Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
MEDICAMENTULUI
OBIECT, IMPORTANŢA,
ORGANIZARE
11
Planul cursului
• INTRODUCERE
• ORGANIZAREA CONTROLULUI MEDICAMENTELOR
• NORME DE CONTROL Ale MEDICAMENTELOR
• CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL MEDICAMENTULUI
Identificarea componentelor
Cercetarea purităţii
Determinarea cantitativă
• METODOLOGIA GENERALA DE CONTROL A MEDICAMENTULUI
PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZă
CONTROLUL ORGANOLEPTIC
DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI CHIMICE
- DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII
- ASPECTUL SOLUTIEI
- DETERMINAREA INDICILOR
- SUBSTANŢE NESAPONIFICABILE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE FIERBERE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE PICURARE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE SOLIDIFICARE
- DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
- DETERMINAREA INTERVALULUI DE DISTILARE
- DETERMINAREA APEI
- REZIDUUL PRIN CALCINARE
- DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
- PIERDEREA PRIN USCARE 22
Medicament (OMS) - “orice substanţă sau produs
utilizat, ori destinat a fi utilizat, în vederea
modificării sau studierii unui sistem fiziologic, în
interesul subiectului căruia îi este administrat”,
care reflectă cu pregnanţă importanţa dictonului
“primum non nocere“.
33
Ministerul Sănătăţii clasifică medicamentele astfel:
1. Medicamente originale
a) substanţe cu structură chimică definită, necunoscute în literatura
medicală internaţională şi formele farmaceutice ale acestora
b) substanţe cu structură chimică definită, cunoscute în literatura de
specialitate, însă neutilizate până în prezent în scopuri terapeutice,
precum şi formele farmaceutice ale acestora
2. Medicament de referinta
un medicament autorizat în Romania sau un medicament autorizat în
unul din statele membre ale UE sau în UE prin procedura centralizată
44
• Introducerea unui medicament în arsenalul terapeutic impune, conform
legislaţiei adoptată de Ministerul Sănătăţii, obţinerea:
1. Autorizatiei de punere pe piata.
2. Autorizatia de fabricaţie şi înregistrare.
55
rezultatele:
• testelor farmaceutice (fizico-chimice, biologice, microbiologice)
• testelor preclinice (toxicologice, farmacologice)
• testelor clinice
descrierea sistemului de farmacovigilenţã
declaraţia privind faptul cã studiile clinice derulate în afara României şi UE
îndeplinesc criteriile etice din Normele referitoare la implementarea regulilor
de bunã practicã
rezumat al caracteristicilor produsului, macheta ambalajului secundar şi
primar, prospectul
document care sã ateste faptul cã fabricantul este autorizat sã producã
medicamentul în ţara sa
copie dupã fiecare autorizaţie de punere pe piaţã a medicamentului obţinutã
într-un alt stat însoţitã de lista statelor membre UE care examineazã cererea
copie dupã rezumatul caracteristicilor prodului propus de cãtre solicitant
copie a prospectului
detalii privitoare la decizii de refuz
dovadã cã solicitantul beneficiazã de serviciile unei persoane calificate,
responsabile cu activitatea de farmacovigilenţã
documente şi informaţii privind rezultatele testelor farmaceutice şi preclinice
ale studiilor clinice
66
Dezvoltarea
preclinica
EFECT TERAPEUTIC
• CALITATEA (ISO)
– reprezinta ansamblul de proprietăţi şi caracteristici ale unei entitãţi care
îi conferã acesteia aptitudinea de a satisface necesitãţi exprimate şi
implicite şi devine unic criteriu de patrundere a unui produs pe piaţa
naţională şi de susţinere a lui la export, deci un element esenţial
pentru succesul unei intreprinderi.
8
■ Țări membre ai asociației
■ Țări corespondente cu asociația
■ Țări observatoare
■ Țări cu ISO 3166-1 care nu sunt membre la ISO
9
Reguli de buna practica de fabricatie
INTRODUCERE
ISTORICUL REVIZUIRILOR
GLOSAR
10
Anexa 1 Fabricaţia medicamentelor sterile
Anexa 2 Fabricaţia medicamentelor biologice de uz uman
Anexa 3 Fabricaţia medicamentelor radiofarmaceutice
Anexa 4 Fabricaţia medicamentelor de uz veterinar altele decât cele imunologice
Anexa 5 Fabricaţia medicamentelor imunologice de uz veterinar
Anexa 6 Fabricaţia gazelor medicinale
Anexa 7 Fabricaţia medicamentelor de origine vegetală
Anexa 8 Prelevarea materiilor prime şi a materialelor de ambalare
Anexa 9 Fabricaţia lichidelor, cremelor şi unguentelor
Anexa 10 Fabricaţia medicamentelor sub formă de aerosoli presurizaţi pentru
inhalat, cu valvă dozatoare
Anexa 11 Sisteme computerizate
Anexa 12 Utilizarea radiaţiilor ionizante în fabricaţia medicamentelor
Anexa 13 Fabricaţia medicamentelor pentru investigaţie clinică
Anexa 14 Fabricaţia medicamentelor derivate din sânge şi plasmă umane
Anexa 15 Calificarea şi validarea
Anexa 16 Certificarea de către o persoană calificată şi eliberarea seriei
Anexa 17 Eliberarea parametrică
Anexa 19 Probe de referinţă şi contraprobe
Anexa 20 Managementul riscului în domeniul calităţii
11
ORGANIZAREA CONTROLULUI
MEDICAMENTELOR
• Pe baza unor situaţii alarmante, în anul 1962 s-a cerut la nivelul O.M.S.
reglementarea legislativa a fabricării, controlului şi distribuirii
medicamentului, instituirea unei autorităţi naţionale de control şi
formarea de personal calificat pentru acest domeniu.
14
14
• 1996 - România este reprezentata la Comisia Farmacopeei
Europene, din cadrul Consiliului Europei, cu statut de observator,
de un specialist din cadrul ICSMCF/ANM.
15
15
Misiunea Agentiei Nationale a Medicamentului si
Dispozitivelor Medicale:
contribuie la protejarea si promovarea sanatatii publice prin:
16
16
17
NORME DE CONTROL A
MEDICAMENTELOR
• 1. Farmacopeea Română ed. X + Suplimente
• 2. Farmacopeea Europeana
• 3. Norme interne.
• 4. Stass-uri.
• 5. Fişe analitice.
• 6. Lucrări de specialitate, etc.
18
18
CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL
MEDICAMENTULUI
Controlul fizico-chimic al medicamentului cuprinde 3 faze:
• 1. Identificarea componentelor.
• 2. Cercetarea purităţii.
19
19
1. Identificarea substanţelor medicamentoase
20
20
b) reacţii chimice specifice şi sensibile
Exemple:
microreacţiile (reacţiilor în picătură) care necesită cantităţi reduse de
probă şi de reactivi.
c) Microcristaloscopia
Exemple:
diferenţierea izomerilor optic activi, pe baza formei variate a cristalelor
rezultate prin tratarea substanţei de analizat cu reactivi speciali.
d) metoda cromatografică
Exemple:
separarea compuşilor medicamentoşi şi identificarea lor fie pe cale
chimică, fie prin parametrii cromatografici (Rf, VR, TR, etc.).
21
21
2. Cercetarea purităţii
• După gradul de puritate, substanţele pot fi grupate în:
substanţe tehnice
substanţe pure
substanţe chimic pure (pro analysi)
substanţe cu grad de puritate foarte avansat (pro chromatography, pro
spectroscopy).
22
22
• Decelarea impurităţilor:
• în substanţele minerale:
reacţii de precipitare
reacţii de culoare
alte tipuri de reacţii chimice, cât mai sensibile şi specifice
23
23
• Cercetarea purităţii substanţelor medicamentoase apelează şi la
metode instrumentale moderne:
gaz-cromatografia - urmărirea proceselor industriale de sinteză şi de
biosinteză a medicamentelor.
spectroscopia în UV - evidenţiază prezenţa impurităţilor puternic
absorbante care deformează spectrul normal al substanţei active.
spectroscopia IR - decelarea impurităţilor atunci când acestea se
găsesc în concentraţii suficient de mari sau atunci când provin din
modificări structurale ale unor grupări funcţionale ori ale moleculei
active în întregime.
polarografia, analiza termică, calorimetria diferenţială,etc.
24
24
3. Determinarea cantitativă
• Supradozarea ori subdozarea principiilor active dintr-un medicament va
avea consecinţe tot atât de grave asupra stării pacientului ca şi erorile
calitative.
• Produsele medicamentoase se pot doza prin metode fizice, chimice si
fizico-chimice:
metode clasice de analiza: (gravimetrice, titrimetrice)
metode instrumentale (absorbţiometrice, potenţiometrice,
cromatografice, etc.).
Metode chimice:
Avantaje:
procedee simple si precise
se bazeaza pe masuratori absolute
necesita echipament simplu, accesibil si usor de intretinut
Dezavantaje:
timp relativ mare de realizare a analizei
precizia scade cu micsorarea cantitatii de proba
lipsite de flexibilitate
uneori lipseste specificitatea
poluante pentru mediu
25
25
Metode fizico-chimice:
Avantaje:
determinari rapide si cu sensibilitate ridicata
se pot analiza cantitati mici de proba
se pot analiza probe complexe
Dezavantaje:
necesita etalonarea initiala si continua a aparatului
sensibilitatea si precizia depind de aparatura sau de metodele
chimice de etalonare
costul initial si de intretinere este ridicat
necesita uneori spatiu pentru aparatura
implica personal cu pregatire speciala
26
METODOLOGIA GENERALA DE CONTROL
A MEDICAMENTULUI
FR X - capitolul “Monografii- Metode generale de analiză”:
• Prelevarea probelor pentru analiză.
• Controlul organoleptic
• Determinări fizice şi fizico-chimice
• Determinări cantitative
• Determinări farmacognostice
• Determinări farmacotehnice
• Determinări biologice şi biochimice
• Controlul preparatelor radiofarmaceutice
FR-X:
• lot - o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară, din care se
obţin una sau mai multe serii de produse
28
28
PRELEVAREA PROBELOR
DEPOZIT FARMACII
Laborator
Cantitate – 4p Cantitate – 3p Cantitate – 3p Cantitate – 2p
Masa de analiza Cantitate – 3p
2p proba 2p proba 2p proba 1p proba
Cantitate – 1p 2p proba
2p contraproba 1p contraproba 1p contraproba 1p contraproba
1p contraproba
29
29
CONTROLUL ORGANOLEPTIC
Aspect
Culoare
30
30
DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI CHIMICE
DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII
• prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ
privind solubilitatea substanţelor în diferiţi solvenţi
• prevederile înscrise în cadrul altor alineate, cum ar fi
"solubilitatea în alcool", au un caracter obligatoriu, fiind
considerate teste de puritate
• Solubilitatea poate fi exprimată prin specificarea volumului de
solvent (în mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substanţă solidă
sau 1 ml substanţă lichidă, la temperatura de 20 20C.
• Verificarea solubilităţii substanţelor farmaceutice nu este
necesar să se efectueze în toţi solvenţii prevăzuţi în monografie,
ci este necesar să se controleze solubilitatea în cel puţin doi
solvenţi diferiţi.
• Dacă se constată prezenţa unor impurităţi insolubile, se verifică
solubilitatea şi în ceilalţi solvenţi prevăzuţi.
31
31
Diferitele solubilităţi pot fi exprimate şi cu ajutorul unor expresii - în
acest caz prevederile de solubilitate se referă la temperatura de 20
5oC.
32
32
• Când se prevede solubilitatea în soluţii de acizi sau în soluţii
de baze nu se precizează volumul din soluţia respectivă,
deoarece dizolvarea are loc ca urmare a unei reacţii chimice.
33
33
• La grăsimi, ceruri şi parafine, solubilitatea se determină
prin agitarea acestora cu solventul prevăzut, până la
dizolvarea sau topirea acestora, adăugarea solventului,
agitare până la răcire şi verificarea solubilităţii după ce
soluţia s-a ţinut la 20 20C timp de 2 ore.
34
34
• Masa substanţei luate în lucru pentru determinarea solubilităţii se
calculează astfel încât să rezulte, de obicei, 10 - 20 ml soluţie.
• În cazul substanţelor uşor solubile, precum şi în cazul substanţelor
foarte costisitoare, se prepară numai 1 - 2 ml soluţie.
ASPECTUL SOLUTIEI
• Claritatea soluţiei → LP
• Coloraţia soluţiei → LP
35
35
DETERMINAREA INDICILOR
• Indice de aciditate = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi
conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase,
balsamuri, ceruri etc.).
5.61 V
I
A m
în care:
- IA = indice de aciditate
- V = volumul de KOH 0.1 mol/l în apă folosit la titrare (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 5.61 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.1
mol/l.
36
36
• Indice de saponificare = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi şi a acizilor
rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat.
(V1 V2 ) 28.05
IS
m
în care:
- IS = indice de saponificare
- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH
0.5 mol/l în alcool.
37
37
• Indice de ester = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu
necesar pentru neutralizarea acizilor graşi rezultaţi din
saponificarea a 1 g probă de analizat.
în care:
- IE = indice de ester
- IS = indice de saponificare
- IA = indice de aciditate.
38
38
• Indice de hidroxil = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1
g probă de analizat.
(V1 V2 ) 28.05
IH IA
m
în care:
- IH = indice de hidroxil
- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- IA = indice de aciditate
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5
mol/l în alcool.
39
39
• Indice de iod = numărul de grame de iod fixat de 100 g probă
de analizat.
(V1 V2 ) 0.01269
II .100
m
în care:
- II = indice de iod
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 0.01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 ml Na2S2O3
0.1 mol/l.
40
40
• Indice de peroxid = numărul de mililitri de tiosulfat de sodiu
0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin
acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat.
10 (V2 V1 )
Ip
m
în care:
- IP = indice de peroxid
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului
(ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 10 = nr. de ml de Na2S2O3 1 mol/l necesari pentru a obtine 0.01
mol/l
41
41
SUBSTANŢE NESAPONIFICABILE
• Substanţe nesaponificabile - substanţele nevolatile la 1050 C,
obţinute din uleiuri, ceruri etc., după saponificare cu un hidroxid
alcalin şi extracţie cu un solvent organic.
5 g probă
50 ml soluţie KOH în alcool (2 mol/l)
100 ml apă de 80 oC
Palnie separare
Extractie cu eter (de 3x)
Spalare cu apa
Reactie neutra la fenolftaleină
Filtrare pe Na2SO4 anh
Distilare
Reziduu (m = ct.), raportare la 100 g P.V.
42
42
DETERMINAREA PUNCTULUI DE FIERBERE
Punctul de fierbere al unui lichid - temperatura corectată, la care presiunea
de vapori a lichidului este egală cu 101.3 kPa (760 mmHg).
• Se foloseşte:
o eprubetă prevăzută cu un dop perforat la mijloc
introdusa într-un balon care conţine parafină
lichidă (R).
un termometru la care se ataşează un tub capilar
închis la partea superioară
• Determinare:
lichidul de analizat se introduce în eprubetă
termometrul cu tubul capilar se cufundă în lichid
se incălzeste treptat, cu 2 - 30C/minut
la început are loc o uşoară degajare de bule de gaz
de la capătul inferior al tubului capilar
in momentul când se ajunge la punctul de fierbere
şi în lichid apare un lanţ continuu de bule de gaz,
becul se îndepărtează
viteza de degajare a bulelor de gaz scade şi când
degajarea acestora încetează şi lichidul are tendinţa
de a fi absorbit în tubul capilar termometrul arată
temperatura de fierbere. 43
43
• Dacă determinarea se efectuează la o altă presiune, diferită
de presiunea normală, temperaturile de fierbere citite trebuie
corectate pentru presiunea normală, conform formulei:
t1 t 2 k( p1 p2 )
în care:
- t1 = temperatura corectată
- t2 = temperatura citită
- k = factor de corecţie prevăzut în tabel
- p1 = 101.3 când presiunea barometrică este măsurată în
kilopascali sau 760 când presiunea barometrică este
măsurată în milimetri coloană mercur
- p2 = presiunea barometrică din timpul determinării.
44
44
Valoarea factorului de corecţie (k) depinde de punctul de fierbere
al lichidului de analizat:
45
45
DETERMINAREA PUNCTULUI DE SOLIDIFICARE
• Punct de solidificare sau punct de congelare = temperatura
cea mai ridicată la care o substanţă lichidă sau o substanţă
solidă adusă în stare lichidă prin topire trec din faza lichidă în
faza solidă.
Dispozitiv:
eprubetă cu pereţii groşi, prevăzut cu un dop
prin care trece un termometru divizat din 0.5 în
0.50C şi un tub de sticlă deschis la ambele capete,
prin care pătrunde un agitator.
eprubeta se fixează cu ajutorul unui dop într-o
altă eprubetă exterioară cu pereţii groşi, cu
diametrul de aproximativ 35 mm, care serveşte ca
baie de aer.
dispozitivul se introduce într-un vas înalt, cu
capacitatea de 1000 ml, care conţine apă sau un
amestec de răcire, astfel încât nivelul lichidului
din vas să se afle deasupra nivelului substanţei
din eprubetă.
vasul este prevăzut cu un agitator şi cu un
46
46
termometru.
Tehnica de lucru:
47
47
DETERMINAREA PUNCTULUI DE PICURARE
Punct de picurare = temperatura la care se desprinde prima picătură din
substanţa încălzită în aparatul Ubbelohde
Se efectuează la produsele de consistenţă solidă sau moale care prin
încălzire se topesc şi curg.
Aparatul este format din:
două manşoane metalice (a) şi (b)
manşonul metalic (a) este fixat la un
termometru cu mercur.
termometrul trebuie astfel gradat încât
intervalul care reprezintă 1oC să aibă
dimensiunea de 1 mm. Baza rezervorului cu
mercur trebuie să se găsească la nivelul
marginii inferioare a două lame (e) care strâng
manşonul metalic (b).
Manşonul metalic (b) are un orificiu lateral (c)
care permite egalizarea presiunii şi este
prevăzut cu trei puncte de oprire (d) pentru
cupa metalică (f) de formă cilindrică.
Cupa metalică (f) se montează în manşonul
metalic (b) până la punctele de oprire (d).
Aparatul este menţinut suspendat în centrul
unei eprubete, cu lungimea de 200 mm şi
diametrul de 40 mm, care serveşte ca baie de
aer.
Aparatul Ubbelhode 48
48
• Cupa metalică (f) se umple cu proba de analizat
(netopită) si se fixează între cele două lame (e).
Lichidul din pahar se încălzeşte, se agită cu o
baghetă de sticlă, până când termometrul arată
o temperatură cu 100C sub punctul de picurare
presupus şi se continuă încălzirea, astfel încât
temperatura să se ridice cu 10C/minut. Se
notează temperatura când se desprinde prima
picătură din cupa metalică (f).
49
49
DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
• Punct de topire = temperatura la care o substanţă se topeşte
complet.
• Dacă substanţa se topeşte cu descompunere, se consideră punct de
topire sau punct de descompunere, temperatura la care substanţa
îşi schimbă aspectul (se brunifică sau apar bule de gaze).
51
51
În unele cazuri, specificate în monografii, punctul de topire se determină cu
un microscop special prevăzut cu un dispozitiv de încălzire.
1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5 – sursă de lumină 5
6 – ocular
7 – mâner pentru poziţionarea probei
4
7 3
52
52
p.t. - grăsimi, ceară, răşini şi produse asemănătoare
un tub de sticlă deschis la ambele capete, (cu lungimea de 10 cm, cu
diametrul interior de 2 mm şi cu grosimea peretelui de 0.5 mm) se introduce,
prin presare şi rotire, în masa solidă ca atare (de exemplu unt de cacao) sau
în masa solidă topită
53
53
DETERMINAREA INTERVALULUI DE DISTILARE
Tehnica de lucru:
100 ml lichid de analizat se
măsoară cu un cilindru gradat şi se
introduc într-un balon de distilare
(a), în care se găsesc câteva
fragmente de porţelan poros, având
grijă ca lichidul să nu atingă gâtul
balonului şi, în special, tubul
lateral
55
55
În cazul determinării intervalului de distilare al unui lichid se citeşte
temperatura la care distilează primele cinci picături de lichid
(temperatura iniţială de distilare) şi temperatura la care distilează
totalitatea lichidului (temperatura finală de distilare).
56
56
Pentru lichidele care distilează < 800C, încălzirea se
efectuează pe baia de apă, cu răcirea foarte activă a
refrigerentului.
57
57
DETERMINAREA APEI
1. Determinarea titrimetrică cu reactivul Karl – Fischer
• Metoda:
se bazează pe reacţia dintre apă şi soluţia de dioxid de sulf, iod şi
piridină în mediu de alcool metilic absolut
se aplică produselor care nu reacţionează cu componentele reactivului
Karl - Fischer.
titrarea se efectuează de preferinţă într-un aparat cu circuit închis, ferit
de umiditatea atmosferică.
Metanol anhidru
Biuretă închisă
Titrare până la (I)
consumarea apei Soluţie de titrare
Probă - iod
- dioxid de sulf
- bază (ex. Py)
Titrare până la (II) în metanol anh.
echivalenţă
58
58
sfârşitul titrării se stabileşte prin schimbarea culorii soluţiei in galben -
brun sau potenţiometric
conţinutul în apă al probei se calculează după formula:
în care:
- V1 = volumul reactivului Karl - Fischer folosit la titrarea probei
(ml)
- V2 = volumul reactivului Karl - Fischer folosit la titrarea
martorului (ml)
- T = titrul reactivului Karl - Fischer
- m = masa probei luate în lucru (mg).
59
59
2. Antrenarea cu vapori de solvenţi organici
Metoda:
are la bază antrenarea vaporilor de apă de
către vaporii unui solvent nemiscibil cu apa
se foloseşte în cazul unor produse lichide
sau moi şi al unor produse vegetale cu un
conţinut ridicat în ulei volatil
în care:
Aparat pentru determinarea apei
- V = volumul apei din eprubeta prin antrenare cu vapori de
gradată (ml) solvenţi organici
- m = masa probei luate în lucru
60
60
REZIDUUL PRIN CALCINARE
• Reziduul prin calcinare = reziduul obţinut prin calcinarea unei
substanţe anorganice sau organice.
• In cazul produselor vegetale reziduul obţinut se numeşte cenuşă.
• Calcinarea cu acid sulfuric
după carbonizarea probei respective, creuzetul se răceşte şi se adaugă
acid sulfuric
se încălzeşte cu precauţie pe sită până la îndepărtarea vaporilor de acid
sulfuric şi se calcinează până la masă constantă.
limitele admise se exprimă în grame şi se calculează procentual (% m/m).
determinarea se efectuează în creuzete din porţelan, nichel sau platină şi
este condusă după tehnica cunoscută: încălzire, calcinare, cântărire la
pondere constantă
eventualele urme de cărbune se îndepărtează cu ajutorul apei, apei
oxigenate sau acidului nitric.
• Reziduul insolubil în acid clorhidric 100 g/l
la reziduul obţinut după calcinare se adaugă HCl 100 g/l
creuzetul acoperit cu o sticlă de ceas se încălzeşte pe baia de apă, se
adaugă apă caldă, se filtrează printr-un filtru fin, precipitatul se spală
până la îndepărtarea urmelor de clorură
filtrul cu precipitat se usucă la 1050C şi se aduce în creuzetul iniţial,
calcinându-se până la masă constantă.
61
61
DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
• se bazează pe distilarea alcoolului
• se determina densitatea sau indicele de refracţie a distilatului
hidroalcoolic.
• Determinare:
se foloseşte un aparat de distilare cu alonjă care trebuie să pătrundă în
apă
se distilă nu mai mult de 30 minute
se determină densitatea relativă cu ajutorul picnometrului şi se citeste
concentraţia în alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.
în care:
- c = concentraţia în alcool a distilatului
corespunzătoare densităţii relative (% m/V)
- m = masa probei luate în lucru (g).
62
62
Dacă proba conţine:
63
63
PIERDEREA PRIN USCARE
• Determinarea:
se efectuează în fiole de cântărire al căror diametru se alege
astfel încât proba luată în lucru să formeze un strat de
aproximativ 5 mm grosime, cu excepţia produselor vegetale
(rădăcini, scoarţe, frunze etc.), la care grosimea stratului poate
fi mai mare (cel mult 2 cm)
fiola de cântărire se aduce la masă constantă în
aceleaşi condiţii în care urmează să se efectueze
determinarea.
64
64
proba luată în lucru, a cărei masă este prevăzută în
monografia respectivă, se pulverizează, dacă este cazul, se
uniformizează prin amestecare şi se cântăreşte la balanţa
analitică
procedee:
- Uscarea în exsicator
- Uscarea în etuvă
- Uscarea în vid
65
65
Uscarea în exsicator
se efectuează în prezenţa unor substanţe deshidratante: acid sulfuric
(R), pentoxid de fosfor (R), clorură de calciu anhidră (R), silicagel
anhidru (R)
Uscarea în etuvă
fiola de cântărire cu proba luată în lucru se ţine în etuvă, la 1050C,
timp de 3 - 4 ore, dacă nu se prevede altfel, se răceşte în exsicator şi se
cântăreşte
se continuă uscarea pe perioade de câte o oră, urmate de răcire în
exsicator şi cântărire, până la masă constantă
Uscarea în vid
se efectuează în etuvă sau în exsicatoare speciale,
conform prevederilor din monografia respectivă
presiunea este de cel mult 2.7 kPa (20.3 mmHg),
dacă nu se prevede altfel.
66
66
PLANUL CURSULUI
67 67
ETAPE in Analiza medicamentelor
selecţionarea probei
măsurarea probei
separarea componenţilor
determinarea analitică
Cerinte:
exactitate
selectivitate
sensibilitate
rapiditate
accesibilitate.
70 70
Schema generală a unui proces de separare:
A treia etapă se despart fazele prin operaţii mecanice sau fizice şi mai
rar chimice.
unde:
- [A] = concentraţia molară
sau:
unde:
- mA = masa solutului A
- MA = masa moleculară a solutului A
- V1, V2 = volumele fazelor.
• Raportul maselor aceluiaşi solut în cele două faze poartă numele de raport de
distribuţie sau factor de capacitate K. Acesta reprezintă o distribuţie
corectată cu volumele de fază ( = V1/V2):
K = D
Factorul de capacitate:
măsoară eficienţa separării
permite optimizarea separării 73
73
2. EFICIENŢA SEPARǍRII
Obiective:
gradul superior de izolare a componentilor in medii libere de
interferente, care sa permita determinarea lor corecta.
recuperarea cantitativă a tuturor componenţilor (sau numai a unor
componenţi) din proba supusă procedeului de separare
Marimi:
Factorul de recuperare – R
Factorul de separare – S
Factorul de selectivitate -
Factorul R – cromatografic
74 74
Factorul de recuperare (R)
75 75
Factorul de separare (S)
Factor de separare S:
măsoară eficienţa separării a doi componenţi A şi B
se defineste, de obicei, în funcţie de componentul care interferează:
76 76
Factorul de selectivitate ()
Factorul de selectivitate
are semnificaţii în funcţie de tipul de metodă
în distilare = raportul presiunii vaporilor.
în metodele de separare bazate pe echilibre interfazice = raportul
coeficienţilor de distribuţie ai celor doi componenţi.
77 77
Factorul R – cromatografic
78 78
Fiecărui component îi corespunde o valoare R dată de
raportul dintre media vitezei de migrare a zonei şi media
vitezei de deplasare a fazei mobile:
unde:
- dz = deplasarea zonei (z)
- V = volumul fazei mobile
- AM = aria secţiunii transversale a coloanei ocupata de faza mobilă
- AS = aria secţiunii transversale a coloanei ocupata de faza staţionară
- D = coeficientul de distribuţie
79 79
Considerând că:
AM şi AS rămân invariabile de-alungul coloanei
procesul cromatografic se desfăşoară liniar (D = constant)
unde:
- V = s x AM
- s = distanţa parcursă de solvent.
R A A M DB A S
RB A M D A A S
81 81
3. MECANISMELE SI FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ
PROCESELE DE SEPARARE
82 82
structura moleculelor în condiţii de coprezenţă
polarităţile moleculelor
forţele ce pot genera asocierile reversibile sau ireversibile care
reţin selectiv un component într-o fază, izolându-l de ceilalţi.
Molecula unui solut este supusă unor interacţii provenite din trei
direcţii:
interacţii cu moleculele fiecăreia din cele două faze cu care
vine în contact
interacţii cu propriile molecule vecine.
84 84
Legăturile interionice
85 85
Forţele van der Waals:
scad exponenţial cu distanţa dintre nucleele
atomilor cei mai apropiaţi ai moleculelor considerate
moleculele nu numai că se atrag, dar se şi resping
când distanţa dintre ele este prea mică.
86 86
Legăturile de hidrogen
87 87
prin volatilizare cromatografice
- Distilare
4. METODE DE SEPARARE
prin extracţie:
- lichid-lichid
- solid-lichid
- in faza solida
- cu fluide supercritice
88 88
METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE
- DISTILAREA -
89 89
1. Echilibrul de distribuţie vapori-lichid
DA
Av
Al
90 90
2. Volatilitatea relativă
este o măsură a diferenţei dintre volatilităţile a 2 componenţi.
se defineşte prin:
raportul dintre fracţiunile molare ale unei specii în stare de vapori (x)v
şi în stare lichidă (x)l
presiunea sa parţială raportată la fracţiunea molară din faza lichidă
(x)l.
91 91
3. Talerul teoretic
92 92
Legea Raoult pentru soluţii ideale
Atunci când un sistem binar de lichide A şi B respectă legea Raoult
la orice concentraţie a amestecului, se numeşte sistem ideal.
unde:
- xA este fracţia molarǎ a lui A în lichid;
- pA0 este presiunea vaporilor de A pur la o temperaturǎ datǎ.
94 94
DISTILAREA SIMPLĂ
95 95
Instalaţia pentru distilarea simplă:
sursa de incalzire
flacon de distilare
cap de distilare care conectează
flaconul de distilare la condensator
termometru
adaptor de distilare care leagă
condensatorul cu flaconul de
colectare
flacon de colectare
96 96
Tehnica de lucru:
97 97
DISTILAREA FRACŢIONATĂ
Distilarea fracţionată
se utilizează pentru separarea unui amestec de lichide
a căror puncte de fierbere sunt apropiate în cicluri
repetate vaporizare-condensare, în interiorul unei coloane
de fracţionare.
98 98
Instalaţia pentru distilarea fracţionată:
Tehnica de lucru:
lichidul ce trebuie purificat este
încălzit
vaporii urcă în coloana de
fracţionare
condensează pe pereţii
condensatorului şi la suprafaţa
materialului de umplutură
condensatul continuă să fie încălzit
de vaporii fierbinţi ce urcă şi va fi
revaporizat
de fiecare dată rezultă vapori din ce
în ce mai concentraţi în
componentul mai volatil
99 99
Coloana de fracţionare:
lungimea şi materialul component influenţează numărul de
recondensări, numărul de talere teoretice, implicit separarea.
este utilizată pentru a furniza un gradient de temperatură peste
cel necesar distilării.
În situaţii ideale:
o temperatura în flaconul de distilare trebuie să fie egală cu punctul
de fierbere al amestecului de lichide
o temperatura de la capătul coloanei de fracţionare trebuie să fie
egală cu cel mai scăzut punct de fierbere al componenţilor.
În realitate:
o fracţiunile de distilat trebuie să fie colectate pe măsura
desfăşurării distilării, concentraţia în compusul cu punctul de
fierbere cel mai mare fiind crescătoare
o Fracţiunile de distilat, ce sunt colectate într-un interval de
temperatură mic, vor fi mai pure.
o Alte fracţiuni trebuie colectate pe măsura schimbării temperaturii,
acestea fiind redistilate pentru a creşte gradul de puritate.
100 100
Într-o distilare fractionată ideală, se obţin douǎ fracţiuni
diferite:
prima - corespunde componentului cu punctul de fierbere
cel mai mic
a doua - corespunde compusului cu punctul de fierbere
mai mare.
101 101
Curbe de distilare
102 102
Legea Raoult pentru soluţii neideale
103 103
Punctul de fierbere al
compusului A pur este de 74oC
Punctul de fierbere al
compusului B este de 69oC.
104 104
DISTILAREA AZEOTROPĂ
105 105
3. distilarea ce foloseşte săruri ionice; sărurile disociază în
amestecul de lichid şi modifică volatilitatea relativă
suficient de mult ca separarea să devină posibilă
106 106
METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE
107 107
PARAMETRII PROCESULUI DE EXTRACŢIE
2. sedimentarea
3. decantarea
5. recuperarea solvenţilor
109 109
Prin aplicarea legii maselor rezultă coeficientul de repartiţie, D:
110 110
Coeficientul de extracţie
111 111
Factorul de recuperare
Randamentul de extractie
[ B] VB
100
[ B] VB [ A] VA
112 112
SISTEME DE EXTRACŢIE
Se clasifica în funcţie de:
o compuşii care se extrag: săruri anorganice, combinaţii complexe
formate de cationi anorganici cu reactivi organici sau compuşi chelaţi
simpli, poliacizi, perechi ionice formate dintr-un ion complex metalic
şi un ion reactiv organic etc.
Solventi:
Hidrocarburi lichide: n-hexan, n-heptan, benzen, toluen, xilen
Derivati halogenati: cloroform, tetraclorura de carbon
Cetone: acetona, metilizobutilcetona
Eteri: eter etilic, dioxan, terbutileter
Alti solventi: acetonitril, dimetilsulfoxid, dimetilformamida
113 113
Avantajele extractiei lichid-lichid
114
PROCEDEE DE EXTRACŢIE LICHID-LICHID
1. Extracţia simplă
2. Extracţia continuă
3. Distribuţia în contracurent.
115 115
1. EXTRACŢIA SIMPLĂ
116 116
Extracţia simplă cu contact multiplu (extracţia în
echicurent)
118 118
3. DISTRIBUŢIA ÎN CONTRACURENT (Countercurrent
Distribution -CCD)
119 119
ALTE PROCEDEE DE EXTRACŢIE
1. Procedeul Craig
2. Extracţia cu contact multiplu
3. Extracţia cu reflux
4. Extracţia diferenţială;
5. Extracţia în contracurent şi curgere bilateralǎ.
1. Procedeul Craig
Este cel mai cunoscut şi eficient procedeu pentru realizarea
extracţiei în contracurent.
Este denumit şi extracţie prin repartiţie fracţionată simplă.
Aparatele moderne au peste 1000 de tuburi, procesul putând fi
automatizat.
120 120
Pâlnii (tuburi) Craig pentru extracţie în contracurent
a - de echilibrare a fazelor
b - poziţie de separare a fazelor (faza extractantă curge din 2 în 3, faza rafinat rămâne în 1)
c - poziţie finală, extractantul se deplasează din 4 în pâlnia următoare
121 121
2. Extracţia cu contact multiplu
3. Extracţia cu reflux
122 122
4. Extracţia diferenţială
se realizează într-un extractor constituit dintr-o coloană cu
umplutură sau dintr-un turn de pulverizare, în care unul din
lichide circulă într-un sens (faza continuă), iar celălalt este
dispersat în picături (faza dispersă) parcurgând coloana în sens
invers, ascendent sau descendent după densitate.
APARATURA
depinde de prima etapă
termeni ce indicǎ tipul de aparat utilizat:
o “solid bed” sau “fixed bed” - se referă la orice operaţie în care prin materialul
solid fix trece solventul utilizat pentru extracţie
o “dispersed contact” - se referă la operaţiile în care particulele solide, suspendate
în fluid sunt în mişcare relativă unele faţă de altele şi faţă de solvent, în timpul
contactului solid-solvent.
124 124
1. Extractorul Soxhlet
este un aparat de extracţie continua
necesitǎ utilizarea unui solvent cu punct de fierbere mic
se va acorda atenţie substanţelor extrase, labile la încǎlzire
125 125
in extractor se pot introduce cartuşe sau “degetare” (thimles)
confecţionate din hârtie sau alte materiale
127 127
EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA
(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)
rezultatul
analiţii de interes doriţi sau impurităţile nedorite din proba sunt reţinute
pe faza staţionară
partea care trece prin faza staţionară este colectată sau casată (daca
conţine analiţii doriţi sau impurităţile nedorite)
in cazul în care porţiunea reţinută în faza staţionară include analiţii
doriţi, aceştia pot fi apoi separaţi din faza staţionară prin colectare printr-un
proces suplimentar, în care faza staţionară se spală cu un eluent
corespunzător.
128
Etapele SPE
130
cartuşele de extracţie in fază solidă şi discurile sunt disponibile cu o
varietate de faze staţionare din care se pot separa analiţii în funcţie de
proprietăţile chimice
cele mai multe faze staţionare sunt bazate pe silice, pe care a fost inserată
o grupă funcţională specifică
unele dintre aceste grupări funcţionale includ:
lanţuri de hidrocarburi de lungime variabilă (SPE cu fază inversă)
grupă de amoniu cuaternar sau grupe amino (schimb anionic)
acid sulfonic sau grupări carboxil (schimb cationic).
131
SPE CU FAZĂ INVERSĂ
132
Silicagelul şi suprafaţa polară modificată
133
SPE PRIN SCHIMB IONIC
schimbul de ioni are loc pe baza interacţiunilor electrostatice între
analit şi grupările din faza staţionară
pentru ca schimbul de ioni să se producă, atât în faza staţionară cat şi
în probă trebuie să fie un pH adecvat în care se face schimbul.
134
SCHIMBUL ANIONIC
136
Aplicaţiile SPE
• Determinarea unor medicamente cu caracter acid/neutru/bazic
137
alprenolol
Profilul de eluţie al
compuşilor bazici
difenhidramină
nortriptilină
138
ibuprofen
Profilul de eluţie
al compuşilor
acizi
acid nalidixic
naproxen
139
Profilul de eluţie al
compuşilor neutri –
hidrocortizon
Concluzii:
• recuperări mari
• selectivitate îmbunătățită
• specificitate și reproductibilitate
142
MICROEXTRACŢIA SP (SPME)
A Bacid tartric
pH = 4 -5
Et-O-Et
Fractiune nemiscibila Fractiune miscibila
cu apa cu apa
PRINCIPII GENERALE
147
Curba gaz-lichid este
cunoscută drept curba de
fierbere.
Dacă ne mişcăm ascendent
de-alungul curbei de
fierbere, temperatura şi
presiunea cresc împreună,
atunci lichidul începe să fie
mai puţin dens datorită
73.8 expansiunii termice şi gazul
începe să fie mai dens la
presiune ridicată.
Densitatile celor două faze
converg şi încep a fi identice,
diferenţa dintre gaz şi lichid
dispare şi curba de fierbere
Diagrama presiune –temperatură se termină in punctul critic
pentru CO2 (coexistă 3 faze).
148
• Capacitatea de dizolvare - este mai mare decât aceea a lichidului
corespunzator. Poate să varieze prin modificarea temperaturii şi presiunii, cu o
influenţă mai puternică a celei din urmă, mai ales în vecinătatea imediată a
punctului critic, aşa numita regiune apropiată de critic.
ρ
S 1.25P 1/2
c
ρ liq
unde:
o S = solubilitate
o ρ = densitatea gazului
o ρliq = densitatea lichidului
149
Parametrii critici ai unor compuşi utilizaţi ca fluide supercritice
150
DIOXIDUL DE CARBON SUPERCRITIC
Avantaje:
Toxicitate redusă.
Este bacteriostatic.
152
Efecte de modificare
Modificatori/antrenanţi :
Exemple de modificatori:
o solvenţi tradiţionali: alcooli (metanol, etanol, izopropanol),
hidrocarburi clorurate, hexan, acetonă, apa
153
APA SUPERCRITICĂ
154
Proprietăţile apei la 250
atmosfere
155
METODE DE EXTRACŢIE CU FLUIDE
SUPERCRITICE
1. Extracţia lichid-fluid supercritic
o Este similară extracţiei lichid-lichid.
o Se utilizeazǎ pentru:
creşterea concentraţiei în etanol în soluţiile apoase
îndepărtarea alcoolului din bere.
156
Exemple de plante pentru care se poate utiliza
extracţia cu fluide supercritice
Nr. Nume plantă Parte utilizată Produşi extraşi
1 Calendula flori oleorăşini
officinalis
2 Echinacea ȋntreaga plantă alkamide, polifenoli incluzând acid
purpurea cicoric, carbohidraţi
3 Eucalyptus spp frunze ulei esenţial
4 Ginkgo biloba frunze flavonoide şi terpenoide
5 Hypericum herba naftodiantone, hipericină şi
perforatum pseudohipericină
6 Levisticum rizomi uscaţi, rădăcini uleiuri esenţiale
officinale
7 Matricaria flori oleorăşini
chamomilla
8 Mentha spp. frunze uleiuri esenţiale
9 Origanum spp. herba uleiuri esenţiale
10 Piper methysticum rizomi, rădăcini kava lactone
11 Piper nigrum fructe oleorăşini
12 Saccharum spp ceară alcooli cu lanţ lung
13 Serenoa repens fructe acizi graşi liberi, fitosteroli (concentraţii
mici), alcooli graşi, TG
14 Taxus brevifolia scoarţă taxol
15 Taxus cuspidate ace paclitaxel si bacatin III
16 Vitis vinifera seminţe procianidine
17 Zingiber officinale rizom oleorăşini 157
Extractor cu fluide supercritice
pentru lichide şi solide
158
Avantajele extracţiei cu fluide supercritice:
159
APLICAŢIILE EXTRACŢIEI CU
FLUIDE SUPERCRITICE
160
• Industria farmaceutica:
161
• Alimentaţie şi agricultură:
• Industria petrochimică:
162
IDENTIFICAREA CHIMICA A MEDICAMENTELOR
Ag+
Substante medicamentoase: nitrat de argint, protargol, argint
coloidal, saruri de argint
Reactii identificare:
HCl → AgCl
NaOH + CuSO4 → precipitat + coloratie violeta
Hg+22, Pb+2
nu sunt folositi in substante medicamentoase
163
163
Grupa analitica II – H2S
Hg+2
Substante medicamentoase: HgO, saruri de mercur
Reactii identificare:
2 HCl → HgCl2
HgCl2 + 2 KI → HgI2
HgI2 + 2KI → K2[HgI4]
Bi+3
Substante medicamentoase: (BiO)2CO3 . 1/2H2O, Bi5O(OH)9(NO3)4
Reactii identificare:
Bi+3 + S-2 → Bi2S3
Bi+3 + 3I- →BiI3
BiI3 + I- → [BiI4]-
164
Grupa analitica III – (NH4)2S
Zn+2
Substante medicamentoase: ZnO, ZnCl2, ZnSO4.7H2O
Reactii identificare:
2 NaOH → Zn(OH)2
+ NaOH → [Zn(OH)4]-2
Na2S → ZnS
Al+3
Substante medicamentoase: Al(OH)3, Al2(SO4)3.18H2O
Reactii identificare:
NaOH → Al(OH)3
+ NaOH → [Al(OH)4]-
165
Grupa analitica IV – (NH4)2CO3
Ca+2
Substante medicamentoase: CaCl2, CaCO3, gluconat de calciu,
glicerofosfat de calciu, fosfat tribazic de calciu, lactat de calciu
Reactii identificare:
coloreaza flacara in rosu-caramiziu
oxalat de amoniu → Ca(COO)2
Ba+2
Substante medicamentoase: BaSO4
Reactii identificare:
coloreaza flacara in galben-verzui
SO4-2 → BaSO4
166
Grupa analitica V
Mg+2
Substante medicamentoase: MgO,MgSO4.7H2O, carbonat bazic de
magneziu, stearat de magneziu, glutamolactat de magneziu
Reactii identificare:
NH4Cl + Na2HPO4 + NH3 → MgNH4PO4
NET → coloratie rosie
Na+
Substante medicamentoase: NaCl, NaBr, NaF, NaHCO3, cetistearat de
sodiu, ciclamat de sodiu, glicerofosfat, LSS
Reactii identificare:
coloreaza flacara in galben
acetat de uranil → NaUO2(CH3COO)3
167
NH4+
Substante medicamentoase: NH4Cl, NH4Br
Reactii identificare:
reactiv Nessler
NaOH, t0C
K+
Substante medicamentoase: KCl, KBr, KMnO4, tiocol, tartrat de
sodiu si potasiu, tartrat acid de potasiu
Reactii identificare:
acid tartric → precipitat alb cristalin
coloreaza flacara in violet (prin sticla de cobalt)
Li+
Substante medicamentoase: Li2CO3
Reactii identificare:
coloreaza flacara in rosu carmin
HCl + NaOH + Na2HPO4 → Li3PO4
168
168
Identificarea unor anioni
169
169
IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR ORGANICE
TESTE DE CULOARE
Foarte multe substanţe dau coloraţii distincte atunci când reacţionează
cu diverşi compuşi
Testele de culoare:
teste generale
“teste speciale”
- se produc coloraţii cu un singur reactiv şi sunt specifice numai unui
singur component
- aduc un aport deosebit la identificarea substanţelor, dar validarea
rezultatului trebuie confirmată după determinarea unor constante sau
caracteristici fizice, cum ar fi spectrul IR etc
170
170
Teste generale
se referă la coloraţia sau coloraţiile obţinute prin tratarea unor
substanţe medicamentoase cu diferiţi reactivi de natură
anorganică.
171
171
172
172
173
173
174
174
175
175
176
176
MICROTESTE
Foarte multe reacţii de culoare pot avea loc în condiţiile unor concentraţii scăzute
de ordinul microgramelor. Aceste reacţii se pot executa cu ajutorul unor
microcapilare sau micropipete.
177
177
2.Testul Vitali
se aplică alcaloizilor cu
nucleu tropanic
se observa mai multe
coloraţii:
- coloraţia A se obţine după
tratarea probei cu acid nitric
concentrat
- coloraţia B se observă după
evaporarea la sec pe baia de
apă a probei tratate cu acid
nitric
- coloraţia C se obţine la
tratarea reziduului colorat B cu
o soluţie proaspăt preparată de
hidroxid de potasiu etanolic.
178
3.Testul cu molibdat de amoniu (testul Froehde)
5. Alte microteste:
- p-dimetilaminobenzaldehida
- clorura ferică
- paraformaldehida cu acid fosforic
- acid sulfuric
- testul taleochinic.
179
179
TESTE DE MICROCRISTAL
sunt teste simple, rapide, sensibile şi specifice pentru identificarea unui număr
mare de substanţe medicamentoase.
In forma sa cea mai simplă testul constă în amestecarea unei picături din
soluţia substanţei de analizat cu aceeaşi cantitate din soluţia unui reactiv.
Această examinare este posibilă dacă există cantitate suficientă din proba de
analizat şi dacă cristalele care trebuie să se formeze apar instantaneu sau în
foarte scurt timp.
181
181
Când a avut loc obţinerea cristalelor, acestea se vor observa din punct de
vedere al aspectului, poziţiei şi dispunerii lor. Pot fi de asemenea
fotografiate.
Trebuie avut în vedere că anumite cristale sunt instabile, putând dispare într-o
oră sau într-un interval mai mic. Acestea se compară imediat sau se
fotografiază.
Ac = cristal lung şi
subţire cu capetele
ascuţite.
Lamă = formă
asemănătoare acului ce
devine plat când lungimea
şi lãţimea cresc în mod
egal şi proporţional.
Baghetă = formă
asemănătoare unui ac
având însă capetele
pătrate.
Tabletă = placă de grosime apreciabilă ce devine prismă când
creşte în grosime.
183
183
Stea = rozetă cu patru sau cel mult şase colţuri, în timp ce o
cruce defineşte un cristal de această formă.
Buchet = complex de
cristale denumite astfel
când toate sunt orientate
în aceeaşi direcţie.
Dendritele = cristale cu
multe ramificaţii.
Rozetă = colecţie de
cristale ce radiază dintr-o
singură încrengătură.
Evantai sau o coamă = îngrămădire de astfel de rozete.
184
184
Reactivi
185
185
o acid picric (soluţie saturată apoasă) pentru: acetofenazina, acetildihi-
drocodeina, ambazina, atropina, benzocaina, fenazona, fentanil,
guanetidina, ergometrina, nicotinat de benzil, primaquin
o acid picrolonic (soluţie saturată apoasă) pentru:
acetildihidrocodeină, fentermin, ftalilsulfatiazol, piperazina, proguanil.
o acid stifnic (5 % în apă) pentru: acefilina, buformin, dipiridamol,
folcodin, imipramina, propranolol, racemetorfan
o acid trinitrobenzoic (soluţie saturată apoasă) pentru: acriflavina,
azapetin, benzamin, ergometrina, etacridina, perfenazina,
racemetorfan
o bromura de aur (5 g AuBr3, 5 g NaBr la 100 ml apă) pentru:
adrenalină, ametocaina, amicarbalid, apomorfina, buformin, carbacol,
clorpromazina, feniramina, metronidazol, propranolol, oxitetraciclina
o bromura de platină (5 g PtBr4, 10 g NaBr la 100 ml apă) pentru:
alfameprolin, azapetin, dexamfetamina, metadona
o carbonat de sodiu (5 % în apă) pentru: aconitina, adrenolona,
amifenazol, antazolin, clordiazepoxid, cinconina, cinconidina,
chinidina, tetraciclina, tebaina
o cianura de aur (5 g AuBr3 şi NaCN până la redizolvarea
precipitatului în 100 ml apă): azacosterol, desipramina, mepacrina,
tioridazina
o cianura de potasiu (5 % în apă): antazolin, iohimbina, levome-torfan,
lobelina
186
186
o clorura de aur (5 % în apă) pentru: amilocaina, cafeină,
clorpromazina, cocaina, feniramina, metildopa, tiamina
o clorura mercurică (5 % în apă): acetilcolina, adrenalina, amidopirina,
benzocaina, cofeină, metadona, tebaina, vancomicina
o clorura de platină (5 % în apă): acefilina, acepromazina, aletamin,
alfameprodin, ametazol, cinconidina, droperidol, stricnina, tiamina
o clorura de zinc (5 % în apă): alfametadol, benzetoniu, imipramina,
papaverina, norcodeina, metixen
o cromat de potasiu (5 % în apă): acetofenazina, alfametadol,
desipramina, sulfanilamida
o fosfat disodic (5 % în apă): adrenalona, oxitetraciclina, sulfadiazina,
sulfametoxazol, sulfafenazol, tetraciclina
o iodura de platină (5 g PtI4, 25 g NaI în 100 ml apă): ambenoniu,
clorfeniramină, clorproguanil, efedrină, levometorfan
o iodura de plumb: bisacodil, bromfeniramina, carbamazepin, cocaina,
dipiridamol, hidralazina
o iodura de potasiu (5 % în apă): amidopirina, chinidina
o iodura de zinc (5 % în apă): alcuronium, levometorfan
o metilarseniat disodic: racemetorfan
187
187
o nitroprusiat de sodiu (1 % în apă): hidromorfon
188
188
Aplicaţii specifice ale testului
testul de microcristal
3-hidroxi-N-metil-morfinanul:
izomerul (-) levorfanul şi racemicul racemorfanul = actiune
narcotica
Izomerul (+) dextrorfanul = lipsit de această acţiune.
Diferenţierea:
racemorfanul se dizolvă în acid
clorhidric 2N şi se tratează cu
Na2CO3 → buchete de plăci mici în
30 minute
190
190
Pentru a diferenţia izomerii optici între ei se procedează astfel:
192
192
Atropina / hiosciamină
+
triiodura de potasiu
193
193
Feniramina şi derivaţii săi halogenaţi - clorfeniramina,
dexclorfeniramina, bromfeniramina, dexbromfeniramina
o + cu iodura de potasiu
clorfeniramina → rozete dense
dexclorfeniramina şi dexbromfeniramina → rozete în formă de
pană şi snopi care au proprietãţi polarizante.
194
194
PURITATEA MEDICAMENTELOR
196
196
Alte organizaţii publică cărţi ce acoperă diferite aspecte ale impuriţăţilor,
incluzând reguli guvernamentale şi ghiduri pentru identificarea şi
monitorizarea impurităţilor ce se găsesc în medicamente.
Ghiduri ICH
197
197
Clasificarea impurităţilor
Impurităţi anorganice
Impurităţi organice
Solventi reziduali
198
198
Impurităţile organice:
pot lua naştere în timpul procesului de obţinere şi/sau
depozitare
pot fi sau nu identificate
pot fi volatile sau nevolatile
Exemple:
o Compuşi de plecare
o Produşi secundari
o Intermediari
o Produşi de degradare
o Reactivi, liganzi, catalizatori
199
199
COMPUSI DE PLECARE
rezultă din:
impurităţile reactivilor
materii prime
produşii de reacţie (izomeri)
compusii izolati din produse vegetale sau animale
Bupivacaina
202
202
PRODUŞI DE DEGRADARE
H H
S CH3 S
6 R1 C N 1
R C N 1
3
CH3 O N CH2 R2
O N N
O COOH COOH
203
203
204
204
205
205
O CH3
H H S
R C NH C C C CH3
O C N CH COOH
Penicilina
+
H
COOH
S
CH NH CH COOH
N N C(CH3)2 -
HS C CH3 N HO
H2O
R O O CH3 R COOH
Acid penicilenic Acid penilic
H2O - CO2
S S
C(CH3)2 C(CH3)2
R CONH C CH NH CH COOH R CONH CH R CONH CH2
COOH HS C CH3 COOH N COOH N COOH
H H
CH3
Acid penamaldic Acid peniciloic Acid peniloic
CH3 +
H
H3C C CH COOH + R CONH CH CHO R CONH CH2 CHO
- CO2
HS NH2 COOH
Penicilamina Acid penaldic Peniciloaldehida
206
S S
R CONH R CONH
N N
O CH2 R' O CH2OH
COOH COOH
Cefalosporina Desacetilcefalosporina
H2O Acilaza
S
R CONH
S
H2N N
N O
O CH2 R' O
COOH Beta-lactamaza O
_ Desacetilcefalosporin-
sau HO
Acid 7-aminocefalosporanic lactona
S S
R CONH CH R CONH CH
+
H HN N
' CH2 R' CH2
- H2O COOH COOH
COOH COOH
Acid cefalosporoic Acid anhidrodesacetil-
cefalosporoic
S
H2N Produsi de fragmentare si
rearanjare structurala
N
O
O
O
Lactona acidului desacetil-
7-aminocefalosporanic
207
Ampicilina
H
6 S CH3
CH C N 1
CH3
NH2 O N
O COOH
S CH3
CH C NH
NH O O C N
CH3 fenilalanil ampicilina
COOH (produs secundar)
C O
CH2 CH NH2
O
NH
S CH3
ampicilin piperazina NH
(produs de degradare) CH3
O O C N COOH
209
209
Amoxicilina
Amoxicilina se degradează →
impuritate dicetopiperazin amoxicilina
(HPLC, MS)
210
210
IMPURITĂŢI ENATIOMERICE
(RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10-oxo-
4-oxa-1- azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-
11-carboxylic acid
211
211
Esomeprazol isomer
al omeprazolului
(S)-5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)
methylsulfinyl] -3H-benzoimidazole
4-[(1R)-2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2- 212
212
(hydroxymethyl)phenol
SOLVENŢI REZIDUALI
Clasa I - solvenţi ce trebuie evitaţi Clasa II - solvenţi ce trebuie limitaţi
Solvent Concentraţie Importanţă Solvent Limita de expunere Concentraţie limită
zilnică permisă (mg/zi) (ppm)
limită (ppm)
1,1,2-tricloretena 0.8 80
1,1,1-tricloretan 1500 pericol pentru
1,2-dicloretena 18.7 1870
mediu 1,2-dimetoxietan 1.0 100
1,1-dicloretena 8 toxic 1,4-dioxan 3.8 380
1,2-dicloretan 5 toxic 2-etoxietanol 1.6 160
2-metoxietanol 0.5 50
Benzen 2 cancerigen
Acetonitril 4.1 410
Tetraclorura de 4 toxic şi pericol
Ciclohexan 38.8 3880
carbon pentru mediu Clorobenzen 3.6 360
Cloroform 0.6 60
a) legate de metodă
214
214
Formarea impurităţilor în timp (îmbătrânire)
215
215
• Alte hidrolize:
o benzilpenicilina, barbital, cloramfenicol, clordiazepoxid,
lincomiycina, oxazepam
• Degradări oxidative
Compuşi susceptibili:
o Hidrocortison, methotrexat, adinazolam
o Derivaţi fenolici: cateholamine, morfină
o Diene conjugate: vitamina A, acizi graşi nesaturaţi
o Heterocicli aromatici
o Derivaţi nitrozo şi nitrici
o Aldehide
216
216
Decarboxilare
Rufloxacina
217
217
Degradare fotolitică
• Ciprofloxacina
219
219
220
220
• Neomicina
antibiotic aminoglicozidic
Structura neomicinelor şi
a impurităţilor:
221
221
Identificarea şi caracterizarea unor
posibile impurităţi din Valsartan
223
- Metoda: HPLC-UV
- Condiţii cromatografice:
coloană: RP18 250 mm x 4.6 mm,5 μm
fază mobilă: A – KH2PO4 0.01 M şi K2HPO4 0.005 M (pH 3 ajustat
cu acid fosforic diluat), B – apă şi acetonitril (1:4, v:v)
eluţie în gradient: %A/%B: 0/50, 20/70, 30/70, 40/80, 50/50,
60/50
rată de curgere: 0.8 ml/min
detecţie: UV la 210 nm
225
Caracteristicile IR, MS, pt ale celor 5 impurităţi
Compus pt 0C IR MS
Impuritatea I 165-167 3419 (legături de întindere N-H și O-H), 3033 (legătură de +ve ESI-MS: 352 (M+H)+, 374
întindere C-H aromatică), 2968 (legătură de întindere C-H (M+Na)+, 390 (M+K)+
alifatică), 1622 (legătură de întindere C=O), 1567
(legături de întindere C=C, C=N aromatice)
Impuritatea II 62-64 3444 (legături de întindere N-H și O-H), 2965 (legătură de +ve ESI-MS: 544 (M+H)+, 566
întindere C-H aromatică), 2931 (legătură de întindere C-H (M+Na)+, 582 (M+K)+
alifatică), 1731 (legătură de întindere C=O carboxilică),
1603 (legătură de întindere C=O amidică)
Impuritatea III 58-60 2929 (legătură de întindere C-H alifatică), 1731 (legătură +ve ESI-MS: 534 (M+Na)+, 550
de întindere C=O carboxilică), 1603 (legătură de întindere (M+K)+
C=O amidică)
Impuritatea IV 87-89 3435 (legături de întindere N-H și O-H), 2968 (legătură de +ve ESI-MS: 456 (M+Na)+
întindere C-H aromatică), 2927 (legătură de întindere C-H
alifatică), 1732 (legătură de întindere C=O carboxilică),
1606 (legătură de întindere C=O amidică)
Impuritatea V 71-75 3421 (legătură de întindere N-H și O-H), 3031 (legătură +ve ESI-MS: 452 (M+H)+, 474
de întindere C-H aromatică), 2935 (legătură de întindere (M+Na)+
C-H alifatică), 1731 (legătură de întindere C=O
carboxilică), 1614 (legătură de întindere C=O amidică)
Valsartan 105-108 2923 (legătură de întindere C-H alifatică), 1732 (legătură +ve ESI-MS: 436 (M+H)+, 458
de întindere C=O carboxilică), 1602 (legătură de întindere (M+Na)+
C=O amidică)
226
Fragmentarea valsartanului şi impurităţile 1, II, III, IV şi V
227
Identificarea şi caracterizarea unor posibile impurităţi obtinute în
urma expunerii Valsartanului la stress prin fotodegradare
Structurile chimice ale valsartanului și ale celor doi produși de fotodegradare : DP-1 și DP-2
228
Elucidarea structurilor celor două impurități
Spectrele 1H-RMN ale impurităților DP-1 (A) și DP-2 (B) Spectrele 13C-RMN pentru impuritatea DP-1 (A) și DP-2 (B)
Datele spectrului de masă și infraroșu pentru DP-1 și DP-2
Impuritatea FT-IR (cm-1) Spectru de masă, m/z (%)
DP-1 3680-3230, 2957, 2871, 1736, 1642, 414.2269 ([M+Na]+, 100), 392.2445 ([M+H]+, 54), 386.2191(M-N2+Na]+,
1533, 1469, 1263, 1100, 952, 820 și 770 21, pierderea de N2), 364.2361 (M-N2 +H]+, 3, pierderea de N2), 357.2043
([M-Me2CH=CH2+Na]+, 5, se pierde izobutilenă) și 235.0971 ([M-
C9H18NO]+, 4, pierderea fragmentului de amidă secundară)
DP-2 2959, 2871, 1730, 1605, 1466, 1388, 384.2040 ([M+Na]+, 69), 362.2215 ([M+H]+, 100), 278.1654 ([M-
1228, 1103, 1025, 996, 820 și 760 C5H7O]+, 17, pierderea catenei laterale valeril), 205.0759 ([M-C9H18NO]+,
61, pierderea fragmentului de amidă secundară)
229
IMPURITATI INSCRISE IN
FARMACOPEEA ROMANA
1. Substanţele reducătoare:
pentru acetazolamidă - se depistează cu amoniac 100 g/l şi
nitrat de argint 0,1 mol/l.
230
230
2. Aminoacizi:
CSS într-un sistem de developare adecvat, acidul -aminocaproic,
trebuie să se prezinte ca o substanţă unitară, pe cromatogramă să nu
apară şi alte spoturi colorate în urma vizualizării cu ninhidrina.
231
231
6. Esterii acizilor benzoic, succinic, oxalic, ftalic, cinamic şi
citric din uleiurile volatile
se depistează prin saponificare cu hidroxid de sodiu când se
formează acizii respectivi insolubili, ce apar sub formă de
cristale.
doar în cazul uleiului de scorţişoară pot apărea cristale
redizolvabile la fierbere.
232
232
10. Alcoolul din eterul anestezic
se evidenţiază cu ajutorul unei soluţii apoase saturate cu eter (măreşte
volumul soluţiei apoase) sau cu ajutorul fuxinei.
12. Peroxizii
se identifică cu iodura de potasiu soluţie 100 g/l.
233
16. Parafinele se scot din produsul impurificat prin cromatografiere pe
coloane de oxid de aluminiu utilizând ca eluent eterul de petrol.
impurificarea se apreciază prin determinarea masică a reziduului ce
rezultă prin evaporare.
234
234
20. Clorhidratul de tetraciclină
se controlează cromatografic deoarece poate fi impurificat cu
anhidrotetraciclină, epitetraciclină, epianhidrotetraciclină.
incadrarea în limitele normale se poate exprima şi prin valoarea
absorbanţei A1cm1% (380 nm) care trebuie să fie cuprinsă între 365 -
387.
235
235
anhidrotetraciclina epianhidrotetraciclina
21. Trihidratul de ampicilină
se cercetează valoarea A268/A266 = 1,10 - 1,30
conţinutul în apă se determină cu reactivul Karl - Fischer
(determinare potenţiometrică) şi care trebuie să fie între 12 – 15 %.
236
236
23. Frunzele de Belladonna
pot fi impurificate cu frunze de Phytolacca americana,
caracterizate prin prezenţa rafidiilor în locul sacilor cu nisip oxalic
atunci când sunt cercetate într-un preparat superficial.
produsul mai este cercetat şi pentru: impurităţi, alte părţi din
aceeaşi plantă; apoatropină şi tropanol, substanţe minerale.
apoataropina
L - hiosciamina
beladonina 237
237
24. Fructele de Pimpinella anisum
se cercetează cu atenţie pentru a nu fi impurificate cu cele de
Conium maculatum, Hyosciamus niger sau Carum carvi.
Hyoscyamus niger
238
238
25. Soluţia injectabilă de albumină serică umană se controlează:
electroforetic pentru fracţiuni proteice străine
spectral în UV pentru hemoglobină liberă şi porfirină
impurităţile pirogene, etc.
26. Perfuzia de dextran 40 (100 g/l) şi glucoză (50 g/l) se cercetează:
aciditatea, vâscozitatea intrinseca 20 = 0,180-0,220 dl/g
impurităţi pirogene
toxicitate.
27. Comprimatele de acetildigitoxină se cercetează:
CSS Kieselgel G - pot fi impurificate cu gitoxină, digitoxină şi produşi
rezultaţi prin hidroliza principiului activ (desacetildigitoxina, digitoxin-
mono- şi bis-digitoxina).
asemănător se cercetează puritatea comprimatelor cu digoxină.
Acetildigoxina =
3-acetildigitoxose-
digitoxose2-digoxigenina
239
239
240
240
28. Drajeurile cu lanatozid C pot fi impurificate cu desacetilanatozida
C, lanatozida D şi C.
se pun în evidenţă cromatografic folosind pentru vizualizare acid
tricloracetic şi cloramină.
Lanatosida C = glucoso-3-acetildigitoxose-digitoxose-2-digoxigenin)
ALTE DEGRADARI
241
241
242
242
PLANUL CURSULUI
DETERMINAREA VOLUMETRICA A MEDICAMENTELOR
243
243
Titrimetria sau volumetria = totalitatea metodelor de determinare
cantitativă care se bazează pe măsurarea exactă a volumelor
de soluţii necesare transformării totale a unei substanţe in
altă substanţă.
Volum de
aA + bB → cC + dD +… echivalenta
244
Solutie titrata/volumetrica
Factor de molaritate
245
Metode vizuale Metode instrumentale Modificarea insusirilor
(volumetria chimica) (volumetria fizico-chimica) fizice ale participantilor
de metodă de lucru
de scurgere
de citire
de titrare
de indicator
de temperatură
de calcul
247
CLASIFICAREA METODELOR
TITRIMETRICE
248
B. După natura mediului în care se execută
Titrări în mediu apos
Titrări în mediu neapos.
249
DETERMINARI IN MEDIU APOS
TITRIMETRIA PRIN REACTII
ACIDO - BAZICE (PROTOMETRIA)
Acidimetria
Alcalimetria
HA + BOH → H2O + BA
sau ionic:
250
Soluţii titrate
251
Indicatori
252
Aplicaţii în analiza medicamentelor
sunt utilizate pentru determinarea substanţelor
medicamentoase cu caracter acid sau bazic.
253
1. Determinarea cantitativă a substanţelor
cu caracter acid
254
254
255
Determinarea derivaţilor barbiturici
257
Determinarea acidului acetilsalicilic din comprimate
258
2 . Determinarea cantitativă a substanţelor
cu caracter bazic
este mai puţin utilizată, fiind preferată titrimetria în mediu
neapos.
259
260
Dozarea benzoatului de sodiu din soluţia injectabilă de
cafeină şi benzoat de sodiu
261
Alte aplicaţii
1. Determinarea amfetaminei.
Principiul determinării: o cantitate exact măsurată de substanţă se
tratează cu H2SO4 0,05 mol/l în exces, iar acidul rămas
neconsumat se titrează cu NaOH 0,1 mol/l în prezenţa
roşului de metil ca indicator.
2. Determinarea meprobamatului.
Principiul determinării: se titrează cu NaOH 0,1 mol/l excesul de
HCl 0,1 mol/l care s-a utilizat pentru neutralizarea
amoniacului rezultat prin hidroliză cu KOH alcoolic.
262
3. Determinarea alcaloizilor
Principiul determinării:
alcaloizii sunt trataţi cu un exces de soluţie titrată de acid, iar excesul
se retitrează cu o soluţie titrată de bază în prezenţa unui indicator
adecvat.
cand se aplică titrarea directă a bazicităţii alcaloizilor, solubilizarea
acestora se face în mediu alcoolic, hidroalcoolic sau alt solvent
neutralizat.
263
TITRIMETRIA PRIN REACTII DE
PRECIPITARE
se bazează pe formarea de precipitate
clasificare in funcţie de cationii care se folosesc în sistemul
de precipitare:
Ag+ + X- AgX
o Argentometria
Hg2+2 + 2X- Hg2X2
o Mercurometria
o Barimetria Ba+2 + Y-2 BaY
o Uranometria. UO2+2 + Y-2 UO2Y
Indicatori
- indicatori reactivi ai ionilor: cromat de potasiu, alaun feric,
ditizona, difenilcarbazona, difenilcarbazida, sulfonftaleine
- indicatori de adsorbţie (în lumina albă şi în lumina
ultraviolet - de fluorescenţă): eozina, fluoresceina, p-
etoxicrisoidina, tropeolina 00, diclorfluoresceina, albastru de
bromfenol
- indicatori redox: difenilamina, difenilbenzidina.
264
ARGENTOMETRIA
Precipitatele formate au structura AgX.
Soluţii titrate
1. Nitrat de argint 0,1 M
Titrul se determină cu NaCl (cromat de potasiu).
2. Tiocianat de amoniu 0,1 M
Titrul se determină cu AgNO3 0,1 M (alaun feric).
265
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea halogenurilor (clorura de amoniu, clorura de
potasiu, clorura de sodiu, bromura de amoniu, bromura de
stronţiu).
Metoda Mohr - titrare directa cu AgNO3 0,1 M în prezenţa
cromatului de potasiu ca indicator:
266
2. Determinarea argintului din combinaţii organice ca: argint
coloidal, proteinat de argint, vitelinat de argint.
Principiul determinării: titrare cu NH4SCN 0,1 M în prezenţa
alaunului feriamoniacal, după prealabila distrugere a
materiei organice cu KMnO4 în mediu de acid sulfuric.
4. Alte exemple:
bromizoval
vioform
acetat de clortestosteron
diclorhidrat de histamină
izocianatul de alil din Sinapis nigrae semen.
267
MERCUROMETRIA
ionul Hg2+2 are proprietatea de a forma cu anionii halogenaţi
precipitate greu solubile de tipul Hg2X2:
Soluţii titrate
1. Azotat mercuros 0,1 M
Titrul se determină pe NaCl.
Indicatori
o difenilcarbazona, difenilcarbazida.
268
TITRIMETRIA PRIN REACTII DE
COMPLEXARE (COMPLEXOMETRIA)
269
Indicatori
Exemple de indicatori:
indicatori metalo-cromici: coloranţi azoici, coloranţi azoici
substituiţi, ftaleine şi sulfoftaleine, coloranţi trifenilmetanici,
coloranţi antrachinonici
indicatori metalici indirecţi: negru de eriocrom T
indicatori acido-bazici si indicatori redox: albastru de
variamin B
indicatori de tulbureală: AgI, AgAg(CN)2.
270
CIANOMETRIA
se bazează pe capacitatea de complexare a diferiţilor cationi de
ionul de cianură.
cea mai importantă metodă cianometrică este
argentocianometria ce are la bază ecuaţiile:
271
In funcţie de condiţiile de titrare şi de indicator, metode pentru
determinarea punctului de echivalenţă:
metoda Liebig: nu utilizează indicator, punctul de echivalenţă
este dat de apariţia unei tulbureli datorită formării Ag[Ag(CN)2]
metoda Denigés: foloseşte drept indicator o iodură alcalină,
sfârşitul titrării este dat de opalescenţa atribuită AgI
metoda Ripan: foloseşte ca indicator difenilcarbazona, care
formează cu Ag+ un complex colorat în violet.
272
COMPLEXONOMETRIA
are la bază reacţia de complexare dintre unii ioni şi acizii
aminopolicarboxilici (complexone)
Exemple complexone:
acidul iminodiacetic
acidul etilendiaminotetraacetic, sarea de sodiu a acidului
etilendiaminotetraacetic (chelaton III, complexon III, trilon B)
acidul hexametilendiaminotetraacetic.
Soluţii titrate
1. EDTA-Na2, etilendiaminotetraacetat disodic (EDTA - disodic,
complexon III) 0,05 M
Titrul se determină cu: zinc (negru de ericrom T), CaCO3 (murexid),
MgSO4.7H2O (negru de eriocrom T).
Indicatori
- negru de eriocrom T, murexid, roşu de pirogalol, xilenoloranj
273
Aplicaţii în analiza medicamentelor
275
2. Determinarea alcaloizilor
Principiul determinării:
mulţi alcaloizi formează precipitate cu diverşi anioni complecşi
care au în structura lor un cation
se determină cationul din complexul alcaloid - anion sau din
complexul reactiv folosit în exces.
Exemple:
sărurile de chinină, teobromina şi teofilina formează precipitate
cu K[BiI4]. Excesul de reactiv se titrează cu complexon III fără a
utiliza indicator complexonometric, finalul titrării este
momentul în care soluţia se decolorează.
Indicatori
indicatori de culoare (compuşi organici): difenilamina,
indofenoli, oxazine, tiazine, diamine
indicatori reactivi ai ionilor: o-fenantrolina, ,’-dipiridilul,
dimetilglioxima, amidonul, -naftoflavone
indicatori turbidimetrici: acidul selenic
indicatori de fluorescenţă: fluoresceina, rodamina B.
Metode instrumentale.
279
DETERMINARI
PERMANGANATOMETRICE
se foloseşte capacitatea oxidantă a ionului MnO4-, care, în
funcţie de mediu, acţionează prin 5, 3, 1 echivalenţi.
281
1. Determinarea sãrurilor feroase:
- au caracter reducãtor şi se titreazã cu KMnO4 0.1 M pânã la
coloratie roz-persistentã.
282
4. Determinarea fenolului:
- permanganatul de potasiu oxidează fenolul în mediu alcalin
descompunându-se în dioxid de carbon şi apă:
5. Determinarea aminofenazonei:
- în mediu alcalin permanganatul de potasiu oxidează
aminofenazona la dioxiaminofenazonă; folosind un exces de
permanganat acesta se dozează iodometric după ecuaţiile de la
determinarea nitriţilor alcalini.
283
DETERMINARI IODOMETRICE
284
Soluţii titrate
Indicatori
amidon,
- naftoflavone
solvenţi ai iodului (cloroform, benzen, tetraclorură de carbon).
285
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea vitaminei C:
- acidul ascorbic este oxidat de iod la acid dehidroascorbic,
titrarea efectuându-se cu I2 0,05 M în prezenţa amidonului:
286
2. Determinarea glucozei:
- se oxidează cu un exces de iod 0,05 M în mediu alcalin (carbonat
de sodiu, borat de sodiu, etc.), la rece şi excesul se retitrează cu
tiosulfat de sodiu.
3. Determinarea fenazonei:
- fenazona formează cu iodul iod - fenazona, care precipită la rece;
excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu în prezenţa
amidonului dupa adaugare de alcool.
287
4. Determinarea cloralhidratului:
- iodul oxidează în mediu alcalin cloralhidratul la acid
tricloracetic, excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu:
5. Determinarea cafeinei:
- cafeina formează cu iodul periodura de cafeină insolubilă
(C8H10N4O2.HI.I4), excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu.
6. Determinarea fenolului:
- în mediu bazic iodul formează cu fenolul triiodfenolul, excesul de
iod 0,05 M se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 M.
288
7. Determinarea penicilinelor:
- penicilinele în mediu bazic hidrolizează la nivelul ciclului -
lactamic rezultând doi compuşi care sunt oxidaţi de iod, iar
excesul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 M.
289
DETERMINARI IODATOMETRICE
In mediu acid iodaţii alcalini se comportă ca oxidanţi, conform
ecuaţiilor:
Soluţii titrate
1. Iodat de potasiu 0,1 M
Deşi iodatul este o titrosubstanţă, titrul se poate determina cu: As2O3;
Na2S2O3; sulfat de hidrazină.
290
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea hidrazinei:
- în mediu acid şi în prezenţa clorurii mercurice, hidrazina reduce
iodatul la iodură, ca indicator se foloseşte un solvent al iodului.
Indicatori
indicatori reversibili: -naftoflavona, p-etoxicrisoidina
indicatori ireversibili: metiloranj, roşu de metil, indigocarmin,
albastru de xilenol
solvenţi.
292
Soluţii titrate
1. Determinarea p - clorfenolului:
- compusul formează cu bromul un derivat bromurat, excesul de
bromat-bromură oxidează KI, iodul pus în libertate se titrează cu
Na2S2O3 0,1 M.
293
3. Determinarea p - hidroxibenzoatului de metil (nipagin):
- nipaginul hidrolizat alcalin se bromurează cu bromat - bromură şi iodul
pus în libertate din KI se titrează cu Na2S2O3 0,1 M în prezenţa
amidonului.
4. Determinarea sulfamidelor:
- sulfamidele se bromurează în mediu acid cu KBr şi KBrO3 0,1 M, iar
excesul se titrează iodometric. Rezultă compuşi dibromuraţi:
Indicatori
- amine: difenilamina, acidul difenilaminosulfonic
- derivaţi de benzidină.
Soluţii titrate
1.Dicromat de potasiu 0,0167 mol/l(0,1 N)
Este o titrosubstanţă, iar titrul se poate determina şi cu sare Mohr
(difenilamină sulfonată).
295
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea sărurilor feroase:
- oxidarea ionilor Fe2+ la Fe3+ de către dicromat are loc în mediu acid creat de
amestecul format din acid sulfuric şi acid fosforic, in prezenta difenilaminei,
pana la albastru:
2. Determinarea metamizolului:
- metamizolul este oxidat de dicromatul de potasiu în mediu acid în prezenţa
difenilaminei după reacţia:
296
DETERMINARI CERIMETRICE
Ce4 + e Ce3
Soluţii titrate
1. Sulfat ceric 0,1 M
Soluţia se poate prepara din Ce(SO4)22(NH4)2SO4.2H2O şi CeO2. Titrul
soluţiei se determină cu: As2O3, sare Mohr, oxalat de sodiu.
Indicatori
- feroina, p-etoxicrisoidina, roşu de metil, difenilamina
- o-fenantrolina feroasă.
297
Aplicaţii în analiza medicamentelor
1. Determinarea oxalaţilor:
- acidul oxalic şi oxalaţii sunt oxidaţi de sulfatul de ceriu în
mediu acid în prezenţa feroinei ca indicator.
298
DETERMINARI NITRITOMETRICE
Soluţii titrate
1. Nitrit de sodiu 0,1 M
Titrul se determină cu acid sulfanilic (iodură de potasiu amidonată).
Indicatori
- iodură de potasiu amidonată, tropeolina 00, acidul
difenilbenzidindisulfonic, galben de metanil.
299
Aplicaţii în analiza medicamentelor
301
6. Determinarea cloramfenicolului:
- grupa nitro a cloramfenicolului se reduce la amină cu pulbere
de zinc şi acid clorhidric şi se titrează cu NaNO2 0,1 M în
prezenţa KBr şi a tropeolinei 00.
302
DETERMINARI IN MEDIU NEAPOS
Avantaje faţă de titrarile în mediu apos:
303
Solvenţii neapoşi sau anhidri se pot clasifica, după proprietăţile lor
sau după efectul produs, în:
A. Solvenţi amfoterici
solvenţi care manifestă o disociere proprie
după caracterul lor se împart în:
a) solvenţi amfiprotici: alcooli, cetone
b) solvenţi protogenici (solvenţi care cedează mai uşor protoni,
funcţionând ca acizi): acid acetic anhidru, acid formic anhidru, acid
propionic anhidru, acid fluorhidric, acid sulfuric anhidru
c) solvenţi protofilici (fixează protoni, comportându-se ca baze):
butilamina, etilendiamina, acetona, metiletilcetona, acetonitrilul.
304
Efectele solvenţilor depind de mai mulţi factori:
1. Capacitatea sa de dizolvare a substanţei
Capacitatea de dizolvare a unui solvent este dependentă de
proprietăţile solvatante ale acestuia, determinate de:
- proprietăţile lor fizice
- constanta dielectrică
- polaritatea sa
- existenţa legăturilor inter- şi intramoleculare etc.
2. constanta dielectrică,
joacă un rol important în disociaţia ionică a substanţei care se dizolvă.
Substanţele ionice prin disociere vor forma doi ioni între care se
manifestă efecte electrostatice. Între cei doi ioni se va interpune stratul
de solvent, în acest fel se va micşora atracţia electrostatică cu atât mai
mult cu cât constanta dielectrică a solventului este mai mare.
În solvenţii cu constantă dielectrică mică, cum este a benzenului (2,28),
nu se vor găsi aproape deloc ioni liberi.
305
3. efectul prototropic al solventului
Solventul intervine prin acceptare sau cedare de protoni.
În funcţie de afinitatea lor variabilă faţă de protoni, solvenţii
sunt susceptibili de a reacţiona cu substanţele dizolvate şi
chiar sunt capabili de a transforma o legătură covalentă într-o
legătură ionică, dând naştere unei perechi de ioni a căror
disociaţie depinde de constanta dielectrică a solventului.
306
Efectul solvenţilor amfiprotici protogeni se manifestă astfel:
307
Alegerea solvenţilor
Pentru a doza un singur component cu caracter acid sau bazic se alege un
solvent care prin efectul său prototropic şi prin constanta sa dielectrică să
exalte la maximum aciditatea sau bazicitatea, adică în acest solvent substanţa
să disocieze la maxim.
308
În mediu neapos, chinina se poate determina cantitativ prin
dizolvare în acid acetic anhidru şi titrare cu acid percloric.
Acidul percloric fiind un acid foarte tare în raport cu acidul
acetic va ceda protonul său solventului, reacţia având loc cu
deplasarea echilibrului spre dreapta:
309
Indicatori
310
Soluţii titrate
A. Soluţii titrate de acizi
1. Acid percloric 0,1 M, 0,01 M în acid acetic anhidru
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu (cristal violet);
hidrogen carbonat de potasiu (violet de metil).
2. Acid percloric 0,1 M, 0,05 M în dioxan
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu.
3. Acid percloric 0,1 M în acid propionic
Titrul se determină cu: ftalat acid de potasiu.
4. Acid percloric 0,1 M în acid trifluoracetic
5. Acid percloric 0,1 M în alcool metilic
Titrul se determină cu tris-(hidroximetil)-aminometan 0,1 M
(albastru de timol şi alfazurin).
6. Acid percloric 0,1 M în etilenglicol-isopropanol
Titrul se determină cu carbonat de sodiu anhidru (metiloranj,
roşu de metil, albastru de timol).
7. Acid clorhidric 0,05 M în alcool metilic
Titrul se determină cu NaOH 0,1 M (fenolftaleină).
8. Acid clorhidric 1 M în etilenglicol-isopropanol (1:1)
9. Acid tosilic 0,005 N în cloroform
Titrul se determină cu stricnină (p - dimetilaminoazobenzen).
311
B. Soluţii titrate de baze
1. Hidroxid de sodiu (potasiu) 0,1 M în alcool metilic anhidru
Titrul se determină cu acid benzoic (albastru de timol)
2. Metoxizi de sodiu, potasiu, litiu 0,1 M
Titrul se determină cu acid benzoic; acid succinic.
3. Metoxid de sodiu 0,1 M în benzen-metanol (10 : 1)
Titrul se determină cu acid benzoic.
4. Metoxid de litiu 0,1 M în benzen-metanol (1 : 6)
5. Hidroxid de tetrabutilamoniu 0,1 M; 0,02 M în benzen-metanol (10:1)
Titrul se determină cu acid benzoic în DMF, acetonă sau MEC (albastru
de timol).
6. Hidroxid de tributilmetilamoniu 0,1 N în benzen-metanol (10:1)
7. Hidroxid de trietilbutilamoniu 0,1 N în benzen-metanol (10:1)
C. Alte soluţii titrate
1. Acetat de sodiu 0,1 N în acid acetic anhidru
2. Anilină 0,1 N în acid acetic anhidru
3. Benzidină 0,05 N în acid acetic anhidru
4. 2 - aminoetoxid de sodiu 0,2 N în etilendiamină
5. Morfolină 0,1 N în acetonitril
6. Perclorat de litiu 0,05 N în acetonitril
7. Morfolină 0,5 N în metanol anhidru
8. Ftalat acid de potasiu 0,1 N; 0,001 N în acid acetic anhidru
9. Tris-(hidroximetil)-aminometan 0,1 N în metanol anhidru 312
DETERMINAREA SUBSTANTELOR
MEDICAMENTOASE CU CARACTER SLAB BAZIC
313
dozarea amestecurilor de baze tari alături de baze slabe sau a
amestecurilor de baze cu polarităţi apropiate având în vedere
scăderea bazicităţii în seria:
314
Determinări de substanţe cu caracter slab bazic
315
316
317
1. Determinarea sărurilor de potasiu
sau de sodiu ale penicilinei G:
- datorită cationilor din structura
acestei peniciline este posibilă
dozarea cu HClO4 în dioxan,
utilizând ca solvent acidul acetic
anhidru şi -naftolbenzeina ca
indicator.
2. Determinarea benzatinpenicilinei:
- datorită azotului din catena laterală
benzatinpenicilina se poate titra cu
HClO4.
3. Determinarea tetraciclinelor:
- datorită bazicităţii create de azotul
terţiar din poziţia 4; tetraciclinele se
dizolvă în acid acetic anhidru şi se
titrează potenţiometric (electrozi de
sticlă şi calomel) cu HClO4 în dioxan.
318
4. Determinarea eritromicinei:
- azotul bazic al eritromicinei se poate
doza cu ajutorul acidului percloric,
folosind ca solvent acidul acetic
anhidru şi ca indicator cristal violetul.
5. Determinarea cefalosporinelor
- sunt derivaţi de semisinteză ai acidului 7-aminocefalosporanic
cu un spectru larg de activitate antimicrobiană, fiind din ce în
ce mai mult utilizate în terapeutică.
- Dezavantaj: sunt greu solubile sub forma acidă.
- Sărurile alcaline se pot determina în mediu neapos: se dizolvă în
dimetilsulfoxid şi se titrează potenţiometric cu acid percloric în
acid acetic anhidru utilizând combinaţia de electrozi sticlă -
calomel.
319
320
320
Substanţe medicamentoase care se determină cu acid percloric
după adăugarea de acetat de mercur.
321
322
Determinarea clorhidratului de efedrina
323
Determinarea clorhidratului de procaină:
- substanţa se dizolvă în acid acetic anhidru, se adaugă acetat de
mercur (II) 5% în acid acetic anhidru, şi se titrează cu HClO4 0,1
M în prezenţa cristal violetului până la coloraţie verde:
324
Determinarea disulfiramului:
325
DETERMINAREA SUBSTANTELOR
MEDICAMENTOASE CU CARACTER SLAB ACID
328
2. Dozarea fenobarbitalului din comprimate
329
3. Determinarea sulfamidelor
- Sulfamidele se pot titra în mediu neapos cu soluţii titrate bazice
datorită faptului că gruparea SO2 are un caracter electrofil, hidrogenul
fixat la N devine ionizabil, astfel încât sulfamidele devin acide şi pot fi
titrate în solvenţi bazici.
4. Determinarea penicilinelor
- Gruparea COOH a penicilinelor se poate determina titrimetric în
mediu DMF cu CH3OK 0,1 M în prezenţa albastrului de timol.
330
5. Determinarea cefalosporinelor
- Cefalosporinele se pot determina cantitativ în mediu neapos
datorită caracterului lor slab acid.
- Cefazolina se dizolvă în DMSO şi se titrează cu HTB 0,05 M.
Titrarea se face potenţiometric utilizând ca electrozi pe cel de
sticlă şi de calomel.
6. Determinarea amino-acizilor
- Amino-acizii ca substanţe amfiprotice se pot doza direct în DMF
cu HTB în benzen - metanol şi în prezenţa albastrului de timol ca
indicator.
- Se poate folosi ca mediu şi piridina, iar ca indicatori -
naftolbenzeina, azovioletul etc.
331
Planul cursului
Determinari cu agenti tensioactivi
Determinari densimetrice
Determinari vascozimetrice
332
DETERMINARI CU AGENTI TENSIOACTIVI
Substanţe tensioactive
substanţele care micşorează tensiunea superficială a
solventului în care sunt introduse
suferă o adsorbţie pozitivă pe suprafaţa lichidelor
au o structură liniară cu un capăt al moleculei compus dintr-
un grup de atomi cu afinitate mare pentru apă, denumită
hidrofilă, iar celălalt capăt al moleculei posedă o grupare de
atomi cu proprietăţi hidrofobe.
Dacă într-un sistem format din două lichide nemiscibile se
introduce o substanţă tensioactivă molecula acesteia se va
orienta cu partea hidrofobă a moleculelor spre lichidul neapos şi
cu partea hidrofilă spre apă.
333
S-a constatat că atunci când într-o soluţie se află prezente două
substanţe antagoniste - una anion activă şi cealaltă cation activă -
ele îşi vor neutraliza reciproc activitatea superficială.
unde:
BX = substanţă superficială cation activă
B+ = ion hidrofob pozitiv
X- = anion al unui radical acid monovalent
AM = substanţă superficială anion activă
A - = ion hidrofob negativ
M+ = H+, Na+, K+, NH4+.
334
Punctul de echivalenţă se pune în evidenţă prin metode fizice şi
chimice:
Metodele fizice
măsoară tensiunea superficială, turbiditatea soluţiei în timpul
titrării.
metode gravimetrice.
335
Titrarea se face într-un sistem format din două faze: apă şi un
solvent organic.
336
In cazul unui colorant acid, reacţiile pot fi reprezentate astfel:
337
In cazul în care se foloseşte la titrare drept indicator un colorant
bazic, solubil în apă, reacţiile pot fi reprezentate astfel:
339
Aplicaţii în analiza medicamentelor
Avantaje
permite dozarea unui mare număr de substanţe
medicamentoase în mod direct
permite dozarea unui mare număr de substanţe
medicamentoase care se găsesc în cantităţi foarte mici
în formele farmaceutice.
340
Limite
Reacţiile sunt influenţate de structura şi natura moleculei de
determinat, dependentă ea însăşi de grupările funcţionale:
Compuşii în a căror moleculă se găsesc grefate grupări
funcţionale hidrofile (OH, COOH, COOR, CONH2 , C=O) diminuează
sau fac să dispară proprietăţile bazice care condiţionează formarea
sării extractibile.
Există unele substanţe medicamentoase şi unii excipienţi care
consumă titrant în cantităţi nestoechiometrice.
Titrări cu LSS
determinarea bazelor cuaternare de amoniu alifatice
determinarea bazelor cuaternare de amoniu ciclice: benzododeciniu,
benzalconiu, cetoxoniu
determinarea bazelor cuaternare de amoniu heterociclice
determinarea derivaţilor de fenotiazină: acepromazina, clordelazin,
clorpromazina, dietazina, izotiazina, metopromazina
determinarea alcaloizilor: tebaina, papaverina, hidrastina, narcotina,
rezerpina.
341
Determinarea substanţelor medicamentoase direct
din forme farmaceutice
342
Folosirea unui sistem de solvenţi format din două faze permite aducerea
în soluţie a tuturor componenţilor formei farmaceutice:
Faza apoasă - dizolvă componenţii polari
Faza organica – dizolva componentii nepolari (şi mai ales excipienţii
graşi).
separarea excipientilor inerţi şi insolubili cum ar fi amidonul şi talcul nu
este necesară.
Metoda de titrare cu LSS se poate aplica formelor farmaceutice: soluţii
medicamentoase, unguente, supozitoare, pulberi, comprimate, drajeuri.
Soluţii medicamentoase
Ex: se determina cantitativ: clorura de benzetoniu alături de
cloramfenicol, etiluretan, cloretonă, clorura de sodiu, propilenglicol, apă
distilată.
Cele două faze sunt formate din părţi egale de apă şi cloroform.
Indicator se foloseste soluţia acido-alcoolică de galben de metil.
Unguente
Excipienţii graşi utilizaţi la prepararea unguentelor nu consumă soluţie
titrată.
Proba de determinat se dizolvă sau se suspendă în amestecul apă -
cloroform, se adaugă indicatorul şi se procedează ca la determinările
titrimetrice obişnuite.
343
Supozitoare
Untul de cacao şi gliceridele semisintetice permit aplicarea directă a metodei prin
faptul că sunt solubile în faza organică a mediului în care se face titrarea.
Comprimate
Cei mai frecvenţi şi utilizaţi excipienţi la prepararea comprimatelor nu consumă în
mod practic soluţie titrată: caolinul, lactoza, carbonatul de calciu, carbonatul de
magneziu, guma arabică, amidonul, fosfatul tricalcic.
Ex: se poate determina maleatul de prometazină alături de meprobamat şi
stearatul de magneziu, papaverina alături de acidul nicotinic şi alţi excipienţi.
Drajeuri
Excipienţii utilizaţi la obţinerea sâmburilor (stearatul de magneziu, talcul) cât şi cei
folosiţi la drajefiere (amidonul, gelatina, zaharoza, talcul, ceara, cetaceumul etc.) nu
interferează titrarea fapt pentru care nu se lucrează în condiţii speciale.
Titrări cu DOSS
Se determină cantitativ cu DOSS: scobutilul, sulfatul de atropină, efedrina,
tetraciclinele, sparteina, stricnina, neostigmina, codeina, apomorfina, chinina etc.
344
DETERMINARI DENSIMETRICE
PRINCIPII GENERALE
d 20
Densitatea relativă, , a unei substanţe = raportul dintre
20
unui volum din acea substanţă la 200 C şi masa unui volum egal
de apă la 4o C.
345
• Relaţiile numerice dintre cele trei mărimi sunt următoarele:
20 = 998,202 . d 20
20
sau d 20
20 = 1,00180 .10 -3 .
20
20
d 20
20 = 1,00170 . d 20
4 sau d 20
4
d
= 0,99823 . 20
346
În laboratoarele pentru analiza şi controlul
medicamentelor cel mai utilizate sunt picnometrele ale
căror tipuri sunt redate în figura.
Picnometre
349
DETERMINǍRI
VÂSCOZIMETRICE
PRINCIPII GENERALE
accelerarea deplasării
stratului cu viteza mai A
mică. dx S
B
• Însemnând cu S
suprafaţa comună a celor v
două straturi, cu dx
distanţa elementară care le
separă şi cu dv diferenţa de
viteză a celor două straturi, unde:
forţa de frecare care ia = coeficient de
naştere este dată de relaţia vâscozitate specific lichidului dat
lui Newton:
dv/dx = gradientul vitezei
(caracterizează variaţia vitezei pe
dv
f s unitatea de lungime, in direcţia
dx perpendiculară celei de deplasare
a straturilor). 351
• Lichide normale = lichidele pentru care factorul este
constant în raport cu dv/dx.
352
• Vâscozitate cinematică, = raportul dintre vâscozitatea
dinamică a unui lichid şi densitatea acestuia la aceiasi
temperatura.
- Unitatea în sistemul CGS este stokes-ul.
353
• Vâscozitatea intrinsecă (internă, caracteristică) sau numărul limită
de vâscozitate se exprimă prin relaţia:
356
Concordanta temperatura - vascozitate
357
APARATURA
După mărimea măsurată După forma constructivă
Vâscozimetre rotametrice
358
• În funcţie de proprietatile de curgere ale lichidului căruia
i se face determinarea se folosesc:
- vâscozimetre cu capilar
- vâscozimetre cu bilă
- vâscozimetre rotaţionale.
=k·t·d
unde:
= vâscozitatea dinamică
k = constanta aparatului
d = densitatea lichidului
t = timpul de curgere exprimat în secunde
360
Vâscozimetru Hoppler
= k.t.(db - d)
unde:
= vâscozitatea dinamică
k = constanta aparatului
t = timpul de cădere al bilei exprimat în secunde
d = densitatea lichidului
db = densitatea bilei
361
• Timpul de curgere (vâscozimetrele Ostwald, Ubbelohde,
Engler) şi timpul de cădere al bilei (vâscozimetrul Hoppler)
trebuie să fie cuprins între 100 şi 300 secunde.
• Măsurarea timpului de curgere/cadere se face cu ajutorul
unui cronometru cu precizie de 0,1 secunde.
• Lichidul trebuie adus la temperatura dorită şi nu trebuie să
conţină bule de aer.
• Variaţiile de temperatură nu trebuie să depasească ± 0,1° C.
• Timpul trebuie să reprezinte media a cel puţin 5 determinări.
• Exemple:
1. Farmacopeele dau indicaţii privind determinarea vâscozităţii
intrinseci la dextran şi în acest caz se foloseşte un vâscozimetru cu
capilar pentru care:
- volumul bulei superioare = 1-2 ml
- diametrul tubului capilar = 1 mm
- lungimea tubului = 10 cm
- timpul de scurgere al apei = minim 100 secunde.
362
2. Determinarea vâscozităţii sistemelor de curgere nenewtoniene
(CMC-Na, MC etc.) se efectuează la un anumit tip de
vâscozimetru şi în condiţii standardizate.
363
• Vâscozimetrul rotativ Brookfield = măsoară mărimea
cuplului de forte necesar pentru a învinge rezistenţa la
rotire a unui cilindru sau disc în interiorul probei.
364
• Reovâscozimetrul Rheotest-2 = funcţionează după principiul
cilindrilor coaxiali.
- În cilindrul exterior cu raza R, termostatat, se află soluţia de
analizat, iar cilindrul interior cu raza r şi lungimea l se roteşte cu
viteza unghiulară .
• Se compune din:
– vâscozimetrul propriu-zis
– aparatul de măsură
M
r
2lr 2
• Pentru fiecare cilindru interior, valoarea tensiunii de forfecare se
exprimă funcţie de:
r=Z
unde:
Z = constantă pentru fiecare cilindru.
368
APLICAŢIILE VÂSCOZIMETRIEI
• Caracterizarea substanţelor medicamentoase, auxiliare şi a
formelor farmaceutice
371
• Substanţe sau corpuri
plastice
- tensiunea de forfecare trebuie să
depăşească "pragul de tensiune"
pentru a determina orientarea
moleculelor în sensul curgerii şi
deci al micşorării vâscozităţii.
- Exemple: gelurile de
macromolecule hidrofile solubile
(solutii concentrate ale unor
compusi macromoleculari),
suspensiile floculate, pastele,
cremele.
Substante tixotrope:
- prin aplicarea unei forţe de forfecare
structura de reţea se distruge, însă
după un timp de repaus structura se
reface.
- Exemple: geluri (aerosil, bentonita),
suspensii, unguente emulsii.
372
DETERMINĂRI REFRACTOMETRICE
PRINCIPII GENERALE
sin i aer
n
sin rm 374
normala
rază
reflectată
raza
incidentă
rază
refractată
375
Când lumina trece dintr-un mediu cu
indice de refracţie mic într-un mediu cu
indice de refracţie mare (ex. din aer în
apă sau din aer în sticlă) razele de
lumină (refractate) se apropie de normală
rază
normala refractată
Când lumina trece dintr-un mediu cu indice
de refracţie mare într-un mediu cu indice de
refracţie mic (ex. din apă în aer sau din sticlă
în aer) razele de lumină refractate se
îndepărtează de normală
Co C 1 1 n2
n2 ; 1
C2 Co n1 sin rl n1
n1 = n2.sin rl
unde:
C1, C2 = viteza radiaţiei luminoase în cele două medii;
Co = viteza radiaţiei luminoase în vid;
n1, n2 = indicii de refractie a luminii in cele doua medii
379
• Determinarea indicelui de refracţie se face indicându-se
condiţiile de lucru, folosindu-se de obicei lumina
monocromatică a liniei D a sodiului situată la = 5893 Å.
380
APARATURA
• Partea principală a unui refractometru o
constituie un corp semicilindric din sticlă cu
indice de refracţie cunoscut. De partea plană
superioară este lipit un inel de sticlă care
formează o cavitate în care se introduce lichidul
de cercetat. Sursa luminoasă trimite un fascicul
de raze care sunt focalizate de lentila colimator.
Razele care vin paralel cu suprafaţa orizontală de
separaţie lichid - sticlă pătrund în sticlă, razele
căzând perpendicular pe suprafaţa de separaţie
fără a fi deviate.
382
• Un alt refractometru folosit este cel de
imersie, care este un aparat de înaltă precizie.
384
Denumirea to C nD
Alcoholum 18 1,3624
Apa 25 1,3325
Sirupus Aetheris 20 1,4060 - 1,4120
Sirupus Balsami Tolutani 20 1,4410 - 1,4490
Sirupus Belladonae 20 1,4416 - 1,4496
Sirupus Chlorali hydratis 5% 20 1,4436 - 1,4497
Sirupus Citri 20 1,4450 - 1,4510
Sirupus Codeini 0,2% 20 1,4490 - 1,4570
Sirupus Ferri chloridi oxydulati 5% 20 1,4360 - 1,4440
Sirupus Kalii guaiacolsulfonatis 6% 20 1,4324 - 1,4390
Sirupus Opii 20 1,4432 - 1,4502
Sirupus Opii dilutus 20 1,4486 - 1,4556
Sirupus Simplex 20 1,4464 - 1,4532
385
• Determinări cantitative
unde:
c = concentraţia soluţiei
n = indicele de refracţie al soluţiei
n0 = indicele de refracţie al solventului
F = factor stabilit experimental care variază în funcţie de
concentraţia soluţiei.
386
• Determinări de structură
Refracţia moleculară (RM) este o mărime care exprimă refracţia
luminii şi este independentă de temperatură. H. A. Lorentz şi L.
Lorentz au dat expresia matematică a acestei mărimi:
n 1 M 2
RM 2 x
n 2 d
unde:
n = indice de refracţie
M = masa moleculară
d = densitatea soluţiei.
• Refracţia moleculară:
are dimensiunile unui volum şi se exprimă în cm3
nu depinde de temperatură, presiune sau starea fizică a probei
este dependentă de lungimea de undă si de structura chimică a
moleculelor.
387
Refracţia moleculară calculată prin însumarea refracţiilor atomice diferă
de valorile calculate cu ajutorul ecuaţiei de mai sus datorită
particularităţilor de structură (natura legăturilor), fapt concretizat prin
datele din tabel.
Valorile refracţiilor de legătură variază în funcţie de grupele existente în
vecinătate.
Legătura RD Legătura RD
C-H 1,676 C=O 3,320
C-C 1,296 C-S 4,610
C=C 4,170 C=S 11,910
C=C (terminal) 5,870 C-N 1,570
C=C (neterminal) 6,240 C=N 3,760
C-C (ciclopropan) 1,490 C=N 4,820
C-C (ciclohexan) 1,270 O-H 1,660
C-C (aromatic) 2,688 N-H 1,760
C-Cl 6,510 N=N 4,120
C-O (alcool, eter) 1,540 N-N 1,990
C-O (ester) 1,460 N=O 4,000
388
• Refracţia moleculară a amestecurilor este o proprietate
aditivă a substanţelor. Ea se poate calcula cu ajutorul relaţiei
Lorentz - Lorentz din indicele de refracţie n, densitatea d a
amestecului ştiind că:
389
ANALIZA CHIROPTICǍ
A MEDICAMENTELOR
• Termenul chiroptic descrie tehnicile ce utilizează dispozitive de
decelare optică ce sunt selective faţă de substanţele şi/sau
moleculele optic active.
390
1. Polarimetria - se bazeaza pe insusirea izomerilor optici
(enantiomerilor) de a roti planul luminii polarizate, datorita
asimetriei unor atomi de carbon din moleculele substantelor
optic active.
- masoara rotirea planului luminii polarizate
sub un anumit unghi (de obicei la o singura lungime de unda)
391
ANALIZA POLARIMETRICĂ
Principii generale
Lumina nepolarizată este compusă dintr-un număr infinit de
vectori electrici şi magnetici ce oscilează perpendicular pe
direcţia de propagare.
392
• Dacă lumina polarizată este
transmisă printr-un mediu achiralic
(a), componentele polarizate
intâlnesc un singur indice de
refracţie şi vitezele lor de propagare
sunt egale. De aici rezultă că,
vectorul sumă va fi mereu o rază
polarizatǎ liniar, orientată de-
alungul direcţiei razei incidente,
OO’.
393
• In cazul moleculelor optic active, fortele rotatorii sunt egale si
opuse sau exista perechi de enantiomeri de puritate egala.
• Mărimea unghiului este direct proporţională cu diferenţa
indicilor de refracţie şi cu grosimea stratului (d).
π
α nL nD x d
λ
• Pentru exprimarea valorii unghiului α în grade, la grosimi de
strat exprimate în dm, valoarea din relaţia de mai sus se
amplifică cu factorul 1800/π.
1. Scattering
E
Incident light
Scatterer
isotropic
crystal anisotropic
(sodium crystal
chloride) (calcite)
397
Pentru obţinerea luminii polarizate se foloseşte pe scară largă
prisma Nicol sau nicolul. Această prismă constă dintr-un cristal
de spat de Islanda tăiat oblic, sub o înclinaţie mare şi lipit cu
balsam de Canada, care are un indice de refracţie mai mare
decât indicele spatului pentru raza extraordinarǎ şi mai mic
decât pentru raza ordinarǎ.
Raza extraordinară pătrunde în stratul de balsam de Canada ca
într-un mediu mai dens şi iese din el în cea de a doua parte a
cristalului ca într-un mediu mai puţin dens. Direcţia de
propagare a razei este paralelă cu cea a razei iniţiale.
Raza ordinară întâlneşte stratul de balsam de Canada ca pe un
mediu mai puţin dens şi, căzând sub un unghi ales mai mare
decât unghiul limită, suferă reflexie totală, fiind apoi absorbită de
peretele înnegrit al nicolului.
Din nicol iese numai raza extraordinară sub forma unei raze
polarizate.
398
APARATURA
Polarimetre.
400
Pentru a elimina influenţa grosimii stratului, densităţii şi
concentraţiei se calculează mărimea - putere rotatorie specifică,
[] dată de următoarele relaţii:
unde:
= unghiul citit la polarimetru
l = lungimea cuvei în dm
d = densitatea
c = concentraţia procentuală.
Concentratia se calculeaza dupa formula:
401
Indicii rotaţiei specifice se referă la temperatura de lucru (20–
25o C) şi la lungimea de undă folosită: linia D a sodiului, 5893
Å sau linia verde a Hg, 4561 Å.
In scopul comparaţiei rotaţiei optice a diferitelor substanţe se
defineşte mărimea numită rotaţie molară:
sau
=.M/100
unde:
M = masa moleculară
402
APLICAŢIILE POLARIMETRIEI
1. Aplicaţii în cercetare
403
2. Aplicaţii în controlul de calitate
Industria farmaceutică
Determinarea purităţii produsului prin măsurarea rotaţiei
specifice şi rotaţiei optice pentru: aminoacizi, antibiotice,
aminozaharuri, analgezice, cocainǎ, codeinǎ, dextrozǎ, diuretice,
seruri, steroizi, tranchilizante, vitamine.
Arome, parfumuri şi uleiuri esenţiale industriale
Inspectarea produselor: camfor, acid citric, gume, acid gliceric,
ulei de lavandă, ulei de lămâie, ulei de mentă, ulei de portocale.
Industria alimentară
Determinarea concentraţiei şi puritǎţii următorilor compuşi din
alimentele pe bază de zaharuri, cereale şi siropuri: carbohidraţi,
lactoză, rafinoză, varietăţi de amidon, fructoză, levuloză, glucoză,
maltoză, sucrozǎ, xiloză, monozaharide naturale.
Industria chimică
Se analizează rotaţia optică ca mod de identificare şi
caracterizare: biopolimeri, polimeri naturali, polimeri sintetici.
404
Uleiurile eterice sunt caracterizate nu prin puterea rotatorie specifică, ci
prin puterea rotatorie, caracterizată prin valori uneori mici ale unghiului
de deviere. Astfel:
• uleiul de anason: - 20 → + 10
• uleiul de cuişoare: 0 → - 1,60
• uleiul de scorţişoară: - 1→ + 10
• uleiul de lămâie: + 57 → 65
• uleiul de ienupăr: - 1 → - 10
• uleiul de mentă: - 18 → - 34
405
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase
unde:
G = conţinutul la % (g/v) în glucoză anhidră determinat.
406
PLANUL CURSULUI
Dispersia optica rotatorie
Dicroismul circular
Separarea cromatografica
- Clasificarea metodelor cromatografice
- Procedeul elutiei
407
2. DISPERSIA OPTICǍ ROTATORIE (DOR)
OPTICAL ROTATORY DISPERSION (ORD)
Principii generale
408
În locul indicilor de refracţie se folosesc în mod
curent valorile extincţiilor celor două componente
(EL şi ED) sau ale absorbanţelor (AL şi AD).
409
Pentru unele substanţe optic active valoarea unghiului scade
repede, trecând prin zero şi ajungând la valori negative.
Această anomalie observată în vecinătatea benzilor de absorbţie
active se numeşte efect Cotton.
410
APLICAŢIILE DISPERSIEI OPTICE ROTATORII
Determinări structurale
Steroli
Stabilirea poziţiei cromoforului carbonilic în structura unui steroid
(prin analiza curbelor caracteristice).
Carvona
412
Hematina şi curbele DOR ale formelor oxidate şi reduse
3. DICROISMUL CIRCULAR (DC)
CIRCULAR DICHROISM (CD)
Principii generale
Cotton a sugerat faptul că există, o diferenţă între
absorbanţele absolute ale celor douǎ raze polarizate circular de
cǎtre un mediu chiralic (dicroism) şi că magnitudinea
dicroismului este proporţionalǎ cu diferenţa dintre
absorbanţe (extincţii).
413
Urmând regulile descompunerii vectorului
normal, vectorul electric se împarte în doi
vectori (verzi) .
414
Cei doi componenţi polarizaţi circular sunt absorbiţi diferenţiat,
astfel că intensităţile lor sunt diferite.
Rezultanta descrie o traiectorie eliptică.
415
Elipticitatea:
este o consecinţă a dicroismului
este direct proporţională cu acesta.
variază cu concentraţia şi grosimea stratului → se utilizeaza
termenul elipticitatea molară.
unde:
c = molaritatea soluţiei
l = grosime strat
100 = datorită utilizării cm.
Elipticitatea molara se exprima în:
100 deg dm3mol-1cm-1 = 100 degcm3/1000mol-1cm-1 =
deg cm2 / 10 mol-1 = deg cm2 dmol-1
416
Elipticitatea molara se poate exprima prin absorbtivitate dicroică.
Absorbtivitatea dicroică, Δε = diferenţa dintre coeficienţii molari de extincţie ai
razelor circular polarizate la stanga şi dreapta.
εL – εR = Δε = absorbtivitate dicroică
[θ] = 3298.2Δε
unde:
[θ] = elipticitatea
Δε = absorbanţă dicroică.
Spectrometru DC
418
Curbele obţinute în dicroismul circular prezintă:
pe ordonată diferenţa dintre coeficienţii molari de extincţie ai celor două
radiaţii circular polarizate Δε
pe abscisă lungimea de undă, λ (nm).
Inregistrarea concomitentă
a curbelor DOR şi DC
419
Avantaje:
utilizarea de probe în cantităţi foarte mici (200 μl soluţie 0.5
mg/ml)
pregătirea probelor se realizează într-un timp scurt
este o metodă nedistructivă
timpul de rezoluţie este de ordinul microsecundelor astfel
dicroismul circular este o metodă rapidă
modificările datorate influenţei mediului asupra probei (pH,
temperatură) pot fi monitorizate cu acurateţe.
Dezavantaje:
determinarea globală a structurii
interferenţa cu absorbţia solventului în regiunea spectrală astfel
încât sunt necesare soluţii foarte diluate
dacă soluţia tampon mascheaza semnalul probei analizate
trebuie să se realizeze operaţii preliminare de dializă, concentrare
sau diluare metoda are o acurateţe de 10 %
pot să apară erori în modul de lucru
aparatura folosită este scumpă.
420
Aplicatiile dicroismului circular
• Determinarea structurii moleculare, configuraţiei şi
conformaţiei unor biocompuşi
422
Demonstrarea compatibilităţii conformaţiei
423
Determinarea structurii unor complecşi de incluziune
424
• Acidul 3 carboxicumarinic
este o moleculă achirală și
astfel nu este de aşteptat să
producă un spectru dicroic.
Totuşi, ȋn absența
ciclodextrinei se poate
ȋnregistra un spectru dicroic
foarte scăzut datorat probabil
unor conformeri generaţi de
diferitele poziţii ale grupării
COOH, ȋn afara planului
cumarinic.
425
Caracterizarea compuşilor chiralici
Dicroismul circular se poate asocia cu analiza HPLC şi analiza spectrală în UV pentru a diferenţia un
derivat chiralic de chinazolină.
Curbele reprezintă pe de o parte analiza derivatului acetilat şi a celui neacetilat analizat dicroic şi
pe de altă parte analiza spectrală a celor doi compuşi după separare HPLC (coloană chiralică OD – H
250 x 4,6 mm, viteză de curgere 0,8 ml/min, fază mobilă: n – hexan – 2- propanol: 9 : 1 la lungimea
de undă 277 nm).
426
Controlul reacţiilor chimice
427
Determinarea stabilităţii termice
• Stabilitatea termică este evaluată prin utilizarea DC prin
urmărirea schimbărilor ce au loc în spectru prin creşterea
temperaturii
428
Controlul preparatelor farmaceutice.
429
• Analiza soluţiei uleioase injectabile ce conţine benzoat de
estradiol, progesteronă şi propionat de testosteronă
430
Monitorizarea legării unor substanţe
medicamentoase de albumina serică
Modificări ȋn spectrul dicroic ȋn urma legării diazepamului de albumina serică – stânga – Spectrul dicroic ȋn urma
modificări ȋn spectrul dicroic ȋn UV apropiat diazepam liber şi legat; dreapta – modificări
interacţiunii ibuprofen-albumină
la creşterea concentraţiei de diazepam
serică umană
Dezlocuirea diazepamului de pe
albumina serică de către ibuprofen
431
ANALIZA TERMICĂ A MEDICAMENTELOR
Analiza termică cuprinde un grup de tehnici în care se
monitorizează diferenţele ce se produc în unele dintre proprietăţile
fizice si chimice ale substanţelor atunci când sunt supuse unui
program controlat de temperatură, prin raportarea la etaloane sau
substanţe de referinţă.
433
Operaţiile necesare unei analize gravimetrice:
pregătirea materialului pentru analiză
cântărirea probelor
dizolvarea substanţelor
precipitarea
separarea
purificarea
uscarea
calcinarea
cântărirea precipitatelor
calculele şi interpretarea rezultatelor.
Numărul mare al metodelor gravimetrice şi exactitatea
rezultatelor obţinute face ca metoda să fie uneori folosită
pentru verificarea altor metode chimice sau fizico - chimice
utilizate în analiza cantitativă.
Exactitatea rezultatelor obţinute în analiza gravimetrică
ţine de performanţa instrumentelor de măsură. S-au elaborat
astfel de metode:
semimicrogravimetrice (10-100 mg)
microgravimetrice (0,01-10 mg)
ultramicrogravimetrice (sub 0,01 mg).
434
ANALIZA TERMOGRAVIMETRICĂ, THERMOGRAVIMETRY (TG),
THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS (TGA),
THERMAL GRAVIMETRIC ANALYSIS
Principii generale
Termogravimetria se bazează pe înregistrarea variaţiei masei unei
substanţe date în funcţie de:
temperatura de încălzire
timp
atmosfera din celula termica (presiunea şi compoziţia gazului: azot,
heliu, aer, etc.)
Analizor termogravimetric
Înregistrarea rezultatelor
436
In mod curent se trasează două feluri de curbe:
1. Curbe de temperatură constantă
Aceste curbe se obţin astfel: încălzind o substanţă la temperaturi diferite
(T1, T2, ....), la temperatura T1 se va atinge un prim echilibru după
timpul t1 şi pe curbă se va înscrie un palier orizontal. Incălzind aceeaşi
substanţă la temperatura T2 se atinge un al doilea echilibru (înscris tot
ca palier orizontal) după un timp t2.
438
• Dacă echilibrul doi este obţinut şi pus în evidenţă printr-un
palier, existenţa, poziţia şi lungimea lui depind de viteza v. Acest
palier indică obţinerea unui compus cu o compoziţie unitară şi
este influenţat de viteza de creştere a temperaturii. Aceste curbe
sunt cunoscute sub denumirea de curbe de termoliză, notate TG.
• În analiza termogravimetrică se utilizează şi curbele diferenţiale
ale variaţiei greutăţii (DTG) corespunzând derivatei curbei de
termoliză.
439
Interpretarea curbelor termogravimetrice
Curbe de termoliza
440
APLICAŢIILE ANALIZEI TERMOGRAVIMETRICE
Măsurarea stabilităţii termice
Determinarea temperaturii şi a modificării masei, în urma
reacţiilor de descompunere, astfel metoda poate fi utilizată pentru
analize cantitative
Măsurarea vitezei de evaporare, măsurarea vaporilor emişi de
amestecurile lichide
Determinarea temperaturii Curie a tranziţiilor magnetice
Identificarea materialelor organice prin măsurarea temperaturii de
scindare a legăturilor în atmosferă inertă sau măsurarea
temperaturii de oxidare în aer sau oxigen
Determinarea purităţii compuşilor minerali, anorganici sau
organici
Determinarea conţinutului în substanţe anorganice sau organice
în diferite materiale
441
Determinarea conţinutului unor pulberi, apei, monoxidului de carbon şi dioxidului
de carbon din carbonaţi
Descompunerea oxalatului de calciu monohidrat
442
o Studierea stabilităţii termice a substanţelor medicamentoase
• Exemplu: teofilina
• pierdere în greutate de 9.3 %
în intervalul 60 - 80 0C, datorat
deshidratării
• ȋntre 250 – 375 0C are loc
pierdere de masă, ȋntr-o
singură etapă, fără obţinerea
unui reziduu
443
443
• Identificarea unor excipienţi ȋntrebuinţaţi
la condiţionarea unor forme farmaceutice
444
444
Analiza telmisartanului
Curbele TG şi DTG
pentru telmisartan
445
445
Descompunerea termică a telmisartanului
ANALIZA TERMICǍ DIFERENTIALǍ (ATD)
DIFFERENTIAL THERMAL ANALYSIS (DTA)
Principii generale
447
O celulă ATD conţine:
- Termocuplu pentru probă,
termocuplu pentru martor, un
bloc ceramic sau metalic
- Cuptor
- Programator pentru
temperatură
- Sistem de înregistrare
Înregistrarea rezultatelor
Diferenţa de temperatură dintre cele două substanţe va fi nulă
dacă nu are loc nici un fenomen fizic sau chimic.
Orice proces chimic care ar avea loc se produce cu degajare sau
absorbţie de căldură. Ca urmare, apare o diferenţă de
temperatură între cele două probe, ceea ce va determina o
deviere faţă de linia de zero, permiţând astfel să se constate
natura procesului termic care se produce: exoterm (+) sau
endoterm (-). 448
DTA
449
APLICAŢIILE ANALIZEI TERMODIFERENŢIALE
Tehnica “fingerprinting” furnizează informaţii referitoare la reacţii
chimice, transformări de fază, modificări structurale ce se pot
petrece pe parcursul încălzirii sau răcirii unei probe, cu scopul
identificării acesteia. Ex. - teofilina
450
o Identificarea transformărilor de fază şi a modificărilor structurale
Analiza ATD a
cilazaprilului
Se constatǎ:
un efect exotermic la 127o şi 161o C,
o descompunere exotermica la 400o
C cu o pierdere de masa de 89,1%.
Corelând datele furnizate de cele trei curbe (TG, DTG, ATD) se pot trage următoarele
concluzii:
dacă curbele TG şi DTG nu arată modificări şi numai curba ATD arată schimbări,
substanţa a suferit fie un proces fizic, fie un proces chimic fără variaţia masei
dacă toate curbele arată modificări şi în final prezintă paliere orizontale înseamnă că au
loc transformări cu variaţii ale masei, iar în final s-au obţinut produşi stabili.
453
CALORIMETRIA PRIN SCANARE DIFERENŢIALĂ
DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC)
Principii generale
454
Atât proba cât şi martorul sunt menţinute aproape la acelaşi
nivel de temperatură pe parcursul analizei. În general,
programarea temperaturii pentru analiza DSC este desemnată
astfel încât proba este ţinută la o temperatură ce creşte liniar
funcţie de timp. Proba martor ar trebui să aibă o capacitate de
încălzire (căldură) peste aceasta temperatură.
455
PROCEDEE
PRT Sensor
Platinum
Resistance Heater
Heat Sink
456
DSC prin flux de căldură, flux termic
457
DSC prin flux termic (Heat Flux DSC)
459
DSC prin compensarea energiei
( Power Compensated DSC)
460
Rezultatele sunt exprimate prin curba de încălzire sau de rǎcire,
care poate fi folosită pentru calcularea entalpiei tranziţiilor.
Entalpia se calculează după formula:
unde:
H = entalpia tranziţiei
K = constanta calorimetrică
A = aria de sub curbă.
461
APLICAŢIILE CALORIMETRIEI PRIN
SCANARE DIFERENŢIALǍ
Determinarea structurilor amorfe
Tranziţiile “Glass”
În sens comun, termenul “glass” se refera la solidele amorfe
transparente, tari şi fragile. In sens ştiinţific, sensul de “glass” este
frecvent extins la toate corpurile solide amorfe (şi topituri care cu
uşurinţă formează solizi amorfi), incluzând masele plastice, răşinile
sau alte solide amorfe lipsite de silicaţi.
462
463
Cristalinitatea substanţelor
Topirea şi cristalizarea (Punct cristalizare - TC; Punct topire - Tm)
464
Transformările fizico chimice ce pot fi evaluate prin tehnica DSC
465
Analize calitative: amprenta digitală a mineralelor, polimerilor şi
argilelor.
466
o Determinarea punctului de topire, polimorfismului şi cristalinităţii
• descompunerea
termică a unor
substanţe
chimioterapeutice
Curbele TG/DTG şi DSC ale unor substanţe chimioterapeutice: (a) trimetoprim, (b)
sulfametoxazol, (c) ampicilină, (d) clorhidrat de tetraciclină, (e) rifampicină, (f)
trimetoprim-sulfametoxazol
468
468
o Interacţiunea medicament-excipient
https://www.youtube.com/watch?v=UNiDkw8nji4
470
CROMATOGRAFIA
Istoric
Friedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867)
farmacist şi chimist - separări pe hârtie de filtru
"Der Bildungstrieb der Stoffe" (1855)
471
Istoric
Reichstein & van Euw (1938): elutie cromatografica
Martin & Synge (1941): cromatografie de repartitie pe coloana – premiul
Nobel pentru chimie
Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subţire (TLC)
Cremer & Prior: cromatografie de gaz-solid
Martin & James (1952): cromatografie de gaz-lichid
Golay (1959): cromatografia de gaze pe coloane capilare
Giddings & Kirkland (1968): cromatografia de lichide de inalta
performanta
472
Proba
474
Faza stationara
Separare
Faza mobila
Amestec Componenti
Alb
Rosu
Galben
475
CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE
Criterii:
starea fizica a celor doua faze
lichid, solid, gaz
polaritatea fazelor
● Cromatografie cu faza normală (FS polară, FM nepolară)
● Cromatografie cu faza inversă (FS nepolară, FM polară)
477
mecanismul care stă la baza procesului elementar de
separare şi după natura celor două faze:
478
Cromatografia de repartiţie - se bazează pe solubilitatea
selectivă a componenţilor amestecului de analizat între două faze
nemiscibile. Faza staţionară este lichidă, înfăşurând sub forma
unui film aderent o suprafaţă inertă, iar faza mobilă poate fi un
lichid sau un gaz.
Deosebim:
cromatografia lichid-lichid
cromatografia gaz-lichid.
479
Cromatografia de excludere - difuzie (excludere
moleculară, filtrare prin gel). Faza mobilă poate fi gaz sau
lichid. Suportul este un material cu porozitate controlată, de
obicei geluri. Moleculele de solut părăsesc coloana
cromatografică în ordinea descrescătoare a masei lor
moleculare. Componenţii cu masă moleculară mare nu pot
pătrunde în faza staţionară conţinută în cavităţile granulelor de
gel si vor părăsi primii coloana - excludere; cei cu masă
moleculară mică vor difuza liber între faza intragranulară (faza
staţionară) şi faza intergranulară (faza mobilă) şi vor ieşi ultimii.
482
PROCEDEUL ELUŢIEI (Cromatografia pe coloana)
484
Cromatograma
485
Parametrii cromatografici
• Linie de bază = orice parte a cromatogramei unde doar faza mobilă iese din coloană.
Volum mort (V0) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană intre punctul
de injectare si punctul mort:
V0 = Qt0
unde:
- Q = viteza de curgere (debit) ml/min.
Volum de retentie (Vr) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană între punctul de
injectare şi picul maxim: Vr = Qtr
487
Coeficient de distribuţie/partitie (K)= raportul concentraţiei unui
component în faza staţionară şi în faza mobilă: [i ]s
K
[i ]m
Depinde de :
- natura componentei repartizate între FS şi FM
- natura fazelor FM şi FS
- temperatura de lucru
- mecanismul de interacţiune cu FS şi cu FM
unde:
- Vs = volumul fazei staţionare;
- Vm = volumul fazei mobile.
488
Factor de separare/selectivitate – este o masura a capacitatii sistemului
cromatografic de a separa doi componenti.
K B kB
K A kA
489
Rezoluţia, (Rs) - măsoară capacitatea efectiva/gradul total de
separare a 2 picuri vecine
unde:
- z = este distanţa între maximul de concentraţie al picurilor de
eluţie aparţinând celor doi soluţi vecini A şi B;
- l = lăţimea fiecărui pic.
• Cu cat rezoluţia are o valoare mai mare, cu atat separarea este mai
buna
491
a) Rs = 1, dB-dA = 4 ,
curbe suprapuse 2 % → separare rapida
b) Rs ≥ 1.5, dB-dA = 6 ,
curbe suprapuse 0.3 % → separare mai buna
492
Planul cursului
- Teoria talerelor
- Izoterme de distributie
- Ecuatia Van Deemter
- Dispersia zonelor
- Tehnici de elutie
- Cromatografia planara (pe coloana deschisa)
- Cromatografia pe hartie
493
TEORIA TALERELOR TEORETICE
(Teoria platourilor teoretice)
494
Exemplu: fiecare taler conţine
- o masă m de fază staţionară,
- faza mobilă este adusă în fracţiuni de volume
vi.
în care :
- L = lungimea coloanei (cm).
497
A, B, C sunt constante pentru o
coloana, un analit si conditii
experimentale date:
- A = difuziune turbulentă, determinata
de curgerea neuniforma a fazei mobile
prin coloana/faza stationara (structura
neuniformă a umpluturii)
- B = difuziunea longitudinală a
Reprezentarea ecuaţiei lui van Deemter moleculelor fazei mobile
- C = coeficientul de rezistenţa la
H = A + B/v + Cv transferul de masă în faza staţionară
- v = viteza de deplasare a fazei mobile
(cm.s-1).
498
Difuzia turbulenta:
500
Coeficientul de rezistenta
501
Dispersia zonelor
502
În timpul migrării prin coloană, substanţa eluată nu rămâne
concentrată într-o porţiune tot atât de îngustă ca în zona de start.
Se produce o etalare progresivă a zonei pe măsură ce se avansează
în coloană. Moleculele suferă o dispersie în jurul unei poziţii medii
unde se găseşte maximum de concentraţie.
505
IZOTERME DE DISTRIBUŢIE
Izoterme de distribuţie
q - cantitate adsorbită pe unitate
de masă de adsorbant ;
c - concentraţie în faza mobilă
506
Izoterma de sorbţie liniarǎ (izoterma I):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2=2q1
- proporţionalitate între cantitatea de
substanţă sorbită şi concentraţia sa în
soluţie
- străbaterea coloanei cromatografice se
face cu o viteză independentă de
concentraţie.
507
Izoterma de sorbţie convexă (izoterma II):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor fi
q2 < 2q1
- la concentraţii mai mari (C2), în soluţie
rămâne o proporţie mai mare de substanţă,
comparativ cu cantitatea corespunzătoare
concentraţiei mai mici (C1)
- substanţa va parcurge coloana cu viteză
mai mare la concentraţie mare şi cu viteză
mai mică la concentraţie mică.
508
Pentru izoterma concavă (izoterma III):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2 > 2q1
- viteza mare va corespunde
concentraţiei mici, deoarece la această
concentraţie există o proporţie mai mare
de substanţă în soluţie.
509
Datorită efectelor de difuzie şi a faptului că echilibrul este
incomplet, distribuţia substanţei în zona de start apare ca o parte
centrală concentrată urmată şi precedată de părţi marginale
corespunzând unor concentraţii uniform descrescătoare.
Dacă izoterma de distribuţie este:
● liniară, aspectul zonei de concentraţie se menţine neschimbat în
timpul deplasării de-alungul coloanei cromatografice.
● curba, zona de concentraţie îşi
schimbă aspectul în timpul deplasării
devenind nesimetrică, porţiunea
maximului de concentraţie a zonelor
deplasându-se mai :
- repede (izotermă convexă)
- încet (izotermă concavă) zona
primind un front abrupt sau prelungit.
Eluţie izocratică
Eluţie în gradient
Eluţia solutului într-un sistem cromatografic Procedeul frontal
Procedeul deplasǎrii
511
1.Eluţia izocratică
Efectul unor
concentraţii
diferite de
solvent
organic
512
Cu cât coloana este mai lungă şi distanţa dintre picuri este mai
mare si picurile probei se lărgesc în acelaşi timp.
513
Schema de eluţie a unui amestec de 6 compuşi
Când se foloseşte un solvent cu putere de eluţie slabă (E1) se
separă bine componenţii 1 şi 2, cu un volum prea mare componenţii
3 şi 4 şi nu se desprind de pe coloană compuşii 5 şi 6.
Dacă se foloseşte un solvent puternic (E2) cu putere de eluţie prea
mare, componenţii 1 - 4 nu se separă, dar compuşii 5 şi 6 sunt bine
514
separaţi.
• Când se foloseşte amestecul
E1 + E2 cu putere de eluţie
medie se obţin separări
intermediare bune dar nu se
separă componenţii 1 şi 2 şi se
eluează componenţii 5 şi 6 într-
un volum prea mare.
• Rezolvarea se face prin aşa-
numita “eluţie în etape“ când se
adaugă eluenţi diferiţi în mod
discontinuu cu o putere de
eluţie crescătoare (E1 urmat de
E1 + E2 şi apoi E2).
• Se recomandă aplicarea acestei
metode numai în cazul probelor
cu izoterme liniare şi de
compoziţie cunoscută pentru a
decide uşor când trebuie
schimbat solventul.
515
2. Eluţia în gradient
517
3.Procedeul frontal
Acest procedeu constă în trecerea soluţiei de analizat prin coloana
cromatografică, nefiind necesar un solvent de developare. Se
determină concentraţia de solut în eluent, se reprezintă această
mărime în funcţie de volumul de eluent şi se obţine o curbă în
trepte.
• Prima treaptă conţine
componentul 1, treapta a doua
conţine componentul 1 şi 2 şi
astfel până la n componenţi.
• Se obţine o separare individuală
doar a componentului cu
afinitatea cea mai slabă pentru
faza staţionară. După acesta,
fiecare treaptă corespunde unui
amestec binar, ternar, până la
soluţia iniţială.
• Metoda nu prezintă un interes
deosebit, informaţiile obţinute
referindu-se mai mult la numărul
Diagrama analizei frontale componenţilor din probă 518
4. Procedeul deplasării
Metoda este eficientă doar când faza staţionară este solidă şi soluţii
sunt adsorbiţi la suprafaţa ei, în funcţie de afinitate.
519
Substanţele cu izoterme liniare nu pot
fi separate prin această metodă deoarece
nici o linie de viteză nu le intersectează.
520
CROMATOGRAFIA PLANARĂ (pe coloana deschisa):
- Cromatografia pe hârtie
- Cromatografia pe strat subţire
- Cromatografia pe strat suprapresurizat
- Cromatografia planarǎ multidimensionalǎ
521
CROMATOGRAFIA PLANARA (CP)
PLANAR CHROMATOGRAPHY (PC)
522
Într-o manieră contradictorie, având în vedere că poate fi pusă în lucru
atât de uşor, CP a câştigat stigmatul unei metode de rezoluţie, si
sensibilitate scazuta şi incapabilă de a răspunde la problema punerii la
punct a metodelor precise, exacte şi specifice.
Mai clar, se poate spune că, atunci când este prost utilizată, CP
instrumentalǎ dă rezultate proaste şi acesta este singurul motiv pentru care
dezvoltarea tehnicilor specifice pentru CP a început cu întârziere, în raport
cu alte tehnici cromatografice.
523
CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
PAPER CHROMATOGRAPHY (PC)
In hârtia cromatografică, datorită structurii fibroase, există goluri, iar celuloza care
formează faza staţionară prezintă suprafeţe de ordinul 600 m2/g.
Faza staţionară este alcătuită din faza apoasă care există întotdeauna în celuloză
datorită caracterului hidrofil şi structurii poroase a celulozei.
524
Hârtia cromatografică obişnuită nu se poate folosi la separările de
substanţe grase, alcaloizi, proteine, etc. Pentru aceste scopuri se foloseşte
hârtia cromatograficǎ hidrofobizată sau celuloza modificată chimic.
525
Caracteristicile unor sorturi comerciale de celuloză
schimbătoare de ioni
526
Pentru separarea în bune condiţii a unor clase de substanţe se aplică
impregnarea hârtiei cu lichide sau substanţe solide.
Hârtiile cele mai utilizate pentru impregnări sunt: Whatman 3,4,1 şi
Schleicher-Schull 2043 şi 2045.
Se impregnează hârtia cu soluţii tampon, acizi, baze, lichide polare sau
nepolare, agenţi de complexare, săruri ale metalelor grele (Ag+, Cu2+, Pb2),
agenţi de precipitare.
Hârtiile impregnate cu acid silicic sunt folosite pentru separările
lipidelor polare, hidraţilor de carbon şi a fosfolipidelor.
Impregnarea hârtiei cu o altă fază staţionară lărgeşte posibilităţile de
separare a substanţelor anorganice şi organice.
527
In separările cromatografice, ca faze mobile se folosesc serii de solvenţi
organici şi compuşi anorganici.
528
CLASIFICARE
529
Detectia
Detectia dupa migrare poate fi:
Vizuala
Instrumentala
Detectia vizuala:
o Detectie chimica:
- directa pentru compusii colorati
- dupa pulverizarea unui reactiv capabil sa reactioneze cu moleculele
separate pentru a da substante colorate
Exemple de reactivi:
● iodură de platină
● verde de bromcrezol
● brom - amidon - iodură de potasiu
● diazotare şi cuplare cu -naftol
● p-nitroanilină diazotată (în mediu bazic)
● p-dimetil-aminobenzaldehida
● reactivul Dragendorff
● vapori de iod
● reactivul Marquis
● reactivul Millon
● ninhidrină
● permanganat de potasiu
530
o Detectie fizica:
- examinare in lumina UV-Vis
Detectia instrumentala
o Detectie densitometrica
o Banda de hârtie se decupează, se extrage cu un solvent adecvat şi
se analizează printr-o metodă adecvată: refractometric,
spectrofotometric etc.
531
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE HARTIE
Alte exemple:
- Identificarea gentamicinei sulfat
- Identificarea vancomicinei clorhidrat
532
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE (CSS)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)
Principii generale
În procesul cromatografic intervin legături intermoleculare de energie
slabă :
forţe van der Waals
legăturile de hidrogen
533
Legăturile de hidrogen
534
Migrarea prin capilaritate a eluantului cu traversarea adsorbantului
antrenează selectiv soluţii. În funcţie de natura chimică:
solutii care au energie de adsorbţie mare sunt puternic fixaţi si sunt
puţin antrenaţi de către eluant → migrează puţin.
soluţii care au energie de adsorbţie mică - fenomenul invers.
535
MĂRIMI FUNDAMENTALE
Factorul de retentie:
variaza invers proportional cu raportul de distributie si este cuprins
intre 0 si 1.
536
DESFÃŞURAREA PROCESULUI CROMATOGRAFIC
În CSS, plăcile sunt constituite dintr-un suport inert rigid sau flexibil
(placă de sticlă, foiţa de aluminiu, etc.), pe care faza staţionară este depusă
sub forma unui strat subţire (grosimea între 200 şi 250 m).
Stratul subţire depus se amestecă cu lianţi minerali sau organici pentru
a asigura adeziunea pe placa cromatografică.
Dimensiunile obişnuite ale suprafeţei stratului sunt:
- 10 x 5 cm
- 10 x 10 cm
- 10 x 20 cm
- 20 x 20 cm.
537
Plăcile flexibile
538
In afara plăcilor clasice ale cromatografiei pe strat subţire se
folosesc plăci HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography):
dimensiuni: 10 x 10 cm sau de 10 x 5 cm
diametrul particulelor: este mult mai mic
grosimea stratului adsorbant: 100 m (200-250 m în
cromatografia clasică)
suportul: silicagel ca în cazul cromatografierii cu faze normale sau
cu Si-C8 sau Si-C18 în cromatografia cu faze inverse
distanţa de migrare: 3-5 cm
spotarea: automat
timpul necesar unei analize: scurt
scanarea: UV-VIS sau prin fluorescenţă cu ajutorul densitometrelor.
539
Depunerea eşantionului (spotarea)
În CSS clasică:
soluţia eşantionului substanţei de analizat este depusă cu ajutorul unui
capilar sau a unei seringi la o distanţă mică (în general 1 cm) de
extremitatea stratului
Volumul depus este foarte mic şi trebuie de avut grijă ca stratul de fază
staţionară să nu se deterioreze cu extremitatea seringii sau a capilarului.
Volumele transferabile prin capilare mici sunt de zeci până la 500 nl, iar
cele prin seringi de 10 nl până la 100 l.
540
Practic, trebuie efectuată spotarea în soluţia unui solvent, a cărui forţă
eluantă să fie mai slaba decât cea a solventului de developare, altfel spus,
dacă faza staţionară este polară, spotarea trebuie efectuată într-un solvent
nepolar.
541
Din punct de vedere comercial sunt disponibile aparatele semi- sau
automate de spotare a probei:
Nanomat; pipeta este coborâtă spre stratul fazei staţionare prin acţiunea
unui magnet. Volumele depuse sunt de 100-200 nl şi repetabilitatea
depunerii este de ordinul 1 %.
542
Developarea plăcilor
Placa este plasată într-o cuvă (bac) de developare, conţinând solventul (sau
amestecul de solvenţi) ce constituie faza mobilă.
543
Ascensiunea capilară
545
METODE DE DEVELOPARE ÎN
CROMATOGRAFIA PLANARA
Developarea liniară
ascendenta
descendenta
Cea mai mare parte a CP este realizată într-un sistem în care placa este
dispusă vertical într-o cuvă adaptată dimensiunilor plăcilor.
546
Un alt procedeu pentru o developare liniară constă în dispunerea plăcii
orizontal. Solventul ajunge din 2 părţi opuse ale plăcii printr-o fantă
capilară. Procesul de developare se opreşte când cele 2 fronturi se întâlnesc.
Avantajul acestui sistem este că, permite ocuparea totală a stratului de
adsorbant şi dublarea numărului de eşantioane pe care le putem analiza.
Developarea circulară
În acest sistem faza staţionară este dispusă orizontal, faza mobilă ajunge
până la centrul plăcii şi se distribuie uniform prin capilaritate, ceea ce
produce un spot circular care creşte dacă se continuă alimentarea
solventului.
Developarea anticirculară
547
Sisteme cu flux forţat
548
Faze polare negrefate
În mod tradiţional, CSS era pusă în lucru cu ajutorul unei
game limitate de faze staţionare (gel de silice, alumină,
celuloză, poliamidă, fixate pe plăci de sticlă sau foi de
aluminiu sau de plastic).
549
Faze polare grefate
550
Faze slab polare sau nepolare grefate
551
FAZE STAŢIONARE
Silicea/gel de silice/silicagel
(acid ortosilicic polimerizat)
552
Modificări chimice ale silicei
Se introduc radicali alifatici C2-C18, grupǎri diolice, CN etc.
553
Alte modificǎri:
Esteri
Legǎturi Si-C
Legǎturi Si-N
554
Siloxani
555
Alumina (oxid de aluminiu, Al2O3)
Proprietăţile adsorbtive au fost atribuite grupelor hidroxil
superficiale.
Toate substanţele organice (excepţie fac hidrocarburile alifatice)
sunt adsorbite de alumină:
compuşii neionici care au grupe donoare de protoni sunt adsorbiţi
prin legături de hidrogen
hidrocarburile aromatice sunt adsorbite pe atomii de aluminiu prin
legăturile .
Alumina acidă şi bazică funcţionează ca schimbători de ioni.
557
Hidroxidul de magneziu
Avantaje:
capacitate de adsorbţie mai mare
mai puţin sensibil la activare
straturile au o bună rezistenţă mecanică chiar fără liant.
Dezavantaje:
reacţionează cu iodul împiedicând astfel identificarea unor substanţe
este mai uşor deshidratat de către solvenţii anhidri
este solubil în alcool etilic.
558
Silicatul de magneziu
559
Pulberea de celuloză
Celuloza se caracterizează prin:
un numar foarte redus de grupe OH libere, acestea fiind antrenate în
legături de hidrogen care unesc diferite agregate structurale între ele.
un numar mare de canale şi goluri în care se pot adsorbi uşor solvenţi
polari capabili de a diminua legăturile de hidrogen sau de a forma la rândul
lor legături de hidrogen cu grupele OH. Are loc o lărgire a canalelor ceea ce
duce la creşterea capacităţii de pătrundere a solvenţilor şi a formării fazelor
staţionare lichide în acest suport.
calităţi excelente de suport pentru cromatografia de repartiţie lichid -
lichid datorita capacitatii mari de a reţine apa şi solvenţii polari.
Preparate din celuloză: pulbere de celuloză-D.O.-Camag, pulbere de
celuloză-D.F.O.-Camag, pulbere de celuloză 65-Schleicher-Schull, Celex
D(DEAE)-Bio Rad. Lab. (SUA), Celuloza ECTEOLA 67-Schleicher-Schull,
Selectacel CM 68-Schleicher-Schull, Celuloză-CM-Serva, Celuloza M.N.-
300,300 G, Celuloza M.N.-300-PEI (schimbător anionic), Celuloza M.N-300-
Poly-P (schimbător anionic).
560
Poliamida (-CO-NH-)
Este un polimer sintetic obţinut prin polimerizarea lactamelor sau
policondensarea acizilor graşi cu amine alifatice.
Grupele C=O şi NH ale poliamidei din interiorul polimerului formează
legături de hidrogen prin intermediul cărora lanţurile sunt legate între ele.
Aceleaşi grupe de la suprafaţa polimerului rămân libere şi joacă un rol
important în adsorbţia produşilor care trebuie separaţi.
O poliamidă folosită în cromatografia planară este Poliamida 6 (6(poli-[-
aminocaprolactama]) cu o granulaţie de 5-20 m.
Poliamida este folosită cu succes în separarea compuşilor cu structură
fenolică. Aceştia sunt relativ puternic adsorbiţi datorită legăturilor de
hidrogen care se pot forma între fenoli, ca donori de protoni şi grupa C=O
amidică ca grupă acceptoare de protoni. Substanţele care au grupe
acceptoare de protoni pot fi mai slab adsorbite prin formarea de legături de
hidrogen cu grupa NH amidică ce funcţionează ca grupă donoare de protoni.
Preparate de poliamidă: poliamidă M.N.; poliamidă Merck.
561
Sefadexul
562
Alţi adsorbanţi utilizaţi în cromatografia pe strat subţire:
563
FAZE MOBILE
Solvenţii utilizaţi pentru optimizare în cromatografia planară, clasaţi
funcţie de forţa eluotropă faţă de n-hexan.
564
DETECŢIA
ANALIZA CALITATIVA
Detectarea vizuală
În cazul fazelor grefate, este utilizată o sare de tungsten şi sodiu. Compuşii apar sub
formă de pete pe fondul luminos prin diminuarea fluorescenţei.
565
Sursele luminoase
566
Formarea de derivaţi pre sau post cromatografic
567
Metoda cea mai raspandita este formarea derivaţilor
după cromatografiere. Tehnica cea mai comună
constă în a pulveriza un reactiv pe placa uscată şi
lipsită de solvent.
Expunerea placii la vapori de iod.
Pulverizarea de solutii caustice, urmata de incalzirea
la 110 0C sau de reactivi diversi, formand compusi
colorati
ANALIZA CANTITATIVA
În scop cantitativ evaluarea conţinutului în substanţa activă de pe
placa cromatografică se face:
• cu ajutorul detectorilor densitometrici (fotodensitometre): scannere
care măsoară intensitatea luminii absorbite sau reflectate de spoturile
cromatografice. Intensitatea acestora se înregistrează sub formă de
curbă care se manifestă sub formă de picuri a căror arie se foloseşte
pentru calcularea concentraţiei.
568
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT SUBTIRE
1 – acid acetilsalicilic
2 – paracetamol
3 – cafeina
4 – amestec
569
Separarea si identificarea ibuprofenului si a cafeinei din comprimate
-Faza stationara: Silica gel 60 F254
-Faza mobila: acetat de etil:etanol:acid acetic (25:1:1)
-Detectie: 254 nm
-Rf ibuprofen = 0.91, Rf cafeina = 0.23, Rfproba = 0.24; 0.93
1 – ibuprofen
2 – cafeina
3 - amestec
570
Separarea, identificarea si determinarea cantitativa a principiilor
active din forme farmaceutice. Ex.:
Fenotizine (FS: kieselgur, FM: eter de petrol+dietilamina amestec saturat
in fenoxietanol, Detectie: UV la 365 nm)
Dexametazona (FS: silice, FM: metanol/clorura de metilen, Detectie: UV
la 254 nm)
Propranolol (FS: silice, FM: amoniac:metanol, Detectie: revelare cu
aldehida anisica)
Piroxicam (FS: silice, FM: acid acetic/toluen, Detectie: UV la 254 nm)
571
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUPRAPRESURIZAT
OVERPRESSURED LAYER CHROMATOGRAPHY( OPLC)
572
Folosirea presiunilor crescute permite utilizarea plăcilor cu
microparticule. Debitul poate fi reglat astfel încât să se obţină o viteză
liniară uniformă a lichidului vector. Astfel, sistemul va permite mai
multe tehnici de lucru.
Eşantioanele pot fi depuse pe o placă uscată, placa poziţionată în
aparat, developarea şi cromatografierea se opresc atunci când se
consideră necesar.
573
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT
SUPRAPRESURIZAT
determinarea trans-veratrolului
determinarea aflatoxinelor B1, B2, G1, G2 prin mǎsurǎri
densitometrice
analiza carotenoidelor din piperul roşu
analiza glicozidelor digitalice.
574
Planul cursului
Gaz-cromatografia
575
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ PERFORMANŢĂ
HIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
1. Parametrii de retentie
Timp retenţie: tR
Volum retenţie: VR
Timp mort: tM
576
2. Coeficient de distribuţie/partitie: Kd; D
3. Factorul de capacitate/retentie: k’
4. Factorul de separare/selectivitate: α
5. Rezoluţia: R
R ≥ 1 - compuşii sunt complet separaţi
R < 1 compuşii nu sunt separaţi.
577
APARATURA
Schema unui cromatograf HPLC
579
Solventi utilizati ca faze mobile in HPLC
580
2. POMPE
581
Pompele pot functiona la:
debit constant
presiune constanta
Pompele cu presiune constanta:
simple, ieftine
se folosesc cand permeabilitatea coloanei, temperatura si vascozitatea
eluentului sunt mentinute constante
debitul poate fi variat cu usurinta
lucreaza la presiuni mici, nu pot fi aplicate la elutie in gradient
prin aplicarea directa a presiunii gazului inert are loc si dizolvarea lui in
eluent
pe masura ce presiunea in coloana scade, bulele de gaz dizolvate se vor
degaja sub forma de bule in interiorul coloanei sau in detector
582
• Astazi, se folosesc doua tipuri de pompe:
Pompe cu piston
583
3. SISTEME DE INJECTARE
Preluarea probei in circuitul cromatografic se face prin
intermediul unei valve rotatorii.
Introducerea probei in aceasta valva se face:
manual
automat
Coloane:
585
Adsorbanţi utilizaţi în cromatografia Faze staţionare chimic legate
de adsorbţie:
Tip Denumirea
Denumirea
Ester silicat, pelicular Durapak
I. Materiale poroase de performanţă înaltă
Carbowax 400
Silicagel
Porasil
Porasil A
ODS/Corasil
Porasil B
Porasil C Silicon monostrat, pelicular Bondapak
Porasil D C18/Corasil
Porasil F Fenil/Corasil
Lichrosorb Vydac
Alumina Fază inverSǎ
Woelm alumina Faze legate polare
Bio - Rad AG Permaphase
Silicon polimolecular, pelicular
II. Materiale poroase de performanţă medie ODS
Silicagel ETH
Davison Code 12
Ester silicat, poros Durapak
Alumina OPN/Porasil-C
Alcoa F - 20 Carbowax 400/Porasil-C
III. Sfere strat poros de înaltă performanţă n-Octan/Porasil-C
Silicagel Bondapak
Silicon monostrat, poros
Corasil II C18/Porasil-B
Pellosil - HC Micropak
Perisorb - A CN
Alumina
NH2
Pellumina HC
Cărbune activ Polimer Zipax
Pellicarb HCP
Poliamida
586
5. DETECTORII
587
Detecţia cu ajutorul indicelui de refracţie poate fi consideratǎ
drept detecţie universalǎ deoarece virtual toate componentele
cauzează o schimbare a indicelui de refractie când sunt
dizolvate într-un solvent.
588
Detectori UV-VIS
• Sunt cei mai utilizati in analiza medicamentelor.
• Functioneaza pe baza legii Lambert-Beer (Absorbtia este proportionala cu
concentratia).
• Au o sensibilitate bună.
• Nu sunt afectaţi de fluctuaţii în viteza de curgere şi temperatură şi sunt
nedistructibili, permiţând soluţiei să fie colectată.
• Pot fi:
Detectori monocromatici: cei mai simpli detectori, sunt fixaţi pe o lungime de
undă tip, de obicei conţin lămpi de joasă presiune care au o emisie intensă la =
254 nm. Unele instrumente permit schimbarea detecţiei la o nouă lungime de
undă (280 nm).
Detectori policromatici: sunt detectorii de lungime de undă variabila, conţin o
lampă cu deuteriu cu o radiaţie continuă de la 180-400 nm, iar lămpile cu
tungsten ( = 400-700 nm) sunt folosite pentru domeniul vizibil.
• Solventul trebuie să fie transparent pe domeniul spectral in care se lucreaza.
589
Detectori de fluorescenţǎ
591
6. SISTEMUL DE CONTROL, ACHIZITIE SI PRELUCRARE A
DATELOR
Urmaresc:
- Controlul complet al analizei cromatografice
- Achizitia si prelucrarea avasata a cromatogramelor
- Validarea metodelor de analiza
- Verificarea si validarea functionalitatii componentelor
cromatografului
- Diagnosticarea problemelor tehnice care pot sa apara.
592
TEHNICI DE ELUARE
• Pentru realizarea unei separări eficiente se pot aplica pe langă eluţia
izocratica si eluţia cu gradient (de solvent, de temperatură, de debit etc.).
593
Dispozitivele pentru eluţia în gradient se împart în două categorii:
dispozitive care modifică compoziţia solventului introdus în pompă (pompă cu
piston aspiratoare-respingătoare). Cele mai multe dispozitive utilizează un rezervor
conţinând un solvent iniţial (slab) şi un mixer. Când eluţia progresează, se
eliberează un al doilea solvent (tare) în primul rezervor unde este amestecat,
obţinându-se un solvent de tărie crescută în mod gradat.
pompe tip seringă care pompează doi curenţi de solvenţi cu viteze diferite.
594
APLICAŢIILE HPLC
ANALIZA CALITATIVA
Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase
CH2OH H CH2OH
H N CH
N CH 3
H
3 H
HN HN
595
• Atenolol Condiţii:
Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm
Faza mobilǎ: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM
H2N
NH4OAc
O Viteza de curgere: 1 ml/min;
O N Detecţie: 254 nm
OH H Timp de curgere = 16 min
K’ = 4.41
=1.13
Bupivacaina
Condiţii:
Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d.
CH3
H H Faza mobilã:hexan-n-propanol-trietilamina
N (80:20:0.1)
N
Viteza de curgere : 1 ml/min
O
CH3 CH3
Detecţie : 254 nm
Timp de curgere: 7-8 min
K’ = 1.89
= 1.25
596
• Efedrina
Condiţii:
CH3 Coloana: Chiral AGP
H C NH CH3 100 x 4.0 mm
H C OH Precoloanã: Chiral AGP, 10 x 3.0 mm
Faza mobilã: ac. octanoic 0.001 M în
tampon fosfat pH 7.0
Detecţie: 225 nm
Ketoconazol Condiţii:
•Coloana: (S,S)Whelk-O 1
•10/100(FEC) 25 x 4.6 mm
N •Faza mobilã: Diclormetan-hexan-IPA +
N 0.011 M acetat de amoniu (46:46:8)
O
•Viteza de curgere: 1.5 m>/min
O
N N O
O •Detecţie: 254 nm
H3C
H
Cl Cl •Timp de reţinere: 16 min
•K’ = 6.60
• = 1.19
597
• Pindolol
H
N
O N
OH H
Condiţii: Condiţii:
Coloana: (3R,4S)-Pirkle 1-J Coloana: -Burke2
25 cm x 4.6 mm 25 cm x 4.6 mm
Faza mobilã: diclormetan-etanol Faza mobilã: diclormetan-
(80:20) + 0.04 M acetat de etanol (85:15) + acetat de
amoniu; amoniu 20 mM;
Viteza de curgere: 1.0 ml/min; Viteza de curgere: 1 mL/min
Detecţie: 254 nm Detecţie: 254 nm
Timp de curgere: 11.0 min Timp de curgere: 11,8 mn;
K’ = 1.56 K’ = 4.35
= 2.06 = 150
598
IDENTIFICAREA PE GRUPE FUNCŢIONALE
Alene
O
O
C
H CH3
Condiţii:
•Coloana: S) Whelk-O 1
•Faza mobilã: hexan-2-propanol-ac.acetic (95;5:1)
•Viteza de curgere: 2 mL/min
•Detecţie: 254 nm
•Timp de curgere:10 min
•K’ = 1.34
• = 5.68
599
Alcooli
OH OH
Condiţii: Condiţii:
Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm Coloana: Whelk-O 1
Faza mobilã: 2% IPA/hexan Faza mobilã: 1% IPA/hexan
Viteza de curgere: 1 ml/min Viteza de curgere: 1 ml/min
Detecţie: 220 nm Detecţie: 254 nm
Timp de curgere: 10 min. Timp de curgere: 15 min.
K’ = 1.76 K’ = 2.52
= 1.13 = 1.08
600
Amide, imide, carbamaţi
CH3 O
Condiţii:
Coloana: Whelk-O 1 Detecţie: 254 nm
N CH3 Faza mobilã: 20% Timp de curgere: 4
H IPA/hexan min
Viteza de curgere: 2 K’ = 3.72
ml/min = 3.17
Aminoacizi
Condiţii:
Coloana: Davankov CSP, 25 cm x 4.6
mm
Faza mobilã: 0.1 mM CuAc2, pH 5-
OH MeOH (70:30)
OH N
H2N Viteza de curgere: 1.5 ml/min
H
O O Detecţie: 254 nm
Timp de curgere: 12 min
valina prolina K’ = 2.52
= 1.08
601
Acizi carboxilici Dioli, hidroxicetone
Condiţii: Condiţii:
•Coloana: (3S,4R)-Whelj-O 1, 25 cm x 4.6 •Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm
mm •Faza mobilã: hexan-IPA-ac.acetic (98:2:0.5)
•Faza mobilã: 5% 2-propanol-hexan cu 0.1% •Viteza de curgere: 1 ml/min
ac trifluoracetic IPA/hexan •Detecţie: 254 nm
•Viteza de curgere: 2 ml/min •Timp de curgere:
•Detecţie: 254 nm •K’ = 7.54
•Timp de curgere: 5 min. • = 1.08
•K’ = 0.84
•= 1.36
•(R)(+) se reţine pe (3S,4R)-Whelk-O 1
O OH
O OH
OH
CH3
Cl
602
Esteri Lactone, anhidride
O
O
O O
OC2H5
O
CH3
Condiţii:
Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm Condiţii:
Faza mobilã: 1hexan-IPA-ac.acetic Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm
(95:5;0.5) Faza mobilã: hexan-IPA-ac.acetic (93:7:0.1), 1%
Viteza de curgere: 1 ml/min IPA/hexan
Detecţie: 280 nm Viteza de curgere: 1 ml/min
Timp de curgere: Detecţie: 254 nm
K’ = 2.85 Timp de curgere: 30 min
= 1.70 K’ = 8.10
= 1.21
603
Detectarea imunologică
604
ANALIZA CANTITATIVA
Concentratia probei:
- calibrare cu standard extern
- metoda standardului intern
- metoda adausului standard
605
Determinarea cantitativã a substanţelor farmaceutice
607
GAZ – CROMATOGRAFIA
GAS-CHROMATOGRAPHY (GC)
Definitie
Atunci când se foloseşte un gaz ca fază mobilă într-un sistem
cromatografic, tehnica este denumită gaz-cromatografie (GC, cromatografie
de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Această tehnică se efectuează
întotdeauna într-o coloană cromatografică deoarece faza mobilă trebuie să
curgă în mod continuu.
Clasificare
cromatografia gaz-lichid (GLC):
- faza staţionară este un lichid
- fenomenul de separare are loc prin repartiţie cromatografică
cromatografia gaz-solid (GSC)
- faza staţionară este o suprafaţă solidă
- fenomenul de separare are loc prin adsorbţie.
608
Principii generale
• Separările în gaz-cromatografie au la bază aceleaşi principii pe care se fundamentează
celelalte tipuri de analiză cromatografică.
• Compuşii de analizat migrează prin sistemul cromatografic cu viteze determinate de
afinităţile lor pentru faza staţionară.
• Puterea de separare depinde de vitezele diferitelor zone de migrare.
FAZA MOBILA
(gaz)
PROBA PROBA
separata
introd
FAZA STATIONARA
609
În gaz-cromatografie:
faza mobilă (gazul purtător) - este un gaz inert (hidrogen, azot, heliu,
argon, aer purificat), astfel încât coeficientul de distribuţie este determinat
de afinitatea probei pentru faza staţionară (în cromatografia de lichide atât
faza staţionară cât şi cea mobilă controlează coeficientul de distribuţie).
610
La concentraţii foarte scăzute coeficientul de activitate este constant:
K = CS/CM
611
Timpul de retenţie, tR, este timpul (minute) necesar eluării maximului
zonei, măsurat din momentul injectării probei.
612
Volumul de retenţie, VR:
V R = Fc • t R
V M = Fc • t M
613
Factor de selectivitate,
Rezoluţia
unde:
- dA, dB = distanţa de retenţie (timp sau volum) pentru cei
doi compuşi;
- w = lărgimea picurilor.
614
sau:
unde:
- Z = diferenţa dintre două picuri cromatografice
- WA = lărgimea picului compusului A
- WB = lărgimea picului compusului B.
RESET
Regulators Syringe/Sampler
Inlets
Detectors
Gas Carrier
Hydrogen
Air
Column
616
Faza mobilă (gazul purtător) se găseşte într-o butelie sub
presiune (150 atm). Reducerea presiunii la 2-3 atm se face cu
ajutorul unui reductor, iar debitul necesar (cm3/min) se
regleazǎ cu ajutorul unui ventil. Presiunea se măsoară cu
ajutorul unui manometru.
617
Introducerea probelor si camera de injectare
Clasificare:
618
Injector cu/fara divizare
(split/splitless)
619
Coloane
620
coloanele împachetate (cu umplutura):
- confectionate din tuburi de otel sau sticla
- conţin un suport solid, poros, inert, sub forma de granule sferice cu un
diametru ~ 0.2 mm
- silicati, alumina, polimeri organici cu porozitate mare
- lungime: 1,5 -10 m
- diametru interior: 2-4 mm
- se utilizează pe scară largă, dar sunt încete şi ineficiente.
coloanele capilare:
- confectionate din silice topita (puritate avansata), aluminiu, nichel, otel
- lungime: 12 – 100 m
- diametru interior: ~ 10 mm
- au eficienţă bună, sunt rapide, dar doar pentru probe mici.
- Sunt de două tipuri:
• - coloane capilare cu pereţii acoperiţi (wall-coated open tubular - WCOT)
- au pereţii acoperiţi cu o fază staţionară lichidă de < 1m;
- coloane capilare cu suport acoperit (support-coated open tubular-(SCOT)
- pereţii interiori ai capilarelor sunt acoperiţi cu un strat subţire de
suport material (pamânt de diatomee) pe care este adsorbită faza
staţionară.
• - Coloanele SCOT sunt mai puţin eficiente decât cel WCOT. Ambele
tipuri de coloane capilare sunt mai eficiente decât coloanele
împachetate. 621
Pentru a rezolva anumite incompatibilităţi ale fazei staţionare ce duce la
utilizarea de coloane paralele în loc de o singură coloană, au apărut sisteme cu 2
coloane.
622
Materiale suport/faze suport
Caracteristici:
• să aibă o suprafaţă activă mare
• să fie inert din punct de vedere chimic şi lipsit de efecte adsorbtive
• să fie robust din punct de vedere fizic
• când este învelit cu faza staţionară trebuie să umple uşor şi uniform
coloana.
Clasificare:
• Suporturi poroase:
- particule cu pori mari si uniformi
- diferite tipuri de pământ de diatomee special purificate, a căror mărimi ale
ochiurilor reţelei sunt de 60 - 80, 80 - 100 şi 100 - 120 mesh (ex:
Chromosorb P, W, G)
• Suporturi neporoase:
- sfere de sticla sau de teflon
- Ex: Chromosorb T, Fluoropak 80) 623
Faze staţionare lichide
metilcianopropilfenil:
R1, R2 = CH3
R1, R2 = cianopropilfenil
sau:
polifenildimetilsiloxan
politrifluoropropildimetilsiloxan
polidicianolildimetilsiloxan
625
Polimeri de fluorosilicon.
- cel mai utilizat este tipul QF-1, temperatura maximă operaţională
- 250o C.
- OV-17 stabil până la 350o C
- au caracter destul de polar (mai mic decât SE 30) dar nu sunt aşa
de selectivi precum Carbowax-urile
- se utilizează pentru analizele compuşilor cu greutate moleculară
mare
626
B. FAZE PE BAZĂ DE POLIETILENGLICOL:
FAZE MOBILE
- hidrogenul - cea mai eficientǎ fazǎ, care furnizează cea mai bună separare.
- heliul - are o capacitate de curgere mare, este comparabil cu hidrogenul din
punct de vedere al eficienţei, are avantajul de a nu fi inflamabil şi poate
funcţiona cu un număr mare de detectori, astfel fiind cel mai utilizat gaz
purtător
- alte gaze: azot, argon
628
Detecţie
Clasificare:
- detectori dependenţi de concentraţie
- detectori dependenţi de debitul masic
Clasificare:
- detectori universali
- detectori specifici
629
Flame-ionization Detector (FID)
630
Thermal conductivity Detector (TCD)
unde:
tA = timpul de retenţie al componentei A;
tet = timpul de retenţie al substantei standard.
633
Se practică adăugarea în amestecul de analizat a unei
componente pure. Dacă are loc creşterea pe cromatogramă a
maximului ce corespunde componentului adăugat, aceasta se
consideră drept dovadă a identităţii componentei - etalon.
Operaţia se efectuează pentru aceeaşi probă de analizat pe mai
multe coloane cu diferiţi adsorbanţi.
634
2. Determinarea cantitativă a compuşilor medicamentoşi
Alţi reactivi:
- alcool izobutilic –clorură de acetil 5:1 (120o C, 20 min)
- anhidrida heptafluorbutirică (anhidrida perfluorobutiricǎ), (120o C,
10 min)
637
Alte exemple:
638
Transformările constau în reacţii care au drept scop introducerea
grupelor trimetilsiliciu (CH3)3Si- în locul hidrogenului activ al grupelor
funcţionale -OH, -COOH, -NH2, -SH etc., ceea ce conferă compuşilor un
grad de volatilitate mai mare.
Sunt folosiţi mai mulţi agenţi de silare. Majoritatea corespund formulei
generale: (CH3)3-Si-X, în care X este o grupă hidrofilă Formarea eterilor are
loc după ecuaţia:
639
CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)
Definitie:
Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din
probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.
Clasificare:
642
Pentru caracterizarea cineticii schimbului ionic se utilizează
izoterma de distribuţie, respectiv izoterma de schimb ionic.
Această izotermă defineşte, la echilibru, relaţia dintre
concentraţiile aceloraşi ioni din răşină şi din soluţie.
643
Mǎrimile ce caracterizează schimbul ionic sunt:
o volumul de retentie VR
o timpul de retentie tR.
unde:
V0 = volumul gol (mort) al sistemului
D = coeficientul de distribuţie
VS = volumul de schimb ionic.
Rezoluţia, Rs, procesului cromatografic: este proporţională cu produsul dintre
selectivitate, eficienţă şi capacitatea sistemului.
644
Factor de capacitate, k, factor de retenţie: este o măsură a
retenţiei unui component.
2
VR1
Eficienţa coloanei H = L/N, unde N 5.54
wh
k 2 VR 2 V 0 VR 2
k 1 VR1 V 0 VR1
645
În schimbul ionic se foloseşte o matrice insolubilă pe care este
fixată o grupare covalentă încărcată negativ sau pozitiv în funcţie
de natura schimbătorului.
647
APARATURA
648
FAZE MOBILE
sunt soluţii apoase cu capacitate ionizantã mare - soluţii diluate de acizi sau baze
şi doar când este necesar, se mai adaugă o concentraţie scăzută de metanol sau
etanol pentru a se facilita dizolvarea moleculelor puţin ionizate în apă
În acest mediu, analitii şi grupele funcţionale ale fazei staţionare sunt ionizate.
pH-ul soluţiilor poate influenţa sau nu ionizarea schimbătorilor acizi sau bazici.
Mecanismul de eluţie se bazează pe deplasarea echilibrului ionic.
649
POMPĂ
INJECTOR 650
COLOANĂ
651
Schimbǎtori de ioni
Schimbătorii de ioni sunt caracterizaţi prin:
- natura grupelor funcţionale ionice de la suprafaţa matricei
- natura matricei utilizată ca suport
Clasificare:
a) în funcţie de natura ionului fixat distingem:
o Schimbǎtori de cationi - au grupe funcţionale anionice
o Schimbǎtori de anioni - au grupe funcţionale cationice
o Schimbǎtori mixti sau amfoteri ce conţin 2 tipuri de grupe.
652
Puterea de eluţie a anionilor:
F-, OH- > OAc- > H2PO4- > HCO3- > Cl- > NO2- > HSO3- > CN- > Br- > NO3- > I-
653
Retentia anionilor/cationilor:
influenta sarcinii – ionii sunt cu atat mai bine retinuti cu cat
sarcina lor este mai mare
influenta naturii ionului – afinitatea ionului pentru rasina creste
in ordinea crescatoare a numarului atomic din grupa
654
b) tipurile de matrice utilizate ca faze staţionare în cromatografia ionică pot fi:
- produsi naturali
- polimeri organici de sinteză
2. Sephadex grefat:
zaharoza prin oxidare → dextran;
dextran prin polimerizare cu glicerina → Sephadex
grefare Sephadex
655
3. Matricele pe bază de silice cuprind 2 grupuri distincte:
• gruparea funcţională este legată direct de particulele de silice
• silicea este acoperită de un strat polimeric (polistiren, silicon,
fluorocarbon) şi acest strat cuprinde gruparea funcţională.
• sunt produse prin legarea chimică a:
- aminelor cuaternare → schimbători puternici de anioni
- alchilsulfonaţilor → schimbători puternici de cationi.
Avantaje:
eficienţă cromatografică bună
stabilitate şi rezistenţă la presiuni mari.
Dezavantaje:
pH limitat; 2 > pH < 7
afinitatea grupelor silanol libere de la suprafaţă
şi a silicei expuse la ionii metalici cu densitate mare
(metale tranziţionale), ce sunt ireversibil adsorbiţi la
suprafaţă, interferând analizele.
656
Polimeri organici de sinteza (rasini)
sfere mici, cu diametrul de 0.5 mm
se clasifica functie de structura chimica si de marimea particulelor
(mesh)
657
658
2. Rasini filmogene
659
Caracteristicile schimbătorilor de ioni
1. Capacitatea de adsorbţie
nu sunt solubili in apa, dar in contact cu apa se umfla, marindu-si volumul,
prin fixarea unor cantitati importante de apa, cu degajare de caldura.
capacitatea de umflare depinde de:
- numarul si natura gruparilor functionale
- gradul de reticulare
cu cât capacitatea ionică este mai mare, legăturile polimerice sunt mai puţine,
cu atât sensibilitatea polimerului la adsorbţie este mai mare.
2. Capacitatea ionică
este determinată de numărul grupelor funcţionale/unitate masă a fazei
staţionare
un rol important în determinarea concentraţiei ionilor concurenţi utilizaţi de
faza mobilă pentru eluţie
capacitatea mare a fazelor staţionare necesită utilizarea unei faze mobile mai
concentrate, ceea ce este o problemă în cromatografia ionică, datorită
detectorilor conductometrici ce nu pot funcţiona bine la concentraţii mari în
săruri.
capacitatea ionică tipică este 10-100 mechiv./g
660
3. Selectivitatea
Afinităţile dintre schimbatori, solut si contraion depind de:
sarcina ionului solutului
mărimea ionului solvatat
gradul de polimerizare al schimbătorului de ioni
polarizarea ionului solutului
capacitatea ionicǎ a schimbătorului fazei staţionare
tipul grupării funcţionale a fazei staţionare.
4. Stabilitatea termica
ȋn general, procesele de schimb ionic au loc la temperatura obişnuită,
dar uneori trebuie să se lucreze la o temperatură mai mare
rasinile sulfonice – max 800 C
rasinile cu grupari de amoniu cuaternar – max 500 C
661
DETECŢIA
DETECŢIE ELECTROCHIMICĂ
Detectori conductometrici
Avantaje:
•toţii ionii sunt conducători electrici, astfel că, detectorul ar trebui să aibă un
răspuns universal
•detectorii sunt relativ simpli din punct de vedere al funcţionării
662
Detectori potenţiometrici
•detecţia se bazează pe măsurarea potenţialului soluţiei ce traversează celula de
detecţie, potenţial ce este dependent de concentraţia ionică a soluţiei.
Detectori amperometrici
– măsoară curentul, la potenţial constant
Detectori coulometrici
- măsoară curentul, la potenţial constant, dar cu o conversie a analitului de 100 %
(reacţie completă).
663
DETECŢIE OPTICĂ
Detecţie prin fluorescenţă: doar dacă analitul prezintă fluorescenţă sau dacă se
utilizează eluenţi pentru detecţia indirectă prin fluorescenţă. Exemplu: salicilat
664
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE
IONI ANORGANICI
Ordinea de eluţie în cromatografia ionică este determinată de
densitatea sarcinii (sarcină/domeniu) ionului vizat.
665
1. Anioni
• Cercetarea anionilor anorganici se face înaintea tuturor, în apa de diferite
provenienţe, ce poate fi: apǎ potabilǎ, apǎ de ploaie, apǎ de diluţie, apǎ din
hemodializǎ şi din farmacii.
• Se pot separa următorii anioni anorganici: Cl-, HPO42-, SO42-, PO43- , SO32-, I-, Br-,
SCN-, CN-, NO2-
2. Cationi
• Se pot separa următorii cationi anorganici: Li, Na, Pb, Cs, Ca, Sr, Ba, Ra, metale
tranziţionale, pǎmânturi rare, NH4+
666
IONI ORGANICI
Pentru acizii şi bazele organice, ordinea de eluţie este determinată de pKa
sau pKb (puterea/tăria acidului sau bazei).
1. Anioni
Anionii organici, ce sunt dozaţi în cromatografia ionică, corespund cel mai
adesea formei ionizate a acizilor organici.
667
• Exemplificăm modul de efectuare a schimbului anionic şi cationic pe
două coloane separate care pot fi cuplate şi alcătui un tip de
cromatografie prin schimb ionic cu dublă coloană.
Schimb cationic
Schimb anionic
668
Determinarea unor impurităţi ȋn produse farmaceutice
- Exemplu: N-metilpirolidina ȋn Cefepime (antibiotic)
669
Determinarea unor ioni din produse farmaceutice: Soluţie Ringer & hemodializă
- Anioni:
• fază mobilă: 1.3 mM Na2CO3 + 2.0 mM NaHCO3 0.8 mL/min
- Cationi:
• fază mobilă: 4.0 mM acid tartric + 0.75 mM acid dipicolinic, 1 mL/min
671
Planul cursului
CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE
● Potentiometria
672
CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE
SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)
673
APARATURA
674
CO2 lichid rece este pompat (12). Înainte de a intra în
coloană este încălzit, devine supercritic (23). Datorită
vâscozităţii scăzute, presiunea la ieşirea din coloană este
aproape identică cu cea din coloană (34). La ieşirea din
coloană, faza mobilă este decompresată, încălzită,
transformându-se în fază gazoasă (45). Produşii sunt
recuperaţi în cicloni (vase pentru separarea produsilor) CO2
gazos este apoi curăţat, răcit şi returnat în rezervor.
675
FAZE MOBILE
o dioxidul de carbon supercritic
o apa supercriticã
Se poate lucra în gradient simplu (temperaturã) sau dublu (temperaturã-
presiune).
Faza mobilã se introduce în stare lichidã (de exemplu CO2) la o temperaturã
joasã şi presiune inferioarã celei critice (PC). Se aplicã apoi o încãlzire la 40o C,
temperaturã superioarã temperaturii critice (TC). Se menţine aceastã temperaturã
pe parcursul procesului cromatografic.
676
POMPĂ
•ȋn cazul coloanelor cromatografice capilare - pentru a controla fluxul principal de fază
mobilă, se utilizează pompe de tip seringă care oferă o presiune constantă
•ȋn cazul coloanelor ȋmpachetate (faze chimic legate/grefate), pentru o amestecare mai
uşoară a fazei mobile sau introducerea de fluide modificatoare, se utilizează pompe de
tip piston.
INJECTOR
•ȋn coloanele capilare - proba trebuie introdusă rapid şi atunci se uilizează supape
acţionate pneumatic, cu divizor
677
COLOANE
678
DETECŢIA
• Detectori – tipul de detector utilizat este determinat de tipul de
coloană utilizat:
• pentru coloanele capilare şi CO2 ca fluid supercritic se pot utiliza toţi
detectorii din gaz-cromatografie şi mulţi dintre cei din HPLC.
• pentru coloanele ȋmpachetate, numărul detectorilor disponibili este
limitat.
Se poate face:
o Spectrofotometric în UV sau IR
o Ionizare în flacãrã (FID - Flame Ionization Detector)
o Capturã de electroni (ECD - Electron Capture Detector)
o Spectrometrie de masã (MS - Mass Spectrometer)
679
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE
TIC
680
Analiza unor substanţe anticancerigene şi anti-HIV
Taxol, R = CH3
Condiţii:
o Coloana: AMICON cu Silice 15 µm, 100 Å, (250 x 0,4 mm)
o Temperatura: 50o C
o Presiunea: 25 Mpa
o Solvent: CO2
o Viteza de curgere: 13,5 g/min
o Modificări ale dioxidului de carbon
cu MeOH, EtOH sau alcool
izopropilic
682
Separarea enantiomerilor Ibuprofenului și Flurbiprofenului
683
5. Alte aplicatii
684
CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE
Clasificare:
• cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration Chromatography, GFC)
- faza mobilă este o soluţie apoasă.
• cromatografie de permeaţie prin gel (Gel Permeation Chromatography,
GPC) - faza mobilă este de natură organică.
• cromatografia de excludere de mărime (moleculară) (Size Exclusion
Chromatography, SEC) – separarea se bazează pe mărimea moleculară a
componentelor
685
PRINCIPII GENERALE
• Mecanismul separării
Separarea se bazeaza pe
faptul ca particulele de
marimi diferite vor elua sau
penetra prin faza stationara
cu viteze diferite.
Acest lucru se datoreaza
porilor fazei stationare care
permit intrarea in ei numai
a moleculelor de o marime
mai mica decat largimea lor,
iar moleculele mari vor
parasi primele coloana
cromatografica.
686
Parametrii separării
• Volum de eluţie
VE = VM + KdVP
unde:
• VE = volumul de eluţie
• Kd = coeficientul de difuzie
Kd = 0 → VE =VM Procesul cromatografic pentru
Kd = 1 → VE =VM + VP analiza
0<Kd<1 → VE <VM + VP unor proteine de marimi diferite
687
VE VM
Kd
VP
VE VM
Kav
VP VG
unde:
• Kav = coeficient de distribuţie/difuzie accesibil
• dar VP + VG = VT - VM
VE VM
Kav
VT VM
688
• Factorul de selectivitate, αS = diferenţa de comportare dintre
moleculele implicate în procesul de separare cromatografică.
Depinde de:
o mărimea moleculelor
o porozitatea gelului
o uniformitatea gelului
• Factorul de capacitate/retenţie, kB
Kd .VP
kB
VM
• Numărul platourilor teoretice se modifică prin:
o lungimea coloanei cromatografice
o reciclarea fazei mobile
o debitul fazei mobile
689
• Rezolutia separarii depinde de:
690
APARATURA
691
Faza mobilă:
- trebuie să fie un solvent bun pentru polimer, în scopul de a evita efectele de non-
excluziune
- trebuie să dizolve proba la o temperatură corespunzătoare şi într-o perioadă suficient
de lungă înainte de injectare, pentru a permite granulelor să se umfle în solvent sau de a
sparge agregatele
- ȋn unele cazuri, poate fi necesar adaosul de electroliţi pentru a obţine dezagregare.
- ca eluenţi în separările pe geluri de agaroză se pot utiliza soluţii ale sărurilor obişnuite,
dar nu şi borat care poate forma complecşi cu grupele hidroxil ale sefarozei.
- exemple: tetrahidrofuranul este un bun solvent pentru mulţi polimeri şi este adesea
utilizat ca fază mobilă; cloroformul şi toluenul sunt utilizaţi pentru dizolvarea polimerilor
atunci când aceştia nu sunt solubili în solvenţii comuni
692
Pompa
Tipuri de pompe:
• Pompe tip seringă.
• Pompe cu piston.
693
Injectorul
694
Coloana
695
Alegerea fazei staţionare trebuie făcută prin examinarea curbei de
calibrare pe diverse coloane.
696
FAZE STAŢIONARE
Fazele staţionare includ:
faze hidrofilice, atunci când se utilizează faze mobile apoase
(apă sau soluţii)
faze lipofilice, când se utilizează faze mobile organice (THF,
cloroform).
Se numesc geluri, pot fi utilizate sub presiune şi temperaturi de
ordinul sutelor de grade.
Proprietăţi:
• diametrul porilor → gradul de reticulare/numărul porilor
Porozitatea se caracterizează prin capacitatea de umflare =
cantitatea de solvent care este absorbită de 1 gr. de gel uscat.
• forma şi mărimea particulelor (granulelor) – trebuie să asigure
stabilirea rapidă a echilibrelor de difuzie
697
• consistenţa – depinde de natura gelurilor şi gradul de
reticulare
• spumoase
- cele mai poroase
- capacitatea cea mai mare de umflare
- rezistenţă mecanică redusă
- se deformează în coloană
• semirigide (xerogeluri)
- cele mai utilizate
• rigide (aerogeluri)
- rezistenţă mecanică mai mare
698
Gel de dextran
Sephadex (Separation Pharmacia dextran)
Gel de agaroza
Sepharose (Separation-Pharmacia-Agarose)
699
Biogel (gel de poliacrilamidă)
Aerogel
700
Alte faze staţionare:
o 701
Detectori
• recunoaşte substanţa ajunsă la nivelul lor
• schimbarea în compoziţia fazei mobile este transformată în semnal
electric ce este transmis la sistemul de prelucrare a datelor.
702
Avantaje:
• absenţa oricăror interacţiuni cu faza staţionară
• eluţie rapidă
• are un timp bine definit de separare, datorită faptului că există un
volum de eluare finală pentru toţi analiţii nereţinuţi
• potenţialul de determinare al analitului este mare
• control şi măsură în timp real
• se aplică pentru separarea speciilor cu masă moleculară mare
• tehnica permite separarea normală a unei mase moleculare cuprinse
între 200 şi 107, fiind utilizată pentru analiza polimerilor sintetici şi
naturali
• sensibilitate bună
• poate oferi benzi înguste
• deoarece analiţii nu interacţionează chimic sau fizic cu coloana,
există o şansă mai mică să apară pierderea analitului.
• estimarea rapidă şi relativ uşoară a greutăţii moleculară şi a
distribuţie de masă pentru probele de polimer
703
Dezavantaje:
704
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE
1. SEPARAREA MOLECULELOR
• Separarea celulelor
limfocitele izolate de monocite
705
2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE
• etalonarea directă a coloanei cromatografice cu etaloane de masă
molară cunoscută
• etalonarea indirectă, plecând de la determinarea volumului
hidrodinamic
determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunând că 90 % sunt sub formă de monomeri
şi 10 % sub formă de dimeri.
706
METODE ELECTROCHIMICE DE ANALIZĂ A
MEDICAMENTELOR
POTENŢIOMETRIA
Principii generale
707
Electrodul studiat este asociat cu un electrod de referinţă având
potenţialul cunoscut şi se măsoară f.e.m. a pilei realizate =
potenţiometria directă.
unde:
E0 = potenţialul normal al metalului
R = constanta gazelor (8316 Jouli)
T = temperatura absolută
n = sarcina ionului
F = constanta lui Faraday (96500 coulombi)
a = coeficient de activitate
Mn+ = ionul metalului cufundat în soluţie.
708
Sisteme de electrozi utilizate în potenţiometrie
Clasificarea electrozilor:
709
Electrozi de specia întâi
sunt mai puţin utilizaţi
sunt constituiţi dintr-un metal şi soluţia unei sări a acestuia: M, MtX
potenţialul E are valoarea determinată de ecuaţia lui Nernst
sunt reversibili în raport cu cationii/anionii carora li se determină
potenţialul.
1. Electrodul de argint:
este constituit dintr-un fir de argint în contact cu o soluţie de ioni de
argint.
se utilizează ca electrod indicator.
710
Electrozi de specia a doua
sunt metale puse în contact cu o sare greu solubilă sau un complex
stabil al metalului respectiv (MX), într-o soluţie ce contine un anion
comun cu sarea: M/MX, MtX
electrodul este reversibil în raport cu anionul comun.
dacă concentraţia anionului se menţine constantă, electrozii de acest tip
se utilizează ca electrozi de referinţă.
1. Electrodul de calomel (SCE): 2. Electrodul de clorură de argint :
este alcătuit dintr-un strat de mercur în constă dintr-un fir de argint în contact
contact cu calomelul şi o soluţie de KCl cu AgCl şi o soluţie de KCl saturată cu
saturată cu calomel: (Hg/Hg2Cl2(sat),KCl). AgCl (Ag/AgCl,KCl).
711
Electrozi de specia a treia
Sunt formaţi dintr-un metal M1 în contact cu o sare greu solubilă sau un
complex stabil M1X al metalului şi o sare mai uşor solubilă sau un complex mai
puţin stabil al unui alt metal M2 în contact cu o sare uşor solubilă a lui M2.
Sarea sau complexul M2X trebuie să aibă un ion comun cu ionul de dozat.
Electrodul se reprezintă M1/M1X/M2X/M2.
Electrozii sunt reversibili în raport cu ionii metalului.
În dozarea calciului se poate utiliza electrodul Ag/Ag2C2O4/ CaC2O4/Ca.
Electrozi redox
Sunt constituiţi dintr-un metal inert pus în contact cu un sistem redox în care
ambele forme sunt solubile.
Electrodul de chinhidrona
este format dintr-o placa de platina sau de aur, scufundata intr-o solutie
saturata de chinhidrona
Electrozii membrană:
acoperă un domeniu larg de concentraţii (1-10-7 moli/l)
au o selectivitate bună
sunt produşi pentru un număr mare de ioni: F-, Cl-, Br-, I-, SCN-, CN-,
S2-, Ag+, Pb2+, Cu 2+, Ca2+, Cd2+, BF4-, NO3-, ClO4-, K+, Mg2+ etc.
713
Clasificare:
A. Electrozi cu membrană cristalină
1. Monocristal: LaF3 pentru F-
2. Policristal sau amestec de cristale:
aglomerare de precipitate cristaline de halogenuri
sau amestec halogenura de arigint si sulfura de argint
Ex: AgCl/Ag2S, AgBr/Ag2S.
715
Când electrodul este introdus în soluţia probă se stabileşte un gradient de
concentraţie cu o mişcare tranzitorie a ionilor din direcţia activităţii mai
mari spre cea mai puţin intensă. Această dezlocuire ionică dezvoltă un
potenţial electric care se opune migraţiei ionice, stabilindu-se astfel un
echilibru.
Cu cât membrana este mai subţire, acest echilibru se stabileşte cu atât
mai repede.
Figura (a) - configuraţia unei membrane cu un timp de răspuns lung.
Electrodul de referinţă intern - electrod de Ag-AgCl. Membrana lichidă
schimbătoare de ioni este conţinută într-un tub de sticlă, separat de
soluţia probă printr-un film de celuloză care acţionează ca o barieră fizică
pentru amestecare.
716
APLICAŢIILE POTENŢIOMETRIEI
1. Determinarea pH-ului
Ecuaţia operaţională a pH-ului este dată de relaţia:
717
Se folosesc şapte soluţii etalon principale pentru acoperirea
domeniului de pH cuprins între 3,5 şi 10,0 si etaloane secundare
pentru pH-ul 1,7 (oxalat de potasiu) şi 12,5 (hidroxid de calciu).
În tabel este redată compoziţia celor şapte soluţii tampon etalon
principale şi valorile pH-urilor corespunzătoare.
719
Stabilirea punctului final al unei titrari potentiometrice poate fi efectuata grafic sau
experimental.
Reprezentand grafic curba de titrare (variatia tensiunii electromotoare in functie de
volumul de solutie titrata utilizat) se constata la inceputul titrarii variatii mici de potential spre
punctul de echivalenta acestea devin tot mai mari si in imediata sa apropiere se obtine un salt
brusc al potentialului.
Punctul de echivalenta va fi dat de valoarea maxima a raportului ΔE/ΔV, in care:
ΔE = variatia tensiunii electromotoare
ΔV = variatia volumului
720
Titrări prin reacţii de precipitare şi complexare
Metoda de titrare potenţiometrică este utilizata în determinările
volumetrice prin reacţii de precipitare şi complexare deoarece de foarte
multe ori nu se pot folosi indicatorii vizuali.
Ambele tipuri de reacţii implică ioni metalici fie ca titranţi, fie ca probe.
Un electrod indicator pentru aceste determinări constă adesea din
metalul corespunzător acestor ioni. Ex: pentru titrarea cu AgNO3
electrodul indicator este confecţionat din argint.
Pentru titrările prin reacţii de precipitare poate fi folosit acel electrod al
cărui potenţial este afectat de concentraţia ionilor.
Alti electrozi indicatori - electrozii membrană ion-selectivi
Ex: Determinarea penicilinelor
Penicilinele formează prin hidroliză penicilamina care dă cu ionii Hg2+
complecşi cu structuri în raportul 2:1 sau 1:1.
721
Titrări redox
Electrod indicator - un metal nobil care serveşte ca mijloc de transfer al
electronilor din soluţie în circuitul exterior - cel mai utilizat electrod este
cel de platină.
Electrod de referinţă - electrod de calomel.
Potenţialul celulei variază conform concentraţiei componenţilor implicaţi
în reacţie.
Ca sursă de eroare în titrările potenţiometrice redox apar semireacţiile
care au loc între reactanţi, la care se adaugă şi semireacţiile de la
electrodul de referinţă.
Se adaugă titrantul şi echilibrul se stabileşte instantaneu între cele două
cupluri redox.
Alte aplicaţii:
determinarea complexonometrică a
Ca2+ şi Mg2+ în apa potabilă şi farmaceutică
determinarea cu EDTA a Cu2+
determinarea Fe2+ cu Ce4+
determinarea cefalosporinelor
determinarea tetraciclinelor A- + B ↔ A + B -
determinarea halogenurilor:
722
PLANUL CURSULUI
ELECTROFOREZA
METODE SPECTROMETRICE
Spectrometria UV-VIS
Turbidimetria si nefelometria
723
ELECTROFOREZA
Definitie:
+ -
+ - 724
Clasificare:
aplicată ionilor relativ mici se numeşte ionoforeză
aplicata pentru particule coloidale, micele şi unele macromolecule poartă termenul de
electroforeză.
Se pot separa:
compuşi metalici
complecşi cationici şi anionici
ioni proveniţi din electroliţi slabi (acizi carboxilici, baze organice, molecule organice
amfotere)
Low pH High pH Ex: aminoacizii - funcţie de pH, pot avea sarcină pozitivă
sau negativă.
La punctul izoelectric sau izoionic nu migrează,
activitatea electroforetică este nulă.
- H+
725
Migrarea particulelor încărcate, în câmp electric, se face cu o viteză
caracteristică fiecărei specii. Viteza de deplasare poartă numele de
“mobilitate electroforetică”().
726
Gradientul de potenţial este determinat de intensitatea i a
curentului (în amperi) raportatã la conductibilitatea
specificã a soluţiei şi aria secţiunii A a electrodului:
unde:
E = câmpul electric
Q = sarcina particulei
r = raza particulei
= vâscozitatea.
727
Clasificarea metodelor electroforetice
După modul cum se desfăşoară electromigrarea:
• electroforeză în mediu liber în coloană de lichid sau
electroforeză cu front mobil (electroforeză frontală,
electroforeză de frontieră)
728
Electroforeza în mediu liber
Migrarea electroforetică se realizează în coloană de lichid într-o
celulă formată dintr-un tub în formă de U umplut cu soluţie
tampon de electrolit, cu o secţiune pătrată, construit din sticlă
transparentă si un spectrometru.
Cei doi electrozi se leagă la o sursă de curent continuu şi se aplică
o diferenţă de potenţial de 100-150 volţi.
Cei trei componenţi proteici vor migra cu viteze diferite ce depind de mărimea, forma
şi sarcina lor.
729
Electroforeza zonala
Se desfãşoarã pe suporturi solide care evitã labilitatea
fronturilor şi eliminã suprafeţele de separare false
datorate concentraţiei soluţiilor.
Lichidul se găseşte într-un suport sau mediu poros:
hârtie de filtru specială pentru electroforeză - acetat de
celuloză sub formă de folii pentru separarea de
insulină, proteine, lipoproteine, glicoproteine,
hemoglobine
geluri de agaroză (proteine), agar (proteine, vitamine,
carbohidraţi), poliacrilamidă, silice, răşini schimbătoare
de ioni, amidon (enzime) etc. – au mare putere de
rezoluţie şi de selecţie moleculară.
Aparatul conţine:
• generator de curent continuu cu tensiune variabilã
cuprinsã între 0 şi 250-500 V şi cu o intensitate de cel
mult 50 mA
• camerã de electroforezã cu douã compartimente
separate anodic şi catodic în care se aflã doi electrozi
de platinã şi în care se poate pune soluţia de
electrolit; electrozii sunt legaţi la bornele
generatorului
• densitometru prevãzut cu un înregistrator de
absorbanţã şi un integrator. 730
Metoda de analiză pe hârtie constă în:
proba de analizat se aplică pe banda de hârtie îmbibatã cu soluţie
tampon: tampon barbital pH = 8,6, tampon borat pH = 8,6 şi 9,0,
tampon fosfat pH = 6,3; 6,5; 7,0; 7,5, tampon ftalat pH = 5,9,
tampon acetat pH = 5,6; 4,0, tampon tris-glicină pH = 8,3
Fracţionarea are loc sub influenţa tensiunii aplicate la capetele
benzii.
Identificarea compuşilor separaţi se poate face prin:
- densitometrie
- culoare
- reacţii chimice cu reactivi adecvaţi
- absorbanţă
- fluorescenţă
unde:
fc = factor de corecţie ce depinde de tipul de hârtie utilizat.
731
Factorii care influenţează electroforeza
1. Natura moleculelor separate
mărimea particulelor
natura şi sarcina speciilor.
2. Aparatura
Suportul
3. Curentul electric
Deplasarea electroforetică este proporţională cu mobilitatea, câmpul
electric şi cu timpul de trecere al curentului electric → d = .E.t
4. pH-ul
Nu influenţează electroforeza acizilor, bazelor tari şi a sărurilor.
Compuşii organici de tipul acizilor carboxilici, bazelor aminate si
substanţelor amfotere migrează numai dacă pH-ul soluţiei de electroliţi
este diferit de punctul izoionic.
5. Natura soluţiei
Ỉn soluţie se pot găsi săruri, acizi, baze etc. care influenţează mobilitatea:
EDTA, acidul citric favorizează separarea unor ioni anorganici
Lauril sulfatul de sodiu (LSS) şi dodecilsulfatul de sodiu (DSS) desfac
agregatele prin fixarea de proteine cărora le conferă sarcină negativă.
732
Electroforeza capilară (EC)
Migrarea se face în tub capilar de silice topită, umplut cu o fază ce constituie mediul de migrare
(electroliţi tampon, gel). Capetele capilarelor se introduc în două bacuri conţinând o soluţie apoasă
de electrolit. Diferenţele de potenţial de circa 30 kV sunt furnizate de o sursă de alimentare.
Electrozii din platină se introduc în cele două bacuri. La un pH>3, peretele capilarei de silice se
încarcă negativ determinând acumularea de sarcini pozitive la suprafaţa electrolitului. Se formează
un flux electroosmotic în direcţia catodului.
733
Mediul de migrare: electroliţi tampon sau gel impregnat cu o
asemenea soluţie. Soluţiei i se pot adăuga:
solvenţi organici: acetonitril
agenţi tensioactivi: LSS, DSS
ciclodextrine
agenţi complexanţi, chelatizanţi sau sechestranţi
compuşi ionici ce conţin cromofori, fluorofori.
Migrarea particulelor:
Toţi compuşii încărcaţi electric se deplasează în electrolit cu o
viteză care depinde de mobilitatea lor electroforetică şi de condiţiile
experimentale.
Un alt factor care controlează migrarea soluţilor este curgerea
electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat prin mobilitate
electro-osmotică. Acest flux se află la originea deplasării tuturor
speciilor prezente într-o probă şi depinde de natura peretelui intern
al tubului capilar: negativ provoacă un flux electro-osmotic dirijat
spre catod şi invers; o suprafaţă pozitivă provoacă o dirijare a
acestuia spre anod.
734
Tehnicile electroforezei capilare
EOF
+ -
tm (min) 0
735
2. Electroforeza capilară micelară (MECE)
EOF
+ -
736
3. Electroforeza capilară pe gel (GCE)
Gelul de agaroză 0,5 – 2%
Gelul de poliacrilamidă 3,5 – 20%
Ex: Pentru separarea electroforetică a proteinelor se foloseşte aşa numita electroforeză pe
gel de poliamidă cu dodecilsulfatul de sodiu, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SDS este un agent tensioactiv anionic care în amestec cu proteinele denaturează structura
secundară şi terţiară a acestora şi încarcă fiecare proteină cu sarcină negativă. SDS
liniarizează proteinele şi contribuie la migrarea în funcţie de mărimea lor. Proteinele
denaturate se aplică pe stratul de gel de poliamidă şi se imersează în soluţia tampon.
Proteinele scurte migrează mai uşor prin porii gelului.
+ -
Ep
737
4. Electroforeza capilară în contracurent
738
APLICAŢIILE ELECTROFOREZEI
IMUNOELECTROFOREZA
740
METODE SPECTROMETRICE ỈN ANALIZA
MEDICAMENTELOR
SPECTROMETRIA UV-VIS
TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA
SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢA
SPECTROMETRIA DE FOSFORESCENŢA
CHEMILUMINISCENŢA Radiatie reflectata
SPECTROMETRIA IR, FT-IR, NIR
SPECTROMETRIA RAMAN Absorbtie
SPECTROMETRIA ATOMICĂ
SPECTROMETRIA CU RAZE X Radiatie incidenta Proba Radiatie transmisa
SPECTROMETRIA RES
SPECTROMETRIA DE MASĂ
SPECTROMETRIA RMN
Radiatie imprastiata Radiatie emisa
741
PRINCIPII GENERALE
Spectrometria = metode bazate pe măsurarea absorbţiei sau
emisiei de energie de catre substanţe în funcţie de lungimea de
undă a radiaţiei.
742
Radiaţiile electromagnetice se caracterizează
prin:
lungimea de undă
frecvenţa
numărul de undă
unde:
- = lungimea de undă (distanta in linie dreapta dintre doua maxime
consecutive ale unei unde elecromagnetice)
- = frecvenţa = c/
- c = viteza luminii = 3.1010 cm/sec
- = număr de undă
• Frecventa, :
este numărul de ondulaţii pe unitate de timp
se exprimă prin timp-1 şi unitatea uzuală este sec-1
se poate exprima şi prin cicli/secundă (cps) sau herţi (Hz).
743
Lungimea de undă poate fi exprimată şi în următoarele unităţi:
1 Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m
1 nm = 10-9 m =10-7 cm = 10 Å
1 m = 10-9 m = 10-6 mm
1 = 10-6 m = 10-3 mm
744
Fiecare radiatie luminoasa poarta o energie - cuanta de energie -
proportionala cu frecventa acesteia.
E = h = h.c/
745
• Spectrele = totalitatea frecvenţelor radiaţiilor simple,
componente ale unei radiaţii electromagnetice compuse, la trecerea
lor printr-un instrument optic adecvat.
748
Diagramele nivelelor de energie a moleculelor
749
Salturi de energie moleculara:
prin excitaţii electronice ce corespund energiilor radiaţiilor cu
= 200 - 800 nm
implicând saltul electronilor pe nivele electronice superioare (un
orbital de antilegătură)
determină spectrele de absorbţie în UV-VIS (spectre electronice)
750
• Ca rezultat al absorbţiei de energie este posibil ca anumite
molecule să emită radiaţii, care constituie subiectul
spectrometriei de emisie.
• Din această categorie fac parte:
spectrometria de fluorescenţă
spectrometria de fosforescenţă.
751
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unei radiaţii continue
provenite de la o sursă luminoasă prin substanţa de cercetat, care
absoarbe din spectru linii sau benzi.
proba
sursă
b/l (cm) detector
P 0 / I0 P/I
C (g/l)
I I0
A ε.b.c - log T - log log
I0 I
T = I (P)/I0 (P0)
%T = 100(I/I0)
log Io/I = log 1/T = .c.b = A = E = D
unde:
- A, E, D = absorbanţa, extincţia, densitatea optică (D)
- = coeficient molar de extincţie (absorbtivitate molara)
- b (l) = grosimea stratului străbătut (cm)
- c = concentraţia (mol/litru)
- T = transmitanţa
- I0 = intensitatea fasciculului luminos incident
- I = intensitatea fasciculului luminos după ce a străbătut mediul
unde:
- b = 1 cm
- c = g % pentru extinctia specifica, moli/l pentru (coeficient
molar de extincţie)
- = absorbanţa specifică
- a = cantitatea de probă luată în lucru.
754
• Relaţia dintre coeficientul molar de extincţie şi extincţia specifică
este:
unde:
M = masa moleculară.
756
a. deplasare batocromă (spre roşu)
- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mari,
ceea ce înseamnă că are loc cu energii de excitaţie mai mici
c. efect hipercrom
- cresterea intensitatii absorbtiei
d. efect hipocrom
- micsorarea intensitatii absorbtiei
757
757
Absorbante tipice ale cromoforilor
758
Cauzele producerii spectrelor
759
Din punct de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor
existenti intr-o molecula, la tranzitiile electronice se disting
urmatoarele tipuri de electroni:
1. electroni de tip
Sunt implicati in legaturi covalente
au energii mari de excitare
nu contribuie la absorbtia in UV-VIS (alcani)
2. electroni
situati pe orbitali ai dublelor si triplelor legaturi
usor excitabili si responsabili de majoritatea spectrelor electronice
3. electroni n
sunt electroni neparticipanti in invelisul exterior de electroni ai unor
atomi de tipul N, O, S si halogeni
sunt mai slab atrasi de nucleele acestor atomi decat electronii
pot fi excitati cu radiatii UV-VIS
contribuie la absorbtiile din acest domeniu spectral
760
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii - * (alcani)
- tranziţii - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)
761
Tranziţii -*
• consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
legatura σ pe un orbital de antilegatura σ*
762
Tranziţii -*
consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
legatura pe un orbital de antilegatura *
763
Tranzitii n→*
R-X, X = Br, I
764
Tranziţii n-*
consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
nelegatura n pe un orbital de antilegatura *
765
765
Tranziţii d - d*
implica electronii din orbitalii moleculari d
sunt specifice compusilor anorganici
sunt ȋnsoţite de o absorbtivitate mică
datorită tranziţiilor dd* ionii unor metale sunt coloraţi (absorb în UV-
VIS)
Relaţiile dintre
absorbtivitatea molară şi
lungimea de undă a unor
metale
766
APARATURA
• Aparatele utilizate pentru determinări spectrale poartă numele
de spectroscoape sau spectrometre.
767
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul
corp incandescent
becul cu filament de
lampa cu halogen
wolfram
descarcari electrice
in gaze
769
770
771
772
773
Reprezentarea spectrelor
Reprezentarea spectrelor în
UV a unor compuşi organici
(absorbanţă- lungime de
undă, coeficient molar de
extincţie-lungime de undă)
775
Cei mai utilizaţi solvenţi sunt apa, alcoolul metilic, alcoolul etilic,
ciclohexanul, 1,4 - dioxanul etc.
Solvenţii utilizaţi trebuie:
să fie lipsiţi de impurităţi pentru a nu influenţa alura curbelor
înregistrate
să nu modifice maximele de absorbţie caracteristice substanţei
analizate.
Absorbanţa în UV-VIS a unor solvenţi
776
APLICAŢIILE SPECTROMETRIEI UV-VIS
Hidrocarburi saturate
• Legăturile covalente existente în aceşti compuşi sunt puternice
şi pentru efectuarea unor tranziţii electronice sunt necesare
energii deosebit de mari, care au loc în domeniul UV de vid
greu accesibil cu aparatele obişnuite.
• Sunt substanţe transparente (nu absorb) şi de aceea au o
largă utilizare ca solvenţi pentru spectroscopia în UV-VIS.
777
Substanţe care conţin heteroatomi (O, S, N)
• În aceşti compuşi au loc tranziţiile -* şi n-*.
• Exemple: alcooli, amine, substanţe heterociclice cu N, sulfuri
etc.
Substanţe nesaturate
• Tranziţiile electronice care au loc sunt -*. Astfel:
- legătura C=C se caracterizează printr-o absorbţie la 165 nm,
- legătura C≡C la 173 nm.
778
Substanţe cu caracter acid şi derivaţi funcţionali
• Tranziţiile electronice de tip -* şi n-* caracterizează
substanţele prin absorbţii în UV de vid şi în domeniul:
- 200-210 nm pentru acizi
- 235 nm pentru cloruri
- 200 nm pentru amide
- 205-210 nm pentru esteri.
Poliene conjugate
• Cu cât lanţul este mai mare are loc o deplasare batocromă
mai accentuată.
• Exemplu: vitamina A absoarbe la 328 nm, provitamina A
(trans - beta - carotenul) la 450 nm, licopina la 472 nm.
779
Compuşii aromatici
• prezintă spectre caracteristice în UV datorită conjugării
specifice stării aromatice.
• compuşii aromatici prezintă benzile caracteristice:
E (etilenice) - 180-220 nm
K (conjugate) - 220-250 nm
B (benzilice) - 250-290 nm
R (radicalice) - 275-330 nm.
• Benzile E şi B apar datorită tranziţiilor n-* si -*.
• Banda K apare la moleculele cu duble legaturi conjugate si se
datoresc unor tranzitii -* cu excitatii mari.
• Benzile R apar dacă pe nucleul aromatic este grefată o
grupare cromofora care posedă o pereche de electroni
neparticipanţi, fiind posibile tranziţii n-*, cu excitatii mici.
• Substituenţii introduşi pe nucleul aromatic produc modificări
în ceea ce priveşte absorbţia.
• Indiferent de natura substituentului se observă o deplasare
batocromă a benzii E. În funcţie de natura substituentului
sunt influenţate şi celelalte benzi.
780
• Identificarea famotidinei:
Spectrul UV al famotidină (5 μg/ml) în metanol (prezintă picuri maxime la trei
lungimi de undă.
782
Substante determinabile spectrometric
783
2. Metode de investigare a formării compuşilor de incluziune
784
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase
Exemple:
786
• Dozarea substantelor in amestec
unde:
- A(A + B)1, A(A + B)2 = absorbanţele determinate la două lungimi de
undă
- CA, CB = concentraţiile căutate
- A1A, A2A, A1B, A2B = absorbanţele specifice sau coeficienţii molari de
extincţie ai celor două substanţe la lungimile de undă respective.
789
Spectrele alcaloizilor din
Catharanthus roseus: A-
catharanthina, B-serpentina,
C-tabersonina, D-vinblastina,
E-vincristina, F-vindolina,
G-ajmalicina, H-triptofan,
I-triptamina, J-secologanina
790
Determinarea cefaclorului
791
• Dozarea şi determinarea stabilităţii substanţelor
Degradarea unei molecule poate atrage după sine modificări în spectrul UV-VIS al acesteia.
Aceste modificări pot fi:
• scăderea absorbanţei la lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbţie
• deplasarea maximului de absorbţie
• modificarea raporturilor absorbanţelor la două lungimi de undă diferite.
792
SPECTROMETRIA DERIVATĂ
constă în transformarea unui spectru de absorbţie iniţial, de ordinul
zero, în spectre derivate de ordinul 1,2 şi n
793
793
Spectrul derivat de ordinul 1
794
Spectrul derivat de ordinul 3
795
795
In practica analitică se utilizează spectrele derivate de ordinul 1
şi 2, adesea şi 4 datorită maximului situat la aceiaşi lungime de
undă cu maximul spectrului de ordinul zero.
Avantajele spectrelor derivate:
oferă o rezoluţie mai bună decât spectrul de ordinul zero, care
creşte odată cu creşterea ordinului
amplitudinea picurilor derivate creşte odată cu ordinul derivatei
pentru o anumită amplitudine dată a picului iniţial (de ordinul
zero).
Principii generale
unde:
- I0 = intensitatea luminii incidente
- = lungimea de undă
- n şi n1 = indicele de refracţie al particulei dispersate, respectiv al
mediului
- N = numărul de particule din unitatea de volum
- v = volumul unei particule
- r = distanţa până la observator
- = unghiul dintre direcţia luminii incidente şi a celei difuzate.
799
Notând cu k mărimile constante, ecuaţia Rayleigh devine:
800
Schema determinărilor turbidimetrice şi
nefelometrice
Aceste metode sunt compatibile cu
cele spectrometrice din punct de
vedere al exactităţii şi sensibilităţii,
însă domeniile de aplicare sunt mult
mai restrânse.
801
801
• Turbiditatea (S) unei suspensii:
se defineşte în mod analog cu absorbanţa
in domeniul concentraţiilor mici:
unde:
- K = coeficient de turbiditate
- l = grosimea stratului străbătut
- c = concentraţia particulelor dispersate (numărul).
802
Determinarea cantitativă
803
Titrarea turbidimetrică
Punctul de echivalenţă al unor titrări se poate sesiza mult mai
exact utilizând tehnica turbidimetrică, prin urmărirea absorbanţei
(turbidităţii) suspensiei în cursul titrării.
804
pentru determinarea punctului de echivalenta se utilizeaza
curbele de titrare
se reprezinta absorbanţa luminii difuzate în funcţie de volumul de
titrant adăugat
Curbe de titrare
805
APLICAŢIILE TURBIDIMETRIEI ŞI
NEFELOMETRIEI
SPECTROSCOPIA IR
SPECTROSCOPIA FT-IR
SPECTROSCOPIA NIR
SPECTROSCOPIA Raman
807
SPECTROSCOPIA ÎN INFRAROŞU
INFRARED SPECTROSCOPY (IR)
808
Principii generale
E = E e + E v + Er + Et
unde
- Ee = energie electronică
- Ev = energie de vibraţie
- Er = energie de rotaţie
- Et = energie de translaţie
809
Spectrul IR = reprezentarea grafica a procentului de energie absorbita
(absorbanta sau transmisia) functie de lungimea de unda exprimata in µm
sau frecventa exprimata in cm-1 (numar de unda).
100%
Transmission
50%
0%
811
Spectrul de vibraţie
întindere
îndoire
812
Întinderea (alungirea) legăturii poate fi:
simetrică
asimetrică; (se modifică distanta interatomică)
se notează cu (vibratii de valenta).
simetrică asimetrică
H
H
C
C
H H
813
Deformarea (indoirea) legaturii:
814
Spectrul de rotaţie-vibraţie
815
Moleculele poliatomice oferă posibilitatea efectuării unui număr mare de
vibraţii care au loc simultan cu participarea tuturor atomilor din moleculă →
vibraţii normale.
O-H OH
CH2
H-bond
C-O
C-H
Spectrul IR al hexanolului
817
Compuşii carbonilici prezintă o absorbţie caracteristică vibraţiei C=O
între 1650 - 2000 cm-1, iar poziţia acestei benzi este influenţată de
efectele inductive şi de conjugare, de geometria moleculei, de formarea
legăturilor de hidrogen, de solvenţii utilizaţi etc.
1715
2x C=O
C-H CH bend
O
C=O
C=O
CH3 C CH2 CH3
2-Butanona
818
Acizii carboxilici sunt caracterizaţi prin benzi de absorbţie
corespunzătoare grupărilor C=O şi OH.
Poziţia benzilor de absorbţie este modificată datorită conjugării
existente în grupa carbonil, legăturilor de hidrogen etc.
O-H
H-bond
C-O
CH2 O
NH2
scissor
CH3
CH2
NH2
820
Hidrocarburile aromatice şi substanţele medicamentoase cu structură
asemănătoare:
vibraţia de valenţă C-H = 3000-3100 cm-1
vibraţie de valenţă C=C = 1450-1650 cm-1
vibraţie de deformare C-H = 671 cm-1.
Ar-H CH3
CH3 C=C
benzene
Toluen Ar-H
821
La fenoli:
pentru aceeaşi grupă OH au o absorbţie micşorată, 3594-3615
cm-1, atribuită conjugării electronilor neparticipanţi ai oxigenului
cu electronii nucleului aromatic.
O-H
C=C C-O
822
APARATURA
Elementele constitutive ale unui spectrofotometru în IR:
- sursa de radiaţii
- monocromatorul
- cuva pentru proba
- detectorul
- amplificatorul
- dispozitivul de înregistrare.
823
Sursa de radiaţii = un corp solid, incandescent, care emite un
spectru continuu într-un interval spectral.
Incălzirea la incandescenţă se face cu ajutorul curentului
electric.
Exemple:
- lampa Nernst = formată dintr-o bara (vergea) cu o compoziţie
complexă (oxid de zirconiu, oxid de ytriu şi oxid de erbiu)
- sursa Globar constituită dintr-o bara (vergea) de carbură de
siliciu
824
Prisma:
trebuie să transmită în condiţii optime radiaţia în domeniul cercetat.
este confecţionata din: LiF pentru domeniul 2 - 6 , NaCl pentru
domeniul 5 - 15 , KBr pentru domeniul 15 - 25 , CaF2, CsBr.
Reţeaua de difracţie:
este alcătuită dintr-un sistem de fante egale, echidistante şi paralele care
alternează cu zone opace.
Detectorul:
este constituit dintr-un receptor termic care transformă energia radiantă
în căldură, care la rândul ei este transformată de receptor în impulsuri
electrice.
cele mai folosite receptoare termice sunt: termoelementul, receptorul
pneumatic şi bolometrul.
Amplificatorul
are rolul de a amplifica impulsurile electrice emise de detector cu
amplitudini mici cuprinse între 10-6 şi 10-7 V.
sunt utilizate cele electronice de curent alternativ.
825
Înregistratorul:
este constituit dintr-un milivoltmetru construit pe principiul compensaţiei,
cu ajutorul caruia se efectuează înregistrarea grafică a spectrului.
Inregistrarea spectrelor în IR se bazează pe măsurarea transmisiei T:
T = P/P0
unde:
P = puterea radiantă a radiaţiei transmise de probă
P0 = puterea radiantă a radiaţiilor incidente.
826
ANALIZA PROBELOR
Lichidele se analizeaza:
- ca atare
- sub formă de soluţie
lichidele pure şi nu prea volatile se pot analiza depunându-le sub
forma unui strat subţire între două discuri optice (NaCl, KBr) care
se presează unul peste altul şi se introduc în celule speciale cu o
grosime de 0,1-1 mm, care se plasează în calea fasciculului
luminos.
lichidele mai pot fi analizate prin introducerea lor în cuve sau
celule.
in cazul utilizării solvenţilor, aceştia trebuie să fie anhidri, puri şi
transparenţi în intervalul în care spectrul prezintă interes.
cei mai utilizaţi solventi: CCl4, CHCl3 şi CS2.
828
Exemple:
829
teobromina
cafeina
830
2. DECELAREA IMPURITĂŢILOR SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE
Se observă:
modificări ale benzilor de absorbţie care trebuie să
caracterizeze substanţa pură
apariţia altor benzi caracteristice unor legături sau funcţii
noi.
831
3. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE
Probleme:
realizarea unor condiţii standardizate
respectarea legii Lambert-Beer.
Exemplu: Alilestrenolul
- se foloseste solvent CCl4.
- maximele de absorbţie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1.
- legea Lambert-Beer se verifică folosind soluţii de concentraţii = 0,5-
2 g% (m/v).
- se poate determina în aceste condiţii şi din diverse produse
farmaceutice.
832
SPECTROSCOPIA IR CU TRANSFORMARE FOURIER
FOURIER TRANSFORM INFRARED SPECTROSCOPY
(FT-IR)
833
Componentele unui spectrometru FT-IR
834
1. Sursa: radiaţia infraroşie
emisă de sursă trece printr-
un dispozitiv ce controlează
cantitatea de energie ajunsă
la probă (şi apoi la detector)
2. Interferometrul: radiaţia
ajunge la interferometru
unde se codează spectrul.
Separatorul
este constituit dintr-un material special (germaniu depus pe o lamă de KBr)
separă fascicolul in două: unul dirijat spre o oglindă fixă, celalalt spre o
oglindă mobilă.
ambele oglinzi reflectă toate radiaţiile către separatorul de fascicule
jumătate din razele reflectate sunt transmise, iar cealaltă jumătate
reflectate
un fascicul trece prin detector, iar celălalt se întoarce la sursă.
838
Interferogramă
rezultatul absorbtiei radiatiei de către probă intr-un timp anumit
are un aspect mult mai complex decât sinusoida simplă obţinută
la o singură lungime de undă a luminii
reprezintă intensitatea absorbtiei ca functie de diferenta de
drum optic intre cele două raze.
Viteză:
deoarece toate frecvenţele sunt măsurate simultan, majoritatea
determinărilor FT-IR sunt de ordinul secundelor
Sensibilitate:
sensibilitatea metodei este mult îmbunătăţită deoarece detectorii utilizaţi
sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult scăzut, iar scanarea rapidă
permite coadiţia mai multor scanări, reducând zgomotul măsurat
întâmplător la nivelul dorit (semnal mediu)
Simplitatea aparaturii:
oglinda mobilă a interferometrului este singura parte a aparatului care se
mişcă continuu, astfel încât este foarte puţin posibilă o defectare mecanică
Calibrarea internă:
aceste aparate utilizează ca standard de calibrare internă a lungimii de
undă, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare şi nu necesită o
calibrare de către utilizator.
840
APLICAŢIILE FT-IR
Evaluare şi identificare:
de compuşi organici, anorganici
în formularea medicamentelor
în determinarea omogenităţii materialelor
în medicina legală.
841
Screeningul controlului de calitate
• compararea probelor pentru aprecierea calitatii (corespunzator -
necorespunzator)
• compararea materialelor din diferite loturi.
Exemple:
Identificarea siliconului (polidimetilsiloxan)
prin determinarea legăturilor chimice din structura sa:
- C-H
- Si-O-Si
- Si-C
CH3[Si(CH3)2O]nSi(CH3)3
842
Identificarea unui colorant
se spectrometrează şi se compară spectrul colorantului etalon
cu cel al probei.
cele două spectre trebuie să fie identice în cazul unui produs
original (nefalsificat).
843
SPECTROSCOPIA ÎN IR APROPIAT
NEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)
844
APARATURA
Spectrofotometru NIR:
sursă de lumină
monocromator
suport care să ţină proba sau o suprafaţa pe care se pune proba
detector prin intermediul căruia se fac măsurători de reflexie sau
transmitanţă.
845
Sursa luminoasă:
lampă tungsten/halogen.
Detectori utilizaţi:
cu silicon = sunt rapizi, nu dau zgomote de fond şi sunt sensibili
de la VIS la 1100 nm.
cu sulfură de plumb = sunt mai înceţi, dar foarte utilizaţi,
deoarece au sensibilitate între 1100-2500 nm şi prezintă o calitate a
semnalului superioară.
cu In, Ga, As = este cel mai scump, dar combină caracteristicile
celui de silicon şi a celui cu cu sulfură de plumb.
846
Moduri de masurare NIR
847
Materialele transparente sunt măsurate în general în
transmitanţă (A/B).
metoda neinvaziva
850
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI NIR
852
Metodele tradiţionale de analiză consumă mult timp şi sunt de
obicei realizate într-un laborator off-line, de aceea nu sunt potrivite
pentru a realiza un număr mare de analize cerute de industria
modernă.
853
2. Analiza formelor dozate intacte
Comprimate
identificarea rapida şi
nedistructiva a principiile active,
excipienţii din comprimate
întregi chiar şi prin blisterele
în care sunt ambalate.
854
Capsule
Spectroscopia NIR:
metodă ideală pentru a determina simultan aceşti parametri
printr-o singură determinare, înlocuind astfel metodele compendiale
consumatoare de timp.
se usureaza testarea stabilităţii care ţinteşte condiţiile de
depozitare şi interacţiunile dintre înveliş şi umplutură.
855
3. Monitorizarea si controlarea proceselor
Se poate monitoriza:
amestecarea pulberilor
cu ajutorul sondelor reflectorizante din fibră optică, astfel
micsorand timpul necesar pentru analizare şi erorile care pot apărea
în mostre.
856
granularea
857
comprimarea şi umplerea capsulelor
858
acoperirea cu film
ambalarea
Un fenomen asemănător se
produce atunci când molecula aflată
pe nivelul = 1, primind energie este
ridicată la nivelul E’ de unde revine
pe nivelul vibraţional = 2.
Există şi posibilitatea ca molecula să se afle pe un nivel vibraţional excitat,
iar după interacţiunea cu cuanta ea să revină pe un nivel cu număr cuantic
de vibraţie mai scăzut.
864
Ca urmare în spectru Raman apar linii
Stokes şi anti-Stokes situate de-o parte şi
de alta a liniilor Rayleigh.
865
Procesul unei determinări spectroscopice Raman poate fi prezentat
astfel: proba de analizat se supune acţiunii unei radiaţii
monocromatice intense (laser). Se analizează lumina difuzată de
moleculele probei sub un unghi de 90o..
In acest caz radiaţia difuzată este perpendiculară pe radiaţia
monocromatică incidentă.
866
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI RAMAN
1. Identificarea unor substanţe medicamentoase
-amfetamina, metamfetamina
- morfina, heroina
867
2. Determinarea formelor dozate contrafăcute
- comprimate acoperite
868
- invelisuri de forme farmaceutice
871
3. Stabilirea structurilor polimorfe
872
Spectrul Raman scoate în evidenţă unele benzi ce pot
caracteriza o anumită formă polimorfă.
Condiţiile folosite pentru spectroscopia FT-Raman cu
temperaturi variabile in situ, scot în evidenţă modificări spectrale
ale dihidraţilor prin încălzire între 60-70°C.
Prin încălzire dihidraţii revin la forma din care au fost obţinuţi.
Nu s-au observat modificări ale vibraţiilor pe măsură ce încălzirea
continuă până la 170oC.
873
Planul cursului
SPECTROSCOPIA ATOMICĂ
SPECTROSCOPIA DE FLUORESCENŢĂ
SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCENŢĂ
SPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENTA
DIFRACTIA CU RAZE X
874
SPECTROSCOPIA ATOMICĂ
ATOMIC SPECTROSCOPY (AS)
Clasificare
875
SPECTROSCOPIA DE ABSORBŢIE ATOMICĂ
ATOMIC ABSORBTION SPECTROSCOPY (AAS)
876
Spectrometru de absorbţie atomică:
sursă de lumină intensă
dispozitiv de trecere a substanţei analizate în atomi
monocromator
sistem de detecţie
amplificare
afişare.
877
Ca sursă spectrală se foloseşte o lampă cu catod cavitar/scobit care emite
radiaţii intense şi monocromatice cu lungimea de undă caracteristică elementului de
analizat.
Lampa este alcătuită dintr-un catod în formă de
tub, construit din elementul care urmează a fi
determinat şi dintr-un anod de wolfram; electrozii
sunt plasaţi într-un tub de sticlă, prevăzut cu o
fereastră de cuarţ în direcţia cavităţii catodului,
umplut cu un gaz inert la presiune scăzută (Ar,
Ne).
în cazul unor elemente volatile (Na, K, Rb, Cs, Hg, Cd, Tl) se pot folosi tuburi cu
descărcări în gaze sau lămpi cu catod cavitar
Ca instrument de incalzire se foloseşte:
-Arzator
878
Dispozitivul folosit pentru detectarea semnalului provenit din flacără este
constituit:
- dintr-un element optic dispersiv (monocromator)
- un detector de radiaţii (fotomultiplicator)
- un sistem de măsurare a valorii absorbanţelor, respectiv a
transmitanţelor.
A = logIo/I = k·c
unde:
A= absorbanta
Io şi I = mărimile semnalului (intensitatea) în lipsa probei în flacără
şi în prezenţa ei
c = concentraţia elementului respectiv
k = coeficientul care depinde de natura elementului şi de condiţiile
experimentului.
880
METODELE SPECTROSCOPIEI DE EMISIE ATOMICĂ
881
Spectroscopia de emisie în flacără
(fotometrie în flacără sau flamfotometrie)
PRINCIPIUL METODEI
• constă în transformarea în vapori atomici a elementelor de determinat
şi excitarea acestora prin introducerea probei de analizat într-o flacără
şi separarea radiaţiilor emise în funcţie de lungimea de undă, urmată
de înregistrarea şi interpretarea acestora.
PRINCIPIUL METODEI
• Excitaţia atomilor poate fi indusă de un arc electric sau descărcare
electrica, urmată de emisie de radiaţie electromagnetică
• Spectroscopia de emisie în scânteie este cea mai reproductivă, dar şi
cea mai puţin sensibilă dintre aceste tehnici.
• Scânteia electrică este o descărcare scurtă şi oscilantă între doi
electrozi aflaţi la o mare diferenţă de potenţial (10.000-50.000 V).
Temperatura scânteii electrice este de ordinul 10.000-30.000 0C.
Spectrometrul de emisie cu
plasmă cuplată inductiv,
utilizând sistemul de dispersie
a luminii monocromator (sus)
sau policromator (jos)
884
Spectroscopia de emisie cu laser
se elimină interferenţele datorate electrozilor din cadrul variantelor în arc sau
scânteie.
poate fi folosită la analiza unor zone foarte mici de pe suprafaţa unei probe care,
observate la microscop, prezintă aspecte diferite de restul probei.
permite analiza interiorului celulelor individuale chiar în organismele vii.
se pot analiza de asemenea incluziuni în metale şi minereuri.
ANALIZA CALITATIVA
1. Identificarea componentului major
2. Identificarea impurităţilor
ANALIZA CANTITATIVA
• Intensitatea luminii absorbite/emise este proporţională cu
concentraţia elementului de dozat.
886
Limitele de detectie in SAA si SEA ale unor
elemente de mare interes
Elementul Limita de detecţie (μg) λ (nm)
SAA SEA
Al 0.1 0.08 309.3
- 396.2
Ag 0.001 0.01 328
Au 0.3 - 242.8
3.0 267.6
Ca 0.003 0.0003 422.7
Cd 0.001 - 228.8
Cu 0.006 0.01 324.8
Hg 0.8 15.0 253.6
Pb 0.001 - 217
K 0.004 0.00008 766.5
Fe 0.005 - 248.3
Li 0.001 0.0001 670.8
Mg 0.004 0.1 285.2
Mn 0.002 - 279.5
Co 0.0007 - 240.7
Na 0.001 0.0008 589
Zn 0.001 15.0 213.9
As 0.25 - 193.7
Bi 0.046 - 223.1
Cr 0.005 - 357.9
Se 0.36 - 196
Exemple
a) analiza calitativă si cantitativă a metalelor, esenţiale şi toxice, din fluidele
biologice şi din ţesuturi
b) analiza fluidelor biologice pentru a determina contaminarea cu metale din
mediul înconjurator (Hg), dar şi pentru a testa prezenţa Al, Pb, Cd, Ni şi a altor
metale în ser şi ţesuturi
c) identificarea şi determinarea cantitativa a conţinutului în: Al, Ca, Cd, Co, Cr,
Cu, Fe, Li, Mn, Ni, Pb, V şi Zn din rădăcinile şi tinctura de Valeriana
d) măsurarea analitică a concentraţiilor elementelor Na, K, Li, Mg, Ca, Al şi Zn
e) determinarea sodiului şi potasiului din soluţiile perfuzabile
f) determinarea contaminării cu aluminiu din soluţiile perfuzabile pentru nutriţia
parenterală
g) determinarea urmelor de impurităţi metalice, Pb, Sb, Bi, Ag, Ba, Ni şi Sr, în
produsele farmaceutice
888
SPECTROSCOPIA DE FLUORESCENŢĂ
FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (FS)
889
Starea electronică fundamentală este un singlet (singletul fundamental).
Procesul de excitare conduce la tranziţia unui electron de pe un orbitalul al starii
fundamentale pe orbitalul neocupat cel mai scăzut al singletului excitat.
O moleculă în starea de singlet S excitat poate să se întoarcă la singletul
fundamental prin emiterea de radiaţii şi execută o tranziţie radiativă permisă. Dacă
această tranziţie este permisă, timpul de viaţă al singletului excitat este extrem de
scăzut, de ordinul 10-8 sec.
Aceasta înseamnă că fluorescenţa încetează dacă sursa de excitaţie este
întreruptă.
891
Mărimi caracteristice
Dacă concentraţia substanţei absorbante este foarte mare toată lumina incidentă
poate fi absorbită de primul strat de soluţie şi puţină lumină va pătrunde în porţiunile
mai îndepărtate ale probei. Fluorescenţa unei astfel de probe va fi neuniformă şi nu va
fi proporţională cu concentraţia. De aceea concentraţiile soluţiilor substanţelor
fluorescente sunt aduse întotdeauna la nivele foarte scăzute pentru a evita absorbţia
unei fracţiuni apreciabile din fascicolul incident.
Dacă F este intensitatea de fluorescenţă (intensitatea radiaţiei emise) şi Iab
intensitatea radiaţiei absorbite, randamentul cuantic al fluorescenţei, , se defineşte:
894
Lumina excitantă trece apoi în celula cu probă. Celulele şi solvenţii sunt aleşi în mod
corespunzător.
Cuvele (celulele) de sticlă sunt folosite pentru cele mai multe analize de fluorescenţă, iar
cele de cuarţ sunt indicate sub 320 nm.
895
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE FLUORESCENŢĂ
Aplicaţii calitative
Fluorescenţa prin selectivitatea sa (o singură λ maximală şi de
emisie pentru fiecare moleculă într-un solvent definit) este un instrument
spectroscopic puternic pentru identificarea moleculelor substanţelor
medicamentoase.
Aplicaţii cantitative
Marea sensibilitate a metodei justifică aplicaţia foarte largă în
domeniul determinărilor cantitative ale medicamentelor. Pot fi luate în
consideraţie două cazuri:
a) determinarea cantitativă a medicamentelor fluorescente
b) determinarea cantitativă a medicamentelor devenite fluorescente
prin reacţii chimice (derivatizare).
896
a) Determinarea cantitativă a medicamentelor fluorescente
Se poate lua în considerare fluorescenţa nativă a unor compuşi ca:
hidrocarburi aromatice, chinoleine, tetracicline, chinina şi derivaţii săi.
897
- Derivarea prin reacţii chimice ce implică reactivi
nefluorescenţi
Apariţia fluorescenţei se poate datora ciclizării suplimentare
ce favorizează delocalizarea electronică:
Vitamina B6 (piridoxalul)
Vitamina B1 (tiamina)
- reacţia tiocromului
898
Adrenalina
899
- Derivarea prin reacţie cu un cromofor fluorescent
Acest tip de reacţie tinde să înlocuiască reacţiile precedente
care au inconvenientul de a modifica în totalitate structura moleculei
de dozat.
In farmacocinetică conservarea integrităţii moleculei este o
necesitate mai ales în studiul metabolismului. Dezvoltarea metodelor
cromatografice de lichide justifică intensitatea cercetărilor în materie
de markeri fluorescenţi.
Procedeul se aplică pentru:
- amino-acizi (sunt derivatizaţi cu corură de dansil şi
ortoftalaldehida;
- acizi şi alcooli cu catenă scurtă.
900
Markerii fluorescenţi introduşi pe molecula unui acid sau
alcool nefluorescent contribuie la transformarea acestora în
molecule fluorescente.
- 3-brommetil,6,7-dimetil-cumarina
- hidroximetilantracenul
901
SPECTROSCOPIA DE CHEMILUMINISCENŢĂ
CHEMILUMINESCENCE SPECTROSCOPY
Caracteristici:
Sensibilitate - se explică prin progresul tehnologiei fotomultiplicatoarelor
cât şi prin calităţile inerente ale chemiluminiscenţei comparativ cu
fluorescenţa, concurenta sa directă. În fluorimetrie, detecţia unei emisii
foarte slabe este împiedicată/deranjată de zgomotul de fond, generat de
fluctuaţiile de energie ale sursei şi de difuzia Raman. Chemiluminiscenţa
care înlocuieşte excitaţia fotonică printr-o excitaţie chimică, nu se mai
confruntă cu aceste probleme, fiind posibilă măsurarea unei foarte slabe
emisii de lumină.
Luminolul
Luminolul (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) şi analogii
săi sunt chemiluminiscenţi în mediu alcalin şi în prezenţa unor
oxidanţi. Mediul poate fi apos sau organic (DMSO). Specia
responsabilă de emisie este dianionul ftalat, ce produce o lumină
albastră. Această reacţie este catalizată de numeroase metale,
complecşii lor şi de metaloproteine.
903
Lucigenina
Lucigenina (dinitrat de N,N’-9,9’-dimetilbisacridină) şi
analogii săi, în mediu alcalin şi în prezenţa apei oxigenate, sau
din contră, în prezenţă de reducători, conduce la emisia de
lumină albastră sau verde, funcţie de solvenţi prin intermediul N-
metilacridonei.
904
Peroxioxalatul
Numeroşi derivaţi ai acidului oxalic (cloruri, esteri, amide) în
prezenţa H2O2 conduc la peroxioxalat, intermediar instabil cu o
energie mare. Acesta formeaza un complex cu fluoroforii uşor
oxidabili prin transfer de sarcină. Apoi, ruperea peroxioxalatului
furnizează fluoroforul excitat (fluorofor*) care revine la starea iniţială
cu emitere de lumină.
905
Alţi derivaţi ai acidului oxalic:
- TCPO - bis(2,4,6-triclorfenil)oxalat
Mecanism:
Ester oxalic + H2O2 Intermediar(I) + produşi
Intermediar(I) + Fluorofor(F) Fluorofor*(F*) + produşi
Fluorofor* Fluorofor + h (lumină)
906
APLICAŢIILE CHEMILUMINISCENŢEI
1. Aplicaţii în titrimetrie
Titrimetria acido-bazică
•Determinarea punctului de echivalenţă prin chemiluminiscenţă se bazează
pe emisia de lumină în mediu alcalin prin indicator, detecţie care poate fi
vizibilă sau fotometrică.
•Avantajul acestui tip de indicatori este că permit titrarea soluţiilor foarte
colorate sau tulburi.
•Exemple indicatori chemiluminiscenţi: sisteme luminol-H2O2-
catalizator, lucigenină-H2O2, luminol sau lucigenină-fluoresceină-H2O2.
Toate aceste sisteme nu pot fi utilizate în prezenţa metalelor grele care
descompun peroxidul de hidrogen.
Titrimetria redox
•Punctul final de echivalenţă este determinat în acest caz de emisia de
lumină care se produce când mediul este oxidat.
•În general, agentul titrant este oxidant, în timp ce indicatorul se găseşte în
mediul conţinând reducătorul.
•Exemple: Luminolul este utilizat, în combinaţie cu hipoclorit sau
hipobromit ca agent titrant în mediu alcalin, pentru determinarea ionilor de
tipul As3+, Sb3+, SCN-, CN-, S2O32-, SO32-, S2- pot fi determinaţi cu o exactitate
(0,05%) şi o precizie (0,02%) excelente.
Lucigenina este asociată cu H2O2 ca agent titrant, în mediu alcalin.
Permite determinarea halogenurilor în apa de brom sau de clor. 907
2. Aplicaţii în spectroscopie
•Chemiluminiscenţa în gaz-cromatografie
-Gaz-cromatografia permite determinarea directa directă a unor compuşi pe baza
reacţiei de chemiluminiscenţă.
-Exemple: Compuşii sulfuraţi sunt detectaţi în flacăra reducătoare (bogată în
hidrogen) unde sunt în primul rând reduşi la sulf elementar, apoi coliziunea între 2
atomi produce o moleculă de sulf în stare excitată, ce revine la starea fundamentală
emiţând o bandă caracteristică la 340-400 nm.
909
Metode ce necesită o derivatizare
Prin modificare chimică, multe substanţe devin fluorescente
ce pot fi apoi determinate prin chemiluminiscenta in urma unor
reactii cu derivati oxalici, H2O2 etc.
910
Principalele reacţii şi compuşii detectabili prin chemiluminiscenţă
911
SPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENŢĂ
PHOSPHORESCENCE SPECTROSCOPY (PHS)
912
diagrama lui Jablonski - Prin absorbţie de energie se
trece de la starea fundamntală
la singlet excitat (S0→S1).
Molecula este adusă într-o
stare electronică excitată
funcţie de cantitatea de energie
primită.
- După conversia internă,
molecula va trece de la starea
S1 la starea de triplet excitat T1.
Prin revenirea la starea
fundamentală (T1→S0) se
produce fenomenul de
fosforescenţă.
- Tranziţia T1S0 este numită “interzisă” căci probabilitatea ca ea să se
producă este foarte redusă (în raport cu tranziţia S1S0 din
fluorescenţă).
- Astfel se explică de ce foarte puţine molecule sunt fosforescente.
Fenomenul T1S0 se poate derula într-un timp relativ lung (până la mai
multe minute).
- Pe de altă parte, nivelul de energie al stării de triplet fiind inferior celui
de singlet excitat corespunzător, emisia de fosforescenţă se va situa
la frecvenţe inferioare celor ale emisiei de fluorescenţă. Astfel
fosforescenţa se va situa adesea în domeniul VIS.
913
Caracterizarea fosforescenţei
Fosforescenţa poate fi caracterizată prin:
- spectrele de emisie şi excitaţie;
- prin randamentul cuantic (P);
- durata de viaţă (P);
- polarizarea sa.
Spectrele de emisie şi de excitaţie
Spectrele de fosforescenţă furnizează informaţii importante
pentru determinarea directă a energiei stării de triplet (ET) a
moleculei. Această măsurătoare se relizează la 77oK sau -196oC;
energia se exprimă în kcal.mol-1 sau în eV.
Randamentul cuantic de fosforescenţă (P)
Analog cu fenomenul de fluorescenţă, randamentul cuantic
de fosfosforescenţă (P) este definit prin relaţia:
914
În concordanţă cu durata de viată relativ lungă, starea T1
este subiectul unei dezactivări neradiative importante deoarece
molecula este în stare gazoasă sau în soluţie; astfel (P) tinde spre 0.
Aceste procese inhibitoare pot fi eliminate sau limitate prin
utilizarea de solvenţi vâscoşi (glicerina), utilizarea unor temperaturi
de bază (azot lichid -77oK) care rigidizează mediul, cu ajutorul unor
suporţi solizi sau al soluţiilor micelare.
unde:
IP = intensitatea de fosforescenţă la t=0
•Polarizarea
Utilzarea luminii polarizate în excitaţie şi emisie permite
explorarea fenomenului de fosforescenţă. 915
APARATURA
Schema de funcţionare
a unui fosforimetru:
916
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE FOSFORESCENŢĂ
-acidul p-aminobenzoic din amestecuri de vitamine,
-teofilina din gelule sau comprimate după extracţia cu o soluţie apoasă de
iodură de potasiu (efectul de atom greu).
-benzodiazepinele pot fi dozate în acelaşi mod în diferite forme solide
(comprimate, gelule).
-Alte substante: acid salicilic, amitriptilina, barbituricele, cocaina,
amfetamina etc.
917
DIFRACŢIA RAZELOR X
X-RAY DIFFRACTION (XRD)
918
- Difractia cu raze X - fenomenul care se produce atunci cand un
fascicol de radiaţii X trece printr-un mediu.
- Un fascicul de raze X paralel, monocromatic, este refractat de către
straturile succesive de atomi dintr-un cristal A, B, C, D.
919
- Cristalul acţionează ca o reţea formată din
planuri paralele (planuri Bragg),
echidistante (d=constanta reticulară), formate
din atomi sau ioni.
- Dacă razele reflectate de pe planuri diferite se
întâlnesc, pentru ca să se amplifice, vorbim de
reflexie Bragg şi se obţine o imagine de
difracţie. Intărirea undelor are loc când raza
R1 reflectată întâlneşte raza R2 reflectată
astfel că diferenţa de drum parcursă de raza
R2 să fie un multiplu întreg (n) al lungimii de
undă. În acest caz:
Difractograma
- furosemid
922
2. Identificarea compusilor din amestecuri
923
3. Cercetarea structurilor polimorfe
•Polimorfismul este foarte comun substanţelor medicamentoase şi acest
lucru se observă în mod deosebit la steroizi (67%), sulfonamide (40%) şi
barbiturice (63%).
•Formele polimorfe arată diferenţe evidente în proprietăţile fizico-chimice ca:
densitate, duritate, higroscopicitate, viteza de solubilizare, stabilitate
termică etc. De asemenea, formele polimorfe sunt implicate în cazul
suspensiilor şi din punct de vedere al biodisponibilităţii.
924
5. Alte aplicaţii
925
SPECTROSCOPIA DE MASA
MASS SPECTROSCOPY (MS)
926
Definitie:
Spectroscopia de masă este o metodă instrumentală de analiză
care se bazează pe fragmentarea moleculelor substanţelor organice sub
acţiunea unor radiaţii cu energii mari de până la 100 eV, iar din analiza
- numărului
- sarcinii
- masei fragmentelor rezultate - se obţin informaţii asupra
• structurii
• identităţii substanţelor cercetate.
Datorită acumulării de energie are loc fragmentarea moleculelor
cu ruperea unor legături interatomice, proces prin care rezultă :
- mai ales ioni pozitivi (rar negativi)
- radicali
- ioni radicali
- molecule neutre.
Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a
structurii moleculare.
927
Pentru a se produce fragmentarea moleculelor, substantele
analizate se aduc in stare gazoasa si se introduc in camera de ionizare in
care se produce fragmentarea.
Dacă un electron are o energie suficientă să scoată un electron de
valenţă dintr-o moleculă neutră dă naştere la un ion molecular pozitiv, cu
număr impar de electroni.
929
Se obţin spectre de masă ce sunt reprezentarea abundeţei fiecărui
tip de ion format, în funcţie de m/z. Abundenţa ionilor poate să fie
prezentată în două moduri:
- sub forma unui spectru continuu, în care semnalele apar sub formă de
picuri cu lărgimi care depind de tipul de aparat. Aparatele de înalta
performanţă pot detecta mase ionice cu o precizie mai mare decât a zecea
parte dintr-un milion (10-5 Da). În prezent limitele de masă ale aparatelor,
care au fost constant îmbunătăţite, pot ajunge la 10-6 Da;
- sub forma unui spectru de fragmente, numit şi spectru de bare, a căror
intensitate se exprimă în procente în raport cu picul cel mai intens
- picul cel mai intens = pic de bază = corespunde ionului molecular cu cea
mai mare abundenţă, numit şi ion de bază.
930
Reprezentarea spectrelor de masă:
a) spectrul de bare al metanolului;
b) spectrul de masă continuu al unei substanţe organice oarecare
931
Diagrama unui spectrometru de masă
Sistem de presiune inalta
933
CĂI DE FRAGMENTARE
1. fragmentare homolitică, , fisiune
935
• Substituenţii aromatici se rup în poziţia faţă de nucleul aromatic cu
producerea ionului de benziliu care se rearanjează mai stabil sub forma
ionului tropiliu.
Surse de ionizare
937
Ion molecular
938
IONIZAREA CHIMICĂ
CHEMICAL IONISATION (CI)
939
În cazul utilizării metanului ca gaz reactiv rezultă:
940
Experimental s-a constatat că:
ionizarea prin impact electronic, mai energică, conduce la spectre mai
bogate în benzi sau picuri şi implicit mai greu de interpretat
ionizarea chimică, mai blândă furnizează spectre mai simple şi mai
uşor de interpretat.
941
BOMBARDAREA CU ATOMI RAPIZI
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
moleculele gazoase, (ex. argon), sunt ionizate prin impact electronic, iar
ionii de argon formaţi sunt conduşi în camera de coliziune, în care
ciocnesc alţi atomi neutri de argon, pe care-i trimit către proba de
analizat.
942
În determinările FAB bombardarea cu ioni rapizi se poate face şi cu
ioni de cesiu (Cs+):
943
pulsatii laser
945
- In urma efectului “coroana”
(de descarcare), gazul
nebulizator formează ioni
primari
- Ionii primari reactionează
imediat cu moleculele de
solvent pentru a forma ioni
reactanti (H3O+, CH3OH2+)
- Ionii reactanti reactionează cu
moleculele de analit si
formează ioni de tip: [M+H]+ (in
mod pozitiv) si [M-H]- in mod
negativ
946
ELECTRONSPRAY IONIZAREA - ELECTRONSPRAY IONISATION
(ESI)
5kV
++ Desolvatare
++
++
+
si Fisiune
+
++ +
+ + + + ++
Gaz nebulizator ++ ++
+ +
+ +
+ + +
+ +
+++
Formarea picaturilor +++++
+
+
++ ++
Gaz de uscare +
+ spre MS
+
Generare ioni+
in faza de gaz
• se relizează tot la presiune atmosferică
• se aplică la ieşirea componenţilor din coloana capilară HPLC.
ESI poate opera in mod pozitiv sau negativ:
● Modul pozitiv:
- pentru substanţele bazice ce formează o sare HCl stabilă.
- principalul ion format: [M+H]+
- se mai pot forma: [M+nH]n+ şi [M+Na+]+
● Modul negativ:
- pentru substanţele acide care formează săruri de Na stabile.
- se pot forma: [M-H]-, [M-nH]n- şi [M+I-]-
Gaz
947
• Producerea picaturilor incarcate electric
949
Caracteristicile de performanţă ale unui analizor
REZOLUTIA
Rezolutie slaba
Rezolutie buna
Rezolutie =18100
8000
eroare 15 ppm
6000
Rezolutie = 14200
Counts
eroare 24 ppm
4000
Rezolutie = 4500
2000
eroare 55 ppm
951
Analizorul cu câmp magnetic
Ionii formaţi în camera de ionizare, acceleraţi şi îndepărtaţi de către
un repulser, sunt conduşi în analizorul (filtrul de masă) cu câmp magnetic,
care este un tub curbat, plasat într-un câmp magnetic perpendicular pe
traictoria ionilor pozitivi. De aceea, traiectoria lor rectilinie deviază,
devenind curbată, în funcţie de valoarea m/z.
Sub acţiunea câmpului magnetic, are loc o uşoară dispersie a
ionilor cu mase diferite, deci cu rapoarte m/z diferite, ceea ce asigură
concentrarea (focalizarea) lor pe traictorii separate şi captarea lor în locuri
diferite (m1/z1, m2/z2, m3/z3 şi m4/z4). Câmpul magnetic are o intensitate
de I=1 Tesla (10.000 Gauss)
952
Analizorul electromagnetic
953
Analizorul cu capcană de ioni/
trapa ionica
(Ion Trap Detector - ITD)
954
Analizorul cu filtru cvadrupol
Este utilizat pentru filtrarea, focalizarea, separarea curentilor ionici
prin oscilatii in camp electric de inalta frecventa.
Analizatorul cvadrupol este alcătuit din patru bare de 10-20 cm,
conexe două câte două, astfel racordate încât să se creeze între ele o
diferenţă de potenţial.
Două bare sunt încărcate pozitiv (+) şi două negativ (-), fiecărei
perechi de electrozi aplicându-i-se câte un voltaj, decalat cu 180o, deci care
alternează. Peste această tensiune se suprapune un câmp de înaltă
frecvenţă.
955
Ionii care părăsesc camera de ionizare sunt orientaţi spre cvadrupol,
(care este vidat) şi obligati să se deplaseze rectiliniu de-a lungul axei O-z.
Când un ion pătrunde în cvadrupol prin punctul “O”, el intră de fapt în
spaţiul central dintre cele patru bare, care este practic un “canal”, cu axa O-z.
Traiectoria acestui ion pozitiv este determinată de componentele vectorului
vitezei în cele trei direcţii xyz, iar pereţii acestui canal atrag sau resping ionul
în funcţie de polaritatea lui. Ionul se deplasează între două bare încărcate
pozitiv care-l focalizează (orientează) pe axa O-z într-un domeniu de potenţial,
numit “zonă de stabilitate”, în timp ce barele încărcate negativ îl
defocalizează, în planul yOz.
Prin urmare tensiunile alternative (+ şi -) sunt defazate între perechile
de bare, iar câmpul rezultat este alcătuit din două părţi, una fixă şi alta
variabilă, de aceea ionii care intră în cvadrupol sunt supuşi unei forţe
variabile ca intensitate şi direcţie, ceea ce face ca ionii să aibă traiectorii
complexe, de regulă instabile, în formă de elice (respectiv de tirbuşon) în cele
trei dimensiuni xyz.
956
Sistem de presiune inalta
- Multiplicatori de electroni cu
dinode separate.
- Multiplicatori de electroni cu
dinode continue (channeltron).
- Detectorii cu microcanale
957
DETECŢIA
958
Multiplicatorul de electroni cu dinode separate
Dinoda este un electrod al unui tub electronic cu emisie secundară
de electroni = catod emisiv. Electonii emişi sunt acceleraţi în zece trepte, de
către alţi zece electrozi, după care sunt captaţi de anod.
Ionii pozitivi se ciocnesc de un catod de conversie care emite
electroni „multiplicaţi” de 10-15 dinode dispuse în cascadă.
Fototubul multiplicator converteşte mai întâi ionii în fotoni, iar
aceştia sunt transformaţi în electroni.
(a) sistem cu dinode separate
şi catod de conversie a
ionilor în electroni;
(b) detaliu al catodului de
conversie,
(c) secţiune într-un tub
multiplicator cu multe
dinode
1 = catod de conversie;
2 = dinode;
3 = conversie în fotoni;
4 = conversia fotonilor în
electroni;
5 = flux de ioni;
6 = anod colector
959
Multiplicatorii de electroni cu dinode continue
În acest caz, ionii sunt deviaţi către un colector cu intrare în
formă de cornet, cofecţionat din sticlă dopată cu plumb, conul având rol
de catod de conversie. Acest catod emite electroni, care sunt atraşi de un
electrod pozitiv, iar şocurile succesive şi numeroase produse de electroni
asupra pereţilor produce multiplicarea lor, ca şi în cazul dinodelor
separate. Acest tip de multiplicator este astfel conceput, încât axa lui să
nu coincidă cu traiectoria ionilor, ceea ce protejează partea sensibilă a
detectorului de impactul speciilor neutre şi astfel fotonii emişi de
filament pot smulge electroni.
Detectorii cu microcanale
Sunt alcătuiţi dintr-un număr foarte mare de microdinode
continuie (channeltroni) aranjate în formă de cuib de albine, având un
rol corespunzător unui tip de placă fotografică. Fiecare detector este
construit dintr-o porţiune de microtub cu diametru interior de 25 m,
căptuşit în interior cu un material semiconductor, care funcţionează ca o
dinodă continuă şi în acest caz, fluxul mare de electroni emişi (similar
unei avalanşe) este captat de un anod, ceea ce permite înregistrarea
simultană a ionilor cu mase cu diferite.
https://www.youtube.com/watch?v=EzvQzImBuq8&t=10s
960
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE MASĂ
Interpretarea spectrelor
+
+
+
+ +
961
Identificarea unui analit
962
Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS
Există spectroteci care corespund unor colecţii (biblioteci) de spectre de
masă ale substanţelor cunoscute, în care sunt incluse (codate) principalele picuri ale
acestora.
Utilizarea acestor spectroteci, în care se caută picurile care interesează,
implică următoarele etape:
- reducerea datelor, prin care spectrul substanţei care ne interesează este redus la
cel mult 16 picuri, acordând preferinţă picurilor mai grele, mai semnificative decât
picurilor uşoare; fiecare spectru este redus în bibliotecă la 8 picuri
966
- În cazul compuşilor organici cu duble legături în catene liniare, cum este
cazul dublei legături alil, aceasta favorizează ruperea legăturii imediat
învecinate dublei legături
- În cazul compuşilor aromatici substituiţi cu catene liniare , se rup
legăturile -, cu formarea unor cationi alil, benzil, etc., stabili, potrivit
reacţiilor următoare:
967
Rearanjarea intramoleculară:
968
969
CUPLAJE
970
Cuplajul HPLC-MS
-se aplică in cazul:
- substanţelor volatizabile, dar stabile termic
- moleculelor polare sau termolabile
- se poate adapta şi utiliza pentru analiza peptidelor, nucleotidelor,
nucleozidelor şi a altor molecule biologice şi pentru moleculele de
substanţe medicamentoase, în special pentru antibiotice.
971
Cuplajul GC-MS
https://www.youtube.com/watch?v=J-wao0O0_qM
972
Planul cursului
Stabilitatea medicamentelor
973
REZONANŢA MAGNETICĂ NUCLEARĂ
NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE (NMR)
este o metodă care are la bază măsurarea influenţei unui câmp magnetic
asupra unor nuclee atomice din molecule. Nucleele atomice posedă un
moment magnetic de spin.
µ
Orientarea în sensul câmpului magnetic are o energie mai mică decât cea
contra câmpului (stabilitate mai mare).
975
APARATURA
OSCILATOR
RECEPTOR INREGISTRATOR
60MHz
Tub cu proba
Bobina de
• Receptor radio care are sarcina de a
detecta absorbtia de energie
• Un magnet care genereaza campul
baleiaj (H1) magnetic H0
• Bobina de baleiaj care adauga lui 976
H0 un
camp variabil H1
Fenomenul de relaxare
La introducerea unei substanţe în câmp magnetic exterior,
tendinţa tuturor moleculelor este aceea de a se aranja în acelaşi sens cu
câmpul.
977
SPECTRUL RMN
Spectrul RMN = curba absorbţiei de energie electromagnetică de
către compusul studiat, în funcţie de câmpul magnetic aplicat (sau
frecvenţă).
Pentru chimia organică prezintă o importanţă deosebită rezonanţa
magnetică a protonului (I=1/2) (rezonanţă protonică) deoarece compuşii
organici au în structură atomi de hidrogen.
Izotopul 12C, precum şi izotopii 16O şi 18O nu au moment magnetic
de spin → nu dau fenomene de RMN → avantaj deosebit.
978
DEPLASAREA CHIMICĂ
In orice combinaţie chimică protonul este înconjurat de un nor
electronic, care ecranează liniile câmpului magnetic exterior şi ca urmare
protonul nu sesizează întregul câmp. Gradul de ecranare diferă după modul
în care este legat protonul respectiv în moleculă, aşa cum e cazul alcoolului
etilic:
979
Diferenţele de ecranare ale diferitelor categorii de protoni în funcţie de modul
lor de legare în moleculă sunt mici. Din această cauză, semnalele tipurilor uzuale de
protoni întâlniţi în compuşii organici se eşalonează pe un domeniu foarte îngust de
variaţie a:
• câmpului magnetic - când frecvenţa este menţinută constantă
• frecvenţei - când câmpul magnetic este constant.
Variaţia câmpului produce o modificare a distanţei între liniile spectrului
(neglijabilă). Trebuie menţinut riguros raportul câmp/frecvenţă prin corectarea
continuă a parametrilor. Corecţia se realizează prin menţinerea automată "la
rezonanţă" a unei probe interne care se află în permanenţă în câmpul aparatului.
Aparatul aduce automat frecvenţa la valoarea o corespunzătoare maximului acestei
curbe în câmpul magnetic respectiv.
STANDARDE
981
Efectul de ecranare diamagnetică fiind proporţional cu intensitatea H a
câmpului, valoarea a unui anumit proton este independentă de câmp, respectiv de
frecvenţă.
Valoarea este aceeaşi indiferent dacă se lucrează cu un aparat de 40 MHz,
60 MHz sau 100 MHz, precum şi dacă se exprimă în funcţie de câmp sau de
frecvenţă.
O altă posibilitate de exprimare a poziţiei semnalului protonului este dată
de diferenţa frecvenţei protonului şi a standardului:
= proton - standard
Valoarea deplasării astfel exprimată, este proporţională cu intensitatea
câmpului (respectiv frecvenţa) şi din acest motiv se utilizează rar pentru exprimarea
deplasării chimice. Transformarea frecvenţelor în mărimi (ppm) se face cu ajutorul
relaţiei:
983
• Depasarea chimica a unor protoni 1H
984
Deplasarea chimică a 13C din grupele funcţionale ale
compuşilor organici:
985
• Deplasarea chimica a 13C – tabel general
986
Intensitatea semnalelor RMN
În RMN intensitatea semnalului unui proton este aceeaşi indiferent de gradul
de ecranare.
Caracteristică pentru intensitatea unui semnal este aria de sub curbă.
Dacă un proton dă un semnal mai larg (domeniu mai larg de câmp sau de frecvenţă)
acesta va fi redus ca intensitate şi invers.
989
Fluorul si fosforul în RMN
• Fluorul şi fosforul reprezintă cei mai studiaţi doi atomi din chimia organică
prin RMN, după hidrogen şi carbon.
• Fluorul, reprezentat în proporţie de 100 % de 19F (I=1/2) este comparabil
cu protonul datorită sensibilităţii sale bune. Deoarece are electronegativitatea mai
mare ca a protonului, devierile chimice sunt distribuite pe o zonă mai mare. Ca o
consecinţă, devine astfel posibil ca în 19F RMN să se facă distincţia între compuşi
care sunt foarte similari, spre deosebire de proton RMN în care semnalele analoge
s-ar amesteca.
• În special sunt importante diferenţele datorate stereochimiei moleculelor precum
şi constanta de cuplu JF-H care poate fi măsurată pe o gamă mai largă decat JH-H.
• Din păcate, un număr relativ mic de molecule naturale conţin atomi de fluor. De
aceea spectrele fluor RMN sunt obţinute de obicei din compuşi în care un atom de
fluor (sau o grupare CF3) au fost introduse într-o poziţie cunoscută. Această
procedură permite obţinerea de informaţii structurale din perturbările care apar
în spectrul unei molecule.
• Rezumând, atomul de fluor aduce modificări minore în stereochimia
moleculei, dar produce o deviere chimică comparabilă cu cea a grupării hidroxil.
991
APLICAŢIILE RMN
992
DETERMINĂRI CALITATIVE
993
Piroxicam
Valoarea deplasărilor chimice şi a constantelor de cuplaj
- 13CRMN
996
- Camfora
Spectrul 13CRMN al
camforei în DCCl3
997
2. Stabilirea conformaţiei şi configuraţiei moleculelor
Deoarece este cunoscut faptul că, între conformaţia şi configuraţia
moleculelor şi acţiunea lor biologică este o strânsă legătură, posibilitatea de legare a
acestora de receptorii enzimatici fiind determinată de factorii sterici, se poate aprecia
importanţa metodei RMN pentru identificarea acestor modificări.
Diastereoizomeria este o relaţie de izomerie în cadrul căreia izomerii se
disting numai prin distanţa ce separă în spaţiu atomii sau grupările ce le compun.
Ca şi în spectrometria IR, o simetrie înaltă a moleculei se traduce întotdeauna
printr-o scădere a numărului “liniilor spectrale”, adică a semnalelor RMN.
Prin această metodă s-a stabilit conformaţia nicotinei, morfinei, analogilor
metadionei, tetraciclinelor, hormonilor steroizi, cardiotonicelor steroidice etc.
Un exemplu simplu poate sugera importanţa spectrului RMN pentru a opta
pentru o anumită formă cis sau trans. Astfel, diferenţierea între formele cis şi trans
ale 2,6 dimetil-1-benzil-piperidinei se bazează pe neechivalenţa protonilor metilenici
şi pe asimetria moleculei.
998
Analiza conformaţională constă în măsurarea constantelor de cuplaj
vicinale ţinând cont de unghiul diedru format de două legături CH.
Aceste constatări au contribuit la elucidarea structurii
conformaţionale a cocainei (methyl (1R,2R,3S,5S)-3-(benzoyloxy)-8-methyl-8-
azabicyclo[3.2.1] octane-2-carboxylate şi pseudococainei (1R-(2endo,3exo))-
isomer.
cocaina pseudococaina
999
3. Evidenţierea interacţiunilor moleculare
Diclofenacul sodic formează cu -ciclodextrinele (-CD) un compus
de incluziune de tip canal (7-8 Å) cu proprietăţi terapeutice îmbunătăţite.
Utilizând metoda RMP se poate dovedi că în interacţiunea acesteia cu
-CD intervin legături de hidrogen.
1000
DETERMINĂRI CANTITATIVE
1001
Avantaje:
• prezintă un caracter nedistructiv - substanţa supusă investigaţiei
analitice rămâne practic nemodificată
• poate fi adaptată controlului automat şi continuu.
• rezolva problemele de structură ale compuşilor organici
• rezolva problemele de analiza calitativă şi cantitativă
• necesita cantităţi reduse de substanţe
• impune condiţii moderate de puritate
• oferă informaţii deosebit de cuprinzătoare, referitoare în primul
rând la scheletul de atomi de carbon şi la dispunerea atomilor.
1002
STABILITATEA MEDICAMENTELOR
1003
Un medicament stabil, într-o perioadă de timp determinată,
trebuie:
• să conţină toate principiile active
• sa aiba o eficacitate terapeutică mai mare de 90 % din valoarea
declarată
• să nu posede indici de toxicitate
• sa nu modifice DL50
• sa nu modifice toleranţa locala
• sa nu modifice parametrii organoleptici şi farmacotehnici.
1004
Stabilitatea unui medicament include:
1005
Medicamentele cu stabilitate limitată pot fi protejate prin măsuri
speciale:
• utilizarea unor gaze inerte, stabilizatori, fotoprotecţie, ambalaje
speciale
• supradozarea unor forme farmaceutice cu substanţe labile (vitamine,
antibiotice) cu coeficient terapeutic mare, care trebuie să asigure un
conţinut minim de principii active, pe întrega durată de utilizare.
1007
Cristalizarea substantelor
• Solubilitatea este mai mare la cristalele care se apropie cel mai mult de
simetria sferică.
Exemple:
• Novobiocina, antibiotic bacteriostatic şi bactericid, în stare amorfă este de 1000
de ori mai solubilă în HCl 0,1 N faţă de forma cristalizată. Forma amorfă se
transformă lent în forma cristalizată şi îsi pierde progresiv activitatea. Se
recomandă adăugarea de adjuvanţi care să mărească vâscozitatea, întârziind
cristalizarea (MC).
• Insulina zinc amorfă este uşor absorbită şi are o durată de acţiune relativ
scurtă, în timp ce produsul cristalizat se absoarbe lent şi are o durată de
acţiune mai îndelungată, motiv pentru care se foloseşte în forme de
administrare retard.
1008
Transformarea formei cristaline
În timp, au loc transformări ale formelor cristaline metastabile
termodinamic, mai solubile şi mai active în forme mai puţin solubile cu
activitate biologică inferioară.
Precipitări
Substanţele active din soluţiile saturate sau suprasaturate precipită cu
uşurinţă.
Apariţia precipitatelor este favorizată de:
• natura şi polaritate substanţelor medicamentoase şi solventului
• temperatura
• modificarea pH-ului
• condiţiile şi durata de depozitare
• manipularea
• procesele de îmbătrânire a soluţiilor coloidale etc.
1009
Modificări de vâscozitate
Vâscozitatea formelor semisolide poate fi modificată în timpul depozitării.
Exemple:
• Structura unguentelor-gel poate fi influenţată de timp şi solicitări
mecanice, determinand o creştere a vâscozităţii.
• La unguentele preparate prin topire apare fenomenul de tixotropie.
• Reducerea vâscozităţii în cursul depozitării se poate observa în cazul
hidrogelurilor ca urmare a acţiunii unor microorganisme.
Modificarea umidităţii
Este des întâlnită absorbţia vaporilor de apă de către substanţele
medicamentoase higroscopice. Acest lucru se întâmplă şi în cazul extractelor
vegetale.
Exemple:
• Ca urmare sâmburii drajeurilor se pot umfla, ceea ce poate afecta eliberarea
substanţelor medicamentoase din comprimate.
• Capsulele gelatinoase operculate pierd apa în cursul depozitării lor în încăperi
prea uscate, devin friabile şi se rup, iar la o umiditate ridicată se umflă.
1010
Pierderea prin evaporare
1011
INSTABILITATEA CHIMICĂ A
MEDICAMENTELOR
1012
REACŢII DE OXIDARE
Oxidarea:
• este superioară la formele lichide faţă de cele solide sau semisolide
• depinde de concentraţia soluţiei (este invers proporţională cu
concentraţia) → se recomandă prepararea de soluţii concentrate ce pot
apoi fi diluate.
1013
Factorii care influenţează reacţia de oxidare:
2. Solventul
Viteza de oxidare a substabţelor medicamentoase dizolvate este invers
proporţională cu concentraţia lor → se recomandă prepararea de soluţii
concentrate.
3. pH-ul
Creşterea concentraţiei ionilor de hidrogen (scăderea pH-ului) duce la
creşterea valorii potenţialului redox → forma redusă a sistemului se oxidează cu
atât mai uşor cu cât pH-ul este mai ridicat.
1014
4. Ionii metalici
Ionii metalelor Cu, Fe, Co, Ni şi Mn manifestă o acţiune catalitică oxidantă.
Astfel ionii de cupru măresc viteza de oxidare a acidului ascorbic de 10000 ori.
Anularea acţiunii se face cu ajutorul substanţelor chelatoare (EDTA-Na2,
acid citric)
5. Substanţele adjuvante
Viteza de oxidare a substanţelor medicamentoase este superioară în cazul
tensidelor, în special neionice (CMC) ca urmare a micşorării distanţelor dintre
molecule sau fixării antioxidanţilor în micele. Viteza de oxidare în soluţii de
tenside este dependentă de natura şi concentraţia substanţei active şi a
tensidului, de temperatură, pH etc.
Din această categorie fac parte tweenurile, polisorbatul 80 etc.
6. Temperatura
Acţionează asupra reacţiilor de oxidare, coeficientul de temperatură fiind
de acelaşi ordin de mărime ca în cazul reacţiilor de hidroliză.
1015
Reacţiile de oxidare in vivo
Reacţiile de oxidare şi hidroliză in vivo sunt determinate de aceiaşi
parametri fizico-chimici ca şi in vitro, cu deosebirea că, substanţele
medicamentoase sunt metabolizate de către sistemele enzimatice, organismul
uman şi animal având tendinţa de transformare a acestora în molecule mai
polare, mai puţin toxice, uşor de eliminat.
Exemple de oxidări des întâlnite:
1016
- acidul ascorbic
1017
- acidul p-aminosalicilic
- captoprilul
1018
- tiamina
Stabilitatea soluţiilor de tiamină este afectată de prezenţa agenţilor
oxidanţi şi reducători, de iod, taninuri, acid picric etc. Ionii de Cu2+
catalizează reacţia de descompunere.
1021
3. Solventul
• Natura, polaritatea şi cantitatea solventului influenţează gradul şi viteza
reacţiilor de solvoliză.
• Înlocuirea unui solvent cu o constantă dielectrică mare, cum ar fi apa
(78,39) cu un solvent cu o constantă dielectrică mică, alcoolul (25,7)
creşte viteza reacţiei de hidroliză a cloramfenicolului.
• Folosirea cosolvenţilor poate duce la scăderea sau creşterea vitezei
reacţiei de hidroliză. Digoxina este mai stabilă în amestecul alcool
polivinilic-apă decât într-o soluţie apoasă.
4. Substanţele adjuvante
• Utilizarea unor substanţe adjuvante polare poate fi însoţită de creşterea,
scăderea sau nemodificarea vitezei de hidroliză.
• Tensidele neionice micşorează viteza de hidroliză a benzocainei,
homatropinei ca urmare a înglobării în micele. Sunt utilizate şi alte
tenside: tween 20, CMC, LSS, PVP.
• În cazul formelor farmaceutice solide, o importanţă deosebită o au
substanţele adjuvante capabile să lege apa. Din această cauză
substanţele medicamentoase foarte sensibile la hidroliză nu trebuiesc
drajefiate.
• Caracterul acid sau bazic al substanţelor adjuvante poate constitui un
factor de stabilitate sau de instabilitate de care trebuie să se ţină seama.
1022
5. Temperatura
Viteza reacţiilor de descompunere creşte odată cu creşterea
temperaturii → importanţa ce trebuie acordată soluţiilor
medicamentoase care se sterilizează termic.
7. Alţi factori
Reacţiile de solvoliză pot fi catalizate de cationii divalenţi
menţionaţi la reacţiile de oxidare, de enzime, de lumină, de oxigen.
În astfel de cazuri trebuie luată în considerare concentraţia
enzimei, a substratului, temperatura, pH-ul şi activitatea ionilor.
1023
Hidroliza esterilor
- hidroliza cocainei:
1024
Hidroliza lactonelor
- hidroliza pilocarpinei
Hidroliza amidelor
- hidroliza indometacinului
1025
Hidroliza lactamelor
- hidroliza ampicilinei
1026
Alte hidrolize
- hidroliza barbituricelor
- hidroliza alantoinei
1027
- hidroliza benzazepinelor
- hidroliza carboplatinului
1028
REACŢII DE DECARBOXILARE
• Sunt reacţii destul de rar întâlnite ca sursă a instabilităţii substanţelor
medicamentoase.
• Depind de efectul reacţiilor de oxidare şi hidroliză.
• Sunt reacţii influenţate de temperatură, lumină, pH, enzime, polaritatea
solvenţilor şi prezenţa ionilor metalici.
• Se decarboxilează acizii: salicilic, p-aminosalicilic etc.
• Importantă este problema decarboxilării PAS cu formarea de m-
aminofenol, toxic.
1029
REACŢII DE IZOMERIZARE
Exemplu:
- izomerizarea licviritigenolului
1030
- racemizarea tetraciclinei
1031
- racemizarea oxazepamului
Oxazepamul se racemizează într-o soluţie la pH neutru sau alcalin
conform reacţiei:
- izomerizarea griseofulvinei
1032
REACŢII DE POLIMERIZARE
• Sunt reacţii cauzate de procesele de autooxidare sau hidroliză şi în urma lor
se formează compuşi intens coloraţi.
• Decurg după un mecanism:
- radicalic specific polimerizării vinilice şi reacţiilor înlănţuite cu cele
trei etape
- mecanism ionic (anionic, cationic).
• Măsurile de stabilizare au în vedere înlăturarea reacţiilor primare,
optimizarea pH-ului, evitarea temperaturilor înalte şi a influenţei luminii.
- polimerizarea catehinelor
1033
REACŢII DE ESTERIFICARE
• decurg invers reacţiilor de hidroliză
• depind de pH.
Exemple: - glicozidarea procainei
- N-acetilarea epinefrinei cu acid acetilsalicilic.
• Se recomandă optimizarea recepturii, mai ales a pH-ului, alegerea
adjuvanţilor adecvaţi, separarea în spaţiu a partenerilor de reacţie.
REACŢIILE FOTOCHIMICE
Degradările fotolitice pot fi un factor important în limitarea
stabilităţii medicamentelor.
Un medicament poate fi afectat chimic de radiaţii cu o anumită
lungime de undă numai dacă absoarbe radiaţia la acea lungime de
undă. Radiaţiile UV care au un nivel înalt energetic, sunt cauza multor
recţii de degradare.
Dacă moleculele absorbante:
- reacţionează - reacţia este numită fotochimica naturală.
- nu participă direct la reacţii, dar transferă din energia lor altor molecule
reactante, substanţa absorbantă se numeşte fotosenzitivă.
1034
Într-o reacţie fotochimică sunt implicate multe variabile, iar
cineticile sunt complexe:
• Intensitatea şi lungimea de undă a luminii şi mărimea, forma, compoziţia
şi culoarea ambalajului pot afecta viteza reacţiei.
Ex: - fotodegradarea clorpromazinei la o semichinonă ca radical liber
intermediar urmează o cinetică de ordinul 0.
- hidrocortizonul, prednisolonul şi metilprednisolonul în soluţii alcoolice
sunt fotodegradate prin reacţii ce urmează o cinetică de ordinul 1.
Ambalajele de sticlă colorate sunt folosite foarte frecvent pentru a
proteja formulările fotosensibile:
• sticla galben-verde dă protecţia cea mai bună în UV
• sticla maronie conferă protecţie considerabilă în UV şi mai puţin în IR.
1035
- fotodegradarea nifedipinei
- fotodegradarea reserpinei
1036
- fotodegradarea clorochinei
1037
- fotodegradarea acidului tiaprofenic
- fotodegradarea clordiazepoxidului
- fotodegradarea menadionei
1038
- fotodegradarea acidului meclofenamic
- fotodegradarea rufloxacinei
1039
- fotodegradarea camforei
- fotodegradarea mentolului
1040