neamina (neomicina A).

219
219
220
220
• Neomicina
 antibiotic aminoglicozidic

Structura neomicinelor şi
a impurităţilor:

Analiză HPLC pentru o


neomicină pură

221
221
Identificarea şi caracterizarea unor
posibile impurităţi din Valsartan

Sinteza valsartanului 222


Sinteza impurităţilor valsartanului

223
- Metoda: HPLC-UV
- Condiţii cromatografice:
 coloană: RP18 250 mm x 4.6 mm,5 μm
 fază mobilă: A – KH2PO4 0.01 M şi K2HPO4 0.005 M (pH 3 ajustat
cu acid fosforic diluat), B – apă şi acetonitril (1:4, v:v)
 eluţie în gradient: %A/%B: 0/50, 20/70, 30/70, 40/80, 50/50,
60/50
 rată de curgere: 0.8 ml/min
 detecţie: UV la 210 nm

Cromatograma HPLC a valsartanului şi a celor 5 impurităţi 224


- Elucidarea structurii impurităţilor:
 LC-MS:
- coloană: RP18 250 mm x 4.6 mm,5 μm
- fază mobilă: A – acetat de amoniu 0.01 M (ajustat la pH 3
cu acid trifluoracetic), B – apă şi acetonitril (1:4, v/v)
- eluţie în gradient
- detecţia MS - ionizare spray (ESI), în mod pozitiv, voltaj
5500 V şi ionizare negativă, la un voltaj de 4500 V
 analiză FTIR – prin pastilare în KBr
 punct de topire

225
Caracteristicile IR, MS, pt ale celor 5 impurităţi
Compus pt 0C IR MS
Impuritatea I 165-167 3419 (legături de întindere N-H și O-H), 3033 (legătură de +ve ESI-MS: 352 (M+H)+, 374
întindere C-H aromatică), 2968 (legătură de întindere C-H (M+Na)+, 390 (M+K)+
alifatică), 1622 (legătură de întindere C=O), 1567
(legături de întindere C=C, C=N aromatice)
Impuritatea II 62-64 3444 (legături de întindere N-H și O-H), 2965 (legătură de +ve ESI-MS: 544 (M+H)+, 566
întindere C-H aromatică), 2931 (legătură de întindere C-H (M+Na)+, 582 (M+K)+
alifatică), 1731 (legătură de întindere C=O carboxilică),
1603 (legătură de întindere C=O amidică)
Impuritatea III 58-60 2929 (legătură de întindere C-H alifatică), 1731 (legătură +ve ESI-MS: 534 (M+Na)+, 550
de întindere C=O carboxilică), 1603 (legătură de întindere (M+K)+
C=O amidică)
Impuritatea IV 87-89 3435 (legături de întindere N-H și O-H), 2968 (legătură de +ve ESI-MS: 456 (M+Na)+
întindere C-H aromatică), 2927 (legătură de întindere C-H
alifatică), 1732 (legătură de întindere C=O carboxilică),
1606 (legătură de întindere C=O amidică)
Impuritatea V 71-75 3421 (legătură de întindere N-H și O-H), 3031 (legătură +ve ESI-MS: 452 (M+H)+, 474
de întindere C-H aromatică), 2935 (legătură de întindere (M+Na)+
C-H alifatică), 1731 (legătură de întindere C=O
carboxilică), 1614 (legătură de întindere C=O amidică)
Valsartan 105-108 2923 (legătură de întindere C-H alifatică), 1732 (legătură +ve ESI-MS: 436 (M+H)+, 458
de întindere C=O carboxilică), 1602 (legătură de întindere (M+Na)+
C=O amidică)

226
Fragmentarea valsartanului şi impurităţile 1, II, III, IV şi V

227
Identificarea şi caracterizarea unor posibile impurităţi obtinute în
urma expunerii Valsartanului la stress prin fotodegradare

Conditii: 35 °C, într-o cameră de stabilitate, emisie de radiație UV de 410 µW/cm2 de la


distanța de 15 cm.

Structurile chimice ale valsartanului și ale celor doi produși de fotodegradare : DP-1 și DP-2

228
Elucidarea structurilor celor două impurități

Spectrele 1H-RMN ale impurităților DP-1 (A) și DP-2 (B) Spectrele 13C-RMN pentru impuritatea DP-1 (A) și DP-2 (B)
Datele spectrului de masă și infraroșu pentru DP-1 și DP-2
Impuritatea FT-IR (cm-1) Spectru de masă, m/z (%)
DP-1 3680-3230, 2957, 2871, 1736, 1642, 414.2269 ([M+Na]+, 100), 392.2445 ([M+H]+, 54), 386.2191(M-N2+Na]+,
1533, 1469, 1263, 1100, 952, 820 și 770 21, pierderea de N2), 364.2361 (M-N2 +H]+, 3, pierderea de N2), 357.2043
([M-Me2CH=CH2+Na]+, 5, se pierde izobutilenă) și 235.0971 ([M-
C9H18NO]+, 4, pierderea fragmentului de amidă secundară)
DP-2 2959, 2871, 1730, 1605, 1466, 1388, 384.2040 ([M+Na]+, 69), 362.2215 ([M+H]+, 100), 278.1654 ([M-
1228, 1103, 1025, 996, 820 și 760 C5H7O]+, 17, pierderea catenei laterale valeril), 205.0759 ([M-C9H18NO]+,
61, pierderea fragmentului de amidă secundară)
229
IMPURITATI INSCRISE IN
FARMACOPEEA ROMANA

• Exemple de impurităţi din diverse substanţe de sinteză,


produse naturale, forme farmaceutice industriale etc :

1. Substanţele reducătoare:
 pentru acetazolamidă - se depistează cu amoniac 100 g/l şi
nitrat de argint 0,1 mol/l.

230
230
2. Aminoacizi:
 CSS într-un sistem de developare adecvat, acidul -aminocaproic,
trebuie să se prezinte ca o substanţă unitară, pe cromatogramă să nu
apară şi alte spoturi colorate în urma vizualizării cu ninhidrina.

3. Apa din uleiurile volatile


 se pune în evidenţă cu sulfură de carbon sau cu acid picric, ca şi în
cazul analizei eterului anestezic.

4. Alcoolii, glicolii, eter-glicolii şi acetatul de glicerol din uleiurile


volatile
 se pun în evidenţă prin procesul de salefiere cu ajutorul unei soluţii
saturate de clorură de sodiu.

5. Benzenul din uleiurile volatile


 se depistează cu acid azotic prin formarea nitrobenzenului cu miros
caracteristic.

231
231
6. Esterii acizilor benzoic, succinic, oxalic, ftalic, cinamic şi
citric din uleiurile volatile
 se depistează prin saponificare cu hidroxid de sodiu când se
formează acizii respectivi insolubili, ce apar sub formă de
cristale.
 doar în cazul uleiului de scorţişoară pot apărea cristale
redizolvabile la fierbere.

7. In uleiurile volatile pot fi adăugate intenţionat uleiuri grase


sau uleiuri rezinificate
 se pun în evidenţă prin pete persistente ce rămân pe hârtia de
filtru după volatilizare.

8. Uleiurile minerale se pot utiliza în scop fraudulos


 se pun în evidenţă cu ajutorul alcoolului, prin tulburarea
amestecului de ulei volatil şi alcool.

9. Acetona trebuie să lipsească din unele substanţe


medicamentoase şi mai ales din eterul anestezic.
 se pune în evidenţă cu nitroprusiat de sodiu în mediu alcalin.

232
232
10. Alcoolul din eterul anestezic
 se evidenţiază cu ajutorul unei soluţii apoase saturate cu eter (măreşte
volumul soluţiei apoase) sau cu ajutorul fuxinei.

11. Aldehidele care pot impurifica eterul anestezic


 se evidenţiază cu ajutorul reactivului Nessler.

12. Peroxizii
 se identifică cu iodura de potasiu soluţie 100 g/l.

13. Substanţele volatile străine din eter


 se identifică după mirosul străin lăsat după evaporarea eterului.

14. Lanolina poate fi impurificată cu clor liber.


 se evidenţiază cu ajutorul firului de cupru introdus în flacără.

15. Glicerina poate impurifica lanolina


 se evidenţiaza titrimetric cu ajutorul NaOH şi a acidului boric.

233
16. Parafinele se scot din produsul impurificat prin cromatografiere pe
coloane de oxid de aluminiu utilizând ca eluent eterul de petrol.
 impurificarea se apreciază prin determinarea masică a reziduului ce
rezultă prin evaporare.

17. Apoatropina şi beladonina din sulfatul de atropină


 se pun în evidenţă prin tratarea soluţiei A a fiecărei substanţe cu
amoniac 100 g/l.

18. Balsamul de Peru poate fi impurificat cu:


- alcool - se pune în evidenţă prin metoda descrisă ca la punctul 10)
- balsam artificial - se pune în evidenţă cu ajutorul alcoolului etilic
- benzaldehidă, terebentină - se izolează din balsam cu eter de petrol,
reziduul rămas după evaporare se cercetează din punct de vedere al
consistenţei şi al mirosului
- uleiurile grase - dacă sunt prezente, tulbură o soluţie de cloralhidrat
3,5 g în 2 ml apă.

19. Pentru sulfatul de bariu se cercetează "gradul de fineţe“:


 prin observarea unei suspensii apoase (5 g substanţă în 50 ml de apă)
după 15 minute ce nu trebuie să scadă sub diviziunea 18.

234
234
20. Clorhidratul de tetraciclină
 se controlează cromatografic deoarece poate fi impurificat cu
anhidrotetraciclină, epitetraciclină, epianhidrotetraciclină.
 incadrarea în limitele normale se poate exprima şi prin valoarea
absorbanţei A1cm1% (380 nm) care trebuie să fie cuprinsă între 365 -
387.

235
235
anhidrotetraciclina epianhidrotetraciclina
21. Trihidratul de ampicilină
 se cercetează valoarea A268/A266 = 1,10 - 1,30
 conţinutul în apă se determină cu reactivul Karl - Fischer
(determinare potenţiometrică) şi care trebuie să fie între 12 – 15 %.

22. Mucilagul de gumă arabică 30 %


 tragacanta - se pune în evidenţă cu o soluţie de acetat de plumb
 dextrine, amidon - mucilagul se tratează cu o soluţie de iod, în
caz de prezenţă apare o coloraţie roşie (dextrine) sau albastră
(amidon)
 zaharoza - se pune în evidenţă cu rezorcinol, cu care formează în
prezenţa acidului clorhidric, la cald, un compus colorat în galben
sau roşu.

236
236
23. Frunzele de Belladonna
 pot fi impurificate cu frunze de Phytolacca americana,
caracterizate prin prezenţa rafidiilor în locul sacilor cu nisip oxalic
atunci când sunt cercetate într-un preparat superficial.
 produsul mai este cercetat şi pentru: impurităţi, alte părţi din
aceeaşi plantă; apoatropină şi tropanol, substanţe minerale.

apoataropina

L - hiosciamina

beladonina 237
237
24. Fructele de Pimpinella anisum
 se cercetează cu atenţie pentru a nu fi impurificate cu cele de
Conium maculatum, Hyosciamus niger sau Carum carvi.

Pimpinella anisum Conium maculatum Carum carvi

Hyoscyamus niger

238
238
25. Soluţia injectabilă de albumină serică umană se controlează:
 electroforetic pentru fracţiuni proteice străine
 spectral în UV pentru hemoglobină liberă şi porfirină
 impurităţile pirogene, etc.
26. Perfuzia de dextran 40 (100 g/l) şi glucoză (50 g/l) se cercetează:
 aciditatea, vâscozitatea intrinseca 20 = 0,180-0,220 dl/g
 impurităţi pirogene
 toxicitate.
27. Comprimatele de acetildigitoxină se cercetează:
 CSS Kieselgel G - pot fi impurificate cu gitoxină, digitoxină şi produşi
rezultaţi prin hidroliza principiului activ (desacetildigitoxina, digitoxin-
mono- şi bis-digitoxina).
 asemănător se cercetează puritatea comprimatelor cu digoxină.

Acetildigoxina =
3-acetildigitoxose-
digitoxose2-digoxigenina

239
239
240
240
28. Drajeurile cu lanatozid C pot fi impurificate cu desacetilanatozida
C, lanatozida D şi C.
 se pun în evidenţă cromatografic folosind pentru vizualizare acid
tricloracetic şi cloramină.
Lanatosida C = glucoso-3-acetildigitoxose-digitoxose-2-digoxigenin)

ALTE DEGRADARI

241
241
242
242
PLANUL CURSULUI
DETERMINAREA VOLUMETRICA A MEDICAMENTELOR

Determinari in mediu apos

Determinari prin reactii acido-bazice


Determinari prin reactii de precipitare
Determinari prin reactii de complexare
Determinari prin reactii redox
Determinari nitritometrice

Determinari in mediu neapos

243
243
 Titrimetria sau volumetria = totalitatea metodelor de determinare
cantitativă care se bazează pe măsurarea exactă a volumelor
de soluţii necesare transformării totale a unei substanţe in
altă substanţă.

 In cadrul determinărilor titrimetrice se adaugă soluţiei de


analizat atâţia mililitri de reactiv până se ajunge la punctul de
echivalenţă.

Volum de
aA + bB → cC + dD +… echivalenta

stoechiometria Concentratie titrant, Concentratia


x volum de probei
reactiei echivalenta

244
 Solutie titrata/volumetrica

 Solutie standard primara

 Solutie standard secundara

 Factor de molaritate

 Punctul de echivalenţă a unei titrări =


momentul în care s-a adăugat exact
cantitatea de reactiv pentru ca reacţia să
se producă total.

 Punctul final al unei titrări = momentul în


care are loc o schimbare fizică a sistemului
probă de analizat - reactiv.

245
Metode vizuale Metode instrumentale Modificarea insusirilor
(volumetria chimica) (volumetria fizico-chimica) fizice ale participantilor

 Pentru aprecierea exactă a punctului de echivalenţă există două categorii de


metode:
 chimice
 fizico-chimice.

 Metodele chimice folosesc indicatori ale căror transformări în apropierea


punctului de echivalenţă sunt însoţite de schimbări perceptibile ca:
 viraj de culoare
 separare de precipitate.

 In cazul metodelor fizice în locul indicatorilor se foloseşte o


proprietate fizico - chimică a sistemului probă de analizat-
reactiv:
- forţa electromotoare
- conductibilitatea electrică

 Acestea se măsoară în timpul titrării şi trebuie să prezinte


la punctul de echivalenţă o caracteristică ce se poate
înregistra cu ajutorul unor aparate.
246
 Intre punctul de echivalenţă şi cel final apare de cele mai multe
ori o diferenţă numită eroare de titrare. Aceasta poate fi:

 de metodă de lucru
 de scurgere
 de citire
 de titrare
 de indicator
 de temperatură
 de calcul

247
CLASIFICAREA METODELOR
TITRIMETRICE

A. După caracterul reacţiilor chimice


 Titrimetrie prin reacţii acido - bazice
 Titrimetrie prin reacţii de precipitare
 Titrimetrie prin formare de combinaţii complexe
 Titrimetrie prin reacţii de diazotare
 Titrimetrie prin reacţii redox
 Titrimetrie prin reacţii între neelectroliţi.

248
B. După natura mediului în care se execută
 Titrări în mediu apos
 Titrări în mediu neapos.

C. După modul de lucru


 Metode directe
 Metode indirecte
 Metode prin diferenţă

249
DETERMINARI IN MEDIU APOS
TITRIMETRIA PRIN REACTII
ACIDO - BAZICE (PROTOMETRIA)
 Acidimetria
 Alcalimetria

 Reacţiile acido-bazice au loc în mediu apos după ecuaţia:

HA + BOH → H2O + BA
sau ionic:

(H3O+ + A-) + (B+ + HO-) → 2H2O + (B+ + A-)

250
Soluţii titrate

Acid clorhidric (1 mol/l, 0.1 mol/l, 0.01 mol/l)


- titrosubstanta: KHCO3, Na2CO3 calcinat
- indicator: metiloranj

Acid sulfuric (0.1 mol/l, 0.05 mol/l, 0.01 mol/l)


- titrosubstanta: KHCO3
- indicator: metiloranj

Hidroxid de sodiu. Hidroxid de potasiu (1 mol/l, 0.5 mol/l,


0.1 mol/l)
- titrosubstanta: acid oxalic, ftalat acid de potasiu
- indicator: fenolftaleină, albastru de timol

251
Indicatori

 In funcţie de procesele analitice:

 indicatori acido-bazici de culoare: fenolftaleina, metiloranj,


roşu de metil, verde malachit, albastru de timol, galben de
metanil, roşu de fenol etc

 indicatori acido-bazici de fluorescenţă: albastru de timol,


fluoresceina, eozina, chinina, -naftolul etc.

 indicatori acido-bazici turbidimetrici: isonitrozoacetil-p-


aminobenzen, o-toluidina etc

 indicatori acido-bazici de adsorbţie: galben de tiazol etc

252
Aplicaţii în analiza medicamentelor
 sunt utilizate pentru determinarea substanţelor
medicamentoase cu caracter acid sau bazic.

 determinările se efectuează prin titrări dependente de


caracterul substanţelor:
- directe
- indirecte
- prin diferenta

253
1. Determinarea cantitativă a substanţelor
cu caracter acid

254
254
255
Determinarea derivaţilor barbiturici

 Acidul barbituric este un acid de tărie mijlocie.

 Derivaţii substituiţi la C5 sunt acizi slabi datorită tautomeriei


lactam - lactimică:

 Datorită acestor structuri derivaţii barbiturici pot fi titraţi cu


hidroxizi alcalini.

 Principiul determinării: substanta se dizolva în alcool metilic


neutralizat, se adauga apă şi se titreaza cu NaOH 0,1 mol/l în
prezenţa indicatorilor (timolftaleină, galben de alizarină etc.).
256
Determinarea fenilbutazonei
 Fenilbutazona, datorită hidrogenului de la C4, se comportă ca
un acid monoprotic.
 Principiul determinării: substanţa se dizolvă în acetonă
neutralizată la roşu de fenol, se adaugă apă şi se titrează cu
NaOH 0,1 mol/l până la coloraţie roz - violetă.

257
Determinarea acidului acetilsalicilic din comprimate

• Datorită caracterului acid, după dispersarea pulberii de


comprimate ȋn alcool (R) neutralizat ȋn prealabil la
fenolftaleină (I) se titrează cu cu hidroxid de sodiu 0.1 mol/l,
până la coloraţie roz.

258
2 . Determinarea cantitativă a substanţelor
cu caracter bazic
 este mai puţin utilizată, fiind preferată titrimetria în mediu
neapos.

259
260
Dozarea benzoatului de sodiu din soluţia injectabilă de
cafeină şi benzoat de sodiu

După extracţia cafeinei, se adaugă eter (R), indicator metiloranj şi


se titrează cu HCl 0.1 mol/l până la coloraţia stratului apos ȋn
roz persistent.

261
Alte aplicaţii
1. Determinarea amfetaminei.
Principiul determinării: o cantitate exact măsurată de substanţă se
tratează cu H2SO4 0,05 mol/l în exces, iar acidul rămas
neconsumat se titrează cu NaOH 0,1 mol/l în prezenţa
roşului de metil ca indicator.

2. Determinarea meprobamatului.
Principiul determinării: se titrează cu NaOH 0,1 mol/l excesul de
HCl 0,1 mol/l care s-a utilizat pentru neutralizarea
amoniacului rezultat prin hidroliză cu KOH alcoolic.

262
3. Determinarea alcaloizilor
Principiul determinării:
 alcaloizii sunt trataţi cu un exces de soluţie titrată de acid, iar excesul
se retitrează cu o soluţie titrată de bază în prezenţa unui indicator
adecvat.
 cand se aplică titrarea directă a bazicităţii alcaloizilor, solubilizarea
acestora se face în mediu alcoolic, hidroalcoolic sau alt solvent
neutralizat.

o alcaloizii din Aconiti tuber - titrare directă cu H2SO4 0,01 mol/l,


indicator roşu de metil
o alcaloizii din Belladonnae folium - titrare cu NaOH 0,02 mol/l a
excesului de H2SO4 0,01 mol/l, indicator roşu de metil
o alcaloizii din Chinae cortex - titrare directă cu HCl 0,1 mol/l,
indicator un amestec din roşu de metil şi albastru de metilen
o alcaloizii din extractum Hyosciami siccum - se extrag cu cloroform,
se dizolvă în H2SO4 0,01 mol/l şi se determină prin titrarea excesului de
acid cu NaOH 0,02 mol/l, indicator roşu de metil
o alcaloizii din Opium şi Opium pulveratum - titrare directă cu H2SO4
0,05 mol/l, indicator roşu de metil

263
TITRIMETRIA PRIN REACTII DE
PRECIPITARE
 se bazează pe formarea de precipitate
 clasificare in funcţie de cationii care se folosesc în sistemul
de precipitare:
Ag+ + X-  AgX
o Argentometria
Hg2+2 + 2X-  Hg2X2
o Mercurometria
o Barimetria Ba+2 + Y-2  BaY
o Uranometria. UO2+2 + Y-2  UO2Y

Indicatori
- indicatori reactivi ai ionilor: cromat de potasiu, alaun feric,
ditizona, difenilcarbazona, difenilcarbazida, sulfonftaleine
- indicatori de adsorbţie (în lumina albă şi în lumina
ultraviolet - de fluorescenţă): eozina, fluoresceina, p-
etoxicrisoidina, tropeolina 00, diclorfluoresceina, albastru de
bromfenol
- indicatori redox: difenilamina, difenilbenzidina.
264
ARGENTOMETRIA
 Precipitatele formate au structura AgX.

 Soluţii titrate
1. Nitrat de argint 0,1 M
Titrul se determină cu NaCl (cromat de potasiu).
2. Tiocianat de amoniu 0,1 M
Titrul se determină cu AgNO3 0,1 M (alaun feric).

265
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea halogenurilor (clorura de amoniu, clorura de
potasiu, clorura de sodiu, bromura de amoniu, bromura de
stronţiu).
 Metoda Mohr - titrare directa cu AgNO3 0,1 M în prezenţa
cromatului de potasiu ca indicator:

 Metoda Volhard - halogenura se tratează cu un exces de soluţie


titrată de AgNO3 şi se titrează excesul de AgNO3 cu o soluţie
titrată de NH4SCN în prezenţa alaunului feriamoniacal:

- ultima reactie indica sfarsitul titrarii

266
2. Determinarea argintului din combinaţii organice ca: argint
coloidal, proteinat de argint, vitelinat de argint.
Principiul determinării: titrare cu NH4SCN 0,1 M în prezenţa
alaunului feriamoniacal, după prealabila distrugere a
materiei organice cu KMnO4 în mediu de acid sulfuric.

3. Determinarea sulfamidelor: sulfadiazina, sulfatiazolul,


sulfametiltiazol, sulfanilamida, succinilsulfatiazol.
Principiul determinării: sulfamidele formează precipitate cu AgNO3
0,1 M, iar excesul de AgNO3 0,1 M se titrează cu NH4SCN 0,1
M în prezenţa alaunului feriamoniacal.

4. Alte exemple:
 bromizoval
 vioform
 acetat de clortestosteron
 diclorhidrat de histamină
 izocianatul de alil din Sinapis nigrae semen.

267
MERCUROMETRIA
 ionul Hg2+2 are proprietatea de a forma cu anionii halogenaţi
precipitate greu solubile de tipul Hg2X2:

Soluţii titrate
1. Azotat mercuros 0,1 M
Titrul se determină pe NaCl.

Indicatori
o difenilcarbazona, difenilcarbazida.

Aplicaţii în analiza medicamentelor


o determinarea clorurilor şi halogenurilor solubile, determinările
efectuându-se în mediu de acid nitric.

268
TITRIMETRIA PRIN REACTII DE
COMPLEXARE (COMPLEXOMETRIA)

 are la bază formarea de complecşi.

 se clasifica după tipul combinaţiilor complexe:


 metode care decurg prin reacţii cu formare de chelaţi
 metode care nu decurg prin reacţii cu formare de chelaţi.

 reacţiile de complexare trebuie să îndeplinească următoarele


condiţii:
 să conducă la formarea unor combinaţii complexe stabile
 reacţiile să aibă puncte nete de echivalenţă care pot fi evidenţiate
cu ajutorul indicatorilor sau instrumental
 reacţiile să decurgă în sistem omogen şi să nu fie însoţite de
procese secundare.

269
Indicatori

1. indicatori în care grupul cromofor face parte din structura


indicatorului

2. indicatori în care grupul cromofor este generat de ionul


metalic care reacţionează cu indicatorul

Exemple de indicatori:
 indicatori metalo-cromici: coloranţi azoici, coloranţi azoici
substituiţi, ftaleine şi sulfoftaleine, coloranţi trifenilmetanici,
coloranţi antrachinonici
 indicatori metalici indirecţi: negru de eriocrom T
 indicatori acido-bazici si indicatori redox: albastru de
variamin B
 indicatori de tulbureală: AgI, AgAg(CN)2.

 se pot folosi şi metodele instrumentale, dintre care mai mult se


utilizează metoda spectrofotometrică.

270
CIANOMETRIA
 se bazează pe capacitatea de complexare a diferiţilor cationi de
ionul de cianură.
 cea mai importantă metodă cianometrică este
argentocianometria ce are la bază ecuaţiile:

271
 In funcţie de condiţiile de titrare şi de indicator, metode pentru
determinarea punctului de echivalenţă:
 metoda Liebig: nu utilizează indicator, punctul de echivalenţă
este dat de apariţia unei tulbureli datorită formării Ag[Ag(CN)2]
 metoda Denigés: foloseşte drept indicator o iodură alcalină,
sfârşitul titrării este dat de opalescenţa atribuită AgI
 metoda Ripan: foloseşte ca indicator difenilcarbazona, care
formează cu Ag+ un complex colorat în violet.

 Aplicaţii in analiza medicamentelor:


 metoda este mai puţin folosită în analiza şi controlul
medicamentelor
 se pot determina cantitativ ionii:

272
COMPLEXONOMETRIA
 are la bază reacţia de complexare dintre unii ioni şi acizii
aminopolicarboxilici (complexone)
 Exemple complexone:
 acidul iminodiacetic
 acidul etilendiaminotetraacetic, sarea de sodiu a acidului
etilendiaminotetraacetic (chelaton III, complexon III, trilon B)
 acidul hexametilendiaminotetraacetic.

Soluţii titrate
1. EDTA-Na2, etilendiaminotetraacetat disodic (EDTA - disodic,
complexon III) 0,05 M
Titrul se determină cu: zinc (negru de ericrom T), CaCO3 (murexid),
MgSO4.7H2O (negru de eriocrom T).

Indicatori
- negru de eriocrom T, murexid, roşu de pirogalol, xilenoloranj

273
Aplicaţii în analiza medicamentelor

1. Determinarea substanţelor medicamentoase care


conţin cationii: Al3+, Bi3+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Cu2+, Fe3+,
Hg2+, Pb2+, Mg2+, Mn2+, Sn2+, Zn2+:
- sulfatul de aluminiu şi potasiu (alumen, alaun de
potasiu), sulfatul de aluminiu: EDTA - disodic 0,05 M,
xilenoloranj
- carbonatul de calciu: tampon amoniacal, edetat de sodiu
şi magneziu, negru de eriocrom T, EDTA - disodic 0,05 M
- clorura de calciu
- gluconat de calciu: tampon amoniacal, edetat de sodiu şi
magneziu, negru de eriocrom T, EDTA - disodic 0,05 M.

Alte exemple: glicerofosfat de calciu, lactat de calciu, soluţia


de clorură de calciu 50%, soluţia de hidroxid de calciu
0,15%, stearat de magneziu, oxid de magneziu, carbonat
bazic de magneziu, sulfat de magneziu, oxid de zinc,
carbonat bazic de bismut, galat bazic de bismut, azotat
bazic de bismut, salicilat bazic de bismut.
274
• Cationul C2+ formeaza cu indicatorul negru de eriocrom T un
complex mai puţin stabil decat complexonatul cationului de
determinat. Reacţia are loc la pH = 9 când indicatorul este
colorat ȋn albastru, iar complexul care rezultă este colorat ȋn
roşu:

C2++ HIn2-+ NH3 ↔ [CIn]- + NH4


albastru roşu

C2+ formeaza cu soluţia titrată de EDTA-Na2 un complex incolor:

C2+ + HY3-↔[CY]2- + NH4+

• La punctual de echivalenţă EDTA-Na2 deplaseaza cationul


din complexul său cu indicatorul cu punerea ȋn libertate a
indicatorului, culoarea soluţiei redevenind albastră.

[CIn]- + HY3-↔ [CY]2-+ HIn2-


rosu incolor albastru

275
2. Determinarea alcaloizilor

 Principiul determinării:
 mulţi alcaloizi formează precipitate cu diverşi anioni complecşi
care au în structura lor un cation
 se determină cationul din complexul alcaloid - anion sau din
complexul reactiv folosit în exces.
Exemple:
 sărurile de chinină, teobromina şi teofilina formează precipitate
cu K[BiI4]. Excesul de reactiv se titrează cu complexon III fără a
utiliza indicator complexonometric, finalul titrării este
momentul în care soluţia se decolorează.

 Alţi autori precipită alcaloizii cu sulfat de cupru,


tetraiodocadmiat dipotasic, picrat de cupru,
tetratiocianatozincat de amoniu, excesul de reactiv se va titra cu
soluţie de complexonă III în prezenţa indicatorilor adecvaţi.
276
3. Determinarea sulfamidelor
 sulfamidele formează compuşi greu solubili cu cationii metalelor
grele
 se determină complexonometric excesul de reactiv cu o soluţie
titrată de complexon III, în prezenţa unui indicator
 ca agenţi de precipitare se folosesc săruri de cupru, săruri
mercurice, AgNO3 etc.

4. Determinarea metalelor insolubile


 proba este incalzita cu EDTA in exces si apoi excesul este titrat
cu solutii de saruri continand Mg+2 sau Zn+2 de concentratie
cunoscuta
 exemple: hidroxid de aluminiu, sulfat de aluminiu, fosfat acid de
calciu
Al3++ HY3- ↔ [AlY]- + H+
Zn2+ + HIn2- + HO- ↔ [ZnIn]- + H2O
albastru rosu
Zn2+ + HY3- + HO- ↔ [ZnY]2- +H2O
[ZnIn]- + HY3- + NH3 ↔ [ ZnY]2- + HIn2- + NH4
rosu albastru 277
DETERMINARI TITRIMETRICE PRIN
REACTII REDOX (REDOXOMETRIA)
 Condiţii:
 să fie totale
 să se desfăşoare cu viteză mare
 punctul de echivalenţă să fie net şi să poată fi pus în evidenţă cu
uşurinţă.

 are loc un fenomen de:


 oxidare prin care o substanţă cedează electroni, mărindu-şi starea de
oxidare
 reducere în care se acceptă electroni, micşorându-se starea de oxidare.

Cele două fenomene se petrec concomitent:


278
278
Stabilirea punctului de echivalenta:

 Indicatori
 indicatori de culoare (compuşi organici): difenilamina,
indofenoli, oxazine, tiazine, diamine
 indicatori reactivi ai ionilor: o-fenantrolina, ,’-dipiridilul,
dimetilglioxima, amidonul, -naftoflavone
 indicatori turbidimetrici: acidul selenic
 indicatori de fluorescenţă: fluoresceina, rodamina B.

 Metode instrumentale.

279
DETERMINARI
PERMANGANATOMETRICE
 se foloseşte capacitatea oxidantă a ionului MnO4-, care, în
funcţie de mediu, acţionează prin 5, 3, 1 echivalenţi.

 mediu puternic acid:

 mediu slab acid, neutru sau slab bazic:

 mediu puternic bazic:

Majoritatea determinărilor cantitative se efectuează în mediu acid.


280
Soluţii titrate

1. Permanganat de potasiu 0,1 M


Titrul se determină cu acid oxalic.
2. Acid oxalic 0,05 M
3. Arsenit de potasiu 0,1 M
Titrul se determină cu soluţie titrată de iod 0,05 M.

Aplicaţii în analiza medicamentelor

 determinarea cantitativă a medicamentelor, atât de natură


anorganică cât şi organică.
 se practică metoda titrării directe sau indirecte.

281
1. Determinarea sãrurilor feroase:
- au caracter reducãtor şi se titreazã cu KMnO4 0.1 M pânã la
coloratie roz-persistentã.

10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 =


5 Fe2(SO4)3 + 2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O

2. Determinarea apei oxigenate:


- în mediu puternic acid apa oxigenatã este oxidatã de permanganatul
de potasiu:

5 H2O2 + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 = 2 MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5 O2

3. Determinarea nitriţilor alcalini:


- deoarece nitriţii nu sunt stabili în mediu acid, determinarea lor se
face cu permanganat de potasiu în exces, iar excesul se determina
indirect prin titrarea cu tiosulfat a iodului eliberat din KI:

5HNO2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 = 5HNO3 + 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O


10 KI + 2KMnO4 + 8H2SO4 = 5I2 + 6 K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O
5I2 + 10Na2S2O3 = 5Na2S4O6 + 10NaI

282
4. Determinarea fenolului:
- permanganatul de potasiu oxidează fenolul în mediu alcalin
descompunându-se în dioxid de carbon şi apă:

C6H5-OH + 14[O] = 6CO2 + 3H2O

5. Determinarea aminofenazonei:
- în mediu alcalin permanganatul de potasiu oxidează
aminofenazona la dioxiaminofenazonă; folosind un exces de
permanganat acesta se dozează iodometric după ecuaţiile de la
determinarea nitriţilor alcalini.

283
DETERMINARI IODOMETRICE

• In iodometrie se poate folosi:

- acţiunea oxidantă a iodului în titrările directe de reducători


I2 + 2e-  2I-

- acţiunea reducătoare a anionului I- în titrările indirecte ale


oxidanţilor
Oxidant + 2e-  I2
I2 + S2O3-2  S4O6-2 + 2I-

284
Soluţii titrate

1. Iod (0,05 M,....)


Titrul se determină cu: As2O3; soluţie titrată de Na2S2O3.
2. Tiosulfat de sodiu (0,1 M,...)
Titrul se determină cu: K2Cr2O7, KBrO3, KIO3.

Indicatori

 amidon,
  - naftoflavone
 solvenţi ai iodului (cloroform, benzen, tetraclorură de carbon).

285
Aplicaţii în analiza medicamentelor

1. Determinarea vitaminei C:
- acidul ascorbic este oxidat de iod la acid dehidroascorbic,
titrarea efectuându-se cu I2 0,05 M în prezenţa amidonului:

286
2. Determinarea glucozei:
- se oxidează cu un exces de iod 0,05 M în mediu alcalin (carbonat
de sodiu, borat de sodiu, etc.), la rece şi excesul se retitrează cu
tiosulfat de sodiu.

3. Determinarea fenazonei:
- fenazona formează cu iodul iod - fenazona, care precipită la rece;
excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu în prezenţa
amidonului dupa adaugare de alcool.

287
4. Determinarea cloralhidratului:
- iodul oxidează în mediu alcalin cloralhidratul la acid
tricloracetic, excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu:

I2 + 2NaOH = NaI + NaIO + H2O


CCl3CH(OH)2 + NaIO + NaOH = CCl3COONa + 2H2O + NaI

5. Determinarea cafeinei:
- cafeina formează cu iodul periodura de cafeină insolubilă
(C8H10N4O2.HI.I4), excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu.

6. Determinarea fenolului:
- în mediu bazic iodul formează cu fenolul triiodfenolul, excesul de
iod 0,05 M se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 M.

288
7. Determinarea penicilinelor:
- penicilinele în mediu bazic hidrolizează la nivelul ciclului -
lactamic rezultând doi compuşi care sunt oxidaţi de iod, iar
excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 M.

289
DETERMINARI IODATOMETRICE
 In mediu acid iodaţii alcalini se comportă ca oxidanţi, conform
ecuaţiilor:

 Modul de funcţionare a iodatului depinde de mediul de reacţie şi de


funcţia reducătoare a partenerului de reacţie.

Soluţii titrate
1. Iodat de potasiu 0,1 M
Deşi iodatul este o titrosubstanţă, titrul se poate determina cu: As2O3;
Na2S2O3; sulfat de hidrazină.
290
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea hidrazinei:
- în mediu acid şi în prezenţa clorurii mercurice, hidrazina reduce
iodatul la iodură, ca indicator se foloseşte un solvent al iodului.

3H2N  NH2 + 2KIO3  3N2 + 2KI + 6H2O

2. Determinarea iodurilor alcaline (iodura de potasiu, iodura


de sodiu):
- iodatul de potasiu oxidează iodurile alcaline reducându-se la I,
sfârşitul titrării este dat de momentul în care cloroformul devine
galben.

5KI + KIO3 + 6HCl  3I2 + 6KCl + 3H2O


2I2 + KIO3 + 6HCl  5ICl + KCl + 3H2O

sau ecuaţia generală:


2KI + KIO3 + 6HCl  3ICl + 3KCl + 3H2O

3. Alte aplicaţii: dozarea acidului ascorbic, sulfatioureei, HIN-ului,


291
acidului tioglicolic, cisteinei.
DETERMINARI BROMO-BROMATOMETRICE
• Bromometria: ȋn mediu acid
BrO3- + 5 Br- + 6 H+  Br2 + 3 H2O
Br2 + 2 e-  2 Br-

• Bromatometria: ȋn mediu acid


BrO3- + 6 e - + 6 H+  Br- + 3 H2O

• deoarece în ambele metode se folosesc soluţii de bromat alcalin,


denumirea de bromo - bromatometrie este mai des utilizată.

Indicatori
 indicatori reversibili: -naftoflavona, p-etoxicrisoidina
 indicatori ireversibili: metiloranj, roşu de metil, indigocarmin,
albastru de xilenol
 solvenţi.

292
Soluţii titrate

1. Bromat de potasiu 0,1 M


Bromatul de potasiu este o titrosubstanţă, dar titrul se poate determina cu
As2O3, Na2S2O3 0,1 M.
2. Bromat de potasiu - bromură de potasiu 0,1 M
Titrul se determină cu Na2S2O3 0,1 M.

Aplicaţii în analiza medicamentelor

1. Determinarea p - clorfenolului:
- compusul formează cu bromul un derivat bromurat, excesul de
bromat-bromură oxidează KI, iodul pus în libertate se titrează cu
Na2S2O3 0,1 M.

2. Determinarea acidului salicilic:


- acidul salicilic se bromurează formând tribromfenolul, excesul de
bromat-bromură se titrează iodometric în prezenţa amidonului.

293
3. Determinarea p - hidroxibenzoatului de metil (nipagin):
- nipaginul hidrolizat alcalin se bromurează cu bromat - bromură şi iodul
pus în libertate din KI se titrează cu Na2S2O3 0,1 M în prezenţa
amidonului.

4. Determinarea sulfamidelor:
- sulfamidele se bromurează în mediu acid cu KBr şi KBrO3 0,1 M, iar
excesul se titrează iodometric. Rezultă compuşi dibromuraţi:

H2NC6H4SO2NHR + 2Br2  H2NC6H2Br2SO2NHR + 2HBr

- Se pot determina cantitativ următoarele sulfamide: sulfanilamida,


sulfacetamida, sulfaguanidina, sulfamerazina.

5. Determinarea sulfocianurilor alcaline: sulfocianurile sunt oxidate de


catre bromat in mediu acid la sulfati, bromatul reducandu-se la Br-;
sfarsitul reactiei este sesizat prin schimbarea culorii indicatorului rosu
de metil, de la rosu la galben-pal.

SCN- + KBrO3 + H2O → SO4-2 + KBr + HCN + H+

6. Alte determinări: acid ascorbic, HIN, diacetilhexestrol, p-aminosalicilat


de sodiu, nipasol, resorcina, salol, timol, - şi -naftol, hipofosfiţi,
salicilamida, fenol.
294
DETERMINARI DICROMATOMETRICE

 Dicromatul de potasiu în mediu acid este un oxidant:

 Indicatori
- amine: difenilamina, acidul difenilaminosulfonic
- derivaţi de benzidină.

 Soluţii titrate
1.Dicromat de potasiu 0,0167 mol/l(0,1 N)
Este o titrosubstanţă, iar titrul se poate determina şi cu sare Mohr
(difenilamină sulfonată).

295
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea sărurilor feroase:
- oxidarea ionilor Fe2+ la Fe3+ de către dicromat are loc în mediu acid creat de
amestecul format din acid sulfuric şi acid fosforic, in prezenta difenilaminei,
pana la albastru:

6FeSO4 + K2Cr2O7 + 7H2SO4 = 3Fe2(SO4)3 + K2SO4 + Cr2(SO4)3 +7H2O

2. Determinarea metamizolului:
- metamizolul este oxidat de dicromatul de potasiu în mediu acid în prezenţa
difenilaminei după reacţia:

3. Alte determinări: vitamina C, alcoolul etilic, HIN, hidrochinona, 1,4-hi-


drazinoftalazina, tioureea şi derivaţii săi.

296
DETERMINARI CERIMETRICE

 se bazează pe caracterul oxidant al ionului Ce4+ în mediu acid:

Ce4 + e  Ce3

 Funcţia oxidantă poate fi redată şi prin ecuaţia:

2Ce(SO4)2 + H2O  Ce2(SO4)3 + H2SO4 + O

Reacţia are loc nu numai în soluţii apoase dar şi în mediu neapos


(aceto-nitril).

Soluţii titrate
1. Sulfat ceric 0,1 M
Soluţia se poate prepara din Ce(SO4)22(NH4)2SO4.2H2O şi CeO2. Titrul
soluţiei se determină cu: As2O3, sare Mohr, oxalat de sodiu.

Indicatori
- feroina, p-etoxicrisoidina, roşu de metil, difenilamina
- o-fenantrolina feroasă.

297
Aplicaţii în analiza medicamentelor

1. Determinarea oxalaţilor:
- acidul oxalic şi oxalaţii sunt oxidaţi de sulfatul de ceriu în
mediu acid în prezenţa feroinei ca indicator.

(COOH)2 + 2Ce(SO4)2 = 2CO2 + H2SO4 + Ce2(SO4)3

2. Alte determinări: hidrochinona, HIN, acidul ascorbic,


tocoferolul, aminofenazona, hipofosfiţi, zaharuri.

298
DETERMINARI NITRITOMETRICE

 Nitritometria este o metodă volumetrică care are la bază reacţia de


diazotare a aminelor aromatice la tratarea lor cu acid azotos.

 Diazotarea decurge la temperatură scăzută:

Ar-NH2 + HNO2 + HCl  ArN  NCl + 2H2O

Soluţii titrate
1. Nitrit de sodiu 0,1 M
Titrul se determină cu acid sulfanilic (iodură de potasiu amidonată).

Indicatori
- iodură de potasiu amidonată, tropeolina 00, acidul
difenilbenzidindisulfonic, galben de metanil.

 Prinderea punctului de echivalenţă se poate face cu mare precizie


folosind metode electrometrice (potenţiometric şi amperometric).

299
Aplicaţii în analiza medicamentelor

1. Determinarea unor sulfamide

 Principiul determinării: se diazotează gruparea amină primară


cu nitrit de sodiu în mediu acid când are loc reacţia generală:
RNHSO2 ArNH2 + NaNO2 + HCl =
RNH-SO2-Ar- N  N Cl + 2H2O
 Punctul final al reacţiei poate fi pus în evidenţă cu ajutorul
iodurii de potasiu amidonată care se colorează în albastru în
prezenţa unui exces de nitrit, sau cu ajutorul tropeolinei 00
ori a galbenului de metanil:
2 NaNO2 + 2KI + 4HCl = 2NaCl + 2KCl + I2 + 2H2O + 2NO

2. Determinarea acidului p-aminobenzoic:


- reacţia de diazotare are loc în mediu de acid clorhidric 0,1 M,
în prezenţa KBr şi a tropeolinei 00, titrarea efectuându-se cu
NaNO2 0,1 M până la coloraţie gălbuie.

3. Determinarea p-aminobenzoatului de etil:


- principiul este asemănător determinării acidului p-
aminobenzoic.
300
4. Determinarea paracetamolului:
- p-hidroxiacetanilida se hidrolizează în mediu acid când se pune
în libertate grupa NH2 primară aromatică, p-hidroxianilina
titrându-se cu NaNO2 0,1 M în prezenţa KBr şi a tropeolinei.

5. Determinarea clorhidratului de procaină

301
6. Determinarea cloramfenicolului:
- grupa nitro a cloramfenicolului se reduce la amină cu pulbere
de zinc şi acid clorhidric şi se titrează cu NaNO2 0,1 M în
prezenţa KBr şi a tropeolinei 00.

302
DETERMINARI IN MEDIU NEAPOS
 Avantaje faţă de titrarile în mediu apos:

- pot fi titrate ca acizi sau ca baze relativ tari în solvenţi anhidri,


în care sunt solubile, numeroase substanţe medicamentoase
cu caracter acid sau bazic slab sau foarte slab, insolubile în
apă

- pot fi titrate substanţe medicamentoase cu caracter neutru în


mediu apos

- se aplică determinărilor de substanţe anorganice, organice,


izomeri, serii de compuşi omologi, amestecuri de acizi, baze,
săruri

- datorită constantei dielectrice a solvenţilor organici, se pot


determina cantitativ cantităţi mici de substanţe fără a
influenţa observarea punctului de echivalenţă prin slăbirea
virajului indicatorilor.

303
Solvenţii neapoşi sau anhidri se pot clasifica, după proprietăţile lor
sau după efectul produs, în:

A. Solvenţi amfoterici
 solvenţi care manifestă o disociere proprie
 după caracterul lor se împart în:
a) solvenţi amfiprotici: alcooli, cetone
b) solvenţi protogenici (solvenţi care cedează mai uşor protoni,
funcţionând ca acizi): acid acetic anhidru, acid formic anhidru, acid
propionic anhidru, acid fluorhidric, acid sulfuric anhidru
c) solvenţi protofilici (fixează protoni, comportându-se ca baze):
butilamina, etilendiamina, acetona, metiletilcetona, acetonitrilul.

B. Solvenţi inerţi (aprotici)


 nu posedă funcţii bazice sau acide uşor de pus în evidenţă.
a) solventi neutri: benzen, dioxan, cloroform, anhidrida acetica
b) solventi bazici: piridina, DMF,DMSO
c) solventi acizi: nitrometan.
 În aceşti solvenţi substanţele cu caracter acid sau bazic se găsesc
nedisociate.

304
Efectele solvenţilor depind de mai mulţi factori:
1. Capacitatea sa de dizolvare a substanţei
 Capacitatea de dizolvare a unui solvent este dependentă de
proprietăţile solvatante ale acestuia, determinate de:
- proprietăţile lor fizice
- constanta dielectrică
- polaritatea sa
- existenţa legăturilor inter- şi intramoleculare etc.

2. constanta dielectrică, 
 joacă un rol important în disociaţia ionică a substanţei care se dizolvă.
 Substanţele ionice prin disociere vor forma doi ioni între care se
manifestă efecte electrostatice. Între cei doi ioni se va interpune stratul
de solvent, în acest fel se va micşora atracţia electrostatică cu atât mai
mult cu cât constanta dielectrică a solventului este mai mare.
 În solvenţii cu constantă dielectrică mică, cum este a benzenului (2,28),
nu se vor găsi aproape deloc ioni liberi.

 Solvenţii se pot clasifica din acest punct de vedere în:


- solvenţi puţin disocianţi (10 - 15);
- solvenţi mediu disocianţi (15 <  < 40);
- solvenţi disocianţi ( > 40).

305
3. efectul prototropic al solventului
 Solventul intervine prin acceptare sau cedare de protoni.
 În funcţie de afinitatea lor variabilă faţă de protoni, solvenţii
sunt susceptibili de a reacţiona cu substanţele dizolvate şi
chiar sunt capabili de a transforma o legătură covalentă într-o
legătură ionică, dând naştere unei perechi de ioni a căror
disociaţie depinde de constanta dielectrică a solventului.

 Efectul solvenţilor amfiprotici protofilic se manifestă astfel:

 Exemplu: dizolvarea fenolului în dimetilformamidă:

306
 Efectul solvenţilor amfiprotici protogeni se manifestă astfel:

X fiind o grupare electronegativă. In acest mod are loc dizolvarea


anilinei în acid acetic:

 In solvenţii aprotici se manifestă aciditatea sau bazicitatea


intrinsecă a substanţei.

307
Alegerea solvenţilor
 Pentru a doza un singur component cu caracter acid sau bazic se alege un
solvent care prin efectul său prototropic şi prin constanta sa dielectrică să
exalte la maximum aciditatea sau bazicitatea, adică în acest solvent substanţa
să disocieze la maxim.

 Dacă se urmăreşte determinarea cantitativă a unui amestec de acizi sau baze


trebuie să se aleagă amestecuri de solvenţi care în anumite proporţii să
permită dozarea diferenţială.

 Solvenţii acizi exaltă bazicitatea permiţand titrări cu acizi tari.

 Solvenţii bazici exaltă aciditatea şi fac posibilă titrarea cu o bază tare.

 Astfel, în dimetilformamidă se titrează mulţi derivaţi barbiturici, cum este


fenobarbitalul, ca acizi tari, cu o soluţie titrată de metoxid de sodiu în
amestecul benzen-alcool metilic.

 In solvenţi aprotici (benzen, tetraclorură de carbon, cloroform) nu apar


fenomene de solvoliză.

 În astfel de medii aciditatea sau bazicitatea intrinsecă este menţinută integral,


fiind posibilă titrarea oricărui acid sau oricărei baze.

308
 În mediu neapos, chinina se poate determina cantitativ prin
dizolvare în acid acetic anhidru şi titrare cu acid percloric.
Acidul percloric fiind un acid foarte tare în raport cu acidul
acetic va ceda protonul său solventului, reacţia având loc cu
deplasarea echilibrului spre dreapta:

 Chinina în acidul acetic utilizat ca solvent va fi o bază tare şi va


accepta uşor protonii acidului:

Titrarea soluţiei acide de chinină cu acid percloric în acid acetic:

309
Indicatori

1. In cazul utilizării solvenţilor acizi: cristal violet, α-naftolbenzeina,


roşu de chinaldină, violet de metil, tropeolină 00

2. In cazul utilizării solvenţilor bazici: albastru de timol, galben de


alizarină, roşu de fenol, albastru de bromtimol, roşu de
chinaldină, timolftaleina, azoviolet

3. In cazul utilizării solvenţilor neutri: metiloranj, roşu neutral,


galben de metanil.

310
Soluţii titrate
A. Soluţii titrate de acizi
1. Acid percloric 0,1 M, 0,01 M în acid acetic anhidru
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu (cristal violet);
hidrogen carbonat de potasiu (violet de metil).
2. Acid percloric 0,1 M, 0,05 M în dioxan
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu.
3. Acid percloric 0,1 M în acid propionic
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu.
4. Acid percloric 0,1 M în acid trifluoracetic
5. Acid percloric 0,1 M în alcool metilic
Titrul se determină cu tris-(hidroximetil)-aminometan 0,1 M
(albastru de timol şi alfazurin).
6. Acid percloric 0,1 M în etilenglicol-isopropanol
Titrul se determină cu carbonat de sodiu anhidru (metiloranj,
roşu de metil, albastru de timol).
7. Acid clorhidric 0,05 M în alcool metilic
Titrul se determină cu NaOH 0,1 M (fenolftaleină).
8. Acid clorhidric 1 M în etilenglicol-isopropanol (1:1)
9. Acid tosilic 0,005 N în cloroform
Titrul se determină cu stricnină (p - dimetilaminoazobenzen).
311
B. Soluţii titrate de baze
1. Hidroxid de sodiu (potasiu) 0,1 M în alcool metilic anhidru
Titrul se determină cu acid benzoic (albastru de timol)
2. Metoxizi de sodiu, potasiu, litiu 0,1 M
Titrul se determină cu acid benzoic; acid succinic.
3. Metoxid de sodiu 0,1 M în benzen-metanol (10 : 1)
Titrul se determină cu acid benzoic.
4. Metoxid de litiu 0,1 M în benzen-metanol (1 : 6)
5. Hidroxid de tetrabutilamoniu 0,1 M; 0,02 M în benzen-metanol (10:1)
Titrul se determină cu acid benzoic în DMF, acetonă sau MEC (albastru
de timol).
6. Hidroxid de tributilmetilamoniu 0,1 N în benzen-metanol (10:1)
7. Hidroxid de trietilbutilamoniu 0,1 N în benzen-metanol (10:1)
C. Alte soluţii titrate
1. Acetat de sodiu 0,1 N în acid acetic anhidru
2. Anilină 0,1 N în acid acetic anhidru
3. Benzidină 0,05 N în acid acetic anhidru
4. 2 - aminoetoxid de sodiu 0,2 N în etilendiamină
5. Morfolină 0,1 N în acetonitril
6. Perclorat de litiu 0,05 N în acetonitril
7. Morfolină 0,5 N în metanol anhidru
8. Ftalat acid de potasiu 0,1 N; 0,001 N în acid acetic anhidru
9. Tris-(hidroximetil)-aminometan 0,1 N în metanol anhidru 312
DETERMINAREA SUBSTANTELOR
MEDICAMENTOASE CU CARACTER SLAB BAZIC

 Cele mai multe substanţe medicamentoase sunt baze organice şi


se caracterizează prin aceea că au o bazicitate slabă şi sunt
insolubile în apă.

 La determinarea substanţelor cu caracter bazic trebuie să se


ţină seama de:
 dozarea substanţelor cu o singură polaritate bazică slabă sau
foarte slabă

 dozarea unor compuşi care au în aceeaşi moleculă două sau


mai multe polarităţi bazice, mai mult sau mai puţin apropiate
ca tărie

313
 dozarea amestecurilor de baze tari alături de baze slabe sau a
amestecurilor de baze cu polarităţi apropiate având în vedere
scăderea bazicităţii în seria:

R-NH2  R2NH  R3N  C5NH5 (Py)  C6H5 - NH2

 dozarea bazelor organice sau anorganice ca atare sau în


amestecuri din diferite forme farmaceutice.

 Se pot doza în mediu neapos:


 Amine primare, secundare şi terţiare (amino-acizi)
 Amide
 Compuşi azotaţi heterociclici (aminofenazona, fenazona,
antibiotice, alcaloizi, antihistaminice)
 Săruri anorganice şi organice: săruri de alcaloizi, săruri
cuaternare de amoniu

314
Determinări de substanţe cu caracter slab bazic

315
316
317
1. Determinarea sărurilor de potasiu
sau de sodiu ale penicilinei G:
- datorită cationilor din structura
acestei peniciline este posibilă
dozarea cu HClO4 în dioxan,
utilizând ca solvent acidul acetic
anhidru şi -naftolbenzeina ca
indicator.

2. Determinarea benzatinpenicilinei:
- datorită azotului din catena laterală
benzatinpenicilina se poate titra cu
HClO4.

3. Determinarea tetraciclinelor:
- datorită bazicităţii create de azotul
terţiar din poziţia 4; tetraciclinele se
dizolvă în acid acetic anhidru şi se
titrează potenţiometric (electrozi de
sticlă şi calomel) cu HClO4 în dioxan.

318
4. Determinarea eritromicinei:
- azotul bazic al eritromicinei se poate
doza cu ajutorul acidului percloric,
folosind ca solvent acidul acetic
anhidru şi ca indicator cristal violetul.

5. Determinarea cefalosporinelor
- sunt derivaţi de semisinteză ai acidului 7-aminocefalosporanic
cu un spectru larg de activitate antimicrobiană, fiind din ce în
ce mai mult utilizate în terapeutică.
- Dezavantaj: sunt greu solubile sub forma acidă.
- Sărurile alcaline se pot determina în mediu neapos: se dizolvă în
dimetilsulfoxid şi se titrează potenţiometric cu acid percloric în
acid acetic anhidru utilizând combinaţia de electrozi sticlă -
calomel.

319
320
320
Substanţe medicamentoase care se determină cu acid percloric
după adăugarea de acetat de mercur.

321
322
Determinarea clorhidratului de efedrina

• Clorhidratul de efedrină se dizolvă ȋn acid acetic anhidru şi se


tratează cu acetat de mercur (II) ȋn acid acetic anhidru,
eliberând o cantitate de acetat, echivalentă cu efedrina luată
ȋn lucru, care se va titra cu acid percloric ȋn dioxan 0.1 mol/l
până la coloraţie roşu-violet.

323
 Determinarea clorhidratului de procaină:
- substanţa se dizolvă în acid acetic anhidru, se adaugă acetat de
mercur (II) 5% în acid acetic anhidru, şi se titrează cu HClO4 0,1
M în prezenţa cristal violetului până la coloraţie verde:

 In mod asemanator se pot determina numeroase substanţe care


conţin în molecula lor grupări cu sulf (S, -SH, -SR1R2).

324
 Determinarea disulfiramului:

325
DETERMINAREA SUBSTANTELOR
MEDICAMENTOASE CU CARACTER SLAB ACID

 necesită măsuri de protecţie în ceea ce priveşte condiţiile de


titrare: biuretele trebuie prevăzute cu rezervoare în care să se
introducă substanţe adsorbante ale umidităţii şi bioxidului de
carbon.

 se pot determina cantitativ următoarele grupe de substanţe:


 compuşi alcoolici
 compuşi fenolici
 acizi carboxilici
 compuşi imidici
 alcaloizi
 sulfamide
 peniciline, cefalosporine
 amino-acizi
 partea acidă a sărurilor minerale sau organice.
326
327
1. Determinarea fenolilor
 Compuşii cu grupări -OH fenolice slab acide în etilen-diamină, DMF,
butilamină, prezintă o aciditate titrabilă cu CH3ONa sau HTB, utilizând
ca indicatori o-nitroanilina sau albastrul de timol.
 Substituenţii electrofili potenţează caracterul acid: -CHO, -COR, -
COOR, -NH2, -NO2.
 Etilendiamina se foloseste ca solvent bazic pentru a intensifica
aciditatea fenolilor, putandu-i titra cu metoxid de potasiu.

328
2. Dozarea fenobarbitalului din comprimate

Comprimatele se dispersează ȋn dimetilformamidă


neutralizată la albastru de timol (I) ȋn metanol şi se titrează
cu metoxid de sodiu 0.1 mol/l până la albastru.

329
3. Determinarea sulfamidelor
- Sulfamidele se pot titra în mediu neapos cu soluţii titrate bazice
datorită faptului că gruparea SO2 are un caracter electrofil, hidrogenul
fixat la N devine ionizabil, astfel încât sulfamidele devin acide şi pot fi
titrate în solvenţi bazici.

- Substituentul R influenţează tăria acidităţii care scade în ordinea:


fenil, piridil, tiazol, naftil, benzil, alchil. Substituenţii alchilici fiind
respingători de electroni (efect -I) micşorează aciditatea, pe când
substituenţii arilici, atrăgători de electroni (efect +I), măresc aciditatea.

4. Determinarea penicilinelor
- Gruparea COOH a penicilinelor se poate determina titrimetric în
mediu DMF cu CH3OK 0,1 M în prezenţa albastrului de timol.

330
5. Determinarea cefalosporinelor
- Cefalosporinele se pot determina cantitativ în mediu neapos
datorită caracterului lor slab acid.
- Cefazolina se dizolvă în DMSO şi se titrează cu HTB 0,05 M.
Titrarea se face potenţiometric utilizând ca electrozi pe cel de
sticlă şi de calomel.

6. Determinarea amino-acizilor
- Amino-acizii ca substanţe amfiprotice se pot doza direct în DMF
cu HTB în benzen - metanol şi în prezenţa albastrului de timol ca
indicator.
- Se poate folosi ca mediu şi piridina, iar ca indicatori -
naftolbenzeina, azovioletul etc.

331
Planul cursului
Determinari cu agenti tensioactivi

Determinari densimetrice

Determinari vascozimetrice

Metode optice nespectrale


Determinari refractometrice
Polarimetrie
Dispersia optica rotatorie
Dicroismul circular

332
DETERMINARI CU AGENTI TENSIOACTIVI
 Substanţe tensioactive
 substanţele care micşorează tensiunea superficială a
solventului în care sunt introduse
 suferă o adsorbţie pozitivă pe suprafaţa lichidelor
 au o structură liniară cu un capăt al moleculei compus dintr-
un grup de atomi cu afinitate mare pentru apă, denumită
hidrofilă, iar celălalt capăt al moleculei posedă o grupare de
atomi cu proprietăţi hidrofobe.
 Dacă într-un sistem format din două lichide nemiscibile se
introduce o substanţă tensioactivă molecula acesteia se va
orienta cu partea hidrofobă a moleculelor spre lichidul neapos şi
cu partea hidrofilă spre apă.

333
 S-a constatat că atunci când într-o soluţie se află prezente două
substanţe antagoniste - una anion activă şi cealaltă cation activă -
ele îşi vor neutraliza reciproc activitatea superficială.

BX + A M  BA + MX

unde:
BX = substanţă superficială cation activă
B+ = ion hidrofob pozitiv
X- = anion al unui radical acid monovalent
AM = substanţă superficială anion activă
A - = ion hidrofob negativ
M+ = H+, Na+, K+, NH4+.

 Produsul BA - este insolubil în apă şi solubil într-un solvent


organic nemiscibil cu apa sau in exces de reactivi.
 Compusul MX - este un electrolit solubil în apă.
 Rolul de component bazic - substanţa superficial cation activă, o
bază organică sau o sare a sa.
 Rolul de component acid - substanţa superficial anionic activă,
un acid organic sau o sare a sa.

334
 Punctul de echivalenţă se pune în evidenţă prin metode fizice şi
chimice:

 Metodele fizice
 măsoară tensiunea superficială, turbiditatea soluţiei în timpul
titrării.
 metode gravimetrice.

 Metodele chimice - utilizează titrări cu indicatori, pot fi:


 directe - se titrează o substanţă cation activă cu o substanţă
anion activă în prezenţa unui colorant ca indicator.

 indirecte - se izolează sarea BA, se redizolvă şi se determină unul


din ionii sării printr-o metodă volumetrică convenabilă.

335
 Titrarea se face într-un sistem format din două faze: apă şi un
solvent organic.

 In funcţie de solubilitatea colorantului (indicatorului), în faza


apoasă sau organică, se cunosc două tipuri de metode de titrare:

 metode în care la punctul de echivalenţă colorantul este


transferat dintr-o fază în alta;
 metode în care nu are loc transferul indicatorului dintr-o fază
în alta.

336
 In cazul unui colorant acid, reacţiile pot fi reprezentate astfel:

 Baza reacţionează cu colorantul formând compusul B+C- care trece


în cloroform. În timpul titrării cu soluţia de tensioactiv (LSS), sarea
colorantului reacţionează cu LSS rezultând sarea B+A- care trece în
cloroform, iar colorantul pus în libertate trece în faza apoasă.
 Drept colorant acid se poate folosi albastru de bromfenol. În acest
caz, punctul final poate fi considerat în mod arbitrar:
- la prima apariţie a unei culori albastre în stratul apos
- la apariţia unei culori de intensitate egală în ambele faze.

337
 In cazul în care se foloseşte la titrare drept indicator un colorant
bazic, solubil în apă, reacţiile pot fi reprezentate astfel:

 Baza reacţionează cu soluţia de tensioactiv (LSS) formând sarea


B+A- solubilă în cloroform, iar colorantul interacţionează cu excesul
de tensioactiv rezultând sarea C+A-, de asemenea solubilă în
cloroform, dar colorată şi mai stabilă decât sarea B+A-.
 Drept colorant bazic se poate folosi albastrul de metilen. Punctul
final al titrării se poate considera în momentul în care:
- apare prima tentă de culoare în stratul cloroformic
- momentul în care toată culoarea albastră s-a transferat în stratul
cloroformic. 338
Soluţii titrate

1. Lauril sulfat de sodiu ( LSS) 0,01 mol/l


CH3 - (CH2)10 - CH2 - SO4Na

Titrul se determină cu papaverină, narcotină etc.

2. Dioctilsulfosuccinat de sodiu (DOSS) 0,01 mol/l

Titrul se determină cu papaverină

339
Aplicaţii în analiza medicamentelor

 Titrarea cu LSS permite o determinare cu o eroare de:


 1 % pentru substanţele pure
 2 – 5 % pentru formele farmaceutice

Avantaje
 permite dozarea unui mare număr de substanţe
medicamentoase în mod direct
 permite dozarea unui mare număr de substanţe
medicamentoase care se găsesc în cantităţi foarte mici
în formele farmaceutice.

340
Limite
 Reacţiile sunt influenţate de structura şi natura moleculei de
determinat, dependentă ea însăşi de grupările funcţionale:
 Compuşii în a căror moleculă se găsesc grefate grupări
funcţionale hidrofile (OH, COOH, COOR, CONH2 , C=O) diminuează
sau fac să dispară proprietăţile bazice care condiţionează formarea
sării extractibile.
 Există unele substanţe medicamentoase şi unii excipienţi care
consumă titrant în cantităţi nestoechiometrice.

Titrări cu LSS
 determinarea bazelor cuaternare de amoniu alifatice
 determinarea bazelor cuaternare de amoniu ciclice: benzododeciniu,
benzalconiu, cetoxoniu
 determinarea bazelor cuaternare de amoniu heterociclice
 determinarea derivaţilor de fenotiazină: acepromazina, clordelazin,
clorpromazina, dietazina, izotiazina, metopromazina
 determinarea alcaloizilor: tebaina, papaverina, hidrastina, narcotina,
rezerpina.
341
Determinarea substanţelor medicamentoase direct
din forme farmaceutice

 Metoda de determinare poate fi folosită pentru dozarea alcaloizilor


şi bazelor medicamentoase organice din preparate farmaceutice în
prezenţa altor principii active sau excipienţi care nu formează săruri
extractibile cu anionul laurilsulfat.
 Substanţe şi excipienţi care nu interferează aplicarea metodei:

342
 Folosirea unui sistem de solvenţi format din două faze permite aducerea
în soluţie a tuturor componenţilor formei farmaceutice:
 Faza apoasă - dizolvă componenţii polari
 Faza organica – dizolva componentii nepolari (şi mai ales excipienţii
graşi).
 separarea excipientilor inerţi şi insolubili cum ar fi amidonul şi talcul nu
este necesară.
 Metoda de titrare cu LSS se poate aplica formelor farmaceutice: soluţii
medicamentoase, unguente, supozitoare, pulberi, comprimate, drajeuri.
Soluţii medicamentoase
 Ex: se determina cantitativ: clorura de benzetoniu alături de
cloramfenicol, etiluretan, cloretonă, clorura de sodiu, propilenglicol, apă
distilată.
 Cele două faze sunt formate din părţi egale de apă şi cloroform.
 Indicator se foloseste soluţia acido-alcoolică de galben de metil.
Unguente
 Excipienţii graşi utilizaţi la prepararea unguentelor nu consumă soluţie
titrată.
 Proba de determinat se dizolvă sau se suspendă în amestecul apă -
cloroform, se adaugă indicatorul şi se procedează ca la determinările
titrimetrice obişnuite.
343
Supozitoare
 Untul de cacao şi gliceridele semisintetice permit aplicarea directă a metodei prin
faptul că sunt solubile în faza organică a mediului în care se face titrarea.

Comprimate
 Cei mai frecvenţi şi utilizaţi excipienţi la prepararea comprimatelor nu consumă în
mod practic soluţie titrată: caolinul, lactoza, carbonatul de calciu, carbonatul de
magneziu, guma arabică, amidonul, fosfatul tricalcic.
 Ex: se poate determina maleatul de prometazină alături de meprobamat şi
stearatul de magneziu, papaverina alături de acidul nicotinic şi alţi excipienţi.

 Excipienţii şi coloranţii care interferează titrarea duc la o eroare acceptabilă, de


maximum 1 %.

Drajeuri
 Excipienţii utilizaţi la obţinerea sâmburilor (stearatul de magneziu, talcul) cât şi cei
folosiţi la drajefiere (amidonul, gelatina, zaharoza, talcul, ceara, cetaceumul etc.) nu
interferează titrarea fapt pentru care nu se lucrează în condiţii speciale.

Titrări cu DOSS
 Se determină cantitativ cu DOSS: scobutilul, sulfatul de atropină, efedrina,
tetraciclinele, sparteina, stricnina, neostigmina, codeina, apomorfina, chinina etc.

344
DETERMINARI DENSIMETRICE

PRINCIPII GENERALE

Densitate - conţinutul masic din unitatea de volum


- caracteristică a fiecărei substanţe la t, p - constante.

Masa volumică (densitate), 20, a unei substanţe = raportul


dintre masa şi volumul substanţei repective la 20o C; Unitatea de
masura in SI este kg/m3 (kg.m-3).

d 20
Densitatea relativă, , a unei substanţe = raportul dintre
20

masa unui volum din acea substanţă la 20o C şi masa unui


volum egal de apă la 20o C.

Densitatea relativă, d 4 , a unei substanţe = raportul dintre masa


20

unui volum din acea substanţă la 200 C şi masa unui volum egal
de apă la 4o C.

345
• Relaţiile numerice dintre cele trei mărimi sunt următoarele:
20 = 998,202 . d 20
20
sau d 20
20 = 1,00180 .10 -3 . 
20

20 = 999,9702 . d 20 sau d 20


4 = 1,000030 . 10 -3 . 
4 20

20
d 20
20 = 1,00170 . d 20
4 sau d 20
4
d
= 0,99823 . 20

• Determinarea densităţii (functie de precizia ceruta)

1. Densimetre (areometre/termoareometre) pentru lichide


2. Balanţa Mohr-Westphal pentru lichide
3. Picnometre pentru lichide, substanţe semisolide şi solide

346
În laboratoarele pentru analiza şi controlul
medicamentelor cel mai utilizate sunt picnometrele ale
căror tipuri sunt redate în figura.

Picnometre

- precizie determinarii - la a patra zecimală


- se determina densitatea lichidelor faţă de apă la temperatura de
20o C, densitatea grăsimilor solide şi a cerurilor după tehnicile şi
formulele descrise în caietul de lucrări practice.
347
APLICAŢIILE DENSIMETRIEI
• Caracterizarea unor lichide şi produse farmaceutice
(identificare/cercetarea puritatii)
Eter etilic (d=0,713)
Alcool metilic (d=0,791)
Alcool etilic (d=0,798)
Benzen (d=0,879)
Aetheroleum Citri (d=0,849-0,855)
Oleum Olivarum (d=0,910-0,915)
Cloroform (d=1,498).

• Determinarea refracţiei moleculare R  n 2


1 M
M n2  2  d
• Determinarea puterii rotatorii specifice a lichidelor
348
• Determinarea conţinutului în alcool al preparatelor
farmaceutice

Conţinutul în alcool se poate determina:


- Prin trasarea unei curbe etalon (standard)
- Din Farmacopeea Română - raportul dintre densitate şi
procentele de masă şi de volum ale amestecurilor de alcool şi
apă (tabelele alcoolmetrice).

• Determinarea conţinutului procentual în acid clorhidric

- Farmacopeea IX-a - densitatea soluţiilor de acid clorhidric şi


coeficienţii de corecţie pentru soluţiile de acid clorhidric.

• Determinarea conţinutului în glicerol al unor amestecuri


de glicerol-apa (tabel Farmacopeea Română)

• Determinarea conţinutului în zahar al preparatelor


farmaceutice (tabel Farmacopeea Română)

349
DETERMINǍRI
VÂSCOZIMETRICE

PRINCIPII GENERALE

• Vâscozitatea = rezistenţa la alunecare a două straturi de lichid


învecinate, caracteristică lichidelor în timpul curgerii.

• Proprietatea de curgere a unui lichid se referă la rezistenţa


acestuia faţă de o forţă de forfecare aplicată asupra sa. Din acest
punct de vedere se disting două sisteme:

1. Sisteme de curgere newtoniene - se supun legii lui Newton.


Tensiunea de forfecare este proporţională cu viteza de forfecare,
coeficientul de vâscozitate este o constantă, la temperatură şi
presiune constantă.

2. Sisteme de curgere nenewtoniene - nu respectă legea lui


Newton. Vâscozitatea se modifică în funcţie de temperatură şi de
tensiunea de forfecare aplicată.
350
• Considerând două
straturi A şi B de fluid care
se mişcă paralel cu planul
lor de contact şi cu viteze
diferite, se va exercita între
ele o acţiune reciprocă care
va determina încetinirea
deplasării stratului cu
viteza iniţială mai mare şi v + dv

accelerarea deplasării
stratului cu viteza mai A
mică. dx S
B
• Însemnând cu S
suprafaţa comună a celor v
două straturi, cu dx
distanţa elementară care le
separă şi cu dv diferenţa de
viteză a celor două straturi, unde:
forţa de frecare care ia  = coeficient de
naştere este dată de relaţia vâscozitate specific lichidului dat
lui Newton:
dv/dx = gradientul vitezei
(caracterizează variaţia vitezei pe
dv
f    s unitatea de lungime, in direcţia
dx perpendiculară celei de deplasare
a straturilor). 351
• Lichide normale = lichidele pentru care factorul  este
constant în raport cu dv/dx.

• Lichide anormale = lichidele la care factorul  variază în


raport cu gradientul de viteză.

• Vâscozitate dinamică sau vâscozitate absolută,  =


coeficientul  din relaţia lui Newton, constant faţă de raportul
dv/dx, reprezintă rezistenţa care apare intre două straturi de
lichid cu suprafaţa de 1 cm2, care se deplaseaza cu viteza de 1
cm/sec pe distanţa de 1 cm.

- Sistemul CGS, unitatea de vâscozitate dinamică este P-ul


(poise).
- Indicarea valorii vâscozităţii dinamice se face alături de
menţionarea temperaturii şi uneori a presiunii.

• Fluiditate,  = inversul vâscozităţii dinamice.


- Unitatea de fluiditate este inversul unităţii de vâscozitate
dinamică, P-1.

352
• Vâscozitate cinematică,  = raportul dintre vâscozitatea
dinamică a unui lichid şi densitatea acestuia la aceiasi
temperatura.
- Unitatea în sistemul CGS este stokes-ul.

• Vâscozitatea relativă, rel, sau raportul de vâscozitate =


raportul dintre vâscozitatea dinamică a lichidului considerat
şi vâscozitatea dinamică a unui lichid de referinţă la aceeaşi
temperatură.

- lichidul de referinţă = apa la temperatura de 20o C.


- Vâscozitatea dinamică relativă este un număr adimensional.
- Deoarece vâscozitatea dinamică a apei la 20o C este 1cP,
vâscozitatea dinamică relativă a unui lichid faţă de apă la 20o
C este numeric egală, în sistemul CGS, cu vâscozitatea sa
dinamică exprimată în cP.

353
• Vâscozitatea intrinsecă (internă, caracteristică) sau numărul limită
de vâscozitate se exprimă prin relaţia:

- este o mărime utilizată în domeniul polimerilor


- poate fi determinată prin extrapolarea uneia din curbele (rel-1)/c=f(c)
respectiv ln rel/c=f(c), pentru c=0.
- are dimensiunile inversului concentraţiei, adică ml/g sau dl/g.

• Vâscozitatea convenţională Engler = raportul dintre timpul de curgere a


200 ml lichid în vâscozimetrul Engler şi timpul de curgere a unui volum
egal de apă la 20o C
- se exprimă în grade Engler.

• Vâscozitatea aparentă/structurala = valoarea vâscozităţii obţinute


pentru sistemele de curgere nenewtoniene în funcţie de:
- tipul de vâscozimetru folosit
- umiditatea substanţei
- concentraţie
- modul de preparare a dispersiei
- durata şi temperatura de agitare
- perioada de repaus anterioară determinării.
- raportul dintre tensiunea si viteza de forfecare
354
355
• Deoarece ridicarea temperaturii determină mărirea
volumului, vâscozitatea lichidelor scade cu creşterea
temperaturii.
• Pentru lichidele normale această dependenţă poate fi
reprezentată prin relaţia exponenţială:
b
  a eT
a si b = constante specifice ce trebuie determinate
experimental
- Prin cresterea temperaturii creşte:
- pe de o parte volumul liber molecular,
- iar pe de altă parte fluiditatea lichidului.

356
Concordanta temperatura - vascozitate

Vâscozitate Vâscozitate Vâscozitate


Temperatură
0C ulei de ricin apă aer
poise centipoise micropoise
0 53 1,792 171
20 9,86 1,005 181
40 2,31 0,656 190
60 0,80 0,469 200
80 0,30 0,357 209
100 0,17 0,284 218

357
APARATURA
După mărimea măsurată După forma constructivă

Vâscozimetre pentru măsurarea Vâscozimetre cu tub capilar


vâscozităţii cinematice

Vâscozimetre cu corp rotitor sau


corp căzător
Vâscozimetre pentru măsurarea
vâscozităţii dinamice

Vâscozimetre rotametrice

Vâscozimetre pentru măsurarea


vâscozităţii convenţionale
Vâscozimetre mecanice

358
• În funcţie de proprietatile de curgere ale lichidului căruia
i se face determinarea se folosesc:
- vâscozimetre cu capilar
- vâscozimetre cu bilă
- vâscozimetre rotaţionale.

• Pentru determinarea timpului de curgere/cadere se folosesc:


- vâscozimetre cu capilar: Ostwald, Ubbelohde, Engler
- vâscozimetre cu bila: Hoppler

• Pentru determinarea forţelor de forfecare se folosesc:


- vâscozimetre rotaţionale: Brookfield.

vascozimetrul Ubbelohde vascozimetrul Engler 359


Vâscozimetrul Ostwald

• Vâscozitatea dinamică se calculează după formula:

=k·t·d

unde:
 = vâscozitatea dinamică
k = constanta aparatului
d = densitatea lichidului
t = timpul de curgere exprimat în secunde

360
Vâscozimetru Hoppler

• Se măsoara timpul necesar de alunecare prin rostogolirea unor


bile de densităţi şi dimensiuni diferite, pe o distanţă
standardizată, în interiorul unui tub calibrat în care se află
lichidul.

• Vâscozitatea dinamică se calculează cu ajutorul relaţiei:

 = k.t.(db - d)
unde:
 = vâscozitatea dinamică
k = constanta aparatului
t = timpul de cădere al bilei exprimat în secunde
d = densitatea lichidului
db = densitatea bilei
361
• Timpul de curgere (vâscozimetrele Ostwald, Ubbelohde,
Engler) şi timpul de cădere al bilei (vâscozimetrul Hoppler)
trebuie să fie cuprins între 100 şi 300 secunde.
• Măsurarea timpului de curgere/cadere se face cu ajutorul
unui cronometru cu precizie de 0,1 secunde.
• Lichidul trebuie adus la temperatura dorită şi nu trebuie să
conţină bule de aer.
• Variaţiile de temperatură nu trebuie să depasească ± 0,1° C.
• Timpul trebuie să reprezinte media a cel puţin 5 determinări.
• Exemple:
1. Farmacopeele dau indicaţii privind determinarea vâscozităţii
intrinseci la dextran şi în acest caz se foloseşte un vâscozimetru cu
capilar pentru care:
- volumul bulei superioare = 1-2 ml
- diametrul tubului capilar = 1 mm
- lungimea tubului = 10 cm
- timpul de scurgere al apei = minim 100 secunde.
362
2. Determinarea vâscozităţii sistemelor de curgere nenewtoniene
(CMC-Na, MC etc.) se efectuează la un anumit tip de
vâscozimetru şi în condiţii standardizate.

• Se va ţine seama de:


- umiditatea substanţei
- concentraţia dispersiei
- modul de preparare
- durata şi temperatura de agitare
- perioada de repaus anterioară determinării.

• Determinarea vâscozităţii se efectuează asupra unei dispersii


2 % a substanţei lipsite de umiditate, dispersie obţinută prin
agitare timp de 60 minute, a amestecului substanţei cu apa
încălzită la 600 C, într-un pahar de laborator cu palete, cu 200
turaţii/minut. După un repaus de şase ore la 20o C se fac zece
determinări cu vâscozimetrul Hoppler, luând în calcul numai
media ultimelor cinci determinări.

363
• Vâscozimetrul rotativ Brookfield = măsoară mărimea
cuplului de forte necesar pentru a învinge rezistenţa la
rotire a unui cilindru sau disc în interiorul probei.

364
• Reovâscozimetrul Rheotest-2 = funcţionează după principiul
cilindrilor coaxiali.
- În cilindrul exterior cu raza R, termostatat, se află soluţia de
analizat, iar cilindrul interior cu raza r şi lungimea l se roteşte cu
viteza unghiulară .

• Se compune din:
– vâscozimetrul propriu-zis
– aparatul de măsură

 Vâscozimetrul este format din:


- Sistemul de antrenare
- Sistemul de măsură
- Sistemul de cilindri coaxiali (Couette)
365
Vâscozimetru
• Sistemul de antrenare:
- un picior (1)
- motorul sincron (2)
- cutia de viteze cu 12 trepte (3)
- puntea de antrenare (4).
• Cu ajutorul cutiei de viteze se poate alege o anumită viteză
de rotaţie, prin rotirea pârghiei (6), fiecărei poziţii a pârghiei
corespunzându-i o viteză, a cărei treaptă este indicată de
scala (7). În piciorul (1) se află un buton (8) care permite
schimbarea turaţiei din domeniul a în domeniul b.

• Sistemul de măsură este un dispozitiv schimbător de


moment mecano-electric, bazat pe rotaţia relativă a axului
de măsură (9), cuplat cu axul de antrenare (10). Un
dinamometru (11) legat în punte cu un potenţiometru (12) Aparat de măsură
măsoară rotaţia relativă, astfel încât semnalul obţinut este
proporţional cu momentul care acţionează asupra axului.
• Comutarea poziţiilor I, II ale dinamometrului permite
schimbarea tensiunilor mecanice de aproximativ 10 ori,
astfel că, fără a schimba domeniul de măsură, se modifică
mult tensiunile. Comutarea se poate face în timpul
funcţionării aparatului.

• Sistemul cilindrilor: 1 = întrerupător motor


- cilindrul interior rotitor (14) 2 = întrerupător sistem măsură
3 = reglaj mecanic zero
- cilindrul exterior, fix, în care se pune substanţa de lucru 4 = reglaj electric zero
(15) 5 = scala masura
- camera de termostatare (acumulator Hoppler) (16). 6 = frecvenţometru;
7 = becuri control întrerupătoare
366
În timpul determinǎrilor se va alcătui un tabel de forma:

t (oC)  (treapta) α Vr r  (daP) (vâscoz. dinamicǎ)

 Tensiunea de forfecare, r, se calculează funcţie de momentul de rotaţie


M, transformat în semnal electric şi măsurat prin valoarea :

M
r 
2lr 2
• Pentru fiecare cilindru interior, valoarea tensiunii de forfecare se
exprimă funcţie de:

r=Z
unde:
Z = constantă pentru fiecare cilindru.

 Viteza de forfecare, va fi: R2


Vr  2
R  r2
r
• Vâscozitatea structurală se calculează cu ajutorul relaţiei:

Vr
367
• Domeniile de utilizare ale reovâscozimetrului:

- determinarea vâscozităţii lichidelor newtoniene


- determinarea vâscozităţii sistemelor nenewtoniene
- determinarea curbelor de curgere în funcţie de temperatura şi
presiunea de împingere.

• Domeniul de măsurare a reovâscozimetrului este de 1-4·106 cP


pentru lichidele newtoniene.

• Domeniul de temperaturǎ în care se lucrează este cuprins între


- 60o C şi + 120o C.

368
APLICAŢIILE VÂSCOZIMETRIEI
• Caracterizarea substanţelor medicamentoase, auxiliare şi a
formelor farmaceutice

- FR X cere exprimarea acestei constante în unităţi de vâscozitate


dinamică (cP) sau vâscozitate intrinsecă (//).
Exemple:
- carboximetilceluloza sodică (tipurile 3, 1000, 10000, 20000)
- dextran 40 şi 70
- macrogoli (200, 300, 400, 600)
- metilceluloza (100, 400, 600, 1000).

Exemple: forme farmaceutice oficializate:


- soluţia perfuzabilă de dextran 40 10 % cu glucoză 5 %
- soluţia perfuzabilă de dextran 70 6 % cu glucoză 5 %
- soluţia perfuzabilă de dextran 40 10 % cu clorură de sodiu 0,9 %
- soluţia perfuzabilă de dextran 70 6 % cu clorură de sodiu 0,9 %
- unguentul cu macrogoli.
369
 Vâscozitatea este o proprietate reologică de curgere a
lichidelor.

 Reologia studiaza proprietatile structurale


mecanice/proprietati reologice ale sistemelor disperse, sub
actiunea unor forţe de forfecare.

 Din categoria fluidelor newtoniene sau ideal - vâscoase fac


parte:
- solventii polari si nepolari: apa, alcool, glicerol, propilenglicol,
uleiuri vegetale, parafina lichida
- formele farmaceutice ca dispersii omogene: sirop simplu, ape
aromatice, solutii de uz intern/extern, solutii injectabile,
solutii oftalmice

 Din categoria fluidelor nenewtoniene fac parte:


- substante pseudoplastice
- substante plastice
- substante dilatante
- substante tixotrope
370
• Substanţele sau corpuri  Substanţele sau corpuri
pseudoplastice (structural - dilatante:
vâscoase sau cvasivâscoase): - dacă tensiunea de forfecare
- îşi modifică vâscozitatea în funcţie creşte, vâscozitatea creşte.
de tensiunea aplicată. - Exemple: suspensia de amidon
- dacă tensiunea de forfecare in apa, suspensia concentrata
creşte, vâscozitatea scade. de 40-50 % amidon in glicol,
- Exemple: solutii diluate de compusi suspensiile concentrate de
macromoleculari cu catena lunga: pigmenti anorganici in fluide
tragacanta, alginati, metilceluloza nepolare (oxid de zinc 30 % in
si derivati sintetici: polividona apa, sulfat de bariu 40 % in apa)
- Reograma acestor sisteme este - Reograma acestor sisteme este
redată în figura: redată în figura:

371
• Substanţe sau corpuri
plastice
- tensiunea de forfecare trebuie să
depăşească "pragul de tensiune"
pentru a determina orientarea
moleculelor în sensul curgerii şi
deci al micşorării vâscozităţii.
- Exemple: gelurile de
macromolecule hidrofile solubile
(solutii concentrate ale unor
compusi macromoleculari),
suspensiile floculate, pastele,
cremele.

 Substante tixotrope:
- prin aplicarea unei forţe de forfecare
structura de reţea se distruge, însă
după un timp de repaus structura se
reface.
- Exemple: geluri (aerosil, bentonita),
suspensii, unguente emulsii.

372
DETERMINĂRI REFRACTOMETRICE
PRINCIPII GENERALE

 Refractometria este o metoda optica nespectrala care se bazeaza pe


determinarea indicelui de refractie a unei raze de lumina care trece
dintr-un mediu cu o densitate, intr-un alt mediu cu densitate diferita.

 Lumina se propagă în vid cu o viteză c = 3·108 m/sec. La trecerea prin


orice mediu transparent, viteza de propagare a luminii scade, dar
ramane de acelasi ordin de marime.

 Raportul dintre viteza luminii în aer şi în orice mediu (substanta)


poartă numele de indice de refracţie absolut al substanţei. Pentru
toate solidele şi lichidele această definiţie se exprimă prin relaţia:
t v aer
η 
λ v mediu
unde:
t = temperatura
 = lungimea de undă a luminii
va = viteza luminii în aer
vm = viteza luminii în mediu 373
• Dacă o rază de lumină intră oblic din aer într-un mediu, ea suferă o
abatere de la direcţia de propagare.

• Raportul dintre sinusul unghiului de incidenţă şi sinusul unghiului de


refracţie este o valoare constantă şi egală cu raportul vitezei de propagare
a luminii în cele două medii. Drumul razelor este reversibil.

sin i aer
n
sin rm 374
normala

rază
reflectată
raza
incidentă

rază
refractată

• Normala, raza incidentă si raza


refractată sunt în acelaşi plan.

375
 Când lumina trece dintr-un mediu cu
indice de refracţie mic într-un mediu cu
indice de refracţie mare (ex. din aer în
apă sau din aer în sticlă) razele de
lumină (refractate) se apropie de normală
rază
normala refractată
 Când lumina trece dintr-un mediu cu indice
de refracţie mare într-un mediu cu indice de
refracţie mic (ex. din apă în aer sau din sticlă
în aer) razele de lumină refractate se
îndepărtează de normală

 Dacă raza incidentă cade


perpendicular sau sub un unghi
foarte mic pe suprafaţa mediului,
atât unghiul de incidenţă cât şi
cel de refracţie nu se pot
măsura, în consecinţă indicele
de refracţie nu se poate
376
determina.
 Pe măsură ce valoarea unghiului de incidenţă creşte se ajunge ca
la un moment dat, când raza intră în mediul mai dens aproape
tangent, unghiul de incidenţă i = 90o. In acest caz, unghiul rm are
valoarea maximă şi poartă numele de unghi limită, rlim sau unghi
critic de refracţie rc. In mediul mai dens nici o rază nu poate
pătrunde sub un unghi de incidenţă mai mare.
 Nici din mediul mai dens razele nu pot trece în mediul mai puţin
dens când acestea cad pe suprafaţa de separaţie sub un unghi mai
mare decât unghiul limită. Aceste raze suferă fenomenul de reflexie
totală, reîntorcându-se în mediul mai dens.

- punctul A - reflexia totală


377
- punctul B reflexie şi refracţie
• Când lumina trece din aer în mediul considerat, la un unghi
de 90o relaţia devine:
sin 90 o 1
 n
sin rl sin rl
• În cazul a două medii materiale:
sin 90 o C1 C1 x C o
 
sin rl C 2 C 2 x Co

Co C 1 1 n2
 n2 ; 1  
C2 Co n1 sin rl n1

n1 = n2.sin rl
unde:
C1, C2 = viteza radiaţiei luminoase în cele două medii;
Co = viteza radiaţiei luminoase în vid;
n1, n2 = indicii de refractie a luminii in cele doua medii

Se poate calcula indicele de refractie intr-un anumit


mediu, masurandu-se unghiul limita de refractie, ceea ce
confera precizie maxima.
378
Măsurarea indicelui de refracţie

• Valoarea indicelui de refracţie depinde de:


 temperatură
 presiune
 lungimea de undă
 concentratia solutiei
 natura solventului

Creşterea cu un grad a temperaturii lichidelor produce o


scădere a indicelui de refracţie de 3,5·10-4 - 5,5·10-4. Aceste
variaţii sunt mai mici la solide.
Pentru o creştere a presiunii cu 1 atm se constată (la
lichide) creşteri ale indicelui de refracţie de cca 3·10-4.
Lungimea de undă influenţează valorile indicilor de
refracţie. Ex: benzenul:
-  = 6563 Å (roşie) - n = 1,49759
-  = 4341 Å (violet) – n = 1,52487.

379
• Determinarea indicelui de refracţie se face indicându-se
condiţiile de lucru, folosindu-se de obicei lumina
monocromatică a liniei D a sodiului situată la  = 5893 Å.

• Această radiaţie este situată în regiunea galbenă a spectrului


vizibil.

• Temperatura la care se determină de obicei indicele de


refracţie este de 25o C sau 20o C .

• Apa are indicele de refracţie n = 1,3325. Celelalte lichide au


indici cuprinşi între această valoare şi aproximativ 2.

• Unele cristale prezintă două valori ale indicelui de refracţie pe


o direcţie dată (dubla refracţie) şi variaţii ale indicelui de
refracţie cu direcţia de propagare (anizotropia optică).

380
APARATURA
• Partea principală a unui refractometru o
constituie un corp semicilindric din sticlă cu
indice de refracţie cunoscut. De partea plană
superioară este lipit un inel de sticlă care
formează o cavitate în care se introduce lichidul
de cercetat. Sursa luminoasă trimite un fascicul
de raze care sunt focalizate de lentila colimator.
Razele care vin paralel cu suprafaţa orizontală de
separaţie lichid - sticlă pătrund în sticlă, razele
căzând perpendicular pe suprafaţa de separaţie
fără a fi deviate.

În câmpul lunetei apare o nouă zonă


luminată dedesubtul razelor corespunzând
lui r1 şi o zonă întunecată deasupra.
Mişcând luneta de-alungul sectorului
circular gradat până ce zona de separaţie
ajunge la încrucişarea unor fire reticulare
existente în câmpul lunetei, se poate citi
unghiul limită şi se determină valoarea n1,
deci indicele de refracţie al lichidului
cercetat.
381
• Refractometrele Pulfrich şi Abbe sunt două aparate utilizate mai
frecvent în refractometrie.

• Lichidul de cercetat se aşează sub forma unei picături pe o prismă


de sticlă (P). Lichidul este reţinut de o contraprismă cu suprafaţa
mată şi zgrunţuroasă. Luneta de observaţie este fixă, se roteşte
numai ansamblul prismă - contraprismă. Tamburul solidar cu
prisma este gradat direct în indici de refracţie. Pentru aşezarea
probei, prisma se aduce într-o anumită poziţie, apoi se roteşte tot
ansamblul prismă-contraprismă-lunetă pentru a se privi comod.

• Aparatele Abbe modernizate sunt înzestrate cu un sistem de


termostatare atât a prismei cât şi a contraprismei. Dacă se
lucrează în lumina albă, zona de demarcaţie lumină - întuneric
din câmpul lunetei nu este netă. Pentru îndepărtarea acestui
inconvenient în câmpul lunetei s-a fixat un compensator,
constituit din două prisme rotative, cu ajutorul căruia se
introduce o dispersie egală şi de semn contrar cu cea a sistemului
lichid - prismă.

• Refractometrul Abbe, folosind o singură prismă din sticlă cu


indice de refracţie ridicat, dă o precizie mică la citire, însă este
comod de manevrat şi necesită cantităţi mici de probă.

382
• Un alt refractometru folosit este cel de
imersie, care este un aparat de înaltă precizie.

• Aparatul are un set de 10 prisme cu indici de


refracţie diferiţi, permiţând în felul acesta o
adaptare în orice moment a prismelor în aşa fel
încât indicele de refracţie al prismei de lucru să
fie cu puţin mai ridicat decât al lichidului de
cercetat.
• Fiecare prismă lucrează într-un domeniu foarte îngust, unghiurile
limită măsurate sunt foarte mari (aproape 90o) şi variază într-un
domeniu foarte limitat. Din acest motiv prisma este legată solidar
cu luneta de mare putere măritoare. Citirea unghiurilor se face pe
o scară gradată plasată în câmpul ocularului, care pentru corecţie
se poate mişca în câmpul vizual cu ajutorul unui şurub
micrometric.
 Refractometrele diferenţiale sunt astfel construite încât la fiecare
prismă sunt alăturate două cuve în care se introduc lichidele de
comparat (probă şi etalon). În vizor apar două linii de demarcaţie
foarte apropiate şi se citeşte distanţa dintre ele. 383
APLICAŢIILE REFRACTOMETRIEI
• Identificarea şi caracterizarea unor lichide şi produse
medicamentoase
Denumirea to C nD
Adeps lanae anhydricus 60 1,4700 - 1,4750
Produsele
Aetheroleum Anisi 20 1,5520 - 1,5600
medicamentoase lichide
Aetheroleum Caryophili 20 1,5280 - 1,5380 (simple şi complexe) pot
Aetheroleum Cinnamomi 20 1,5800 - 1,5910 fi caracterizate cu
Aetheroleum Citri 20 1,4738 - 1,4755 ajutorul indicelui de
refracţie.
Aetheroleum Citronellae 20 1,4630 - 1,4750
Aetheroleum Eucalypti 20 1,4580 - 1,4700 Indicele de refracţie poate
Aetheroleum Foeniculi 20 1,5280 - 1,5400 servi totodată şi drept
Aetheroleum Juniperi 20 1,4720 - 1,4820
mijloc de apreciere a
purităţii. Impurităţile
Aetheroleum Lavandulae 20 1,4580 - 1,4640 prezente într-un lichid
Aetheroleum Menthae 20 1,4600 - 1,4710 cercetat duc la
Aetheroleum Pini montanae 20 1,4750 - 1,4780 importante modificări ale
Aetheroleum Terebinthinae 20 1,4670 - 1,4780
indicelui de refracţie.
Aetheroleum Thymi 20 1,4900 - 1,5000

384
Denumirea to C nD
Alcoholum 18 1,3624
Apa 25 1,3325
Sirupus Aetheris 20 1,4060 - 1,4120
Sirupus Balsami Tolutani 20 1,4410 - 1,4490
Sirupus Belladonae 20 1,4416 - 1,4496
Sirupus Chlorali hydratis 5% 20 1,4436 - 1,4497
Sirupus Citri 20 1,4450 - 1,4510
Sirupus Codeini 0,2% 20 1,4490 - 1,4570
Sirupus Ferri chloridi oxydulati 5% 20 1,4360 - 1,4440
Sirupus Kalii guaiacolsulfonatis 6% 20 1,4324 - 1,4390
Sirupus Opii 20 1,4432 - 1,4502
Sirupus Opii dilutus 20 1,4486 - 1,4556
Sirupus Simplex 20 1,4464 - 1,4532

385
• Determinări cantitative

 Indicele de refracţie variază liniar cu concentraţia în cazul soluţiilor


binare. Ca urmare se poate trasa o curbă cu soluţii etalon de
concentraţii cunoscute, care poate fi utlizata pentru determinarea
concentratiei necunoscute a unei solutii.

 Se poate aplica şi formula:

unde:
c = concentraţia soluţiei
n = indicele de refracţie al soluţiei
n0 = indicele de refracţie al solventului
F = factor stabilit experimental care variază în funcţie de
concentraţia soluţiei.

 Citirea concentratiei din tabele FR X:


- determinarea concentratiei in zahar
- determinarea concentratiei in glicerol

386
• Determinări de structură
Refracţia moleculară (RM) este o mărime care exprimă refracţia
luminii şi este independentă de temperatură. H. A. Lorentz şi L.
Lorentz au dat expresia matematică a acestei mărimi:

n 1 M 2
RM  2 x
n 2 d
unde:
n = indice de refracţie
M = masa moleculară
d = densitatea soluţiei.

• Refracţia moleculară:
 are dimensiunile unui volum şi se exprimă în cm3
 nu depinde de temperatură, presiune sau starea fizică a probei
 este dependentă de lungimea de undă si de structura chimică a
moleculelor.
387
 Refracţia moleculară calculată prin însumarea refracţiilor atomice diferă
de valorile calculate cu ajutorul ecuaţiei de mai sus datorită
particularităţilor de structură (natura legăturilor), fapt concretizat prin
datele din tabel.
 Valorile refracţiilor de legătură variază în funcţie de grupele existente în
vecinătate.
Legătura RD Legătura RD
C-H 1,676 C=O 3,320
C-C 1,296 C-S 4,610
C=C 4,170 C=S 11,910
C=C (terminal) 5,870 C-N 1,570
C=C (neterminal) 6,240 C=N 3,760
C-C (ciclopropan) 1,490 C=N 4,820
C-C (ciclohexan) 1,270 O-H 1,660
C-C (aromatic) 2,688 N-H 1,760
C-Cl 6,510 N=N 4,120
C-O (alcool, eter) 1,540 N-N 1,990
C-O (ester) 1,460 N=O 4,000
388
• Refracţia moleculară a amestecurilor este o proprietate
aditivă a substanţelor. Ea se poate calcula cu ajutorul relaţiei
Lorentz - Lorentz din indicele de refracţie n, densitatea d a
amestecului ştiind că:

M = x1M1 + x2M2 +....


unde:
x1, x2 = fracţiile molare ale componentelor;
M1, M2 = masele moleculare.

Atunci se poate scrie valoarea refracţiei moleculare:

389
ANALIZA CHIROPTICǍ
A MEDICAMENTELOR
• Termenul chiroptic descrie tehnicile ce utilizează dispozitive de
decelare optică ce sunt selective faţă de substanţele şi/sau
moleculele optic active.

IUPAC (Uniunea Internaţională de Chimie pură şi aplicată):


• substanţă chirală = substanţă ce interacţionează diferit cu cele
doua componente rotatorii D(R) şi L(S) ale luminii polarizate
circular
• chiralitatea = abilitatea unei molecule de a exista ca izomer
dextrogir sau levogir.

390
1. Polarimetria - se bazeaza pe insusirea izomerilor optici
(enantiomerilor) de a roti planul luminii polarizate, datorita
asimetriei unor atomi de carbon din moleculele substantelor
optic active.
- masoara rotirea planului luminii polarizate
sub un anumit unghi (de obicei la o singura lungime de unda)

2. Dispersia optică rotatorie (DOR) - mǎsoarǎ deviaţia


luminii polarizate circular, funcţie de lungimea de undă.

3. Dicroismul circular (DC) - mǎsoarǎ absorbanţa dicroică a


luminii polarizate circular, funcţie de lungimea de undǎ.

391
ANALIZA POLARIMETRICĂ
Principii generale
 Lumina nepolarizată este compusă dintr-un număr infinit de
vectori electrici şi magnetici ce oscilează perpendicular pe
direcţia de propagare.

 În lumina naturalǎ, vectorul electric oscilează în toate


planurile posibile ce cuprind direcţia de propagare.
 În lumina polarizata, vectorul electric oscilează într-un singur
plan, numit planul luminii polarizate.

392
• Dacă lumina polarizată este
transmisă printr-un mediu achiralic
(a), componentele polarizate
intâlnesc un singur indice de
refracţie şi vitezele lor de propagare
sunt egale. De aici rezultă că,
vectorul sumă va fi mereu o rază
polarizatǎ liniar, orientată de-
alungul direcţiei razei incidente,
OO’.

• În contrast, într-un mediu chiralic (b), vor exista doi indici de


refracţie diferiţi pe aceeaşi direcţie (dubla refracţie, birefringenţa).
Datorită celor doi indici de refracţie, cele două componente
rotatorii L şi R se propagă in afara planului fasciculului incident
cu viteze diferite. Insumând vectorii pentru raza transmisă,
reprezentată de diagonala paralelogramului OLO’R (în care OL şi
OR sunt adiacente) se observă că polarizarea este tot liniară;
rezultanta este rotită faţă de direcţia initială cu un unghi .

393
• In cazul moleculelor optic active, fortele rotatorii sunt egale si
opuse sau exista perechi de enantiomeri de puritate egala.
• Mărimea unghiului  este direct proporţională cu diferenţa
indicilor de refracţie şi cu grosimea stratului (d).

π
α  nL  nD  x d
λ
• Pentru exprimarea valorii unghiului α în grade, la grosimi de
strat exprimate în dm, valoarea din relaţia de mai sus se
amplifică cu factorul 1800/π.

• Când nD<nL sau raza dextro se propagă mai repede,


substanţa este dextrogiră,
• Când nD>nL, unghiul  are valoarea negativă, substanţa
respectivă este levogiră.
394
Obţinerea luminii polarizate

1. Scattering

E
Incident light

Scatterer

 Este o metodă ce constă în împrăştierea anormală (difuzie


anormală) a luminii pe direcţia de propagare la un unghi de 90o.
Radiaţia luminoasă este în acest caz polarizată liniar. 395
2. Reflexie

 Când o rază de lumină atinge suprafaţa de separaţie a două medii


transparente cea mai mare parte a luminii se refractă, cealaltă parte se
reflectă de pe suprafaţa de separaţie şi această rază este parţial
polarizată. Dacă raza refractată este perpendiculară pe cea reflectată,
lumina reflectată este polarizata liniar. Unghiul la care se petrece acest
fenomen se numeşte unghi de polarizare sau unghi Brewster.
396
3. Birefringenţă - (sinonim - refracţie dublă)

 Fenomenul de dubla refractie sau birefringenta consta in dedublarea


unei raze de lumina atunci cand aceasta strabate o substanta cristalina,
care prezinta fenomenul de birefringenta.

 Daca privim un obiect printr-o substanta birefringenta, se vor observa


doua imagini ale obiectului, iar la rotirea cristalului in jurul directiei
razei incidente, una din imagini ramane fixa si cea de-a doua se roteste
odata cu cristalul:
 una din raze respecta legile refractiei - raza ordinara
 cealalta raza nu respecta legile refractiei – raza extraordinara

isotropic
crystal anisotropic
(sodium crystal
chloride) (calcite)

397
 Pentru obţinerea luminii polarizate se foloseşte pe scară largă
prisma Nicol sau nicolul. Această prismă constă dintr-un cristal
de spat de Islanda tăiat oblic, sub o înclinaţie mare şi lipit cu
balsam de Canada, care are un indice de refracţie mai mare
decât indicele spatului pentru raza extraordinarǎ şi mai mic
decât pentru raza ordinarǎ.
 Raza extraordinară pătrunde în stratul de balsam de Canada ca
într-un mediu mai dens şi iese din el în cea de a doua parte a
cristalului ca într-un mediu mai puţin dens. Direcţia de
propagare a razei este paralelă cu cea a razei iniţiale.
 Raza ordinară întâlneşte stratul de balsam de Canada ca pe un
mediu mai puţin dens şi, căzând sub un unghi ales mai mare
decât unghiul limită, suferă reflexie totală, fiind apoi absorbită de
peretele înnegrit al nicolului.
 Din nicol iese numai raza extraordinară sub forma unei raze
polarizate.

398
APARATURA

Polarimetre.

Principiile de functionare ale unui polarimetru:


 Dacă în drumul razelor care ies dintr-un nicol se pune un alt
nicol orientat în acelaşi fel (sau la un unghi de 180o) lumina va
intra ca rază extraordinară şi va ieşi din al doilea nicol ca rază
neatenuată, obţinându-se maximum de transmisie. Dacă cel de
al doilea nicol se roteşte în jurul axei sale cu 90o, raza
extraordinară iese din primul nicol şi, intrând în al doilea nicol,
va fi eliminată prin reflexie totală ca o rază ordinară ce este
complet eliminata.
399
 Introducând o substanţă optic activă în cuva polarimetrului
având nicolii încrucişaţi (90o), din cauza rotirii planului de
polarizare, nicolul analizor nu mai este perpendicular pe acest
plan şi câmpul vizual apare luminat. Pentru obţinerea câmpului
întunecat, nicolul analizor trebuie rotit în jurul axei sale cu un
unghi .
 Unghiul  depinde în mai mică măsură de temperatură, dar
este dependent de lungimea de undă a sursei şi este direct
proporţional cu grosimea stratului de lichid, densitatea (pentru
lichidele pure), respectiv concentraţia pentru soluţii.

400
 Pentru a elimina influenţa grosimii stratului, densităţii şi
concentraţiei se calculează mărimea - putere rotatorie specifică,
[] dată de următoarele relaţii:

• pentru lichidele pure:

• pentru substante in soluţii:

unde:
 = unghiul citit la polarimetru
l = lungimea cuvei în dm
d = densitatea
c = concentraţia procentuală.
Concentratia se calculeaza dupa formula:
401
 Indicii rotaţiei specifice se referă la temperatura de lucru (20–
25o C) şi la lungimea de undă folosită: linia D a sodiului, 5893
Å sau linia verde a Hg, 4561 Å.
 In scopul comparaţiei rotaţiei optice a diferitelor substanţe se
defineşte mărimea numită rotaţie molară:

sau

=.M/100

unde:
M = masa moleculară

 IUPAC a hotǎrât că termenul vechi de rotaţie moleculară este


impropriu şi a recomandat să fie înlocuit cu rotaţie molară.

402
APLICAŢIILE POLARIMETRIEI

1. Aplicaţii în cercetare

 Izolarea şi identificarea compuşilor cristalizaţi necunoscuţi


din diverşi solvenţi sau separaţi prin HPLC
 Evaluarea şi caracterizarea compuşilor optic activi prin
măsurarea rotaţiei specifice şi compararea acestor valori cu
valorile teoretice menţionate de literatură
 Investigarea cineticii reacţiilor prin măsurarea rotaţiei optice
în timp
 Monitorizarea schimbărilor de concentraţie a componentului
optic activ în timpul reacţiei, ca în scindarea enzimatică
 Diferenţierea izomerilor optici.

403
2. Aplicaţii în controlul de calitate
Industria farmaceutică
 Determinarea purităţii produsului prin măsurarea rotaţiei
specifice şi rotaţiei optice pentru: aminoacizi, antibiotice,
aminozaharuri, analgezice, cocainǎ, codeinǎ, dextrozǎ, diuretice,
seruri, steroizi, tranchilizante, vitamine.
 Arome, parfumuri şi uleiuri esenţiale industriale
 Inspectarea produselor: camfor, acid citric, gume, acid gliceric,
ulei de lavandă, ulei de lămâie, ulei de mentă, ulei de portocale.

Industria alimentară
 Determinarea concentraţiei şi puritǎţii următorilor compuşi din
alimentele pe bază de zaharuri, cereale şi siropuri: carbohidraţi,
lactoză, rafinoză, varietăţi de amidon, fructoză, levuloză, glucoză,
maltoză, sucrozǎ, xiloză, monozaharide naturale.

Industria chimică
 Se analizează rotaţia optică ca mod de identificare şi
caracterizare: biopolimeri, polimeri naturali, polimeri sintetici.
404
Uleiurile eterice sunt caracterizate nu prin puterea rotatorie specifică, ci
prin puterea rotatorie, caracterizată prin valori uneori mici ale unghiului
de deviere. Astfel:
• uleiul de anason: - 20 → + 10
• uleiul de cuişoare: 0 → - 1,60
• uleiul de scorţişoară: - 1→ + 10
• uleiul de lămâie: + 57 → 65
• uleiul de ienupăr: - 1 → - 10
• uleiul de mentă: - 18 → - 34
405
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase

 Dozarea substanţelor medicamentoase din forme farmaceutice, cum


sunt soluţiile perfuzabile simple sau complexe este posibilă prin
aplicarea formulelor ce leagă puterea rotatorie specifică de concentraţia
soluţiilor.

 Exemple: Se aplică determinarea polarimetrică pentru:


 soluţia perfuzabilă de dextran 40 10 % cu glucoză 5 %

unde:
G = conţinutul la % (g/v) în glucoză anhidră determinat.

 soluţia perfuzabilă de dextran 70 6 % cu glucoză 5 %


 soluţia perfuzabilă de dextran 40 10 % cu NaCl 0,9 %
 soluţia perfuzabilă de fructoză 5,4 %, 10 % sau 40 %
 soluţia perfuzabilă de glucoză 5 %
 soluţia perfuzabilă de clorură de potasiu şi glucoză
 soluţia perfuzabilă de clorură de sodiu şi glucoză
 soluţia injectabilă de glucoză 20 %, 33 % sau 40 %.

406
PLANUL CURSULUI
Dispersia optica rotatorie

Dicroismul circular

Analiza termica a medicamentelor


- Analiza gravimetrica
- Analiza termogravimetrica
- Analiza termica diferentiala
- Calorimetria prin scanare diferentiala

Separarea cromatografica
- Clasificarea metodelor cromatografice
- Procedeul elutiei

407
2. DISPERSIA OPTICǍ ROTATORIE (DOR)
OPTICAL ROTATORY DISPERSION (ORD)

Principii generale

 Dispersia optică rotatorie măsoară variaţia rotaţiei optice a


unei substanţe la schimbarea lungimii de undă a radiaţiei
luminoase.

 Unele molecule organice prezintă în domeniul UV al spectrului


una sau mai multe benzi de absorbţie active. Pe măsură ce
frecvenţa luminii polarizate se apropie de domeniul benzii active,
diferenţa (nL-nD) şi odată cu ea valoarea unghiului  creşte
atingând un maxim.

408
În locul indicilor de refracţie se folosesc în mod
curent valorile extincţiilor celor două componente
(EL şi ED) sau ale absorbanţelor (AL şi AD).

Înregistrarea curbelor DOR - domeniul uzual 250 - 700 nm şi poate


conduce la două tipuri de curbe:
 Curbe “normale” sau “plane” - curbele care nu prezintă nici un
maxim sau minim
 pot fi “pozitive” sau “negative” - după cum au o alură crescătoare
sau descrescătoare

409
 Pentru unele substanţe optic active valoarea unghiului  scade
repede, trecând prin zero şi ajungând la valori negative.
 Această anomalie observată în vecinătatea benzilor de absorbţie
active se numeşte efect Cotton.

 Curbele “anormale” ce corespund efectului Cotton, pot fi:


 "curbe cu efect Cotton pozitiv’’ - când maximul este situat la o
lungime de unda mai mare decat lungimea de unda a minimului
 "curbe cu efect Cotton negativ", când lungimea de unda a
maximului este mai mica decat lungimea de unda a minimului

410
APLICAŢIILE DISPERSIEI OPTICE ROTATORII
Determinări structurale
Steroli
 Stabilirea poziţiei cromoforului carbonilic în structura unui steroid
(prin analiza curbelor caracteristice).

Structuri sterolice şi curbele DOR


- Cetona cu grupa carbonil în poziţia 2 a compusului A prezintă o
curbă cu efect Cotton pozitiv
- Compusul B cu grupa carbonil în poziţia 6 prezinta o curbă cu
efect Cotton negativ.
- Răspunzătoare de apariţia curbelor de dispersie optică rotatorie o
constituie scheletul decalinei, C, pe care se găseşte grupa carbonil.
411
Dextrometorfan

Dextrometorfan şi curba DOR

Carvona

Carvona şi curba DOR

Hematina a tip I. Formele


reduse şi oxidate prezintǎ
curbe DOR anormale cuprinse
între 220 şi 500 nm

412
Hematina şi curbele DOR ale formelor oxidate şi reduse
3. DICROISMUL CIRCULAR (DC)
CIRCULAR DICHROISM (CD)

Principii generale
 Cotton a sugerat faptul că există, o diferenţă între
absorbanţele absolute ale celor douǎ raze polarizate circular de
cǎtre un mediu chiralic (dicroism) şi că magnitudinea
dicroismului este proporţionalǎ cu diferenţa dintre
absorbanţe (extincţii).

413
 Urmând regulile descompunerii vectorului
normal, vectorul electric se împarte în doi
vectori (verzi) .

 Cei 2 vectori (verzi) ce se rotesc opus, fiecare dintre ei descriind o


circumferinţă.

 Ca urmare, lumina polarizată este o rezultantă a razelor de lumină polarizate


circular la dreapta şi la stânga

 Când o substanţă dată are o absorbanţă diferită pentru lumina polarizată la


dreapta, în comparaţie cu lumina polarizată la stânga, la o anumită lungime de
undă, se spune că obţinem un fenomen de dicroism circular, la acestă lungime
de undă.

414
 Cei doi componenţi polarizaţi circular sunt absorbiţi diferenţiat,
astfel că intensităţile lor sunt diferite.
 Rezultanta descrie o traiectorie eliptică.

Lumina polarizată eliptic (purpuriu) este


compusă prin contribuţia inegală a luminii circular
polarizată dreapta şi a luminii polarizate stânga

 Elipticitate = unghiul θ, a cărui tangentă este egală cu raportul


dintre cele două axe ale elipsei, descrisă de rezultanta
componentelor dreapta şi stânga circular polarizate, după trecerea
prin mediul optic activ.
 Tangenta unghiului θ = raportul între axa mică şi cea mare a
elipsei.

415
 Elipticitatea:
 este o consecinţă a dicroismului
 este direct proporţională cu acesta.
 variază cu concentraţia şi grosimea stratului → se utilizeaza
termenul elipticitatea molară.

unde:
c = molaritatea soluţiei
l = grosime strat
100 = datorită utilizării cm.
 Elipticitatea molara se exprima în:
100 deg dm3mol-1cm-1 = 100 degcm3/1000mol-1cm-1 =
deg cm2 / 10 mol-1 = deg cm2 dmol-1

416
 Elipticitatea molara se poate exprima prin absorbtivitate dicroică.
 Absorbtivitatea dicroică, Δε = diferenţa dintre coeficienţii molari de extincţie ai
razelor circular polarizate la stanga şi dreapta.

εL – εR = Δε = absorbtivitate dicroică

 Legatura dintre absorbtivitatea dicroică si elipticitatea molarǎ [] este exprimata


prin următoarea relaţie:

[θ] = 3298.2Δε
unde:
[θ] = elipticitatea
Δε = absorbanţă dicroică.

 Absorbţia dicroică diferă de absorbţia optică simplă, prin faptul că valoarea Δε


poate fi pozitivă sau negativă, după cum lumina polarizată stângă este mai mult
sau mai puţin absorbită decât cea polarizată dreaptă.

 Legea Lambert (pentru dicroismul circular:

ΔA(λ) = [εL– εR] x [c] x l


unde:
ΔA = AL-AR (A = absorbanţa)
εL,εR = coeficienţii molari ai radiaţie polarizate circular dreapta si stanga
[C] = concentraţie molară
l = grosimea stratului (cm). 417
APARATURA

Etape în măsurarea spectrului DC:


1. Prepararea probelor
2. Calibrarea aparatului
3. Determinarea spectrului
4. Analiza datelor

Spectrometru DC
418
Curbele obţinute în dicroismul circular prezintă:
 pe ordonată diferenţa dintre coeficienţii molari de extincţie ai celor două
radiaţii circular polarizate Δε
 pe abscisă lungimea de undă, λ (nm).

 În DC se măsoară absorbanţa dicroică sau elipticitatea în funcţie de


lungimea de undă.

Curba de dicroism circular

Inregistrarea concomitentă
a curbelor DOR şi DC

419
Avantaje:
 utilizarea de probe în cantităţi foarte mici (200 μl soluţie 0.5
mg/ml)
 pregătirea probelor se realizează într-un timp scurt
 este o metodă nedistructivă
 timpul de rezoluţie este de ordinul microsecundelor astfel
dicroismul circular este o metodă rapidă
 modificările datorate influenţei mediului asupra probei (pH,
temperatură) pot fi monitorizate cu acurateţe.

Dezavantaje:
 determinarea globală a structurii
 interferenţa cu absorbţia solventului în regiunea spectrală astfel
încât sunt necesare soluţii foarte diluate
 dacă soluţia tampon mascheaza semnalul probei analizate
trebuie să se realizeze operaţii preliminare de dializă, concentrare
sau diluare metoda are o acurateţe de  10 %
 pot să apară erori în modul de lucru
 aparatura folosită este scumpă.

420
Aplicatiile dicroismului circular
• Determinarea structurii moleculare, configuraţiei şi
conformaţiei unor biocompuşi

Determinarea structurii secundare a proteinelor

Determinarea comparativă a structurii unei proteine


Tranziţiile ȋn structura secundară a proteinelor prin DC 421
Determinarea modificărilor conformaţionale datorate
interacţiunilor dintre moleculele asimetrice

Legarea unei proteine de un


oligonucleotid

Modificarea spectrului proteinei ȋn


urma interacţiunii cu altă proteină

422
Demonstrarea compatibilităţii conformaţiei

Spectrul DC al unei proteine

423
Determinarea structurii unor complecşi de incluziune

Spectrele DC pentru salbutamol


inclus/neinclus ȋn ciclodextrină

424
• Acidul 3 carboxicumarinic
este o moleculă achirală și
astfel nu este de aşteptat să
producă un spectru dicroic.
Totuşi, ȋn absența
ciclodextrinei se poate
ȋnregistra un spectru dicroic
foarte scăzut datorat probabil
unor conformeri generaţi de
diferitele poziţii ale grupării
COOH, ȋn afara planului
cumarinic.

• Prin includere ȋn cavitatea


ciclodextrinei se observă
inducerea unui spectru
dicroic semnificativ,
caracterizat prin două benzi
Spectrul dicroic al acidului 3 carboxicumarinic ȋn pozitive la 290 şi 330 nm.
prezenţa unor concentraţii crescătoare de β-
ciclodextrină

425
Caracterizarea compuşilor chiralici

Dicroismul circular se poate asocia cu analiza HPLC şi analiza spectrală în UV pentru a diferenţia un
derivat chiralic de chinazolină.
Curbele reprezintă pe de o parte analiza derivatului acetilat şi a celui neacetilat analizat dicroic şi
pe de altă parte analiza spectrală a celor doi compuşi după separare HPLC (coloană chiralică OD – H
250 x 4,6 mm, viteză de curgere 0,8 ml/min, fază mobilă: n – hexan – 2- propanol: 9 : 1 la lungimea
de undă 277 nm).

426
Controlul reacţiilor chimice

• Schimbările importante pe care le suferă spectrul


dicroic al unei molecule prin introducerea unui
cromofor, eliminarea lui sau modificarea vecinătăţii
sale, pot fi valorificate pentru controlul operativ al
unor reacţii chimice direct în mediul reacţional, ţinând
cont că alte metode fizice ar necesita separări
prealabile.

• Exemplu - în prepararea prin fermentaţie a


prednisolonului plecând de la hidrocortizon, acesta
poate fi pus în evidenţă pe măsură ce se consumă şi se
poate aprecia randamentul în prednisolon.

427
Determinarea stabilităţii termice
• Stabilitatea termică este evaluată prin utilizarea DC prin
urmărirea schimbărilor ce au loc în spectru prin creşterea
temperaturii

428
Controlul preparatelor farmaceutice.

 Analiza comprimatelor cu metilandrostanolon şi


metiltestosteron

-340 nm - absorbtia datorată metiltestosteronului


-elongaţia negativă a metiltestosteronului şi cea
pozitivă a etilandrostanolonului se compenseaza
la 315 nm, unde curba prezintă un punct de
dicroism nul
-cunoscând deja concentraţia în
metiltestosteronă, este uşor de calculat
metilandrostanolonul, raportând extincţia la
curba etalon a acestuia, din care se deduce
cantitatea necesară pentru a obţine
compensarea.

429
• Analiza soluţiei uleioase injectabile ce conţine benzoat de
estradiol, progesteronă şi propionat de testosteronă

- la 316 nm progesterona ne oferă un punct nul


- la 325 nm cele două curbe etalon sunt secante
ceea ce însemnă că cei doi compuşi prezintă la
concentraţii egale la aceeaşi elongaţie astfel că
valoarea găsită la această elongaţie pe curba de
determinat va permite calcularea concentraţiei
globale a celor doi steroizi

 Analiza unor medicamente chirale antiaritmice (chinidină, flecainida și


propranolol) şi a unor medicamente anti-inflamatorii chirale (ibuprofen și
naproxen).

430
Monitorizarea legării unor substanţe
medicamentoase de albumina serică

Modificări ȋn spectrul dicroic ȋn urma legării diazepamului de albumina serică – stânga – Spectrul dicroic ȋn urma
modificări ȋn spectrul dicroic ȋn UV apropiat diazepam liber şi legat; dreapta – modificări
interacţiunii ibuprofen-albumină
la creşterea concentraţiei de diazepam
serică umană

Dezlocuirea diazepamului de pe
albumina serică de către ibuprofen

431
ANALIZA TERMICĂ A MEDICAMENTELOR
 Analiza termică cuprinde un grup de tehnici în care se
monitorizează diferenţele ce se produc în unele dintre proprietăţile
fizice si chimice ale substanţelor atunci când sunt supuse unui
program controlat de temperatură, prin raportarea la etaloane sau
substanţe de referinţă.

Clasificarea tehnicilor termoanalitice:


Proprietãţi fizice Tehnici derivate Abrevieri
Masa Termogravimetrie TG
Masa izobaricã (determinarea modificãrii)
Detecţia gazelor (evolved gas detection) EGD
Analiza gazelor (evolved gas analysis) EGA
Analiza termicã a emanaţiilor
Analiza termoparticulelor
Temperaturã Determinarea curbelor de încãlzire şi racire
Analiza termicã diferenţialã DTA
Entalpie Calorimetria prin scanare diferenţialã DSC
Dimensiuni Termodilatometrie
Modificãri mecanice Mãsurãri termomecanice
Mãsurãri dinamo-termomecanice
Modificãri acustice Termosonimetrie
432
ANALIZA GRAVIMETRICĂ

 Metodele gravimetrice se bazează pe separarea substanţei de


analizat sub forma unui compus foarte greu solubil, cu o
compoziţie bine definită, cunoscută şi care, după ce a fost
adus într-o formă stabilă, se cântăreşte.

 Condiţiile reacţiilor de precipitare:


 să fie totale
 să rezulte produşi cu o solubilitate cât mai mică, cu o
compoziţie cunoscută şi bine definită
 să se desfăşoare cu o viteză cât mai mare
 precipitarea să nu fie însoţită de fenomene secundare
 compuşii rezultaţi în urma precipitării să poată fi aduşi prin
prelucrări adecvate la compoziţii stabile, cunoscute şi
reproductibile.

433
 Operaţiile necesare unei analize gravimetrice:
 pregătirea materialului pentru analiză
 cântărirea probelor
 dizolvarea substanţelor
 precipitarea
 separarea
 purificarea
 uscarea
 calcinarea
 cântărirea precipitatelor
 calculele şi interpretarea rezultatelor.
 Numărul mare al metodelor gravimetrice şi exactitatea
rezultatelor obţinute face ca metoda să fie uneori folosită
pentru verificarea altor metode chimice sau fizico - chimice
utilizate în analiza cantitativă.
 Exactitatea rezultatelor obţinute în analiza gravimetrică
ţine de performanţa instrumentelor de măsură. S-au elaborat
astfel de metode:
 semimicrogravimetrice (10-100 mg)
 microgravimetrice (0,01-10 mg)
 ultramicrogravimetrice (sub 0,01 mg).
434
ANALIZA TERMOGRAVIMETRICĂ, THERMOGRAVIMETRY (TG),
THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS (TGA),
THERMAL GRAVIMETRIC ANALYSIS
Principii generale
 Termogravimetria se bazează pe înregistrarea variaţiei masei unei
substanţe date în funcţie de:
 temperatura de încălzire
 timp
 atmosfera din celula termica (presiunea şi compoziţia gazului: azot,
heliu, aer, etc.)

 Pot fi analizate: materiale anorganice, metale, polimeri, plastic,


ceramică, sticlă, materiale compuse.
 Intervalul de temperatură: 25-900o C, max 1000o C;
 Cantitatea de probă utilizată: 1-150 mg, (de preferat - peste 25 mg),
dar se obţin rezultate bune şi pentru cele de 1 mg.
 Sensibilitatea metodei: 0.01 mg.
 Se poate asocia: cu un spectrometru de masă pentru identificarea şi
măsurarea vaporilor generaţi, cu o sensibilitate mai mare decât dacă
cele 2 metode s-ar folosi separat.
 Probele: pot fi analizate sub formă de pulbere sau fragmente mici,
astfel încât temperatura din interiorul probei să rămână apropiată de
temperatura gazului. 435
APARATURA

Analizor termogravimetric
Înregistrarea rezultatelor

 Se obţin curbe care permit aducerea unui solid la temperaturi


determinate şi urmărirea:
 variaţiei masei funcţie de timp: m = f(t)
 variaţiei masei funcţie de temperatura de încălzire: m = f(T).

436
 In mod curent se trasează două feluri de curbe:
1. Curbe de temperatură constantă
 Aceste curbe se obţin astfel: încălzind o substanţă la temperaturi diferite
(T1, T2, ....), la temperatura T1 se va atinge un prim echilibru după
timpul t1 şi pe curbă se va înscrie un palier orizontal. Incălzind aceeaşi
substanţă la temperatura T2 se atinge un al doilea echilibru (înscris tot
ca palier orizontal) după un timp t2.

 Astfel se determină condiţiile în care un precipitat sau o substanţă


trebuie să fie uscat sau calcinat pentru obţinerea în final a unui compus
cu o compoziţie unitară şi bine cunoscută.
437
2. Curbe la temperaturi variabile
 Variind liniar temperatura în funcţie de timp se obţine curba
m = f(T).

 În figura este reprezentat graficul curbei obţinute când este


stabilit un prim echilibru la temperatura T < T1 şi când apare un
al doilea echilibru la T > T1. Linia plină reprezintă curba dacă se
aşteaptă la fiecare temperatură un anumit timp pentru atingerea
echilibrului. Liniile punctate reprezintă curbele obţinute în mod
real, dacă se ridică temperatura cu vitezele crescânde v1, v2, v3.

438
• Dacă echilibrul doi este obţinut şi pus în evidenţă printr-un
palier, existenţa, poziţia şi lungimea lui depind de viteza v. Acest
palier indică obţinerea unui compus cu o compoziţie unitară şi
este influenţat de viteza de creştere a temperaturii. Aceste curbe
sunt cunoscute sub denumirea de curbe de termoliză, notate TG.
• În analiza termogravimetrică se utilizează şi curbele diferenţiale
ale variaţiei greutăţii (DTG) corespunzând derivatei curbei de
termoliză.

439
Interpretarea curbelor termogravimetrice

Curbe de termoliza

Curba termogravimetrica (TG) si curba


termogravimetrica derivata (DTG)

440
APLICAŢIILE ANALIZEI TERMOGRAVIMETRICE
 Măsurarea stabilităţii termice
 Determinarea temperaturii şi a modificării masei, în urma
reacţiilor de descompunere, astfel metoda poate fi utilizată pentru
analize cantitative
 Măsurarea vitezei de evaporare, măsurarea vaporilor emişi de
amestecurile lichide
 Determinarea temperaturii Curie a tranziţiilor magnetice
 Identificarea materialelor organice prin măsurarea temperaturii de
scindare a legăturilor în atmosferă inertă sau măsurarea
temperaturii de oxidare în aer sau oxigen
 Determinarea purităţii compuşilor minerali, anorganici sau
organici
 Determinarea conţinutului în substanţe anorganice sau organice
în diferite materiale

441
 Determinarea conţinutului unor pulberi, apei, monoxidului de carbon şi dioxidului
de carbon din carbonaţi
 Descompunerea oxalatului de calciu monohidrat

442
o Studierea stabilităţii termice a substanţelor medicamentoase

• Exemplu: teofilina
• pierdere în greutate de 9.3 %
în intervalul 60 - 80 0C, datorat
deshidratării
• ȋntre 250 – 375 0C are loc
pierdere de masă, ȋntr-o
singură etapă, fără obţinerea
unui reziduu

443
443
• Identificarea unor excipienţi ȋntrebuinţaţi
la condiţionarea unor forme farmaceutice

Curbele termogravimetrice ale


α-lactozei monohidrat, α-
lactozei şi a β-lactozei

444
444
Analiza telmisartanului

Curbele TG şi DTG
pentru telmisartan

445
445
Descompunerea termică a telmisartanului
ANALIZA TERMICǍ DIFERENTIALǍ (ATD)
DIFFERENTIAL THERMAL ANALYSIS (DTA)
Principii generale

 Prin încălzirea unei substanţe, odată cu schimbările fizice şi


chimice, se produce şi o absorbţie sau o degajare de căldură. Se
spune că are loc o variaţie a temperaturii în masa substanţei.

 Măsurarea variaţiei de temperatură in masa substantei se face


cu ajutorul analizei termice diferenţiale.

 ATD reprezintă o tehnică de înregistrare a diferenţei de


temperatură dintre probă şi un martor, atunci când cele 2
substanţe sunt supuse unor intervale de temperaturǎ identice,
într-un mediu încălzit sau răcit cu o rată controlată.
446
APARATURA
 Metoda utilizată pe scară largă pentru caracterizarea
diverselor categorii de substanţe constă în: proba de analizat se
încălzeşte în comparaţie cu o masă identică dintr-o substanţă
inertă (Al2O3); se înregistrează diferenţa de temperatură din
cursul încălzirii cu ajutorul a două termocupluri diferenţiale
introduse unul în probă, altul în substanţa inertă; se apreciază
comparativ variaţia de temperatură.

447
O celulă ATD conţine:
- Termocuplu pentru probă,
termocuplu pentru martor, un
bloc ceramic sau metalic
- Cuptor
- Programator pentru
temperatură
- Sistem de înregistrare

Înregistrarea rezultatelor
 Diferenţa de temperatură dintre cele două substanţe va fi nulă
dacă nu are loc nici un fenomen fizic sau chimic.
 Orice proces chimic care ar avea loc se produce cu degajare sau
absorbţie de căldură. Ca urmare, apare o diferenţă de
temperatură între cele două probe, ceea ce va determina o
deviere faţă de linia de zero, permiţând astfel să se constate
natura procesului termic care se produce: exoterm (+) sau
endoterm (-). 448
DTA
449
APLICAŢIILE ANALIZEI TERMODIFERENŢIALE
 Tehnica “fingerprinting” furnizează informaţii referitoare la reacţii
chimice, transformări de fază, modificări structurale ce se pot
petrece pe parcursul încălzirii sau răcirii unei probe, cu scopul
identificării acesteia. Ex. - teofilina

 Curbele ATD ale calculilor urinari

450
o Identificarea transformărilor de fază şi a modificărilor structurale

Analiza ATD a
cilazaprilului

Curba ATD a cilazaprilului

Descompunerea termică a cilazaprilului 451


451
Interacţiunea medicament-excipient

Curbele ATD pentru clorhidrat de berberină (A), amestec fizic (B),


HP-β-CD (C) şi complex de incluziune (D)
452
452
 S-au construit aparate care înregistrează concomitent cele trei curbe,
arătând atât modificările de masă cât şi variaţiile de temperaturǎ.

Se constatǎ:
 un efect exotermic la 127o şi 161o C,
 o descompunere exotermica la 400o
C cu o pierdere de masa de 89,1%.

 Corelând datele furnizate de cele trei curbe (TG, DTG, ATD) se pot trage următoarele
concluzii:
 dacă curbele TG şi DTG nu arată modificări şi numai curba ATD arată schimbări,
substanţa a suferit fie un proces fizic, fie un proces chimic fără variaţia masei
 dacă toate curbele arată modificări şi în final prezintă paliere orizontale înseamnă că au
loc transformări cu variaţii ale masei, iar în final s-au obţinut produşi stabili.

453
CALORIMETRIA PRIN SCANARE DIFERENŢIALĂ
DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC)

Principii generale

 Calorimetria prin scanare diferenţialǎ (DSC) măsoară cantitatea


de căldură care trebuie introdusă sau îndepărtată din proba de
analizat, pentru a o menţine la aceiaşi temperatură cu o
substanţă de referinţǎ inertă, în timp ce temperatura incintei în
care se găseşte proba şi martorul creşte progresiv.
 Se reprezintă grafic puterea calorica introdusă sau îndepărtată
în sau din probă, funcţie de temperatura momentană a incintei
în care se găseşte proba şi substanţa de referinţă.
 Semnalul proporţional cu capacitatea calorică a
probei
 Dacă proba de analizat nu suferă o transformare
fizico-chimică sau o tranziţie termica, semnalul DSC va
arăta ca o linie.
 Intensitatea şi temperatura la care au loc procesele
termice din probă, se evalueaza fata de aceasta linie
(linie de bază – de referinta).

454
 Atât proba cât şi martorul sunt menţinute aproape la acelaşi
nivel de temperatură pe parcursul analizei. În general,
programarea temperaturii pentru analiza DSC este desemnată
astfel încât proba este ţinută la o temperatură ce creşte liniar
funcţie de timp. Proba martor ar trebui să aibă o capacitate de
încălzire (căldură) peste aceasta temperatură.

 Principiul de bază al acestei tehnici este acela că, atunci când


proba suferă o transformare fizică, căldura va trebui să treacă
prin probă, apoi să fie menţinută la aceiaşi temperatură ca
martorul. În funcţie de proces, endoterm sau exoterm, prin
probă va trece o cantitate de căldură mai mare sau mai mică.
 Dacă o probă solidă se topeşte, va necesita o cantitate mai mare
de căldură pentru a creşte temperatura la acelaşi nivel cu cea a
martorului. Aceasta se datorează absorbţiei căldurii de către
probă, ceea se petrece în tranziţia de fază endotermă din solid în
lichid.
 Când proba suferă un proces exoterm (cristalizare) este necesară
o cantitate de căldură mai mica pentru a creşte temperatura
probei.

455
PROCEDEE

 DSC prin flux de căldură, flux termic (Heat Flux DSC)


 DSC prin compensarea energiei (Power Compensated DSC)

Heat Flux DSC Power Compensated DSC


Platinum Alloy
Sample Reference

PRT Sensor

Platinum
Resistance Heater

Heat Sink

456
DSC prin flux de căldură, flux termic

DSC prin compensarea energiei

457
DSC prin flux termic (Heat Flux DSC)

 Proba şi martorul se află in aceiaşi incintă.


 În acest calorimetru căldura este transferată
probei şi martorului printr-un disc confecţionat din
aliaj de constantan.
 Căldura transportată la probă şi martor este
controlată prin monitorizarea diferenţei de
temperatură dintre probă şi martor.

 În plus, în această funcţie, în transferul de căldură discul


serveşte ca unitate de măsură.
 Proba şi martorul sunt aşezate pe platforme situate pe suprafaţa
discului. Sub fiecare platformă există un disc de chromel.
Legătura dintre aceste două aliaje formează un termocuplu
chromel-constantan.
 Temperatura este monitorizată specific printr-un monocuplu
chromel-aluminiu ataşat sub plăcuţa de chromel.
 Semnalul senzorilor este utilizat pentru măsurarea diferenţei de
flux energetic.
 Se masoara diferenta de temperatura intre cele 2 creuzete,
iar prin calibrare aceasta diferenta de temperatura se
converteste in raportul dq/dt. 458
 Capacitatea calorică
(căldura specifică)

 Flux termic - raportul dintre cantitatea de căldură, q şi timp, t:

 Capacitate de încălzire - raportul dintre fluxul de căldură şi


viteza de încălzire

459
DSC prin compensarea energiei
( Power Compensated DSC)

 Se utilizeaza 2 incalzitoare pentru monitorizarea vitezelor de incalzire


individuale in cele 2 cuptoare Atât proba cât şi martorul sunt
menţinuţi la aceiaşi temperatură, monitorizând consumul de
electricitate de la încǎlzirea lor.
 Elementele de încălzire sunt de mase mici pentru a asigura că,
încălzirea, răcirea şi echilibrarea termică decurg cât se poate de rapid.
 Proba şi martorul sunt plasate deasupra unui încălzitor şi
temperaturile sunt monotorizate utilizând senzori electronici de
temperatură plasaţi imediat sub probe. În general, se utilizează
termometre cu rezistenţă de platinorită.

460
 Rezultatele sunt exprimate prin curba de încălzire sau de rǎcire,
care poate fi folosită pentru calcularea entalpiei tranziţiilor.
Entalpia se calculează după formula:

unde:
H = entalpia tranziţiei
K = constanta calorimetrică
A = aria de sub curbă.

461
APLICAŢIILE CALORIMETRIEI PRIN
SCANARE DIFERENŢIALǍ
 Determinarea structurilor amorfe
Tranziţiile “Glass”
 În sens comun, termenul “glass” se refera la solidele amorfe
transparente, tari şi fragile. In sens ştiinţific, sensul de “glass” este
frecvent extins la toate corpurile solide amorfe (şi topituri care cu
uşurinţă formează solizi amorfi), incluzând masele plastice, răşinile
sau alte solide amorfe lipsite de silicaţi.

 Definiţia standard de “glass” (solid


sticlos) - faza solidă se formeaza prin răcirea
rapidă a substantei topite.

 Temperatura de tranziţie “Glass”, Tg ,


este temperatura la care solidul amorf
devine fragil la răcire sau moale la încălzire.

462
463
 Cristalinitatea substanţelor
Topirea şi cristalizarea (Punct cristalizare - TC; Punct topire - Tm)

464
Transformările fizico chimice ce pot fi evaluate prin tehnica DSC

465
 Analize calitative: amprenta digitală a mineralelor, polimerilor şi
argilelor.

466
o Determinarea punctului de topire, polimorfismului şi cristalinităţii

Substanţe medicamentoase ce se pot detecta prin valoarea punctului de


topire, determinat prin DSC
Substanţă pt Viteza de Interval de pt 0C ȋnscris Farmacope Observaţii:
determi ȋncălzire tempera ȋn ea - puritate
nat prin 0C/minn tură Farmaco care - polimorfism
DSC 0C necesar pei citeaz - descompunere
0C ă
Acetaminofen 168.6 10 168-172 - USP -
Acid ascorbic 192 20 190-192 - USP -
Aspartam 246-247 236 USP polimorfism
Cafeină 236 2.5 235-237.5 USP 99.90 %
236.4 5
236.2 10
236.9 2
Cloramfenicol 150.6 10 149-153 148.9 USP 99.79 %
150.6 2
Haloperidol 150.9 2 147-152 150.8 USP 99.30 %
147-151 BP
Nifedipin 171.4 2.5 171-175 172.3 USP 99.70 %
Paracetamol 168.9 2 168-172 - USP 99.50 %
Progesteronă 130 5 126-131 - USP 99.80 %
polimorfism
467
467
Determinarea structurilor

• descompunerea
termică a unor
substanţe
chimioterapeutice

Curbele TG/DTG şi DSC ale unor substanţe chimioterapeutice: (a) trimetoprim, (b)
sulfametoxazol, (c) ampicilină, (d) clorhidrat de tetraciclină, (e) rifampicină, (f)
trimetoprim-sulfametoxazol
468
468
o Interacţiunea medicament-excipient

Termogramele DSC şi TG ale: aciclovirului (1), amestecului fizic (2),


β-ciclodextrinei (3), compusului de incluziune (4)
469
469
• Din datele DSC se poate
observa un pic endoterm,
corespunzător topirii
0
trimetoprimului la 200 C, iar
picul corespunzător topirii β-
ciclodextrinei este la 85 0C.

• Evaluarea amestecului fizic


demonstrează prezenţa celor
două picuri, spre deosebire de
compuşii de incluziune la care
picul de topire al
trimetoprimului dispare,
datorită încapsulării
medicamentului în cavitatea Termograma DSC pentru I) trimetoprim, II) β-
internă a ciclodextrinei. ciclodextrină, III) amestec fizic, IV) complex

https://www.youtube.com/watch?v=UNiDkw8nji4

470
CROMATOGRAFIA
Istoric
Friedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867)
farmacist şi chimist - separări pe hârtie de filtru
"Der Bildungstrieb der Stoffe" (1855)

Mihail Semenovici Tswett (1872 - 1919) botanist rus


1903: separarea componentelor pe coloana
FS: Al2O3 (umplutură polară)
FM: eter de petrol (eluent nepolar)
propune termenul de "Cromatografie"

471
Istoric
Reichstein & van Euw (1938): elutie cromatografica
Martin & Synge (1941): cromatografie de repartitie pe coloana – premiul
Nobel pentru chimie
Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subţire (TLC)
Cremer & Prior: cromatografie de gaz-solid
Martin & James (1952): cromatografie de gaz-lichid
Golay (1959): cromatografia de gaze pe coloane capilare
Giddings & Kirkland (1968): cromatografia de lichide de inalta
performanta

472
Proba

Faza stationara Faza mobila

 Cromatografia cuprinde o serie de metode de


analiză bazate pe separarea componenţilor unei
probe, prin migrarea lor diferenţiată între două
faze dintre care una este staţionară, iar cealaltă
mobilă.

 Migrarea diferenţiată este o consecinţă a


vitezelor diferite cu care componenţii amestecului
antrenaţi de faza mobilă se deplasează de-
alungul fazei staţionare în coloana
cromatografică sau un echivalent al acesteia:
hârtia cromatografică sau stratul subţire.
473
 Mişcarea moleculelor este determinată de raportul
dintre 2 forţe:
o forţa ce împinge faza mobilă şi odată cu ea moleculele
pentru care are afinitate, favorizată de solubilitate,
volatilitate, etc.;
o forţa de reţinere a fazei staţionare pentru moleculele
cu care interacţionează.
 Raportul dintre cele 2 forţe este diferit, funcţie de
moleculele ce trebuie separate, ceea ce determină
mobilităţi diferite şi separarea componentelor.

474
Faza stationara

Separare

Faza mobila
Amestec Componenti

Componenti Afinitate pentru faza stationara Afinitate pentru faza mobila


Albastru ---------------- Insolubil in faza mobila

Alb  
Rosu  
Galben          

475
CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

Criterii:
 starea fizica a celor doua faze
 lichid, solid, gaz

 modul de curgere al developantului sau eluentului


 ascendent, descendent, radial, bidimensional, în flux
programat etc

 după tehnica de lucru adoptată


 eluţie izocratica, in gradient, frontală, prin deplasare

 după forma izotermei de sorbţie


 lineară - nelineară; în regim izotermic, cu regim
programat etc.
476
 natura fizica a fazei mobile
● gaz-cromatografie
● lichid-cromatografie
● cromatografia cu fluide supercrititce

 polaritatea fazelor
● Cromatografie cu faza normală (FS polară, FM nepolară)
● Cromatografie cu faza inversă (FS nepolară, FM polară)

FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloză


FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat
FM polare : metanol, acetonitril, etanol, apă, tetrahidrofuran
FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen

477
 mecanismul care stă la baza procesului elementar de
separare şi după natura celor două faze:

Cromatografia de adsorbţie - constă în distribuirea


componenţilor unui amestec dat, în funcţie de afinităţile lor pentru
faza staţionară (un solid dotat cu proprietăţi adsorbante).
 Distingem după natura fazei mobile:
 cromatografie lichid-solid
 cromatografie gaz-solid.

478
Cromatografia de repartiţie - se bazează pe solubilitatea
selectivă a componenţilor amestecului de analizat între două faze
nemiscibile. Faza staţionară este lichidă, înfăşurând sub forma
unui film aderent o suprafaţă inertă, iar faza mobilă poate fi un
lichid sau un gaz.
 Deosebim:
 cromatografia lichid-lichid
 cromatografia gaz-lichid.

Cromatografia prin schimb ionic - constă în schimbul


reversibil de ioni şi anume între ionii din soluţie şi ionii de
acelaşi semn ai grupărilor ionizabile ale schimbătorului de ioni.

479
Cromatografia de excludere - difuzie (excludere
moleculară, filtrare prin gel). Faza mobilă poate fi gaz sau
lichid. Suportul este un material cu porozitate controlată, de
obicei geluri. Moleculele de solut părăsesc coloana
cromatografică în ordinea descrescătoare a masei lor
moleculare. Componenţii cu masă moleculară mare nu pot
pătrunde în faza staţionară conţinută în cavităţile granulelor de
gel si vor părăsi primii coloana - excludere; cei cu masă
moleculară mică vor difuza liber între faza intragranulară (faza
staţionară) şi faza intergranulară (faza mobilă) şi vor ieşi ultimii.

Cromatografia de afinitate – se bazeaza pe proprietatea


unor adsorbanti macromoleculari de a manifesta o afinitate
specifica pentru anumiti analiti. Analizeaza interactiunile
specifice dintre moleculele de analit si un ligand fixat pe un
suport inert insolubil; liganzii sunt inclusi in suportul solid,
caruia ii confera specificitate pentru anumite molecule de analit,
fata de care manifesta o afinitate, legandu-le prin covalenta.
480
Mecanisme de separare 481
PROCEDEUL ELUŢIEI (Cromatografia planara)

• Factor de repartitie, Rf (raport frontal, factor de retentie,


“retardation factor”) = raportul dintre distanta parcursa de
solut si distanta parcursa de frontul solventului.

482
PROCEDEUL ELUŢIEI (Cromatografia pe coloana)

 Metoda constă în introducerea unei cantităţi mici de probă în coloana


cromatografică şi apoi a unui volum mare de fază mobilă. Componenţii
separaţi sunt colectaţi la baza coloanei în fracţiuni şi analizaţi prin diverse
metode .

Separare cromatografică pe coloană


483
 Developare: repartizarea componenţilor pe coloana
cromatografică. Rezultă o separare completă dacă zonele
componenţilor sunt distincte, despărţite prin spaţii de sorbent
libere de substanţă.

 Eluent/eluant/faza mobila/ agent de eluare:


solventul/amestecul de solventi care antrenează componentii
amestecului supus analizei, la traversarea unei faze stationare.

 Eluţie: procesul prin care proba părăseşte coloana, apoi fiecare


component este identificat şi dozat.

 Cromatogramă/Curbă de eluţie: rezultatul distribuţiei


zonelor de-alungul coloanei, reprezentarea grafică a concentraţiei
unui analit în funcţie de timp sau de volumul de eluent.

484
Cromatograma

485
Parametrii cromatografici

• Linie de bază = orice parte a cromatogramei unde doar faza mobilă iese din coloană.

• Maximul picului = cel mai înalt punct al picului.

• Punct de injectare = punctul în care proba este plasată în coloană.

• Punct mort = pozitia picului unui solut neretinut

 Timp mort (t0) = timpul între punctul de injectare şi punctul mort

 Volum mort (V0) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană intre punctul
de injectare si punctul mort:
V0 = Qt0
unde:
- Q = viteza de curgere (debit) ml/min.

 Timp de retentie (tr) = timpul între punctul de injectare şi picul maxim


486
 Înălţime pic = distanţa între maximul picului şi linia de bază

 Volum de retentie (Vr) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană între punctul de
injectare şi picul maxim: Vr = Qtr

 Timp de retentie corectat (t’r) = timpul între punctul mort şi


picul maxim sau diferenta dintre timpul de retentie si timpul mort.

 Volum de retentie corectat (V’r) = volumul fazei mobile ce trece


prin coloană între punctul mort şi picul maxim sau diferenţa între
volumul de reţinere şi volumul mort.

 Lăţime pic la 0.5 h = latimea la jumătatea înălţimii picului.

 Lăţimea picului pe linia de bază = distanţa între intersecţiile


tangentelor desenate la cele 2 părţi ale picului şi baza picului.

487
 Coeficient de distribuţie/partitie (K)= raportul concentraţiei unui
component în faza staţionară şi în faza mobilă: [i ]s
K
[i ]m
Depinde de :
- natura componentei repartizate între FS şi FM
- natura fazelor FM şi FS
- temperatura de lucru
- mecanismul de interacţiune cu FS şi cu FM

 Factor de capacitate/retentie (k’) = raportul dintre numarul de moli de solut adsorbit de


catre faza stationara si numarul de moli prezenti in faza mobila.

unde:
- Vs = volumul fazei staţionare;
- Vm = volumul fazei mobile.

488
 Factor de separare/selectivitate – este o masura a capacitatii sistemului
cromatografic de a separa doi componenti.

K B kB
 
K A kA

489
Rezoluţia, (Rs) - măsoară capacitatea efectiva/gradul total de
separare a 2 picuri vecine

unde:
- z = este distanţa între maximul de concentraţie al picurilor de
eluţie aparţinând celor doi soluţi vecini A şi B;
- l = lăţimea fiecărui pic.

Distanţa dintre punctele de


inflexiune este de 2,
l = 4.

Rezoluţia a două picuri vecine


490
Considerând cele două picuri egale şi foarte apropiate astfel
ca tangentele lor să se întâlnească pe linia de bază, se constată că
lăţimea ambelor picuri este egală cu 8. In mod similar şi distanţa z
se poate exprima în unităţi de abatere standard. Valoarea sa este de
4 (2 pentru fiecare pic). Prin urmare, rezoluţia pentru două picuri
a căror tangente se ating (rezoluţie 98o) este:

• Cu cat rezoluţia are o valoare mai mare, cu atat separarea este mai
buna

491
a) Rs = 1, dB-dA = 4 ,
curbe suprapuse 2 % → separare rapida

b) Rs ≥ 1.5, dB-dA = 6 ,
curbe suprapuse 0.3 % → separare mai buna

c) Rs < 1, dB-dA = 3.2 ,


curbe suprapuse →
separare complet nesatisfacatoare

492
Planul cursului
- Teoria talerelor
- Izoterme de distributie
- Ecuatia Van Deemter
- Dispersia zonelor
- Tehnici de elutie
- Cromatografia planara (pe coloana deschisa)

- Cromatografia pe hartie

- Cromatografia pe strat subtire

493
TEORIA TALERELOR TEORETICE
(Teoria platourilor teoretice)

 În teoria talerelor se presupune că, în timpul trecerii prin


coloană, solutul este întotdeauna în echilibru cu fazele mobilă şi
staţionară.

 Totuşi, între faze niciodată nu se atinge echilibrul.

 Pentru a lua în consideraţie această condiţie de non-echilibru, se


consideră coloana divizată într-un număr de talere, fiecare având o
anumită mărime, astfel că solutul va sta un anumit timp în fiecare.

 Mărimea talerelor este stabilită astfel încât să furnizeze un


anumit timp de rezidenţă a solutului, pentru a se stabili un
echilibru între cele 2 faze.

494
 Exemplu: fiecare taler conţine
- o masă m de fază staţionară,
- faza mobilă este adusă în fracţiuni de volume
vi.

 După stabilirea echilibrului, fiecare porţiune


de fază mobilă este transferată pe talerul imediat
inferior. Astfel, faza mobilă a talerului r, în
echilibru cu faza stationara a aceluiaşi taler, se
deplasează în talerul următor r + 1 unde vine în
contact cu o nouă fracţiune de fază staţionară
cu care se va pune în echilibru. In acelaşi timp
faza staţionară care a rămas pe talerul r se va
pune în echilibru cu faza mobilă provenită din
talerul r - 1.

 In coloana cu talere, funcţionarea este


discontinuă; are loc o suită de operaţii de punere
în echilibru şi de transferări alternative, faza
mobilă deplasându-se cu un volum
corespunzător unui taler ( vi) la fiecare transfer.
495
 Numărul de talere teoretice (N) conţinute de coloană este strâns
legat de capacitatea de echilibru, determinând eficienţa coloanei.
în care:
2
 R
t
N  a 
W
- tR = timp de retentie  
- w = latimea picului
- a = constantă ce depinde de înălţimea picului măsurat

Pentru a compara 2 coloane ce au lungimi diferite sau aceeaşi


coloană în condiţii diferite, se foloseşte HETP (Height Equivalent to a
Theoretical Plate):

în care :
- L = lungimea coloanei (cm).

 Un număr mare de talere teoretice (N) sau o valoare HETP mică


determină o eficienţă bună a coloanei.
496
ECUAŢIA VAN DEEMTER

 Ecuaţia van Deemter:


- arată legătura între înăltimea talerelor teoretice şi viteza
procesului.
- descrie procesele de transport-difuzie, ce determinǎ deformarea
picului.
- indică modalitatea de obţinere a unei eficienţe maxime
respectiv o valoare HETP minimă în funcţie de viteza fazei
mobile.

497
 A, B, C sunt constante pentru o
coloana, un analit si conditii
experimentale date:
- A = difuziune turbulentă, determinata
de curgerea neuniforma a fazei mobile
prin coloana/faza stationara (structura
neuniformă a umpluturii)
- B = difuziunea longitudinală a
Reprezentarea ecuaţiei lui van Deemter moleculelor fazei mobile
- C = coeficientul de rezistenţa la
H = A + B/v + Cv transferul de masă în faza staţionară
- v = viteza de deplasare a fazei mobile
(cm.s-1).

498
Difuzia turbulenta:

- este data de particule solide mici, acoperite sau nu cu un film


subtire, cu forma si traiecte diferite de deplasare
- inaintarea neuniforma a analitilor ce trebuie separati
cromatografic produce turbulente care determina largirea zonei
in care se afla fiecare analit
- depinde de:
■ debitul fazei mobile
■ caracteristicile particulelor
■ calitatea materialului de umplutura
499
Difuzia longitudinala

- exprima influenta difuziunii moleculelor in directia de curgere


a fazei mobile
- depinde de:
■ capacitatea de curgere a fazei mobile
■ coeficientul de difuzie al analitului in faza mobila
■ vascozitatea fazei mobile
■ temperatura
■ masa moleculara a analitului.

500
Coeficientul de rezistenta

- corespunde rezistentei la transferul de masa


a) nu toate moleculele din faza mobila sunt antrenate cu
aceiasi viteza, conditiile de repartitie sunt diferite
b) contactul dintre faza mobila si stationara nu este identic
peste tot
c) elutia nu se face cu aceiasi viteza pentru toate moleculele

501
Dispersia zonelor

 În “cromatografia ideală” zonele de concentraţie sunt


compacte şi se caracterizează prin:
 solutul este întotdeauna în echilibru între cele două
faze
 echilibrul de distribuţie se instalează instantaneu
 procesul de sorbţie este termodinamic reversibil
 coloana cromatografică este uniformă
 viteza fazei mobile este constantă
 raportul dintre cele două faze este acelaşi în toate
punctele coloanei
 nu au loc fenomene de difuzie.

502
 În timpul migrării prin coloană, substanţa eluată nu rămâne
concentrată într-o porţiune tot atât de îngustă ca în zona de start.
Se produce o etalare progresivă a zonei pe măsură ce se avansează
în coloană. Moleculele suferă o dispersie în jurul unei poziţii medii
unde se găseşte maximum de concentraţie.

 Pentru “cromatografia neideală” echilibrul de distribuţie al


solutului între faze nu se atinge în mod instantaneu în toate
punctele coloanei, ci zona solutului suferă o dispersare ca urmare
a difuziei în faza mobilă şi în faza staţionară;
o faza mobilă curge întâmplător prin canale de lungimi diferite
antrenând molecule de solut cu viteze variabile;
o asocierea la faza staţionară solidă constituită din particule
poroase a unei părţi din faza mobilă lichidă care rămâne în
micropori fixată poate participa la procesul de separare mărind
complexitatea sistemului;
o distribuţia fazei staţionare lichide sub formă de film neuniform în
jurul granulelor de suport solid inert, conduce la acumulări de
cantitǎţi variabile între granulele sau canalele capilare ale
suportului solid inert. 503
 Admiţând că dispersia respectǎ legile de distribuţie
întâmplătoare, curba de distribuţie în coloană a speciei eluate sau
curba de eluţie prezintă forma unei curbe Gauss, simetrică în
raport cu poziţia medie.

Curba de distribuţie Gauss 504


 Când curba este gaussiană (simetrică):

- aria triunghiului este: 4Cmaxe-1/2 = 2,4265 Cmax

- aria curbei este:

 Difuzia are loc liber datorită gradientului de


concentraţie din regiunea corespunzătoare unei
concentraţii mari (centrul zonei) către regiunile de
concentraţii mici (zone periferice) conform legii lui Fick.
 Alt tip de difuzie în faza mobilă este aşa numita difuzie
turbulentă generată de neregularităţile canalelor
străbătute de solut. Din această cauză moleculele ajung
la capătul coloanei după intervale de timp diferite.

505
IZOTERME DE DISTRIBUŢIE

 Caracterul liniar şi neliniar al izotermelor de distribuţie se reflectă


în aspectul zonelor de concentraţie ale componenţilor separaţi pe
coloană sub forma curbelor de eluţie.

 Se consideră două concentraţii C1 şi C2 în faza mobilă. Valorile


corespunzătoare din faza staţionară adsorbantă sunt q1 şi q2

Izoterme de distribuţie
q - cantitate adsorbită pe unitate
de masă de adsorbant ;
c - concentraţie în faza mobilă

506
 Izoterma de sorbţie liniarǎ (izoterma I):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2=2q1
- proporţionalitate între cantitatea de
substanţă sorbită şi concentraţia sa în
soluţie
- străbaterea coloanei cromatografice se
face cu o viteză independentă de
concentraţie.

507
 Izoterma de sorbţie convexă (izoterma II):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor fi
q2 < 2q1
- la concentraţii mai mari (C2), în soluţie
rămâne o proporţie mai mare de substanţă,
comparativ cu cantitatea corespunzătoare
concentraţiei mai mici (C1)
- substanţa va parcurge coloana cu viteză
mai mare la concentraţie mare şi cu viteză
mai mică la concentraţie mică.

508
 Pentru izoterma concavă (izoterma III):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2 > 2q1
- viteza mare va corespunde
concentraţiei mici, deoarece la această
concentraţie există o proporţie mai mare
de substanţă în soluţie.

509
 Datorită efectelor de difuzie şi a faptului că echilibrul este
incomplet, distribuţia substanţei în zona de start apare ca o parte
centrală concentrată urmată şi precedată de părţi marginale
corespunzând unor concentraţii uniform descrescătoare.
 Dacă izoterma de distribuţie este:
● liniară, aspectul zonei de concentraţie se menţine neschimbat în
timpul deplasării de-alungul coloanei cromatografice.
● curba, zona de concentraţie îşi
schimbă aspectul în timpul deplasării
devenind nesimetrică, porţiunea
maximului de concentraţie a zonelor
deplasându-se mai :
- repede (izotermă convexă)
- încet (izotermă concavă) zona
primind un front abrupt sau prelungit.

 Izotermele de distribuţie liniare se


întâlnesc mai ales în cromatografia de
repartiţie şi în domeniul concentraţiilor
mici în cromatografia de adsorbţie. Cel
mai frecvent tip de izotermă este cel
convex, iar cel mai rar cel concav. 510
TEHNICI DE ELUŢIE

 Separarea prin eluţie este unul dintre procesele de adsorbţie-


extracţie ce are loc continuu din momentul injectării probei în
sistemul de distribuţie până la ieşirea din coloană.

 Reprezentarea grafică a concentraţiei solutului atât în faza mobilă


cât şi în cea staţionară este de tip Gaussian.
 Echilibrul între cele 2 faze
se stabileşte când
probabilitatea unei molecule
de solut de a pătrunde în
faza stationara este aceeaşi
cu probabilitatea moleculei
de solut de a avea suficientă
energie cinetică pentru a
părăsi faza staţionară şi a
intra în faza mobila.

Eluţie izocratică
Eluţie în gradient
Eluţia solutului într-un sistem cromatografic Procedeul frontal
Procedeul deplasǎrii
511
1.Eluţia izocratică

 Condiţiile cromatografice se menţin constante pe parcursul


experimentului.

 Această tehnică este posibilă numai în cazul unui amestec cu număr


redus de componenţi.

 Fiecare component al probei trece prin coloană cu o viteză constantă


specifică şi determinată de concentraţia solventului organic al eluentului.

Efectul unor
concentraţii
diferite de
solvent
organic

512
 Cu cât coloana este mai lungă şi distanţa dintre picuri este mai
mare si picurile probei se lărgesc în acelaşi timp.

 O coloană mai lungă, întotdeauna va determina o rezoluţie mai


bună. Este necesar să se mărească lungimea coloanei de 4 ori
pentru a dubla rezoluţia.

 Eluţia izocratică este necorespunzătoare pentru separarea


probelor care conţin mulţi componenţi cu coeficienţi de distribuţie
cu valori încadrate pe un interval larg.

 Pentru realizarea unei separări bune în aceste condiţii trebuie


ales un eluant cu putere de eluţie corespunzătoare pentru toţi
componenţii.

513
Schema de eluţie a unui amestec de 6 compuşi
 Când se foloseşte un solvent cu putere de eluţie slabă (E1) se
separă bine componenţii 1 şi 2, cu un volum prea mare componenţii
3 şi 4 şi nu se desprind de pe coloană compuşii 5 şi 6.
 Dacă se foloseşte un solvent puternic (E2) cu putere de eluţie prea
mare, componenţii 1 - 4 nu se separă, dar compuşii 5 şi 6 sunt bine
514
separaţi.
• Când se foloseşte amestecul
E1 + E2 cu putere de eluţie
medie se obţin separări
intermediare bune dar nu se
separă componenţii 1 şi 2 şi se
eluează componenţii 5 şi 6 într-
un volum prea mare.
• Rezolvarea se face prin aşa-
numita “eluţie în etape“ când se
adaugă eluenţi diferiţi în mod
discontinuu cu o putere de
eluţie crescătoare (E1 urmat de
E1 + E2 şi apoi E2).
• Se recomandă aplicarea acestei
metode numai în cazul probelor
cu izoterme liniare şi de
compoziţie cunoscută pentru a
decide uşor când trebuie
schimbat solventul.

515
2. Eluţia în gradient

 Puterea de eluţie a solventului care intră în coloană se schimbă


mereu.

 Se realizează cu doi solvenţi, unul slab şi altul puternic. Aceştia


sunt amestecaţi în proporţii treptate astfel încât primul solvent
care părăseşte dispozitivul să fie cel slab E1, în timpul separării
eluentul devine în mod progresiv mai bogat în E2, iar la sfârşitul
separării solventul care părăseşte dispozitivul să fie numai E2 pur.

 Metoda are următoarele avantaje:


 este posibil să se separe componenţii cu proprietăţi sorbtive
foarte diferite într-o singură operaţie
 se obţin picuri de eluţie strâmte şi înalte datorită linearizării
izotermelor de distribuţie sub efectul gradientului
picurile de eluţie sunt mai apropiate datorită aplatizării
izotermelor de distribuţie
 se evită pierderea vreunui component
 diagrama de eluţie este uşor interpretabilă deoarece un
component apare într-un singur pic.
516
Prezentarea comparativă a separării unui amestec de 16 aminoacizi

 Alte procedee de eluţie:


o eluţia cu debit programat (se modifică debitul în timpul separării);
o eluţia cu temperatură programată;
o eluţia în gradient de fază staţionară sau având coloane umplute
cu faze staţionare cu polarităţi diferite.

517
3.Procedeul frontal
 Acest procedeu constă în trecerea soluţiei de analizat prin coloana
cromatografică, nefiind necesar un solvent de developare. Se
determină concentraţia de solut în eluent, se reprezintă această
mărime în funcţie de volumul de eluent şi se obţine o curbă în
trepte.
• Prima treaptă conţine
componentul 1, treapta a doua
conţine componentul 1 şi 2 şi
astfel până la n componenţi.
• Se obţine o separare individuală
doar a componentului cu
afinitatea cea mai slabă pentru
faza staţionară. După acesta,
fiecare treaptă corespunde unui
amestec binar, ternar, până la
soluţia iniţială.
• Metoda nu prezintă un interes
deosebit, informaţiile obţinute
referindu-se mai mult la numărul
Diagrama analizei frontale componenţilor din probă 518
4. Procedeul deplasării
 Metoda este eficientă doar când faza staţionară este solidă şi soluţii
sunt adsorbiţi la suprafaţa ei, în funcţie de afinitate.

 În coloană este introdusă o moleculă numită deplasant (“displacer”) ce


deplasează soluţii de faza staţionară. În această situaţie, molecula
deplasant determinǎ zone de concentraţii mari în solut, adiacente
frontului deplasant.
 Se numeşte agent de deplasare ideal acea substanţă care introdusă în
orice concentraţie CD determină o linie de viteză care intersectează
izoterma solutului. În caz contrar, deplasantul este neideal şi se constată
impurificarea treptei următoare sub forma unui pic de eluţie.

 În zonele concentrate, soluţii intră în competiţie pentru locurile de la


suprafaţa fazei staţionare. Componenţii cu afinitate mare pentru
suprafaţa fazei staţionare se ataşează în locul celor cu afinitate mică. Pe
măsură ce frontul deplasant traversează coloana, împinge soluţii, iar
competiţia între aceştia este continuă.

 In final componenţii se separă în zone adiacente şi distincte.

519
 Substanţele cu izoterme liniare nu pot
fi separate prin această metodă deoarece
nici o linie de viteză nu le intersectează.

 Ipotezele care stau la baza metodei


conduc la concluzia că, fiecare treaptă
cuprinde numai component pur.

 Totuşi, s-a constatat uneori că un


solut se află parţial şi în treapta
următoare. Această contaminare rezultă
din influenţa reciprocă dintre deplasant
şi solutul considerat.
 Pentru a evita contaminarea zonelor
componenţilor separaţi se recomandă
folosirea unor substanţe intermediare,
care să aibă în condiţiile precizate
izotermele de distribuţie intercalate între
cele corespunzătoare componenţilor
amestecului de analizat.
 Aceste substanţe se aleg astfel încât
să poată fi eliminate ulterior prin metode
simple, ca volatilizarea. Ex: la separarea
aminoacizilor s-au folosit ca intermediari
alcoolii.

520
CROMATOGRAFIA PLANARĂ (pe coloana deschisa):
- Cromatografia pe hârtie
- Cromatografia pe strat subţire
- Cromatografia pe strat suprapresurizat
- Cromatografia planarǎ multidimensionalǎ

CROMATOGRAFIA PE COLOANA (pe coloana inchisa):


- Cromatografia de lichide de inalta performanta
- Cromatografia prin schimb ionic
- Cromatografia de excludere
- Gaz-cromatografia
- Cromatografia cu fluide supercritice

521
CROMATOGRAFIA PLANARA (CP)
PLANAR CHROMATOGRAPHY (PC)

 Cromatografia planară (CP, cromatografia pe pat/coloană deschisǎ) –


include:
 cromatografia pe hârtie
cromatografia pe strat subţire.

 Este probabil cea mai accesibilă metodă cromatografică, ce necesită


pentru funcţionarea de bază doar suportul, solventul şi un recipient adaptat
să conţină cele două elemente precedente pentru a realiza developarea.

 Este o metoda simplǎ, robustǎ, rapidǎ şi necesită doar mijloace modeste


de echipament, de resurse şi de personal calificat.

 Este utilizata pentru analiza calitativă şi semi-cantitativă.

522
 Într-o manieră contradictorie, având în vedere că poate fi pusă în lucru
atât de uşor, CP a câştigat stigmatul unei metode de rezoluţie, si
sensibilitate scazuta şi incapabilă de a răspunde la problema punerii la
punct a metodelor precise, exacte şi specifice.

 Un astfel de punct de vedere este incorect şi poate fi comparat cu


imposibilitatea obţinerii de rezultate sensibile şi cantitative în HPLC,
bazându-ne doar pe experienţa câştigată prin cromatografia pe coloană.

 Mai clar, se poate spune că, atunci când este prost utilizată, CP
instrumentalǎ dă rezultate proaste şi acesta este singurul motiv pentru care
dezvoltarea tehnicilor specifice pentru CP a început cu întârziere, în raport
cu alte tehnici cromatografice.

523
CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
PAPER CHROMATOGRAPHY (PC)

 Cromatografia pe hârtie este o metodă fizico-chimică de separare şi identificare a


unor amestecuri de substanţe, bazată pe repartiţia lor diferită între:
 faza staţionară - hârtia cromatograficǎ şi lichidul fixat pe ea
 fază mobilă - un solvent sau amestec de solvenţi organici şi anorganici.
 O separare cromatografică depinde în mare măsură de modul cum s-au ales cele
două faze.

 In hârtia cromatografică, datorită structurii fibroase, există goluri, iar celuloza care
formează faza staţionară prezintă suprafeţe de ordinul 600 m2/g.

 Datorită structurii poroase este posibilă ascensiunea capilară a solventului şi


separarea componenţilor.

 Faza staţionară este alcătuită din faza apoasă care există întotdeauna în celuloză
datorită caracterului hidrofil şi structurii poroase a celulozei.

524
 Hârtia cromatografică obişnuită nu se poate folosi la separările de
substanţe grase, alcaloizi, proteine, etc. Pentru aceste scopuri se foloseşte
hârtia cromatograficǎ hidrofobizată sau celuloza modificată chimic.

525
Caracteristicile unor sorturi comerciale de celuloză
schimbătoare de ioni

 Prin grefarea pe lanţul macromolecular al celulozei de grupări ionizabile


s-a obţinut celuloza schimbătoare de ioni, caracterizată printr-o mare
capacitate de schimb.

 Grupările ionizabile se găsesc pe suprafaţa reţelei macromoleculare şi din


acest motiv asigură o adsorbţie mărită faţă de proteine, acizi nucleici etc.

526
 Pentru separarea în bune condiţii a unor clase de substanţe se aplică
impregnarea hârtiei cu lichide sau substanţe solide.
 Hârtiile cele mai utilizate pentru impregnări sunt: Whatman 3,4,1 şi
Schleicher-Schull 2043 şi 2045.
 Se impregnează hârtia cu soluţii tampon, acizi, baze, lichide polare sau
nepolare, agenţi de complexare, săruri ale metalelor grele (Ag+, Cu2+, Pb2),
agenţi de precipitare.
 Hârtiile impregnate cu acid silicic sunt folosite pentru separările
lipidelor polare, hidraţilor de carbon şi a fosfolipidelor.
 Impregnarea hârtiei cu o altă fază staţionară lărgeşte posibilităţile de
separare a substanţelor anorganice şi organice.

527
 In separările cromatografice, ca faze mobile se folosesc serii de solvenţi
organici şi compuşi anorganici.

 Pentru toate tipurile de cromatografie s-a încercat să se facă o clasificare


a solvenţilor, dupa:
 tăria relativă - grupându-i în ordinea puterii de eluţie
 tensiunea superficială dintre solvent şi faza staţionară.

Exemple de solvenţi utilizati în cromatografia pe hârtie:


 alcooli: amilic (n- şi izo-), butilic (n-, izo-, terţ-), etilic, metilic, propilic
(n-, izo-)
 cetone: acetona, acetilacetona, etilizopropilcetona, metiletilcetona
 esteri: acetat de etil, formiat de etil
 eteri: eter etilic, dioxan
 acizi organici: acid butiric, acid formic, acid propionic, acid acetic
 baze organice: dietilamină, nicotină, piridină
 alţi solvenţi: tetrahidrofuran, benzen, toluen, xilen (o, m, p), ciclohexan.

528
CLASIFICARE

 După sensul de migrare al fazei mobile:


 radială, circulară sau pe discuri
 orizontală
 ascendentă
 descendentă

 După direcţia de migrare a sistemelor:


 unidimensională
 bidimensională

529
Detectia
 Detectia dupa migrare poate fi:
 Vizuala
 Instrumentala

 Detectia vizuala:
o Detectie chimica:
- directa pentru compusii colorati
- dupa pulverizarea unui reactiv capabil sa reactioneze cu moleculele
separate pentru a da substante colorate
Exemple de reactivi:
● iodură de platină
● verde de bromcrezol
● brom - amidon - iodură de potasiu
● diazotare şi cuplare cu -naftol
● p-nitroanilină diazotată (în mediu bazic)
● p-dimetil-aminobenzaldehida
● reactivul Dragendorff
● vapori de iod
● reactivul Marquis
● reactivul Millon
● ninhidrină
● permanganat de potasiu
530
o Detectie fizica:
- examinare in lumina UV-Vis

 Detectia instrumentala
o Detectie densitometrica
o Banda de hârtie se decupează, se extrage cu un solvent adecvat şi
se analizează printr-o metodă adecvată: refractometric,
spectrofotometric etc.

531
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE HARTIE

 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase. Ex:


 Separarea si identificarea fenobarbitalului si difenilhidantoinei
din tablete (FS: Whatman 1, FM: amoniac 10 %: apa:butanol –
70:30:100, Detectie: sulfat de mercur (II))

 Identificarea si determinarea puritatii substanţelor


medicamentoase. Ex:
 Identificarea si determinarea puritatii ergometrinei maleat (FS:
hartie Schleicher-Schull 2043/b impreganata cu dimetil-
ftalat:cloroform - 1:9, FM: formamida: hidroxid de potasiu 0.1 N
impregnat cu demetilftalat (2:8), Detectie: imersare in
paradimetilaminobenzaldehida 0.5 % in cloroform:ciclohexan –
1:19)

 Alte exemple:
- Identificarea gentamicinei sulfat
- Identificarea vancomicinei clorhidrat

532
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE (CSS)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)

Principii generale
 În procesul cromatografic intervin legături intermoleculare de energie
slabă :
 forţe van der Waals
 legăturile de hidrogen

Forţele van der Waals


 Energia lor corespunde:
- căldurii de vaporizare a unui lichid
- căldurii de sublimare a unui solid.
 Sunt responsabile de existenţa lichidelor şi cristalelor moleculare.
 Sunt forţe atractive şi nespecifice.
 Există trei tipuri de forţe Van der Waals:
 forţe Keesom – de tip dipol - dipol
 forţe Debye - de tip dipol – dipol indus
 forţe London - de tip dipol indus – dipol indus

533
Legăturile de hidrogen

 Se formeaza cand protonii atomilor de hidrogen, legati de atomi puternic


electronegativi A (F, O, N...) sunt atrasi de electronii unor atomi identici
situati pe alte molecule. Se poate atribui atomului A sarcina negativă - şi
atomului de H sarcina +, legătura realizând astfel un dipol electrostatic.
Interacţiunea între doi dipoli este numită legăturǎ de hidrogen:

 Comparativ cu legătura covalentă, aceasta este o legătură de energie


slabă şi de lungime mare.

 Existenţa ei permite o orientare a moleculelor în interiorul lichidului care


sunt ordonate în spaţiu si determina:
 scaderea entropiei lichidului si a energiei libere
 creşterea stabilitatii.
Ex. H2O este mai stabilă decât H2S.

 Numărul legăturilor de hidrogen care se stabilesc într-o situaţie depinde


de temperatură.

 Interacţiunile conduc la echilibre reversibile.

534
 Migrarea prin capilaritate a eluantului cu traversarea adsorbantului
antrenează selectiv soluţii. În funcţie de natura chimică:
 solutii care au energie de adsorbţie mare sunt puternic fixaţi si sunt
puţin antrenaţi de către eluant → migrează puţin.
 soluţii care au energie de adsorbţie mică - fenomenul invers.

 Principiul CSS - probele sunt separate prin migrarea eluantului prin


faza stationara.

 Faza staţionară sau adsorbantul este în general ales un gel de silice.


Legăturile care se stabilesc se datorează grupărilor silanol libere. Alti
adsorbanţi: alumina, celuloza, kieselgur, poliamida, silicat de magneziu,
etc

 Faza mobilă sau eluantul este un solvent uzual (sau un amestec de


solvenţi), caracterizat prin forţa eluantă, εo.

 Dacă adsorbantul rămâne acelaşi, migrarea unui compus depinde


exclusiv de natura eluantului (forţa sa eluantă), ceea ce induce
posibilitatea unei reproductibilităţi a rezultatelor pentru un eluant dat.

535
MĂRIMI FUNDAMENTALE

 Fenomenul de adsorbţie în strat subţire poate fi considerat ca o


tehnică de separare a compuşilor dintr-un amestec.
 Fiecare cromatogramă obţinută cu acelaşi adsorbant, acelaşi eluant şi
în condiţii experimentale identice prezintă acelaşi aspect: fiecare compus
migrează în acelaşi mod.

 Astfel, este posibil pentru un sistem cromatografic dat, să se


caracterizeze un solut (substanţa dizolvată) prin distanţa pe care o
parcurge în raport cu frontul de solvent.

 Factorul de retentie:
 variaza invers proportional cu raportul de distributie si este cuprins
intre 0 si 1.

536
DESFÃŞURAREA PROCESULUI CROMATOGRAFIC

Placa, faza staţionară

 În CSS, plăcile sunt constituite dintr-un suport inert rigid sau flexibil
(placă de sticlă, foiţa de aluminiu, etc.), pe care faza staţionară este depusă
sub forma unui strat subţire (grosimea între 200 şi 250 m).
 Stratul subţire depus se amestecă cu lianţi minerali sau organici pentru
a asigura adeziunea pe placa cromatografică.
 Dimensiunile obişnuite ale suprafeţei stratului sunt:
- 10 x 5 cm
- 10 x 10 cm
- 10 x 20 cm
- 20 x 20 cm.

537
 Plăcile flexibile

 sunt constituite din 90 ± 2 % de fază (silice, C18...) inclusă


într-o matrice de poli[tetra]fluoretilena (Téflon) care îi conferă
o mare plasticitate şi posibilitatea decupării normale (cu un
foarfece)
 mărimea porilor de silice: 60 Å
 grosimea stratului: 0,2 mm
 diametrul particulelor: 8 m
 au o capacitate de adsorbţie mult mai mare decât plăcile
clasice (utilizare în mod analitic şi preparativ).

538
 In afara plăcilor clasice ale cromatografiei pe strat subţire se
folosesc plăci HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography):
 dimensiuni: 10 x 10 cm sau de 10 x 5 cm
 diametrul particulelor: este mult mai mic
 grosimea stratului adsorbant: 100 m (200-250 m în
cromatografia clasică)
 suportul: silicagel ca în cazul cromatografierii cu faze normale sau
cu Si-C8 sau Si-C18 în cromatografia cu faze inverse
 distanţa de migrare: 3-5 cm
 spotarea: automat
 timpul necesar unei analize: scurt
 scanarea: UV-VIS sau prin fluorescenţă cu ajutorul densitometrelor.

539
Depunerea eşantionului (spotarea)

 În CSS clasică:
 soluţia eşantionului substanţei de analizat este depusă cu ajutorul unui
capilar sau a unei seringi la o distanţă mică (în general 1 cm) de
extremitatea stratului
 Volumul depus este foarte mic şi trebuie de avut grijă ca stratul de fază
staţionară să nu se deterioreze cu extremitatea seringii sau a capilarului.

 Volumele transferabile prin capilare mici sunt de zeci până la 500 nl, iar
cele prin seringi de 10 nl până la 100 l.

 Spotul astfel obţinut poate fi circular şi cât mai mic posibil.

 Depunerea ideală este cât mai mic posibilă, de 0,5-5 l în CSS, de 50


până la 500 nl în HPTLC (monoplăci).

 Utilizarea de capilare cu vârf confecţionat din siliciu permite depunerea


(spotarea) unui volum de 10 nl.

540
 Practic, trebuie efectuată spotarea în soluţia unui solvent, a cărui forţă
eluantă să fie mai slaba decât cea a solventului de developare, altfel spus,
dacă faza staţionară este polară, spotarea trebuie efectuată într-un solvent
nepolar.

541
 Din punct de vedere comercial sunt disponibile aparatele semi- sau
automate de spotare a probei:

 Nanomat; pipeta este coborâtă spre stratul fazei staţionare prin acţiunea
unui magnet. Volumele depuse sunt de 100-200 nl şi repetabilitatea
depunerii este de ordinul 1 %.

 Linomat(Camag); metodă semi-automatǎ de spotare prin pulverizare pe


benzi înguste.

 În cazul unei serii mai mari, operaţia poate fi automatizată total cu


ajutorul unui depunător automat de eşantionare, capabil să spoteze de la
100 nl până la mai mulţi l, cu o precizie de 1 %.

542
Developarea plăcilor
Placa este plasată într-o cuvă (bac) de developare, conţinând solventul (sau
amestecul de solvenţi) ce constituie faza mobilă.

543
Ascensiunea capilară

 Stratul poros poate fi asimilat cu o multitudine de mici capilare


interconectate şi lichidul urcă pe strat umplând capilarele cele mai
mici.

 Se constată experimental că, relaţia între distanţa parcursă de


către frontul de solvent şi timp este direct proportionala.
544
Influenţa fazei gazoase asupra vitezei ascensiunii în capilare

 Legea de mai sus nu este respectată, când cuva de developare are


dimensiuni mult mai mari decât cele ale plăcii. Aceasta se datorează
faptului că, o parte a fazei este în contact cu atmosfera cuvei.

 Influenţa fazei gazoase se manifestă in mai multe moduri:


 adsorbţia vaporilor solventului de către stratul uscat
 evaporarea solventului.
 Aceste 2 fenomene au loc concomitent. Atenuarea unuia din aceste
efecte nu se poate controla mai ales când e vorba de amestecuri de solvenţi.

 O placă de silicagel uscată absoarbe 10 % apã din greutatea sa (când


este situată în atmosfera ambiantă).

 Singura soluţie constă în a reproduce exact toate operaţiunile efectuate


în timpul unei cromatografieri.

545
METODE DE DEVELOPARE ÎN
CROMATOGRAFIA PLANARA

 Unele metode de developare în cromatografia pe strat subţire sunt


identice cu cele descrise la cromatografia pe hârtie.

 Developarea liniară
 ascendenta
 descendenta

 Cea mai mare parte a CP este realizată într-un sistem în care placa este
dispusă vertical într-o cuvă adaptată dimensiunilor plăcilor.

 Pentru evitarea influenţei nefaste a vaporilor solvenţilor, se utilizeazã aşa


numitele cuve „sendwich”: O placă de suport inert (sticlă etc.) este aşezată
paralel la o distanţă de câţiva mm faţă de placa cu solutul de analizat; ca
urmare a căldurii de adsorbţie se evită transformarea solvenţilor volatili în
picături.

546
 Un alt procedeu pentru o developare liniară constă în dispunerea plăcii
orizontal. Solventul ajunge din 2 părţi opuse ale plăcii printr-o fantă
capilară. Procesul de developare se opreşte când cele 2 fronturi se întâlnesc.
Avantajul acestui sistem este că, permite ocuparea totală a stratului de
adsorbant şi dublarea numărului de eşantioane pe care le putem analiza.

Developarea circulară

 În acest sistem faza staţionară este dispusă orizontal, faza mobilă ajunge
până la centrul plăcii şi se distribuie uniform prin capilaritate, ceea ce
produce un spot circular care creşte dacă se continuă alimentarea
solventului.

Developarea anticirculară

 În acest procedeu, lichidul vector migreazǎ de la periferie spre centrul


plăcii. Practic, un canal foarte strâmt înconjurǎ placa, este umplut de faza
mobilǎ şi transferul pe strat este realizat prin capilaritate.
 În acest sistem, suprafaţa ce trebuie sa fie inundată de faza mobilă se
diminuează pe măsură ce acesta înaintează.

547
Sisteme cu flux forţat

 Sistemul caută să împrospăteze capilaritatea şi în acest fel sã domine


faza mobilă. Scopul imediat este câştigarea de timp şi de a ajunge la un
sistem de cvasicoloană.

Utilizarea forţei centrifuge

 Migrarea solventului este în funcţie de viteza de alimentare a fazei


staţionare.
 Viteza maximă permisã este definită de cantitatea de lichid ce poate
alimenta stratul fără a inunda suprafaţa.

548
Faze polare negrefate
 În mod tradiţional, CSS era pusă în lucru cu ajutorul unei
game limitate de faze staţionare (gel de silice, alumină,
celuloză, poliamidă, fixate pe plăci de sticlă sau foi de
aluminiu sau de plastic).

549
Faze polare grefate

 Curent, sunt utilizate 3 tipuri de faze: amino, cian şi diol.


 Migrarea solvenţilor este rapidă şi plăcile nu sunt sensibile la umiditate
(cum sunt suporturile anorganice polare).
 Faza amino posedă proprietăţi de schimbători de ioni.
 În cursul utilizării fazelor hidroorganice cu faze cian, este recomandată
utilizarea unei sări dizolvante în faza mobilă pentru ameliorarea transferului
de masă.

550
Faze slab polare sau nepolare grefate

 Datorită progresului fazelor de silice grefate folosite pentru HPLC, a


apãrut o gamă de plăci cu silice, având grefate structuri chimice de tip C18,
C12, C8, C2, difenil, agenţi de complexare chiralici, destinate separării
formelor enantiomere de aminoacizi etc.
 Gama fazelor grefate este totdeauna relativ limitată, în comparaţie cu cele
disponibile pentru HPLC, dar este într-un progres continuu. Introducerea
acestor faze de silice grefate a condus la un nou interes pentru CP cu fază
inversă (Reverses Phase Chromatography –RPC).

551
FAZE STAŢIONARE

Silicea/gel de silice/silicagel
(acid ortosilicic polimerizat)

552
Modificări chimice ale silicei
 Se introduc radicali alifatici C2-C18, grupǎri diolice, CN etc.

553
Alte modificǎri:

Esteri

Legǎturi Si-C
Legǎturi Si-N

554
Siloxani

Monomeri organici (a), polimeri (b)

555
Alumina (oxid de aluminiu, Al2O3)
Proprietăţile adsorbtive au fost atribuite grupelor hidroxil
superficiale.
 Toate substanţele organice (excepţie fac hidrocarburile alifatice)
sunt adsorbite de alumină:
 compuşii neionici care au grupe donoare de protoni sunt adsorbiţi
prin legături de hidrogen
 hidrocarburile aromatice sunt adsorbite pe atomii de aluminiu prin
legăturile .
Alumina acidă şi bazică funcţionează ca schimbători de ioni.

In vederea obţinerii unor rezultate reproductibile a fost necesară o standardizare


a gradului de activare. Brockmann şi Schoder au definit 5 grade de activare în
funcţie de conţinutul de apă adsorbită. S-au ales 5 coloranţi standard (azobenzen,
p-metoxidiazobenzen, galben Sudan, roşu Sudan şi p-aminoazobenzen) şi în funcţie
de ei s-au definit gradele de activare: I, II, III, IV, V corespunzătoare la 0, 3, 6, 10 şi
15% conţinut în apă.
556
Kieselgur

 reprezintă pământul de infuzorii ce se găseşte în natură sub formă de


zăcăminte provenind din scoici microscopice de diatomee.
 este constituit din dioxid de siliciu cristalizat (kieselsaϋre)
 structura poroasă îi oferă posibilităţi adsorbante
 este folosit în separările cromatografice de repartiţie când este impregnat
cu substanţe hidrofile sau lipofile
 este un adsorbant inactiv deoarece are o suprafaţă specifică foarte mică
(aproximativ 1 m2/g) şi pH neutru.
 Kieselgurul folosit în cromatografia pe strat subţire este de o calitate
specială, de o puritate avansată şi cu mărimea particulelor de 10 m.
 Tipuri de kieselgur folosit în cromatografia pe strat subţire: Kieselgur G-
Merck, Celite 545-John Moville (SUA), Kieselgur G-B.D.H.

557
Hidroxidul de magneziu

 se aseamănă în proprietăţi cu oxidul de aluminiu, faţă de care prezintă


unele avantaje şi dezavantaje:

 Avantaje:
 capacitate de adsorbţie mai mare
 mai puţin sensibil la activare
 straturile au o bună rezistenţă mecanică chiar fără liant.

 Dezavantaje:
 reacţionează cu iodul împiedicând astfel identificarea unor substanţe
 este mai uşor deshidratat de către solvenţii anhidri
 este solubil în alcool etilic.

 Preparate de hidroxid de magneziu mai des utilizate: Sea Sorb-43-


Fischer; Magnesia-West Vaco; hidroxid de magneziu Fischer.

558
Silicatul de magneziu

 principalele preparate din silicat de magneziu: silicat de magneziu -


Woelm; adsorbosil-M-1-A.S.L.(A.D.M.-1), adsorbosil M-2-A.S.L.
(A.D.M.-2), silicat de magneziu-M-1-Bio-Rad. Lab. (SUA).
 se utilizează într-o formă alcalină cu pH = 9,8 şi o formă neutră cu
pH = 7,5.

559
Pulberea de celuloză
 Celuloza se caracterizează prin:
 un numar foarte redus de grupe OH libere, acestea fiind antrenate în
legături de hidrogen care unesc diferite agregate structurale între ele.
 un numar mare de canale şi goluri în care se pot adsorbi uşor solvenţi
polari capabili de a diminua legăturile de hidrogen sau de a forma la rândul
lor legături de hidrogen cu grupele OH. Are loc o lărgire a canalelor ceea ce
duce la creşterea capacităţii de pătrundere a solvenţilor şi a formării fazelor
staţionare lichide în acest suport.
 calităţi excelente de suport pentru cromatografia de repartiţie lichid -
lichid datorita capacitatii mari de a reţine apa şi solvenţii polari.
 Preparate din celuloză: pulbere de celuloză-D.O.-Camag, pulbere de
celuloză-D.F.O.-Camag, pulbere de celuloză 65-Schleicher-Schull, Celex
D(DEAE)-Bio Rad. Lab. (SUA), Celuloza ECTEOLA 67-Schleicher-Schull,
Selectacel CM 68-Schleicher-Schull, Celuloză-CM-Serva, Celuloza M.N.-
300,300 G, Celuloza M.N.-300-PEI (schimbător anionic), Celuloza M.N-300-
Poly-P (schimbător anionic).

560
Poliamida (-CO-NH-)
 Este un polimer sintetic obţinut prin polimerizarea lactamelor sau
policondensarea acizilor graşi cu amine alifatice.
 Grupele C=O şi NH ale poliamidei din interiorul polimerului formează
legături de hidrogen prin intermediul cărora lanţurile sunt legate între ele.
Aceleaşi grupe de la suprafaţa polimerului rămân libere şi joacă un rol
important în adsorbţia produşilor care trebuie separaţi.
 O poliamidă folosită în cromatografia planară este Poliamida 6 (6(poli-[-
aminocaprolactama]) cu o granulaţie de 5-20 m.
 Poliamida este folosită cu succes în separarea compuşilor cu structură
fenolică. Aceştia sunt relativ puternic adsorbiţi datorită legăturilor de
hidrogen care se pot forma între fenoli, ca donori de protoni şi grupa C=O
amidică ca grupă acceptoare de protoni. Substanţele care au grupe
acceptoare de protoni pot fi mai slab adsorbite prin formarea de legături de
hidrogen cu grupa NH amidică ce funcţionează ca grupă donoare de protoni.
 Preparate de poliamidă: poliamidă M.N.; poliamidă Merck.

561
Sefadexul

 Este dextran de origine bacteriană caracterizat prin punţile


transversale de 1, 3 - gliceril - ester.
 Se folosesc diferite tipuri de sefadex (mai ales site moleculare), notate
G10, G25, G75, G100, G200, care diferă între ele prin gradul de polimerizare
şi prin numărul punţilor transversale. Numărul mare de legături
transversale duce la obţinerea unor ochiuri cu diametrul mic, ceea ce
conferă proprietăţi selective în separarea substanţelor cu moleculă mare
sau mică. Sefadexul se foloseşte în cromatografia pe strat subţire pentru
încercări preliminare şi orientative pentru transpunerea separărilor pe
coloană.
 Tipuri de sefadex utilizate mai des: Sephadex G-25; Sephadex G-50;
Sephadex G-75; Sephadex G-100; Sephadex G-200.
Se cunosc sefadexuri modificate chimic ce funcţionează pe principiul
schimbătorilor de ioni cu mărimea particulelor cuprinsă între 20-300 .

562
Alţi adsorbanţi utilizaţi în cromatografia pe strat subţire:

 oxidul de magneziu, oxidul de bismut,


 silicaţii de calciu şi aluminiu,
 carbonaţii de calciu, magneziu, zinc,
 fosfaţii de calciu şi magneziu,
 sulfatul de calciu,
 cărbunele activ,
 polietena,
 polivinilpirolidona,
 amidonul,
 schimbătorii de ioni.

563
FAZE MOBILE
 Solvenţii utilizaţi pentru optimizare în cromatografia planară, clasaţi
funcţie de forţa eluotropă faţă de n-hexan.

564
DETECŢIA
ANALIZA CALITATIVA
Detectarea vizuală

 Placa este iluminată printr-o sursă convenabilă:


 lumina albă permite reperarea substanţelor colorate,
 lumina ultravioletă permite vizualizarea substanţelor fluorescente atunci când ele
sunt iluminate la aceste lungimi de undă.

 Pentru facilitarea detectării, se amestecă un indicator fluorescent cu stratul de


adsorbant. Acesta poate fi o sare anorganică ce dă plăcii o culoare galbenă (acetat de
uranil) sau galben verzuie (silicat de zinc). Cea mai utilizată este o sulfură mixtă de
zinc şi cadmiu fluorescent la 254 nm de unde şi denumirea de F254. Alte săruri sunt
în general fluorescente la 366 nm (sarea de sodiu a 5,8,10-trisulfonat-hidroxi-3-piren).

 Alte substanţe utilizate: rodamina B, dicloro-2,7-fluoresceina şi derivaţi de stilben.

 În cazul fazelor grefate, este utilizată o sare de tungsten şi sodiu. Compuşii apar sub
formă de pete pe fondul luminos prin diminuarea fluorescenţei.

565
Sursele luminoase

 Pentru a acoperi gama de 200-800 nm sunt utilizate două seturi de


lămpi:
 lampi care emit un spectru continuu:
o lămpi de halogen sau tungsten (VIS - 400-800 nm)
o lămpi cu deuteriu (UV - 200-400 nm)
o lămpile cu xenon - posedă un maximum de energie către 550 nm
 care emit un spectru discontinuu
o lămpi cu vapori de Hg cu presiune scăzută - 254 nm
o lămpi cu vapori de Hg cu presiune înaltă - 313-436 nm

 Selectarea lungimilor de undă dorite se realizează cel mai frecvent cu


ajutorul filtrelor. În fluorescenţă se foloseşte un monocromator. Un filtru
plasat între detector şi placă permite eliminarea lungimilor de unda
nedorite.

566
Formarea de derivaţi pre sau post cromatografic

 Când solutul nu posedă nici o grupare cromoforă susceptibilă de a


permite o detecţie spectrofotometrică, solutul se transforma printr-o
reacţie cu un reactiv specific. (Această etapă poate fi realizată înaintea
cromatografierii).

 Alte tehnici: impregnarea cu un solvent care nu trebuie să altereze


cromatograma. Ex: impregnarea plăcilor cu ulei de parafină permite
exaltarea semnalelor luminoase (până la de 100 ori).

 Derivaţii fluorescenţi sunt obţinuţi prin expunerea la vapori de


amoniac.

 Utilizarea unei soluţii de eluant în care este dizolvat reactivul. Ex:


ninhidrina pentru detectarea acizilor aminaţi, fluorescamina pentru
amine biogenice şi proteine.

 Reactivul poate fi prezent în faza staţionară. Nu trebuie confundat cu


indicatorul de fluorescenţă al plăcilor. Ex: utilizarea unei sǎri de
zirconiu permite detectarea unor estrogeni.

567
Metoda cea mai raspandita este formarea derivaţilor
după cromatografiere. Tehnica cea mai comună
constă în a pulveriza un reactiv pe placa uscată şi
lipsită de solvent.
Expunerea placii la vapori de iod.
Pulverizarea de solutii caustice, urmata de incalzirea
la 110 0C sau de reactivi diversi, formand compusi
colorati
ANALIZA CANTITATIVA
 În scop cantitativ evaluarea conţinutului în substanţa activă de pe
placa cromatografică se face:
• cu ajutorul detectorilor densitometrici (fotodensitometre): scannere
care măsoară intensitatea luminii absorbite sau reflectate de spoturile
cromatografice. Intensitatea acestora se înregistrează sub formă de
curbă care se manifestă sub formă de picuri a căror arie se foloseşte
pentru calcularea concentraţiei.

 dupa razuirea spotului de pe cromatoplaca, dizolvarea componentei


intr-un solvent convenabil si masurarea absorbantei spetrofotometric.

568
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT SUBTIRE

 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase


 Separarea si identificarea acidului acetilsalicilic, paracetamolului si
cafeinei din comprimate
-Faza stationara: Silica gel 60 F254
-Faza mobila: acetat de etil
-Detectie: 254 nm
-Rf aspirina = 0.76, Rf paracetamol = 0.53, Rf cafeina = 0.25, Rf proba 4 =
0.23; 0.52; 0.90

1 – acid acetilsalicilic
2 – paracetamol
3 – cafeina
4 – amestec

569
 Separarea si identificarea ibuprofenului si a cafeinei din comprimate
-Faza stationara: Silica gel 60 F254
-Faza mobila: acetat de etil:etanol:acid acetic (25:1:1)
-Detectie: 254 nm
-Rf ibuprofen = 0.91, Rf cafeina = 0.23, Rfproba = 0.24; 0.93

1 – ibuprofen
2 – cafeina
3 - amestec

570
 Separarea, identificarea si determinarea cantitativa a principiilor
active din forme farmaceutice. Ex.:
 Fenotizine (FS: kieselgur, FM: eter de petrol+dietilamina amestec saturat
in fenoxietanol, Detectie: UV la 365 nm)
 Dexametazona (FS: silice, FM: metanol/clorura de metilen, Detectie: UV
la 254 nm)
 Propranolol (FS: silice, FM: amoniac:metanol, Detectie: revelare cu
aldehida anisica)
 Piroxicam (FS: silice, FM: acid acetic/toluen, Detectie: UV la 254 nm)

571
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUPRAPRESURIZAT
OVERPRESSURED LAYER CHROMATOGRAPHY( OPLC)

 Metoda constă în introducerea unei plăci cromatografice într-o incintă


închisă sub presiune. Placa este acoperită de o membrană flexibilă. Odată
închis capacul aparatului, se aplicǎ o presiune asupra membranei de 1,2
Mpa-2,5 MPa.

 Faza mobilă este forţată să traverseze stratul subţire. Omogenitatea şi


liniaritatea scurgerii solventului sunt asigurate pe toată lărgimea plăcii.
Frontul solventului avansează cu o viteză dependentǎ de debitul pompei
aleasǎ de operator.

 Presiunea necesară pentru a păstra constant debitul unei faze mobile


creşte cu distanţa migrării.

572
 Folosirea presiunilor crescute permite utilizarea plăcilor cu
microparticule. Debitul poate fi reglat astfel încât să se obţină o viteză
liniară uniformă a lichidului vector. Astfel, sistemul va permite mai
multe tehnici de lucru.
 Eşantioanele pot fi depuse pe o placă uscată, placa poziţionată în
aparat, developarea şi cromatografierea se opresc atunci când se
consideră necesar.

 O nouă versiune de OPLC, utilizează 2, 3, sau mai multe plăci


cromatografice în cursul unei singure developări. Această tehnică
denumită Overpressured Multi Layer Cromatography (OPMLC) este
foarte atractivă datorită numărului foarte important de eşantioane (50–
100) ce pot fi separate într-o singură migrare, reproductibilitatea fiind
identică pentru ansamblul plăcilor cromatografice.

573
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT
SUPRAPRESURIZAT

 determinarea trans-veratrolului
 determinarea aflatoxinelor B1, B2, G1, G2 prin mǎsurǎri
densitometrice
 analiza carotenoidelor din piperul roşu
 analiza glicozidelor digitalice.

574
Planul cursului

Cromatografia de lichide de inalta performanta

Gaz-cromatografia

Cromatografia de schimb ionic

575
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ PERFORMANŢĂ
HIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)

 Cromatografia de lichide de înaltă performanţă/înaltă presiune


(High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau
de înaltă viteză (High Speed Liquid Chromatography – HSLC) este
o tehnică:

1. Parametrii de retentie

 Timp retenţie: tR
 Volum retenţie: VR
 Timp mort: tM

576
2. Coeficient de distribuţie/partitie: Kd; D

3. Factorul de capacitate/retentie: k’

4. Factorul de separare/selectivitate: α

5. Rezoluţia: R
R ≥ 1 - compuşii sunt complet separaţi
R < 1 compuşii nu sunt separaţi.

6. Talerele (platourile) în sistemele cromatografice

577
APARATURA
Schema unui cromatograf HPLC

-1-2 sau mai multe rezervoare cu solventi


- o pompă de înaltă presiune
- sistem de degazare
- injector pentru introducerea probei
- (precoloane) coloane cromatografice
- detectoare
- sistem de prelucrare a datelor
578
1. REZERVOARE DE SOLVENT
• Rezervoarele sunt confectionate din sticla, cu volume de cel
putin 500 ml. Conductele de alimentare cu solvent spre pompe
sunt prevazute cu frite pentru prevenirea intrarii impuritatilor
mecanice in sistemul cromatografic.
• In general se folosesc amestecuri de solvenţi miscibili, de
puritate ridicata, filtrate si degazate.
• Aceştia trebuie să îndeplinească anumite condiţii pentru a nu
influenţa eluarea şi detectarea:
 Putere de elutie a solventului
 Vascozitate
 Lungime de unda limita
 Punct de fierbere
 Polaritate
 Aciditate
 Bazicitate

579
Solventi utilizati ca faze mobile in HPLC

Solvent G.M. P.f. (OC) I.R. UV (nm) Vâscoz. (cP)  (Debye)

Acetonitril 41 82 1.341 195 358 3.37

Dioxan 88 101 1.421 215 1.26 0.45

Etanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68

Metanol 32 65 1.326 205 1.58 1.66

Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68

Tetrahidrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70

Apa 18 100 1.333 185 1.00 1.84

580
2. POMPE

• Sunt elemente ale sistemului HPLC care determina vehicularea


sub presiune a fazei mobile in acesta.
• Viteza de curgere prin coloană este de 1-3 ml/min cu o presiune
variind între 3.4-27.6 MPa.
• Pompele trebuie să aibă o fluctuaţie minimă între aceste limite
pentru a atinge o mare stabilitate a răspunsurilor date de
detector.

 In functie de numarul de solventi pe care ii poate manipula o


singura pompa exista:
 pompe simple
 pompe binare, ternare sau cuaternare

581
Pompele pot functiona la:
 debit constant
 presiune constanta
Pompele cu presiune constanta:
 simple, ieftine
 se folosesc cand permeabilitatea coloanei, temperatura si vascozitatea
eluentului sunt mentinute constante
 debitul poate fi variat cu usurinta
 lucreaza la presiuni mici, nu pot fi aplicate la elutie in gradient
 prin aplicarea directa a presiunii gazului inert are loc si dizolvarea lui in
eluent
 pe masura ce presiunea in coloana scade, bulele de gaz dizolvate se vor
degaja sub forma de bule in interiorul coloanei sau in detector

Pompele cu debit constant:


 scumpe
 debit constant
 indicate in cazul elutiei in gradient

582
• Astazi, se folosesc doua tipuri de pompe:
 Pompe cu piston

 Pompe tip seringa

583
3. SISTEME DE INJECTARE
Preluarea probei in circuitul cromatografic se face prin
intermediul unei valve rotatorii.
Introducerea probei in aceasta valva se face:
 manual
 automat

a. incarcarea buclei de injectare


b. preluarea probei din bucla de injectare catre coloana
584
4. COLOANE si FAZE STATIONARE

Coloane:

 sunt confecţionate din oţel inoxidabil (crom-nichel-


molibden), sticla, alte materiale (polietilena, tantal)
 sunt umplute cu faze staţionare
 la capete, materialul de umplere este limitat de două
opritoare (foiţe metalice sau din teflon, polietilena), cu rolul
de a evita modificarea coloanei
 se caracterizează prin lungime şi diametru interior
 dimensiuni coloane standard:
o lungime: 5 - 25 cm
o diametrul interior: < 6.3 mm
o diametrul exterior: 5-50 mm
o faza staţionară este formată din materiale rigide, particule
de dimensiuni mici (5-10 mm), împachetate într-o coloană
cilindrică.
 sistemele utilizate sunt cele care definesc mecanismul de
separare.

585
Adsorbanţi utilizaţi în cromatografia Faze staţionare chimic legate
de adsorbţie:

Tip Denumirea
Denumirea
Ester silicat, pelicular Durapak
I. Materiale poroase de performanţă înaltă
Carbowax 400
 Silicagel
Porasil
Porasil A
ODS/Corasil
Porasil B
Porasil C Silicon monostrat, pelicular Bondapak
Porasil D C18/Corasil
Porasil F Fenil/Corasil
Lichrosorb Vydac
 Alumina Fază inverSǎ
Woelm alumina Faze legate polare
Bio - Rad AG Permaphase
Silicon polimolecular, pelicular
II. Materiale poroase de performanţă medie ODS
 Silicagel ETH
Davison Code 12
Ester silicat, poros Durapak
 Alumina OPN/Porasil-C
Alcoa F - 20 Carbowax 400/Porasil-C
III. Sfere strat poros de înaltă performanţă n-Octan/Porasil-C
 Silicagel Bondapak
Silicon monostrat, poros
Corasil II C18/Porasil-B
Pellosil - HC Micropak
Perisorb - A CN
 Alumina
NH2
Pellumina HC
 Cărbune activ Polimer Zipax
Pellicarb HCP
Poliamida
586
5. DETECTORII

 Detectorul – recunoaste substanta ce ajunge la nivelul lui. Schimbarea compozitiei fazei


mobile este transformata in semnal electric, care este transmis la sistemul de prelucrare
a datelor.
 Este caracterizat de:
 selectivitate
 specificitate
 sensibilitatea la concentratie
 sensibilitatea la variatia fluxului de masa
 zgomot
 limita de detectie
 liniaritate
 constanta de timp
 stabilitate
 timp de raspuns optim

 Detectorii pot fi clasificati in:


A. Detectori care masoara o proprietate specifica analitului:
 Detector spectrofotometric in UV-Vis
 Detector de fluorescenta
 Detectori electrochimici
 Spectrometru de masa
B. Detectori care masoara o proprietate specifica fizica a efluentului:
 Detector refractometric
 Detector de conductivitate
 Detector dielcometric

587
 Detecţia cu ajutorul indicelui de refracţie poate fi consideratǎ
drept detecţie universalǎ deoarece virtual toate componentele
cauzează o schimbare a indicelui de refractie când sunt
dizolvate într-un solvent.

588
Detectori UV-VIS
• Sunt cei mai utilizati in analiza medicamentelor.
• Functioneaza pe baza legii Lambert-Beer (Absorbtia este proportionala cu
concentratia).
• Au o sensibilitate bună.
• Nu sunt afectaţi de fluctuaţii în viteza de curgere şi temperatură şi sunt
nedistructibili, permiţând soluţiei să fie colectată.
• Pot fi:
 Detectori monocromatici: cei mai simpli detectori, sunt fixaţi pe o lungime de
undă tip, de obicei conţin lămpi de joasă presiune care au o emisie intensă la  =
254 nm. Unele instrumente permit schimbarea detecţiei la o nouă lungime de
undă (280 nm).
 Detectori policromatici: sunt detectorii de lungime de undă variabila, conţin o
lampă cu deuteriu cu o radiaţie continuă de la 180-400 nm, iar lămpile cu
tungsten ( = 400-700 nm) sunt folosite pentru domeniul vizibil.
• Solventul trebuie să fie transparent pe domeniul spectral in care se lucreaza.

589
Detectori de fluorescenţǎ

• În cazul acestor detectori soluţia este excitată cu radiaţii UV


şi măsoară radiaţiile ce sunt emise la lungimi de undă mai
mari (VIS).
• Sunt câteva medicamente care au o fluorescenţă naturală
puternică (alcaloizii din ergot) şi pentru asemenea
medicamente detectarea prin fluorescenţă poate duce la o
sensibilitate mai bună decât detecţia în UV.
• Multe substanţe medicamentoase pot fi convertite în derivaţi
fluorescenţi.
• Selectivitatea detectorilor de fluorescenţă este extrem de
preţioasă pentru identificarea medicamentelor.
• Solvenţii aleşi pentru detectarea de fluorescenţă nu trebuie
să fie fluorescenţi în condiţiile unor astfel de determinări (să
nu adsoarbă şi să nu emită în domeniul de undă ales.
• De asemenea, pH-ul poate fi important deoarece unele
medicamente arată fluorescenţă în forma ionică.
590
 Analiza produşilor modificaţi chimic (prin derivatizare)

• este adesea necesară pentru a atinge o cromatografie


satisfăcătoare.
• se aplică pentru componentele de toate polarităţile şi greutăţile
moleculare şi este un avantaj al HPLC faţă de gaz-cromatografie.
• Este utilizată pentru a creşte sensibilitatea detecţiei cand
detectările utilizate nu sunt satisfăcătoare pentru componentele
nederivate.
• Absorbţia în UV şi fluorescenţa pot fi obţinute cu ajutorul unor
reactivi.
 UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazină şi 3,5-
dinitrobenzen (DNBC).
 derivaţii fluorescenţi pot fi formaţi cu agenţi de tipul: cloruri de
dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) şi cu unele
amine fluorescente.

591
6. SISTEMUL DE CONTROL, ACHIZITIE SI PRELUCRARE A
DATELOR

Urmaresc:
- Controlul complet al analizei cromatografice
- Achizitia si prelucrarea avasata a cromatogramelor
- Validarea metodelor de analiza
- Verificarea si validarea functionalitatii componentelor
cromatografului
- Diagnosticarea problemelor tehnice care pot sa apara.

592
TEHNICI DE ELUARE
• Pentru realizarea unei separări eficiente se pot aplica pe langă eluţia
izocratica si eluţia cu gradient (de solvent, de temperatură, de debit etc.).

Eluţia normalã (izocratică):


 utilizează un eluent a cărui compoziţie şi viteză sunt constante.

Eluţia cu gradient de compozitie a solventului:


 constă în modificarea continuă a compoziţiei eluantului în timpul
separării, astfel încât puterea de eluţie sã fie mărită gradat.
 migrarea diferenţiată a componentelor dintr-un amestec depinde de
retenţia preferenţială în faza staţionară → rezoluţia este proporţională cu
fracţiunea din solut prezentă în faza staţionară.

Se poate realiza la:


 presiune joasa
 presiune mare

 Eluţia în gradient prezintă şi dezavantaje,:


 creşterea complexităţii utilajelor şi a tehnicii de lucru.

593
 Dispozitivele pentru eluţia în gradient se împart în două categorii:
 dispozitive care modifică compoziţia solventului introdus în pompă (pompă cu
piston aspiratoare-respingătoare). Cele mai multe dispozitive utilizează un rezervor
conţinând un solvent iniţial (slab) şi un mixer. Când eluţia progresează, se
eliberează un al doilea solvent (tare) în primul rezervor unde este amestecat,
obţinându-se un solvent de tărie crescută în mod gradat.

pompe tip seringă care pompează doi curenţi de solvenţi cu viteze diferite.

Eluţie cu debit programat


- presupune modificarea vitezei de curgere a fazei mobile în timpul procesului de
separare.

Eluţie la temperaturã programată


- are drept efect micşorarea tuturor valorilor k’ ale componenţilor, ridicarea
constantă a temperaturii determinând reducerea vâscozităţii eluantului şi creşterea
solubilităţii componenţilor din probă.

Utilizarea coloanelor cuplate reprezintă o tehnică recentă bazată pe ajustarea


valorilor k’ ale componenţilor prin modificarea fazei staţionare. Această metodă
foloseşte la început o coloană scurtă conţinând o fază staţionară pentru care
componenţii prezintă valori k’ reduse. Această coloană prefracţionează componenţii
în funcţie de valorile k’. Diferitele fracţiuni sunt apoi dirijate spre alte coloane
umplute cu faze staţionare, care oferă valori k’ încadrate în intervalul optim.

594
APLICAŢIILE HPLC
ANALIZA CALITATIVA
 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase

Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa


cromatografiere prin:
 Metode cromatografice:
- Dupa marimile de retentie
- Metoda adaosului standard
- Metoda retentiei relative
 Metode spectrale
Alcaloizi din ergot
elimoclavina lisergol

CH2OH H CH2OH

H N CH
N CH 3
H
3 H

HN HN

595
• Atenolol Condiţii:
 Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm
 Faza mobilǎ: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM
H2N
NH4OAc
O  Viteza de curgere: 1 ml/min;
O N  Detecţie: 254 nm
OH H  Timp de curgere = 16 min
 K’ = 4.41
 =1.13

Bupivacaina
Condiţii:
 Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d.
CH3
H H  Faza mobilã:hexan-n-propanol-trietilamina
N (80:20:0.1)
N
 Viteza de curgere : 1 ml/min
O
CH3 CH3
 Detecţie : 254 nm
 Timp de curgere: 7-8 min
 K’ = 1.89
  = 1.25

596
• Efedrina
Condiţii:
CH3  Coloana: Chiral AGP
H C NH CH3  100 x 4.0 mm
H C OH  Precoloanã: Chiral AGP, 10 x 3.0 mm
 Faza mobilã: ac. octanoic 0.001 M în
tampon fosfat pH 7.0
 Detecţie: 225 nm

Ketoconazol Condiţii:
•Coloana: (S,S)Whelk-O 1
•10/100(FEC) 25 x 4.6 mm
N •Faza mobilã: Diclormetan-hexan-IPA +
N 0.011 M acetat de amoniu (46:46:8)
O
•Viteza de curgere: 1.5 m>/min
O
N N O
O •Detecţie: 254 nm
H3C
H
Cl Cl •Timp de reţinere: 16 min
•K’ = 6.60
• = 1.19

597
• Pindolol
H
N

O N
OH H

Condiţii: Condiţii:
Coloana: (3R,4S)-Pirkle 1-J Coloana: -Burke2
25 cm x 4.6 mm 25 cm x 4.6 mm
Faza mobilã: diclormetan-etanol Faza mobilã: diclormetan-
(80:20) + 0.04 M acetat de etanol (85:15) + acetat de
amoniu; amoniu 20 mM;
Viteza de curgere: 1.0 ml/min; Viteza de curgere: 1 mL/min
Detecţie: 254 nm Detecţie: 254 nm
Timp de curgere: 11.0 min Timp de curgere: 11,8 mn;
K’ = 1.56 K’ = 4.35
= 2.06  = 150

598
 IDENTIFICAREA PE GRUPE FUNCŢIONALE

Alene

O
O
C
H CH3

Condiţii:
•Coloana: S) Whelk-O 1
•Faza mobilã: hexan-2-propanol-ac.acetic (95;5:1)
•Viteza de curgere: 2 mL/min
•Detecţie: 254 nm
•Timp de curgere:10 min
•K’ = 1.34
• = 5.68
599
Alcooli
OH OH

Condiţii: Condiţii:
 Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm  Coloana: Whelk-O 1
 Faza mobilã: 2% IPA/hexan  Faza mobilã: 1% IPA/hexan
 Viteza de curgere: 1 ml/min  Viteza de curgere: 1 ml/min
 Detecţie: 220 nm  Detecţie: 254 nm
 Timp de curgere: 10 min.  Timp de curgere: 15 min.
 K’ = 1.76  K’ = 2.52
  = 1.13   = 1.08
600
Amide, imide, carbamaţi

CH3 O
Condiţii:
 Coloana: Whelk-O 1  Detecţie: 254 nm
N CH3  Faza mobilã: 20%  Timp de curgere: 4
H IPA/hexan min
 Viteza de curgere: 2  K’ = 3.72
ml/min   = 3.17

Aminoacizi
Condiţii:
 Coloana: Davankov CSP, 25 cm x 4.6
mm
 Faza mobilã: 0.1 mM CuAc2, pH 5-
OH MeOH (70:30)
OH N
H2N  Viteza de curgere: 1.5 ml/min
H
O O  Detecţie: 254 nm
 Timp de curgere: 12 min
valina prolina  K’ = 2.52
  = 1.08

601
Acizi carboxilici Dioli, hidroxicetone
Condiţii: Condiţii:
•Coloana: (3S,4R)-Whelj-O 1, 25 cm x 4.6 •Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm
mm •Faza mobilã: hexan-IPA-ac.acetic (98:2:0.5)
•Faza mobilã: 5% 2-propanol-hexan cu 0.1% •Viteza de curgere: 1 ml/min
ac trifluoracetic IPA/hexan •Detecţie: 254 nm
•Viteza de curgere: 2 ml/min •Timp de curgere:
•Detecţie: 254 nm •K’ = 7.54
•Timp de curgere: 5 min. • = 1.08
•K’ = 0.84
•= 1.36
•(R)(+) se reţine pe (3S,4R)-Whelk-O 1

O OH
O OH
OH
CH3
Cl

602
Esteri Lactone, anhidride

O
O
O O
OC2H5
O
CH3

Condiţii:
Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm Condiţii:
Faza mobilã: 1hexan-IPA-ac.acetic Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm
(95:5;0.5) Faza mobilã: hexan-IPA-ac.acetic (93:7:0.1), 1%
Viteza de curgere: 1 ml/min IPA/hexan
Detecţie: 280 nm Viteza de curgere: 1 ml/min
Timp de curgere: Detecţie: 254 nm
K’ = 2.85 Timp de curgere: 30 min
 = 1.70 K’ = 8.10
 = 1.21

603
 Detectarea imunologică

 Tehnica implică colectarea de solvent în fracţiuni mici (1 ml) şi prelevări


de medicament în fracţiuni.

 Necesitã mult timp, dar au reversibilitate şi selectivitate mai mare decat


detectările convenţionale.

 În multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct în coloană.

 HPLC cu detectare imunologică este utilizată pentru analiza


metaboliţilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracţie
(glucuronidele). Astfel de compuşi polari nu pot fi observaţi în concentraţii
mici prin detectări convenţionale, ele fiind mascate de componentele
endogene.

 Poate fi utilizată pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor,


lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.

604
ANALIZA CANTITATIVA

• Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria /inaltimea


picului si concentratia componentului respectiv.

• Metodele de determinare constau in masurarea:


 Aria picului:
- metode manuale
- metode electronice

 Concentratia probei:
- calibrare cu standard extern
- metoda standardului intern
- metoda adausului standard

605
 Determinarea cantitativã a substanţelor farmaceutice

• Determinarea cantitativã a vitaminei B-12 din ser


Condiţii:
• HPLC/ICP-MS
• ICP = Inductively coupled plasma emission spectrometer
• HPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100,
Waitress’s LC
• Coloana:COSMOSIL, 5C18-AR
• Faza mobilã: apã-ac.acetic-isopropanol (90:1:9)
• Viteza de curgere: 10 ml/min

• Determinarea amitriptilinei şi perfenazinei


Condiţii:
• HPLC/Agilent 1000
• Coloana: cianopropil
• Faza mobilã: acetonitril-metanol-fosfat monopotasic
• Viteza de curgere 2.0 mL/min
• Detecţie: UV 215 nm
606
• Determinarea omapatrilatului din plasmã (inhibitor de
endopeptidazã)
Condiţii
S H
•HPLC: Waters 510 HPLC pump, Waters
O automated gradient
HS
N •Coloana analiticã BDS Hypercil C8 (3 m, 50
H O mm×2 mm ID) precedatã de Hypercil C8.
COOH
•Faza mobilã: 62.5 % apã şi 37.5 % acetonitril,
cu acetat de amoniu 1 mmol/L la pH 5.5.
•Viteza de curgere: 0.2 mL/min,
•Volumul injectat 25 L.

 Alte determinǎri cantitative


• Determinarea activităţii antioxidante a capsaicinei;
• Determinarea cantitativă a aminoacizilor din lichidul
cefalorahidian;
• Determinarea cantitativǎ a cumarinei din extracte alcoolice.

607
GAZ – CROMATOGRAFIA
GAS-CHROMATOGRAPHY (GC)
Definitie
Atunci când se foloseşte un gaz ca fază mobilă într-un sistem
cromatografic, tehnica este denumită gaz-cromatografie (GC, cromatografie
de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Această tehnică se efectuează
întotdeauna într-o coloană cromatografică deoarece faza mobilă trebuie să
curgă în mod continuu.

Clasificare
 cromatografia gaz-lichid (GLC):
- faza staţionară este un lichid
- fenomenul de separare are loc prin repartiţie cromatografică
 cromatografia gaz-solid (GSC)
- faza staţionară este o suprafaţă solidă
- fenomenul de separare are loc prin adsorbţie.

608
Principii generale
• Separările în gaz-cromatografie au la bază aceleaşi principii pe care se fundamentează
celelalte tipuri de analiză cromatografică.
• Compuşii de analizat migrează prin sistemul cromatografic cu viteze determinate de
afinităţile lor pentru faza staţionară.
• Puterea de separare depinde de vitezele diferitelor zone de migrare.

FAZA MOBILA
(gaz)

PROBA PROBA
separata
introd

FAZA STATIONARA
609
În gaz-cromatografie:

 faza mobilă (gazul purtător) - este un gaz inert (hidrogen, azot, heliu,
argon, aer purificat), astfel încât coeficientul de distribuţie este determinat
de afinitatea probei pentru faza staţionară (în cromatografia de lichide atât
faza staţionară cât şi cea mobilă controlează coeficientul de distribuţie).

 compuşii de analizat migrează prin coloană numai când sunt în stare


gazoasă şi din acest motiv se ţine cont de relaţia dintre presiunea de vapori a
acestora şi concentraţia lor în faza staţionară. Unei soluţii ideale i se aplică
legea lui Raoult:
p = x . po
unde:
po = presiunea de vapori a probei pure
x = fracţiunea molară a probei în soluţie
p = presiunea de vapori a probei deasupra soluţiei.

610
La concentraţii foarte scăzute coeficientul de activitate este constant:

In locul expresiei x/p se defineşte coeficientul de partaj K prin relaţia:

K = CS/CM

Din ecuaţie rezultă că afinitatea substanţelor de cercetat (probe) pentru


faza staţionară în gaz-cromatografie depinde de:
 presiunea de vapori
 coeficientul de activitate al acestora, ceea ce arată că este posibil să se
separe substanţele care au presiuni de vapori identice, dacă coeficienţii lor
de activitate sunt diferiţi în faza staţionară a gaz-cromatografiei.

611
 Timpul de retenţie, tR, este timpul (minute) necesar eluării maximului
zonei, măsurat din momentul injectării probei.

 Viteza de curgere, Fa este debitul fazei mobile în ml/min măsurat la


orificiul de golire al coloanei, la temperatura camerei. Viteza de curgere
(debitul) în interiorul coloanei, Fc va fi diferită de viteza de curgere din afara
coloanei, Fa dacă temperatura coloanei Tc diferă de temperatura ambiantă
Ta. Relaţia dintre aceste mǎrimi este:

- în care temperaturile sunt exprimate pe scara temperaturilor absolute.

612
 Volumul de retenţie, VR:

V R = Fc • t R

 Volumul fazei mobile al coloanei VM:

V M = Fc • t M

Optimizarea condiţiilor cromatografice se bazează pe aceste relaţii şi


considerarea acestor termeni depinde de:
- presiunea din interiorul coloanei;
- temperatura coloanei.

613
Factor de selectivitate, 

Pentru două specii A şi B:


α = k’B/k'A

Rezoluţia

unde:
- dA, dB = distanţa de retenţie (timp sau volum) pentru cei
doi compuşi;
- w = lărgimea picurilor.
614
sau:

unde:
- Z = diferenţa dintre două picuri cromatografice
- WA = lărgimea picului compusului A
- WB = lărgimea picului compusului B.

Cea mai bună separare se obţine atunci când rezoluţia Rs = 1,5


615
APARATURA
Filters/Traps Data system
H

RESET

Regulators Syringe/Sampler

Inlets

Detectors
Gas Carrier
Hydrogen
Air

Column

616
 Faza mobilă (gazul purtător) se găseşte într-o butelie sub
presiune (150 atm). Reducerea presiunii la 2-3 atm se face cu
ajutorul unui reductor, iar debitul necesar (cm3/min) se
regleazǎ cu ajutorul unui ventil. Presiunea se măsoară cu
ajutorul unui manometru.

 Probele de analizat şi substanţele etalon se injectează în camera


de evaporare. Gazul pătrunde în camera termostat (în care se găseşte
camera de evaporare menţinută la o temperatură cuprinsă între 100-
300o C) şi antreneaza proba in coloana cromatografică.

 Moleculele de proba vor interactiona cu faza stationara, in functie


de taria fortelor intre componente si adsorbanti sau in functie de
repartitia intre faza mobila si lichidul stationara.

 La iesirea din coloana componentele sunt decelate de un detector,


produc un semnal care se inregistreaza si care este transformat in
cromatograma (curbă cu maxime (picuri) caracteristice numărului şi
cantităţii diferitelor componente în probă).

617
Introducerea probelor si camera de injectare

 Lichide si solide (se dizolvă într-un solvent adecvat) –microseringi


de capacităţi cuprinse între 1-10 l
 Gaze – seringi cu volume de 0.1 – 0.5 ml
 Probele gazoase – se utilizeaza injectoare cu bucle (ca in LC)

 Injectorul – vaporizeaza (incalzit la 250 – 280 0C) si antreneaza


amestecul proba-gaz vector in capul coloanei.

 Gazele – pot fi introduse direct in coloana.

 Clasificare:

Injector cu vaporizare directa

618
Injector cu/fara divizare
(split/splitless)

Injector cu temperatura programata

619
Coloane

Coloane împachetate Coloane capilare

620
 coloanele împachetate (cu umplutura):
- confectionate din tuburi de otel sau sticla
- conţin un suport solid, poros, inert, sub forma de granule sferice cu un
diametru ~ 0.2 mm
- silicati, alumina, polimeri organici cu porozitate mare
- lungime: 1,5 -10 m
- diametru interior: 2-4 mm
- se utilizează pe scară largă, dar sunt încete şi ineficiente.

 coloanele capilare:
- confectionate din silice topita (puritate avansata), aluminiu, nichel, otel
- lungime: 12 – 100 m
- diametru interior: ~ 10 mm
- au eficienţă bună, sunt rapide, dar doar pentru probe mici.
- Sunt de două tipuri:
• - coloane capilare cu pereţii acoperiţi (wall-coated open tubular - WCOT)
- au pereţii acoperiţi cu o fază staţionară lichidă de < 1m;
- coloane capilare cu suport acoperit (support-coated open tubular-(SCOT)
- pereţii interiori ai capilarelor sunt acoperiţi cu un strat subţire de
suport material (pamânt de diatomee) pe care este adsorbită faza
staţionară.

• - Coloanele SCOT sunt mai puţin eficiente decât cel WCOT. Ambele
tipuri de coloane capilare sunt mai eficiente decât coloanele
împachetate. 621
Pentru a rezolva anumite incompatibilităţi ale fazei staţionare ce duce la
utilizarea de coloane paralele în loc de o singură coloană, au apărut sisteme cu 2
coloane.
622
Materiale suport/faze suport

 un rol important şi particular - când faza lichidă este în cantitate mică


 sunt formate din particule solide, inerte fizic si chimic, stabile termic,
acoperite cu un film foarte subtire si uniform de faza stationara
 înainte de întrebuinţare – sufera câteva operaţii de purificare

 Caracteristici:
• să aibă o suprafaţă activă mare
• să fie inert din punct de vedere chimic şi lipsit de efecte adsorbtive
• să fie robust din punct de vedere fizic
• când este învelit cu faza staţionară trebuie să umple uşor şi uniform
coloana.

 Clasificare:
• Suporturi poroase:
- particule cu pori mari si uniformi
- diferite tipuri de pământ de diatomee special purificate, a căror mărimi ale
ochiurilor reţelei sunt de 60 - 80, 80 - 100 şi 100 - 120 mesh (ex:
Chromosorb P, W, G)

• Suporturi neporoase:
- sfere de sticla sau de teflon
- Ex: Chromosorb T, Fluoropak 80) 623
Faze staţionare lichide

 lichide, formate din compusi cu vascozitate mare, care pot acoperi


intreaga suprafata a fazelor suport, aderand puternic la suprafata
lor.

 numărul total al substanţelor folosite ca faze staţionare în gaz -


cromatografie depăşeşte ordinul sutelor. Fiecare are caracterul său
specific, fiind utilizate în analizele curente sau în analiza anumitor
categorii de compuşi.

 Se clasifica după polaritatea sau selectivitatea lor faţă de unele


caracteristici ale probei ce trebuie analizata:
o greutate moleculară
o forma
o punctul de fierbere
o prezenţa unor grupe funcţionale caracteristice în moleculă etc.

 Fazele staţionare sunt de obicei legate:


- covalent – leagă faza staţionară de suport
- prin reacţii de polimerizare.
624
A. Faze pe bază de polisiloxani (uleiuri sau gume siliconate,
siliconi):

 polidimetilsiloxani: R1, R2 - CH3


 metilfenilsiloxani: raport diferit R2/R1
R1= CH3, R2 = C6H5 sau R1= C6H5, R2 = CH3

 metilcianopropilfenil:
R1, R2 = CH3
R1, R2 = cianopropilfenil
sau:
 polifenildimetilsiloxan
 politrifluoropropildimetilsiloxan
 polidicianolildimetilsiloxan
625
 Polimeri de fluorosilicon.
- cel mai utilizat este tipul QF-1, temperatura maximă operaţională
- 250o C.
- OV-17 stabil până la 350o C
- au caracter destul de polar (mai mic decât SE 30) dar nu sunt aşa
de selectivi precum Carbowax-urile
- se utilizează pentru analizele compuşilor cu greutate moleculară
mare

 Polimeri de silicon - nitrili:


- ex: XF-1105, XF-1150, XE-60
- sunt utilizaţi pentru separarea steroizilor
- sunt compuşi cu polaritate moderată care au o reţinere selectivă
faţă de grupările hidroxil.
- polimerul QF-1 se utilizează împreună cu SE-30 pentru separarea
compuşilor cu greutate moleculară mare.
- temperatura maximă operaţională 250o C.

626
B. FAZE PE BAZĂ DE POLIETILENGLICOL:

 Polietilenglicol 400 (PEG 400; Macrogoli 400):


- temperatura maximă operaţională 100o C
- foarte utilizat pentru determinarea alcoolilor, eterilor, aldehidelor,
alţi compuşi cu p.f. scăzute.

 Carbowax 1500 şi 1540 (polietilenglicoli 1500 şi 1540; Macrogoli


1500 şi 1640)

 Carbowax 20 M (polietilenglicoli 20):


- temperatura maximă operaţională 250o C
- utilizat pentru analiza compuşilor cu p.f. ridicate (alcaloizi,
substanţe cu caracter bazic)
- adesea se modifică impregnându-se cu hidroxid de potasiu ce se
adaugă în concentraţie de 5 %
627
FAZE STATIONARE SOLIDE
Sunt constituite din materiale adsorbante:
 silice sau alumina dezactivata cu saruri minerale
 polimeri porosi
 grafit
Polimeri poroşi – perle:
-au fost descrişi pentru prima dată în 1966 de Hollis şi sunt formaţi din
divinilbenzen şi polistiren
- Ex: Porapak (P, Q, R, S, T), Polipak (1, 2), Chromosorb 101, 102.
- Se folosesc pentru separarea gazelor, a acizilor organici, a glicolilor,
aminelor, solvenţilor volatili etc.
- Temperatura maximă operaţională este 250o C.
- Pot fi impregnaţi (înveliţi) cu numeroase faze staţionare, silanizarea fiind
frecvent utilizată pentru obţinerea de performanţe în separările dificile.

FAZE MOBILE
- hidrogenul - cea mai eficientǎ fazǎ, care furnizează cea mai bună separare.
- heliul - are o capacitate de curgere mare, este comparabil cu hidrogenul din
punct de vedere al eficienţei, are avantajul de a nu fi inflamabil şi poate
funcţiona cu un număr mare de detectori, astfel fiind cel mai utilizat gaz
purtător
- alte gaze: azot, argon

628
Detecţie

 Detectorii reprezintă unii dintre componenţii cei mai importanţi ai


unui gaz- cromatograf. Trebuie să fie:
- sensibili
- să răspundă prompt şi proporţional cu concentraţiile
- să răspundă independent de natura componenţilor
- să nu fie influenţaţi de debitul gazului purtător
- să reacţioneze la temperaturi mari (0-400o C)
- stabili
- sǎ aibǎ un răspuns linear.

 Clasificare:
- detectori dependenţi de concentraţie
- detectori dependenţi de debitul masic

 Clasificare:
- detectori universali
- detectori specifici

629
Flame-ionization Detector (FID)

- gaz purtător: H2 şi aer


- selectivitate: majoritatea compuşilor
organici
- rezistent, sensibil (10-13 g/s)
- semnalul depinde de atomii de
carbon din analit (de masă şi nu de
concentraţie)
- sensibilitate scăzută la grupe
carbonil, amine, alcool
- nu este sensibil la apă, dioxid de
carbon, dioxid de sulf, oxizi de azot
- distructiv
- interval dinamic larg (107)

630
Thermal conductivity Detector (TCD)

- gaz purtător: indicaţii


- selectivitate: universal
- conductivitatea termică a heliului şi azotului este mai mare decât a substanţelor organice
- rezistent
- sensibilitate scăzută (10-8 g/s)
- nedistructiv
- interval dinamic larg (105)
631
Electron capture Detector (ECD)

- gaz purtător: H2 şi aer


- selectivitate: halogeni, nitraţi, nitriţi, peroxizi, anhidride, compuşi organometalci
- simplu
- sensibil (10-15 g/s pentru grupări electronegative)
- nedistructiv
- nu este sensibil la amine, alcooli
- interval dinamic limitat (102)
632
APLICAŢIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI

1. Identificarea compuşilor medicamentoşi si cercetarea


impuritatilor

 se folosesc mărimile de retentie VR şi tR


 identitatea timpului de retentie al unui component cu acela al aceluiaşi
component pur oferă un indiciu că cei doi componenţi sunt identici
 timpii de retentie sunt proporţionali cu punctele de fierbere ale
componenţilor care ies din coloană în ordinea acestora
 folosind diferite faze staţionare selective componenţii se pot separa chiar
dacă au aceleaşi puncte de fierbere
 timpul de retenţie depinde de diferiţi factori (lungimea coloanei, diametru,
temperatura). Din această cauză, în scopuri calitative se utilizează aşa-
numiţii timpi de retenţie relativi, trr, definiţi prin relaţia:

unde:
tA = timpul de retenţie al componentei A;
tet = timpul de retenţie al substantei standard.
633
 Se practică adăugarea în amestecul de analizat a unei
componente pure. Dacă are loc creşterea pe cromatogramă a
maximului ce corespunde componentului adăugat, aceasta se
consideră drept dovadă a identităţii componentei - etalon.
 Operaţia se efectuează pentru aceeaşi probă de analizat pe mai
multe coloane cu diferiţi adsorbanţi.

- Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu


posibilitatea identificarii produsilor de degradare.

634
2. Determinarea cantitativă a compuşilor medicamentoşi

 Principala problemă a analizei cantitative în gaz-cromatografie este


măsurarea ariei picurilor.
 Aria picurilor este proporţională cu cantitatea de substanţă ce se găseşte
în zona eluată.
 Aria maximului picului poate fi calculată prin mai multe metode:
- măsurarea înălţimii maximului simetric, considerându-l de forma unui
triunghi, când aria este produsul dintre înălţimea si latimea picului
masurata la jumatatea inaltimii: metodă destul de precisă, dar exactitatea ei
depinde de măsura în care forma maximului rămâne neschimbată dacă
cantitatea de substanţă variază.

- planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile cu


ajutorul dispozitivelor de integrare şi a computerelor.

• Prin metodele enumerate se măsoară aria sau cantitatea de substanţă


proporţională cu aria de sub pic. Aceste cantităţi trebuie transformate în
valori sau procente ale componenţilor analizaţi.

- Gaz-cromatografele moderne efectuează automat determinările cantitative


prin ataşarea la aparat a unui calculator adecvat.
- Studii farmacocinetice – studii de biodisponibilitate (determinarea
concentratiei plasmatice).
635
Conditiile de analiza ale unor importante clase de medicamente:
- Faza staţionară: metilsilicon SE 30 polimer 3 %, depus pe Gaz- Chrom. P 80-100 mesh.
- Coloana se condiţionează înainte de operare la 290o C, 48 ore în curent de azot.
- Temperatura injectorului 280oC, iar a termostatului coloanei 220-275o C , cu o creştere de 3o C/min.
- Gaz purtător: azot
- Debitul gazului purtător: 63 ml/min.

Clasa Grupa Compusul Solventul


cafeina cloroform
papaverina cloroform
alcaloizi atropina cloroform
codeina alcool metilic
teofilina alcool metilic
morfina alcool metilic
romergan cloroform
Compuşi bazici fenotiazine clorpromazina alcool metilic
trifluoperazina alcool metilic
tioridazina alcool metilic
diazepam alcool metilic
azepine nitrazepam alcool metilic
clordiazepoxid alcool metilic
imipramina alcool metilic
barbiturice luminal sodic alcool metilic
ciclobarbital sodic alcool metilic
amobarbital sodic alcool metilic
pentotal sodic alcool metilic
steroizi acetoxiprogesterona alcool metilic
Compuşi neutri testosteron (fenil-propionat) alcool metilic
636
estradiol alcool metilic
Gaz-cromatografierea compuşilor nevolatili
Există foarte mulţi compuşi care nu sunt volatili şi nu pot fi
analizaţi gaz-cromatografic ca atare. S-a apelat la transformarea
acestor compuşi în derivaţi mai volatili.

 Transformările constau în reacţii care au drept scop


transformarea grupelor puternic polare ca: -OH, -COOH, -NH2 în
grupe mai puţin polare: COOR, NHCOR.
Ex: Aminoacizii - sunt transformaţi în N-trifluoroacetilmetil esteri
volatili:

Alţi reactivi:
- alcool izobutilic –clorură de acetil 5:1 (120o C, 20 min)
- anhidrida heptafluorbutirică (anhidrida perfluorobutiricǎ), (120o C,
10 min)

637
Alte exemple:

- Determinarea flurbiprofenului din comprimate


– dupa derivatizare cu metilen-N-
(trimetilsilil)trifluoracetamida

- Determinarea simultana a melatoninei si piridoxinei in comprimate – dupa


derivatizare cu metilen-N-(trimetilsilil)trifluoracetamida + trimetilclorosilan

638
 Transformările constau în reacţii care au drept scop introducerea
grupelor trimetilsiliciu (CH3)3Si- în locul hidrogenului activ al grupelor
funcţionale -OH, -COOH, -NH2, -SH etc., ceea ce conferă compuşilor un
grad de volatilitate mai mare.
 Sunt folosiţi mai mulţi agenţi de silare. Majoritatea corespund formulei
generale: (CH3)3-Si-X, în care X este o grupă hidrofilă Formarea eterilor are
loc după ecuaţia:

Ex: derivatizarea flavonelor:

639
CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)
Definitie:

 Este o tehnica cromatografica in care faza staţionară este constituita din


compuşi în a căror structură se află grupări acide sau bazice ionizabile
capabile să reţină cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.

 Aceşti compuşi poartă numele de răşini schimbătoare de ioni.

 Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din
probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.

Clasificare:

 cromatografie de schimb cationic:


 schimbătorul reţine ionii încărcaţi pozitiv, înlocuind ionul H+ al acestuia
 Ex: (-SO3H, -PO3H2)

cromatografie de schimb anionic:


 schimbătorul reţine ionii încărcaţi negativ, inlocuind ionul X- al acestuia
 Ex: (-RN+H3X-)
640
Principii generale

Schimbul de ioni, echilibrul ionic, retinerea ionilor


 Schimbul de ioni reprezintă o reacţie chimică heterogenă între o
fază solidă (răşină schimbătoare de ioni, R-X), o fază lichidă
(eluentul) şi proba ce conţin un cation sau anion. Eluentul poate
conţine un ion schimbabil de aceiasi sarcină cu cel de pe răşină.
Schimbul ionic se reprezintă astfel:
R-X-C+ + M+B- ↔ R-X-M+ + C+ + B-
R-X+A- + M+B- ↔ R-X+B- + M+ + A-

 Pentru 2 cationi monovalenţi (A+ şi B+) reacţia este:


R-A+ + B+  R-B+ + A+

Constanta de schimb ionic:


unde:
[A+]R, [B+]R = concentraţiile la echilibru ale ionilor A+ şi B+ în
schimbător (sau în faza solidă)

[A+]m, [B+]m = concentraţiile la echilibru ale ionilor A+ şi B+ în faza


mobilă (sau eluant). 641
 Dacǎ > 1  B+ din soluţie are o afinitate mai mare decât A+
pentru schimbul ionic, cu deplasarea reacţiei spre dreapta.
 Dacǎ < 1  A+ are afinitate mai mare decât B+, procesul
fiind deplasat spre stânga.
 Dacǎ = 1  afinitatea lui A+ şi B+ pentru schimbul ionic e
asemănătoare.

 Ionii polivalenti prezintă un plus de afinitate faţă de cei


monovalenţi.

 Pentru caracterizarea schimbului se defineşte coeficientul de


distribuţie, D.
 De ex. pentru ionul |B+| :

642
 Pentru caracterizarea cineticii schimbului ionic se utilizează
izoterma de distribuţie, respectiv izoterma de schimb ionic.
Această izotermă defineşte, la echilibru, relaţia dintre
concentraţiile aceloraşi ioni din răşină şi din soluţie.

 Pentru ionul B+:


- Dacă izoterma e convexă (1) 
[B]m < [B]R; ionul B+ are un plus de afinitate
pentru schimbul ionic faţă de ionul fixat iniţial
(A+);

- Dacă izoterma este liniară (2): 


[B]m = [B]R, afinitatea ionilor este aceiaşi;

- Dacă izoterma e concavă (3) 


[B]m > [B]R, ionul B+ are o afinitate mai mică
decât ionul A+ fixat iniţial.
Izoterme de schimb ionic
1=convexa, 2= linearǎ, 3=concavǎ

643
 Mǎrimile ce caracterizează schimbul ionic sunt:
o volumul de retentie VR
o timpul de retentie tR.

 Volumul de retentie VR al unei analize cromatografice

unde:
V0 = volumul gol (mort) al sistemului
D = coeficientul de distribuţie
VS = volumul de schimb ionic.
 Rezoluţia, Rs, procesului cromatografic: este proporţională cu produsul dintre
selectivitate, eficienţă şi capacitatea sistemului.

644
 Factor de capacitate, k, factor de retenţie: este o măsură a
retenţiei unui component.

2
 VR1 
 Eficienţa coloanei H = L/N, unde N  5.54 
 wh 

 Selectivitate, α, reprezintă capacitatea sistemului de a separa două picuri:

k 2 VR 2  V 0 VR 2
  
k 1 VR1  V 0 VR1

645
 În schimbul ionic se foloseşte o matrice insolubilă pe care este
fixată o grupare covalentă încărcată negativ sau pozitiv în funcţie
de natura schimbătorului.

 (-E-), o grupare fixată pe matrice şi legată ionic de un cation


alcătuiesc grupul ionogenic al schimbătorului.
 Cationul poate fi schimbat reversibil de alţi cationi fără
alterarea matricei.

Schema generală a schimbului ionic


E- = grupare funcţională (SO3-)
C+ = contraion schimbabil (Na+).
646
 Grupele funcţionale de la suprafaţa fazei staţionare realizează
specii încărcate pozitiv/negativ.

 La echilibru, grupele funcţionale încărcate pozitiv/negativ sunt


inlocuite de ionii din proba de analizat.

 În a doua şi a treia etapă, componenţii probei străbat coloana şi


sunt distribuiţi între faza staţionară şi cea mobilă.

 In timpul inlocuirii acestia se adsorb si desorb.

 Echilibrul de distribuţie este determinat prin competiţia dintre


componenţii probei şi cei ai schimbatorului.

 Ionul retinut pe coloana se desprinde de pe aceasta cu o faza


mobila ce contine un ion de aceiasi sarcina mai puternic retinut de
schimbator.

647
APARATURA

648
FAZE MOBILE

 sunt soluţii apoase cu capacitate ionizantã mare - soluţii diluate de acizi sau baze
şi doar când este necesar, se mai adaugă o concentraţie scăzută de metanol sau
etanol pentru a se facilita dizolvarea moleculelor puţin ionizate în apă

 În acest mediu, analitii şi grupele funcţionale ale fazei staţionare sunt ionizate.
pH-ul soluţiilor poate influenţa sau nu ionizarea schimbătorilor acizi sau bazici.
Mecanismul de eluţie se bazează pe deplasarea echilibrului ionic.

•Exemple de faze mobile:


pentru anioni: acizi organici, minerali, carboxilici aromatici şi sărurile lor, acizi
carboxilici alifatici, acizi sulfonici aromatici şi alifatici, hidroxid de potasiu, complex
poliol-borat, EDTA, săruri anorganice
pentru cationi: acizi anorganici, baze organice

649
POMPĂ

INJECTOR 650
COLOANĂ

• Coloana este umplută cu fază staţionară polimeră,


reticulată, pe care sunt grefate grupări acide sau
bazice ionizabile, capabile să fixeze cationi sau anioni
în anumite condiţii experimentale.

651
Schimbǎtori de ioni
 Schimbătorii de ioni sunt caracterizaţi prin:
- natura grupelor funcţionale ionice de la suprafaţa matricei
- natura matricei utilizată ca suport

Clasificare:
a) în funcţie de natura ionului fixat distingem:
o Schimbǎtori de cationi - au grupe funcţionale anionice
o Schimbǎtori de anioni - au grupe funcţionale cationice
o Schimbǎtori mixti sau amfoteri ce conţin 2 tipuri de grupe.

Schimbator Tipul Grupele


funcţionale
Schimbǎtori de acid tare -HSO3-
cationi acid mediu -PO32-, -AsO32-
acid slab -COO-
Schimbǎtori de baza tare -N+R3
anioni bazǎ intermediara -N+HR2
bazǎ slabǎ -N+H2R

652
Puterea de eluţie a anionilor:
F-, OH- > OAc- > H2PO4- > HCO3- > Cl- > NO2- > HSO3- > CN- > Br- > NO3- > I-

Puterea de eluţie a cationilor:


Li+ > H+ > Na+ > NH4+ > K+ > Rb+ > Cs+ > Ag+
Be+2 > Mn+2 Mg+2 Zn+2 > Co+2 > M+2 (metale tranziţionale) > Ca+2 > Sr+2
Al3+ > M3+ (metale tranziţionale) > Ce3+

653
 Retentia anionilor/cationilor:
 influenta sarcinii – ionii sunt cu atat mai bine retinuti cu cat
sarcina lor este mai mare
 influenta naturii ionului – afinitatea ionului pentru rasina creste
in ordinea crescatoare a numarului atomic din grupa

654
b) tipurile de matrice utilizate ca faze staţionare în cromatografia ionică pot fi:
- produsi naturali
- polimeri organici de sinteză

Produsi naturali (organici sau anorganici)


 1. Zeoliti sau aluminosilicati alcalini sau alcalino-pamantosi
 pot acţiona atât ca acizi cât şi ca baze
 indică posibilitatea utilizării lor ca schimbători de cationi şi anioni.
 utilizare limitata datorita sensibilitatii crescute la schimbarile de pH
 Ex: Na2.Al2O3.4SiO2.2H2O

 2. Sephadex grefat:
 zaharoza prin oxidare → dextran;
 dextran prin polimerizare cu glicerina → Sephadex
 grefare Sephadex

655
 3. Matricele pe bază de silice cuprind 2 grupuri distincte:
• gruparea funcţională este legată direct de particulele de silice
• silicea este acoperită de un strat polimeric (polistiren, silicon,
fluorocarbon) şi acest strat cuprinde gruparea funcţională.
• sunt produse prin legarea chimică a:
- aminelor cuaternare → schimbători puternici de anioni
- alchilsulfonaţilor → schimbători puternici de cationi.

Avantaje:
 eficienţă cromatografică bună
 stabilitate şi rezistenţă la presiuni mari.

Dezavantaje:
 pH limitat; 2 > pH < 7
 afinitatea grupelor silanol libere de la suprafaţă
şi a silicei expuse la ionii metalici cu densitate mare
(metale tranziţionale), ce sunt ireversibil adsorbiţi la
suprafaţă, interferând analizele.

656
Polimeri organici de sinteza (rasini)
 sfere mici, cu diametrul de 0.5 mm
 se clasifica functie de structura chimica si de marimea particulelor
(mesh)

 1. Copolimeri reticulati polistiren/divinilbenzen


 sunt produse prin derivatizarea chimică a polimerilor organici de
sinteză: se obţine polimerul cu proprietăţi fizice şi chimice potrivite,
după care se introduc grupele funcţionale.
 Avantaje - domeniu larg de pH (0-14)
- sunt expuse la limitări de presiune, deoarece sunt
materiale relativ « soft » şi astfel, atât lungimea coloanei cât şi viteza de
curgere sunt limitate
- răşinile macroporoase sunt relativ mai rigide şi stabile şi
pot fi utilizate la coloane lungi şi viteze de curgere mari.
 Dezavantaje – capacitate mica de schimb ionic

 Ex: - copolimeri ai stirenului cu divinilbenzen,


- copolimeri ai divinilbenzenului cu acid acrilic sau metacrilic.

657
658
 2. Rasini filmogene

 Ex: Latex, depus sub forma unei pelicule continue pe un suport


impermeabil format din microsfere de silice, sticla sau polistiren.
 gruparile functionale sunt fixate pe particulele de latex
 configuratia filmogena - concentrarea pe o suprafata minima a
schimbatorului de ioni → scaderea fenomenului de difuzie → se
accelereaza schimbarea → cresterea eficacitatii cromatografice
 Stabile pentru un domeniu larg de pH

659
Caracteristicile schimbătorilor de ioni

1. Capacitatea de adsorbţie
 nu sunt solubili in apa, dar in contact cu apa se umfla, marindu-si volumul,
prin fixarea unor cantitati importante de apa, cu degajare de caldura.
 capacitatea de umflare depinde de:
- numarul si natura gruparilor functionale
- gradul de reticulare
 cu cât capacitatea ionică este mai mare, legăturile polimerice sunt mai puţine,
cu atât sensibilitatea polimerului la adsorbţie este mai mare.

2. Capacitatea ionică
 este determinată de numărul grupelor funcţionale/unitate masă a fazei
staţionare
 un rol important în determinarea concentraţiei ionilor concurenţi utilizaţi de
faza mobilă pentru eluţie
 capacitatea mare a fazelor staţionare necesită utilizarea unei faze mobile mai
concentrate, ceea ce este o problemă în cromatografia ionică, datorită
detectorilor conductometrici ce nu pot funcţiona bine la concentraţii mari în
săruri.
 capacitatea ionică tipică este 10-100 mechiv./g

660
3. Selectivitatea
Afinităţile dintre schimbatori, solut si contraion depind de:
 sarcina ionului solutului
 mărimea ionului solvatat
 gradul de polimerizare al schimbătorului de ioni
 polarizarea ionului solutului
 capacitatea ionicǎ a schimbătorului fazei staţionare
 tipul grupării funcţionale a fazei staţionare.

4. Stabilitatea termica
 ȋn general, procesele de schimb ionic au loc la temperatura obişnuită,
dar uneori trebuie să se lucreze la o temperatură mai mare
 rasinile sulfonice – max 800 C
 rasinile cu grupari de amoniu cuaternar – max 500 C

661
DETECŢIA

DETECŢIE ELECTROCHIMICĂ

– are la bază un sistem de electrozi, când ȋn urma aplicării unui potential


are loc un proces de oxidare/reducere cu transfer de electroni şi se măsoară
curentul corespunzător.

Detectori conductometrici

 Măsoară conductivitatea fazei mobile, bogată în specii ionice.

 Avantaje:
•toţii ionii sunt conducători electrici, astfel că, detectorul ar trebui să aibă un
răspuns universal
•detectorii sunt relativ simpli din punct de vedere al funcţionării

 Este determinată de:


-puterea ionică
-tipul de specii din soluţie
-temperatură

662
Detectori potenţiometrici
•detecţia se bazează pe măsurarea potenţialului soluţiei ce traversează celula de
detecţie, potenţial ce este dependent de concentraţia ionică a soluţiei.

Detectori amperometrici
– măsoară curentul, la potenţial constant

Detectori coulometrici
- măsoară curentul, la potenţial constant, dar cu o conversie a analitului de 100 %
(reacţie completă).

663
DETECŢIE OPTICĂ

Detecţie prin spectroscopie UV-Vis: măsoara absorbanţa, care este direct


proporţională cu concentraţia de analit
Detecţie directă – se utilizează avantajul de a avea grupări cromofore diferite şi astfel
diferite sensibilităti pentru ioni. Exemplu: nitrit, nitrat, iodura, tiosulfat, cetonă, amino,
carboxyl etc
Detecţie indirectă – se utilizează un eluent cu o putere de absorbţie mare, astfel ȋncât
analitul să reducă semnalul ȋn detector (concentraţia eluentului este redusă ȋn regiunea
picului ȋn funcţie de concentraţia analitului). Exemplu: ftalat, benzoat, salicilat, sulfat,
clorură etc
Detectie după derivatizare – doar dacă nu există alte metode de detecţie. Exemplu:
metalele tranziţionale, bromat, cromat

Detecţie prin fluorescenţă: doar dacă analitul prezintă fluorescenţă sau dacă se
utilizează eluenţi pentru detecţia indirectă prin fluorescenţă. Exemplu: salicilat

664
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvoltă în zilele noastre cu aplicaţii în:


• analiza medicamentelor
• chimia anorganică
• chimia organică

Metoda se aplicǎ determinǎrilor de:

IONI ANORGANICI
 Ordinea de eluţie în cromatografia ionică este determinată de
densitatea sarcinii (sarcină/domeniu) ionului vizat.

665
1. Anioni
• Cercetarea anionilor anorganici se face înaintea tuturor, în apa de diferite
provenienţe, ce poate fi: apǎ potabilǎ, apǎ de ploaie, apǎ de diluţie, apǎ din
hemodializǎ şi din farmacii.
• Se pot separa următorii anioni anorganici: Cl-, HPO42-, SO42-, PO43- , SO32-, I-, Br-,
SCN-, CN-, NO2-

2. Cationi
• Se pot separa următorii cationi anorganici: Li, Na, Pb, Cs, Ca, Sr, Ba, Ra, metale
tranziţionale, pǎmânturi rare, NH4+

666
IONI ORGANICI
Pentru acizii şi bazele organice, ordinea de eluţie este determinată de pKa
sau pKb (puterea/tăria acidului sau bazei).
1. Anioni
Anionii organici, ce sunt dozaţi în cromatografia ionică, corespund cel mai
adesea formei ionizate a acizilor organici.

1 = tartrat, 2 = formiat, 3 = acetat, 4 = propionat, 5 = izobutirat, 6 = butirat,


7 = izovalerat, 8 = valerat
2. Cationi
Compuşii cu azot cuaternar pot fi cromatografiaţi în coloane de răşini
schimbătoare cationice.

667
• Exemplificăm modul de efectuare a schimbului anionic şi cationic pe
două coloane separate care pot fi cuplate şi alcătui un tip de
cromatografie prin schimb ionic cu dublă coloană.

Schimb cationic

Schimb anionic

668
Determinarea unor impurităţi ȋn produse farmaceutice
- Exemplu: N-metilpirolidina ȋn Cefepime (antibiotic)

Determinarea N-metil pirolidinei ca impuritate ȋn Cefepime,


fază mobilă: 6 mM HNO3 + 10 % acetonitril

669
Determinarea unor ioni din produse farmaceutice: Soluţie Ringer & hemodializă

- Anioni:
• fază mobilă: 1.3 mM Na2CO3 + 2.0 mM NaHCO3 0.8 mL/min
- Cationi:
• fază mobilă: 4.0 mM acid tartric + 0.75 mM acid dipicolinic, 1 mL/min

Determinarea ionilor lactat şi clorură


- Lactat 2235 mg/L Determinarea ionilor sodiu, potasiu, calciu
- Clorura 4314 mg/L
- Sodiu 130.8 mg/L
- Potasiu 5.3 mg/L
670
- Calciu 1.8 mg/L
Studii de dizolvare a unor comprimate
- Exemplu: Analiza mediului de dizolvare ȋn timpul testului de dizolvare a unor
comprimate de citrat de calciu ȋn fluid intestinal

Analiza mediului de dizolvare al comprimatelor de citrat de calciu,


fază mobilă: acid metansulfonic 20 mM

671
Planul cursului

CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE

CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

METODE ELECTROCHIMICE DE ANALIZĂ A MEDICAMENTELOR

● Potentiometria

672
CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE
SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)

 Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) derivă din metodele


convenţionale ale cromatografiei de lichide, în special din HPLC şi din
gaz-cromatografie (GC), fiind o metodă de separare puternică şi
universală, atât la scară analitică, cât şi la scară preparativă.
 Relaţia celor trei tipuri de cromatografie este redatã ma jos:

673
APARATURA

674
 CO2 lichid rece este pompat (12). Înainte de a intra în
coloană este încălzit, devine supercritic (23). Datorită
vâscozităţii scăzute, presiunea la ieşirea din coloană este
aproape identică cu cea din coloană (34). La ieşirea din
coloană, faza mobilă este decompresată, încălzită,
transformându-se în fază gazoasă (45). Produşii sunt
recuperaţi în cicloni (vase pentru separarea produsilor) CO2
gazos este apoi curăţat, răcit şi returnat în rezervor.
675
FAZE MOBILE
o dioxidul de carbon supercritic
o apa supercriticã
 Se poate lucra în gradient simplu (temperaturã) sau dublu (temperaturã-
presiune).
 Faza mobilã se introduce în stare lichidã (de exemplu CO2) la o temperaturã
joasã şi presiune inferioarã celei critice (PC). Se aplicã apoi o încãlzire la 40o C,
temperaturã superioarã temperaturii critice (TC). Se menţine aceastã temperaturã
pe parcursul procesului cromatografic.

676
POMPĂ

– tipul de pompă utilizată este determinat de tipul de coloană utilizată:

•ȋn cazul coloanelor cromatografice capilare - pentru a controla fluxul principal de fază
mobilă, se utilizează pompe de tip seringă care oferă o presiune constantă

•ȋn cazul coloanelor ȋmpachetate (faze chimic legate/grefate), pentru o amestecare mai
uşoară a fazei mobile sau introducerea de fluide modificatoare, se utilizează pompe de
tip piston.

INJECTOR

– tipul de injector utilizat este determinat de tipul de coloană utilizată:

•ȋn coloanele capilare - proba trebuie introdusă rapid şi atunci se uilizează supape
acţionate pneumatic, cu divizor

•pentru coloanele ȋmpachetate - se utilizează valve injectoare tipice.

677
COLOANE

 Coloane capilare (din gaz-cromatografie) - pentru separările unor probe


complexe - eficienţa mare

 Coloane cu faze legate (din cromatografia de lichide) – pentru separările ce au


loc cu viteză crescută ce necesită coloane cu eficienţă moderată şi pentru probe ce
au puţini componenţi

 lichid depus sub forma de film la suprafata unui strat inert

678
DETECŢIA
• Detectori – tipul de detector utilizat este determinat de tipul de
coloană utilizat:
• pentru coloanele capilare şi CO2 ca fluid supercritic se pot utiliza toţi
detectorii din gaz-cromatografie şi mulţi dintre cei din HPLC.
• pentru coloanele ȋmpachetate, numărul detectorilor disponibili este
limitat.

Se poate face:
o Spectrofotometric în UV sau IR
o Ionizare în flacãrã (FID - Flame Ionization Detector)
o Capturã de electroni (ECD - Electron Capture Detector)
o Spectrometrie de masã (MS - Mass Spectrometer)

679
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

Determinarea unor sulfonamide


Condiţii:
o Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC
o Coloana: 250 x 4,6 mm cu fazã staţionarã cianopropil (mãrimea particulelor 5
mm)
o Temperatura: 50o C
o Sistem injecţie: Model 7125, 10 ml
o Faza mobilã: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, creştere liniarã
la 15% timp de 10 minute)
o Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute
o Presiunea: 180 bari
o Detecţie: UV 230 nm

TIC

680
Analiza unor substanţe anticancerigene şi anti-HIV

Taxol, R = CH3

Separãri chiralice/achiralice/de izomeri


O
O O
N N O
H3C CH2 CH2 S H3C CH2 CH2 S
NH C CH3 NH C CH3
N N
H H

(+) Albendazol sulfoxide, (-)Albendazol sulfoxide

Lansoprazol Omeprazol Pantoprazol 681


Fitolul

Condiţii:
o Coloana: AMICON cu Silice 15 µm, 100 Å, (250 x 0,4 mm)
o Temperatura: 50o C
o Presiunea: 25 Mpa
o Solvent: CO2
o Viteza de curgere: 13,5 g/min
o Modificări ale dioxidului de carbon
cu MeOH, EtOH sau alcool
izopropilic

682
Separarea enantiomerilor Ibuprofenului și Flurbiprofenului

Fază mobilă: CO2 modificat cu un amestec de 5 % izopropanol și 5 % etanol (total v/ v


10 %)
Coloana: Whelk-O1

683
5. Alte aplicatii

o Separări de vitamine liposolubile


o Separări de acizi graşi
o Separarea benzodiazepinelor din ser
o Purificǎri de substanţe farmaceutice

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales


pentru separarea:
o substantelor termolabile
o compusilor nevolatili
o unor macromolecule

684
CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

Definiţie: Cromatografia de excludere sterică este o metodă prin care


moleculele se separă pe baza mărimii lor sau în termeni tehnici, pe baza
volumului hidrodinamic. În mod curent, se aplică moleculelor mari sau
complecşilor macromoleculari, cum ar fi proteinele şi polimerii industriali.

Clasificare:
• cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration Chromatography, GFC)
- faza mobilă este o soluţie apoasă.
• cromatografie de permeaţie prin gel (Gel Permeation Chromatography,
GPC) - faza mobilă este de natură organică.
• cromatografia de excludere de mărime (moleculară) (Size Exclusion
Chromatography, SEC) – separarea se bazează pe mărimea moleculară a
componentelor

685
PRINCIPII GENERALE

• Mecanismul separării
Separarea se bazeaza pe
faptul ca particulele de
marimi diferite vor elua sau
penetra prin faza stationara
cu viteze diferite.
Acest lucru se datoreaza
porilor fazei stationare care
permit intrarea in ei numai
a moleculelor de o marime
mai mica decat largimea lor,
iar moleculele mari vor
parasi primele coloana
cromatografica.

686
Parametrii separării

• Volumul total al coloanei


cromatografice
VT = VP + VM + VG
unde:
• VT = volumul total
• VP = volumul porilor
• VG = volumul ocupat de granulele de
gel
• VM = volumul fazei mobile

• Volum de eluţie
VE = VM + KdVP
unde:
• VE = volumul de eluţie
• Kd = coeficientul de difuzie
Kd = 0 → VE =VM Procesul cromatografic pentru
Kd = 1 → VE =VM + VP analiza
0<Kd<1 → VE <VM + VP unor proteine de marimi diferite

687
VE  VM
Kd 
VP

VE  VM
Kav 
VP  VG
unde:
• Kav = coeficient de distribuţie/difuzie accesibil
• dar VP + VG = VT - VM

VE  VM
Kav 
VT  VM
688
• Factorul de selectivitate, αS = diferenţa de comportare dintre
moleculele implicate în procesul de separare cromatografică.
Depinde de:
o mărimea moleculelor
o porozitatea gelului
o uniformitatea gelului

• Factorul de capacitate/retenţie, kB

Kd .VP
kB 
VM
• Numărul platourilor teoretice se modifică prin:
o lungimea coloanei cromatografice
o reciclarea fazei mobile
o debitul fazei mobile

689
• Rezolutia separarii depinde de:

 alegerea condiţiilor care să furnizeze spaţiu suficient între zonele de


probă relevante, adică realizarea unei selectivităţi suficiente.

 contracararea efectelor de extindere ale zonei, adică obţinerea unui


randament suficient în procesele cromatografice.

690
APARATURA

691
Faza mobilă:

- trebuie să fie un solvent bun pentru polimer, în scopul de a evita efectele de non-
excluziune
- trebuie să dizolve proba la o temperatură corespunzătoare şi într-o perioadă suficient
de lungă înainte de injectare, pentru a permite granulelor să se umfle în solvent sau de a
sparge agregatele
- ȋn unele cazuri, poate fi necesar adaosul de electroliţi pentru a obţine dezagregare.
- ca eluenţi în separările pe geluri de agaroză se pot utiliza soluţii ale sărurilor obişnuite,
dar nu şi borat care poate forma complecşi cu grupele hidroxil ale sefarozei.
- exemple: tetrahidrofuranul este un bun solvent pentru mulţi polimeri şi este adesea
utilizat ca fază mobilă; cloroformul şi toluenul sunt utilizaţi pentru dizolvarea polimerilor
atunci când aceştia nu sunt solubili în solvenţii comuni

692
Pompa

• Introduce, prin intermediul fazei mobile, proba de analizat în sistem.


• In funcţie de compoziţia probei se vor obţine soluţii de diferite vâscozităţi.
• Trebuie să furnizeze aceiaşi vitezǎ de curgere, independent de diferenţa
de vâscozitate.
• Modificările solventului trebuie făcute rapid şi uşor.
• Deoarece modificările solventului implică apariţia în sistem a unui nou
solvent, pompa trebuie să aibă un volum intern mic.
• Rezervorul cu solvent trebuie să fie destul de mare pentru a permite
utilizarea continuă a analitului şi trebuie să fie uşor înlocuibil.

Tipuri de pompe:
• Pompe tip seringă.
• Pompe cu piston.

693
Injectorul

• Introduce soluţia de analizat în faza mobilă.


• Trebuie să permită introducerea de:
o volume mici (pentru determinarea masei moleculare)
o volume mari (dacă este dorită fracţiunea colectată).
• Nu trebuie să influenţeze curgerea continuă a fazei mobile.
• Trebuie să poată fi injectate automat multiprobe, când
volumul probei este mare.

694
Coloana

• Separă eficient componenţii probei unii de alţii.

• Coloanele cu eficienţă mare, determină separări bune şi rapide ale


analiţilor.

• Fiecare coloană trebuie să furnizeze informaţii reproductibile pentru


o perioadă lungă de timp atât în scop analitic cât şi de colectare a
fracţiunilor.

• Eficientizarea este optimă când se folosesc solvenţi cu vâscozitate


micǎ şi când analitul este adus la temperaturi mari.

695
 Alegerea fazei staţionare trebuie făcută prin examinarea curbei de
calibrare pe diverse coloane.

 Coloana aleasă trebuie să dea un răspuns linear despre masa


moleculară a analitului.

 Curba de calibrare se determină utilizând macromolecule cu masă


cunoscută şi reprezentând pe abscisă timpul de retentie (sau volumul)
şi pe ordonată logaritmul masei moleculare. Utilizând timpul sau
volumul de retentie se poate determina masa moleculară. Masa şi
volumul moleculei sunt în relaţie directă.

 Ex: Calibrarea pentru polistiren se face


utilizând oligomerii săi cu diverse grade de
polimerizare (n = 1-14).
 Picul din extremitatea dreaptă reprezintă
stirenul monomeric - molecula cea mai mică,
care eluează cel mai târziu. Vo este volumul
mort, Vz reprezintă volumul de lichid dintre
particulele fazei staţionare. V0-Vz este volumul
porilor fazei staţionare.

696
FAZE STAŢIONARE
 Fazele staţionare includ:
 faze hidrofilice, atunci când se utilizează faze mobile apoase
(apă sau soluţii)
 faze lipofilice, când se utilizează faze mobile organice (THF,
cloroform).
 Se numesc geluri, pot fi utilizate sub presiune şi temperaturi de
ordinul sutelor de grade.

Proprietăţi:
• diametrul porilor → gradul de reticulare/numărul porilor
Porozitatea se caracterizează prin capacitatea de umflare =
cantitatea de solvent care este absorbită de 1 gr. de gel uscat.
• forma şi mărimea particulelor (granulelor) – trebuie să asigure
stabilirea rapidă a echilibrelor de difuzie

697
• consistenţa – depinde de natura gelurilor şi gradul de
reticulare
• spumoase
- cele mai poroase
- capacitatea cea mai mare de umflare
- rezistenţă mecanică redusă
- se deformează în coloană
• semirigide (xerogeluri)
- cele mai utilizate
• rigide (aerogeluri)
- rezistenţă mecanică mai mare

• să nu reacţioneze cu solvenţii – pH slab acid sau slab


bazic

• să aibă afinitate redusă – evitarea fenomenelor de


adsorbţie

698
Gel de dextran
Sephadex (Separation Pharmacia dextran)

Gel de agaroza

Sepharose (Separation-Pharmacia-Agarose)

699
Biogel (gel de poliacrilamidă)

Aerogel

700
 Alte faze staţionare:

o Fazele staţionare constituite din alcooli polivinilici


(Fractogel) sau copolimeri cu poliglicerometacrilat sau
vinilpoliacetat sunt utilizate pentru separările de polimeri
biologici ce se găsesc într-o fază apoasă (polizaharide,
proteine)

o Gelurile stiren-divinilbenzen (Styragel) sunt utilizate pentru


separarea compuşilor dizolvaţi în solvenţi organici.

oPentru separări hidrofilice sunt utilizate gelurile poroase


constituite din silicaţi ce conţin grupări gliceropropilice (Si-
(CH2)3-O-CH2-CH2(OH).CH2OH).

o 701
Detectori
• recunoaşte substanţa ajunsă la nivelul lor
• schimbarea în compoziţia fazei mobile este transformată în semnal
electric ce este transmis la sistemul de prelucrare a datelor.

Un detector ideal trebuie:


• sa fie nedistructivi pentru componentii separati, daca sunt
colectati pentru analiza completa
• să aibă aceiaşi sensibilitate pentru toate componentele
• să aibă un interval de sensibilitate mare (să detecteze cantităţi
foarte mici, dar şi mari de probă)
• să nu fie influenţat de variaţia temperaturii
• să aibă un răspuns rapid
• să fie uşor de manipulat

Tipuri de detectori folosiţi:


• detectori de indice de refracţie (polimeri - variaţia indicelui de
refracţie este dependentă de masa moleculară)
• detectori de absorbţie în UV-Vis şi IR. Detectorii UV sunt excelenţi
pentru polimerii stirenici (polistiren, stiren/isopren,
stiren/butadienă, epoxizi, fenoli, policarbonaţi, poliuretani şi
poliesteri aromatici).

702
Avantaje:
• absenţa oricăror interacţiuni cu faza staţionară
• eluţie rapidă
• are un timp bine definit de separare, datorită faptului că există un
volum de eluare finală pentru toţi analiţii nereţinuţi
• potenţialul de determinare al analitului este mare
• control şi măsură în timp real
• se aplică pentru separarea speciilor cu masă moleculară mare
• tehnica permite separarea normală a unei mase moleculare cuprinse
între 200 şi 107, fiind utilizată pentru analiza polimerilor sintetici şi
naturali
• sensibilitate bună
• poate oferi benzi înguste
• deoarece analiţii nu interacţionează chimic sau fizic cu coloana,
există o şansă mai mică să apară pierderea analitului.
• estimarea rapidă şi relativ uşoară a greutăţii moleculară şi a
distribuţie de masă pentru probele de polimer

703
Dezavantaje:

• nu este aplicabilă pentru probe cu dimensiuni


asemănătoare, cum sunt izomerii (este necesară o diferenţă
de cel puţin 10 % între masele moleculare)

• filtrarea trebuie să fie efectuată înainte de a utiliza


instrumentul pentru a preveni ca praful şi alte particule să
interfereze cu detectoarele. Deşi utilă pentru protejarea
instrumentului, pre-filtrarea probei are posibilitatea de a
elimina o substanţă cu masă moleculară mai mare, înainte
de a putea fi încărcată pe coloană.

704
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE
1. SEPARAREA MOLECULELOR

• Separarea moleculelor cu mărime diferită


 gelurile care exclud substanţele cu mase moleculare mai mari de 5.000
u.a.m. realizează o veritabilă desalefiere, deoarece ionii minerali care
difuzează liber pot fi eliminaţi în acest mod
 separarea iodului nefixat în cursul purificării unui trasor, după marcarea
unei proteine cu 131I.

• Analiza unui amestec de macromolecule


 purificarea fracţiunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau
reactivi de diagnostic
 analiza stabilităţii materialelor plastice (ambalaje)

• Separarea celulelor
 limfocitele izolate de monocite

• Fracţionarea moleculelor mici


 analiza peptidelor
 analiza coloranţilor

705
2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE
• etalonarea directă a coloanei cromatografice cu etaloane de masă
molară cunoscută
• etalonarea indirectă, plecând de la determinarea volumului
hidrodinamic
 determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunând că 90 % sunt sub formă de monomeri
şi 10 % sub formă de dimeri.

3. DETERMINAREA DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE


 se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul
masei moleculare.

4. DETERMINAREA PURITĂŢII UNOR SUBSTANŢE


FARMACEUTICE
Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca
impuritati) in insulina.

706
METODE ELECTROCHIMICE DE ANALIZĂ A
MEDICAMENTELOR

POTENŢIOMETRIA

Principii generale

 Potenţiometria este o metodă de analiză bazată pe măsurarea


variaţiilor de potenţial care apar la introducerea unor electrozi în
soluţia de analizat în funcţie de activitatea, respectiv concentraţia
ionilor din soluţie.

 Potenţialul depinde de reacţia electrochimică ce are loc la electrod


şi este determinată de:
 natura şi activitatea speciilor ionice prezente
 natura electrodului
 mărimea curentului ce trece prin soluţie.

707
 Electrodul studiat este asociat cu un electrod de referinţă având
potenţialul cunoscut şi se măsoară f.e.m. a pilei realizate =
potenţiometria directă.

 Determinarea potenţialului se bazează pe ecuaţia lui Nernst


măsurăndu-se forţa electromotoare (f.e.m.):

unde:
E0 = potenţialul normal al metalului
R = constanta gazelor (8316 Jouli)
T = temperatura absolută
n = sarcina ionului
F = constanta lui Faraday (96500 coulombi)
a = coeficient de activitate
Mn+ = ionul metalului cufundat în soluţie.

 Precizia este mai mare atunci când se urmăreşte variaţia f.e.m. în


funcţie de volumul de titrant adăugat în cursul titrării - procedeul se
foloseşte la determinarea punctului de echivalenţă (p.e.) şi se
numeşte titrare potenţiometrică (potenţiometria indirectă).

708
Sisteme de electrozi utilizate în potenţiometrie

 Clasificarea electrozilor:

 din punct de vedere funcţional:


- electrozi indicatori sau de lucru
- electrozi de referinţă.

 după natura sistemului electrochimic:


- electrozi de specia întâi
- electrozi de specia a doua
- electrozi de specia a treia
- electrozi redox
- electrozi cu membrană.

709
Electrozi de specia întâi
 sunt mai puţin utilizaţi
 sunt constituiţi dintr-un metal şi soluţia unei sări a acestuia: M, MtX
 potenţialul E are valoarea determinată de ecuaţia lui Nernst
 sunt reversibili în raport cu cationii/anionii carora li se determină
potenţialul.

1. Electrodul de argint:
 este constituit dintr-un fir de argint în contact cu o soluţie de ioni de
argint.
 se utilizează ca electrod indicator.

2. Electrodul normal de hidrogen (NHE):


 este format dintr-o placă de platina platinată scufundată într-o
soluţie de ioni H+ peste care se trece un curent de hidrogen.
 este utilizat drept electrod de referinţă.

710
Electrozi de specia a doua
 sunt metale puse în contact cu o sare greu solubilă sau un complex
stabil al metalului respectiv (MX), într-o soluţie ce contine un anion
comun cu sarea: M/MX, MtX
 electrodul este reversibil în raport cu anionul comun.
 dacă concentraţia anionului se menţine constantă, electrozii de acest tip
se utilizează ca electrozi de referinţă.
1. Electrodul de calomel (SCE): 2. Electrodul de clorură de argint :
este alcătuit dintr-un strat de mercur în constă dintr-un fir de argint în contact
contact cu calomelul şi o soluţie de KCl cu AgCl şi o soluţie de KCl saturată cu
saturată cu calomel: (Hg/Hg2Cl2(sat),KCl). AgCl (Ag/AgCl,KCl).

711
Electrozi de specia a treia
 Sunt formaţi dintr-un metal M1 în contact cu o sare greu solubilă sau un
complex stabil M1X al metalului şi o sare mai uşor solubilă sau un complex mai
puţin stabil al unui alt metal M2 în contact cu o sare uşor solubilă a lui M2.
 Sarea sau complexul M2X trebuie să aibă un ion comun cu ionul de dozat.
Electrodul se reprezintă M1/M1X/M2X/M2.
 Electrozii sunt reversibili în raport cu ionii metalului.
 În dozarea calciului se poate utiliza electrodul Ag/Ag2C2O4/ CaC2O4/Ca.

Electrozi redox
 Sunt constituiţi dintr-un metal inert pus în contact cu un sistem redox în care
ambele forme sunt solubile.

Electrodul de chinhidrona
 este format dintr-o placa de platina sau de aur, scufundata intr-o solutie
saturata de chinhidrona

 pe suprafata platinei se stabileste echilibrul electronic:

HO-C6H4-OH ↔ O=C6H4=O + 2H+ + 2e-


712
Electrozi membrană

 Sunt sisteme electrochimice în care o membrană selectivă separă două


soluţii de electroliţi între care se stabileşte o diferenţă de potenţial
datorită diferenţei de activitate a unui ion comun aflat de ambele părţi
ale membranei.

 Dacă concentraţia ionului respectiv dintr-o parte a membranei se


menţine constantă, potenţialul electrodului va depinde de activitatea
ionului din cealaltă parte.

 Electrozii membrană:
 acoperă un domeniu larg de concentraţii (1-10-7 moli/l)
 au o selectivitate bună
 sunt produşi pentru un număr mare de ioni: F-, Cl-, Br-, I-, SCN-, CN-,
S2-, Ag+, Pb2+, Cu 2+, Ca2+, Cd2+, BF4-, NO3-, ClO4-, K+, Mg2+ etc.

Electrozi membrană ioni-selectivi (ISE)

 Sunt electrozi ce dezvoltă un potenţial ce depinde de concentraţia


speciei ionice faţă de care sunt reversibili. Pot fi selectivi faţă de anioni,
cationi şi chiar faţă de substanţe inactive în urma unor reacţii
intermediare.

713
Clasificare:
A. Electrozi cu membrană cristalină
1. Monocristal: LaF3 pentru F-
2. Policristal sau amestec de cristale:
aglomerare de precipitate cristaline de halogenuri
sau amestec halogenura de arigint si sulfura de argint
Ex: AgCl/Ag2S, AgBr/Ag2S.

B. Electrozi cu membrană necristalina


1. Sticla : sticlă cu silicaţi pentru Na+, H+, anioni, enzime
2. Lichide : schimbător ionic lichid pentru Ca2+
3. Lichid imobilizat într-un polimer rigid : matrice de policlorură de vinil
pentru Ca2+ si NO3- .

Sticla specială conţine 22% Na2O, 6% CaO şi 72% SiO2


714
 Electrozii lichizi:
Ex: membrana este constituită dintr-un lichid hidrofob de tipul acizilor graşi
cu catenă lungă
 partea anionică R-COO - rămâne în interiorul fazei de membrană.
 cationul mobil este schimbat cu cationii fazei apoase adiacentă
membranei.
 funcţionează ca membrană lichidă schimbătoare de cationi.
Ex: utilizând cationi hidrofobi (compuşii cuaternari de amoniu cu catenă
lungă R4N), pot fi formate membrane lichide schimbătoare de anioni.
 Moleculele schimbătorilor de ioni pot fi dizolvate în alt solvent organic
pentru a forma membrana.
Ex: Eterii ciclici (inelari):
 au proprietăţi hidrofobe
 au capacitatea de a transfera ionii metalici din apă în faza
organică.
 sunt dizolvaţi într-un solvent organic, distribuţia ionilor în
această fază a membranei organice avand loc prin includerea lor
în cavitatea moleculară.
 din această distribuire rezultă o abatere de la electroneutralitate şi ca urmare se dezvoltă
un potenţial.
 capacitatea acestor membrane de a dezvolta un potenţial este consecinţa permeabilităţii
lor selective pentru anumiţi ioni.

715
 Când electrodul este introdus în soluţia probă se stabileşte un gradient de
concentraţie cu o mişcare tranzitorie a ionilor din direcţia activităţii mai
mari spre cea mai puţin intensă. Această dezlocuire ionică dezvoltă un
potenţial electric care se opune migraţiei ionice, stabilindu-se astfel un
echilibru.
 Cu cât membrana este mai subţire, acest echilibru se stabileşte cu atât
mai repede.
 Figura (a) - configuraţia unei membrane cu un timp de răspuns lung.
Electrodul de referinţă intern - electrod de Ag-AgCl. Membrana lichidă
schimbătoare de ioni este conţinută într-un tub de sticlă, separat de
soluţia probă printr-un film de celuloză care acţionează ca o barieră fizică
pentru amestecare.

 Figura (b) – configuraţia unei membrane lichidă


foarte subţire şi cu un timp de răspuns foarte scurt.
Soluţia probă se separă de electrodul intern printr-un
disc de filtru poros saturat cu faza lichidă schimbătoare
de ioni.

716
APLICAŢIILE POTENŢIOMETRIEI
1. Determinarea pH-ului
Ecuaţia operaţională a pH-ului este dată de relaţia:

Determinările de pH se fac cu ajutorul pH-metrelor.

717
 Se folosesc şapte soluţii etalon principale pentru acoperirea
domeniului de pH cuprins între 3,5 şi 10,0 si etaloane secundare
pentru pH-ul 1,7 (oxalat de potasiu) şi 12,5 (hidroxid de calciu).
 În tabel este redată compoziţia celor şapte soluţii tampon etalon
principale şi valorile pH-urilor corespunzătoare.

 Se recomandă etalonarea celulei cu una din soluţiile etalon a


cărui pH se apropie de pH - ul estimat al probei.
 Este bine să se măsoare pH-ul unei a doua soluţii etalon, după
prima etalonare în alt domeniu de pH, pentru a controla aderenţa
celulei la metoda teoretică prevăzută de ecuaţia lui Nernst.
718
2. Titrări potenţiometrice

 Titrarea potenţiometrică - constă în măsurarea forţei


electromotoare a unei celule în vederea determinării punctului
final al unor titrări volumetrice atunci când:
 nu există indicator de culoare
 indicatorul este distrus de mediul de reacţie
 soluţiile care trebuie titrate sunt colorate sau tulburi.

 Titrarea potenţiometrică determină variaţia de potenţial dintre doi


electrozi, unul indicator şi altul de referinţă, după fiecare
adăugare de volum măsurat de soluţie titrată.
 Schimbarea activităţii ionilor titraţi la punctul de echivalenţă se
determină prin măsurarea variaţiei de potenţial a electrodului
indicator, care depinde de concentraţia componentului din soluţia
de analizat.
 Ca electrod indicator se foloseşte electrodul de sticlă, electrodul de
chinhidronă etc.,
 Ca electrod de referinţă se foloseşte electrodul de calomel.
 Electrozii se conectează la un potenţiometru ce va măsura
tensiunea electromotoare

719
 Stabilirea punctului final al unei titrari potentiometrice poate fi efectuata grafic sau
experimental.
 Reprezentand grafic curba de titrare (variatia tensiunii electromotoare in functie de
volumul de solutie titrata utilizat) se constata la inceputul titrarii variatii mici de potential spre
punctul de echivalenta acestea devin tot mai mari si in imediata sa apropiere se obtine un salt
brusc al potentialului.
 Punctul de echivalenta va fi dat de valoarea maxima a raportului ΔE/ΔV, in care:
ΔE = variatia tensiunii electromotoare
ΔV = variatia volumului

720
Titrări prin reacţii de precipitare şi complexare
 Metoda de titrare potenţiometrică este utilizata în determinările
volumetrice prin reacţii de precipitare şi complexare deoarece de foarte
multe ori nu se pot folosi indicatorii vizuali.
 Ambele tipuri de reacţii implică ioni metalici fie ca titranţi, fie ca probe.
 Un electrod indicator pentru aceste determinări constă adesea din
metalul corespunzător acestor ioni. Ex: pentru titrarea cu AgNO3
electrodul indicator este confecţionat din argint.
 Pentru titrările prin reacţii de precipitare poate fi folosit acel electrod al
cărui potenţial este afectat de concentraţia ionilor.
 Alti electrozi indicatori - electrozii membrană ion-selectivi
Ex: Determinarea penicilinelor
 Penicilinele formează prin hidroliză penicilamina care dă cu ionii Hg2+
complecşi cu structuri în raportul 2:1 sau 1:1.

 Curba de titrare indică două salturi de potenţial.


 Titrarea se face cu ajutorul unei soluţii de Hg(ClO4)2
0.005 M
 Cantităţi de peniciline = 1-10 mg
 Electrozi indicatori: de platină sau electrodul
membrană ion selectiv de mercur şi grafit
 Electrod de referinţă - electrod de calomel

721
Titrări redox
 Electrod indicator - un metal nobil care serveşte ca mijloc de transfer al
electronilor din soluţie în circuitul exterior - cel mai utilizat electrod este
cel de platină.
 Electrod de referinţă - electrod de calomel.
 Potenţialul celulei variază conform concentraţiei componenţilor implicaţi
în reacţie.
 Ca sursă de eroare în titrările potenţiometrice redox apar semireacţiile
care au loc între reactanţi, la care se adaugă şi semireacţiile de la
electrodul de referinţă.
 Se adaugă titrantul şi echilibrul se stabileşte instantaneu între cele două
cupluri redox.
Alte aplicaţii:
 determinarea complexonometrică a
Ca2+ şi Mg2+ în apa potabilă şi farmaceutică
 determinarea cu EDTA a Cu2+
 determinarea Fe2+ cu Ce4+
 determinarea cefalosporinelor
 determinarea tetraciclinelor A- + B ↔ A + B -
 determinarea halogenurilor:

722
PLANUL CURSULUI

 ELECTROFOREZA

 METODE SPECTROMETRICE
 Spectrometria UV-VIS
 Turbidimetria si nefelometria

723
ELECTROFOREZA
Definitie:

 este o metodă care are la bază migrarea particulelor încãrcate


electric, solubilizate sau dispersate într-o soluţie de electrolit sau printr-
un suport solid poros (hârtie cromatografică, gel) sub acţiunea unui
câmp electric.

+ -

+ - 724
Clasificare:
 aplicată ionilor relativ mici se numeşte ionoforeză
 aplicata pentru particule coloidale, micele şi unele macromolecule poartă termenul de
electroforeză.

Se pot separa:
 compuşi metalici
 complecşi cationici şi anionici
 ioni proveniţi din electroliţi slabi (acizi carboxilici, baze organice, molecule organice
amfotere)

Low pH High pH Ex: aminoacizii - funcţie de pH, pot avea sarcină pozitivă
sau negativă.
La punctul izoelectric sau izoionic nu migrează,
activitatea electroforetică este nulă.
- H+

725
 Migrarea particulelor încărcate, în câmp electric, se face cu o viteză
caracteristică fiecărei specii. Viteza de deplasare poartă numele de
“mobilitate electroforetică”().

 Mobilitatea  a unei particule reprezintã distanţa d (în metri)


parcursã de o particulã coloidalã încãrcatã electric în timpul t de o
secundã sub acţiunea unui câmp electric al cãrui gradient de
potenţial E este de un volt/metru.

Se exprimă în m/sec, iar în câmp electric în m2/volt/sec (m2.V-1s-1).

726
 Gradientul de potenţial este determinat de intensitatea i a
curentului (în amperi) raportatã la conductibilitatea
specificã  a soluţiei şi aria secţiunii A a electrodului:

 Vâscozitatea mediului influenţează viteza de deplasare a


particulei:

unde:
E = câmpul electric
Q = sarcina particulei
r = raza particulei
 = vâscozitatea.

Atunci, mobilitatea particulei va fi:

727
Clasificarea metodelor electroforetice
După modul cum se desfăşoară electromigrarea:
• electroforeză în mediu liber în coloană de lichid sau
electroforeză cu front mobil (electroforeză frontală,
electroforeză de frontieră)

• electroforeză pe medii stabilizante sau electroforeză


zonală sau pe suport.

728
Electroforeza în mediu liber
 Migrarea electroforetică se realizează în coloană de lichid într-o
celulă formată dintr-un tub în formă de U umplut cu soluţie
tampon de electrolit, cu o secţiune pătrată, construit din sticlă
transparentă si un spectrometru.
 Cei doi electrozi se leagă la o sursă de curent continuu şi se aplică
o diferenţă de potenţial de 100-150 volţi.

 Cei trei componenţi proteici vor migra cu viteze diferite ce depind de mărimea, forma
şi sarcina lor.
729
Electroforeza zonala
 Se desfãşoarã pe suporturi solide care evitã labilitatea
fronturilor şi eliminã suprafeţele de separare false
datorate concentraţiei soluţiilor.
 Lichidul se găseşte într-un suport sau mediu poros:
 hârtie de filtru specială pentru electroforeză - acetat de
celuloză sub formă de folii pentru separarea de
insulină, proteine, lipoproteine, glicoproteine,
hemoglobine
 geluri de agaroză (proteine), agar (proteine, vitamine,
carbohidraţi), poliacrilamidă, silice, răşini schimbătoare
de ioni, amidon (enzime) etc. – au mare putere de
rezoluţie şi de selecţie moleculară.

Aparatul conţine:
• generator de curent continuu cu tensiune variabilã
cuprinsã între 0 şi 250-500 V şi cu o intensitate de cel
mult 50 mA
• camerã de electroforezã cu douã compartimente
separate anodic şi catodic în care se aflã doi electrozi
de platinã şi în care se poate pune soluţia de
electrolit; electrozii sunt legaţi la bornele
generatorului
• densitometru prevãzut cu un înregistrator de
absorbanţã şi un integrator. 730
 Metoda de analiză pe hârtie constă în:
 proba de analizat se aplică pe banda de hârtie îmbibatã cu soluţie
tampon: tampon barbital pH = 8,6, tampon borat pH = 8,6 şi 9,0,
tampon fosfat pH = 6,3; 6,5; 7,0; 7,5, tampon ftalat pH = 5,9,
tampon acetat pH = 5,6; 4,0, tampon tris-glicină pH = 8,3
 Fracţionarea are loc sub influenţa tensiunii aplicate la capetele
benzii.
 Identificarea compuşilor separaţi se poate face prin:
- densitometrie
- culoare
- reacţii chimice cu reactivi adecvaţi
- absorbanţă
- fluorescenţă

Mobilitatea electroforetică în cazul analizei pe hârtie este:

unde:
fc = factor de corecţie ce depinde de tipul de hârtie utilizat.

731
Factorii care influenţează electroforeza
1. Natura moleculelor separate
 mărimea particulelor
 natura şi sarcina speciilor.

2. Aparatura
 Suportul

3. Curentul electric
 Deplasarea electroforetică este proporţională cu mobilitatea, câmpul
electric şi cu timpul de trecere al curentului electric → d = .E.t

4. pH-ul
 Nu influenţează electroforeza acizilor, bazelor tari şi a sărurilor.
 Compuşii organici de tipul acizilor carboxilici, bazelor aminate si
substanţelor amfotere migrează numai dacă pH-ul soluţiei de electroliţi
este diferit de punctul izoionic.

5. Natura soluţiei
Ỉn soluţie se pot găsi săruri, acizi, baze etc. care influenţează mobilitatea:
 EDTA, acidul citric favorizează separarea unor ioni anorganici
 Lauril sulfatul de sodiu (LSS) şi dodecilsulfatul de sodiu (DSS) desfac
agregatele prin fixarea de proteine cărora le conferă sarcină negativă.

732
Electroforeza capilară (EC)
Migrarea se face în tub capilar de silice topită, umplut cu o fază ce constituie mediul de migrare
(electroliţi tampon, gel). Capetele capilarelor se introduc în două bacuri conţinând o soluţie apoasă
de electrolit. Diferenţele de potenţial de circa 30 kV sunt furnizate de o sursă de alimentare.
Electrozii din platină se introduc în cele două bacuri. La un pH>3, peretele capilarei de silice se
încarcă negativ determinând acumularea de sarcini pozitive la suprafaţa electrolitului. Se formează
un flux electroosmotic în direcţia catodului.

733
 Mediul de migrare: electroliţi tampon sau gel impregnat cu o
asemenea soluţie. Soluţiei i se pot adăuga:
 solvenţi organici: acetonitril
 agenţi tensioactivi: LSS, DSS
 ciclodextrine
 agenţi complexanţi, chelatizanţi sau sechestranţi
 compuşi ionici ce conţin cromofori, fluorofori.

 Migrarea particulelor:
 Toţi compuşii încărcaţi electric se deplasează în electrolit cu o
viteză care depinde de mobilitatea lor electroforetică şi de condiţiile
experimentale.
 Un alt factor care controlează migrarea soluţilor este curgerea
electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat prin mobilitate
electro-osmotică. Acest flux se află la originea deplasării tuturor
speciilor prezente într-o probă şi depinde de natura peretelui intern
al tubului capilar: negativ provoacă un flux electro-osmotic dirijat
spre catod şi invers; o suprafaţă pozitivă provoacă o dirijare a
acestuia spre anod.

734
Tehnicile electroforezei capilare

1. Electroforeza capilară zonală


Este o electroforeză în soluţie liberă şi se realizează într-o capilară umplută cu
soluţie de electrolit. Separarea se face în funcţie de mobilitatea electroforetică a
analiţilor.

EOF
+ -

tm (min) 0
735
2. Electroforeza capilară micelară (MECE)

• Este o variantă a “Micellar Electrokinetic Capilary


Chromatograpy” (MECC). Se mai numeşte cromatografie
capilară electrocinetică.
• În soluţia de electrolit se adaugă agent tensioactiv. Se
formează agregate sferice purtătoare de sarcini electrice.
Micelele sunt formate din lanţuri, cu extremităţile hidrofobe
spre interior, iar extremităţile hidrofile încărcate electric
orientate spre exterior. Micelele se dezagregă şi se refac
continuu. Ele înglobează analiţi hidrofobi pe care îi antrenează
în migrarea lor electroforetică.

EOF
+ -
736
3. Electroforeza capilară pe gel (GCE)
Gelul de agaroză 0,5 – 2%
Gelul de poliacrilamidă 3,5 – 20%
Ex: Pentru separarea electroforetică a proteinelor se foloseşte aşa numita electroforeză pe
gel de poliamidă cu dodecilsulfatul de sodiu, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SDS este un agent tensioactiv anionic care în amestec cu proteinele denaturează structura
secundară şi terţiară a acestora şi încarcă fiecare proteină cu sarcină negativă. SDS
liniarizează proteinele şi contribuie la migrarea în funcţie de mărimea lor. Proteinele
denaturate se aplică pe stratul de gel de poliamidă şi se imersează în soluţia tampon.
Proteinele scurte migrează mai uşor prin porii gelului.

+ -
Ep
737
4. Electroforeza capilară în contracurent

 Se introduce în soluţia tampon folosită, a unor aditivi numiţi “selectori


chiralici”: ciclodextrine, eteri coroană, proteine, hidraţi de carbon,
antibiotice macrociclice (vancomicina, rifampicine), complecşi metalici
enantioselectivi.
 Ciclodextrine [CD]: (, , -CD)
 Eteri coroană: (+)-(18-crown-6)2,3,11,12-tetracarboxilic acid (18C6H4), (-)-
(18-crown-6)2,3,11,12-tetracarboxilic acid (18C6H4)

Sunt utilizaţi pentru separarea enantiomerilor aminoacizilor aromatici: triptofan (L,D), 5-


hidroxitriptofan (L,D), fenilalanina (L,D), tirozină (L,D), homofenilalanina (L,D), 3,4-
dihidroxifenilalanina (L,D), 3-hidroxifenilglicina(L,D).

738
APLICAŢIILE ELECTROFOREZEI

1. Determinarea mobilităţii electroforetice

2. Separarea electroforetică a chiralilor


 Izomerii D şi L pot fi separaţi cu ajutorul ciclodextrinelor, izomerul D formează
un complex stabil cu ciclodextrina si este reţinut mai mult timp de
ciclodextrine.

3. Identificarea şi separarea unor compuşi biologici


 Chimiotripsina poate fi impurificată cu tripsină şi din acest motiv farmacopeele
cer controlul purităţii prin electroforeza clasică.
 Tehnica de lucru prevede:
 folosirea hârtiei de tip MN 862 Whatman nr. 1 sau Schleicher-Schüll 2043 b
sub formă de benzi de 3 cm lăţime.
 benzile de hârtie se impregnează cu tampon barbital pH 8.6 şi se introduc în
camera electroforetică cu aproximativ 15 minute înainte de aplicarea soluţiilor
 se lucrează în paralel, probă şi etalon
 determinarea se efectuează la tensiunea de 200 V timp de 5 ore.
 benzile de hârtie se usucă la temperatura camerei apoi se imersează în
reactivul de colorare constituit din albastru de bromfenol dizolvat în alcool
saturat cu clorură de mercur (II).
 in continuare, benzile de hârtie se spală, de repetate ori în acid acetic 0.5 %
până când fondul benzii de hârtie se decolorează, se usucă parţial la
temperatura camerei şi se expun la vapori de amoniac concentrat.
 proba de analizat se consideră corespunzătoare dacă prezintă o singură zonă
colorată în albastru, iar migrarea s-a făcut cu aceeaşi viteză cu cea a
etalonului.
739
Determinarea cantitativă

Fracţiunile separate electroforetic se pot evalua cantitativ prin două


procedee:
 în mod direct prin determinarea densităţii optice a spoturilor de pe suport
cu ajutorul spectrometrelor ce pot măsura lumina transmisă (fotometrie
prin transparenţă) sau lumina reflectată (fotometrie prin reflexie)
 în mod indirect prin determinarea printr-o metodă ulterioară a fracţiunilor
eluate de pe suport.

IMUNOELECTROFOREZA

 În masa de geloză, într-o adâncitură se pune serul de analizat, iar într-un


şanţ central se introduce serul unui animal imunizat cu antigene.
 In prima etapă, în primul godeu se introduce serul bolnav, iar în al doilea
serul etalon, apoi se face separarea electroforetică.
 Serul imunizat se pune în şanţul central, se lasă în repaus 24 de ore, timp
în care se produce difuzia în geloză a proteinelor separate din serurile
iniţiale şi proteinele serului imunizat.
 La contactul anticorpilor din serul imunizat cu proteinele serice antigene,
acestea din urmă formează arcuri caracteristice de precipitare.
 Prezenţa sau absenţa proteinelor anormale se stabileşte prin compararea
arcurilor formate de serul bolnavului cu cel al martorului.

740
METODE SPECTROMETRICE ỈN ANALIZA
MEDICAMENTELOR

 SPECTROMETRIA UV-VIS
 TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA
 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢA
 SPECTROMETRIA DE FOSFORESCENŢA
 CHEMILUMINISCENŢA Radiatie reflectata
 SPECTROMETRIA IR, FT-IR, NIR
 SPECTROMETRIA RAMAN Absorbtie

 SPECTROMETRIA ATOMICĂ
 SPECTROMETRIA CU RAZE X Radiatie incidenta Proba Radiatie transmisa

 SPECTROMETRIA RES
 SPECTROMETRIA DE MASĂ
 SPECTROMETRIA RMN
Radiatie imprastiata Radiatie emisa
741
PRINCIPII GENERALE
 Spectrometria = metode bazate pe măsurarea absorbţiei sau
emisiei de energie de catre substanţe în funcţie de lungimea de
undă a radiaţiei.

 Spectrometria de absorbţie - utilizata pentru identificarea şi


determinarea cantitativă a substantelor, bazandu-se pe
proprietatea lor de a absorbi selectiv radiatiile electromagnetice.

 Metoda se caracterizează prin:


 sensibilitate
 simplitate
 rapiditate
 specificitate.

742
 Radiaţiile electromagnetice se caracterizează
prin:
 lungimea de undă
 frecvenţa
 numărul de undă

unde:
-  = lungimea de undă (distanta in linie dreapta dintre doua maxime
consecutive ale unei unde elecromagnetice)
-  = frecvenţa = c/
- c = viteza luminii = 3.1010 cm/sec
- = număr de undă

• Frecventa, :
 este numărul de ondulaţii pe unitate de timp
 se exprimă prin timp-1 şi unitatea uzuală este sec-1
 se poate exprima şi prin cicli/secundă (cps) sau herţi (Hz).

743
 Lungimea de undă poate fi exprimată şi în următoarele unităţi:
1 Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m
1 nm = 10-9 m =10-7 cm = 10 Å
1 m = 10-9 m = 10-6 mm
1  = 10-6 m = 10-3 mm

 Ỉn spectrometria IR unitatea frecvent folosită este micronul, ,


sau numărul de undă 1/, exprimat în cm-1.

 Numărul de undă poate fi exprimat şi în kayser: 1 k = 1 cm-1

744
 Fiecare radiatie luminoasa poarta o energie - cuanta de energie -
proportionala cu frecventa acesteia.

E = h = h.c/

- h = constanta lui Planck = 6.6 x 10-27erg sec

Relaţia energie, frecvenţă


şi lungimea de undă a
radiaţiilor

 creşterea lungimii de undă are loc de la razele gama la undele TV-radio


 energia şi frecvenţa radiaţiilor creşte de la undele TV-radio la razele gamma
 creşterea lungimii de undă se manifestă prin scăderea energiei şi frecvenţei.

745
• Spectrele = totalitatea frecvenţelor radiaţiilor simple,
componente ale unei radiaţii electromagnetice compuse, la trecerea
lor printr-un instrument optic adecvat.

• Metodele spectrometrice sunt legate calitativ şi cantitativ de


domeniul spectral în care se lucrează:
 ultraviolet
 vizibil
 infraroşu etc.

• Spectrul electromagnetic al luminii albe = totalitatea regiunilor


spectrale (UV, VIS, IR, etc).

Spectrul electromagnetic al luminii 746


Diagrama spectrului electromagnetic al luminii 747
 Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicol de radiatii continue
prin substanta de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.

 Cantitatea de energie absorbita este functie de:


 structura
 numarul de molecule sau atomi ai substantei cu care interactioneaza fascicolul
de radiatii.

 Energia oricărei molecule este dată de suma energiilor electronice, vibraţionale şi


rotaţionale:

E = Eelectronică + Evibratională + Erotatională

 Raportul celor trei energii este:

Eelectronică > Evibratională > Erotatională

748
Diagramele nivelelor de energie a moleculelor

749
Salturi de energie moleculara:
 prin excitaţii electronice ce corespund energiilor radiaţiilor cu
 = 200 - 800 nm
 implicând saltul electronilor pe nivele electronice superioare (un
orbital de antilegătură)
 determină spectrele de absorbţie în UV-VIS (spectre electronice)

 prin excitaţii moleculare determinate de radiaţiile IR cu  = 2,0


- 25 µm
rezultă spectrele moleculare de rotaţie – vibraţie sau spectrele IR

750
• Ca rezultat al absorbţiei de energie este posibil ca anumite
molecule să emită radiaţii, care constituie subiectul
spectrometriei de emisie.
• Din această categorie fac parte:
 spectrometria de fluorescenţă
 spectrometria de fosforescenţă.

751
 Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unei radiaţii continue
provenite de la o sursă luminoasă prin substanţa de cercetat, care
absoarbe din spectru linii sau benzi.

 Absorbţia radiaţiilor luminoase în condiţiile analizei spectrale


cantitative are loc conform legii Lambert-Beer.

 La trecerea unei radiaţii luminoase Po printr-un mediu, acesta va


absorbi o parte din radiaţie şi restul va trece sub forma unei radiaţii
P cu intensitate mai mica.

proba
sursă
b/l (cm) detector
P 0 / I0 P/I

C (g/l)

Absorbţia radiaţiilor la trecerea printr-un mediu lichid 752


 Măsurarea radiaţiilor se face în transmitanţă sau absorbanţă:

I I0
A  ε.b.c  - log T  - log  log
I0 I
T = I (P)/I0 (P0)
%T = 100(I/I0)
log Io/I = log 1/T = .c.b = A = E = D

unde:
- A, E, D = absorbanţa, extincţia, densitatea optică (D)
-  = coeficient molar de extincţie (absorbtivitate molara)
- b (l) = grosimea stratului străbătut (cm)
- c = concentraţia (mol/litru)
- T = transmitanţa
- I0 = intensitatea fasciculului luminos incident
- I = intensitatea fasciculului luminos după ce a străbătut mediul

Daca b = 1 cm, iar c = 1 mol/litru, A = 

 = absorbtivitate molara sau coeficient molar de extinctie =


absorbanta unei solutii de concentratie 1 mol/litru si grosimea stratului
absorbant de 1 cm la o anumita lungime de unda
753
 Extincţie (Absorbanta) specifică = absorbanţa
corespunzătoare unei soluţii a cărei concentraţie este de 1 g %.

 Relaţiile mărimilor implicate sunt:

 În cazul determinării cantitative dintr-o probă:

unde:
- b = 1 cm
- c = g % pentru extinctia specifica, moli/l pentru  (coeficient
molar de extincţie)
- = absorbanţa specifică
- a = cantitatea de probă luată în lucru.

754
• Relaţia dintre coeficientul molar de extincţie şi extincţia specifică
este:

unde:
M = masa moleculară.

• Coeficientul molar de extincţie:


 este o mărime constantă
 depinde de :
■ lungimea de undă a luminii incidente
■ natura substanţei dizolvate
■ temperatura soluţiei
 corespunde extincţiei soluţiei molare a substanţei
 valoarea caracterizează sensibilitatea determinării
 cu cât are o valoare mai mare, cu atât şi sensibilitatea determinării
va fi mai mare.
755
SPECTROMETRIA UV - VIS
 Regiunea spectrală:
UV - îndepărtat: 100 - 200 nm
UV - apropiat: 200 - 400 nm
VIS: 400 - 800 nm.

Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza prezentei cromoforilor.

 Cromofori (grupe cromofore)


 sunt grupe de atomi, care prezente într-o substanţă pot da naştere
la spectre electronice (de absorbţie).
 Grupă auxocromă
 este o grupă de atomi saturată care, ataşată unui cromofor,
modifică lungimea de undă (max) la care are loc absorbţia şi
intensitatea maximă de absorbţie.

756
a. deplasare batocromă (spre roşu)
- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mari,
ceea ce înseamnă că are loc cu energii de excitaţie mai mici

b. deplasare hipsocromă (spre albastru)


- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mici,
ceea ce se realizează cu ajutorul unei energii de excitaţie mai mari

c. efect hipercrom
- cresterea intensitatii absorbtiei

d. efect hipocrom
- micsorarea intensitatii absorbtiei

757
757
Absorbante tipice ale cromoforilor

758
Cauzele producerii spectrelor

 Energia luminoasă se absoarbe pe seama promovării


electronilor implicaţi în tranziţii dintr-un orbital de legătură 
sau  ocupat cu electroni în starea fundamentală într-un orbital
de antilegătură * sau * neocupat în starea fundamentală,
capabil de a fi ocupat în starea excitată.

 În afara electronilor  şi  în tranziţiile electronice sunt implicaţi


şi electronii neparticipanţi n, electroni de nelegătură, care pot fi
promovaţi în orbitalii de antilegătură * sau *.

759
 Din punct de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor
existenti intr-o molecula, la tranzitiile electronice se disting
urmatoarele tipuri de electroni:

1. electroni de tip 
 Sunt implicati in legaturi covalente 
 au energii mari de excitare
 nu contribuie la absorbtia in UV-VIS (alcani)

2. electroni 
 situati pe orbitali  ai dublelor si triplelor legaturi
 usor excitabili si responsabili de majoritatea spectrelor electronice

3. electroni n
 sunt electroni neparticipanti in invelisul exterior de electroni ai unor
atomi de tipul N, O, S si halogeni
 sunt mai slab atrasi de nucleele acestor atomi decat electronii 
 pot fi excitati cu radiatii UV-VIS
 contribuie la absorbtiile din acest domeniu spectral

760
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii  - * (alcani)
- tranziţii  - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)

761
Tranziţii -*
• consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
legatura σ pe un orbital de antilegatura σ*

• necesita o energie mare

• apare in UV indepartat (< 200 nm)

• sunt caracteristice substantelor care contin numai legaturi simple;


exemple: legaturi C-H şi C-C

• legaturile σ în compusii organici au stabilitatea mare, ceea ce se


traduce printr-o diferenta de energie semnificativa intre orbitalii ocupati
si orbitalii liberi.

• sunt tranzitii puternice

762
Tranziţii -*
 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
legatura  pe un orbital de antilegatura *

 sunt caracteristice compuşilor cu legături duble omogene sau


heterogene: C=C; N=N; C=O; N=O (alchene, compuşi carbonilici, alchine,
azo compuşi).

 sunt tranziţii puternice

763
Tranzitii n→*

 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de


nelegatura n pe un orbital de antilegatura σ*

 caracterizează substanţele organice care conţin în molecula lor


heteroatomi cu electroni neparticipanţi: O, N, S şi halogeni.

 tranzitiile au loc cu energii mai mici decat tranzitiile →*.

 au loc la lungimi de unda cuprinse intre 150-250 nm.

 numarul compusilor organici cu grupe functionale capabile de aceste


tranzitii in regiunea UV este mic.

R-X, X = Br, I

764
Tranziţii n-*
 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
nelegatura n pe un orbital de antilegatura *

 sunt caracteristice compuşilor cu legături duble heterogene: C=N; C=S;


C=O; N=O compuşi carbonilici).

 Se produc prin trecerea unui electron din orbitalul de nelegatura n in


orbitalul de antilegatura *.

 necesită o energie mai mică decât cea -*

 au loc în plin domeniu UV pentru lungimi de undă cuprinse între 270 -


290 nm.

765
765
Tranziţii d - d*
 implica electronii din orbitalii moleculari d
 sunt specifice compusilor anorganici
 sunt ȋnsoţite de o absorbtivitate mică
 datorită tranziţiilor dd* ionii unor metale sunt coloraţi (absorb în UV-
VIS)

Relaţiile dintre
absorbtivitatea molară  şi
lungimea de undă a unor
metale

766
APARATURA
• Aparatele utilizate pentru determinări spectrale poartă numele
de spectroscoape sau spectrometre.

• După tipul de receptor utilizat, spectrometrele pot fi:


 cu citire vizuală
 cu citire fotoelectrică
 cu înregistrare fotografică
 cu receptori termici.

767
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul

Spectrometru UV-VIS cu fascicul dublu


768
Surse de spectru continuu
utilizate in UV-Vis

corp incandescent

becul cu filament de
lampa cu halogen
wolfram

descarcari electrice
in gaze

lampa cu deuteriu lampa de xenon

769
770
771
772
773
Reprezentarea spectrelor

 înregistrarea de către spectrofotometru fie a absorbanţei, fie a transmisiei, fie a


coeficientului molar de extincţie sau a logaritmului acestui coeficient în funcţie de
lungimea de undă.

Reprezentarea spectrelor în
UV a unor compuşi organici
(absorbanţă- lungime de
undă, coeficient molar de
extincţie-lungime de undă)

Reprezentarea spectrelor prin absorbanţă


molară ()-lungimea de undă pentru cafeină şi
aspirină
774
774
Aspecte privind determinările în UV – VIS

 Legea Lambert-Beer este valabila numai pentru solutii diluate


deoarece la concentratii mai mari de 10-2 M solutiile au o forta
ionica ridicata, iar interactiunile electrostatice dintre
componentii solutiei sunt mai intense si nu va exista o
linearitate (proportionalitate intre concentratie si absorbanta)

 Concentraţia probei trebuie astfel aleasă încât determinarea să


se înscrie în scala de înregistrare a aparatului şi în zona
maximă de acurateţe.

 Alegerea selectivă a solventului în funcţie de absorbţia


substanţei de analizat şi mărimea concentraţiei probei este de
cea mai mare importanţă în analiza UV şi VIS.

 Solventul utilizat nu trebuie să absoarbă în regiunea în care


se face determinarea sau se înregistrează spectrul.

775
 Cei mai utilizaţi solvenţi sunt apa, alcoolul metilic, alcoolul etilic,
ciclohexanul, 1,4 - dioxanul etc.
 Solvenţii utilizaţi trebuie:
 să fie lipsiţi de impurităţi pentru a nu influenţa alura curbelor
înregistrate
 să nu modifice maximele de absorbţie caracteristice substanţei
analizate.
Absorbanţa în UV-VIS a unor solvenţi

776
APLICAŢIILE SPECTROMETRIEI UV-VIS

1. Identificarea substanţelor medicamentoase


• Spectrele UV-VIS oferă informaţii în legătură cu:
 structura globală a electronilor substanţei analizate
 natura cromoforilor existenţi, poziţia lor faţă de alte elemente
structurale
 stereochimia moleculei
 existenţa legăturilor de hidrogen etc.

Hidrocarburi saturate
• Legăturile covalente existente în aceşti compuşi sunt puternice
şi pentru efectuarea unor tranziţii electronice sunt necesare
energii deosebit de mari, care au loc în domeniul UV de vid
greu accesibil cu aparatele obişnuite.
• Sunt substanţe transparente (nu absorb) şi de aceea au o
largă utilizare ca solvenţi pentru spectroscopia în UV-VIS.

777
Substanţe care conţin heteroatomi (O, S, N)
• În aceşti compuşi au loc tranziţiile -* şi n-*.
• Exemple: alcooli, amine, substanţe heterociclice cu N, sulfuri
etc.

Substanţe nesaturate
• Tranziţiile electronice care au loc sunt -*. Astfel:
- legătura C=C se caracterizează printr-o absorbţie la 165 nm,
- legătura C≡C la 173 nm.

• Cromoforul C=O se caracterizează printr-o bandă de absorbţie


de intensitate mare în regiunea 190-200 nm.

• Datorită tranziţiilor n-* mai apare o bandă de intensitate mai


slabă între 270 - 290 nm.

778
Substanţe cu caracter acid şi derivaţi funcţionali
• Tranziţiile electronice de tip -* şi n-* caracterizează
substanţele prin absorbţii în UV de vid şi în domeniul:
- 200-210 nm pentru acizi
- 235 nm pentru cloruri
- 200 nm pentru amide
- 205-210 nm pentru esteri.

Poliene conjugate
• Cu cât lanţul este mai mare are loc o deplasare batocromă
mai accentuată.
• Exemplu: vitamina A absoarbe la 328 nm, provitamina A
(trans - beta - carotenul) la 450 nm, licopina la 472 nm.

• Creşterea numărului dublelor legături conjugate în moleculele


beta-carotenului, licopinei şi a dehidrolicopinei face ca aceste
substanţe să absoarbă în VIS şi să fie colorate în portocaliu,
roşu şi violet.

779
Compuşii aromatici
• prezintă spectre caracteristice în UV datorită conjugării
specifice stării aromatice.
• compuşii aromatici prezintă benzile caracteristice:
 E (etilenice) - 180-220 nm
 K (conjugate) - 220-250 nm
 B (benzilice) - 250-290 nm
 R (radicalice) - 275-330 nm.
• Benzile E şi B apar datorită tranziţiilor n-* si -*.
• Banda K apare la moleculele cu duble legaturi conjugate si se
datoresc unor tranzitii -* cu excitatii mari.
• Benzile R apar dacă pe nucleul aromatic este grefată o
grupare cromofora care posedă o pereche de electroni
neparticipanţi, fiind posibile tranziţii n-*, cu excitatii mici.
• Substituenţii introduşi pe nucleul aromatic produc modificări
în ceea ce priveşte absorbţia.
• Indiferent de natura substituentului se observă o deplasare
batocromă a benzii E. În funcţie de natura substituentului
sunt influenţate şi celelalte benzi.
780
• Identificarea famotidinei:
Spectrul UV al famotidină (5 μg/ml) în metanol (prezintă picuri maxime la trei
lungimi de undă.

λmax (nm) A (1 %, 1 cm) Absorbtivitate molară (l mol-1cm-1)

288.0 4.94 166.7

211.0 6.52 220.0

205.1 5.98 201.8


781
• Identificarea citarabinei

Analiza spectroscopică în UV a citarabinei dizolvată ȋn acid clorhidric 0.1 mol/l a arătat


un maxim la 281 nm

782
Substante determinabile spectrometric

783
2. Metode de investigare a formării compuşilor de incluziune

• Investigarea obţinerii compusului de incluziune dintre naproxen-β-ciclodextrină

784
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase

• metoda standardului extern


• metoda absorbantei specifice
• metoda absorbtivităţii molare
• metoda curbei etalon - metoda celor mai mici pătrate

Exemple:

• Dozarea ofloxacinei din pulbere vrac


sau din formă farmaceutică
- solvenți: HCl 0.1 mol/l
- lungimea de undă = 293 nm.
- proba: comprimate ofloxacin de
concentraţie 200 mg/cpr
- metoda curbei etalon
- ecuația dreptei de regresie –
y = 0.121x - 0.015
785
• Dozarea flavonelor prin formarea unui complex între flavonoide şi clorură de aluminiu
din comprimate

reactivi: solutie clorura de aluminiu 0.1 M, acetat de potasiu 1 M, solutie de hidroxid de


sodiu 10 %.

786
• Dozarea substantelor in amestec

• Presupunând substanţele A şi B ca făcând parte dintr-un preparat


farmaceutic, se trasează curba de absorbţie pentru cele două
substanţe dizolvate în acelaşi solvent

• Spectrul de absorbtie al amestecului celor doi componenti, A si B este


echivalent cu rezultatul insumarii spectrelor caracteristice celor doi
componenti.

• Se masoara absorbanta probei cu cele doua componente, la doua


lungimi de unda corespunzatoare maximelor de absorbtie a celor doua
componente (absorbantele sunt aditive)

Determinarea unui amestec de două substanţe


787
 Se aplică legea aditivităţii:

 Din sistemul obţinut se determină cantitativ conţinutul în cele


două substanţe:

unde:
- A(A + B)1, A(A + B)2 = absorbanţele determinate la două lungimi de
undă
- CA, CB = concentraţiile căutate
- A1A, A2A, A1B, A2B = absorbanţele specifice sau coeficienţii molari de
extincţie ai celor două substanţe la lungimile de undă respective.

 Spectrometrele moderne permit determinarea automată a unui


amestec de doi sau mai mulţi componenţi.
788
Alte aplicatii

Determinarea alcaloizilor şi a unor precursori din


Chataranthus roseus

789
Spectrele alcaloizilor din
Catharanthus roseus: A-
catharanthina, B-serpentina,
C-tabersonina, D-vinblastina,
E-vincristina, F-vindolina,
G-ajmalicina, H-triptofan,
I-triptamina, J-secologanina

790
Determinarea cefaclorului

Determinarea constă in spectrometrarea la 340 nm a 2,5-


dicetopiperazinei rezultate în tampon amoniacal la pH 10.

791
• Dozarea şi determinarea stabilităţii substanţelor

Degradarea unei molecule poate atrage după sine modificări în spectrul UV-VIS al acesteia.
Aceste modificări pot fi:
• scăderea absorbanţei la lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbţie
• deplasarea maximului de absorbţie
• modificarea raporturilor absorbanţelor la două lungimi de undă diferite.

792
SPECTROMETRIA DERIVATĂ
 constă în transformarea unui spectru de absorbţie iniţial, de ordinul
zero, în spectre derivate de ordinul 1,2 şi n

 picurile spectrelor derivate sunt mai accentuate şi mai bine


diferenţiate
 importanţi sunt doi factori: ordinul derivatei
şi lungimea de undă la care se calculează
derivata. Practic este vorba de o transformare
electronică a semnalului (absorbanţei).

793
793
Spectrul derivat de ordinul 1

 un maxim corespunzător punctului de


inflexiune al părţii ascendente a
spectrului de ordinul zero
 un minim corespunzător punctului de
inflexiune din partea descendentă a
spectrului de ordinul zero.

Spectrul derivat de ordinul 2

 două maxime ce corespund celor două


puncte de inflexiune ale primei derivate
 un minim care se află la aceiaşi
lungime de undă cu maximul de
absorbţie din spectrul de ordinul zero

794
Spectrul derivat de ordinul 3

 două maxime, unul mai mic.


al doilea mai mare
 două minime din care unul
mai important datorită faptului că
ţine seama de maximele si
minimele spectrului derivat de
ordinul 2.

Spectrul derivat de ordinul 4

 un maxim accentuat încadrat


între
 două maxime mai mici şi
 două minime accentuate.
 picul important (mai mare) este
situat la aceiaşi lungime de undă
cu maximul picului spectrului de
ordinul zero.

795
795
 In practica analitică se utilizează spectrele derivate de ordinul 1
şi 2, adesea şi 4 datorită maximului situat la aceiaşi lungime de
undă cu maximul spectrului de ordinul zero.
 Avantajele spectrelor derivate:
 oferă o rezoluţie mai bună decât spectrul de ordinul zero, care
creşte odată cu creşterea ordinului
 amplitudinea picurilor derivate creşte odată cu ordinul derivatei
pentru o anumită amplitudine dată a picului iniţial (de ordinul
zero).

Diclofenac : spectrele derivate de ordinul zero şi 1


796
Aplicatii

Spectrele unui amestec binar de tripolidina si pseudoefedrina


797
TURBIDIMETRIA ŞI NEFELOMETRIA

Principii generale

 se bazeaza pe proprietatea particulelor solide de a dispersa


(a imprastia = a difuza) lumina incidenta, care strabate un
mediu heterogen care include analitul sub forma unor particule
fine.

 Fenomenul de difuziune se datorează împrăştierii radiaţiei


luminoase de către un mediu neomogen.

 Poate fi provocată de gaze, lichide sau solide.

 Principiul are la baza o reactie de transformare a unui analit


intr-o combinatie greu solubila care se formeaza treptat,
precipitatul avand forma unei suspensii fine, uniform
dispersate in mediul de reactie.
798
 Difuziunea cauzată de particulele solide este deosebit de
importantă.
 În cazul particulelor mici (diametrul < /10 a radiaţiei difuzate)
de formă sferică, intensitatea luminii difuzate (I) este dată de legea
lui Rayleigh:

unde:
- I0 = intensitatea luminii incidente
-  = lungimea de undă
- n şi n1 = indicele de refracţie al particulei dispersate, respectiv al
mediului
- N = numărul de particule din unitatea de volum
- v = volumul unei particule
- r = distanţa până la observator
-  = unghiul dintre direcţia luminii incidente şi a celei difuzate.
799
 Notând cu k mărimile constante, ecuaţia Rayleigh devine:

 Dacă dimensiunea particulelor este mult mai mare decât cea


indicată sau dacă ele nu sunt sferice, se observă abateri considerabile
de la ecuaţia Rayleigh.
 Intensitatea luminii difuzate se poate
determina pe două căi:

 prin determinarea scaderii intensităţii


fasciculului luminos transmis în direcţia
propagării acestuia pana la echivalenta, dupa care
nu se mai modifica = turbidimetrie

 prin observarea directă a luminii difuzate într-


un unghi de 45o sau 90o faţă de direcţia
fasciculului incident = nefelometrie sau
tyndallometrie.

800
Schema determinărilor turbidimetrice şi
nefelometrice
 Aceste metode sunt compatibile cu
cele spectrometrice din punct de
vedere al exactităţii şi sensibilităţii,
însă domeniile de aplicare sunt mult
mai restrânse.

 Dacă suspensia este densă, lumina


este difuzată puternic, tehnica
turbidimetrică fiind mai indicată.

 În cazul când lumina difuzată este


slabă, tehnica nefelometrică este mai
avantajoasă, deoarece se pot
determina intensităţi slabe difuzate cu
precizie mai mare.

801
801
• Turbiditatea (S) unei suspensii:
 se defineşte în mod analog cu absorbanţa
 in domeniul concentraţiilor mici:

unde:
- K = coeficient de turbiditate
- l = grosimea stratului străbătut
- c = concentraţia particulelor dispersate (numărul).

• K (coeficientul de turbiditate) depinde de:


 forma si marimea particulelor
 lungimea de unda
 indicele de refractie al suspensiei

802
Determinarea cantitativă

• Pentru o anumită suspensie, o aparatură dată şi în lumină


monocromatică, turbiditatea poate fi determinată prin o relatie
similară cu cea din spectrometria de absorbtie, Lambert – Beer.

• Este de preferat ca suspensia să nu fie colorată, respectiv


produsul de solubilitate al precipitatului să fie cât mai mic.

• Determinarea depinde de:


 concentraţie
 prezenţa substanţelor străine
 temperatură
 timp
 prezenţa coloizilor protectori etc.

803
Titrarea turbidimetrică
 Punctul de echivalenţă al unor titrări se poate sesiza mult mai
exact utilizând tehnica turbidimetrică, prin urmărirea absorbanţei
(turbidităţii) suspensiei în cursul titrării.

Schema unei aparat de titrare turbidimetrica

804
 pentru determinarea punctului de echivalenta se utilizeaza
curbele de titrare
 se reprezinta absorbanţa luminii difuzate în funcţie de volumul de
titrant adăugat

 toate curbele (1-8) au două puncte


deosebit de importante:
 începutul de precipitare
 punctul absorbţiei maxime.

 Volumul de echivalenta corespunde


absorbantei maxime.

Curbe de titrare
805
APLICAŢIILE TURBIDIMETRIEI ŞI
NEFELOMETRIEI

 determinarea cantitativă a ionului sulfat si a bariului ca BaSO4


 determinarea halogenurilor
 determinarea aluminiului, aurului, argintului, telurului
 caracterizarea unor sisteme nemiscibile (emulsii)
 controlul dezvoltării culturii de bacterii în medii lichide nutritive
 determinarea unor fracţiuni proteice separate SFC prin reacţia de
precipitare cu acid sulfosalicilic 3%
 analiza granulometrică a precipitatelor
 determinarea masei moleculare a unor polimeri
 determinarea alcaloizilor prin precipitare ca fosfomolibdati
 determinarea unor siropuri
 controlul unor aerosoli.
806
PLANUL CURSULUI

SPECTROSCOPIA IR

SPECTROSCOPIA FT-IR

SPECTROSCOPIA NIR

SPECTROSCOPIA Raman

807
SPECTROSCOPIA ÎN INFRAROŞU
INFRARED SPECTROSCOPY (IR)

 Grupeaza metode de identificare si dozare nedestructive bazate


pe absorbtia sau reflexia de catre probe a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,75 - 1000 µm:

 Regiunea fundamentala 2,5 - 25 µm = regiunea IR analitic

808
Principii generale

 Spectrele în IR sunt spectre moleculare, mult mai complexe decât cele


atomice, molecula reprezentând un sistem în care nu se poate considera
întreaga masă concentrată într-un singur punct; masa moleculei este dată
de nucleele atomilor corespondenţi care sunt considerate puncte materiale.

E = E e + E v + Er + Et
unde
- Ee = energie electronică
- Ev = energie de vibraţie
- Er = energie de rotaţie
- Et = energie de translaţie

 În mod asemănător atomului, molecula poate trece de la o stare


energetică inferioară la o stare energetică superioară prin absorbţie de
energie, a cărei valoare este egală cu diferenţa energiilor celor două stări.

809
Spectrul IR = reprezentarea grafica a procentului de energie absorbita
(absorbanta sau transmisia) functie de lungimea de unda exprimata in µm
sau frecventa exprimata in cm-1 (numar de unda).
100%
Transmission
50%
0%

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500


Wavenumber (cm-1)
810
Spectrul de rotaţie

 Este reprezentat de linii fine care se datoreaza variaţiei energiei


de rotaţie a moleculei ca urmare a absorbtiei radiatiilor IR cu  >
100 de µm.
 Aceste linii sunt aşezate la intervale egale de frecvenţă.
 In general, moleculele polare prezintă spectre de rotaţie.

811
Spectrul de vibraţie

 Radiatiile cu  = 1 -100 µm cand sunt absorbite provoaca


perturbări în energia de vibraţie a moleculelor.
 Modificarea energiei vibratorii a moleculei are drept consecinţă:
 întinderea
 deformarea sau îndoirea legăturii, ceea ce implică deplasarea
atomilor în afara axei lor de legătură.

întindere

îndoire

812
 Întinderea (alungirea) legăturii poate fi:
 simetrică
 asimetrică; (se modifică distanta interatomică)
 se notează cu  (vibratii de valenta).

simetrică asimetrică

H
H
C
C
H H

813
 Deformarea (indoirea) legaturii:

 este notată  (se modifică unghiul dintre legături)

 caracterizează vibratiile de deformare

leganare in plan forfecare in plan balansare in afara rasucire in afara


H planului planului
H H H
C C C C
H H H H

814
Spectrul de rotaţie-vibraţie

 Schimbarea stării de rotaţie a moleculelor apare în acelaşi timp


cu variaţia stării de vibraţie → tranziţiile de vibraţie apar
împreună cu cele de rotaţie → apare spectrul de rotaţie-vibraţie.

 Totalitatea tranziţiilor între nivelele de rotaţie si cele de vibraţie


constituie aşa numita bandă de vibraţie-rotaţie.

815
 Moleculele poliatomice oferă posibilitatea efectuării unui număr mare de
vibraţii care au loc simultan cu participarea tuturor atomilor din moleculă →
vibraţii normale.

 Vibraţiile normale ale moleculelor sunt:


 vibraţii de valenţă - se produc în direcţia dreptei care leagă două nuclee
atomice
 vibratii de deformare - a căror direcţie este perpendiculară pe legătura
de valenţă.

 În spectrele substanţelor organice sunt prezente anumite benzi de


absorbţie care caracterizează anumite legături sau funcţii din moleculă.

 Studiul spectrelor compuşilor organici cu diferite tipuri de legături (-OH,


C-H, N-H, C=C, C=O, C=N etc.) arată că, prezenţa lor în diferite molecule
duce la apariţia constantă a unor benzi de absorbţie. Poziţia acestor benzi
caracteristice fiecărei legături este uşor modificată de la un compus la altul.

 Grupa de atomi vibrează independent cu o frecvenţă proprie; aceste


frecvenţe sunt denumite frecvenţe caracteristice de grup.
816
La alcooli:
- vibraţia de valenţă OH pentru moleculele de alcooli
neasociaţi
prin legături de hidrogen = 3600-3650 cm-1.
- vibraţia de valenţă OH pentru moleculele de alcooli asociaţi
prin legături de hidrogen = 3200-3100cm-1.

O-H OH
CH2
H-bond
C-O

C-H
Spectrul IR al hexanolului

817
 Compuşii carbonilici prezintă o absorbţie caracteristică vibraţiei C=O
între 1650 - 2000 cm-1, iar poziţia acestei benzi este influenţată de
efectele inductive şi de conjugare, de geometria moleculei, de formarea
legăturilor de hidrogen, de solvenţii utilizaţi etc.
1715

2x C=O

C-H CH bend
O
C=O
C=O
CH3 C CH2 CH3
2-Butanona

818
 Acizii carboxilici sunt caracterizaţi prin benzi de absorbţie
corespunzătoare grupărilor C=O şi OH.
 Poziţia benzilor de absorbţie este modificată datorită conjugării
existente în grupa carbonil, legăturilor de hidrogen etc.

O-H
H-bond

C-O
CH2 O

C-H C=O CH3 CH2 CH2 C OH

Spectrul IR al acidului butanoic


819
 Aminele prezintă:

 vibraţii de valenţă N-H simetrice la 3400 cm-1 şi asimetrice la 3500 cm-1,

 vibraţii de deformare, N-H între 1560-1650 cm-1 (deformare în plan) şi


650-900 cm-1 (deformare în afara planului).

NH2
scissor
CH3
CH2
NH2

CH3 CH2 CH2 CH2 NH2


1-Butanamine

820
 Hidrocarburile aromatice şi substanţele medicamentoase cu structură
asemănătoare:
 vibraţia de valenţă C-H = 3000-3100 cm-1
 vibraţie de valenţă C=C = 1450-1650 cm-1
 vibraţie de deformare C-H = 671 cm-1.

Ar-H CH3

CH3 C=C
benzene

Toluen Ar-H

821
 La fenoli:
 pentru aceeaşi grupă OH au o absorbţie micşorată, 3594-3615
cm-1, atribuită conjugării electronilor neparticipanţi ai oxigenului
cu electronii nucleului aromatic.

O-H

C=C C-O

822
APARATURA
 Elementele constitutive ale unui spectrofotometru în IR:
- sursa de radiaţii
- monocromatorul
- cuva pentru proba
- detectorul
- amplificatorul
- dispozitivul de înregistrare.

823
 Sursa de radiaţii = un corp solid, incandescent, care emite un
spectru continuu într-un interval spectral.
 Incălzirea la incandescenţă se face cu ajutorul curentului
electric.
 Exemple:
- lampa Nernst = formată dintr-o bara (vergea) cu o compoziţie
complexă (oxid de zirconiu, oxid de ytriu şi oxid de erbiu)
- sursa Globar constituită dintr-o bara (vergea) de carbură de
siliciu

 Monocromatorul = separă după lungimi de undă radiaţia emisă


de sursa de radiaţii.
 este constituit din fante (de intrare şi de ieşire), colimator,
elemente de dispersie (prisma sau reţeaua de difracţie) şi
obiectivul de focalizare.

824
Prisma:
 trebuie să transmită în condiţii optime radiaţia în domeniul cercetat.
 este confecţionata din: LiF pentru domeniul 2 - 6 , NaCl pentru
domeniul 5 - 15 , KBr pentru domeniul 15 - 25 , CaF2, CsBr.

Reţeaua de difracţie:
 este alcătuită dintr-un sistem de fante egale, echidistante şi paralele care
alternează cu zone opace.

 Detectorul:
 este constituit dintr-un receptor termic care transformă energia radiantă
în căldură, care la rândul ei este transformată de receptor în impulsuri
electrice.
 cele mai folosite receptoare termice sunt: termoelementul, receptorul
pneumatic şi bolometrul.

 Amplificatorul
 are rolul de a amplifica impulsurile electrice emise de detector cu
amplitudini mici cuprinse între 10-6 şi 10-7 V.
 sunt utilizate cele electronice de curent alternativ.

825
 Înregistratorul:
 este constituit dintr-un milivoltmetru construit pe principiul compensaţiei,
cu ajutorul caruia se efectuează înregistrarea grafică a spectrului.
 Inregistrarea spectrelor în IR se bazează pe măsurarea transmisiei T:

T = P/P0
unde:
P = puterea radiantă a radiaţiei transmise de probă
P0 = puterea radiantă a radiaţiilor incidente.

826
ANALIZA PROBELOR

 Lichidele se analizeaza:
- ca atare
- sub formă de soluţie
 lichidele pure şi nu prea volatile se pot analiza depunându-le sub
forma unui strat subţire între două discuri optice (NaCl, KBr) care
se presează unul peste altul şi se introduc în celule speciale cu o
grosime de 0,1-1 mm, care se plasează în calea fasciculului
luminos.
 lichidele mai pot fi analizate prin introducerea lor în cuve sau
celule.
 in cazul utilizării solvenţilor, aceştia trebuie să fie anhidri, puri şi
transparenţi în intervalul în care spectrul prezintă interes.
 cei mai utilizaţi solventi: CCl4, CHCl3 şi CS2.

 Substanţele solide se analizează:


- sub formă de soluţie
- sub formă de suspensie în nujol/ulei de parafină
- dispersie solidă 1% în pastilă de KBr.
827
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI ÎN IR
 nu există compuşi care să prezinte spectre IR identice.

 domeniul frecvenţelor < 1500 cm-1 (regiunea amprentelor digitale) sunt


mult utilizate pentru stabilirea identităţii substanţelor analizate.

1. IDENTIFICAREA SUBSTANŢELOR MEDICAMENTOASE

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul obţinut în aceleaşi


condiţii cu substanţe etalon

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul etalon (din


cataloage sau monografii) la care s-au precizat valorile benzilor de absorbţie
caracteristice şi care trebuie să fie prezente şi în spectrul substanţei de
analizat.

Spectrul etalon = se obţine utilizând drept substanţe aşa - numitele


substanţe de referinţă pentru IR (s.r.i.r.) înscrise în capitolul Standarde al
farmacopeelor.

828
Exemple:

 acetazolamidă, acid iopanoic, acid nalidixic


 p-aminobenzoat de etil, ampicilina sodică, trihidrat de
ampicilină, benzilpenicilina potasică, palmitat de
cloramfenicol, clordiazepoxid, acetat de clortestosteronă,
cloxacilina sodică
 clorhidrat de cocaină, acetat de cortizon, acetat de
dezoxicortizon, dexametazona, dextran 40 şi 70,
diazepam, ergocalciferol
 lactobionat de eritromicină, furosemid,
hidroclorotiazidă, hidrocortizonă, hidroxiprogesteronă

829
teobromina

cafeina

830
2. DECELAREA IMPURITĂŢILOR SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 Impurităţile substanţelor medicamentoase provenite din procesul


de obţinere, cât şi cele rezultate prin degradarea substanţei păstrate
în condiţii necorespunzătoare produc modificări vizibile atunci când
se efectuează o analiză atentă a spectrului înregistrat.

 Se observă:
 modificări ale benzilor de absorbţie care trebuie să
caracterizeze substanţa pură
 apariţia altor benzi caracteristice unor legături sau funcţii
noi.

831
3. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase ca atare


 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase din
produsele farmaceutice.

 Probleme:
 realizarea unor condiţii standardizate
 respectarea legii Lambert-Beer.

 Exemplu: Alilestrenolul
- se foloseste solvent CCl4.
- maximele de absorbţie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1.
- legea Lambert-Beer se verifică folosind soluţii de concentraţii = 0,5-
2 g% (m/v).
- se poate determina în aceste condiţii şi din diverse produse
farmaceutice.

832
SPECTROSCOPIA IR CU TRANSFORMARE FOURIER
FOURIER TRANSFORM INFRARED SPECTROSCOPY
(FT-IR)

 Metoda se bazeaza pe operatia matematica care permite trecerea de


la un domeniu de masurare la altul, de exemplu, de la timp la
lungime de unda, sau o functie de timp, f(t), simpla intr-o functie a
frecventei, F().

 Aceasta functie se numeste “transformata Fourier” a functiei de


timp si permite transformarea intr-un spectru.

 Spectroscopia IR cu transformare Fourier a evoluat ca urmare a


dezvoltării interferometrului, dispozitiv capabil să măsoare simultan
toate frecvenţele radiaţiilor IR.

 Semnalele pot fi măsurate foarte rapid, în mai puţin de o secundă.

833
Componentele unui spectrometru FT-IR

834
1. Sursa: radiaţia infraroşie
emisă de sursă trece printr-
un dispozitiv ce controlează
cantitatea de energie ajunsă
la probă (şi apoi la detector)

2. Interferometrul: radiaţia
ajunge la interferometru
unde se codează spectrul.

3. Proba: radiaţia intră în


compartimentul probei unde
este transmisă sau reflectată
de la suprafaţa probei,
dependent de tipul de
analiză. Acestea sunt
frecvenţe specifice de energie,
ce sunt caracteristici unice
ale probei şi sunt absorbite.
835
4. Detectorul: în final radiaţia
trece prin detector pentru
măsurarea semnalului specific
(determinarea finală).

5. Calculator: semnalul măsurat


este transmis la calculator unde
are loc transformarea Fourier.
 Spectrul infraroşu final este
prezentat utilizatorului pentru
interpretare şi modificări
ulterioare.
 Deoarece pentru a măsura
intensitatea absorbţiei este
necesară o scală relativă, trebuie
măsurat un spectru de fond care se
determină fără probă în calea
radiaţiei.
 Spectrul de fond se compară cu
cel al probei pentru a determina
transmitanţa (procentual).
 Prin această tehnică se obţine un
spectru caracteristic al probei. 836
Principiul metodei:

 substanţa de analizat se spectrometrează


în IR, absorbţia are loc la diferite numere de
undă

 diferitele radiatii se separa cu un


dispozitiv (sistem) de franje de interferenta in
doua fascicole. Cele doua fascicole se
recombina pe acelasi traiect, traverseaza
proba si ajung la detector

 se măsoară energia fiecărei radiaţii


absorbite de probă

 prin măsurarea intensităţii fiecărei franje


(radiaţii ce au trecut printr-un sistem de
franje) se obţine o interferogramă

 transformarea Fourier a inregistrarii


obtinute ca functie a diferentei de drum
parcurs face posibila obtinerea unui spectru
dependent de frecventa sau de numarul de
unda.
837
 Spectrometrele FT-IR au la bază un interferometru Michelson:
 un separator de fascicule
 o oglindă fixă
 o oglindă mobilă.

Separatorul
este constituit dintr-un material special (germaniu depus pe o lamă de KBr)
 separă fascicolul in două: unul dirijat spre o oglindă fixă, celalalt spre o
oglindă mobilă.
 ambele oglinzi reflectă toate radiaţiile către separatorul de fascicule
 jumătate din razele reflectate sunt transmise, iar cealaltă jumătate
reflectate
 un fascicul trece prin detector, iar celălalt se întoarce la sursă.
838
 Interferogramă
 rezultatul absorbtiei radiatiei de către probă intr-un timp anumit
 are un aspect mult mai complex decât sinusoida simplă obţinută
la o singură lungime de undă a luminii
 reprezintă intensitatea absorbtiei ca functie de diferenta de
drum optic intre cele două raze.

 Odată ce interferograma este colectată, trebuie transformată într-


un spectru (de emisie, absorbţie, transmisie, etc).
 Un microprocesor converteste interferograma in domeniul de
frecvente cu ajutorul unei operatii matematice denumită
transformare Fourier.

Interferograma unei surse cu banda largă Spectru FT-IR al diclofenacului839sodic


Avantajele FT-IR

 Viteză:
 deoarece toate frecvenţele sunt măsurate simultan, majoritatea
determinărilor FT-IR sunt de ordinul secundelor

 Sensibilitate:
 sensibilitatea metodei este mult îmbunătăţită deoarece detectorii utilizaţi
sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult scăzut, iar scanarea rapidă
permite coadiţia mai multor scanări, reducând zgomotul măsurat
întâmplător la nivelul dorit (semnal mediu)

 Simplitatea aparaturii:
 oglinda mobilă a interferometrului este singura parte a aparatului care se
mişcă continuu, astfel încât este foarte puţin posibilă o defectare mecanică

 Calibrarea internă:
 aceste aparate utilizează ca standard de calibrare internă a lungimii de
undă, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare şi nu necesită o
calibrare de către utilizator.
840
APLICAŢIILE FT-IR

 metodă utilizată pentru identificarea oricărei probe.


 sensibilitatea va face posibilă identificarea unei cantităţi foarte
mici de impurităţi, ceea ce demonstrează că analiza FT-IR este o
metodă valoroasă în controlul de calitate sau în aplicaţiile asigurării
calităţii.
 sensibilitatea şi precizia detectorilor FT-IR, la care se adaugă
gama largă de software de algoritm au crescut utilizarea practică a
metodei în analiza cantitativă.

Evaluare şi identificare:
 de compuşi organici, anorganici
 în formularea medicamentelor
 în determinarea omogenităţii materialelor
 în medicina legală.

841
Screeningul controlului de calitate
• compararea probelor pentru aprecierea calitatii (corespunzator -
necorespunzator)
• compararea materialelor din diferite loturi.

Exemple:
 Identificarea siliconului (polidimetilsiloxan)
 prin determinarea legăturilor chimice din structura sa:
- C-H
- Si-O-Si
- Si-C

CH3[Si(CH3)2O]nSi(CH3)3

842
 Identificarea unui colorant
 se spectrometrează şi se compară spectrul colorantului etalon
cu cel al probei.
 cele două spectre trebuie să fie identice în cazul unui produs
original (nefalsificat).

843
SPECTROSCOPIA ÎN IR APROPIAT
NEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)

 este o tehnică rapidă şi nedistructivă, capabilă de a furniza date despre


constituenţii oricărei matriţe
 acoperă lungimi de undă cuprinse de la mijlocul infraroşului până la
domeniul vizibil.
 13000-4000 cm-1 sau 800-2500 nm

844
APARATURA

Spectrofotometru NIR:
 sursă de lumină
 monocromator
 suport care să ţină proba sau o suprafaţa pe care se pune proba
 detector prin intermediul căruia se fac măsurători de reflexie sau
transmitanţă.

845
 Sursa luminoasă:
 lampă tungsten/halogen.

 Detectori utilizaţi:
 cu silicon = sunt rapizi, nu dau zgomote de fond şi sunt sensibili
de la VIS la 1100 nm.
 cu sulfură de plumb = sunt mai înceţi, dar foarte utilizaţi,
deoarece au sensibilitate între 1100-2500 nm şi prezintă o calitate a
semnalului superioară.
 cu In, Ga, As = este cel mai scump, dar combină caracteristicile
celui de silicon şi a celui cu cu sulfură de plumb.

846
Moduri de masurare NIR

847
 Materialele transparente sunt măsurate în general în
transmitanţă (A/B).

Lichidele tulburi sau semisolidele şi solidele pot fi măsurate în


transmitanţă difuză (B), reflectanţă difuză (C) sau transflectanţă
(D/E).

 Metoda depinde de absorbţia sau caracteristicile de împrăştiere a


radiaţiei. Valorile relative ale absorbanţei sunt măsurate în funcţie
de un compus de referinţă.

 Pentru a măsura spectre NIR, prezentarea optimă a probei este


foarte importantă, în special atunci când se determină probe solide.

 Au fost construite câteva tipuri de celule în care se vor pune


probele:
- cuve de cuarţ pentru lichide
- celule cu ferestre de cuarţ pentru semisolide şi pulberi
- celule ajustabile pentru tablete şi capsule. 848
 Analiza în timpul procesului industrial este destinată furnizării de
informaţii în timp real asupra proceselor tehnologice. Această operaţie
necesită instrumente care sunt rapide şi fără părţi în mişcare.

 Instrumentele AOTF (filtru acustico-optic) efectuează numeroase citiri pe


secundă, aleg lungimi de undă prin utilizarea semnalelor frecvenţelor radio
pentru a modifica indexul refractiv al unui cristal birefracţional (de obicei
TeO2). Lungimile de undă pot fi scanate mult mai rapid.

 Analiza cantitativă clasică utilizează legea Lambert-Beer. Această analiză


necesită prezenţa benzilor de absorbţie ale fiecărui component, ceea ce
limitează utilizarea sa.

 În NIR s-a permis dezvoltarea logicii de analiză cantitativă bazată pe


principiul analizei factoriale. Determinarea se poate face şi din amestecuri
complexe.

 Se înregistrează spectrele NIR. Se reprezintă absorbanţa funcţie de


lungimea de undă. Spectrometrele NIR sunt capabile să efectueze în câteva
secunde un număr mare de măsurători. Se obţin numeroase valori numerice
ale eşantioanelor.

 Aplicaţiile analitice ale NIR constau în exploatarea datelor spectrale pentru


a determina valoarea unei variabile cantitative şi calitative. Acesta este un
tratament informativ care va permite detaşarea eficace a informaţiilor.
849
AVANTAJE NIR

 nu este necesara prepararea probei → reducere timp de analiza


 metoda nedistructiva
 cantitati mici de reactivi
 metoda excelenta pentru analiza probelor solide

 metoda neinvaziva

850
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI NIR

 Determinarea substanţelor medicamentoase


 Formularea comprimatelor, capsulelor, produselor liofilizate,
excipienţilor
 Controlul nedistructiv al formelor farmaceutice dozate
 Monitorizarea şi controlul proceselor (amestecarea pulberilor,
uscarea, granularea, peletizarea, comprimarea, umplerea capsulelor,
acoperirea cu film, ambalarea).

 Spectroscopia NIR combinată cu analiza multivariată a datelor


deschide multe perspective interesante în analiza farmaceutică, atât
calitativă cât şi cantitativă.
 Măsurătorile NIR rapide şi nedistructive fără pregătire prealabilă a
probei cresc foarte mult aria de acoperire analitică.
 Trăsătura caracteristică a combinării dintre informaţia chimică şi
fizică permite evaluarea unei ”semnături spectrale” pentru
materialele brute, intermediare şi formele finale de dozare, ceea ce la
rândul ei oferă posibilitatea determinării simultane a mai multor
caracteristici ale probelor. 851
1. Identificarea şi certificarea materiilor brute şi intermediare

 Materiile brute menite a fi utilizate în industria farmaceutică,


adică principii active şi excipienţi, sunt supuse cerinţelor
farmaceutice de calitate impuse de Good Manufacturing Practice
(GMP), Guidelines for Medical Products şi monografiilor din
farmacopeei.

 Pentru a garanta siguranţa maximă a produsului, normele GMP


impun o testare specială în interiorul lanţului de aprovizionare. În
afară de verificarea de rutină a substanţei, fiecare recipient trebuie să
fie identificat în cadrul oricărui lot de materie primă.

 Deoarece procesele farmaceutice moderne se bazează foarte mult


pe reproductibilitatea sursei de material brut, pentru a asigura
consecvenţa în calitatea produsului finit, certificarea materialelor
este o altă cerinţă analitică în lanţul de aprovizionare care trebuie
satisfăcută. Certificarea trebuie să confirme gradul şi/sau sursa de
material, şi proprietăţi fizice cum ar fi mărimea particulei, densitatea,
morfologia etc.

852
 Metodele tradiţionale de analiză consumă mult timp şi sunt de
obicei realizate într-un laborator off-line, de aceea nu sunt potrivite
pentru a realiza un număr mare de analize cerute de industria
modernă.

 Pentru a asigura identitatea conţinutului fiecărui container cu


material de start (brut) a fost posibilă utilizarea tehnicilor NIR
bazate pe sondele cu fibră optică pentru identificarea şi certificarea
materiilor prime într-o manieră rapidă şi nedistructivă.

 În tehnica NIR, identitatea chimică a unui anume material este de


obicei confirmată cu ajutorul unei biblioteci de spectre. Combinarea
informaţiilor chimice şi fizice din bibliotecă poate fi utilizată şi
pentru certificarea materialelor.

853
2. Analiza formelor dozate intacte

Comprimate

 determinarea parametrilor fizici şi biofarmaceutici:


 duritatea
 grosimea învelişului
 viteza de dizolvare.

 identificarea rapida şi
nedistructiva a principiile active,
excipienţii din comprimate
întregi chiar şi prin blisterele
în care sunt ambalate.

854
Capsule

 Învelişul gol de obicei compus din gelatină şi 12-16% umiditate


reziduală (apa) acţionează ca un plasticizant, provine de la un
producător şi este umplut automat în maşini de mare viteză.

 Identificarea, analiza, conţinutul în apă şi dizolvarea.

 Spectroscopia NIR:
 metodă ideală pentru a determina simultan aceşti parametri
printr-o singură determinare, înlocuind astfel metodele compendiale
consumatoare de timp.
 se usureaza testarea stabilităţii care ţinteşte condiţiile de
depozitare şi interacţiunile dintre înveliş şi umplutură.

855
3. Monitorizarea si controlarea proceselor

Se poate monitoriza:

 amestecarea pulberilor
 cu ajutorul sondelor reflectorizante din fibră optică, astfel
micsorand timpul necesar pentru analizare şi erorile care pot apărea
în mostre.

 deoarece majoritatea ingredientelor şi excipienţilor activi


farmaceutici absorb radiaţiile NIR, măsurătorile efectuate cu NIR pot
oferi informaţii legate de omogenitate tuturor componenţilor din
amestec, oferind o „amprenta multivariată” privind proprietăţile
chimice şi fizice ale mostrelor.

856
 granularea

 Producerea comprimatelor impune de multe ori o etapă de


granulare pentru a îmbunătăţi caracteristicile legate de cât de
compact este compusul.

 Monitorizarea şi stabilirea momentului în care procesul este


finalizat, folosindu-se spectroscopia NIR oferă posibilitatea
determinării în acelaşi timp a mărimii particulelor şi a umiditatii.

 Pot fi determinate cu uşurinţă interacţiunile dintre apă şi


excipient, formarea hidraţilor şi separarea amestecului.

857
 comprimarea şi umplerea capsulelor

 Aparatele de mare viteză folosite pentru umplerea automatizată a


capsulelor şi pentru formarea de comprimate necesită amestecuri de
pulberi care nu se separă sau amestecuri de granule care au bună
fluiditate pentru a fi siguri că funcţionează bine şi pentru a asigura
uniformitatea conţinutului şi o bună dizolvare a produsului final.

 În realitate, separarea anumitor tipuri de amestecuri prezentând


diferenţe din punct de vedere a dimensiunilor şi densităţii
particulelor poate avea loc în timpul vibraţiilor la oprirea
malaxorului, în timpul transferului şarjei către zona de umplere sau
comprimare şi chiar în interiorul echipamentului folosit.

 Deoarece tehnicile NIR pot recunoaşte schimbările fizice şi chimice


care au loc la nivelul amestecurilor de particule, la nivel de
comprimate şi capsule umplute, fără a interveni în procesul de
formare a comprimatelor şi de umplere a capsulelor, au ca rezultat
creşterea vitezei de producţie şi îmbunătăţirea calitatii produsului.

858
 acoperirea cu film

 Filmarea este procesul cel mai adesea folosit în industria


farmaceutică fie pentru a îmbunătăţi gustul şi pentru a face
comprimatele mai uşor de înghiţit, fie pentru a controla procentul
de dizolvare în cazul formelor de dozare solide. Indiferent de scopul
pentru care este folosită, filmarea este strâns legată de consistenţa
şi uniformitatea sa pe nucleul solid. Mostrele culese la diferite
intervale în timp sunt analizate cu ajutorul unui spectrometru NIR
prin reflecţie.

 ambalarea

 Ambalarea este ultima treaptă din procesul de producţie a unui


produs farmaceutic. Pentru a se asigura siguranţa produsului
final, se recomandă să se efectueze o ultimă verificare a identităţii
produsului aflat pe linia de ambalare. Recent, a fost creat un astfel
de sistem de inspecţie, bazat pe combinaţia între o cameră de
înaltă rezoluţie având aplicat un spectrometru NIR on-line, ce
acoperă domeniul 900-1700 nm.
859
4. Alte aplicaţii farmaceutice

 Adăugând informaţia spaţială şi colectarea în paralel de informaţii,


vizualizarea cu ajutorul NIR respectă nevoile analitice ale calităţii
farmaceutice şi controlul calităţii şi în multe domenii, poate servi drept
alternativă la spectroscopia convenţională.

 Lucrări din domeniul farmaceutic se axează asupra unor aspecte ca:


 analiza uniformităţii amestecului în pulberi şi comprimate
 compoziţia şi caracteristicile morfologice ale comprimatelor filmate şi ale
granulatelor multistratificate
 schimbările de ordin spaţial care au loc în sistemele de matrici
biodegradabile, în cazul hidratării şi degradării matricei şi eliberării active.

Imagini color în NIR


ale distribuirii de
lisozim la suprafaţa
unui comprimat de
poli(D,L-lactid-co-
glicolid);
după 4 zile (A) si
după 14 zile (B)
860
SPECTROSCOPIA RAMAN
RAMAN SPECTROSCOPY (RS)
 Într-o moleculă poliatomică pe lângă vibraţia unui atom de - alungul liniei
de legătură pot apărea mişcări în cursul cărora se deplasează sincron mai
mulţi atomi.

 Efectul Raman = lumina monocromatică difuzată de un mediu


transparent conţine pe lângă frecvenţa luminii incidente si
 o serie de linii cu frecvenţe mai mici = linii Stokes
o serie de linii foarte slabe cu frecvenţe mai mari dispuse simetric faţă de
primele = linii anti-Stokes

 Există o strânsă legătură între spectrele IR şi Raman deoarece ambele se


datorează unor tranziţii vibratorii (vibratorii - rotatorii) ale moleculelor.
 Ca urmare frecvenţa Raman corespunde ca valoare frecventei vibraţiilor
din IR (şi se exprimă tot în cm-1).

 Deosebirea fundamentală = la spectrele IR molecula este excitată de o


cuantă din regiunea IR, având exact energia necesară pentru a excita
vibraţional molecula care o absoarbe total, pe când cuanta excitatoare
Raman (situată în UV - VIS) are o energie mult mai mare, din care se
transmite o mică parte moleculelor (ca energie de vibraţie) restul emiţându-se
ca o cuantă de lumină cu energie (frecvenţă) diminuată.
861
 Se presupune o cuantă cu
frecvenţa  din domeniul VIS sau
UV care interacţionează cu o
moleculă.
 În urma interacţiunii, molecula
aflată pe nivelul vibraţional
fundamental  = 0 este ridicată
pe un nivel energetic E.
 În scurt timp, molecula coboară
pe nivelul fundamental  = 0, prin
emisia unei cuante de aceeaşi
frecvenţă , dar orientată la
întâmplare în altă direcţie (de aici
difuzia).

 Cea mai mare parte a


moleculelor urmează acest proces
corespunzător unui şoc elastic =
o ciocnire în decursul căreia nu
are loc o transformare a energiei
cinetice în alte forme de energie.

 Fenomenul este analog când molecula primeşte energie şi se reîntoarce


pe nivelul  =1.
 In ambele cazuri are loc difuzia simplă a luminii (linie Rayleigh) la
frecvenţa  identică cu frecvenţa luminii incidente. 862
 Dacă molecula ridicată pe nivelul
energetic E nu coboară decât pe
nivelul  = 1 atunci are loc emisia
unei cuante de energie mai mică.
Restul energiei cuantei incidente este
folosită pentru excitarea vibraţională
a moleculei.

 In cazul când molecula excitată


coboară până la nivelul  = 2 se va
difuza o cuantă de energie şi mai
mică (-2R).

 Un fenomen asemănător se
produce atunci când molecula aflată
pe nivelul  = 1, primind energie este
ridicată la nivelul E’ de unde revine
pe nivelul vibraţional  = 2.
 Există şi posibilitatea ca molecula să se afle pe un nivel vibraţional excitat,
iar după interacţiunea cu cuanta ea să revină pe un nivel cu număr cuantic
de vibraţie mai scăzut.

 Energia eliberată de molecula care trece pe un nivel mai scăzut de energie


este transferată cuantei care va avea deci o frecvenţă mai mare ca frecvenţa
luminii incidente (+R, +2R). 863
 Diferenţa de energie dintre radiaţia incidentă şi radiaţia
împrăştiată (difuzată) se reprezintă prin diferenţa inverselor
lungimilor
 deplasarea Raman exprimată în număr de undă (cm-1) se
calculează după formula:
R(cm-1) = (1/o - 1/R)
unde:
R= deplasare Raman;
o = lungimea de undă incidentă (UV-VIS, laser);
R = lungimea de undă a radiaţiei difuzate.

 frecvenţa Raman, (R) = diferenţa dintre frecvenţa cuantei înainte


şi după ciocnirea cu molecula pe care o excită: R = -.
 Frecvenţa cuantei incidente scade cu valoarea R, corespunzătoare
frecvenţei cuantei din IR care absorbită total ar exercita aceeaşi
vibraţie a moleculei.

864
Ca urmare în spectru Raman apar linii
Stokes şi anti-Stokes situate de-o parte şi
de alta a liniilor Rayleigh.

865
 Procesul unei determinări spectroscopice Raman poate fi prezentat
astfel: proba de analizat se supune acţiunii unei radiaţii
monocromatice intense (laser). Se analizează lumina difuzată de
moleculele probei sub un unghi de 90o..
 In acest caz radiaţia difuzată este perpendiculară pe radiaţia
monocromatică incidentă.

866
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI RAMAN
1. Identificarea unor substanţe medicamentoase
-amfetamina, metamfetamina

- morfina, heroina

867
2. Determinarea formelor dozate contrafăcute
- comprimate acoperite

A = spectrul FT-IR ATR (Atenuated Total Reflectance) al comprimatului acoperit


B = spectrul Raman al aceluiaşi comprimat acoperit

868
- invelisuri de forme farmaceutice

A = spectrul Raman al învelişului suspect


B = spectrul Raman al învelişului autentic
869
- miezul unui comprimat

A = spectrul Raman al miezului comprimatului suspect


B = spectrul Ramana al miezului comprimatului autentic
870
- spectrul Raman al miezului si ingredientelor

871
3. Stabilirea structurilor polimorfe

Carbamazepina există sub două forme polimorfe. Acestea pot


fi diferenţiate cu ajutorul spectroscopiei Raman, sub varianta Fourier
Transform Raman Spectroscopy (FTRS).
Între carbamazepina I şi carbamazepina III există o legătură
prin forma dihidratată.

872
 Spectrul Raman scoate în evidenţă unele benzi ce pot
caracteriza o anumită formă polimorfă.
 Condiţiile folosite pentru spectroscopia FT-Raman cu
temperaturi variabile in situ, scot în evidenţă modificări spectrale
ale dihidraţilor prin încălzire între 60-70°C.
 Prin încălzire dihidraţii revin la forma din care au fost obţinuţi.
Nu s-au observat modificări ale vibraţiilor pe măsură ce încălzirea
continuă până la 170oC.

873
Planul cursului
 SPECTROSCOPIA ATOMICĂ

 SPECTROSCOPIA DE FLUORESCENŢĂ

 SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCENŢĂ

 SPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENTA

 DIFRACTIA CU RAZE X

874
SPECTROSCOPIA ATOMICĂ
ATOMIC SPECTROSCOPY (AS)

 este o metodă de analiză a unor elemente capabile de a fi transformate


în atomi liberi care pot să absoarbă şi să emită energie.
 este utilizată în mod deosebit pentru determinarea unor elemente ca: Mg,
Ca, Li, Zn, Fe, metale grele din forme farmaceutice, lichide biologice şi din
ţesuturi.

Clasificare

- SPECTROSCOPIA DE ABSORBŢIE ATOMICĂ

- SPECTROSCOPIA DE EMISIE ATOMICĂ


Spectroscopie de emisie in flacara
Spectroscopie de emisie optica

875
SPECTROSCOPIA DE ABSORBŢIE ATOMICĂ
ATOMIC ABSORBTION SPECTROSCOPY (AAS)

 se bazează pe fenomenul de absorbţie a radiaţiilor monocromatice


de către atomii unui element aflaţi în stare fundamentală.

 La absorbtia radiatiei, atomul trece din starea fundamentala la


primul nivel de energie.
 Emisia aceleiasi radiatii se datoreaza tranzitiei din starea excitata
in starea fundamentala.

876
 Spectrometru de absorbţie atomică:
 sursă de lumină intensă
 dispozitiv de trecere a substanţei analizate în atomi
 monocromator
 sistem de detecţie
 amplificare
 afişare.

877
 Ca sursă spectrală se foloseşte o lampă cu catod cavitar/scobit care emite
radiaţii intense şi monocromatice cu lungimea de undă caracteristică elementului de
analizat.
 Lampa este alcătuită dintr-un catod în formă de
tub, construit din elementul care urmează a fi
determinat şi dintr-un anod de wolfram; electrozii
sunt plasaţi într-un tub de sticlă, prevăzut cu o
fereastră de cuarţ în direcţia cavităţii catodului,
umplut cu un gaz inert la presiune scăzută (Ar,
Ne).
 în cazul unor elemente volatile (Na, K, Rb, Cs, Hg, Cd, Tl) se pot folosi tuburi cu
descărcări în gaze sau lămpi cu catod cavitar
 Ca instrument de incalzire se foloseşte:
-Arzator

-Cuptor electric de grafit

878
 Dispozitivul folosit pentru detectarea semnalului provenit din flacără este
constituit:
- dintr-un element optic dispersiv (monocromator)
- un detector de radiaţii (fotomultiplicator)
- un sistem de măsurare a valorii absorbanţelor, respectiv a
transmitanţelor.

 Conform legii Lambert - Beer:

A = logIo/I = k·c

unde:
A= absorbanta
Io şi I = mărimile semnalului (intensitatea) în lipsa probei în flacără
şi în prezenţa ei
c = concentraţia elementului respectiv
k = coeficientul care depinde de natura elementului şi de condiţiile
experimentului.

 pentru un element dat, k este o mărime constantă.


 intre A şi concentraţia c există o dependenţă liniară; se alege o astfel de
concentraţie încât A să nu depăşească valoarea 0,3.
879
SPECTROSCOPIA DE EMISIE ATOMICĂ
ATOMIC EMISSION SPECTROSCOPY (AES)

 Se măsoară emisia atomilor excitati, caracteristică fiecărui element.

 Intensitatea luminii emise, Ie, depinde de numărul atomilor care


revin la starea fundamentală si concentratie:

880
METODELE SPECTROSCOPIEI DE EMISIE ATOMICĂ

Spectroscopie de emisie în flacără

Spectroscopie optică de emisie:


 Spectroscopie de emisie în arc/scânteie electrică
 Spectroscopie de emisie în plasmă
 Spectroscopie de emisie atomică cu laser
 Spectroscopie de emisie cu descărcare aureolară

881
Spectroscopia de emisie în flacără
(fotometrie în flacără sau flamfotometrie)

PRINCIPIUL METODEI
• constă în transformarea în vapori atomici a elementelor de determinat
şi excitarea acestora prin introducerea probei de analizat într-o flacără
şi separarea radiaţiilor emise în funcţie de lungimea de undă, urmată
de înregistrarea şi interpretarea acestora.

Design-ul instrumental al spectrometrului de


emisie în flacără 882
Spectroscopia de emisie în arc/scânteie electrică

PRINCIPIUL METODEI
• Excitaţia atomilor poate fi indusă de un arc electric sau descărcare
electrica, urmată de emisie de radiaţie electromagnetică
• Spectroscopia de emisie în scânteie este cea mai reproductivă, dar şi
cea mai puţin sensibilă dintre aceste tehnici.
• Scânteia electrică este o descărcare scurtă şi oscilantă între doi
electrozi aflaţi la o mare diferenţă de potenţial (10.000-50.000 V).
Temperatura scânteii electrice este de ordinul 10.000-30.000 0C.

Schema unui spectrometru de emisie de arc/scânteie 883


Spectroscopia de emisie în plasmă
Avantaje faţă de arcul sau scânteia electrică.
•Temperatura plasmei este de ordinul 9000 K.
•Spectrul obţinut este foarte bogat în linii deoarece tranziţiile electronice ce pot avea loc sunt
foarte numeroase. Aceasta însă face să crească posibilitatea interferenţelor spectrale.
•Din acest motiv, spectrometrul utilizat trebuie să aibă o rezoluţie înaltă.
•Sensibilitatea şi exactitatea sunt foarte bune.
•Intensitatea radiaţiei emise de un element este funcţie liniară de concentraţie într-un interval
larg.
•Pot fi analizate probe gazoase sau lichide (în unele cazuri şi probe solide pulverulente)
•Cea mai des întâlnită metodă comercială foloseşte pentru a excita proba o plasmă cuplată
inductiv (ICP).

Spectrometrul de emisie cu
plasmă cuplată inductiv,
utilizând sistemul de dispersie
a luminii monocromator (sus)
sau policromator (jos)

884
Spectroscopia de emisie cu laser
 se elimină interferenţele datorate electrozilor din cadrul variantelor în arc sau
scânteie.
 poate fi folosită la analiza unor zone foarte mici de pe suprafaţa unei probe care,
observate la microscop, prezintă aspecte diferite de restul probei.
 permite analiza interiorului celulelor individuale chiar în organismele vii.
 se pot analiza de asemenea incluziuni în metale şi minereuri.

Spectroscopia de emisie cu descărcare aureolară


(GD-OES, Glow Discharge - Optical Emission Spectroscopy)
• provoacă, în vidul care mai conţine urme de
argon, o descărcare în arc.
• permite caracterizarea privind compoziţia
chimică în funcţie de distanţă (în adâncime) a
materialelor compozite - straturi obţinute prin
tratamente termice sau alte prelucrări ale
suprafeţele exterioare de pe piesele solicitate în
condiţii extreme
• proba poate consta şi din pulberi sau chiar din
materiale izolatoare
Sursa pentru obţinerea descărcării
aureolare în GD-OES 885
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI ATOMICE

ANALIZA CALITATIVA
1. Identificarea componentului major
2. Identificarea impurităţilor

ANALIZA CANTITATIVA
• Intensitatea luminii absorbite/emise este proporţională cu
concentraţia elementului de dozat.

1. calibrare cu standard extern


2. metoda adausului standard
3. metoda curbei de calibrare

886
Limitele de detectie in SAA si SEA ale unor
elemente de mare interes
Elementul Limita de detecţie (μg) λ (nm)
SAA SEA
Al 0.1 0.08 309.3
- 396.2
Ag 0.001 0.01 328
Au 0.3 - 242.8
3.0 267.6
Ca 0.003 0.0003 422.7
Cd 0.001 - 228.8
Cu 0.006 0.01 324.8
Hg 0.8 15.0 253.6
Pb 0.001 - 217
K 0.004 0.00008 766.5
Fe 0.005 - 248.3
Li 0.001 0.0001 670.8
Mg 0.004 0.1 285.2
Mn 0.002 - 279.5
Co 0.0007 - 240.7
Na 0.001 0.0008 589
Zn 0.001 15.0 213.9
As 0.25 - 193.7
Bi 0.046 - 223.1
Cr 0.005 - 357.9
Se 0.36 - 196
Exemple
a) analiza calitativă si cantitativă a metalelor, esenţiale şi toxice, din fluidele
biologice şi din ţesuturi
b) analiza fluidelor biologice pentru a determina contaminarea cu metale din
mediul înconjurator (Hg), dar şi pentru a testa prezenţa Al, Pb, Cd, Ni şi a altor
metale în ser şi ţesuturi
c) identificarea şi determinarea cantitativa a conţinutului în: Al, Ca, Cd, Co, Cr,
Cu, Fe, Li, Mn, Ni, Pb, V şi Zn din rădăcinile şi tinctura de Valeriana
d) măsurarea analitică a concentraţiilor elementelor Na, K, Li, Mg, Ca, Al şi Zn
e) determinarea sodiului şi potasiului din soluţiile perfuzabile
f) determinarea contaminării cu aluminiu din soluţiile perfuzabile pentru nutriţia
parenterală
g) determinarea urmelor de impurităţi metalice, Pb, Sb, Bi, Ag, Ba, Ni şi Sr, în
produsele farmaceutice

888
SPECTROSCOPIA DE FLUORESCENŢĂ
FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (FS)

 Analiza de fluorescenţă este o metodă care constă în măsurarea


luminii emise de moleculele unei substanţe supuse fenomenului
de excitare (prin absorbţie) cauzat de o radiaţie incidentă.

 O moleculă poate fi excitată din starea electronică fundamentală


într-o altă stare prin absorbţie de energie. Multe molecule sunt
capabile să emită această energie sub formă de radiaţie, astfel
întorcându-se în starea fundamentală. Radiaţia emisă se
numeşte fluorescenţă.

889
 Starea electronică fundamentală este un singlet (singletul fundamental).
 Procesul de excitare conduce la tranziţia unui electron de pe un orbitalul al starii
fundamentale pe orbitalul neocupat cel mai scăzut al singletului excitat.
 O moleculă în starea de singlet S excitat poate să se întoarcă la singletul
fundamental prin emiterea de radiaţii şi execută o tranziţie radiativă permisă. Dacă
această tranziţie este permisă, timpul de viaţă al singletului excitat este extrem de
scăzut, de ordinul 10-8 sec.
 Aceasta înseamnă că fluorescenţa încetează dacă sursa de excitaţie este
întreruptă.

Stările electronice 890


 Dacă excitarea moleculelor se face cu radiaţii luminoase din domeniul UV sau VIS
acestea emit radiaţiile primite în totalitate sau parţial.
 Maximul emisiei unui compus fluorescent este situat la o lungime de undă mai
mare decât cea corespunzătoare maximului de absorbţie. Intensitatea fluxului
luminos descreşte atunci când excitaţia încetează.
 Spectrele de fluorescenţă şi cele de excitaţie pot fi considerate imagini în oglindă.
 Pentru ca o moleculă să prezinte fluorescenţă este necesar ca molecula excitată
să se întoarcă la starea fundamentală prin intermediul unei tranziţii radiative.
 O condiţie necesară pentru producerea fluorescenţei este desigur absorbţia
puternică a luminii de către moleculă.
 Structurile aromatice, heterociclice şi înalt conjugate sunt apte să inducă moleculei
propietatea de fluorescenţă.
 Modificările structurale care cresc intensitatea absorbţiei pot mari intensitatea
fluorescenţei.

891
Mărimi caracteristice

 Dacă concentraţia substanţei absorbante este foarte mare toată lumina incidentă
poate fi absorbită de primul strat de soluţie şi puţină lumină va pătrunde în porţiunile
mai îndepărtate ale probei. Fluorescenţa unei astfel de probe va fi neuniformă şi nu va
fi proporţională cu concentraţia. De aceea concentraţiile soluţiilor substanţelor
fluorescente sunt aduse întotdeauna la nivele foarte scăzute pentru a evita absorbţia
unei fracţiuni apreciabile din fascicolul incident.
 Dacă F este intensitatea de fluorescenţă (intensitatea radiaţiei emise) şi Iab
intensitatea radiaţiei absorbite, randamentul cuantic al fluorescenţei, , se defineşte:

 Randamentul cuantic, , poate lua valori între 0 - 1.

 Intensitatea luminii emise (transmise) scade exponenţial după încetarea excitaţiei


conform ecuaţiei:
It = I0.e-kt
unde:
It = intensitatea luminii transmise
I0 = intensitatea luminii incidente
k = constantă

 Intensitatea luminii absorbite este egală cu diferenţa dintre intensitatea luminii


incidente şi intensitatea luminii transmise:
Ia = I 0 - It 892
 Pe baza randamentului cuantic se poate calcula intensitatea fluorescenţei:
F = .Ia = (I0-It)
de unde:
F = .I0(1-It/I0)
Pentru corelarea intesităţii de fluorescenţă cu concentraţia se ţine seama de
absorbanţă care este egală cu raportul logaritmic al intensităţii radiaţiei incidente şi
intensitatea radiaţiei transmise.
A =logI0/It
sau
It/I0 = 10-A
 Intesitatea de fluorescenţă devine:
F = .I0(1-It/I0) = .I0(1-10-A)
 Deoarece în spectroscopia de fluorescenţă se lucrează cu soluţii foarte diluate,
absorbanţa A are valoarea zero şi (1-10-A) = A, intensitatea de fluorescenţă ia valoarea:
F = .I0.A
 Din spectrometria UV-VIS se ştie că A = .l.c şi atunci
F = .Io..l.c
Notând: K = ..l
F = K.I0.c
 Din această relaţie se constată că intensitatea de fluorescenţă este proporţională
cu concentraţia substanţei analizate.

 Intensitatea de fluorescenţă este proporţională şi cu absorbţia moleculară.


Pentru acest motiv este necesar să se folosească ca radiaţie excitantă lumina
corespunzătoare maximului de absorbţie. 893
APARATURA

 Măsurarea intensităţii fluorescenţei se face cu ajutorul spectrofluorimetrelor.


 Sursa luminoasă trebuie să fie intensă şi foarte stabilă deoarece F depinde direct
de Io. Se folosesc de obicei lămpi cu arc cu vapori de mercur sau xenon.
 Lampa de xenon emite uniform radiaţii pe un domeniu larg de lungimi de undă
 Emisiunea lămpii cu mercur este concentrată în câteva benzi foarte intense,
valorile maxime ale lungimii de undă a radiaţiei excitante fiind 254 şi 365 nm.
 Pentru a asigura specificitatea excitaţiei şi a reduce aberaţiile luminii, din radiaţia
emisă de sursa luminoasă este selectată o bandă de radiaţie cu ajutorul
monocromatorului de excitaţie.

894
 Lumina excitantă trece apoi în celula cu probă. Celulele şi solvenţii sunt aleşi în mod
corespunzător.

 Cuvele (celulele) de sticlă sunt folosite pentru cele mai multe analize de fluorescenţă, iar
cele de cuarţ sunt indicate sub 320 nm.

 Măsurarea intensităţii fluorescenţei pe direcţia de propagare a radiaţiei excitante se face cu


ajutorul unui detector, după trecerea prin monocromatorul de emisie dispus perpendicular.

 Lumina fluorescentă cade pe o celulă fotoelectrică sau pe un fotomultiplicator, se produce


un semnal electric care este amplificat şi măsurat cu un instrument de măsură gradat direct în
intensităţi de fluorescenţă.

 Aparatele moderne au înlocuit filtrele primare şi secundare cu monocromatoare care permit


selectarea unei benzi foarte înguste. Aceste instrumente, sunt capabile să măsoare spectre de
excitaţie şi de fluorescenţă în acelaşi mod în care spectrofotometrul poate fi folosit pentru
determinarea spectrelor de absorbţie.

895
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE FLUORESCENŢĂ

 Aplicaţii calitative
Fluorescenţa prin selectivitatea sa (o singură λ maximală şi de
emisie pentru fiecare moleculă într-un solvent definit) este un instrument
spectroscopic puternic pentru identificarea moleculelor substanţelor
medicamentoase.

 Aplicaţii cantitative
Marea sensibilitate a metodei justifică aplicaţia foarte largă în
domeniul determinărilor cantitative ale medicamentelor. Pot fi luate în
consideraţie două cazuri:
a) determinarea cantitativă a medicamentelor fluorescente
b) determinarea cantitativă a medicamentelor devenite fluorescente
prin reacţii chimice (derivatizare).

896
a) Determinarea cantitativă a medicamentelor fluorescente
 Se poate lua în considerare fluorescenţa nativă a unor compuşi ca:
hidrocarburi aromatice, chinoleine, tetracicline, chinina şi derivaţii săi.

b) Determinarea cantitativă a medicamentelor devenite fluorescente


prin reacţii chimice
 Relativ puţine molecule de interes farmaceutic prezintă o fluorescenţă
nativă. Progresele farmacocinetice au incitat analiştii să dezvolte reacţii
chimice care să permită o detecţie fluorimetrică sau pentru dozări directe, fie
pentru detecţia în cromatografia de lichide.
 Numărul şi varietatea reacţiilor exclud un catalog exhaustiv şi din acest
motiv prezentăm câteva exemple.

897
- Derivarea prin reacţii chimice ce implică reactivi
nefluorescenţi
Apariţia fluorescenţei se poate datora ciclizării suplimentare
ce favorizează delocalizarea electronică:
Vitamina B6 (piridoxalul)

Vitamina B1 (tiamina)
- reacţia tiocromului

898
Adrenalina

899
- Derivarea prin reacţie cu un cromofor fluorescent
Acest tip de reacţie tinde să înlocuiască reacţiile precedente
care au inconvenientul de a modifica în totalitate structura moleculei
de dozat.
In farmacocinetică conservarea integrităţii moleculei este o
necesitate mai ales în studiul metabolismului. Dezvoltarea metodelor
cromatografice de lichide justifică intensitatea cercetărilor în materie
de markeri fluorescenţi.
Procedeul se aplică pentru:
- amino-acizi (sunt derivatizaţi cu corură de dansil şi
ortoftalaldehida;
- acizi şi alcooli cu catenă scurtă.

900
Markerii fluorescenţi introduşi pe molecula unui acid sau
alcool nefluorescent contribuie la transformarea acestora în
molecule fluorescente.
- 3-brommetil,6,7-dimetil-cumarina

- hidroximetilantracenul

- reacţia Hantzsch (condensarea formaldehidei cu acetilacetona în


prezenţa amoniacului)

901
SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCENŢĂ
CHEMILUMINESCENCE SPECTROSCOPY

Desemnează emisia de lumină ce însoţeşte desfăşurarea unor reacţii


chimice.
Se caracterizează prin producerea unei specii moleculare fluorescente într-
o stare electronică excitată care revine la starea fundamentală prin emisia
unui foton.

Caracteristici:
Sensibilitate - se explică prin progresul tehnologiei fotomultiplicatoarelor
cât şi prin calităţile inerente ale chemiluminiscenţei comparativ cu
fluorescenţa, concurenta sa directă. În fluorimetrie, detecţia unei emisii
foarte slabe este împiedicată/deranjată de zgomotul de fond, generat de
fluctuaţiile de energie ale sursei şi de difuzia Raman. Chemiluminiscenţa
care înlocuieşte excitaţia fotonică printr-o excitaţie chimică, nu se mai
confruntă cu aceste probleme, fiind posibilă măsurarea unei foarte slabe
emisii de lumină.

Selectivitate - îşi are originea în reunirea obligatorie a mai multor


proprietăţi fizice sau chimice pentru ca o moleculă să fie chemiluminiscentă.
Poate fi modulată în funcţie de condiţiile experimentale ca pH-ul, natura
solventului, prezenţa catalizatorilor, natura şi concentraţia reactivilor,
natura cineticii acestui fenomen.
902
Reacţii de chemiluminiscenţă

Luminolul
Luminolul (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) şi analogii
săi sunt chemiluminiscenţi în mediu alcalin şi în prezenţa unor
oxidanţi. Mediul poate fi apos sau organic (DMSO). Specia
responsabilă de emisie este dianionul ftalat, ce produce o lumină
albastră. Această reacţie este catalizată de numeroase metale,
complecşii lor şi de metaloproteine.

903
Lucigenina
Lucigenina (dinitrat de N,N’-9,9’-dimetilbisacridină) şi
analogii săi, în mediu alcalin şi în prezenţa apei oxigenate, sau
din contră, în prezenţă de reducători, conduce la emisia de
lumină albastră sau verde, funcţie de solvenţi prin intermediul N-
metilacridonei.

904
Peroxioxalatul
Numeroşi derivaţi ai acidului oxalic (cloruri, esteri, amide) în
prezenţa H2O2 conduc la peroxioxalat, intermediar instabil cu o
energie mare. Acesta formeaza un complex cu fluoroforii uşor
oxidabili prin transfer de sarcină. Apoi, ruperea peroxioxalatului
furnizează fluoroforul excitat (fluorofor*) care revine la starea iniţială
cu emitere de lumină.

905
Alţi derivaţi ai acidului oxalic:
- TCPO - bis(2,4,6-triclorfenil)oxalat

- ester difenil oxalic ( Cyalume)

Mecanism:
Ester oxalic + H2O2  Intermediar(I) + produşi
Intermediar(I) + Fluorofor(F)  Fluorofor*(F*) + produşi
Fluorofor*  Fluorofor + h (lumină)

906
APLICAŢIILE CHEMILUMINISCENŢEI

1. Aplicaţii în titrimetrie

Titrimetria acido-bazică
•Determinarea punctului de echivalenţă prin chemiluminiscenţă se bazează
pe emisia de lumină în mediu alcalin prin indicator, detecţie care poate fi
vizibilă sau fotometrică.
•Avantajul acestui tip de indicatori este că permit titrarea soluţiilor foarte
colorate sau tulburi.
•Exemple indicatori chemiluminiscenţi: sisteme luminol-H2O2-
catalizator, lucigenină-H2O2, luminol sau lucigenină-fluoresceină-H2O2.
Toate aceste sisteme nu pot fi utilizate în prezenţa metalelor grele care
descompun peroxidul de hidrogen.

Titrimetria redox
•Punctul final de echivalenţă este determinat în acest caz de emisia de
lumină care se produce când mediul este oxidat.
•În general, agentul titrant este oxidant, în timp ce indicatorul se găseşte în
mediul conţinând reducătorul.
•Exemple: Luminolul este utilizat, în combinaţie cu hipoclorit sau
hipobromit ca agent titrant în mediu alcalin, pentru determinarea ionilor de
tipul As3+, Sb3+, SCN-, CN-, S2O32-, SO32-, S2- pot fi determinaţi cu o exactitate
(0,05%) şi o precizie (0,02%) excelente.
Lucigenina este asociată cu H2O2 ca agent titrant, în mediu alcalin.
Permite determinarea halogenurilor în apa de brom sau de clor. 907
2. Aplicaţii în spectroscopie

•prin măsurarea emisiei de chemiluminiscenţă a reacţiei, emisă proporţional


cu concentraţia substanţei de dozat, când toţi ceilalţi cofactori ai reacţiei
sunt excluşi.
•Exemple:
- Determinarea metalelor: foarte mulţi cationi metalici influenţează
sistemul luminol-H2O2. Unii sunt inhibitori ca V3+, Ce4+, Th4+, ZrO2+, alţii
sunt activatori ca Fe3+, Cu2+, Co2+, Cr3+, Mn2+, Hg2+.
Cantităţile minime detectabile depind de sistemul de detecţie utilizat, dar cu
un fotomultiplicator ele sunt în general inferioare nanogramelor şi pot atinge
valori de picograme (10-12) ca în cazul Fe2+ sau Co2+.
-Aspectul cel mai interesant este selectivitatea pe care o oferă detecţia prin
chemiluminiscenţă şi care permite simplificarea considerabilă a
pretratamentului eşantionului. De exemplu: doar Fe2+ este capabil să
activeze reacţia luminol-O2 în timp ce alte metale necesită prezenţa H2O2.

- Determinarea substanţelor organice:


- Reacţia luminol-H2O2 este catalizată de metaloproteine ca feritina,
citocromii, mioglobina, hemoglobina, catalaza etc. Astfel, se pot măsura
cantităţi de proteine inferioare ng.
- S-a studiat chemiluminiscenţa unor medicamente în prezenţa KMnO4.
Rezultate bune: morfină, dihidromorfină, nor-morfină, N-oxid-morfină şi
buprenorfină.
908
3. Aplicatii in cromatografie
•Chemiluminiscenţa în cromatografia de lichide
-Detecţia prin chemiluminiscenţă implică amestecarea la ieşirea din coloană a
fluoroforului cu reactivii de excitaţie.
-Daca este necesară derivarea substanţei de determinat, reacţia de grefaj prin fluorofor
poate să fie selectivă. Este cazul clorurii de dansil care derivează aminele primare, dar
şi pe cele secundare şi fenolii. Limita de detecţie a derivaţilor formaţi este adesea foarte
joasă (de ordinul pg), dar este foarte rar posibil să se grefeze 1 pg de substanţă de
dozat.
-Factorul limitant al metodei nu este detecţia derivatului (fluorofor-substanţă de
dozat), ci formarea sa. În aceste condiţii, limita de detecţie reală a metodei este mai
puţin favorabilă. Din acest motiv, aplicaţiile cele mai interesante, din punct de vedere al
controlului, privesc determinările realizabile direct fără derivatizare.

•Chemiluminiscenţa în gaz-cromatografie
-Gaz-cromatografia permite determinarea directa directă a unor compuşi pe baza
reacţiei de chemiluminiscenţă.
-Exemple: Compuşii sulfuraţi sunt detectaţi în flacăra reducătoare (bogată în
hidrogen) unde sunt în primul rând reduşi la sulf elementar, apoi coliziunea între 2
atomi produce o moleculă de sulf în stare excitată, ce revine la starea fundamentală
emiţând o bandă caracteristică la 340-400 nm.

909
Metode ce necesită o derivatizare
Prin modificare chimică, multe substanţe devin fluorescente
ce pot fi apoi determinate prin chemiluminiscenta in urma unor
reactii cu derivati oxalici, H2O2 etc.

a = dansil (sulfonat de dimetilaminonaftalen)


b = luminarina (chinolizincumarina)
c = reactiv pe bază de rodamina B
d = N-(4aminobutil)-N-etilisoluminol

910
Principalele reacţii şi compuşii detectabili prin chemiluminiscenţă

911
SPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENŢĂ
PHOSPHORESCENCE SPECTROSCOPY (PHS)

Fosforescenţa ca şi fluorescenţa este un fenomen al


spectroscopiei de emisie ce implică intervenţia nivelurilor electronice
ale atomilor şi moleculelor.
Principii generale
Fosforescenţa constă în emisia unei radiţii de către o
moleculă excitată. Această emisie de lumină traduce revenirea
moleculei excitate la starea fundamentală.
Teoria cuantică defineşte doă tipuri de stări excitate:
- starea singlet (S) caracterizată prin aceea că toţi electronii
moleculei sunt pari, notaţi ;
- starea de triplet (T) caracterizată prin elctroni cu spini pereche,
notaţi , .

912
diagrama lui Jablonski - Prin absorbţie de energie se
trece de la starea fundamntală
la singlet excitat (S0→S1).
Molecula este adusă într-o
stare electronică excitată
funcţie de cantitatea de energie
primită.
- După conversia internă,
molecula va trece de la starea
S1 la starea de triplet excitat T1.
Prin revenirea la starea
fundamentală (T1→S0) se
produce fenomenul de
fosforescenţă.
- Tranziţia T1S0 este numită “interzisă” căci probabilitatea ca ea să se
producă este foarte redusă (în raport cu tranziţia S1S0 din
fluorescenţă).
- Astfel se explică de ce foarte puţine molecule sunt fosforescente.
Fenomenul T1S0 se poate derula într-un timp relativ lung (până la mai
multe minute).
- Pe de altă parte, nivelul de energie al stării de triplet fiind inferior celui
de singlet excitat corespunzător, emisia de fosforescenţă se va situa
la frecvenţe inferioare celor ale emisiei de fluorescenţă. Astfel
fosforescenţa se va situa adesea în domeniul VIS.
913
Caracterizarea fosforescenţei
Fosforescenţa poate fi caracterizată prin:
- spectrele de emisie şi excitaţie;
- prin randamentul cuantic (P);
- durata de viaţă (P);
- polarizarea sa.
Spectrele de emisie şi de excitaţie
Spectrele de fosforescenţă furnizează informaţii importante
pentru determinarea directă a energiei stării de triplet (ET) a
moleculei. Această măsurătoare se relizează la 77oK sau -196oC;
energia se exprimă în kcal.mol-1 sau în eV.
Randamentul cuantic de fosforescenţă (P)
Analog cu fenomenul de fluorescenţă, randamentul cuantic
de fosfosforescenţă (P) este definit prin relaţia:

914
În concordanţă cu durata de viată relativ lungă, starea T1
este subiectul unei dezactivări neradiative importante deoarece
molecula este în stare gazoasă sau în soluţie; astfel (P) tinde spre 0.
Aceste procese inhibitoare pot fi eliminate sau limitate prin
utilizarea de solvenţi vâscoşi (glicerina), utilizarea unor temperaturi
de bază (azot lichid -77oK) care rigidizează mediul, cu ajutorul unor
suporţi solizi sau al soluţiilor micelare.

•Durata de viaţă a fosforescenţei (P)


Timpul de viaţă (P) este definit ca intervalul de timp în care
emisia s-a diminuat cu valoarea 1/e.

•Intensitatea de fosforescenţă la timpul (t) va fi dat relaţia:

unde:
IP = intensitatea de fosforescenţă la t=0

•Polarizarea
Utilzarea luminii polarizate în excitaţie şi emisie permite
explorarea fenomenului de fosforescenţă. 915
APARATURA

Schema de funcţionare
a unui fosforimetru:

•Sursa este constituită dintr-o lampă de xenon sau o sursă laser.


•Detectorul cel mai folosit este tubul fotomultiplicator (Photomultiper
Tub –PMT)
Luminometrele moderne sunt aplicate pentru a lucra în acelaşi timp în
fluorescenţă şi în fosforescenţă, iar timpul de latenţă (te) şi timpul de
măsură (tm) pot fi alese de operator în funcţie de cunoştinţele sale în
ceea ce priveşte durata de emisie a lămpii de excitare, dar şi în funcţie
de P.

916
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE FOSFORESCENŢĂ
-acidul p-aminobenzoic din amestecuri de vitamine,
-teofilina din gelule sau comprimate după extracţia cu o soluţie apoasă de
iodură de potasiu (efectul de atom greu).
-benzodiazepinele pot fi dozate în acelaşi mod în diferite forme solide
(comprimate, gelule).
-Alte substante: acid salicilic, amitriptilina, barbituricele, cocaina,
amfetamina etc.

917
DIFRACŢIA RAZELOR X
X-RAY DIFFRACTION (XRD)

Radiaţiile electromagnetice cu lungimi de undă cuprinse între 10 –


0,01 nm, 10-8-10-6 cm, corespunzând frecvenţelor de ordinul 30 -30000 PHz
(petahertz=1015 hertz) sunt cunoscute sub denumirea de raze X.

Metodele de analiză care folosesc razele X se bazează pe 3


fenomene distincte: emisia, absorbţia şi difracţia.

Razele X sunt produse prin accelerarea


electronilor din stratul profund al
atomului unor metale ţintă cu un foton
incident de înaltă energie (stratul K).

Astfel se emite energie la diverse lungimi


de undă: molibden (0,07 nm), crom
(0,23 nm), cupru (0,15 nm), cobalt (0,18
nm).

918
- Difractia cu raze X - fenomenul care se produce atunci cand un
fascicol de radiaţii X trece printr-un mediu.
- Un fascicul de raze X paralel, monocromatic, este refractat de către
straturile succesive de atomi dintr-un cristal A, B, C, D.

919
- Cristalul acţionează ca o reţea formată din
planuri paralele (planuri Bragg),
echidistante (d=constanta reticulară), formate
din atomi sau ioni.
- Dacă razele reflectate de pe planuri diferite se
întâlnesc, pentru ca să se amplifice, vorbim de
reflexie Bragg şi se obţine o imagine de
difracţie. Intărirea undelor are loc când raza
R1 reflectată întâlneşte raza R2 reflectată
astfel că diferenţa de drum parcursă de raza
R2 să fie un multiplu întreg (n) al lungimii de
undă. În acest caz:

- Legea lui Bragg se utilizează la determinarea


constantei de reticulare, a dimensiunilor
celulei elementare şi, cunoscând densitatea
corpului la determinarea greutăţii
moleculare.
- Nu există două substanţe în stare cristalină
în care distanţa dintre planurile de reflexie să
fie identică în toate direcţiile. Aşadar, aşezând
un cristal în toate unghiurile posibile faţă de
fasciculul de raze X, se obţine o imagine
caracteristică.
920
APARATURA
spectrometru de
tip Bragg

Difractograma

Difractograma înregistrează pe ordonată intensitatea relativă a radiaţiei I/Io


şi pe abscisă valorile unghiului de difracţie sau de reflexie selectivă exprimate
în grade.
921
APLICAŢIILE DIFRACŢIEI RAZELOR X
1. Identificarea compuşilor medicamentoşi
- morfina şi heroina

- furosemid

922
2. Identificarea compusilor din amestecuri

923
3. Cercetarea structurilor polimorfe
•Polimorfismul este foarte comun substanţelor medicamentoase şi acest
lucru se observă în mod deosebit la steroizi (67%), sulfonamide (40%) şi
barbiturice (63%).
•Formele polimorfe arată diferenţe evidente în proprietăţile fizico-chimice ca:
densitate, duritate, higroscopicitate, viteza de solubilizare, stabilitate
termică etc. De asemenea, formele polimorfe sunt implicate în cazul
suspensiilor şi din punct de vedere al biodisponibilităţii.

4. Determinarea structurii cristaline a proteinelor


- structura mioglobinei (3D-alfa helix)

924
5. Alte aplicaţii

•Analiza calitativă şi cantitativă a fazelor compuşilor anorganici, organici şi


a materialelor:
- compuşi chimici, medicamente, biomateriale, materiale plastice;
- minereuri, minerale, ceramice, ciment, materiale de construcţii.

•Determinarea texturii materialelor policristaline

•Determinarea orientării materialelor monocristaline

•Determinarea proprietăţilor microcristaline (mărimea cristalelor, mărimea


distribuţiei, microdeformarea)

•Determinarea vitezei de formare a fracţiunilor amorfe şi cristaline

•Determinarea parametrilor reţelei cristaline.

925
SPECTROSCOPIA DE MASA
MASS SPECTROSCOPY (MS)

926
Definitie:
Spectroscopia de masă este o metodă instrumentală de analiză
care se bazează pe fragmentarea moleculelor substanţelor organice sub
acţiunea unor radiaţii cu energii mari de până la 100 eV, iar din analiza
- numărului
- sarcinii
- masei fragmentelor rezultate - se obţin informaţii asupra
• structurii
• identităţii substanţelor cercetate.
Datorită acumulării de energie are loc fragmentarea moleculelor
cu ruperea unor legături interatomice, proces prin care rezultă :
- mai ales ioni pozitivi (rar negativi)
- radicali
- ioni radicali
- molecule neutre.
Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a
structurii moleculare.

927
Pentru a se produce fragmentarea moleculelor, substantele
analizate se aduc in stare gazoasa si se introduc in camera de ionizare in
care se produce fragmentarea.
Dacă un electron are o energie suficientă să scoată un electron de
valenţă dintr-o moleculă neutră dă naştere la un ion molecular pozitiv, cu
număr impar de electroni.

Fragmentele sunt accelerate de un camp electric.


Ionii care provin din camera de ionizare sunt trecuţi în analizorul
de masă unde sunt separaţi cu ajutorul unui câmp magnetic, care deviază
particulele în funcţie de raportul m/z, în care m = masa exprimată în
unităţi atomice, iar z este sarcina electrică (se notează şi cu m/e). 928
1. introducerea probei şi aducerea analiţilor în stare de vapori
2. ionizarea moleculelor în stare gazoasă cu formarea unui amestec statistic de ioni
proveniţi din fragmentarea moleculelor
3. accelerarea ionilor şi focalizarea lor în funcţie de raportul m/z, prin utilizarea unor
lentile electronice, pentru mărirea energiei lor cinetice
4. separarea fasciculelor de ioni cu acelaşi raport m/z prin ”filtrare” în analizorul de
masă, aparatura automatizată putând conţine mai multe tipuri de analizoare legate
în serie
5. detecţia ionilor separaţi de către un detector care cuantifică sarcinile electrice, prin
măsurarea curenţilor ionici daţi de fluxurile separate care au acelaşi m/z şi care sunt
proporţionale cu abundenţa (concentraţia) lor
6. înregistrarea spectrului de masă, respectiv a abundenţei ionilor, în funcţie de m/z,
prin urmare, este vorba de intensitatea fiecărui curent ionic care este funcţie de m/z.

929
Se obţin spectre de masă ce sunt reprezentarea abundeţei fiecărui
tip de ion format, în funcţie de m/z. Abundenţa ionilor poate să fie
prezentată în două moduri:
- sub forma unui spectru continuu, în care semnalele apar sub formă de
picuri cu lărgimi care depind de tipul de aparat. Aparatele de înalta
performanţă pot detecta mase ionice cu o precizie mai mare decât a zecea
parte dintr-un milion (10-5 Da). În prezent limitele de masă ale aparatelor,
care au fost constant îmbunătăţite, pot ajunge la 10-6 Da;
- sub forma unui spectru de fragmente, numit şi spectru de bare, a căror
intensitate se exprimă în procente în raport cu picul cel mai intens
- picul cel mai intens = pic de bază = corespunde ionului molecular cu cea
mai mare abundenţă, numit şi ion de bază.

930
Reprezentarea spectrelor de masă:
a) spectrul de bare al metanolului;
b) spectrul de masă continuu al unei substanţe organice oarecare

931
Diagrama unui spectrometru de masă
Sistem de presiune inalta

Sursa Analizor Sistem


Injector de masa Detector date
de ioni

Camera de ionizare 932


FRAGMENTAREA MOLECULELOR
Spectrometria de masă se bazează pe ionizarea şi fragmentarea
moleculelor, prin acumularea de energie până la un nivel la care se
produce ruperea unor legături intermoleculare, concomitent cu formarea
unor fragmente, caracterizate prin raportul dintre masa şi sarcina lor,
m/z.
Se formează un amestec de:
 ioni pozitivi (care au cea mai mare abundenţă)
 ioni negativi (mai rar şi cu abundeţă mai mică)
 radicali neutri din punct de vedere electric
 radicali ionici.
Procesul de ionizare se produce în camera de ionizare, putându-se
utiliza mai multe procedee de fragmentare a moleculelor gazoase prin:
 impact electronic sau chimic
 bombardare cu atomi rapizi
 prin impact cu impulsuri laser de scurtă durată etc.

933
CĂI DE FRAGMENTARE
1. fragmentare homolitică, , fisiune 

2. fragmentare intramoleculară cu rearanjare de legături

3. fragmentare heterolitică a legăturilor

Ionii produşi de ionul molecular pot ei înşişi să se fragmenteze prin aceste


metode. 934
Poziţiile de fisiune sunt adesea indicate pe o formulă moleculară
cu numerele de masă ale ionilor.

În sistemele nesaturate şi aromatice, localizarea sarcinii nu este


aşa de clară.
Fisiunea  este posibilă când se poate stabiliza ionul rezultat.

935
• Substituenţii aromatici se rup în poziţia  faţă de nucleul aromatic cu
producerea ionului de benziliu care se rearanjează mai stabil sub forma
ionului tropiliu.

Surse de ionizare

1. Ionizarea prin impact electronic (Electron ionisation - EI)


2. Ionizarea chimicã (Chemical ionisation – CI)
3. Bombardarea cu atomi rapizi (Fast Atom/Ion Bombardment – FAB)
4. Ionizarea prin desorbţie laser asistată de o matrice (Matrix assisted
laser desorption ionization - MALDI)
5. Ionizarea la Presiune Atmosferică (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization - APCI)
6. Ionizarea prin electrospray (Electrospray Ionization - ESI)
936
Ionizare prin impact electronic
- Moleculele intră în camera de ionizare
unde există un vid înaintat de cca.10-6
torri.
- Moleculele de analit se ciocnesc cu un
flux îngust de electroni, generat de un
filament de reniu sau wolfram încălzit în
vid, de un curent de 50-100 mA.
- Electronii sunt acceleraţi de o diferenţă
de potenţial de 10-100 eV.
- Prin coliziunea unei molecule cu un
electron se produce un ion molecular.

937
Ion molecular

938
IONIZAREA CHIMICĂ
CHEMICAL IONISATION (CI)

 Este un procedeu mai blând, necesitând energii mai mici.

 Moleculele gazoase de substanţă analizată se introduc în camera de


ionizare împreună cu un gaz reactiv (metan, izopropan, amoniac).

 Gazul reactiv se introduce în cantitate mai mare în raport cu substanţa


de analizat, fapt dovedit prin presiunile lor relative egale cu cca. 10-6 torri
pentru proba de analizat si 0.3-3 torri pentru gazul reactiv.

 Acest amestec este bombardat cu un flux de electroni, care produce


numai fragmentarea moleculelor de gaz reactiv, aflat în amestec în
proporţie mult mai mare decât proba.

 Ionii rezultaţi din gazul reactiv reacţionează cu moleculele neionizate ale


acestui gaz, dând o plasmă, care conţine numeroşi ioni reactivi.

939
 În cazul utilizării metanului ca gaz reactiv rezultă:

 Ionii formaţi ai gazului reactiv sunt acizi Brönsted şi atacă moleculele de


analizat (AB) pe care le ionizează, fomându-se ioni pseudomoleculari,
trecându-se mai intîi prin faza de aduct.

940
Experimental s-a constatat că:
 ionizarea prin impact electronic, mai energică, conduce la spectre mai
bogate în benzi sau picuri şi implicit mai greu de interpretat
 ionizarea chimică, mai blândă furnizează spectre mai simple şi mai
uşor de interpretat.

Adesea cele două spectre sunt complementare şi, prin


analizarea şi compararea lor, se pot obţine informaţii mai complete şi
mai sigure în beneficiul analizei.

941
BOMBARDAREA CU ATOMI RAPIZI
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)

 este un procedeu de ionizare în care molecula de compus organic este


supusă unui impact cu atomi neutri sau grei, cum sunt atomii de argon
sau de xenon, de mare viteză

 moleculele gazoase, (ex. argon), sunt ionizate prin impact electronic, iar
ionii de argon formaţi sunt conduşi în camera de coliziune, în care
ciocnesc alţi atomi neutri de argon, pe care-i trimit către proba de
analizat.

 proba de analizat = este o dispersie în glicerină, alcool 3-nitrobenzilic


sau în dietanolamină (matrice), depusă la extremitatea unui suport
introdus în sursă.

Acest tip de ionizare întrebuinţat in special pentru compuşii care


nu pot fi aduşi în stare gazoasă.

942
În determinările FAB bombardarea cu ioni rapizi se poate face şi cu
ioni de cesiu (Cs+):

943
pulsatii laser

IONIZAREA PRIN DESORBŢIE ASISTATA LASER


DINTR-O MATRICE
MATRIX ASSISTED LASER DESORBTION
IONISATION (MALDI)

 compusul de analizat este amestecat cu


acid dihidroxibenzoic (este vorba de o matrice
solidă), iar o cantitate mică din proba
pregătită în acest fel se depune pe o
matrice extremitate a unui suport, în sursa
instrumentului
 proba se supune impactului cu un impuls
laser de scurtă durată (ex. 5 nanosecunde
pentru laserul UV de N2 cu  = 337 nm)
 rezultă o plasmă pe suprafaţa ţintei care
are numai câteva zecimi de mm2.
 matricea de acid dihidroxibezoic uşurează
desorbţia moleculelor mari şi fotoionizarea
lor.
 nu provoacă fragmentarea moleculelor
analizate
 ionii se formează la fiecare emisie de lumină
a laserului, fenomen care este adaptat foarte
bine la analizoarele cu timp de zbor.
 nu se aplică compuşilor cu masa
moleculară mai mică de 500 Da deoarece 944
IONIZAREA CHIMICA LA PRESIUNE ATMOSFERICĂ
ATMOSPHERIC PRESSURE CHEMICAL IONISATION (APCI)
 Este analoagă ionizării chimice (CI).
 Se aplică la determinarea elementelor sau biomoleculelor cu M > 2000
Da (daltoni), polare şi puţin stabile.

 Se realizează cu plasmă de argon sau azot.

 Pentru dozarea unor elemente, se trec atomii acestora sub formă de


cationi, obţinându-se raze ionice, de aceea plasma de azot/argon, poate
fi utilizată ca mediu de ionizare.

 Pentru aceasta, conducerea ionilor către analizorul de masă se face


printr-un mic orificiu, practicat într-un con metalic răcit.

 Prin acest procedeu dur se distrug toate legăturile chimice din


compuşi, de aceea sunt analizaţi atomii elementelor componente.

 În cazul probelor solide se utilizează pentru volatilizare un laser


înaintea introducerii analitului în plasmă.

945
- In urma efectului “coroana”
(de descarcare), gazul
nebulizator formează ioni
primari
- Ionii primari reactionează
imediat cu moleculele de
solvent pentru a forma ioni
reactanti (H3O+, CH3OH2+)
- Ionii reactanti reactionează cu
moleculele de analit si
formează ioni de tip: [M+H]+ (in
mod pozitiv) si [M-H]- in mod
negativ

946
ELECTRONSPRAY IONIZAREA - ELECTRONSPRAY IONISATION
(ESI)
5kV

++ Desolvatare
++
++
+
si Fisiune
+
++ +
+ + + + ++
Gaz nebulizator ++ ++
+ +
+ +
+ + +
+ +
+++
Formarea picaturilor +++++
+
+
++ ++
Gaz de uscare +
+ spre MS
+

Generare ioni+

in faza de gaz
• se relizează tot la presiune atmosferică
• se aplică la ieşirea componenţilor din coloana capilară HPLC.
ESI poate opera in mod pozitiv sau negativ:
● Modul pozitiv:
- pentru substanţele bazice ce formează o sare HCl stabilă.
- principalul ion format: [M+H]+
- se mai pot forma: [M+nH]n+ şi [M+Na+]+
● Modul negativ:
- pentru substanţele acide care formează săruri de Na stabile.
- se pot forma: [M-H]-, [M-nH]n- şi [M+I-]-
Gaz
947
• Producerea picaturilor incarcate electric

• Evaporarea solventului si contractia picaturilor


• Densitate de sarcini crescuta → explozii coulombice si dezintegrarea picaturii in picaturi
mai mici
• Desorbtia ionilor in faza gazoasa 948
Sistem de presiune inalta

Sursa Analizor Sistem


Injector de masa Detector date
de ioni

Analizorul cu filtru cvadrupol


Analizorul cu timp de zbor
Analizorul cu trapă ionică
Analizorul cu rezonanţă ciclotronică
Analizorul cu câmp magnetic
Analizorul electromagnetic

949
Caracteristicile de performanţă ale unui analizor
REZOLUTIA

Rezolutie slaba
Rezolutie buna

6130 6140 6150 6160 6170

Rezoluţia - reprezintă capacitatea unui spectrometru de masă de a distinge între


ioni cu rapoarte m/z diferite.
- depinde de lărgimea picului de masă: cu cât lărgimea picurilor de
masă este mai mică şi cu cât puterea de separare este mai mare, cu atât rezoluţia
este mai mare, iar spectrometrul de masă este mai performant. 950
• SENSIBILITATEA - se exprima in masa de proba necesara si consumata
- depinde de modul de ionizare
• ACURATETEA – reprezintă abilitatea cu care analizorul poate furniza
informaţii m/z
-Măsurarea acuratetei depinde de rezolutie.
- Rezolutie mare → acuratete mai bună.

Rezolutie =18100
8000
eroare 15 ppm

6000
Rezolutie = 14200
Counts

eroare 24 ppm
4000

Rezolutie = 4500
2000
eroare 55 ppm

2840 2845 2850 2855


Mass (m/z)

951
Analizorul cu câmp magnetic
Ionii formaţi în camera de ionizare, acceleraţi şi îndepărtaţi de către
un repulser, sunt conduşi în analizorul (filtrul de masă) cu câmp magnetic,
care este un tub curbat, plasat într-un câmp magnetic perpendicular pe
traictoria ionilor pozitivi. De aceea, traiectoria lor rectilinie deviază,
devenind curbată, în funcţie de valoarea m/z.
Sub acţiunea câmpului magnetic, are loc o uşoară dispersie a
ionilor cu mase diferite, deci cu rapoarte m/z diferite, ceea ce asigură
concentrarea (focalizarea) lor pe traictorii separate şi captarea lor în locuri
diferite (m1/z1, m2/z2, m3/z3 şi m4/z4). Câmpul magnetic are o intensitate
de I=1 Tesla (10.000 Gauss)

952
Analizorul electromagnetic

Analizorul electromagnetic primeşte ionii acceleraţi şi îndepărtaţi din


camera de ionizare în două module - electrostatic şi magnetic, perpendicular
pe traiectoriile ionilor, ceea ce asigură separarea ionilor, cu o rezoluţie mare,
dar numai pentru mase nu prea ridicate.

P = probă; CI = cameră de ionizare; V = vid;


SE = sector electric; SM = sector maganetic;
TS = trasare semnal; R = curbura sectoarelor

953
Analizorul cu capcană de ioni/
trapa ionica
(Ion Trap Detector - ITD)

În camera de ionizare sunt plasaţi trei electrozi a căror suprafaţă


internă este hiperboloidală. Unul dintre aceşti electrozi este inelar, iar
ceilalţi doi alcătuiesc pereţii superior şi inferior ai camerei de ionizare.
Electrodului inelar central i se aplică un potenţial alternativ de frecvenţă
radio fixă, iar electrozii superior şi inferior sunt legaţi la masă. Acest câmp
are rol de capcană pentru ionii formaţi prin bombardament ionic (impact
ionic) sau prin ionizare chimică. Ionii sunt evacuaţi din capcană în mod
secvenţial, în funcţie de rapoartele m/z. Fluxurile de ioni separate sunt
colectate de sistemul de detecţie.

Detectorul are o rezoluţie medie pentru domeniul de masă 30-650


u.a.m. şi este potrivit pentru identificarea simplă şi pentru dozarea ionilor
formaţi prin fragmentare.

954
Analizorul cu filtru cvadrupol
Este utilizat pentru filtrarea, focalizarea, separarea curentilor ionici
prin oscilatii in camp electric de inalta frecventa.
Analizatorul cvadrupol este alcătuit din patru bare de 10-20 cm,
conexe două câte două, astfel racordate încât să se creeze între ele o
diferenţă de potenţial.

Două bare sunt încărcate pozitiv (+) şi două negativ (-), fiecărei
perechi de electrozi aplicându-i-se câte un voltaj, decalat cu 180o, deci care
alternează. Peste această tensiune se suprapune un câmp de înaltă
frecvenţă.
955
Ionii care părăsesc camera de ionizare sunt orientaţi spre cvadrupol,
(care este vidat) şi obligati să se deplaseze rectiliniu de-a lungul axei O-z.
Când un ion pătrunde în cvadrupol prin punctul “O”, el intră de fapt în
spaţiul central dintre cele patru bare, care este practic un “canal”, cu axa O-z.
Traiectoria acestui ion pozitiv este determinată de componentele vectorului
vitezei în cele trei direcţii xyz, iar pereţii acestui canal atrag sau resping ionul
în funcţie de polaritatea lui. Ionul se deplasează între două bare încărcate
pozitiv care-l focalizează (orientează) pe axa O-z într-un domeniu de potenţial,
numit “zonă de stabilitate”, în timp ce barele încărcate negativ îl
defocalizează, în planul yOz.
Prin urmare tensiunile alternative (+ şi -) sunt defazate între perechile
de bare, iar câmpul rezultat este alcătuit din două părţi, una fixă şi alta
variabilă, de aceea ionii care intră în cvadrupol sunt supuşi unei forţe
variabile ca intensitate şi direcţie, ceea ce face ca ionii să aibă traiectorii
complexe, de regulă instabile, în formă de elice (respectiv de tirbuşon) în cele
trei dimensiuni xyz.
956
Sistem de presiune inalta

Sursa Analizor Sistem


Injector de masa Detector date
de ioni

- Multiplicatori de electroni cu
dinode separate.
- Multiplicatori de electroni cu
dinode continue (channeltron).
- Detectorii cu microcanale

957
DETECŢIA

Pentru detecţia ionilor formaţi în camera de ionizare,


acceleraţi şi îndepărtaţi din această cameră, se utilizează diferite
tipuri de detectoare.
Detectoarele trebuie să fie foarte sensibile la sarcinile
electrice transportate de ioni.
Numărul de ioni individuali ai aceleiaşi specii este de
regulă mare, astfel că semnalul este de tip analogic, iar unele
detectoare au o putere mare de multiplicare, putând detecta
impactul unui singur ion.

958
Multiplicatorul de electroni cu dinode separate
Dinoda este un electrod al unui tub electronic cu emisie secundară
de electroni = catod emisiv. Electonii emişi sunt acceleraţi în zece trepte, de
către alţi zece electrozi, după care sunt captaţi de anod.
Ionii pozitivi se ciocnesc de un catod de conversie care emite
electroni „multiplicaţi” de 10-15 dinode dispuse în cascadă.
Fototubul multiplicator converteşte mai întâi ionii în fotoni, iar
aceştia sunt transformaţi în electroni.
(a) sistem cu dinode separate
şi catod de conversie a
ionilor în electroni;
(b) detaliu al catodului de
conversie,
(c) secţiune într-un tub
multiplicator cu multe
dinode
1 = catod de conversie;
2 = dinode;
3 = conversie în fotoni;
4 = conversia fotonilor în
electroni;
5 = flux de ioni;
6 = anod colector
959
Multiplicatorii de electroni cu dinode continue
În acest caz, ionii sunt deviaţi către un colector cu intrare în
formă de cornet, cofecţionat din sticlă dopată cu plumb, conul având rol
de catod de conversie. Acest catod emite electroni, care sunt atraşi de un
electrod pozitiv, iar şocurile succesive şi numeroase produse de electroni
asupra pereţilor produce multiplicarea lor, ca şi în cazul dinodelor
separate. Acest tip de multiplicator este astfel conceput, încât axa lui să
nu coincidă cu traiectoria ionilor, ceea ce protejează partea sensibilă a
detectorului de impactul speciilor neutre şi astfel fotonii emişi de
filament pot smulge electroni.

Detectorii cu microcanale
Sunt alcătuiţi dintr-un număr foarte mare de microdinode
continuie (channeltroni) aranjate în formă de cuib de albine, având un
rol corespunzător unui tip de placă fotografică. Fiecare detector este
construit dintr-o porţiune de microtub cu diametru interior de 25 m,
căptuşit în interior cu un material semiconductor, care funcţionează ca o
dinodă continuă şi în acest caz, fluxul mare de electroni emişi (similar
unei avalanşe) este captat de un anod, ceea ce permite înregistrarea
simultană a ionilor cu mase cu diferite.

https://www.youtube.com/watch?v=EzvQzImBuq8&t=10s
960
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE MASĂ
Interpretarea spectrelor

+
+
+
+ +

961
Identificarea unui analit

Pentru identificarea compuşilor moleculari analizaţi prin


spectroscopie de masă se poate proceda în două moduri:

- prin compararea spectrului obţinut experimental cu spectrul


compusului analizat existent într-o bibliotecă de spectre sau al aceleiaşi
substanţe de puritate standard (mai mare de 99,9 %).

- structura moleculară a compusului iniţial poate fi reconstituită


din fragmentele rezultate prin ionizare - dificil datorita fragmentărilor
succesive a ionilor, care sunt procese complexe (cu atât mai complexe cu
cât masa compusului este mai mare)

De fapt, identificarea unei molecule organice se face prin spectrele


de masă date de elementele pe care le conţin.

962
Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS
Există spectroteci care corespund unor colecţii (biblioteci) de spectre de
masă ale substanţelor cunoscute, în care sunt incluse (codate) principalele picuri ale
acestora.
Utilizarea acestor spectroteci, în care se caută picurile care interesează,
implică următoarele etape:

- reducerea datelor, prin care spectrul substanţei care ne interesează este redus la
cel mult 16 picuri, acordând preferinţă picurilor mai grele, mai semnificative decât
picurilor uşoare; fiecare spectru este redus în bibliotecă la 8 picuri

- precercetarea, care constă în selecţionarea spectrelor reduse din spectrotecă, la


acelea care au picuri cu aceleaşi poziţii ca şi picurile din spectrul redus al substanţei
cercetate, chiar dacă intensitatea lor este diferită

- cercetarea principală, care constă în reluarea selecţiei precedente printr-un


algoritm mai subtil care include printre criteriile de alegere:
• intensitatea
• masa
• raritatea picului, afectând un indice de identitate de la 0 la 1000 fiecărui spectru,
prin aceasta realizându-se o clasare prin similaritatea descrescătoare.
Există numeroşi algoritmi de cercetare, iar prin modificarea criteriilor de
alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea şi alegerea între diverse
clasamente.
Cea mai importantă spectrotecă de masă este aceea a NIST (National
Institut of Standards and Technology), care includea peste 250000 de spectre la
nivelul anului 1996, iar în prezent numărul spectrelor este desigur mai mare.
963
https://www.youtube.com/watch?v=sTi--ixdAME

Elemente mai frecvent întâlnite în compuşii organici:

Trebuie avut în vedere că, izomerii aceleiaşi substanţe pot da


spectre apropiate, însă practic spectrele lor nu sunt riguros identice, decât
în cazuri extrem de rare. În cazul izomerilor optici, aceştia pot fi
diferenţiaţi prin timpul lor de retenţie pe coloane cromatografice potrivite.
Cele mai precise informaţii le oferă spectrele obţinute prin ionizare
cu impact electronic, care produce fragmentarea maximă, cu cea mai mare
abundenţă. 964
Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de masă pot fi utilizate cu şanse mari de certitudine


pentru stabilirea formulei moleculare a unei substanţe, deoarece poziţia
fiecărui pic care provine din fragmentarea unui ion precedent (exceptând
cazul unor reamenajări) oferă informaţii care se pot utiliza pentru
stabilirea ionului în cauză. Exemplu:
- prezenţa unui pic cu (M-1)+ - ionul s-a format prin pierderea unui atom
de hidrogen
- prezenţa unui pic cu masa (M-15)+ - ionul provine din ionul M+ prin
pierderea foarte probabilă a unei grupe de metil (CH3 cu masa M=15)
- daca ionul M+ conduce la un ion cu masa (M-18)+ - ionul a pierdut o
moleculă de apă.

Trebuie să se ţină seama că, de regulă, procesul de fragmentare


sau cel de reamenajare a ionilor care se formează din ionul molecular
trebuie să conducă la radicali sau ioni mai stabili decât ionul din care
provin.
965
Fragmentarea:
- duce la formarea ionilor moleculari
- la formarea fiecărui ion molecular se rupe legătura cea mai polarizabilă (cu
caracterul cel mai polar), cu eliminarea unui electron din această legătură.
- De regulă, ruperea acestor legături se face la atomii de carbon cei mai
substituiţi, rezultând carbocationii cei mai stabili, cum sunt carbocationii
terţiari, conform următoarei reacţii:

966
- În cazul compuşilor organici cu duble legături în catene liniare, cum este
cazul dublei legături alil, aceasta favorizează ruperea legăturii imediat
învecinate dublei legături
- În cazul compuşilor aromatici substituiţi cu catene liniare , se rup
legăturile -, cu formarea unor cationi alil, benzil, etc., stabili, potrivit
reacţiilor următoare:

Fragmentarea legăturilor -, în care este implicat un heteroatom


se face astfel încât sarcina pozitivă să rămână la ionul heteroatomic, aşa
cum se observă din reacţia următoare:

967
Rearanjarea intramoleculară:

- este un fenomen care se produce atunci când se pot forma prin


fragmentare specii instabile, mai ales dacă acestea conţin un
heteroatom.
- se face prin migrarea unui atom de hidrogen din poziţia  fata de o
grupare functionala polara. Intermediar, se formează o stare ciclică,
după care se rupe legătura din poziţia beta. Acest tip de rearanjare,
numită “rearanjarea Mac Lafferty”, se produce mai ales în cazul
moleculelor conţinând o grupă carbonil (ce există inclusiv într-o grupă
carboxil), aşa cum se observă din exemplul dat mai jos:

968
969
CUPLAJE

Detecţia compuşilor organici, inclusiv medicamentoşi, nu se


face prin spectroscopie de masă, decât dacă se află în stare pură. Dar
substanţele medicamentoase, care trebuie să fie detectate şi dozate prin
spectroscopie de masă, se găsesc în amestec cu alte substanţe, deci în
matrici complexe, ceea ce implică pretratarea prealabilă a probelor prin
extracţie şi purificare.
Din aceste considerente, spectroscopia de masă se utilizează în
cuplaj cu HPLC sau/şi GC, legând capătul de ieşire al coloanei la
camera de ionizare a unui spectrometru de masă. În acest fel, se poate
analiza fiecare fracţiune (pic) care iese din coloana cromatografică, pe
măsură ce avansează eluţia, inclusiv în cazul urmelor de substanţe
existente în probă.
Aceste cuplaje sunt utilizate la detecţia şi dozarea moleculelor
organice, inclusiv medicamentoase, din matrici complexe, cum sunt cele
biologice (biochimice) sau din extracte de plante, ceea ce face posibilă
detecţia lor din urină, sânge, plasmă, ţesuturi, precum şi studiul
biodisponibilităţii şi al metabolismului medicamentelor.

970
Cuplajul HPLC-MS
-se aplică in cazul:
- substanţelor volatizabile, dar stabile termic
- moleculelor polare sau termolabile
- se poate adapta şi utiliza pentru analiza peptidelor, nucleotidelor,
nucleozidelor şi a altor molecule biologice şi pentru moleculele de
substanţe medicamentoase, în special pentru antibiotice.

971
Cuplajul GC-MS

- in practica analitică cuplajul GC-MS este mai utilizat decat HPLC-MS


(datorită necesităţii de eliminare a fazei mobile, în special când aceasta este
apa, care stânjeneşte funcţionarea corectă a spectrometrelor de masă).

- Faza staţionară trebuie să aibă o volatilitate foarte scăzută şi o mare


stabilitate termică, pentru a se evita complet orice distilare, deoarece o
distilare chiar minimă perturbă traseele spectrometrului.

- trebuie utilizat un gaz inert chimic - heliu şi hidrogen

- când sunt utilizate coloane umplute, devine importantă diferenţa de


presiune dintre ieşirea din coloana cromatografică şi intrarea în
spectrometrul de masă. Pentru atenuarea acestei diferenţe se utilizează
separatoare între gaz-cromatograf şi spectrometrul de masă, pentru
reducerea presiunii efluentului (eluatului) gazos, concomitent cu
îmbogăţirea vaporilor cu analiţi prin eliminarea gazului vector. În plus, prin
utilizarea unor coloane capilare cu debit mic este posibilă introducerea
directă a efluentului care iese din gaz-cromatograf în spectrometrul de
masă, fără nici o interfaţă.

https://www.youtube.com/watch?v=J-wao0O0_qM
972
Planul cursului

Rezonanta magnetica nucleara

Stabilitatea medicamentelor

973
REZONANŢA MAGNETICĂ NUCLEARĂ
NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE (NMR)

 este o metodă care are la bază măsurarea influenţei unui câmp magnetic
asupra unor nuclee atomice din molecule. Nucleele atomice posedă un
moment magnetic de spin.
µ

Spinul = mişcare de rotaţie în jurul propriei axe, determinat de


dezechilibrul care apare între masă şi sarcinile nucleare.
Mişcarea de spin se notează cu I.
Nucleul în rotaţie reprezintă un curent electric elementar.
Acest curent va da naştere unui câmp magnetic, astfel încât
nucleul în mişcarea de spin poate fi considerat un magnet elementar a
cărui axă corespunde cu axa spinului.
Protonul, datorită structurii, prezintă o repartiţie a:
 sarcinii pozitive spre periferie

 a masei mecanice spre centru.


974
Un nucleu al cărui spin este diferit de zero se comportă ca un magnet
minuscul al cărui moment magnetic µ este egal cu:
µ = .I
Vectorul momentului magnetic nuclear este coliniar cu momentul de spin
sau opus acestuia în funcţie de constanta giromagnetică .
Considerând nuclee cu valoarea spinului ½ (1H, 13C, 19F), aceştia au două
stări de spin posibile: m = 1/2 si m = -1/2. La introducerea acestora într-un câmp
magnetic apare o diferenţă de energie pe masura ce valoarea câmpului magnetic
creşte.
Diferenţa de energie va fi:
E = h..B0
unde:
h = constanta lui Plank
 = constanta giromagnetică
B0 = valoarea câmpului electromagnetic

Orientarea în sensul câmpului magnetic are o energie mai mică decât cea
contra câmpului (stabilitate mai mare).

Pentru ca protonul să interacţioneze cu o cuantă de radiaţie


electromagnetică este necesar ca aceasta să posede exact diferenţa energetică E.
Numai în acest caz radiaţia electromagnetică va putea fi absorbită de proton, care îşi
va inversa spinul, adică va trece din starea de energie joasă la cea de energie mare.
Condiţia de rezonanţă va fi dată de valoarea E, de unde frecvenţa de rezonanţă va fi:

975
APARATURA
OSCILATOR
RECEPTOR INREGISTRATOR
60MHz

Tub cu proba

Magnet (H0 fix)

• Un emitator de frecventa fixa ν = 60 MHz

Bobina de
• Receptor radio care are sarcina de a
detecta absorbtia de energie
• Un magnet care genereaza campul
baleiaj (H1) magnetic H0
• Bobina de baleiaj care adauga lui 976
H0 un
camp variabil H1
Fenomenul de relaxare
La introducerea unei substanţe în câmp magnetic exterior,
tendinţa tuturor moleculelor este aceea de a se aranja în acelaşi sens cu
câmpul.

Existenţa unor protoni cu orientare antiparalelă se datoreşte în


principal agitaţiei termice.

In momentul rezonanţei, protonii cu orientare paralelă îşi


modifică poziţia, trecând ca urmare a absorbţiei de energie în orientare
antiparalelă.

Cedarea energiei absorbite pentru restabilirea echilibrului iniţial


se face prin fenomenul de relaxare (tranziţii neînsoţite de radiaţii).

Sunt cunoscute relaxările:


• spin - reţea - caracterizate prin timpul de relaxare T1
• spin-spin - caracterizate prin timpul de relaxare T2.
Luand în considerare cei doi timpi se poate prevedea ce influenţă
va avea starea fizică a unei anumite probe asupra liniei de absorbţie.

977
SPECTRUL RMN
Spectrul RMN = curba absorbţiei de energie electromagnetică de
către compusul studiat, în funcţie de câmpul magnetic aplicat (sau
frecvenţă).
Pentru chimia organică prezintă o importanţă deosebită rezonanţa
magnetică a protonului (I=1/2) (rezonanţă protonică) deoarece compuşii
organici au în structură atomi de hidrogen.
Izotopul 12C, precum şi izotopii 16O şi 18O nu au moment magnetic
de spin → nu dau fenomene de RMN → avantaj deosebit.

Alte elemente care prezintă moment magnetic de spin

978
DEPLASAREA CHIMICĂ
In orice combinaţie chimică protonul este înconjurat de un nor
electronic, care ecranează liniile câmpului magnetic exterior şi ca urmare
protonul nu sesizează întregul câmp. Gradul de ecranare diferă după modul
în care este legat protonul respectiv în moleculă, aşa cum e cazul alcoolului
etilic:

Această diferenţă de valoare a câmpurilor magnetice de rezonanţă a


nucleelor (sau a frecvenţei de rezonanţă atunci când este fix câmpul), în
funcţie de vecinătăţi structurale se numeşte "deplasare chimică" şi se
consideră în raport cu poziţia unei linii alese arbitrar.

979
Diferenţele de ecranare ale diferitelor categorii de protoni în funcţie de modul
lor de legare în moleculă sunt mici. Din această cauză, semnalele tipurilor uzuale de
protoni întâlniţi în compuşii organici se eşalonează pe un domeniu foarte îngust de
variaţie a:
• câmpului magnetic - când frecvenţa este menţinută constantă
• frecvenţei - când câmpul magnetic este constant.
Variaţia câmpului produce o modificare a distanţei între liniile spectrului
(neglijabilă). Trebuie menţinut riguros raportul câmp/frecvenţă prin corectarea
continuă a parametrilor. Corecţia se realizează prin menţinerea automată "la
rezonanţă" a unei probe interne care se află în permanenţă în câmpul aparatului.
Aparatul aduce automat frecvenţa la valoarea o corespunzătoare maximului acestei
curbe în câmpul magnetic respectiv.

STANDARDE

Punctul zero nu poate servi ca referinţă. De aceea, distanţa între diferitele


semnale RMN se măsoară în raport cu poziţia unui compus standard:
• introdus în prealabil în aparat (standard extern)
• dizolvat în probă (standard intern).
Substanţa standard:
• trebuie să dea un singur semnal intens şi foarte îngust, de preferinţă la una din
extremităţile scării uzuale
• să fie inertă chimic
• sa fie uşor solubilă (în cazul folosirii ca standard intern).
Cel mai utilizat standard este tetrametilsilanul (TMS, (CH3)4Si), lichid cu
punct de fierbere de 27o C, care dă un semnal corespunzător celor 12 protoni perfect
echivalenţi şi puternic ecranaţi (semnalul se află la extremitatea de câmp mare a scării
aparatului).
980
Deplasarea chimică a unui proton

Diferenţa de câmp (numărătorul fracţiei) fiind foarte mică, iar


valoarea absolută a câmpurilor fiind foarte mică rezultă valori  foarte mici.
Din această cauză  se exprimă de obicei în ppm, după relaţia:

Pentru tipurile uzuale de protoni deplasările chimice au valori 


cuprinse între 0-10.
Deplasarea chimică se mai poate exprima şi în funcţie de frecvenţe
considerând câmpul magnetic constant. In acest caz frecvenţa standardului
(TMS) este mai mică decât cea corespunzătoare unui proton dezecranat:

981
Efectul de ecranare diamagnetică fiind proporţional cu intensitatea H a
câmpului, valoarea  a unui anumit proton este independentă de câmp, respectiv de
frecvenţă.
Valoarea  este aceeaşi indiferent dacă se lucrează cu un aparat de 40 MHz,
60 MHz sau 100 MHz, precum şi dacă se exprimă  în funcţie de câmp sau de
frecvenţă.
O altă posibilitate de exprimare a poziţiei semnalului protonului este dată
de diferenţa frecvenţei protonului şi a standardului:
 =  proton -  standard
Valoarea deplasării astfel exprimată, este proporţională cu intensitatea
câmpului (respectiv frecvenţa) şi din acest motiv se utilizează rar pentru exprimarea
deplasării chimice. Transformarea frecvenţelor în mărimi (ppm) se face cu ajutorul
relaţiei:

Pentru un aparat de 60 MHz relaţia devine:

Astfel pentru =1 ppm corespunde o "frecvenţă" de 60 Hz la un aparat de


60 MHz sau de 100 MHz.
De aici rezultă avantajul folosirii aparatelor de frecvenţă mare care
răspândesc deplasările chimice pe un domeniu mai larg de frecvenţe, permiţând
astfel scindarea mai bună a semnalelor.
Fiecare categorie de protoni sau de atomi de 13C se situează în spectrul
RMN la valori caracteristice ale deplasării chimice, în funcţie de ecranarea
corespunzătoare.
982
Solvenţii folosiţi influenţează valoarea deplasării chimice: acetona-d6,
acetonitril-d3, benzen-d6, cloroform-d1, diclormetan-d2, dimetilformamida-
d7, dimetilsulfoxid-d6, 1,4-dioxan-d8, etanol-d6, acid formic-d2, metanol-
d4, nitrometan-d3, piridina-d5, tetrahidrofuran-d8, toluen-d8, acid
trifluoroacetic-d1.

Deplasarea chimică a protonilor din moleculele organice

983
• Depasarea chimica a unor protoni 1H

984
Deplasarea chimică a 13C din grupele funcţionale ale
compuşilor organici:

985
• Deplasarea chimica a 13C – tabel general

986
Intensitatea semnalelor RMN
În RMN intensitatea semnalului unui proton este aceeaşi indiferent de gradul
de ecranare.
Caracteristică pentru intensitatea unui semnal este aria de sub curbă.
Dacă un proton dă un semnal mai larg (domeniu mai larg de câmp sau de frecvenţă)
acesta va fi redus ca intensitate şi invers.

Determinarea numărului de protoni


cu ajutorul intensităţii semnalelor
RMN,
1 - Semnale RMN;
2 - Curbe integrale

Intensitatea benzilor de absorbţie RMN este proporţională cu numărul de


protoni responsabili de absorbţie.
Majoritatea aparatelor trasează pe spectru şi curbele integrale. Valoarea
absolută a acestor integrale (suprafeţe) este lipsită de semnificaţie deoarece ea
depinde de:
• valoarea amplificării
• durata de înregistrare a spectrului.
Ceea ce se compară sunt valorile relative ale integralelor diferitelor semnale,
ele fiind în acelaşi raport ca şi numărul diferitelor categorii de protoni echivalenţi.

IA/IB = nr. protoni A/nr. protoni B


987
CONSTANTA DE CUPLAJ
Se consideră doi protoni dintr-o moleculă având valori suficient de diferite
ale deplasărilor chimice.
In timpul înregistrării semnalului unuia din protoni
• la o parte din molecule - al doilea proton este orientat în sensul câmpului exterior
• la altă parte din molecule (aproximativ 50%) al doilea proton este orientat contra
câmpului.
Din starea de relaxare are loc schimbarea spinului. Are loc şi cuplarea spin-
spin.
Diferenţa de frecvenţă între cele două linii ale primului proton este egală cu
diferenţa între liniile celui de al doilea proton (care este "cuplat" cu primul).
Această diferenţă de frecvenţă exprimată în MHz se numeşte constantă de
cuplaj (se notează cu J) şi este independentă de intensitatea câmpului exterior,
respectiv de frecvenţa la care lucrează aparatul.
Pentru unele molecule câmpul exterior va fi întărit de momentul de spin al
celui de al doilea proton, iar pentru altele va fi slăbit:
• moleculele din prima categorie vor da pentru primul proton un semnal la un câmp
exterior mai slab
• moleculele din a doua categorie vor da un semnal, pentru acelaşi proton, la un câmp
mai intens.
Urmează că, în loc de un singur semnal al protonului 1 se obţin în realitate
două semnale, fiecare de intensitate integrată jumătate, situate unul la un câmp mai
slab, altul la un câmp mai intens. În mod analog, semnalul protonului 2 va fi scindat
de primul proton în două semnale.
Dacă diferenţa de deplasare chimică între protonii cuplaţi 1 şi 2 este mică (în
raport cu constanta de cuplaj) cele două semnale ale fiecărui proton au intensităţi
diferite:
• liniile exterioare scad
• liniile interioare cresc. 988
În practică se întâlnesc deseori cazuri în care un proton este
cuplat simultan cu mai mulţi alţi protoni, cu constante de cuplaj
identice sau diferite. In asemenea cazuri spectrul se amplifică.
Exemplu: atomul de hidrogen din structurile cu:

989
Fluorul si fosforul în RMN

• Fluorul şi fosforul reprezintă cei mai studiaţi doi atomi din chimia organică
prin RMN, după hidrogen şi carbon.
• Fluorul, reprezentat în proporţie de 100 % de 19F (I=1/2) este comparabil
cu protonul datorită sensibilităţii sale bune. Deoarece are electronegativitatea mai
mare ca a protonului, devierile chimice sunt distribuite pe o zonă mai mare. Ca o
consecinţă, devine astfel posibil ca în 19F RMN să se facă distincţia între compuşi
care sunt foarte similari, spre deosebire de proton RMN în care semnalele analoge
s-ar amesteca.
• În special sunt importante diferenţele datorate stereochimiei moleculelor precum
şi constanta de cuplu JF-H care poate fi măsurată pe o gamă mai largă decat JH-H.
• Din păcate, un număr relativ mic de molecule naturale conţin atomi de fluor. De
aceea spectrele fluor RMN sunt obţinute de obicei din compuşi în care un atom de
fluor (sau o grupare CF3) au fost introduse într-o poziţie cunoscută. Această
procedură permite obţinerea de informaţii structurale din perturbările care apar
în spectrul unei molecule.
• Rezumând, atomul de fluor aduce modificări minore în stereochimia
moleculei, dar produce o deviere chimică comparabilă cu cea a grupării hidroxil.

Scala relativă exprimată in ppm faţă de un compus de referinţă 990


• Fosforul (31P, I= 1/2) reprezintă un alt element analizabil prin RMN.
Există un singur izotop natural.
• A fost studiat de la începuturile RMN pentru că este un element
important din alcătuirea compuşilor anorganici şi are un rol foarte
important în biologie.

Scala relativă exprimată in ppm faţă de un compus de referinţă

991
APLICAŢIILE RMN

Metoda RMN este la ora actuală cel mai important intrument


analitic din arsenalul investigaţiei fizice. Astfel, prin intermediul acestei
metode se pot stabili:
• datele structurale ale compuşilor organici
• proprietăţile dinamice ale moleculelor (conformaţia moleculelor,
configuraţia izomerilor, diastereoizomerii, tautometria ceto-enolică)
• analiza cantitativă a compuşilor ca atare sau în amestecuri
• lungimea catenelor tensidelor neionice
• procentul de hidrogen dintr-o probă necunoscută
• indicele de iod pentru caracterizarea protonilor olefinici.

992
DETERMINĂRI CALITATIVE

1. Determinarea structurii substanţelor medicamentoase


Spectrul RMN al unei substanţe organice necunoscute se
interpretează în etape, adaptându-se specificului substanţei şi
problemelor analitice care trebuie rezolvate. Se vor stabili întâi numărul
şi natura semnalelor mai importante din spectru.
Sub aspect analitic, cele mai caracteristice sunt de obicei:
• semnalele grupelor metil din regiunea valorilor de câmp ridicate (0-3
ppm )
• multipleţii complecşi de la câmpurile slabe (7-9 ppm ), produşi de
protonii grefaţi pe nucleele aromatice
• grupările metilenice ce se pot identifica în regiunea mijlocie a spectrului
(3 - 5 ppm ).
Probleme mai dificile ridică de obicei protonii ataşaţi în locuri
diferite în spectru, în funcţie de structură.

993
 Piroxicam
Valoarea deplasărilor chimice şi a constantelor de cuplaj

Semnalele prezentate în spectrul piroxicamului solvit în CDCl3 au


fost atribuite după cum urmează:
- semnalul - 2,93 ppm faţă de TMS (=0) corespunde, prin poziţie şi
intensitate relativă, protonilor grupării N-metil
- semnalul - 8,94 ppm corespunde protonului grupării -NH amidice
- semnalul - 13,2 ppm, prin poziţia sa foarte dezecranată şi prin faptul că
nu este scindat, se atribuie grupării -OH fenolice
- multipletul din intervalul 7-8,5 ppm corespunde protonilor aromatici şi
anume celor patru protomi din nucleul benzenic şi celor patru protoni din
inelul pirimidinic.
994
995
Dipiridamol
- 1HRMN

- 13CRMN

996
- Camfora

Spectrul 13CRMN al
camforei în DCCl3

- Identificarea morfinei si heroinei

997
2. Stabilirea conformaţiei şi configuraţiei moleculelor
Deoarece este cunoscut faptul că, între conformaţia şi configuraţia
moleculelor şi acţiunea lor biologică este o strânsă legătură, posibilitatea de legare a
acestora de receptorii enzimatici fiind determinată de factorii sterici, se poate aprecia
importanţa metodei RMN pentru identificarea acestor modificări.
Diastereoizomeria este o relaţie de izomerie în cadrul căreia izomerii se
disting numai prin distanţa ce separă în spaţiu atomii sau grupările ce le compun.
Ca şi în spectrometria IR, o simetrie înaltă a moleculei se traduce întotdeauna
printr-o scădere a numărului “liniilor spectrale”, adică a semnalelor RMN.
Prin această metodă s-a stabilit conformaţia nicotinei, morfinei, analogilor
metadionei, tetraciclinelor, hormonilor steroizi, cardiotonicelor steroidice etc.
Un exemplu simplu poate sugera importanţa spectrului RMN pentru a opta
pentru o anumită formă cis sau trans. Astfel, diferenţierea între formele cis şi trans
ale 2,6 dimetil-1-benzil-piperidinei se bazează pe neechivalenţa protonilor metilenici
şi pe asimetria moleculei.

În cazul izomerului trans (asimetric), cei doi protoni metilenici dau un


cuartet central la  = 3,41 ppm, în timp ce în izomerul cis (simetric) se manifestă la
aceeaşi intensitate a câmpului sub forma unui singlet.

998
Analiza conformaţională constă în măsurarea constantelor de cuplaj
vicinale ţinând cont de unghiul diedru format de două legături CH.
Aceste constatări au contribuit la elucidarea structurii
conformaţionale a cocainei (methyl (1R,2R,3S,5S)-3-(benzoyloxy)-8-methyl-8-
azabicyclo[3.2.1] octane-2-carboxylate şi pseudococainei (1R-(2endo,3exo))-
isomer.

cocaina pseudococaina

Valorile unghiurilor diedre determinate cu ajutorul constantelor de


cuplaj permite a opta pentru configuraţia de scaun a ciclului piperidinic şi
de a considera grupa esterică în poziţie axială.

999
3. Evidenţierea interacţiunilor moleculare
Diclofenacul sodic formează cu -ciclodextrinele (-CD) un compus
de incluziune de tip canal (7-8 Å) cu proprietăţi terapeutice îmbunătăţite.
Utilizând metoda RMP se poate dovedi că în interacţiunea acesteia cu
-CD intervin legături de hidrogen.

Caracteristicile spectrale RMN

1000
DETERMINĂRI CANTITATIVE

Substanţele medicamentoase pot fi analizate cantitativ


spectrometric RMN deoarece produc semnale caracteristice care permit
determinarea chiar dintr-un amestec complex cu structuri apropiate. Se
poate compara suprafaţa acestui semnal (maxim) cu aceea a unui compus
etalon.
Analiza cantitativă RMN:
• permite un dozaj specific
• nu necesită separări prealabile
• necesită cantităţi sub ordinul miligramelor.
Acest tip de dozări dă rezultate extrem de exacte în cazul aplicării
la diverse amestecuri medicamentoase ca:
• acid acetilsalicilic-fenacetină-cafeină
• fenacetină-amidopirină-fenazonă-cafeină.
Se pot determina hormoni steroizi, alcaloizi etc.

1001
Avantaje:
• prezintă un caracter nedistructiv - substanţa supusă investigaţiei
analitice rămâne practic nemodificată
• poate fi adaptată controlului automat şi continuu.
• rezolva problemele de structură ale compuşilor organici
• rezolva problemele de analiza calitativă şi cantitativă
• necesita cantităţi reduse de substanţe
• impune condiţii moderate de puritate
• oferă informaţii deosebit de cuprinzătoare, referitoare în primul
rând la scheletul de atomi de carbon şi la dispunerea atomilor.

1002
STABILITATEA MEDICAMENTELOR

În practica farmaceutică obţinerea unor medicamente cu


stabilitate cât mai mare în timp, cu o biodisponibilitate, securitate şi
inocuitate cât mai ridicată, este o prioritate de care trebuie să se ţină
seama.

În timpul prelucrării sau depozitării, medicamentele şi


substanţele de uz farmaceutic suferă diferite interacţiuni fizico-chimice
sau biologice, sub influenţa unor factori interni sau externi, ceea ce are
ca urmare:
• alterarea calităţii manifestate la exterior
• scăderea până la anulare a efectelor farmacologice
• efecte toxice.

Medicamentele sunt considerate instabile atunci când pierd


mai mult de 10 % din activitatea lor în perioada de timp de la
preparare şi până la administrarea completă.

1003
Un medicament stabil, într-o perioadă de timp determinată,
trebuie:
• să conţină toate principiile active
• sa aiba o eficacitate terapeutică mai mare de 90 % din valoarea
declarată
• să nu posede indici de toxicitate
• sa nu modifice DL50
• sa nu modifice toleranţa locala
• sa nu modifice parametrii organoleptici şi farmacotehnici.

Stabilitatea medicamentelor este rezultatul diversităţii


principiilor activi, a excipienţilor, a procedeelor tehnologice de
fabricaţie, a formelor galenice, a modului de condiţionare, a condiţiilor
de transport, depozitare, conservare.

Pe întregul parcurs, de la preparare şi până la utilizare, trebuie


menţinute toate proprietăţile fizico-chimice, microbiologice şi
biofarmaceutice, pe care le-au avut în momentul preparării.

1004
Stabilitatea unui medicament include:

- stabilitatea fizică: atestată prin păstrarea proprietăţilor fizice


iniţiale, aspect, culoare, miros, uniformitatea masei, forma cristalină
sau amorfă, solubilitatea, tendinţa de dispersie

- stabilitatea chimică: manifestată prin menţinerea în limite fixe a


integrităţii şi a reactivităţii chimice a fiecărui component

- stabilitatea microbiologică: constă în menţinerea sterilităţii sau a


rezistenţei la dezvoltarea microorganismelor, în condiţii determinate, ca
şi o eficacitate a conservanţilor, eventual adăugaţi

- stabilitatea toxicologică: nu se admite nici o mărire semnificativă a


toxicităţii, evaluată cantitativ prin DL50

- stabilitatea terapeutică: care exclude orice modificare a eficacităţii


terapeutice.

1005
Medicamentele cu stabilitate limitată pot fi protejate prin măsuri
speciale:
• utilizarea unor gaze inerte, stabilizatori, fotoprotecţie, ambalaje
speciale
• supradozarea unor forme farmaceutice cu substanţe labile (vitamine,
antibiotice) cu coeficient terapeutic mare, care trebuie să asigure un
conţinut minim de principii active, pe întrega durată de utilizare.

Astfel, pentru antibiotice, supradozarea nu trebuie să


depăşească:
- 15 % pentru forme solide
- 20 % pentru forme lichide
- 25 % pentru unguente, supozitoare, aerosoli
- 15 % pentru alte forme
• indicarea unor condiţii speciale de conservare (ferit de lumină, la
temperaturi de...., etc).

Perioada de timp în care un medicament îşi păstreză integral


caracteristicile lui limitate se numeşte durată de valabilitate, iar
data expirării lui termen de valabilitate.
Termenele trebuiesc menţionate în monografie, pe ambalaj.
Acestea sunt legate de forma de prezentare şi de condiţiile de
depozitare. În majoritatea cazurilor, diferiţii factori, nu acţionează
izolat, ci dependent unii de alţii, acţiunea lor fiind reciprocă.
1006
INSTABILITATEA FIZICĂ A MEDICAMENTELOR

Transformările fizice sunt mai specifice şi mai tipice mai ales în


cazul formelor farmaceutice şi se referă la:
• rezistenţa comprimatelor
• consistenţa unguentelor
• stabilitatea emulsiilor şi suspensiilor
• vâscozitatea siropurilor
• limpezimea soluţiilor
• aglomerarea particulelor
• modificarea omogenităţii preparatului
• modificarea eliberării principiilor active
• modificarea solubilităţii.

Cele mai frecvente modificări fizice se referă la:


• cristalizarea substanţelor
• transformarea formei cristaline
• creşterea cristalelor
• cristalizarea din soluţie a hidraţilor şi solvaţilor.

1007
Cristalizarea substantelor

Comportarea la dizolvare este o consecinţă a gradului de ordonare a


substanţelor cristalizate şi amorfe.

• În general, substanţele amorfe sunt mai solubile decât cele cristalizate,


deoarece necesită o energie mai mică pentru o asamblare amorfă faţă de o reţea
cristalină.

• Solubilitatea este mai mare la cristalele care se apropie cel mai mult de
simetria sferică.

• Cristalizarea substanţelor amorfe este favorizată de creşterea temperaturii


şi este însoţită de micşorarea solubilităţii.

Exemple:
• Novobiocina, antibiotic bacteriostatic şi bactericid, în stare amorfă este de 1000
de ori mai solubilă în HCl 0,1 N faţă de forma cristalizată. Forma amorfă se
transformă lent în forma cristalizată şi îsi pierde progresiv activitatea. Se
recomandă adăugarea de adjuvanţi care să mărească vâscozitatea, întârziind
cristalizarea (MC).

• Insulina zinc amorfă este uşor absorbită şi are o durată de acţiune relativ
scurtă, în timp ce produsul cristalizat se absoarbe lent şi are o durată de
acţiune mai îndelungată, motiv pentru care se foloseşte în forme de
administrare retard.

1008
Transformarea formei cristaline
În timp, au loc transformări ale formelor cristaline metastabile
termodinamic, mai solubile şi mai active în forme mai puţin solubile cu
activitate biologică inferioară.

Factorii care favorizează aceste transformări sunt:


• - pulverizarea, granularea, comprimarea etc.

Ca măsuri de stabilizare se recomandă:


• utilizarea formelor polimorfe stabile a substanţelor medicamentoase
• optimizarea recepturii.

Precipitări
Substanţele active din soluţiile saturate sau suprasaturate precipită cu
uşurinţă.
Apariţia precipitatelor este favorizată de:
• natura şi polaritate substanţelor medicamentoase şi solventului
• temperatura
• modificarea pH-ului
• condiţiile şi durata de depozitare
• manipularea
• procesele de îmbătrânire a soluţiilor coloidale etc.

1009
Modificări de vâscozitate
Vâscozitatea formelor semisolide poate fi modificată în timpul depozitării.
Exemple:
• Structura unguentelor-gel poate fi influenţată de timp şi solicitări
mecanice, determinand o creştere a vâscozităţii.
• La unguentele preparate prin topire apare fenomenul de tixotropie.
• Reducerea vâscozităţii în cursul depozitării se poate observa în cazul
hidrogelurilor ca urmare a acţiunii unor microorganisme.

Modificarea umidităţii
Este des întâlnită absorbţia vaporilor de apă de către substanţele
medicamentoase higroscopice. Acest lucru se întâmplă şi în cazul extractelor
vegetale.
Exemple:
• Ca urmare sâmburii drajeurilor se pot umfla, ceea ce poate afecta eliberarea
substanţelor medicamentoase din comprimate.
• Capsulele gelatinoase operculate pierd apa în cursul depozitării lor în încăperi
prea uscate, devin friabile şi se rup, iar la o umiditate ridicată se umflă.

Utilizarea unor ambalaje adecvate, impermeabile la apă, facilitează


stabilitatea formelor farmaceutice faţă de apă.

1010
Pierderea prin evaporare

• Este consecinţa unei depozitări şi ambalări necorespunzătoare.


• Sunt caracteristice preparatelor dermice cu multă apă; duce la uscarea
hidrogelurilor şi emulsiilor U/A.
• Dacă solventul evaporat este alcoolul se constată apariţia de precipitate.

Exemple: Comprimatele sublinguale cu nitroglicerină neambalate pierd în trei


luni la 20 0C, 30 % din principiul activ.

Pierderea prin adsorbţie

Substanţele ajutătoare, materialele de ambalaj pot adsorbi substanţele


medicamentoase.

Exemple: Acidul silicic coloidal şi cărbunele medicinal pot adsorbi clorura de


cetilpiridiniu, micşorând astfel acţiunea antimicrobiană a acesteia.

1011
INSTABILITATEA CHIMICĂ A
MEDICAMENTELOR

Se produce datorită unor reacţii de:


- Oxidare
- Solvoliza
- Decarboxilare
- Izomerizare
- Polimerizare
- Esterificare
- Fotochimice

1012
REACŢII DE OXIDARE

Funcţiile cele mai sensibile la autoxidare sunt:


- fenoli
- cateholi;
- alcooli
- tioeteri;
- acizi carboxilici
- nitriţi
- aldehide

Oxidarea:
• este superioară la formele lichide faţă de cele solide sau semisolide
• depinde de concentraţia soluţiei (este invers proporţională cu
concentraţia) → se recomandă prepararea de soluţii concentrate ce pot
apoi fi diluate.

1013
Factorii care influenţează reacţia de oxidare:

1. Oxigenul din aer şi antioxidanţii


Antioxidanţii:
• sunt substanţe antioxigen sau inhibitori ai oxidării, solubile în apă şi grăsimi,
incolori, netoxici, nealergici, eficienţi în concentraţie mică.
• acţionează prin două mecanisme:
● prin potenţialul lor redox inferior substanţelor medicamentoase
● prin furnizarea unui radical liber, nestabil, atomul de hidrogen necesar
stabilizării lui, fără a forma alt radical liber → acţionează ca inhibitor de radicali
liberi în cadrul reacţiilor în lanţ ROO. , RO. + HX  ROOH sau ROH + X’. Are loc
o blocare a unui lanţ de reacţii, care nu este totdeauna bine definit din cauza
antioxidanţilor.

2. Solventul
Viteza de oxidare a substabţelor medicamentoase dizolvate este invers
proporţională cu concentraţia lor → se recomandă prepararea de soluţii
concentrate.

3. pH-ul
Creşterea concentraţiei ionilor de hidrogen (scăderea pH-ului) duce la
creşterea valorii potenţialului redox → forma redusă a sistemului se oxidează cu
atât mai uşor cu cât pH-ul este mai ridicat.

1014
4. Ionii metalici
Ionii metalelor Cu, Fe, Co, Ni şi Mn manifestă o acţiune catalitică oxidantă.
Astfel ionii de cupru măresc viteza de oxidare a acidului ascorbic de 10000 ori.
Anularea acţiunii se face cu ajutorul substanţelor chelatoare (EDTA-Na2,
acid citric)

5. Substanţele adjuvante
Viteza de oxidare a substanţelor medicamentoase este superioară în cazul
tensidelor, în special neionice (CMC) ca urmare a micşorării distanţelor dintre
molecule sau fixării antioxidanţilor în micele. Viteza de oxidare în soluţii de
tenside este dependentă de natura şi concentraţia substanţei active şi a
tensidului, de temperatură, pH etc.
Din această categorie fac parte tweenurile, polisorbatul 80 etc.

6. Temperatura
Acţionează asupra reacţiilor de oxidare, coeficientul de temperatură fiind
de acelaşi ordin de mărime ca în cazul reacţiilor de hidroliză.

7. Umiditatea atmosferică şi ambalajul


Umiditatea atmosferică relativă determină viteza de descompunere şi are
un loc important în diverse interacţiuni.

1015
Reacţiile de oxidare in vivo
Reacţiile de oxidare şi hidroliză in vivo sunt determinate de aceiaşi
parametri fizico-chimici ca şi in vitro, cu deosebirea că, substanţele
medicamentoase sunt metabolizate de către sistemele enzimatice, organismul
uman şi animal având tendinţa de transformare a acestora în molecule mai
polare, mai puţin toxice, uşor de eliminat.
Exemple de oxidări des întâlnite:

1016
- acidul ascorbic

1017
- acidul p-aminosalicilic

Chinonimina formată se poate polimeriza şi forma compuşi cu structura:

- captoprilul

1018
- tiamina
Stabilitatea soluţiilor de tiamină este afectată de prezenţa agenţilor
oxidanţi şi reducători, de iod, taninuri, acid picric etc. Ionii de Cu2+
catalizează reacţia de descompunere.

Condiţionarea în forme farmaceutice solide (comprimate, pulberi) a


tiaminei asigură o stabilitate satisfăcătoare dacă este păstrată la loc
uscat.
1019
REACŢII DE SOLVOLIZĂ
• Sunt reacţiile de degradare a substanţelor medicamentoase în soluţii
parenterale sau perfuzii.
• Au loc între molecula unui solvent, cel mai frecvent apa (reacţii de
hidroliză) sau alţi solvenţi (alcool, PEG).
• Solvenţii acţionează ca agenţi nucleofili şi atacă centrele electrofile din
substanţele medicamentoase.
• Polaritatea legăturilor dintre atomii de carbon şi heteroatomi
influenţează scindarea hidrolitică a substanţelor medicamentoase.
• Grupele funcţionale cele mai afectate sunt: esteri, lactone, amide,
lactame, oxime, imide, ureide ciclice.
• Aceste grupe funcţionale suferă reacţii de solvoliză, dar vitezele
reacţiilor sunt diferite, funcţie de labilitatea legăturilor, pH, soluţii
tampon, polaritatea solventului, temperatura, umiditatea atmosferică,
formă farmaceutică, ambalaj. EX: viteza reacţiei de solvoliză a beta-
lactamelor este mult mai mare în comparaţie cu analogul linear.
• Efectele electronice, inductive sau electromere şi sterice ale
substituenţilor, formarea de legături de hidrogen sau simpla modificare
a solubilităţii influenţează mult viteza reacţiilor de hidroliză.
EX: Stabilitatea esterilor scade în prezenţa unor grupe funcţionale cu
caracter acido-bazic: NH2, OH, COOH
1020
Factorii care influenţează reacţia de solvoliză:

1. Concentraţia ionilor de hidroniu şi hidroxil


Există un domeniu de pH în care vitezele parţiale datorate ionilor
de hidroniu şi hidroxil sunt egale, zona de pH izocatalitic, interval în
care viteza reacţiei de hidroliză este minimă şi stabilitatea substanţelor
medicamentoase la hidroliză este maximă.
În cazul în care pH-ul izocatalitic este situat în zona alcalină,
efectul catalitic al ionilor OH predomină faţă de cel al ionilor hidroniu
şi invers.
Pentru asigurarea stabilităţii, pH-ul se ajustează astfel încât să
fie în zona de pH izocatalitc.

2. Natura şi concentraţia substanţelor tampon


Sunt o serie de soluţii tampon, care prin pH-ul lor influenţează
reacţiile de hidroliză.
Soluţiile tampon cele mai utilizate sunt: acetat, fosfat, citrat,
borat.

1021
3. Solventul
• Natura, polaritatea şi cantitatea solventului influenţează gradul şi viteza
reacţiilor de solvoliză.
• Înlocuirea unui solvent cu o constantă dielectrică mare, cum ar fi apa
(78,39) cu un solvent cu o constantă dielectrică mică, alcoolul (25,7)
creşte viteza reacţiei de hidroliză a cloramfenicolului.
• Folosirea cosolvenţilor poate duce la scăderea sau creşterea vitezei
reacţiei de hidroliză. Digoxina este mai stabilă în amestecul alcool
polivinilic-apă decât într-o soluţie apoasă.

4. Substanţele adjuvante
• Utilizarea unor substanţe adjuvante polare poate fi însoţită de creşterea,
scăderea sau nemodificarea vitezei de hidroliză.
• Tensidele neionice micşorează viteza de hidroliză a benzocainei,
homatropinei ca urmare a înglobării în micele. Sunt utilizate şi alte
tenside: tween 20, CMC, LSS, PVP.
• În cazul formelor farmaceutice solide, o importanţă deosebită o au
substanţele adjuvante capabile să lege apa. Din această cauză
substanţele medicamentoase foarte sensibile la hidroliză nu trebuiesc
drajefiate.
• Caracterul acid sau bazic al substanţelor adjuvante poate constitui un
factor de stabilitate sau de instabilitate de care trebuie să se ţină seama.

1022
5. Temperatura
Viteza reacţiilor de descompunere creşte odată cu creşterea
temperaturii → importanţa ce trebuie acordată soluţiilor
medicamentoase care se sterilizează termic.

6. Umiditatea atmosferică, ambalajul


În cazul preparatelor solide umiditatea atmosferică constituie un
important factor de hidroliză, deoarece intervine în echilibrul apos.
În cazul ambalajelor o atenţie deosebită trebuie acordată
permeabilităţii acestora la vapori şi gaze.

7. Alţi factori
Reacţiile de solvoliză pot fi catalizate de cationii divalenţi
menţionaţi la reacţiile de oxidare, de enzime, de lumină, de oxigen.
În astfel de cazuri trebuie luată în considerare concentraţia
enzimei, a substratului, temperatura, pH-ul şi activitatea ionilor.

1023
Hidroliza esterilor

- hidroliza cocainei:

1024
Hidroliza lactonelor
- hidroliza pilocarpinei

Hidroliza amidelor
- hidroliza indometacinului

1025
Hidroliza lactamelor
- hidroliza ampicilinei

1026
Alte hidrolize
- hidroliza barbituricelor

- hidroliza alantoinei

1027
- hidroliza benzazepinelor

- hidroliza carboplatinului

1028
REACŢII DE DECARBOXILARE
• Sunt reacţii destul de rar întâlnite ca sursă a instabilităţii substanţelor
medicamentoase.
• Depind de efectul reacţiilor de oxidare şi hidroliză.
• Sunt reacţii influenţate de temperatură, lumină, pH, enzime, polaritatea
solvenţilor şi prezenţa ionilor metalici.
• Se decarboxilează acizii: salicilic, p-aminosalicilic etc.
• Importantă este problema decarboxilării PAS cu formarea de m-
aminofenol, toxic.

• Ca măsuri de stabilizare se recomandă înlăturarea reacţiilor primare de


oxidare şi hidroliză, optimizarea metodelor de preparare, evitarea
temperaturilor prea înalte, a luminii şi utilizarea unor ambalaje adecvate.

1029
REACŢII DE IZOMERIZARE

• Este posibilă transformarea unei substanţe medicamentoase optic


active într-o formă racemică inactivă şi invers.
• Sunt influenţate de o cataliză acido-bazică, de pH etc.

Exemplu:
- izomerizarea licviritigenolului

1030
- racemizarea tetraciclinei

1031
- racemizarea oxazepamului
Oxazepamul se racemizează într-o soluţie la pH neutru sau alcalin
conform reacţiei:

- izomerizarea griseofulvinei

1032
REACŢII DE POLIMERIZARE
• Sunt reacţii cauzate de procesele de autooxidare sau hidroliză şi în urma lor
se formează compuşi intens coloraţi.
• Decurg după un mecanism:
- radicalic specific polimerizării vinilice şi reacţiilor înlănţuite cu cele
trei etape
- mecanism ionic (anionic, cationic).
• Măsurile de stabilizare au în vedere înlăturarea reacţiilor primare,
optimizarea pH-ului, evitarea temperaturilor înalte şi a influenţei luminii.

- polimerizarea catehinelor

1033
REACŢII DE ESTERIFICARE
• decurg invers reacţiilor de hidroliză
• depind de pH.
Exemple: - glicozidarea procainei
- N-acetilarea epinefrinei cu acid acetilsalicilic.
• Se recomandă optimizarea recepturii, mai ales a pH-ului, alegerea
adjuvanţilor adecvaţi, separarea în spaţiu a partenerilor de reacţie.

REACŢIILE FOTOCHIMICE
Degradările fotolitice pot fi un factor important în limitarea
stabilităţii medicamentelor.
Un medicament poate fi afectat chimic de radiaţii cu o anumită
lungime de undă numai dacă absoarbe radiaţia la acea lungime de
undă. Radiaţiile UV care au un nivel înalt energetic, sunt cauza multor
recţii de degradare.
Dacă moleculele absorbante:
- reacţionează - reacţia este numită fotochimica naturală.
- nu participă direct la reacţii, dar transferă din energia lor altor molecule
reactante, substanţa absorbantă se numeşte fotosenzitivă.

1034
Într-o reacţie fotochimică sunt implicate multe variabile, iar
cineticile sunt complexe:
• Intensitatea şi lungimea de undă a luminii şi mărimea, forma, compoziţia
şi culoarea ambalajului pot afecta viteza reacţiei.
Ex: - fotodegradarea clorpromazinei la o semichinonă ca radical liber
intermediar urmează o cinetică de ordinul 0.
- hidrocortizonul, prednisolonul şi metilprednisolonul în soluţii alcoolice
sunt fotodegradate prin reacţii ce urmează o cinetică de ordinul 1.
Ambalajele de sticlă colorate sunt folosite foarte frecvent pentru a
proteja formulările fotosensibile:
• sticla galben-verde dă protecţia cea mai bună în UV
• sticla maronie conferă protecţie considerabilă în UV şi mai puţin în IR.

Riboflavina este mai bine protejată de un stabilizator care are o


grupare hidroxil ataşată sau în vecinătatea inelului aromatic.

Fotodegradarea sulfacetamidei în soluţie poate fi inhibată de către


un antioxidant precum tiosulfatul de sodiu sau metabisulfitul.

Fotodegradările au loc prin reacţii de hidroliză, eliminare,


oxidare etc.

1035
- fotodegradarea nifedipinei

- fotodegradarea reserpinei

1036
- fotodegradarea clorochinei

1037
- fotodegradarea acidului tiaprofenic

- fotodegradarea clordiazepoxidului

- fotodegradarea menadionei

1038
- fotodegradarea acidului meclofenamic

- fotodegradarea rufloxacinei

1039
- fotodegradarea camforei

- fotodegradarea mentolului

1040