Controlul Microb Produselor Alim Ind Metod DS7179627069196830627 PDF

Digitally signed by
Library TUM
Reason: I attest to the
accuracy and integrity
of this document
UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
PRODUSELOR ALIMENTARE
Indicaţii metodice privind

controalele microbiologice
Chişinău
2017
0
UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI
FACULTATEA TEHNOLOGIA ALIMENTELOR

DEPARTAMENTUL TEHNOLOGIA PRODUSELOR
ALIMENTARE
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
PRODUSELOR ALIMENTARE
Indicaţii metodice privind

controalele microbiologice
Chişinău
Editura „Tehnica-UTM”
2017
1
CZU 663/664.09(076.5)
C 69
Indicaţiile metodice la disciplina Microbiologia produselor alimentare
sunt destinate studenţilor de la specialităţile Facultăţii Tehnologia Alimentelor
Materialul este prezentat în conformitate cu programul de învăţământ
universitar. Sunt prezentate metode de prelevare a probelor din diverse materii
prime; caracteristica mediilor de cultură; metode de testare microbiologică a
laptelui şi produselor derivate, a cărnii şi produselor din carne, a produselor de
panificaţie etc. în conformitate cu SM, ISO, EN; modul de prelucrare a
rezultatelor testărilor, precum şi caracteristica microorganismelor de alterare a
produselor alimentare.
Acest material poate servi drept suport bibliografic pentru studenţi,
masteranzi şi doctoranzi.
Autori: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

dr., conf. univ. Silvia RUBŢOV
dr., conf. univ. Lilia POPESCU
inginer Valentina COSTIŞ
inginer, doctorand Irina GURMEZA
Redactor responsabil: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

Recenzent: dr., conf. univ. Aurelia CHIRSANOVA
dr., conf. univ. Valentina CALMÂŞ
DESCRIEREA CIP A CAMEREI NAŢIONALE A CĂRŢII

Controlul microbiologic al produselor alimentare: Indicaţii metodice
privind controalele microbiologice / Luiza Sandulachi, Silvia Rubţov, Lilia
Popescu [et al.]; Univ. Tehn. a Moldovei, Fac. Tehnologia Alimentelor, Dep.
Tehnologia Produselor Alimentare. – Chişinău: Tehnica-UTM, 2017. – 128 p.
Bibliogr.: p. 117-120 (57 tit.). – 50 ex.
ISBN 978-9975-45-472-8.
663/664.09(076.5)
C 69
Redactor: E. Gheorghişteanu
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Bun de tipar 15.02.17 Formatul hărtiei 60 x 84 1/16
Hârtie ofset .Tipar RISO Tirajul 50. ex.
Coli de tipar 8,0 Comanda nr. 11
ISBN 978-9975-45-472-8. © UTM, 2017
2
INTRODUCERE
Cerinţele mereu în creştere ale consumatorilor privind

calitatea şi perioada de valabilitate a alimentelor şi băuturilor
trebuie permanent satisfăcute de către producători [26]. O
importanţă deosebită pentru consumator are siguranţa
microbiologică a produselor alimentare, a căror securitate este o
sarcină de bază a controlului microbiologic la întreprinderi.
Controlul microbiologic se efectuează atât asupra procesului de
producţie, cât şi asupra calităţii producţiei finite, precum şi asupra
stării sanitare a încăperilor de producţie, asupra utilajelor,
inventarului mic şi asupra igienei personale a lucrătorilor [27].
Indicaţiile metodice includ metode de prelevare şi analiză
microbiolocă a produselor alimentare. Sunt vizate diverse metode
de testare microbiologică a materiilor prime şi a produselor din
carne, lapte, patiserie, cofetărie, băuturi, conserve etc. [8-33].
Microorganismele pot fi analizate prin diferite metode.
Pentru detectarea microorganismelor sunt utilizate de obicei metode
de cultură şi examinare microscopică, iar pentru diferenţierea lor -
metode biochimice şi serologice. Pentru detectarea
microorganismelor în culturi sunt necesare medii nutritive lichide şi
solide, în sau pe care microorganismele sunt concentrate prin
creştere. O determinare cantitativă este posibilă numai cu medii
nutritive solide, deoarece coloniile dezvoltate pe suprafaţa acestora
pot fi evaluate şi numărate individual. Pentru analize microbiologice
pot fi utilizate următoarele medii de cultură:
 medii de cultură aprobate de FDA, publicate în Manualul
Analitic Bacteriologic [30];
 seturi de cartonaşe impregnate cu mediu nutritiv - CMN,
care optimizează masiv metoda filtrului membrană;
 cartonaşe absorbante de umezit cu mediu nutritiv lichid;
 medii nutritive cu agar sau gelatină ca agent
solidificator;
3
 petrifilme pentru diferite testări microbiologice;
 medii de cultură utilizate în metoda directă de testare.
Această lucrare vizează caracteristica mediilor de cultură,
modul de utilizare, condiţiile de testare, incubare şi analiza
rezultatelor obţinute. Sunt caracterizate succint cele mai des
întâlnite microorganisme, antrenate în riscul microbiologic al
produselor alimentare. Sunt date referinţe la metode standarde
naţionale şi internaţionale de determinare a NTG, E. coli, bacterii
coliforme, Salmonella spp, Proteus spp, Colstriduim perfringens,
Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Penicillium spp, Saccharomyces,
Rhodutorula etc.
Metodele de testare microbiologică precum şi mediile de
cultură utilizate în aceste testări sunt prezentate în conformitate cu
Manualul Analitic Bacteriologic (BAM) elaborat de FDA [30]. În
acest manual, disponibil on-line, se fac referinţe la metodele oficiale
de analiză a AOAC International; Metode standard pentru
examinarea produselor lactate, Proceduri pentru examinarea
microbiologică, recomandate de Foods Association American
Public Health; Metode standard pentru Analiza apei a Agenției
pentru Protecția Mediului. FDA lucreaza în strânsă colaborare cu
AOAC International, APHA, EPA, Federația Internațională a
Producătorilor de Lapte (IDF/FIL), prin intermediul participării la
Codex Alimentarius, Organizația Internațională de Standardizare
(ISO).
Scopul prezentului volum de indicaţii este a pune la
dispoziţia studenţilor, masteranzilor şi doctoranzilor o suită de
tehnici utile în diagnosticarea şi managementul ulterior al riscului
microbiologic al produselor alimentare. Controalele microbiologice
vizate pentru produsele alimentare: Lapte şi produse lactate, Carne
şi produsele din carne, Produse de morărit şi panificaţie, Conserve
din carne şi conserve vegetale, precum şi Controlul microbiologic al
zahărului sunt în conformitate cu SM, ISO, EN, SR, GOST în
vigoare.
4
1. GENERALITĂŢI
1.1. Enumerarea şi identificarea microorganismelor realizată

într-un laborator acreditat
Probele se prelevează şi se trimit la laborator [35].
Microorganismele sunt incubate pe o placă de geloză într-
o cutie Petri timp de 24-48 de ore în condiţii de mediu
standard.
Microorganismele pot fi identificate prin probe: analiza
proprietăţilor cum ar fi culoare, miros etc.; inocularea
(însămânţarea) într-un mediu specific, de ex. Pseudomonas;
conţinutul sau producţia de enzime specifice; folosind anticorpi sau
examinând ADN-ul lor.
Figura 1.1. Identificarea microorganismelor în probele prelevate [36]

FDA stabileşte standarde ştiinţifice pentru testarea produselor
alimentare pentru diferiţi contaminanți. Laboratoarele și companiile
de produse alimentare din întreaga lume folosesc aceste standarde
pentru a asigura consumatorul că produsele alimentare sunt sigure
pentru consum. Manualul analitic bacteriologic (BAM), elaborat de
FDA şi pus la dispoziţie on-line, reprezintă o colecție de proceduri
preferate de către analiști în laboratoarele US Food and Drug
Administration pentru detectarea în produsele alimentare și
cosmetice a agenților patogeni (bacterii, fungi, levuri, paraziţi),
precum și toxinelor microbiene [30] .
5
1.2. Medii nutritive utilizate în coltroalele microbiologice
oficiale ale produselor alimentare
Controlul microbiologic al produselor alimentare trebuie
efectuat în conformitate cu standardele în vigoare, prin metode
aprobate prin HG, SM, SR, EN, ISO [8-35]. Pentru testările
microbiologice sunt utilizate diverse medii nutritive în conformitate
cu metodologia de determinare a unui tip de microorganism [28].
Prezentăm caracteristica unor medii nutritive utilizate în
controalele microbiologice oficiale.
Tabelul 1.1. Indexul mediilor conform BAM

(Manual analitic bacteriologic) [30]
Index Denumirea mediului Index Denumirea mediului
M1 A-1 Mediu M74 Bulion lactoză
M3 Acetat Agar M76 Laurii Tryptose (LST)
Bulion
M5 AE Mediu sporulat, M80 Eozină albastru de metilen
modificat (pentru C. (L-EMB) Levine Agar
perfringens)
M6 Mediu Agar P M104 MR-VP bulion
M11 Agar-agar pentru M124 Count placă de agar (PCA)
anaerobi (metoda standard)
M12 Anaerob gălbenuș de M164 Triptonă (triptofanul)
ou Agar bulion
M17 Mediu Baird-Parker, R11 Apă sau echivalent diluant
pH 7 tamponată cu fosfat
Butterfield
M25 Briliant Verde R 27 Soluție salină fiziologică
Lactoză Bilă Bulion
M49 EC bulion R44 Indicator roşu de metil
M72 Bulion citrat lui R97 Diluantul Peptonă, 0,5%
Koser
6
Tabelul 1.2. Compoziţia mediilor şi diluanţilor recomandaţi
pentru testările microbiologice [30]
Indexul mediului / Modul de preparare
Compoziţia mediului
1 2
M1 Se dizolvă ingredientele într-un litru de
Triptonă - 20g; apă distilată. Se ajustează pH-ul la 6,9 ±
Lactoză - 5g; 0,1. Se introduc câte 10 ml de bulion în
NaCl - 5g; eprubete (18×150mm) cu tuburi de
Tripton X100 - 1ml; fermentație. Mediul se sterilizează în
Salicină - 0,5g; autoclavă 10 min la temperatura de
Apă distilată 1litru. 121°C. Se depozitează în întuneric până
la 7 zile.
M3 Se adăugă toate ingredientele, cu
Acetat de sodiu - 2g; excepția MgSO4 la un litru apă distilată.
NaCl - 5g; Se încălzește până la fierbere sub
MgSO4 (anhidru) -0,2g; agitare. Se adaugă MgSO4 și se
Fosfat de amoniu - 1 g; ajustează pH-ul. Se dozează câte 8 ml în
K2HPO4 - 1 g; tuburi (16×150mm). Mediul se
Albastru de bromtimol - sterilizează în autoclavă 15 min la
0,08 g; temperatura de 121°C. Tuburile se
Agar-agar - 20 g; înclină pentru a obține o pantă de 5 cm,
Apă distilată - l litru. pH-ul final 6,7.
M5 Se dizolvă ingredientele și se ajustează
Polypeptone - 10,0 g; pH 7,5±0,1, utilizând carbonat de sodiu
Extract de drojdie - 10,0 g; 2M. Mediul se toarnă câte15 ml în
Na2HPO4 - 4,36 g; tuburi de (20x150 mm) cu capac cu filet
KH2PO4 - 0,25 g; și se sterilizează în autoclavă timp de
Acetat de amoniu - 1,5 g; 15 min la T 121°C. După sterilizare, se
MgSO4 × 7H2O - 0,2 g; adaugă prin picături la fiecare tub câte
Apă distilată 1 litru. 0,6 ml de 10% rafinoză sterilizată și
0,2 ml carbonat de sodiu 0,66 M și
0,32% clorură de cobalt (CoCI2×6H2O).
Se verifică pH, ar trebui să fie de
7,8±0,1. Chiar înainte de utilizare, se
adaugă la fiecare tub 0,2 ml ascorbat de
sodiu de 1,5% sterilizat prin filtrare
(preparat zilnic).
7
Tabelul 1.2 (continuare)
1 2
M6
Extract de carne de vită - 3 g; Se încălzește cu agitare pentru a
NaCI-0,5 g; dizolva Agar-agarul. Se sterilizează
Peptonă -5 g ; în autoclavă 15 min la temperatura
K2HPO4 0,25 g; de 121°C, pH final
Triptonă -1,7 g; 7,8 ± 0,2.
Polisorbat 80- 1 g;
Soytone -0,3 g ;
Bromcresol violet-0,06 g;
Dextroză- 5,25 g;
Agar-agar- 15 g;
Apă distilată- l litru.
M11 Se încălzește cu agitare pentru a
Tripticaz (triptic) soia agar 40 g; dizolva Agar-agarul. Se ajustează
Agar-agar 5 g; pH-ul la 7,5±0,2. Se sterilizează în
Extract de drojdie 5 g; autoclavă 15 min la temperatura
L-cisteina (dizolvat în 5 ml de de 121°C. Se răcește la 50°C. Se
NaOH) 0,4 g; dizolvă 1g hemină în 100 ml apă
Apă distilată l litru. distilată. Se sterilizează 15 min la
121°C. Se refrigerează la 4°C. Se
dizolvă 1 g de vitamina K1 în
100 ml etanol 95%. Soluția poate
necesita 2-3 zile de agitare
intermitentă pentru a se dizolva.
Refrigerare la temperatura de 4°C.
Mediu final. La baza de 1 litru se
adaugă o soluție de 0,5 ml și
hemină 1 ml de soluție de vitamina
K1. Se amestecă și se toarnă porții
de 20 ml în plăci Petri
(15×100 mm). Mediul trebuie să fie
redus înainte de inoculare până la
24 de ore de incubare anaerobă în
torpedou anaerob sau borcan
GasPak.
8
1 2
M12 Se sterilizează 15 min la 121°C. Se ajustează
Extract de drojdie 5 g; pH-ul la 7,0±0,2. Se spală 2 ouă proaspete cu
Triptonă 5 g; peria rigidă. Se înmoaie ouăle în 70% etanol
Proteoză peptonă 20 g; timp de 1 oră (prelucrarea aseptică a ouălor).
NaCl 5 g; Se extrag gălbenuşurile. Se adaugă
Agar-agar 20 g; gălbenușul la un volum egal 0,85% soluție
Apă distilată 1 litru. salină sterilă. Se agită prin scuturare. Emulsia
gălbenuș de ou (50%) este disponibilă şi în
comerț. Prepararea mediului. Pentru un
mediu de 1 litru sterilizat şi răcit (48-50°C) se
adaugă un amestec de 80 ml de ou-salină și se
amestecă. Se toarnă imediat în plăci Petri.
După solidificare plăcile se păstrează 2-3 zile
la temperatura ambiantă sau la 35°C timp de
24 ore..
M17 Se sterilizează 15 min la 121°C, pH final -
Triptonă - 10 g; Extract 7,0±0,2. Pentru utilizare imediată, se menține
de carne de vită - 5 g; mediul topit la 48-50°C, înainte de a adăuga o
Extract de drojdie – 1g; îmbogățire. În caz contrar, mediul se
Piruvat de sodiu - 10 g; solidifică. Mediul se păstrează la temperatura
Glicină - 12 g; Clorură de 4±1°C până la 1 lună. Înainte de utilizare
de litiu × 6H2O .-.5g; mediile se solubilizează.
Agar-agar - 20 g.
M25 Se dizolvă peptona și lactoza în 500 ml apă.
Peptonă - 10 g; Se adaugă 20 g oxgall deshidratat dizolvat în
Lactoză - 10 g; 200 ml de apă distilată. pH-ul soluţiei trebuie
Oxgall - 20 g; să fie 7,0-7,5. Se agită și se adaugă apă până
Briliant verde 0,0133 g; la 975 ml. Se ajustează pH-ul la 7,4. Se
Apă distilată 1 litru. adaugă 13,3 ml 0,1% verde strălucitor apos.
Se adaugă apă distilată până la 1 litru. Se
dozează în tuburi de fermentație, ca nivelul
mediului să acopere plăcile inversate. Se
sterilizează 15 min la 121°C, pH final,
7,2 ± 0,1.
9
1 2
M49 Se distribuie câte 8 ml în eprubete
Trypticase sau (16×150mm) conținând tuburi
Tryptose - 20g; (10×75mm) de fermentație
Sărurile biliare Nr.3 - 1,5 g; răsturnate. Se sterilizează în
Lactoză - 5 g; autoclavă 15 min la temperatura de
K2HPO4 - 4 g; 121°C, pH final, 6,9 ± 0,2.
KH2PO4 - 1,5 g;
NaCl - 5 g;
Apă distilată 1 litru.
M72 Se dozează în tuburi cu capac filetat,
NaNH4HPO4×4H2O –1,5 g; cantitatea - la alegere. Se sterilizează
KH2PO4 (monobazic) – 1 g; în autoclava 15 min la temperatura de
MgSO4×7H2O - 0,2 g; 121°C. pH final, 6,7±0,2. Această
Citrat de sodiu×2H2O - 3 g; formulare este listată în Metode
Apă distilată - 1 litru. oficiale de analiză a AOAC
International, și Metode standard
pentru examinarea apelor reziduale
din APHA. Această compoziţie este
diferită de cea a mediului deshidratat
disponibil în comerț, care este
satisfăcătoare.
M74 Se toarnă volume a câte 225 ml în
Extract de carne 500 ml flacoane Erlenmayer. După
de vită - 3 g; sterilizare, 15 min la 121°C și chiar
Peptonă - 5 g; înainte de utilizare, se regleză aseptic
Lactoză 5 g; volumul la 225 ml, pH final
Apă distilată 1 litru. 6,9 ± 0,2.
M76 Se toarnă volume de 10 ml în
Triptoză sau Trypticase - 20 g; eprubete de (20×150 mm) conținând
Lactoză - 5 g; tuburi răsturnate (10×75 mm) de
K2HPO4 - 2,75 g; fermentație. Se sterilizează 15 min la
KH2PO4 - 2,75 g; 121°C, pH final 6,8±0,2.
NaCl - 5 g;
Laurii sulfat de sodiu -0,1 g;
10
Tabelul 1. 2 (continuare)
1 2
M80 Se adaugă ingredientele într-un litru de apă
Peptonă - 10 g; şi se fierb până la dizolvarea peptonei,
Lactoză - 10 g; fosfatului și Agar-agarului. Apoi se adaugă
K2HPO4 - 2 g; apă pentru a restabili volumul inițial. Se
Agar-agar - 15 g; repartizează în volume de 100 sau 200 ml și
Eozină Y - 0,4 g; se sterilizează în autoclavă 15 min la
Albastru 121°C, pH final 7,1 ± 0,2. Înainte de
de metil - 0,065 g; utilizare, la fiecare volum de 100 ml se
Apă distilată - 1 litru. dozează: 5 ml soluție sterilă de 20%
lactoză, 2 ml soluție apoasă 2% eozină Y şi
4,3 ml soluție apoasă de albastru de metilen
0,15%. Atunci când se utilizează produsul
deshidratat complet, se fierbe pentru a
dizolva toate ingredientele în 1 litru de apă.
Se repartizează în recipiente de 100 sau 200
ml și se sterilizează 15 min la 121°C, pH
final 7,1±0,2.
M104 Se dizolvă ingredientele în apă, cu o
Mediul 1.Tamponate încălzire ușoară, dacă este necesar. Se
pulbere peptonă-apă repartizează câte 10 ml în eprubete
(Difco sau BBL) - 7g; (16×150 mm) și se sterilizează în autoclavă
Glucoză - 5 g; 15 min la 118-121°C, pH final, 6,9 ± 0,2.
K2HPO4 - 5 g; Se dizolvă ingredientele în apă. Se
Apă distilată - 1 litru. repartizează 10 ml în eprubete
Mediul 2. Cazeină (16×150 mm) și se sterilizează în autoclavă
pancreatică - 3,5 g; 15 min la 121°C, pH final 7,5±0,2. Pentru
Gastroduodenal Digest de testul Salmonella: Se repartizează câte 10
țesut animal - 3,5 g; ml în eprubete (16×150 mm) și se
Dextroză - 5,0 g; sterilizează în autoclavă 12-15min la
Fosfat de potasiu - 5,0 g 121°C.
Apă distilată - 1 litru. Pentru testul la halofile Vibrio spp. se
Mediul 3.Peptonă - 5,0 g; adaugă clorură de sodiu la o concentrație
Glucoză - 5,0 g; finală de 2-3%.
Tampon fosfat - 5,0 g;
Apă distilată - 1 litru.
11
1 2
M124 Se încălzește soluţia pentru a se dizolva
Triptonă - 5 g; ingredientele. Se repartizează în tuburi sau
Extract de drojdie 2,5 g; eprubete adecvate. Se sterilizează 15 min la
Dextroză - 1 g; 121°C, pH final 7,0±0,2. Pentru drojdii
Agar-agar - 15 g; viabile și fungi se distribuie volume de 20-
Apă distilată 1 litru. 25 ml în plăci Petri sterile (15×100 mm).
M164 Se dizolvă și se distribuie volume de 5 ml în
Triptonă sau eprubete (16×125 mm sau 16×150 mm). Se
Trypticase - 10 g; sterilizează în autoclavă 15 min la 121°C, pH
Apă distilată - 1 litru. final 6,9±0,2.
R11 Se ajustează pH-ul la 7,2 cu NaOH 1N. Se
KH2PO4 - 34 g; aduce volumul la 1 litru cu apă distilată. Se
Apă distilată - 500 ml. sterilizează 15 min la 121°C. Se depozitează
în frigider.
R27 Se dizolvă 8,5 g NaCI într-un litru apă
Soluție de formaldehidă - distilată. Se sterilizează în autoclavă 15 min
(36-38%) - 6 ml; la 121°C. Se răcește la temperatura camerei.
NaCl - 8,5 ml; Se adaugă 6 ml de soluție de formaldehidă.
Apă distilată 1 litru. Nu se sterilizează după adăugarea
formaldehidei.
R44 Se dizolvă roșu de metil în 300 ml de etanol.
Roșu de metil 0,10 g; Se aduce volumul la 500 ml cu apă distilată.
Etanol, 95% 300 ml;
Apă distilată -500 ml.
R97 Se sterilizează în autoclavă 15 min la
Peptonă - 5 g; temperatura de 121°C, pH final 7,0 ± 0,2.
12
Metoda filtrului membrană
Metoda
directă Proba de analizat este filtrată printr-
un filtru membrană
Metoda Monitor MF
Proba de Metoda
analizat este
Standard MF
pipetată
într-o placă Filtrul membrană
După filtrare se adaugă
Petri. după filtrare este
mediu nutritiv prin
transpus pe un
partea de sus şi se
mediu de cultură
creează un scurt vid
(a, b, c) şi apoi
(< 1sec.). Monitorul se
incubat.
închide la partea de jos
cu dop. Apoi pâlnia
este îndepartată, capacul
şi partea de jos
Apoi se constituind o placă
amestecată Petri.
cu mediul
nutritiv, se
omogenizează
prin rotirea
plăcii şi se
termostatează.
a) b) c)
a) pe un cartonaş impregnat
cu mediu nutritiv, umezit
înainte cu apă sterilă;
b) pe un cartonaş absorbant
umezit înainte cu mediu
nutritiv lichid;
c) pe un mediu nutritiv tip
Agar-agar.
Figura 1.2. Metode de inoculare a probelor prelevate [28]

13
1.3. Descrierea şi rezultatele tipice de evaluare a creşterii
microorganismelor
În compartimentul de mai sus au fost vizate mediile de cultură
care necesită o pregătire prealabilă înaintea utilizării în încercările
microbiologice. De corectitudinea pregătirii mediilor depind rezultatele
testării microbiologice, deci şi veridicitatea acestora. Actualmente se
comercializează medii preparate gata pentru anumite testări
microbiologice. În „Controlul microbiologic al alimentelor, băuturilor
şi produselor farmaceutice‖ sunt vizate diferite medii nutritive utilizate
în controalele microbiologice, modul de utilizare al acestora, precum şi
evaluarea rezultatelor testărilor [28]. Mai jos prezentăm unele din
aceste medii şi domeniul de utilizare al acestora.
 Numărul total de colonii
 CMN Standard TTC , Tip 14055; 14005

Mediu extract de carne-peptonă pentru determinarea numărului
total de colonii; conform standardului ―APHA (apă)‖, din 1998 şi
modificare prin adaos de TTC. Mediu de cultură deshidratat pentru
creşterea de microorganisme în materii prime, ape (calitate generală),
ape reziduale, băuturi, bere, alimente şi alte produse.
Referinţe: APHA (apă), ISO 7704, VLB şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 2–5 zile la temperatura de 30±2°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Pe acest mediu cresc predominant
bacterii. Majoritatea coloniilor sunt de culoare roşie datorită reducerii
TTC.
 CMN Standard, Tip 14064
Mediu extract de carne-peptonă pentru determinarea numărului
total de colonii; reţetă conform standardului ―APHA (apă)‖,1998.
Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea de microorganisme în
materii prime, ape (calitate generală), ape reziduale, băuturi, bere,
alimente şi alte produse.
Referinţe: APHA (apă), ISO 7704, VLB şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 2–5 zile la temperatura de 30±2°C.
bacterii. Morfologia şi culoarea acestora variază.
14
 CMN Yeast Extract, Tip 14090
Pentru detectarea numărului total de colonii de bacterii aerobe
heterotrofe. Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea
microorganismelor în ape (calitate generală) şi alte produse.
Referinţe: EG 98/83, HMSO, ISO 6222, ISO 7704, ISO 8199 şi
SOP interne.
Condiţii de incubare: 44±4h la 36±2°C; 68±4h la temperatura de
22±2°C.
bacterii. Majoritatea coloniilor sunt incolore.
 CMN Endo, Tip 14053; 14003
Mediu selectiv pentru detectarea şi numărarea E. coli şi
bacteriilor coliforme. Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea
microorganismelor în materii prime, apă (calitate generală), ape
naturale, ape reziduale, băuturi, băuturi răcoritoare, concentrate,
sucuri de fructe, zahăr, produse zaharoase, alimente şi alte produse.
Referinţe: APHA (lactate), APHA (alimente), ISO 7704, ISO
9308-1 [1990], USDA şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 24±2 h la 36±2°C sau conform ISO 9308-1
[1990].
Evaluare şi rezultate tipice: E. coli formează colonii roşii cu un
luciu metalic şi un punct roşu la partea de dedesubt a membranei.
Alte coliforme cresc în colonii de culoare roşu închis până la
deschis fără luciu metalic. Coloniile incolore de bacterii lactoză-
negative nu vor fi luate în considerare.
 CMN Bismuth Sulfite, Tip 14057
Mediu de cultură selectiv conform Wilson şi Blair pentru
izolarea Salmonella thyphii şi a altor salmonele. Mediu de cultură
deshidratat pentru creşterea microorganismelor în produse
farmaceutice, cosmetice, materii prime, apă (calitate generalã), ape
reziduale, alimente şi alte produse.
Referinţe: AFNOR, APHA (lactate), APHA (alim.), AOAC,
DGHM, FDA, HMSO, ISO 6579 [1981], ISO 7704, USDA, USP şi
SOP interne.
15
Condiţii de incubare: Până la 48 h la temperatura de 36±2°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Majoritatea salmonelelor formeazã
colonii de culori deschise cu centre maro până la negru, înconjurate
de o zonă neagră cu luciu metalic (―ochi de peşte‖).
Unele specii de salmonele dezvoltă colonii colorate uniform maro
până la negru, lipsite de zona tipică.
Observaţie: La suspectarea unei foarte slabe contaminări cu
salmonela, se va prepara o cultură de îmbogăţire selectivă, iar proba
se va scarifica apoi cu un fir de inoculare pe un filtru membrană
deja amplasat pe un CMN preumezit.
 Bacterii patogene nefecale

Condiţiile de incubare sunt cele recomandate de Sartorius.
Ele pot varia în funcţie de tipul probelor, în concordanţă cu
standardul de referinţă sau cerinţele utilizatorului: Pseudomonas
aeruginosa Cultură mixtă cu Pseudomonas aeruginosa.
 CMN Cetrimide, Tip 14075
Pentru detectarea şi numărarea Pseudomonas aeruginosa
conform Lowbury. Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea
microorganismelor în produse farmaceutice, cosmetice, materii
prime, apă (calitate generală), ape reziduale, alimente şi alte
produse.
Referinţe: APHA (apă), AOAC, ASM, DIN 38411, EG 98/83, EP,
FDA, ISO 7704, ISO 8199, EN 12780, USP şi SOP interne.
Condiţii de incubare:48±4 h la temperatura de 37±1°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Pseudomonas aeruginosa formează
colonii albastre, albastru-verzui sau galben-verzui cu diametrul de
1–2 mm şi halo albastru. Coloniile produc piocianină şi
fluoresceină, fiind fluorescente sub lumina UV. Alte pseudomonade
dezvoltă colonii de diferite culori.
Observaţie: Pentru identificarea definitivă a Pseudomonas
aeruginosa sunt necesare teste suplimentare.
16
 CMN Chapman, Tip 14074
Mediu sare manitol conform Chapman, modificat pentru
detectarea şi izolarea stafilococilor patogeni. Mediu de cultură
deshidratat pentru creşterea microorganismelor în produse
farmaceutice, cosmetice, materii prime, apă (calitate generală), ape
reziduale, alimente şi alte produse.
Referinţe: APHA (alim.), AOAC, DGHM, FDA, HMSO, ISO
7704, USP şi SOP interne.
Condiţii de incubare: Până la 3 zile la 36±2°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Staphylococcus aureus formează
colonii galbene cu un halo tot galben (manitol-pozitive). Alţi
stafilococi cresc fãră zone de modificare a culorii. Majoritatea altor
bacterii sunt inhibate.
 Drojdii şi mucegaiuri
 CMN Lysine, Tip 14061
Mediu selectiv pentru izolarea şi numărarea coloniilor de
―drojdii sălbatice‖ în fabrici de bere conform Morris şi Eddy. Mediu
de cultură deshidratat pentru creşterea microorganismelor în bere şi
alte produse.
Referinţe: Journal Institute of Brewing, VLB şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 2–5 zile la temperaturi de 25–28°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Pe acest mediu cresc numai ―drojdii
sălbatice‖ (neaparţinând genului Saccharomyces) care utilizează
lizina ca singura sursă de azot, formează colonii de culoare albă sau
crem. Drojdiile de bere de cultură nu cresc deloc sau numai foarte
slab.
 CMN Malt Extract, Tip 14086
Pentru izolarea şi numărarea drojdiilor şi mucegaiurilor.
Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea microorganismelor în
vin, băuturi răcoritoare, concentrate, sucuri de fructe, alimente şi
alte produse.
Referinţe: APHA (alim.), AOAC, IFU şi SOP interne.
17
Condiţii de incubare: Până la 3 zile la 25±2°C sau 7 zile la
temperatura de 30±2°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Drojdiile dezvoltă de obicei colonii
netede, albe, rarerori colorate. Mucegaiurile cresc în general în
colonii cu aspect catifelat sau ca de vată de bumbac, albe în faza
timpurie de creştere şi de diferite culori mai târziu, după formarea
conidiosporilor. Observaţie: pH-ul scăzut al acestui mediu suprimă
creşterea majorităţii bacteriilor. El este disponibil cu două tipuri
diferite de filtre membrană: Saccaromyces cerevisiae şi Cultură
mixtă de Saccaromyces şi Rhodutorula.
 CMN Sabouraud, Tip 14069
Pentru cultivarea şi numărarea drojdiilor şi mucegaiurilor.
produse farmaceutice, cosmetice, materii prime, apă (calitate
generală), ape reziduale şi alte produse.
Referinţe: APHA (alim.), AOAC, EP, USP şi SOP interne.
Condiţii de incubare: Până la 5 zile la temperaturi de 20–25°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Drojdiile dezvoltă uzual colonii
netede, albe sau colorate. Mucegaiurile formează colonii catifelate
sau cu aspect de vată, care sunt la început albe şi capătă apoi diverse
culori, după producerea conidiosporilor.
 CMN Schaufus Pottinger (m Green yeast and mold), Tip
14070; 14072; 14080; 14083; 14091
Mediu: M Green Yeast and Mold pentru detectarea
drojdiilor şi mucegaiurilor conform Schaufus şi Pottinger. Mediu de
cultură deshidratat pentru creşterea microorganismelor în vin,
băuturi răcoritoare, concentrate, zahăr şi produse zaharoase, precum
şi în alte produse.
Referinţe: SOP interne.
Condiþii de incubare: 2–7 zile la temperaturi de 25–30°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Drojdiile dezvoltă colonii cu aspect
catifelat sau de vată, albicioase sau verzui, care pot căpăta însă alte
culori după producerea conidiosporilor. Ele au o suprafaţă netedă.
Fermentatorii zahărului producători de acid cresc în colonii
18
albicioase până la galbene, cei neproducători de acid – în colonii
verzui până la albastru-verzui.
Observaţie: PH-ul scăzut al acestui mediu inhibă creşterea
majorităţii bacteriilor. Acest mediu este disponibil cu variate tipuri
de filtre membrană: 3 porozităţi şi 2 culori diferite.
 Microorganisme alterante ale produselor

 CMN Glucose Tryptone, Tip 14066
Pentru numărarea bacteriilor mezofile şi termofile, în special
a microorganismului ―flat-sour‖ în conserve de alimente. Plăcile
Petri sunt de construcţie specială, închise etanş pentru incubare
microaerofilă. Mediu de cultură deshidratat pentru creşterea
microorganismelor în sucuri de fructe, zahăr, produse zaharoase,
alimente şi alte produse.
Referinţe: APHA (lactate), APHA (alim.), AOAC, ICUMSA, IFU,
ISO 7704, NCA şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 48h la 55±2°C sau până la 3 zile la 31±1°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Microorganismele care fermentează
glucoza şi produc acizi cresc în colonii gălbui spre verde. Coloniile
―flat-sour‖ au un diametru de 2-5 mm, sunt de culoare gălbuie -
verde şi sunt înconjurate de un halo galben.
Observaţie: Pentru incubarea la 55°C, plăcile Petri trebuie să fie
introduse într-o cameră climatică cu atmosferă umedă.
 CMN Suc de Tomate (Tomato Juice), Tip14079
Pentru detectarea bacteriilor acidolactice alterante ale
produselor, în special Oenococcus oeni conform Dubois, Bindan şi
Lafon-Lafourcade. Plăci Petri speciale, cu închidere etanşă, pentru
incubare microaerofilă. Mediu de cultură deshidratat pentru
creşterea microorganismelor în vin, suc de fructe şi altele.
Referinţe: ISO 7704, Lanaridris & Lafon-Lafourcade şi SOP
interne.
Condiţii de incubare: 4-6zile (până la 8zile) la 28–30°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Lactobacilii formează colonii
compacte, albicioase până la uşor gălbui, cu diametrul de 1–3 mm.
19
Pediococii dezvoltă colonii ceva mai mici, cu diametrul de cca
1 mm, care mai târziu capătă o culoare albicioasă până la slab
maronie. Oenococcus oeni creşte în colonii incolore până la
albicioase, cu diametrul sub 1mm.
Observaţie: Acest mediu trebuie să fie incubat în condiţii anaerobe
până la microaerofile.
 CMN Weman, Tip 14065
Pentru detectarea şi determinarea bacteriilor producătoare de
mucozităţi mezofile, conform Weman, modificat conform Lorenz.
băuturi răcoritoare, concentrate, zahăr, produse zaharoase şi alte
produse.
Referinţe: ICUMSA, ISO 7704 şi SOP interne.
Condiţii de incubare: 2–3 zile la temperaturi de 25–30°C.
Evaluare şi rezultate tipice: Coloniile bacteriilor formatoare de
mucozităţi mezofile sunt netede, rotunde şi de obicei incolore,
transparente sau translucide. Unele au un diametru de peste 5 mm.
Nerespectarea exactă a instrucţiunilor de lucru poate
cauza rezultate nesatisfãcătoare:
creştere inhibată, colonii minuscule – cartonaş prea uscat:
umezire insuficientă;
colonii neclar delimitate:
- cartonaş prea umed; strat de apă pe filtrul membrană:
umezire prea intensă;
- coloniile de microbi mobili (precum Bacillus sau
Proteus) tind să erupă chiar şi la o dozare corectă a apei.
Pentru prevenire se va adăuga NaCI sau un emulsificator.
contaminare de dedesubt. Creştere inhibată a coloniilor cu inel
de exces de lichid, neclare, deseori inclusiv o decolorare a
cartonaşului:
- membrana aşezată cu partea colorată în jos în loc de în sus;
- contaminare în timpul rehidratării (prin microbi aerieni, prin
contact sau prin apă contaminată);
- contaminare în timpul preparării;
20
- microbi spălaţi de pe membrană din cauza unei filtrări cu vid
incomplete, clătiri cu un lichid sau înclinări a plăcii Petri gata
preparate;
- suport filtru contaminat;
- pensetă contaminată.
creştere asimetrică pe membrană – placa Petri aşezată înclinat
în incubator:
creştere de colonii prea abundentă sau prea rare (număr
microbial optim: între 20 şi 200 germeni per filtru) – alegere greşită
a diluării probei sau amestecare neadecvată a probei cu diluent.
creştere neuniformă – volum de probă filtrat sub 5 ml, filtrare
fãră adăugare de soluţie tampon sterilă de NaCl ca diluant sau
amestecare inadecvată volum probă cu diluantul.
Figura 1.3. Identificarea în laborator a diferitor specii de

microorganisme [36]
21
Tabelul 1.3. Exemple de aplicaţii tipice [28]
Produs Detectare şi numărare Tip de mediu nutritiv
1 2 3
Lactobacili, pediococi şi VLB-S7-S
Bere alte microorganisme
alterante ale berii
Număr total de colonii Număr total de colonii
Standard, Standard TTC
Drojdii sălbatice Lysine
Drojdii şi mucegaiuri Wallerstein Nutrient, Wort
Microorganisme Orange Serum
Alimente acidotolerante
Enterobacterii, E. coli şi Chromocult, ECD, Endo,
coliforme (MacConkey), m FC, Teepol
Lauryl Sulphate, Tergitol TTC
Enterococi, Enterococcus Azide / KF Strep
faecalis
Pseudomonas aeruginosa Cetrimide
Stafilococi, Chapman
Staphylococcus aureus
Bacterii termofile Glucose Tryptone
producătoare de spori şi
mezofile
Număr total de colonii Caso, Standard, Standard
TTC, TGE /Tryptone
Glucose Extrac
Drojdii şi mucegaiuri Malt Extract, Wort
Enterobacterii, E. coli şi Endo, (Mac Conkey),
Sucuri de coliformi Tergitol TTC*
fructe Oenococcus şi alte Jus de Tomate /Tomato
microorganisme alterante Juice, Orange Serum
ale produselor
Drojdii şi mucegaiuri Malt Extract, Schaufus
Pottinger / m Green yeast
and mold,Wallerste in
Nutrient, Wort
22
1 2 3
E. coli şi coliformi Endo
Lactate Enterococi, Enterococcus Azide | KF Strep
faecalis
Salmonele Bismuth Sulfite
Microorganisme Orange Serum, VLB-S-7-S
Sucuri de acidotolerante, bacterii
fructe, acidolactice
concentrate Enterobacterii, E. coli şi Endo, MacConkey
coliformi
Bacterii producătoare de Weman
spori mezofile,
Leuconostoc
Număr total de colonii Standard, Standard TTC,
TGE | Tryptone Glucose
Extract
Pottinger | m Green yeast and
mold, Wallerste in Nutrient
E. coli şi coliformi Endo
Zahăr, Bacterii mezofile, Weman
produse producătoare de spori,
zaharoase Leuconostoc
Bacterii termofile Glucose Tryptone
producătoare de spori şi
mezofile
Pottinger | m Green yeast and
mold, Wort Apă
acidotolerante şi
bacterii acidolactice
Enterobacterii, E. coli şi Chromocult, ECD, Endo,
coliforme (MacConkey), m FC, Teepol
| Wa pe reziduale
Lauryl Sulphate, Tergitol TTC
23
1 2 3
Enterococi, Enterococcus
faecalis Azide|KF Strep
Apă
(calitate Pseudomonas aeruginosa Cetrimide
generală),
Salmonella Bismuth Sulfite
ape
Stafilococi, Chapman
minerale,
Staphylococcus aureus
ape
Număr total de colonii Caso, R2A, Standard,
naturale,
Standard TTC, TGE |
ape
Tryptone Glucose Extract,
reziduale
Yeast Extract
Drojdii şi mucegaiuri, Sabouraud
Candida albicans
Acetobacter Orange Serum, Wort (ambele
umezite cu o soluþie de 5-8%
etanol)
acidotolerante, bacterii
acidolactice
Vin Oenococcus şi alte Jus de Tomate / Tomato
bacterii alterante ale Juice
vinului
Pottinger / m Green yeast
and mold,
Wallerstein Nutrient, Wor
24
2. ETAPELE ANALIZEI MICROBIOLOGICE
Analiza microbiologică constă în aplicarea metodelor şi
tehnicilor microbiologice pentru observarea, izolarea şi identificarea
microorganismelor existente în produsele examinate în scopul
stabilirii prezenţei sau absenţei microorganismelor nocive pentru
sănătatea consumatorului sau pentru conservarea valorii alimentare
a produselor.
2.1. Sisteme de analiză a probelor

În stabilirea planului pentru analiza microbiologică se ţine
cont de microorganismele ce pot fi prezente, de natura alimentelor
şi de modul în care acestea sunt prelucrate înainte de consum, de
destinaţia lor. În funcţie de capacitatea laboratorului, se alege
numărul de probe analizate din acelaşi lot, precum şi al testelor
microbiologice aplicate, mergând progresiv de la determinarea
microorganismelor indicatori sanitari, la determinarea
microorganismelor patogene.
2.2. Interpretarea rezultatelor în analiza microbiologică

În urma analizei microbiologice a alimentelor se obţin
rezultate ce reprezintă limite pentru două categorii de
microorganisme:
microorganisme-indicatori igienico-sanitari: număr total de
germeni, bacterii anaerobe, bacterii coliforme, enterococi,
bacteriofagi.
microorganisme patogene şi facultativ patogene: bacterii din
genul Sallmonella, Shigella, Vibrio, Bacillus cereus,
Staphilococcus, Clostridium perfringens, Cl. botulinum,
mucegaiuri toxicogene.
În afara acestor grupe, pentru stabilirea cauzelor alterării
produselor alimentare şi prevenirea acesteia prin analiză se mai
determină grupa microorganismelor-agenţi de alterare: bacterii
psihrofile, proteolitice, lipolitice, lactice, sporulate aerobe, sporulate
anaerobe sulfito-reducătoare, butirice, drojdii osmotolerante,
mucegaiuri.
25
În ceea ce priveşte microorganismele patogene, prezenţa
unor specii deosebit de periculoase, cum ar fi Salmonella typhi,
Clostridium botulinum, nu este admisă în nici un produs. În schimb
microorganismele cu potenţial patogen diminuat cum ar fi, Bacillus
cereus, Staphilococcus aureus pot fi întâlnite frecvent în unele
alimente şi prezenţa lor în număr redus poate fi tolerată în anumite
limite.
3. METODE DE ANALIZĂ A PRINCIPALELOR GRUPE

DE MICROORGANISME
3.1. Determinarea microorganismelor - indicatori sanitari

 Numărul total de microorganisme
Acest test trebuie realizat în conformitate cu SM SR EN ISO
4833:2014 Microbiologia produselor alimentare şi furajelor.
Metoda orizontală pentru enumerarea microorganismelor. Tehnica
de numărare a coloniilor la 30°C [9].
Principiul metodei. Metoda constă în determinarea
bacteriilor organotrofe aerobe mezofile şi se bazează pe faptul că
celulele microbiene prezente în proba de analizat, în contact cu
mediul nutritiv solidificat, vor forma fiecare în parte colonii vizibile
cu ochiul, după incubare la 30ºC timp de 48-72 ore. Este cunoscută
şi sub denumirea de NTG (număr total de germeni). Ţinând cont de
diluţia decimală folosită şi numărul de colonii formate (CFU-colony
forming units) se determină numărul de microorganisme pe gram
sau cm3 produs, exprimat în ufc.
Tehnica de lucru. Se cântăresc aseptic 10g sau 25g produs
şi se omogenizează cu 90, respectiv 225 cm3 diluant steril
obţinându-se prima diluţie; după omogenizare se recoltează 1cm3 cu
o pipetă gradată sterilă şi se fac în continuare diluţiile decimale a
doua, a treia, a patra ş. a. în ser fiziologic steril. Numărul de diluţii
este dependent de gradul de contaminare presupus al produsului şi
dedus în urma efectuării examenului microscopic direct.
Se pipetează câte 1cm3 din diluţiile obţinute, după ce s-a
obţinut o bună uniformizare a diluţiei prin agitarea eprubetei şi
barbotarea conţinutului, în câte 2 plăci Petri sterile. În fiecare placă
26
se adaugă 15-18 cm3 mediu nutritiv fluidificat în prealabil pe baie
de apă la fierbere şi menţinut în baie termostat la 45ºC până în
momentul folosirii. Se face rapid uniformizarea prin mişcări în sens
opus, în plan orizontal, după care se lasă placa în repaus pentru a se
produce solidificarea mediului.
Figura 3.1. Modalităţi de efectuare a diluţiilor [52]

*Toate probele se realizează în duplicat
Se notează pe capacul plăcii: proba, mediul, diluţia, data.

Plăcile inoculate ce conţin mediu nutritiv solidificat cu agar
se plasează, după ambalare în hârtie, cu capacul în jos, în termostat,
pentru a evita ca picăturile de condens, căzând pe suprafaţa
mediului, să producă deplasări de celule, coalescenţa coloniilor.
Incubarea se poate face la temperatura 30oC±1oC timp de 72 h sau
la 35oC±1oC timp de 48 h.
Interpretarea rezultatelor
Particularităţi de numărare a coloniilor [52]
După termostatare se efectuează numărarea coloniilor din
plăcile Petri care nu conţin mai mult de 300 colonii. Se aleg pentru
numărare plăcile care conţin un număr de colonii cuprins între 25 şi
250, acestea trebuie să fie repartizate pe o suprafaţă mai mare de
27
25% din suprafaţa totală a mediului de cultură. Pentru numărare se
poate adopta [52]:
 numărarea manuală, cu ajutorul unui numărător electronic (care
la atingerea fiecărei colonii o contabilizează în memoria sa),
pentru a evita erorile de numărare;
 numărarea automată, utilizând instrumente speciale de numărare,
când se consumă numai 10% din timp, comparativ cu numărarea
manuală. Există totuşi şi unele limitări ale acestui procedeu şi
anume: pot să apară erori de numărare în cazul prezenţei în
mediu a unor impurităţi solide sau bule de gaz; nu se obţin
rezultate bune când coloniile au diametru mare şi sunt răspândite
pe o suprafaţă mare etc.
La numărare pot fi întâlnite următoarele tipuri de colonii:
- lanţuri de colonii, care aparţin unei singure surse (celule
asociate, în perechi, lanţuri, pachete etc.). În acest caz se va
număra întregul lanţ ca o singură colonie;
- colonii dezvoltate în filmul de apă dintre mediul de cultură şi
suprafaţa capacului interior;
- colonii dezvoltate în filmul de apă de la suprafaţa mediului
cu agar.
Rezultatele se exprimă, după caz, în unităţi formatoare de

colonii (ufc) per gram sau ml produs, astfel [52]:
1) Plăcile din două diluţii succesive conţin 25-250 colonii
pe placă:
C (3.1)
N , ufc / g (ml ) ,
(n1 0,1 n 2 ) d
în care: ΣC – suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;

n1 – numărul de plăci reţinute din prima diluţie;
n2 – numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă;
d – factor de diluţie corespunzător primei diluţii.
28
Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1,0 - 9,9)
x 10x, unde x este puterea atribuită numărului 10.
Exemplu: Dacă la numărare au fost alese câte 2 plăci
corespunzătoare diluţiilor a doua şi a treia, iar numărul de colonii
din cele 4 plăci reţinute este:
- la prima diluţie reţinută, 10-2 : 232 şi 244 colonii;
- la a doua diluţie reţinută, 10-3: 33 şi 28 colonii.
(3.2)
(prin rotunjire la două cifre semnificative*)
*
Exemplu:
ufc calculat ufc estimat
12700 13000
12400 12000
15500 16000
14500 15000
2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai

puţin de 25 colonii. Se aplică modul de calcul prezentat mai sus.
Plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d=1, produse
lichide), sau suspensia iniţială (d=10-1, produse solide), conţin mai
puţin de 25 colonii:
C
N , ufc / g (ml ) . (3.3)
2 d
Conform ISO 4833, pentru o abatere medie pătratică

r2=0,95, intervalele de variaţie a numărului posibil de ufc, pentru
plăcile în care se dezvoltă mai puţin de 15 colonii, sunt prezentate în
tabelul 3.1. [52]:
29
Tabelul 3.1. Limite de încredere pentru estimări în cazul unui număr
de colonii sub baremul minim
Număr de Intervalul Număr de Intervalul
colonii/placă posibil de colonii/placă posibil de
variaţie a ufc variaţie a ufc
1 <1÷ 2 9 4÷ 14
2 <1÷ 4 10 4÷ 16
3 <1÷ 5 11 5÷ 18
4 1÷ 6 12 6÷ 19
5 2÷ 9 13 7÷ 20
6 2÷ 10 14 7÷ 21
7 1÷ 12 15 8÷ 23
8 3÷ 13
3) În plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d=1,

produse lichide) sau suspensia iniţială (d=10-1, produse solide) nu
s-a dezvoltat nici o colonie:
ufc/ml < 1 (produse lichide);
ufc/g < 1 ·10-1(produse solide).
4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii,

numărarea se poate realiza: pe anumite sectoare delimitate ale
suprafeţei plăcii n/..., sectoare delimitate (4, 8 sau 16) pe o
suprafaţă delimitată (pătrat) de 1 cm2, astfel: când numărul de
colonii pe un pătrat este mai mare de 10 se numără la întâmplare
coloniile de pe 4 zone reprezentative, se determină media
aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri; când
numărul de colonii distribuite pe un pătrat este mai mic decât se
numără coloniile de pe 12 pătrăţele reprezentative, se determină
media aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri.
5) Când numărul de colonii pe placă este foarte mare, este
imposibilă numărarea, concentraţia de celule este mult mai mare
decât diluţia estimată.
6) Când se produce contaminarea accidentală sau se obţin
rezultate neconcludente, analiza este efectuată necorespunzător.
30
Tabelul 3.2. Condiţii de cultivare pentru numărarea
microorganismelor impuse de normativele ISO
Medii de Condiţii de
Grup de microorganisme cultură termostatare
temperatură/timp
Număr total de
microorganisme aerobe, care se PCA 30ºC/72h ± 3h
dezvoltă la 30ºC
Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru

evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentată în
tabelul 3.3.
Tabelul 3.3. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi
formatoare de colonii
Indicator Compoziţie medii de cultură, g/l
microbiologic
Număr total de PCA (engl. Plate count agar);
microorganisme SMA- Standard methods agar)
aerobe mezofile Triptonă ..................... ......5,0g
Extract de drojdie ....... ....2,5g
Glucoză anhidră .......... ...1,0 g
Agar-agar ........ ..........12,0-18,0g
Apă până la ......... .........1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial
31
.
Figura 3.2. Efectuarea diluţiilor şi determinarea numărului
total de germeni [37]
32
start start
finiş finiş
start finiş
1 2 3
1- primul, 2- al doilea, 3- al
treilea, 4 –al patrulea set de
zigzag Figura 3.4. Însămânţare în sector
Figura 3.3. Metoda de izolare (se obţin colonii confluente) [40]
prin strii pe placa Petri [38]
Figura 3.5. Plăci Petri compatibile şi incompatibile în testări

microbiologice [37]
33
Turnarea Placa Petri după
mediului inoculare şi
nutritiv în termostatare (A) - gespă microbiană;
plăci Petri (B) – colonii separate
a b)
) a) E.coli pe mediu Agar TSA Mostre după incubare şi
(mediu general) termostatare utilizând medii
b) E.coli pe mediu Agar MacConkey solide (placa Petri) şi lichide
(mediu selectiv şi diferenţial) (eprubete)
Figura 3.6. Proprietăţile culturale ale microorganismelor [39]
Figura 3.7. Caractere culturale ale bacteriilor [39]

34
Tabelul 3.4. Metode pentru determinarea microorganismelor
Nr. Tipul/Denumirea Material/produs Document de
încercării referinţă
1 2 3 4
1. Produse alimentare de
Determinarea soia, seminţe, nucă;
bacteriilor produse din carne,
coliforme, 37oC semifabricate din carne; SM ISO
inclusiv: produse pe bază de 4831:2010
grăsimi vegetale; lapte
şi produse lactate; peşte
şi produse de peşte;
bere; produse de
cofetărie şi patiserie,
gemuri, jeleuri etc.;
băuturi nealcoolice
îmbuteliate.
Ape minerale naturale, SM SR EN ISO
potabile. 9308-1:2016
Produse din carne, SM SR ISO
Escherichia coli semifabricate din carne; 16649-2:2011
produse lactate. SM ISO
7251:2016
Ape minerale naturale, SM SR EN ISO
potabile. 9308-1:2016
Produse cosmetice. SM EN ISO
21150:2016
2. Lapte şi produse lactate, SM SR EN ISO
Determinarea îngheţată. 6888-1:2011
Staphilococilor Peşte şi produse de
coagulazopozitivi peşte; produse din SM SR EN ISO
(Staphylococcus carne, semifabricate din 6888-3:2013
aureus şi alte carne; produse de
specii) cofetărie şi patiserie,
gemuri, jeleuri etc.
Produse cosmetice SM EN ISO
19250:2013
35
1 2 3 4
3. Ape minerale naturale, SM ISO
Determinarea potabile. 19250:2013
Salmonella Peşte şi produse de
peşte;
produse din carne,
semifabricate din carne;
produse pe bază de
grăsimi vegetale; SM SR EN ISO
produse alimentare de 6569:2015
soia, seminţe, nuci; (cu excepţia
lapte şi produse lactate, p.9.5.6)
îngheţată, produse
lactate deshidratate
pentru copii;
produse de cofetărie şi
patiserie, gemuri, jeleuri
etc.; bere fabricată din
malţ.
Băuturi nealcoolice PSI2.1-5-
îmbuteliate, fără pulpă. 719p.5.4.1.1
(SM SR ISO
19250:2013)
4. Determinarea Produse din carne,
Listeria produse culinare; SM SR EN ISO
monocytogenes lapte şi produse lactate; 11290-1:2013
îngheţată; produse
lactate deshidratate
pentru copii.
5 Determinarea Ape minerale naturale, SM EN ISO
Pseudomonas potabile. 16266:2016
aeroginosa Produse cosmetice. SM EN ISO
22717:2016
36
1 2 3 4
6. Determinarea Ape minerale naturale, SM SR EN ISO
Enterococilor potabile. 7899-2:2016
7. Ape minerale naturale, SM SR EN ISO
Determinarea potabile. 26461-2:2012
Clostridiilor sulfito- Produse SM ISO
reducătoare agroalimentare. 15213:2016
8. Produse pe bază de SM SR ISO 21527-
Detrminarea: grăsimi vegetale; 1:2014
Drojdii, mucegaiuri, produse alimentare de SM SR ISO 21527-
inclusiv Candida soia, seminţe, nucă; 2:2014
albicans lapte şi produse lactate, GOST 10444.12-
îngheţată; produse 88p.4/
lactate deshidratate (PSI2.15/02p.5.4.4)
pentru copii; produse
de cofetărie şi
patiserie, gemuri,
jeleuri etc.
Băuturi nealcoolice GOST 30712-
îmbuteliate . 2001p.6.4/(PSÎ 2.1-
5/13 p.5.4.4)
Produse cosmetice. SM EN ISO
16212:2013
SM EN ISO
18416:2016
9 Determinarea Conserve, suc de GOST 10444.14-
cantităţii de micete tomate, pastă de 19/(PSÎ 2.1-5/02
după Govard tomate. p.5.7)
10. Determinarea Produse de cofetărie şi SM EN ISO
Bacillus cereus patiserie, gemuri, 21871:2014
prezumtiv, 30oC jeleuri etc.
Produse lactate SM SR EN ISO
deshidratate pentru 7932:2014
copii.
37
11. Determinarea Produse din carne, SM SR ISO
familiei semifabricate din carne; 21528-2:2011
Enterobacteriaceae, lapte şi produse lactate,
37oC îngheţată.
Produse lactate pentru SM SR ISO
copii, inclusiv 21528-1:2014
deshidratate.
12. Determinarea SM SR ISO
bacteriilor acido- Lapte şi produse 15214:2014
lactice, o30C lactate.
Determinarea PSÎ 2.1-5/14 (IM-
Bifidobacteriilor 1987)
13. Determinarea Conserve (cu excepţia GOST 30425-97/
sterilităţii industriale celor lactice). (PSÎ 2.1-5/12)
 Bacterii anaerobe
Principiul metodei. Metoda constă în determinarea
numărului de colonii care se dezvoltă în medii nutritive cu potenţial
de oxido-reducere negativ sau în medii în care este oprit accesul
oxigenului din aer prin cultivarea în eprubete lungi cu lungimea de
25cm şi diametrul 0,8-1cm, umplute cu mediu pe 2/3 din lungime,
fie în plăci Petri cu păstrarea plăcilor înoculate în anaerostat.
Metoda este utilizată ca indicator pentru produse alimentare
ambalate (conserve, semiconserve, produse vacuumate) unde există
condiţii de anaerobioză favorabile pentru multiplicarea bacteriilor
anaerobe ce pot fi prezente în produsul analizat.
Tehnica de lucru. După pregătirea probei şi efectuarea
diluţiilor decimale, din primele 3 diluţii se recoltează cîte 1cm3
suspensie omogenă şi se inoculează în câte 2 eprubete ce conţin
mediu Agar peptonat de carne şi Bulion de carne, fluidificat şi răcit
la 42-45ºC (temperatură verificată prin ţinerea strânsă a eprubetei în
mână, când nu se mai simte senzaţia de arsură). Se face o bună
omogenizare, apoi mediul inoculat se toarnă în eprubete pentru
anaerobi şi imediat se face răcirea mediului. Pentru a preveni
38
accesul oxigenului din aer, peste mediul solidificat se adaugă o
soluţie sterilă din agar 2% încât înălţimea stratului de agar să fie de
minimum 2 cm şi din nou se face răcirea. După notarea probelor se
face incubarea la 35ºC timp de 48 h.
Interpretarea rezultatelor. După incubare se numără
bacteriile anaerobe, dezvoltate în colonii în profunzimea coloanei de
mediu gelificat. Se face media pentru cele 2 eprubete care aparţin
aceleiaşi diluţii şi, ţinând cont de factorul de diluţie, ce exprimă
numărul de bacterii anaerobe /g produs. Pentru analiza calităţii
microflorei anaerobe, se face o uşoară încălzire a tubului şi, la
încălzirea în flacăra arzătorului de gaz a părţii inferioare a eprubetei,
coloana de gel se deplasează spre gura eprubetei şi este expulzată în
exterior. Din coloniile prezente în profunzimea mediului se execută
preparate microscopice sau izolări de culturi pure.
 Bacterii coliforme
Bacteriile coliforme, conform definiţiei ISO, sunt bacterii Gram
negative nesporulate, oxidazo-negative, aerobe sau facultativ
anaerobe, ce pot să se înmulţească în prezenţa sărurilor biliare (care
inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu
proprietăţi echivalente), capabile a produce fermentaţia
heterolactică a lactozei cu producere de acid lactic şi gaze, timp de
48 ore şi la temperaturi de 35-37°C. Grupul bacteriilor coliforme
cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes,
Citrobacter freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter
amalonatica.
Principiul metodei. Metoda pentru determinarea bacteriilor
coliforme include teste prezumtive de confirmare şi teste complete,
bazate în primul rând pe capacitatea bacteriilor de a fermenta
lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, în timp de 48 ore la
35oC, asociate cu alte proprietăţi biochimice.
Testul prezumtiv constă în inocularea probei în mediu
nutritiv cu lactoză, mediu de îmbogăţire favorabil înmulţirii atât
bacteriilor coliforme cât şi altor bacterii care folosesc lactoza ca
39
sursă de carbon. Confirmarea probelor pozitive se face fie în funcţie
de prezenţa gazelor acumulate în tubul Durham, fie ca urmare a
scăderii pH-ului prin acumularea de acid lactic.
Testul de confirmare constă în transferul şi inocularea din
eprubetele pozitive ale testului prezumtiv în medii selective care
favorizează dezvoltarea bacteriilor coliforme de origine fecală.
Testul complet permite identificarea speciilor grupului
bacteriilor coliforme şi se bazează pe testarea unor proprietăţi
biochimice caracteristice.
Din grupul bacteriilor coliforme, specia Escherichia coli este
indicatorul care certifică o contaminare fecală recentă. E.coli se
prezintă sub formă de bastonaşe drepte, izolate sau în perechi,
mobile cu cili peritrich, Gram negative, facultativ anaerobe. Se
dezvoltă uşor pe medii simple, formând colonii cu aspect neted, slab
convexe şi suprafaţă lucioasă.
Tehnica de lucru
 Determinarea coliformilor totali
Analiza se efectuează în două etape, după cum urmează:
etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv) are rolul de a
previziona prezenţa bacteriilor coliforme şi multiplicarea acestora,
dacă sunt în concentraţii reduse, în vederea evidenţierii lor facile în
etapa următoare.
etapa de confirmare certifică prezenţa bacteriilor coliforme
prin cultivare în condiţii selective specifice.
Pornind direct de la eşantionul de analiză (în cazul unui
produs lichid) sau de la suspensia iniţială (10-1) (în cazul unui
produs solid), în funcţie de gradul de contaminare presupus se pot
adopta două modalităţi de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru
inoculare câte 10 ml de probă (pentru probele cu grad de
contaminare mai redus) utilizând mediu selectiv de îmbogăţire
dublu concentrat, sau câte 1 ml de probă prin inoculare în mediu
selectiv de îmbogăţire simplu concentrat. Pentru acest din urmă caz
se inoculează serii a câte trei eprubete în paralel şi pentru
40
următoarele diluţii succesive: 10 -1, 102 ş.a. Probele inoculate se
termostatează la temperatura de 37°C, timp de 24-48 h.
Se înregistrează eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de
gaz în plutitor), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate
timp de 24 h şi se înregistrează din nou eprubetele pozitive. Pentru
confirmare, din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă şi se
inoculează în eprubete cu Bulion Lactoză Bilă Verde Briliant
(BLBVB); după termostatare, la temperatura de 37°C, timp de 48 h,
în condiţiile în care se produc gaze în plutitor, tulburare şi virajul
culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirmă
că în produsul analizat sunt prezente bacteriile coliforme.
 Evidenţierea prezenţei bacteriilor de origine fecală

Testul constă în transferul cu o ansă a probelor din eprubetele
pozitive ale testului prezumtiv, în eprubete cu mediu EC şi
termostatare la temperatura de 45,5°C, timp de 24 h.
 Certificarea prezenţei speciilor E.coli

Din eprubetele pozitive ce conţin mediu EC, după
termostatare la temperatura de 45,5°C, timp de 24 h, se fac trasări
aplicând metode scarificate pe suprafaţa mediului Levine cu agar,
repartizat în plăci Petri pentru a obţine colonii distincte. Se
termostatează apoi la temperatura de 35°C, timp de 18-24 h. Din
coloniile caracteristice se fac inoculări pentru testele biochimice,
denumite generic IMVC*, care permit diferenţierea E. coli de
Enterobacter aerogenes.
*I – producere de indol din triptofan,
M – reacţia faţă de roşu de metil,
V – reacţia Vages Proskauer de producere a acetoinei,
C – utilizarea citratului.
Diferenţierea între specii se face pe baza proprietăţilor după

cum urmează (tabelul 3.5.):
41
Tabelul 3.5. Proprietăţile biochimice ale speciilor coliforme
Specii I M V V Mobilitate
Escherichia coli + + - - +
Enterobacter - - + + -
aerogenes
Calculul şi interpretarea rezultatelor. Folosind, metoda

titrului, în funcţie de numărul eprubetelor pozitive, se stabileşte
cifra caracteristică. Din tabelul lui Mac Cready, corespunzător cifrei
caracteristice şi numărului de eprubete inoculate în paralel, se
determină numărul probabil de coliformi (MPN). Pentru a calcula
numărul probabil de coliformi/cm3 probă, valoarea din tabel se
înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzător primei cifre din cifra
caracteristică.
Interpretarea rezultatelor. Pentru fiecare eşantion examinat
se reţin trei diluţii consecutive, care, după caz, corespund uneia
dintre situaţiile următoare:
a) cel puţin o diluţie prezintă trei eprubete pozitive. Se alege
diluţia cea mai mare (adică cea care corespunde celei mai mici
concentraţii de eşantion inoculat), care prezintă trei eprubete
pozitive şi încă două diluţii succesive. Dacă schema de diluţie
adoptată este necorespunzătoare, adică nu există diluţii la care să se
fi înregistrat şi probe negative, se aleg cele mai mari trei diluţii
succesive din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie
de probă inoculată);
b) nu există cazuri să se prezinte trei eprubete pozitive. Cazul
unu nu poate fi aplicat. Se aleg cele mai mari trei diluţii succesive
din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie de probă
inoculată), care conţin cel puţin un răspuns pozitiv;
c) cazuri particulare. În toate cazurile în care mai mult de una
dintre cele trei diluţii de la pct. a) şi b) nu prezintă eprubete pozitive
(adică cea în care s-a inoculat cea mai mare cantitate de probă) şi
cele două diluţii consecutive mai mici (adică cele în care
42
concentraţiile de probă inoculată sunt de 10 şi respectiv 100 de ori
mai mici decât în prima diluţie aleasă), excluzând cazul în care se
înregistrează probe pozitive, doar la prima diluţie preparată, pornind
de la eşantion. În acest ultim caz, se vor reţine primele trei diluţii,
chiar dacă seria include două diluţii care nu prezintă nici o probă
pozitivă.
 Grupele principale de produse pentru care se
recomandă analiza
Lapte şi produse lactate; carne şi produse din carne; peşte şi
produse din peşte; băuturi alcoolice; băuturi nealcoolice; produse de
cofetărie şi patiserie.
Identificarea Escherichia coli. Din eprubetele unde s-au
depistat bacterii Coli după incubare la temperatura 37oC, 48 h se fac
trasări pe suprafaţa mediului Endo, repartizat în plăci pentru a
obţine colonii distincte. Aceste plăci se termostatează la temperatura
37oC/48h. După termostatare se examinează proprietăţile culturale
şi morfologice ale coloniilor dezvoltate. Coloniile Escherichia Coli
au un luciu metalic şi sunt transparente.
Escherichia coli, colorarea după Escherichia coli cultivată pe Agar

Gram. Sunt bacili Gram-negativi MacConkey
Figura 3.8. Escherichia coli, proprietăţi culturale şi morfologice [41
43
3.2. Determinarea microorganismelor patogene, agenţi ai
toxiinfecţiilor alimentare şi intoxicaţiilor prin alimente
contaminate
 Genul Salmonella
Bacteriile din genul Salmonella se prezintă sub formă de
bastonaşe Gram-negative, mobile, cu cili peritrich (excepţie S.
galinarium), facultativ aerobe sau anaerobe, se pot multiplica în
medii de cultură şi în alimente, produc endotoxine.
Principiul metodei. În mod normal numărul de bacterii ce
aparţin genului Salmonella în produse alimentare este absent sau
foarte redus, acestea fiind asociate cu o microfloră mult mai
numeroasă în care de obicei predomină enterobacteriile. În scopul
creării unor condiţii favorabile pentru genul Salmonella, pentru a fi
detectate în produse, în analiza microbiologică se parcurg mai multe
etape şi anume:
etapa de preîmbogăţire, prin inocularea în medii nutritive
lichide lipsite de selectivitate;
etapa de îmbogăţire, prin inocularea în medii nutritive cu
grade diferite de selectivitate care să favorizeze înmulţirea
Salmonellei;
inocularea pe medii selective şi medii de diferenţiere pentru
izolarea coloniilor caracteristice genului Salmonella;
etapa de confirmare prin teste biochimice şi serologice a
speciilor aparţinând genului.
Tehnica de lucru. La analiza produselor care au suferit
tratamente termice, refrigerare, congelare, uscare, se recomandă ca
după efectuarea probei omogene (25g în 225cm3 ser fiziologic
steril) să se transfere integral în mediu de preîmbogăţire (500cm3) şi
să se facă incubarea la 37oC timp de 16-20 ore. După termostatare,
din vas se recoltează câte 10cm3 probă şi se inoculează în 2 vase ce
conţin câte 100cm3 din mediile de îmbogăţire termostatate în
prealabil la 42oC. Se face incubarea la aceeaşi temperatură (42oC)
timp de 48 ore. Din vasele cu mediile de îmbogăţire, chiar după 24
h, se pot face recoltări cu firul şi se fac trasări pe suprafaţa mediilor
44
de cultură de diferenţiere, în scopul obţinerii de colonii distincte şi
plăcile se incubă la 37 oC timp de 20-24 h. După 48 h se repetă
trasările şi se izolează, sub formă de culturi pure, minimum 5
colonii din fiecare placă, colonii presupuse a aparţine genului
Salmonella.
Pe mediul cu sulfit de bismut coloniile tipice de Salmonella
sunt de culoare brun spre negru, turtite, aderente la mediu cu luciu
metalic. Mediul din jurul coloniilor este brun la început, apoi, cu
creşterea timpului de incubare, se închide la culoare. Pe mediul cu
verde brilliant coloniile tipice sunt incolore, roz sau roşietice,
translucide sau opace pe fondul cu nuanţe roz spre roşu ale mediului
ce le înconjoară. Bacteriile lactoză-pozitive formează pe acest
mediu colonii de culoare galben-verzui. Prin cultivarea pe mediu cu
uree reacţia este pozitivă dacă, după incubare la 37oC/24-48 h,
culoarea mediului este roz spre roşu.
Pentru evidenţierea -galactozidazei se recoltează o ansă
din centrul coloniei de analizat şi se transferă în 0,25cm3 soluţie
salină, în eprubete. Se adaugă o picătură de toluen şi se menţine
eprubeta la 37oC în baie de apă termostatată timp de câteva minute.
Se adaugă reactiv şi după amestecare se mai menţine încă 24 h.
Apariţia unei culori galbene indică o reacţie pozitivă.
Salmonella typhi E.coli + Salmonella SS + E.coli

enteritidis
Figura 3.9. E. coli şi Salmonella, proprietăţi morfologice şi culturale
[44]
45
 Metoda orizontală pentru detectarea bacteriilor din
genul Salmonella
Sunt microorganisme ce formeaza colonii tipice sau mai
putin tipice pe medii selective şi manifestă caracteristici biochimice
şi serologice deschise conform standardului SM EN ISO
6579/2013.
Modul de lucru:
1. Reîmbogaţirea într-un mediu nutritiv respectiv (apă
peptonată, tamponată).
2. Imbogaţirea a doua medii selective lichide:
- bulion Rapaport vasiliadis cu soia modificat;
- bulion Muller – Kauffman tetrationat – novobiocină.
3. Izolare şi identificare.
4. Confirmarea identităţii.
Pregătirea probei de analizat şi preîmbogăţirea selectivă se
face EN ISO 8261/2005.
Salmonella enkridis – colonii mici, reflexe albastrui, aspectul
de repartizare a microbilor este în funcţie de unde s-a facut
însămânţarea (bulion, agar-agar, mediu solid).
 Genul Staphilococcus
Metoda de determinare se bazează pe proprietăţile, genul
stafilococilor de a utiliza manitolul în condiţii de anaerobioză şi a
produce enzima coagulaza. Se apreciază dacă numai 30-50% din
tulpinile de stafilococi coagulazo-pozitivi sunt producători de
enterotoxine. Stafilococii se prezintă sub forma unor aglomeraţii
formate prin sciziune din celule sferice cu diametrul 0,8 m în formă
de ciorchine. Formează colonii netede uşor convexe, lucioase cu
consistenţă cremoasă şi margini regulate. Pigmentaţia coloniilor
variază de la alb la galben auriu în funcţie de specie. În medii
lichide produc turbiditate, o peliculă inelară şi, în timp, un depozit
pulverulent şi limpezirea lichidului. Sunt bacterii facultativ
anaerobe, se dezvoltă optim la 30-37oC cu limite între 6,5-46oC, pH
optim 7-7,5. Pentru diagnosticarea speciilor se folosesc anumite
caractere diferenţiale. Staphilococcus aureus spre deosebire de alţi
stafilococi banali produce fosfolipoproteinlipaza şi poate consuma
46
gălbenuş de ou. Este tolerant la sare, clorură de litiu, tiocianat de
potasiu, azidă de sodiu, glicină, polimixină.
Tehnica de lucru. Din proba omogenizată şi următoarele
trei diluţii succesive se inoculează câte 1cm3 în câte o eprubetă cu
mediu hipersalin şi se face incubarea la 37oC/24 h. În eprubetele
pozitive se observă virarea culorii indicatorului de la roşu la galben
şi în frotiu se disting stafilococi Gram-pozitivi. Pentru izolarea
coloniilor, din eprubetele pozitive se fac trasări pe mediul solidificat
cu agar-agar, repartizat în plăci şi termostatare la 37 oC/24-48 h.
Dacă după incubare, în plăci s-au dezvoltat colonii circulare
convexe de culoare aurie, pentru confirmare se face în continuare
verificarea pentru evidenţierea coagulazei.
În acest scop, din coloniile caracteristice se face recoltarea
cu o ansă a unei cantităţi cât mai mari de celule şi se introduc în
eprubete ce conţin câte 0,5 cm3 plasmă de iepure cu citrat. Se face
termostatarea la 37 oC/6-18 h şi se consideră reacţia pozitivă când în
eprubetă s-a produs coagularea. În funcţie de rezultatele obţinute se
determină cantitatea cea mai mică de produs în care s-au pus în
evidenţă stafilococii coagulazo-pozitivi.
Staphylococcus aureus Colonii tipice de Staphylococcus aureus

Figura 3.10. Staphylococcus aureus, proprietăţi morfologice şi
culturale [43]
 Bacillus cereus
Metoda se bazează pe proprietatea Bacillus cereus de a
forma colonii caracteristice când se dezvoltă pe mediu cu gălbenuş
de ou, ca urmare a faptului că produce enzima lecitinaza.
47
Bacillus cereus se prezintă sub formă de bastonaşe drepte,
izolate sau asociate în lanţuri, Gram pozitive, mobile, aerobe. Forma
coloniilor diferă în limite largi, frecvent au un aspect sticlos cu
margini dantelate sau cu ramificaţii rizoidale (exemplu Bacillus
cereus var.mycoides). Formează endospori ovali în poziţie centrală
de tip bacillus. Prezintă unele caractere biochimice importante în
diferenţiere.
Tehnica de lucru. Se repartizează mediul fluidificat în plăci
Petri şi se lasă în repaos pentru a se produce solidificarea mediului
şi zvântarea suprafeţei. Cu o pipetă sterilă se plasează pe suprafaţa
mediului 0,25 cm3 din proba omogenizată sau diluţii şi se face
repartizarea uniformă cu ajutorul unei baghete în formă de L. Se
face incubarea la 30 C timp de 20-24 h.
Figura 3.11. Bacillus cereus, proprietăţi morfologice şi culturale [56]
Interpretarea rezultatelor. Se numără coloniile care prezintă

o zonă circulară în care s-a produs o precipitare densă a
gălbenuşului şi se calculează numărul în funcţie de volumul de
inocul şi diluţie. Pentru confirmare, din coloniile pozitive se fac
frotiuri colorate după tehnica Gram şi studiul microscopic se
completează cu teste biochimice. În funcţie de rezultatele obţinute
se stabileşte numărul de celule confirmate /g produs care aparţin
speciei Bacillus cereus.
48
 Clostridium perfringens (Velchia perfringens)
Metodele de determinare a Cl.perfringens se bazează pe
capacitatea de a reduce sulfaţii la sulfuri prin cultivare pe medii
selective, urmată de confirmarea prin teste biochimice care
diferenţiază speciile genului. Cl. perfringens se prezintă sub formă
de bastonaşe drepte, Gram pozitive, imobile. Endosporii sunt ovali,
subterminali şi termorezistenţi. Formează colonii cu diametrul 2-5
cm, translucide, cu suprafaţă lucioasă, galben-cenuşie, care prezintă
următoarele caractere biochimice: Cl. perfringens este strict
anaerob, termofil, cu temperatura optimă de creştere la 37 C.
Tehnica de lucru. Din proba omogenizată şi diluţii decimale
se recoltează câte 1cm3 şi se introduce în câte 2 plăci Petri sterile.
Peste suspensia de microorganisme se repartizează mediul nutritiv,
se uniformizează şi se lasă în repaus pentru gelifiere. Se inversează
plăcile şi se ternostatează la 37ºC timp de 24 h. Se numără coloniile
colorate în negru, apreciind numărul prezumtiv de celule per gram
probă de analizat. Pentru confirmare, din aproximativ 10 colonii
caracteristice se face transfer în eprubete cu mediu - bulion glicelat.
Se recomandă să se facă o scurtă fierbere pentru îndepărtarea
oxigenului, urmată de o răcire bruscă. Eprubetele se termostatează
la 35ºC timp de 18-24 h. Se verifică microscopic puritatea şi
identitatea coloniilor prin prezenţa bacteriilor sub formă de
bastonaşe groase cu capete drepte Gram-pozitive şi prin teste
biochimice.
Interpretarea rezultatelor. În funcţie de numărul de colonii de
culoare neagră dezvoltate în plăci şi numărul de colonii confirmate
prin teste biochimice, se calculează numărul de bacterii /g. De
exemplu media coloniilor din plăci cu diluţia a III-a a fost egală cu
25, iar din cele 10 colonii testate 8 au fost confirmate, rezultă că, în
probă, numărul de celule Clostridium perfringens/g este
nc 8 (3.4)
N n k 25 103 2.104 ,
nt 10
49
unde: N este numărul de bacterii Clostridium perfringens /g;
n – media coloniilor din plăci;
nt – coloniile testate;
nc – coloniile confirmate.
Vedere la microscop Creştere pe placa

Petri
Figura 3.12. Clostridium perfringers, proprietăţi morfologice
şi culturale [45]
 Clostridium botulinum
Pentru evidenţierea prezenţei de celule vii de Cl. botulinum
în alimente se foloseşte metoda culturală bazată pe capacitatea
acestora de a produce digestia particulelor de carne cu producere de
turbiditate în mediu şi gaze (CO2, H2, H2S). Clostridium botulinum
se prezintă sub formă de bacili cu capetele rotungite, Gram pozitivi,
mobili, cu cili peritrich. Formează spori ovali subterminali,
termorezistenţi. În bulion nutritiv cresc abundent, dând o turbiditate
uniformă, iar pe mediu solidificat, colonii mari, cenuşii, cu margini
neregulate, lobate, translucide sau semiopace.
Tehnica de lucru. Din proba omogenizată se introduc
aproximativ câte 5g în 3 eprubete cu mediu proaspăt fiert şi răcit. O
eprubetă se încălzeşte la 60ºC timp de 15 min, a 2-a - la 80ºC timp
de 30 min, iar a 3-a serveşte drept eprubetă martor. Eprubetele se
termostatează la 30ºC timp de 5-15 zile şi periodic se examinează
aspectul mediului.
50
Interpretarea rezultatelor. Dacă după 5 zile, prin
examinarea probelor, se constată turbiditate, producere de gaze, o
digestie a particulelor de carne şi miros de alterat, se presupune
prezenţa în proba analizată a celulelor viabile de Clostridium
botulinum. Dacă în eprubetele pasteurizate nu se constată creşterea,
după 5 zile se prelungeşte perioada de incubare şi din nou se face
examinarea microscopică. În eprubetele pozitive, din mediu se
execută preparate colorate după tehnica Gram şi se observă dacă
sunt prezente celule tipice, gradul de sporulare şi poziţia sporului în
celulă. Pentru confirmare, pot fi efectuate teste imunologice pentru
detectarea toxinei botulinice, fie în supernatantul mediului de
cultură fie în extractele alimentului incriminat.
Clostridium botulinum izolat pe

Clostridium botulinum (CBI)-Agar şi Blutagar
Figura 3.13. Clostridium botulinum, proprietăţi morfologice şi
culturale [46]
 Determinarea bacteriilor de putrefacţie

Principiul metodei. Bacteriile de putrefacţie sunt
microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine
animală până la produşi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene,
compuşi indolici.
51
Primele semne ale alterării prin putrefacţie sunt formarea de
mucus, apariţia mirosului neplăcut şi modificarea gustului.
Bacteriile de putrefacţie aparţin următoarelor genuri: Pseudomonas,
Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc.
Determinarea acestora are la bază două principii:

1) Evidenţierea hidrolizei substratului de natură proteică,
astfel se determină bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza
cazeinei).
2) Evidenţierea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor
prin realizarea de teste biochimice reunite în testul HIL (H -
evidenţierea producerii de hidrogen sulfurat; I - evidenţierea
producerii de indol; L - capacitatea de a lichefia gelatina).
 Determinarea bacteriilor cazeinolitice
Se realizează diluţii decimale. Prin metoda culturală Koch se
fac inoculări în mediul PCA suplimentat cu 1% cazeină sau 10%
lapte. Mediile se uniformizează rapid în plăci Petri sterile, prin
rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se
produce solidificarea acestora. După solidificarea mediului, plăcile
se termostatează cu capacul în jos, timp de 48 h, la temperatura de
37°C. Bacteriile care au capacitatea de a hidroliza cazeina vor
prezenta în jurul coloniilor o zonă clară incoloră, comparativ cu
restul mediului care este opac, aceasta deoarece bacteriile
cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare, care
difuzează în exteriorul coloniilor şi hidrolizează cazeina.
 Determinarea produşilor finali ai hidrolizei
proteinelor - testul HIL
Testul H – evidenţiază prezenţa hidrogenului sulfurat,
rezultat din proteoliza proteinelor. Se transferă 1ml suspensie
iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Se plasează
deasupra lichidului o hârtie sterilă, îmbibată cu acetat de plumb.
Proba se termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h. Proba
este pozitivă dacă hârtia se înnegreşte, ca urmare a formării de
52
sulfură de plumb, prin reacţia dintre acetatul de plumb şi H2S care
se degajă.
Testul I – evidenţiază prezenţa indolului. Se transferă 1ml
suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă.
Proba se termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h, apoi se
adăugă 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich. Proba se consideră pozitivă
la apariţia unui inel de culoare roşie la interfaţa mediu-reactiv, care
indică prezenţa indolului.
Testul L– evidenţiază bacteriile care lichefiază gelatina. Se
recoltează cu ansa celule din suspensia iniţială şi se înţeapă un tub
de gelatină într-o eprubetă sterilă. Se termostatează la temperatura
de 20˚C, timp de 7 zile.
Interpretarea rezultatelor. Proba este pozitivă dacă se
produce lichefierea parţială sau totală a tubului de gelatină. La
stabilirea numărului de bacterii cu activitate cazeinolitică se aplică
aceeaşi formulă de calcul utilizată pentru stabilirea numărului de
unităţi formatoare de colonii (metoda indirectă de numărare).
recomandă analiza
Carne, preparate din carne sau peşte, brânzeturi.

Mediu de Compoziţie medii de cultură, g/l-1
cultura/Denumire
Triptonă ......................... 5,0g
PCA Extract de drojdie .......... 2,5g
(engl. Plate count Glucoză anhidră ............... 1,0
agar) Agar-agar .......................12,0-18,0g
Apă până la .....................1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.
53
Tabelul 3.7. Compoziţia soluţiilor şi a reactivilor utilizaţi
Reactiv - Compoziţie medii de cultură, g/l-1
Soluţie/Denumire
Apă peptonată Peptonă ....................... 10,0g
Apă până la .............. 1000ml
Soluţie de acetat de Acetat de plumb .......... 10,0g
plumb Apă până la ................ 100ml
Reactiv Kovacs P dimetilnanobenzaldehidă………..10,0g
HCl…………………………………25,0ml
Alcool amilic până la ……………...100ml
3.3. Evidenţa mucegaiurilor producătoare de aflatoxine

Metoda se bazează pe cultivarea mucegaiurilor inoculate sub
formă de culturi pure, pe mediu optim pentru eliberarea
aflatoxinelor şi determinarea calitativă a micetoxinelor prin
cromatografie şi studiu în lumina UV cu o lungime de undă de 369
nm.
Tehnica de lucru. Din culturi pure ale mucegaiurilor izolate
de pe produsele alimentare se fac inoculări prin înţepare în zona
centrală a plăcilor Petri în care se află mediul nutritiv. Plăcile se
termostatează la 28ºC timp de 5-7 zile, condiţii care favorizează
elaborarea aflatoxinelor. După acest interval plăcile se expun la
radiaţii ultraviolete cu lungimea de undă 365nm. Dacă cultura
analizată prezintă o zonă fluoriscentă în jurul coloniei, se presupune
prezenţa aflatoxinelor. Ţinând cont de faptul că mucegaiurile pot să
producă substanţe care dau fluorescenţă, ca de exemplu flavocol,
acidul deoxy-hidroxi-aspergilic fără efect toxicogen, în cazul
prezenţei zonei fluorescente, se decupează zona cu mediu
fluoriscent şi se face extracţia eventualelor toxine. Extracţia se face
întâi în mediu apos apoi se repetă cu cloroform (3 fracţiuni
combinate şi concentrate la sec). Din extract se face
cromatografierea pe plăci de sticlă acoperite cu un start de silicagel
54
G, cu o grosime a stratului de 250 m. În momentul analizei plăcile
se activează prin menţinere la 115ºC timp de 30 min.
Reziduul uscat se dizolvă într-un cm3 de cloroform şi 20 ml
se folosesc pentru spotare în paralel cu soluţia standard de
aflatoxine B1 şi G1. Developarea se poate face în sistemul toluol-
acetat de etil-acid formic de 90% în raport de 5:4:1. Revelarea se
face după zvântarea plăcii, cu ajutorul unei lămpi în UV cu
lungimea de undă 365 nm.
În sistemul de developare propus, aflatoxinele au
următoarele Rf:
Aflatoxina B1 = 0,56 fluoriscenţă albastru violet
Aflatoxina B2 = 0,50 fluoriscenţă albastru violet
Aflatoxina G2 = 0,40 fluoriscenţă verde
Aflatoxina G2 = 0,26 fluoriscenţă verde.
Metoda propusă are o sensibilitate de 0,01 g/kg. Se poate
adapta şi pentru detectarea eventualelor aflatoxine din produse
alimentare care au suferit alterări prin mucegăire.
Sinteza micotoxinelor
Log biomasa
Faza latentă Faza exponenţială Faza exponenţială

Faza exponenţială
Figura 3.14. Fazele de crestere fungică şi localizare a sintezei

micotoxinelor [47]
55
Figura 3.15. Factori care favorizează creşterea fungică şi producţia
de toxine [47]
3.4. Determinarea bacteriilor, agenţi de alterare a produselor

alimentare
 Bacterii psihrofile
Metoda se bazează pe cultivarea bacteriilor pe mediu
nutritiv şi incubarea plăcilor la temperatura 7-10ºC timp de 7 zile,
condiţii ce favorizează creşterea bacteriilor psihrofile.
Tehnica de lucru. Se face omogenizarea probei de analizat
şi diluţii decimale. Din diluţii se recoltează aseptic câte 1cm3 care se
introduce în două plăci Petri (probe duble) şi deasupra se
repartizează mediul nutritiv. Plăcile se menţin în poziţie inversată în
frigider şi după o săptămână se face analiza calitativă şi cantitativă a
plăcilor.
56
Interpretarea rezultatelor. Se calculează numărul de
bacterii psihrofile la gram sau cm3 probă în funcţie de diluţia
folosită şi numărul de colonii dezvoltate. În funcţie de
caracteristicile morfologice şi afinitatea tinctorială se pot face
identificări ale speciilor predominante.
 Bacterii proteolitice
Pentru evidenţierea capacităţii bacteriilor de a produce
enzime proteolitice se face cultivarea bacteriilor pe medii nutritive
cu substrat proteic (gelatină, cazeină din lapte) şi se apreciază zona
de proteoliză din jurul coloniilor.
Tehnica de lucru. Pentru studiul activităţii gelatinilice a
bacteriilor, din proba de analizat sau diluţii se fac inoculări în
mediul bulion de carne agar (BCA). După însămânţare se face
incubarea la 37ºC timp de 24-48 h. Pentru evidenţierea activităţii de
hidroliză a gelatinei, suprafaţa mediului se acoperă cu o soluţie de
clorură mercurică. În jurul coloniilor active apare o zonă
transparentă în contrast cu restul mediului care devine opac. Pentru
studiul bacteriilor cu activitate caseolitică, din proba de analizat şi
diluţii se fac inoculări în mediul de bulion de carne-fosfat şi se
repartizează în plăci concomitent cu adăugarea de lapte degresat
steril (în proporţie de 10% faţă de mediu) cu o bună uniformizare a
mediului. Plăcile sunt incubate la 37ºC timp de 2-3 zile. Se
consideră bacterii cazeolitice, bacteriile care formează colonii
înconjurate de o zonă clară. Capacitatea proteolitică se poate
determina prin stabilirea raportului între diametrul zonei clare în
care s-a produs proteoliza şi diametrul coloniei în nm. Pentru
determinarea cantitativă a activităţii proteolitice, din coloniile
selecţionate prin metode calitative, se fac inoculări în medii
nutritive lichide. Filtratul este folosit drept sursă de enzime.
57
 Determinarea bacteriilor sporogene
a) Bacterii sporogene aerobe
Pentru separarea bacteriilor sporogene de microflora asociată,
aflată în stare vegetativă, se utilizează termorezistenţa superioară a
endosporilor bacterieni şi cultivarea pe medii nutritive în plăci Petri.
Tehnica de lucru. Din proba de analizat în prima etapă se
execută diluţii decimale în apă peptonată de 1%, sterilă. Eprubetele
cu diluţii se pasteurizează la 70 C timp de 10 min în baie de apă
termostatată. Pentru respectarea regimului de pasteurizare, într-o
eprubetă cu apă se introduce un termometru de control şi se
păstrează timp de 10 minute din momentul atingerii temperaturii de
70 C. Eprubetele se răcesc brusc şi apoi se fac însămânţări cu câte 1
cm3 din fiecare diluţie, în câte 2 plăci Petri şi se repartizează mediul
de cultură fluidificat şi răcit la 45 C. Se face incubarea plăcilor la
temperatura optimă, de obicei, 35 C pentru mezofili şi 45-550C
pentru termofili timp de 24-48 h, după care se face numărarea
coloniilor caracteristice bacteriilor sporogene, asociată cu examenul
microscopic pentru controlul prezenţei endosporilor.
b) Bacterii sporogene anaerobe, sulfito - reducătoare

Bacteriile sulfito-reducătoare anaerobe aparţin genului
Clostridium şi se prezintă sub formă de bacili Gram pozitivi,
catalaze-negativi care în anumite condiţii de cultivare produc H 2S.
Pentru evidenţiere se face cultivarea pe medii în compoziţia cărora
intră substanţe cu sulf precum şi substanţe care inhibă creşterea
bacteriilor din genul Bacillus.
Tehnica de lucru. Din fiecare diluţie a probei de analizat se
însămânţează câte 1cm3 în mediu cu sulfit şi, după omogenizare, se
repartizează în tuburi lungi pentru anaerobi astfel încât mediul să
ocupe aproximativ 3/4 din înălţimea tubului. Se face răcirea
mediului prin menţinerea tubului în curent de apă rece, în poziţie
58
verticală. După răcire, deasupra mediului solidificat se toarnă o
cantitate de agar-agar cu tioglicelat (b) pe o înălţime de 2 cm. Se
face termostatarea la 37 C pentru anaerobi mezofili sau la 50-55 C
pentru termofili, timp de 24-48 h.
Interpretarea rezultatelor. După incubare se numără
coloniile colorate în negru. Ca urmare a formării sulfurii de fier în
urma reducerii sulfitului din compoziţia mediului şi ţinând cont de
valoarea coeficientului de diluţie se poate face raportarea numărului
per gram de produs analizat. Pentru confirmare se fac examene
microscopice şi testul pentru catalază.
c) Bacterii sporogene anaerobe

Prin cultivarea în mediu nutritiv în condiţii de anaerobioză se
evidenţiază capacitatea bacteriilor din genul Clostridium de a
produce prin fermentaţia zaharurilor, acid butiric şi gaze: CO2, H2.
Tehnica de lucru. În eprubete cu 1,5 cm3 parafină, sterilizate, se
adaugă câte 1 cm3 din diluţiile probei de analizat şi câte 10 cm3
lapte-peptonă steril. Se face pasteurizarea la 70 C-10 min. Se face
răcirea rapidă a eprubetelor menţinute în poziţie verticală astfel
încât la suprafaţa mediului lichid se formează un dop de parafină
care împiedică accesul aerului. Se face incubarea eprubetelor la
37 C timp de 24-48 h.
Interpretarea rezultatelor. În prezenţa bacteriilor butirice,
datorită gazelor rezultate prin fermentaţie, se produce o deplasare a
dopului de parafină şi se constată degajarea mirosului caracteristic
de acid butiric. În preparatul microscopic se disting endospori ovali,
subterminali, caracteristici.
 Condiţii de cultivare şi compoziţia mediilor de cultură
pentru numărarea microorganismelor [52]
tabelul 3.8.
59
pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi
formatoare de colonii [52]
Indicatori Compoziţie medii de cultură, g/l
microbiologici
1 2
BD Trypticase Soy Agar
Bacterii Extract pancreatic de cazeină….15,0 g
sporulate Clorură de sodiu …………........ 5,0
aerobe Extract papaic de soia ………… 5,0
Agar - agar………………….......15,0
pH 7,3 ± 0,2
*Ajustată şi/sau completată în funcţie de necesităţi
pentru a corespunde criteriilor de performanţă.
MYP
Bacillus Mediu de bază ................. 90 ml
cereus Soluţie polimixină B ......... 1,0ml
Emulsie de gălbenuş de ou10,0ml
Se lichefiază mediul de bază, se temperează la 50ºC,
apoi se adaugă aseptic celelalte componente.
Mediul de bază Agar- agar .....12g-18g3)
Extract de carne....1,0g Apă până la ......900 ml
Peptonă ...............10,0g pH=7,2, la 25ºC
D-manitol ............10,0g Soluţie de polimixină B
Clorură de sodiu ...10,0g Sulfat de
Roşu de fenol ...... 0,025g polimixină B....106UI
Apă până la ........ 100 ml
Agar glucozat Purpur de
Triptonă ...............10,0g bromcrezol........0,015g
Extract de drojdie...1,5g Agar-agar ....... 12g-18g 3)
Glucoză ..................10,0g Apă până la ......1000 ml
Clorură de sodiu ...... 5,0g pH=7,0
(la 25ºC, după sterilizare)
60
1 2
Mediul Voges-Proskauer K2HPO4................5,0g
Bacillus (VP) Apă până l. ..1000 ml
cereus Peptonă....................7,0g pH=7,0 (la 25ºC, după
Glucoză.....................5,0g sterilizare)
Clorură de sodiu .......5,0g
Mediul cu nitrat Apă până la .........1000 ml
Peptonă...................5,0g pH=7,0 (la25ºC, după
Extract de carne .......3,0g sterilizare
Azotat de potasiu......1,0g
 Grupele principale de produse pentru care

se recomandă analiza
Făinuri, lapte, produse lactate acide şi brânzeturi, carne şi produse
din carne, conserve alimentare, zahăr şi produse zaharoase, produse
deshidratate, condimente şi plante aromate.
 Sisteme de cultivare în anaerobioză

Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea
atmosferei controlate (anaerobioză, microaerofilie îmbogăţită în
CO2).
Figura 3.16. Sisteme anaerobioză (GASPACK) [52]
61
Containerele sunt rezistente la şocuri şi sistemul perfect de
etanşeizare transformă sistemele GasPak EZ în condiţii ideale de
stocare şi transport. Noua tehnologie, bazată pe un sistem
rectangular de termostatare, etanşeizare uşoară şi rezistenţă la
şocuri, minimizează riscul apariţiei condensului, asigurând astfel o
vizibilitate perfectă a coloniilor bacteriene. Structura sistemului
anaerob şi indicatorii CO2 asigură metoda optimă de obţinere a
condiţiilor anaerobe.
3.5. Determinarea drojdiilor în alimente

 Determinarea nunărului total
Metoda se bazează pe cultivarea pe medii optime pentru
multiplicarea cu pH acid urmată de examenul microscopic care
poate confirma natura coloniilor dezvoltate.
Tehnica de lucru. Din proba organizată şi primele 3 diluţii
se fac inoculări cu câte 1cm3 în plăci Petri peste care se repartizează
mediul nutritiv adecvat. După uniformizarea şi gelifierea mediului,
plăcile se termostatează la 25 C timp de 3-5 zile. Se numără
coloniile caracteristice de drojdii şi se raportează la 1g (1cm3)
produs analizat. Pentru confirmare se execută preparate umede şi se
studiază morfologia celulelor.
Interpretarea rezultatelor. Metoda culturală prezintă
avantajul determinării numărului de celule vii din produs şi permite
izolarea de culturi pure, în vederea studierii caracterelor fiziologie şi
a identificării speciilor dezvoltate în plăci.
 Drojdii osmotolerate
Drojdiile, mucegaiurile şi bacteriile osmofile sunt
microorganisme capabile să crească într-un mediu cu concentraţii
ridicate de zahăr sau sare, producând alterări care conduc la
modificarea calităţii senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor.
Prin această metodă, numărul de microorganisme osmofile se
apreciază prin examen cultural indirect, pe baza coloniilor formate
microorganismele prezente în proba de analizat, sau o diluţie a
acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate, suplimentate
62
cu 10% zahar sau sare, după termostatare optimă. Metoda se
bazează pe capacitatea drojdiilor osmotolerante de a se înmulţi în
condiţiile cultivării pe medii cu concentraţii ridicate în zahăr.
Mediu de bază:
• pentru bacterii: dextroză, 110 g; Plate Count Agar
23,5 g, apă distilată, 1,000 ml;
• pentru drojdii şi mucegaiuri: mediu hiperglucidic.
Mediul de diluare: zaharoză sau NaCl 400 g; apă distilată
1000 ml.
Tehnica de lucru. Pentru obţinerea diluţiilor decimale pot fi
folosite două tehnici pentru orice tip de probă luată în analiză.
Numărul de diluţii depinde de calitatea microbiologică a probei
luate în analiză, şi anume:
 Din proba de analizat se execută în condiţii aseptice diluţia
1/5, prin transferul a 20 g probă în 80 ml mediu de diluare. Aceasta
reprezintă diluţia iniţială - 1:5 (proba martor). Se transferă aseptic
20 ml din proba martor în 80 ml mediu de diluare, proba este astfel
diluată cu un factor de diluare de 25.
 Se cântăresc în condiţii aseptice 10 g probă de analiză şi se
transferă în 90 ml mediu de diluare, obţinând diluţia întâi, din care
se obţin alte diluţii decimale prin diluare succesivă.
Cu o pipetă sterilă se transferă în 2 plăci Petri în paralel, câte
1ml probă de analizat. Se repartizează în fiecare placă Petri câte cca.
15 ml mediu de cultură fluidificat şi temperat la temperatura de
45±5°C. Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea
plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce
solidificarea lor. După solidificarea mediului, plăcile se
termostatează cu capacul în jos în următoarele condiţii:
 Bacterii osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 35-37°C timp de 48±3h (2
zile). Se reţin plăcile care conţin 25-250 de colonii. Se numără
coloniile formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate
în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de
colonii per ml sau gram de produs.
63
 Drojdii şi mucegaiuri osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 25-30°C timp de 72 h (3
zile). Dacă coloniile formate sunt de dimensiuni mici, se extinde
perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se numără coloniile
formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu
exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii
per ml sau gram de produs. Se înregistrează numărul de
drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs. Numărul de
microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculează
ca medie ponderată, cu formula 3.1. Rezultatele calculate se
rotunjesc la două cifre semnificative. Se aplică aceeaşi formulă de
calcul ca şi la bacterii aerobe mezofile sau drojdii şi mucegaiuri.
 Grupele principale de produse pentru care se recomandă

analiza
Zahăr şi produse derivate, produse conservate prin adaos de
zahăr, lapte condensat, amestecuri de sărare, saramuri şi produse
conservate prin sărare .

Mediu de Compoziţie medii de Mediude Compoziţie
cultură/ cultură, g·l-1 cultură/ medii de
Denumire Denumire cultură, g·l-1
Triptonă......... 5,0g Extract de
PCA Extract de drojdie ..2,5g Mediu drojdie .. 10g
(engl. Plate Glucoză anhidră ... 1,0 hiperglucidic Glucoză .200,0 g
Count Agar) Agar-agar . 12,0-18,0g Uree .......1,0 g
Apă până la ... 1000ml Agar-agar....
pH=7,2 12,0-18,0g
Mediul este disponibil Apă până la ..
comercial. 1000ml.
64
 Determinarea numărului de celule autolizate
În suspensii de drojdie, la analiza culturilor de producţie a
drojdiei comprimate ş.a., se poate determina numărul de celule
moarte (autolizate) prin metode directe cu ajutorul indicatorilor de
culoare. Astfel când celulele de drojdie sunt imersate într-o soluţie
de albastru de metilen, celulele vii, care conţin enzime de tipul
reductazelor, apar necolorate deoarece colorantul pătruns în celulă
este redus la leucoderivatul său incolor. Celulele de drojdie
autolizate, în care reductazele sunt inactive, se vor observa colorate
în albastru.
Tehnica de lucru. Se amestecă soluţia de albastru de
metilen cu un volum egal de suspensie de drojdie (concentraţie de
aproximativ 104/cm3) şi după 5 minute din amestec se plasează o
picătură pe lama sau camera THOMA. Concentraţia de celule
trebuie să fie astfel pregătită încât într-un câmp microscopic să fie
prezente 40-60 de celule la grosisment 10x40. Se examinează
aproximativ locul de celule, considerându-se la număr şi celulele–
muguri cu dimensiuni mai mari decât 1/2 din dimensiunile celulei
mamă.
Exprimarea rezultatelor. În funcţie de diluţiile efectuate, se
face calculul celulelor autolizate, rezultatul se exprimă la 1g drojdie
sau se determină viabilitatea, ca procent de celule necolorate din
numărul total de celule examinate.
 Determinarea capacităţii de sporulare a drojdiilor
Drojdiile din familia Endomacetaceas, Saccharomycetaceae
pot în anumite condiţii de mediu să producă ascospori prin
partenogeneză sau copulare, proprietate care le diferenţiază de
drojdiile asporogene incluse în familia Griptococcaceae. Această
proprietate este utilizată în teste de identificare a drojdiilor
împreună cu alte teste biochimice.
Tehnica de lucru . Din coloniile drojdiilor de analizat se fac
trasări pe mediul Gorodkova, se face incubarea la 25 C timp de 3-5
zile şi se apreciază prin examenul microscopic prezenţa şi numărul
de ascospori, formaţi ascosporilar ş.a.
65
Colonii untoase
Cultură de Candida de Candida
albicans, mediu albicans,mediu
Sabouraud, 4x Candida utilis
Sabouraud
Figura 3.17. Levuri genul Candida, proprietăţi morfologice şi
culturale [57]
3.6. Determinarea mucegaiurilor în alimente

 Determinarea numărului total
Prin metoda culturală Koch se asigură condiţii optime pentru
creşterea coloniilor, condiţii favorabile şi pentru drojdii ale căror
colonii se pot diferenţia uşor după caracterele morfologice. Prin
această metodă, numărul de drojdii şi mucegaiuri se apreciază
indirect, pe baza coloniilor generate de celulele acestor
microorganisme, prezente în proba de analizat, care se formează
când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu
nutritiv gelozat, după termostatare la 25°C timp de 72 h.
Tehnica de lucru este identică cu cea utilizată la numărarea
drojdiilor prin metoda culturală. Din coloniile caracteristice de
mucegaiuri se execută preparate între lamă şi lamelă când se pot
evidenţia structuri care să permită identificarea genului/speciei.
Se cântăresc 25 g probă produs alimentar, peste care se
adaugă 225 ml apă peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.
Pentru diluarea probei se aplică schema de diluţie din figura 3.1. Cu
o pipetă sterilă se transferă, în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 cm2
probă de analizat, dacă produsul este lichid, sau câte 1 cm2 diluţie
iniţială, în cazul altor produse. Se realizează apoi prima diluţie
decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă aceste operaţii cu
diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare
diluţie decimală. Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 cm2
66
mediu MEA (Malt Extract Agar) cu temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan
orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea
lor.
Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul
utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face
termostatarea. După solidificarea mediului plăcile se termostatează
cu capacul în jos, pentru 3-5 zile, la temperatura de 25-28°C.
Exprimarea rezultatelor constă în determinarea globală a
numărului de colonii (drojdii şi mucegaiuri) per gram (ml) produs
analizat cu exprimarea procentuală a speciilor predominante de
mucegaiuri în microflora produsului. Se reţin plăcile care conţin 25-
250 de colonii. Numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri per ml sau
gram de produs se calculează ca media ponderată, aplicând formula
3.1. Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative.
Se exprimă gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0
şi 9,9 multiplicat cu 10n, unde n este puterea atribuită lui 10. Dacă
cele două placi Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide)
sau al diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii,
se face media aritmetică a coloniilor numărate în cele două placi.
Rezultatul se exprimă sub forma:
- numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per ml:
NE = m (produse lichide);
- numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per gram:
NE = m·d-1 (alte produse),
în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale (alte produse).
Dacă cele două plăci Petri, la nivelul probei de analizat

(produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse), nu conţin nici
o colonie, rezultatul se exprimă sub forma:
- mai puţin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse
lichide);
- - mai puţin de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri per gram
(alte produse).
67
recomandă analiza
Pâine şi produse de panificaţie, produse lactate acide si
brânzeturi, carne şi produse din carne, uleiuri, grăsimi şi seminţe
oleaginoase, fructe, legume şi produse prelucrate, băuturi alcoolice,
băuturi nealcoolice, făinuri proteice, furaje, şroturi, zahăr şi
produse zaharoase, cereale şi produse din cereale, produse de
cofetărie şi patiserie, condimente, supe, sosuri, salate.
Observaţii. Deoarece mustul de malţ este un mediu de
cultură cu o selectivitate redusă, pentru a preveni dezvoltarea unor
colonii bacteriene, se recomandă ajustarea pH-ului la valori de 3,5-
4 prin introducerea în mediul fluidificat a acidului lactic (1 picătură
acid lactic 9% în fiecare eprubetă). După omogenizare şi
verificarea pH-ului obţinut, cu hârtie indicator de pH se face
repartizarea în plăci. Nu se recomandă ajustarea pH-ului înainte de
sterilizare, deoarece agarul în mediu acid şi la temperatura de
sterilizare îşi pierde capacitatea de a forma gel.
Tabelul 3.10. Condiţii de cultivare pentru numărarea

microorganismelor impuse de normativele ISO [52]
Grup de Medii de cultură Condiţii de
microorganisme termostatare
temperatură/timp
- YGC
Drojdii şi mucegaiuri - OGA (OGYE) 25ºC/5 zile

tabelul 3.11.
68
pentru determinarea şi confirmarea numărului
de unităţi formatoare de colonii [52]
Indicator Compoziţie medii de cultură, g·l-1
microbiologic
YGC OGA (OGYE)
(Extract de drojdie, Oxitetraciclină glucoză
glucoză,cloramfenicol agar)
agar ) Extract de drojdie . 5g
Extract de drojdie .. 5g Glucoză ............. 20g
Drojdii şi Glucoză .................20g Agar-agar .......... 16g
mucegaiuri Cloramfenicol ..... 0,1g Apă până la ...1000ml
Agar-agar ............ 15g pH=7,2
Apă până la ....1000 ml În momentul utilizării, în
pH=6,6 mediul fluidificat se
adaugă 100 ml soluţie
1mg/ml oxitetraciclină.
Geloză nutritivă MEA (Malt Extract
(geloză albă) Agar)
Agar-agar ....... 12-18g Extract de malt ....30g
Apă până la ...1000 ml Peptonă ............... 5g
Agar-agar ............15g
Apă până la ...1000ml
pH=7,6
Tabelul 3.12. Temperaturi minime necesare pentru dezvoltarea

unor mucegaiuri şi pentru producția de micotoxine [47]
o o
Specia fungiilor C Micotoxina C
Aspergillus flavus 10 Aflatoxine 10
Aspergillus clavatus 10 Patulină 12
Aspergillus ochraceus 10-12 Ochratoxină 12
Penicillium expansum 0 Patulină 0-24
Penicillium cyclopium 0 Ochratoxină 0-24
Penicillium cyclopium 0 Acid penicilic 4
Fusarium roseum 15 Zearalenonă 10
69
Proprietăţiele culturale Răspândire şi rol
În condiții necorespunzătoare de
păstrare, ca urmare a contaminării
înainte de recoltare, se poate produce
mucegăirea masivă a boabelor de
porumb, alune, semințe oleaginoase
cu importante pierderi economice. A.
flavus crește într-un domeniu larg de
temperatură (12-48oC), valoarea
minimă de aw 0,78 la 33oC la
valoarea optimă de pH=7,5.
Conidiosporii au rezistență termică
Aspergillus
redusă cu D60=1 min. Poate produce
flavus micotoxine cu denumirea generică de
aflatoxine.
Se întâlnesc în sol, pe resturi

vegetale, diferite semințe depozitate,
pe pâine. Poate elabora toxina
sterigmatocystina (nidulina).
Aspergillus nidulans
A. fumigatus este un fung filamentos
ubicuitar, saprobiot în sol, joacă un
rol important în reciclarea C și N2 din
resturile vegetale. Fiind un fung
contaminant, el se izolează destul de
frecvent din aerul ambiant, din apă și
Aspergillus fumigatus de pe diverse suprafețe, inclusiv din
clinici și spitale. Din prelevatele
clinice, izolarea sa este destul de
facilă, prin utilizarea mediilor uzuale
de cultivare.
Figura 3.18. Unele specii de Aspergillus care se gasesc în diferite

alimente [47]
70
Tabelul 3.13. Exigenţele termice pentru dezvoltarea
mucegaiurilor [47]
Mezofile Temperatura, oC Termotolerante Temperatura,oC
Maxim <50 Maxim 50

Minim >0 Minim >0
Optim 15-30 Optim 15-40
Termofile Psihrofile
Maxim 50 Maxim 20
Minim 20 Minim <50
Optim 0-17
Tabelul 3.14. Principalele mucegaiuri care se gasesc

în diferite alimente [47]
Mucegaiul Toxina Produsul
Aspergillus Aflatoxina, Porumb, arahide,

sterigmatocistina ochratoxina
orez,
A fasole, lapte,
preparate din carne
Fusarium Fusarine, Moniliformine, Grâu, porumb, orz,
Tricotecine, Fumonisine orez, secară, nuci
Penicillium Patulina, citrinina, Fructe şi sucuri de
ochratoxina A fructe, grâu, orez,
brânză, nuci
Alternaria Alternariol, Fructe, legume şi
Acid tenuazonic produse derivate,
mere și roșii
Claviceps Ergot Grâu, secară și orez
71
Tabelul 3.15. Valori ale aw necesare pentru dezvoltarea unor
mucegaiuri şi pentru producția de micotoxine [47]
Mucegaiul aw Micotoxina aw
Aspergillus flavus 0,78 Aflatoxine 0,83
Aspergillus parasiticus 0,70 Aflatoxine 0,80
Penicillium expansum 0,85 Patulină 0,99
Penicillium patulum 0,83 Patulină 0,95
Aspergillus clavutus 0,85 Patulină 0,99
Aspergillus achraceus 0,77 Ochratoxine 0,88
Aspergillus ochraceus 0,77 Acid penicilic 0,90
Penicillium cyclopium 0,82 Ochratoxine 0,90
Penicillium viridicatum 0,83 Ochratoxine 0,90
Penicillium citrinum 0,80 Citrină 0,88
Penicillium martensii 0,79 Acid penicilic 0,99
4. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL LAPTELUI ŞI

PRODUSELOR DERIVATE
4.1. Controlul microbiologic al laptelui crud

Eşantionarea în vederea examenului microbiologic
Eşantioanele în vederea examenului microbiologic trebuie
realizate în conformitate cu SM SR EN ISO 707:2012 [8].
Eşantioanele în vederea examenului microbiologic trebuie
întotdeauna prelevate primele folosind tehnici aseptice. Dacă este
posibil, ele trebuie luate din aceleaşi recipiente de produs ca şi acele
pentru analize chimice, fizice şi examen senzorial. În cazul
rezervoarelor mici, laptele se amestecă bine, de exemplu prin
transvazare, amestecare sau scufundare (plonjor). În cazul
rezervoarelor sau cisternelor de lapte, laptele se agită mecanic timp
de cel puţin 5 minute pentru a obţine o omogenizare suficientă.
72
Eşantionarea laptelui praf şi a produselor din lapte praf se
realizează cu ajutorul unei spatule sterilizate pentru a îndepărta
stratul de la suprafaţa produsului din zona de eşantionare.
Eşantionul se prelevează cu o sondă sterilă din zona de centru a
recipientului. Eşantionul se transferă cât mai repede posibil într-un
recipient pentru eşantionare sterilizat, care trebuie închis imediat,
luând măsuri de precauţie aseptice. Pentru a preleva o porţiune din
miezul untului se folosesc sonde sterilizate. În prealabil se
îndepărtează stratul superior (cel puţin 5 mm) de la suprafaţa
untului, în zona de eşantionare.
În cazul brânzeturilor preambalate în bucăţi mici, se
prelevează un număr suficient de ambalaje sau porţiuni, pentru a se
obţine eşantionul. Eşantionul, în ambalajul original, se pune în
recipientul pentru eşantion (pungi de plastic etc.). În eşantionarea
brânzeturilor se mai aplică şi alte tehnici cum ar fi: prin decupare de
sectoare sau felii, prin prelevarea miezului etc. [8].
Produsele în ambalaje până la 1kg se recoltează ca atare,
pentru produse din ambalaje mai mari de 1kg se recoltează în mod
aseptic probe de 250-500 cm3 (pentru lapte şi produse fluide) sau de
250-500g (lapte praf, brânzeturi şi unt). Probele se analizează
imediat după recoltare sau după caz se admite păstrarea la 2-4 C
timp de maximum 4 ore, pentru produse proaspete, şi maximum 24
h, pentru brânzeturi, unt, lapte praf.
Pentru controlul microbiologic probele se omogenizează şi
se execută diluţii decimale în ser fiziologic steril sau citrat de sodiu
2% steril, cu următoarele precizări:
 smântâna consistentă se menţine, înainte de omogenizare, pe
baie de apă la temperatura de 47 C.
 îngheţata, după îndepărtarea ambalajului, se trece în vas
steril şi se menţine până la topire pe baie de apă la 47 C.
 din brânzeturi, lapte praf şi alte produse lactate solide se
cântăresc aseptic câte l0g, se omogenizează în mojar steril şi
se adaugă 90 cm3 soluţie sterilă de citrat de sodiu 2%
încălzită la 47 C până se obţine o suspensie uniformă
(diluţia 1-a).
73
În cazul untului, se cântăresc aseptic l0 g într-o eprubetă
sterilă (20x20 mm) şi se adaugă 20 cm3 apă peptonată 1%. Eprubeta
se menţine la 47°C pe baie de apă până la topirea untului şi se fac
rotiri repetate pentru omogenizare, până se observă separarea
grăsimii de zară (plasmă). Cu o pipetă sterilă se recoltează 2 cm3
plasmă (cantitate care corespunde la 1g unt, se adaugă 8 cm3 soluţie
de diluare, obţinându-se diluţii.
 Criteriile de igienă pentru lapte crud
Laptele crud trebuie să întrunească următoarele criterii
(tabelul 4.1) [16].
Tabelul 4.1. Criterii de igienă pentru lapte crud [16]
N.T.G. per ml la
Tipul laptelui N.T.S. per ml2)
30°C1)
Lapte crud de la vaci < 100000 < 400000
Lapte crud provenit de la alte
specii decât bovine, destinat
pentru fabricarea produselor < 500000 < 400000
care nu implică nici un tratament
termic
Lapte crud provenit de la alte
specii decât bovine < 1500000 < 400000
1
determinat ca medie geometrică variabilă pe o perioadă de două luni, cu cel
puţin două probe pe lună;
2
determinat ca medie geometrică variabilă pe o perioadă de 3 luni, cu cel puţin o
probă pe lună.
4.2. Aprecierea calităţii microbiologice a laptelui

Pentru determinarea numărului de microorganisme din lapte
se poate folosi metoda de numărare Breed; în mod indirect se poate
aprecia calitatea microbiologică a laptelui în funcţie de durata în
care se produce modificarea culorii unor indicatori de pH şi rH
(albastru de metilen sau resazurină), sub acţiunea reductazelor şi a
cataboliţilor formaţi în condiţii standardizate, sub acţiunea
microorganismelor vii prezente în produs.
74
 Proba reductazei
Principiul metodei. Proba reductazei este o metodă indirectă de
apreciere a numărului de microorganisme vii dintr-un produs, în
funcţie de corelaţia dintre gradul de contaminare şi durata în care se
produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de
metilen şi resazurina), sub acţiunea enzimelor din categoria
reductazelor sintetizate de celulele vii prezente în produs. Indicatorii
redox au în forma oxidată culoare albastru (în cazul albastrului de
metilen) şi albastru violet (în cazul resazurinei), iar prin reducere (în
prezenţa reductazelor) se transformă în leucoderivaţi incolori.
Analiza se prestează cel mai bine pentru evaluarea calităţii
microbiologice a laptelui materie primă. În funcţie de tipul
indicatorului şi concentraţia acestuia variază durata analizei şi
culoarea probei, parametrii în funcţie de care se poate aprecia gradul
de contaminare şi calitatea microbiologică a produsului. Astfel, în
cazul utilizării albastrului de metilen, iniţial, proba are culoare
albastră care în timp se transformă în incolor. Resazurina îşi
schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi apoi incolor.
 Proba reductazei cu albastru de metilen

Albastrul de metilen este un indicator de oxidoreducere, care
în prezenţa reductazelor trece din forma oxidată colorată în albastru
la leucoderivatul incolor.
Tehnica de lucru. Pentru analiza laptelui, se introduc 20
cm lapte într-o eprubetă sterilă, se adaugă 1 cm3 soluţie de albastru
3
de metilen şi după omogenizare se notează timpul. Eprubeta se

menţine în baia de apă termostatică la 38-40 C astfel încât nivelul
apei să fie superior probei. Se fac notaţii asupra modificării culorii
la intervale de: 20, 60, 120, 180, 330 min. Prin metoda rapidă se
procedează în acelaşi mod folosind următoarele cantităţi: 10 cm3
lapte şi 1 cm3 soluţie de albastru de metilen diluţie 1/10.
Interpretarea rezultatelor şi aprecierea calităţii laptelui se face
conform datelor din tabelul 4.2.
75
Tabelul 4.2. Aprecierea calităţii laptelui în proba reductazică cu
albastru de metilen [4]
Durata decolorării probei în Numărul de Calitatea laptelui
minute bacterii per cm3
Metoda clasică Metoda rapidă
330 180 5×105 Bună
120-330 60-180 5×105 – 4×106 Satisfăcătoare
20-120 8-60 4×106 – 20×106 Slabă
20 8 20×106 Foarte slabă
 Proba reductazei cu resazurină

Se apreciază că, la temperaturi de 38-40°C, capacitate
reductazică superioară o au lactobacilii, streptococii şi bacteriile
coliforme. Dacă probele se menţin la temperatura de 22°C, la
reducere participă şi bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus,
Enterococcus.
Principiu. Resazurina este un indicator redox, care îşi
schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi incolor în
funcţie de potenţialul de oxidoreducere.
Tehnica de lucru. Pentru aprecierea calităţii microbiologice
a laptelui crud, în eprubete cu 10 cm3 lapte analizat se adaugă 1 cm3
soluţie de resazurină 0,05%, se astupă cu dop de cauciuc şi se face
termostatare la 38-40 C urmărindu-se modificarea culorii după 20 şi
60 min. În proba reductazică cu resazurină aprecierea se face după
datele înscrise în tabelul 4.3.
Tabelul 4.3. Aprecierea numărului de bacterii din lapte [4]

Timpul de Culoarea Număr de Calitatea laptelui
modificare a probei bacterii la
culorii 1 cm3 lapte
După 1oră Albastru 5×105 Bună
După 1 oră Albstru-violet 5×105–4×106 Satisfăcătoare
După 1 oră Ros-alb 4×106–20×106 Slabă
După 20 min Alb 20×106 Foarte slabă
76
Interpretarea rezultatelor. Se apreciază că la temperatura de
38-40 C capacitatea reductazică superioară o au lactobacilii,
streptococii şi bacteriile coliforme. Dacă probele se menţin la 22 C,
la reducere participă şi bacterii din g. Achromobacter, g. Bacillus, g.
Enterococcus.
 Determinarea numărului total de microorganisme
din lapte
Acest test se efectuează în conformitate cu SM SR EN ISO
4833:2011, care este vizat în compartimentul 3.1. Determinarea
microorganismelor - indicatori sanitari (Numărul total de
microorganisme).
Determinarea numărului total de bacterii aerobe
Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în
plăcile selectate pentru numărare).
Tabelul 4.4. Rezultatele testării
Proba/ Diluţia Nr. colonii/placă
1
2
3
4
Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi
formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs:
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
Proba 3 _______________
Proba 4 _______________
 Bacterii anaerobe sporulate din lapte

Determinarea bacteriilor butirice
Speciile de clostridii cum sunt C. butyricum, C.
tyrobutyricum şi C. thermosaccharolyti fermentează tumultuos
lactoza din lapte cu producere de gaze, acid acetic, acid butiric si
77
butanol. Primele două specii se întâlnesc mai frecvent în
brânzeturile cu defecte. Ele se pot dezvolta la temperatura de
maturare a unor brânzeturi provocând ,,balonarea târzie’’. Se
execută prin metoda Weinzirl în proba de lapte destinat fabricării
brânzeturilor.
Tehnica de lucru. În 5 eprubete sterile ce conţin parafină se
introduc câte 5 cm3 din proba de analizat. După pasteurizate (10
minute la 80 C) şi termostatare 48 ore la 37 C se apreciază
eprubetele pozitive, în care s-a produs deplasarea dopului de
parafină.
Interpretarea calităţii laptelui se face astfel:
- lapte de calitate bună – toate probele negative
- lapte de calitate satisfăcătoare – 1 eprubetă pozitivă din 5
- lapte de calitate nesatisfăcătoare – 2 până la 5 eprubete
pozitive.
Numărarea celulelor somatice din laptele crud cu ajutorul

analizatorului Somatos
Prin celule somatice se înţeleg celulele, de exemplu
leucocitele şi celulele epiteliale, al căror nucleu poate fi colorat
distinct cu albastru de metilen.
Principiul metodei. La adăugarea în lapte a soluţiei
Mastoprim, ultima intră în reacție cu celulele somatice şi modifică
vâscozitatea laptelui. Numărarea celulelor somatice se realizează
prin măsurarea vâscozităţii probei de control.
Tehnica de lucru. Se accesează butonul ,,Start’’. În balonul
montat se adaugă 10 ml lapte şi 5 ml soluţie Mastoprim. Se
accesează din nou butonul ,,Start’’. După expirarea timpului de
reacţie, valoarea citită de pe ecran reprezintă numărul de celule
somatice în probă.
78
 Proba fermentaţiei (lactocoagulare)
Această metodă se aplică în cazul laptelui destinat fabricării
brânzeturilor.
Principiul metodei. În rezultatul activităţii vitale a
microorganismelor, din lapte se elimină diferite enzime, care
fermentează lactoza, condiţionând formarea coagulului. Structura
coagulului format este în funcţie de bacteriile participante la
fermentare.
Tehnica de lucru. Într-o eprubetă sterilă se introduc 20 cm3
lapte şi se menţine în termostat la 37 C. Se urmăreşte timpul în care
se produce coagularea, iar după 24 ore se examinează aspectul
coagulului.
Exprimarea rezultatelor. Dacă coagularea s-a produs după
4-6 ore, rezultă că în lapte predomină bacteriile lactice, care produc
prin fermentaţie acid lactic care determină coagularea acidă a
cazeinei. Un coagul compact, omogen, denotă prezenţa bacteriilor
lactice homofermentative, un coagul buretos, în care se disting bule
de gaz, evidenţiază predominanţa bacteriilor coliforme. Executarea
unui frotiu colorat prin tehnica Gram confirmă concluziile privind
aspectul probei fermentate (bacteriile lactice sunt Gram-pozitive,
bacteriile coliforme – Gram-negative).
 Determinarea bacteriilor coliforme
Se execută prin metoda titrului prin însămânţarea a câte
1 cm3 în câte 3 eprubete cu mediu Kessler din 3 diluţii succesive şi
termostatarea la 37 C timp de 48 h. În funcţie de numărul de
eprubete pozitive se stabileşte cifra caracteristică şi numărul
probabil de coliformi. Pentru identificarea bacteriilor din genul
Escherichia se folosesc metodele descrise anterior.
4.3. Criteriile microbiologice de siguranţă alimentară şi

igienă a prelucrării laptelui şi a produselor lactate
Examenul microbiologic al brânzei, untului şi smântânii
obţinute din lapte crud sau lapte ce a fost supus unui tratament
79
termic mai scăzut decât pasteurizarea şi alte produse lactate din
lapte netratat termic trebuie să includă prevederile HG nr. 221 [25].
Tabelul 4.5. Criterii microbiologice pentru produsele lactate

din lapte netratat termic
Plan de
Valorile
prelevare
Nr. Analizele care trebuie efectuate limită admisibile
de probe
n c m M
1 Listeria monocitogenes (pentru
produse care se consumă ca
5 0 Absenţă în 25g
atare)
Absenţă în 25g
2 Salmonella 5 0
3 E. coli
(aici Unt şi smântână din
indicator lapte crud
10 100
al 5 2
ufc/g ufc/g
nivelului
de igienă)
4 Stafilococi
Unt şi smântână din 10
coagulazo- 5 2 100
lapte crud ufc/g
pozitivi ufc/g
Brânzeturi din lapte
crud 5 2 104 105
ufc/g ufc/g
Brânzeturi din lapte
care s-a supus
100 1000
tratamentului 5 2
ufc/g ufc/g
termic mai scăzut
decât pasteurizarea
n - numărul de unităţi ce constituie proba;
c - numărul de unităţi de probă care dau valori între m şi M.
80
Examenul microbiologic al laptelui pasteurizat şi altor
produse lactate lichide pasteurizate, produse din lapte şi zer ce au
fost supuse tratamentului termic şi alte produse şi subproduse din
lapte tratat termic trebuie să includă prevederile HG nr. 221 [25].
Tabelul 4.6. Criterii microbiologice pentru produsele lactate

din lapte tratat termic
Plan de Valorile
prelevare de limită
Nr. Analizele care trebuie efectuate
probe admisibile
n c m M
1 Enterobacte- Lapte pasteurizat
riaceae şi alte produse
5 0 10 ufc/ml
lactate lichide
pasteurizate
produse care se consumă ca atare)
3 E. coli Brânzeturi din lapte
(indicator şi zer ce a fost supus
100 1000
al unui tratament 5 2
ufc/g ufc/g
nivelului termic
de igienă)
4 Brânză maturată
Stafilococi realizată din lapte
coagulazo- sau zer care a fost 100 1000
5 2
pozitivi supus pasteurizării ufc/g ufc/g
sau unui tratament
termic mai puternic
Brânzeturi nematu-
rate, moi (brânză
proaspătă) din lapte
10 100
sau zer care a fost 5 2
ufc/g ufc/g
supus pasteurizării
sau unui tratament
termic mai puternic
5 Enterotoxina stafilococică (dacă
se detectează valori mai mari de Nedetectate în
5 0
105 ufc/g Stafilococi coagulazo- 25 g
pozitivi)
81
Examenul microbiologic al îngheţatei şi deserturilor pe bază
de produse lactate congelate trebuie să includă prevederile HG nr.
221 [25].
Tabelul 4.7. Criterii microbiologice pentru îngheţată şi

deserturi pe bază de produse lactate congelate
Plan de
Valorile
prelevare
de probe
limită admisibile
n c m M
1 Enterobacteriaceae 100
5 2 10 ufc/g
ufc/g
2 Salmonella (numai îngheţata pe
bază de lapte, excluzând produsele
care în timpul procesului de
fabricare sau datorită compoziţiei
produsului elimină riscul de
Salmonella)
Tabelul 4.8. Criterii microbiologice pentru laptele

praf şi zerul praf
Nr. Valorile
unităţi / limită
probă admisibile
n c m M
1 Salmonella 5 0 Absenţă în 25g
2 Enterobacteriaceae 5 0 10 ufc/g
3 Stafilococi coagulazo-pozitivi 100
5 2 10 ufc/g
ufc/g
4 Enterotoxina stafilococică (dacă se
Nedetectate în
detectează valori mai mari de 105 5 0
25 g
ufc/g Stafilococi coagulazo-pozitivi)
produse care se consumă ca atare)
82
Metodele de diagnosticare trebuie să fie în conformitate cu
prevederile SM SR ISO 21528-1: 2014 şi SM SR ISO 21528-2:
2011 – Enterobacteriaceae; SM SR EN ISO 11290-1 - Listeria
monocitogenes; SM SR EN ISO 6888-1: 2011 - Stafilococi
coagulazo-pozitivi; metoda europeană de selecţie a LCR pentru
stafilococi coagulazo-pozitivi - Enterotoxina stafilococică, SM SR
EN ISO 6579: 2015 – Salmonella.
Tabelul 4.9. Criterii de siguranţă alimentară

Rezultat
Nr. Indicatorul
satisfăcător Nesatisfăcător
1 Listeria Valorile observate Prezenţa bacteriei este
monocitogenes indică absenţa bacteriei detectată în oricare
unitate de probă
2 Salmonella Valorile observate Prezenţa bacteriei este
indică absenţa bacteriei detectată în oricare
unitate de probă
3 Enterotoxina În toate unităţile de Enterotoxina este
stafilococică probă enterotoxina nu detectată în oricare
este detectată unitate de probă
Tabelul 4.10. Criterii de igienă a prelucrării

Rezultat
Nr. Indicatorul
satisfăcător acceptabil Nesatisfăcător
1 Enterobact Absenţa - Prezenţa bacteriei este
eriaceae bacteriei detectată în oricare
unitate de probă
2 E. coli Dacă toate Dacă maximul Dacă una din mai
valorile valorii c/n este multe valori observate
observate între m şi M, iar sunt > M sau mai
sunt < m restul valorilor multe valori c/n sunt
sunt < m între m şi M.
3 Stafilococi Dacă toate Dacă maximul Dacă una din mai
coagulazo- valorile valorii c/n este multe valori observate
pozitivi observate între m şi M, iar sunt > M sau mai
sunt < m restul valorilor multe valori c/n sunt
sunt < m între m şi M.
83
4.4. Numărarea selectivă a bacteriilor lactice
Produsele lactate fermentate sunt fabricate din lapte şi/sau
produse lactate prin acţiunea unor microorganisme specifice care
determină reducerea pH-ului şi coagularea. Microorganismele
utilizate trebuie să fie viabile, active şi în număr important în
produsul finit în momentul vânzării la consumator (tabelul 4.11.).
Tabelul 4.11. Numărul de microorganisme viabile în produsele
lactate fermentate [HG 611]
Lapte
Iaurt,
fermentat
Indicatorul lapte Chefir Cumâs
(lapte acru,
acidofil
lapte covăsit)
Microorganisme din
culturile starter1, 107 107 107 107
ufc/g, minimum
Microorganisme
marcate², ufc/g, 106 106 - -
minimum
Drojdii, ufc/g,
- - 104 104
minimum
1)
culturi starter specifice;
2)
se aplică în cazul în care se utilizează microorganisme (altele decât sunt
menţionate în punctul 1) care au fost adăugate la culturile starter specifice.
Metoda de determinare a numărului de bacterii

(Streptococcus subsp. thermophilus și Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus cu/fără bacterii probiotice) din iaurt se face prin
numărarea coloniilor după inocularea în plăci cu medii selective.
Din punct de vedere microscopic, celulele de L. bulgaricus
se prezintă sub formă de bastonaşe cu capete rotunjite, cu
dimensiuni de (0,5-0,8) (2,0-9,0)μm, separate sau asociate de
obicei în lanţuri scurte, aranjate ca palisade, afinitatea tinctorială –
Gram-pozitive.
84
S. thermophilus se prezintă sub formă de celule sferice cu
diametrul de 0,7-0,9 μm, asociate în perechi sau lanţuri lungi,
afinitatea tinctorială – Gram-pozitive.
Într-un balon cotat de 100 ml se adaugă 10 g iaurt şi 50 ml
diluant. Amestecul se agită şi se mai adaugă diluant până la cotă. În
eprubeta sterilă cu 9 ml diluant se adaugă 1 ml din prima diluţie.
Conţinutul eprubetei se agită. De obicei, pentru numărarea L.
bulgaricus se utilizează diluţia a cincea şi a şasea iar pentru
numărarea S. thermophilus – diluaţia a şaptea şi a opta. Pentru
detectarea L. bulgaricus, S. thermophilus se însămânţează câte 1 ml
din fiecare diluţie în două plăci Petri pentru fiecare tip de
microorganism.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus sunt enumerate
şi izolate utilizând MRS agar, incubate anaerob (se realizează în
tuburi speciale pentru plăci Petri în prezenţa sistemelor anaerobe, de
tip Anérocult A, FN 25, etc.), la 37±1⁰C pentru 72 de h.
Streptococcus subsp. thermophilus sunt enumerate şi izolate
utilizând M17 agar, la 37±1⁰C pentru 48 de ore.
Calcularea şi exprimarea rezultatelor. Se efectuează
numărarea coloniilor din plăcile Petri care nu conţin mai mult de
300 colonii. Se calculează numărul de microorganisme după
formula 3.1. Numărul total de bacterii lactice în iaurt se determină
prin suma numărului de L. bulgaricus (ufc/g) şi de S. thermophilus
(ufc/g).
Exemplu de calcul. La numărarea L. bulgaricus pe plăcile
Petri au fost obţinute următoarele rezultate:
diluţia 10-5 – 295 şi 245 colonii;
diluţia 10-6 – 33 şi 40 colonii.
Prin urmare:
85
La numărarea S. thermophilus pe plăcile Petri au fost
obţinute următoarele rezultate:
diluţia 10-6 – 280 şi 240 colonii;
diluţia 10-7 – 30 şi 38 colonii.
Prin urmare:
Numărul total de bacterii lactice va fi:
5. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL CĂRNII ŞI

PREPARATELOR DIN CARNE
5.1. Controlul microbiologic al cărnii crude şi refrigerate

Pe carne pot ajunge microorganisme de pe părul şi pielea
animalelor, din conţinutul intestinal, de pe mâinile personalului, al
instrumentelor folosite, din aer etc.
Recoltarea probelor. Pentru controlul microbiologic al
ţesutului muscular, probele de carne se recoltează prin intermediul
unui cuţit sau bisturiu steril flambat şi anume fiind scoase câteva
bucăţi de carne sub formă cubică cu latura de 8-10 cm, din
profunzimea sfertului anterior şi posterior al carcasei.
În cazul recoltării probei din carcasa întreagă se scot câteva
fragmente din regiunea coapsei, omoplatului şi din regiunea
cervicală, din apropierea rănii de sacrificare.
Examenul bacterioscopic. În mod mai rapid starea de
prospeţime a cărnii se poate aprecia prin examen direct microscopic
şi organoleptic.
Examenul direct microscopic. În acest scop se fac preparate
microscopice de la suprafaţă şi din profunzime (după o prealabilă
cauterizare făcută la suprafaţă prin intermediul unei spatule
86
flambate). Frotiurile din profunzime se fac prin amprentă, prin
secţiunea făcută prin suprafaţa cauterizată. Examinarea frotiului,
colorat Gram, de la suprafaţă sau din adâncime, permite stabilirea
numărului mediu de microorganisme pe câmp microscopic, în urma
examinării a 10 câmpuri de microscopie. Totodată în frotiul
examinat, se urmăreşte prezenţa şi aspectul fibrelor musculare.
Aprecierea calităţii cărnii după rezultatele obţinute în
urma examinării frotiului efectuat prin amprenta de la
suprafaţă
Carne proaspătă. În frotiu nu sunt prezente
microorganisme sau se găsesc în număr mic proaspete -
izolate. Frotiul nu prezintă fragmente de ţesut muscular.
Carne relativ proaspătă. În frotiu se găsesc 10-20
microorganisme în câmpul microscopic, în majoritate coci.
Pot fi prezente rare fragmente de ţesut muscular proaspăt.
Carne alterată. În frotiu se găsesc 20-30 microorganisme în
câmpul microscopic, printre care şi bacili Gram negativi,
precum şi fragmente proaspete de ţesut muscular.
Conform normelor bacteriologice în vigoare, se admite ca
limită de dare în consum a cărnii, „maximum 20 microorganisme pe
câmp microscopic‖ în frotiul efectuat de la suprafaţa cărnii prin
amprentă, nefiind admisă prezenţa microorganismelor din frotiul
efectuat din profunzime.
Pentru a aprecia mai bine starea cărnii se ţine seama şi de
caracteristicile organoleptice ale probei de carne (aspect exterior,
culoare, consistenţă, miros).
Examen senzorial
 Carne proaspătă:
- la suprafaţă prezintă o peliculă, grăsimea are culoare,
consistenţă şi gust normal;
- la suprafaţă, culoarea cărnii este roz până la roşu, în secţiune
este lucioasă, uşor umedă până a fi lipicioasă. Sucul muscular
se obţine greu şi este limpede;
87
- carnea este elastică, compactă în secţiune, nu lasă urme prin
apăsare cu degetul;
- mirosul este plăcut, caracteristic.
 Carne relativ proaspătă:
- cu privire la aspectul exterior, uneori carnea prezintă o
peliculă uscată, iar alteori este parţial acoperită cu mucus lipicios.
Grăsimea are aspect mat şi consistenţă mai slabă. Uneori pot fi
observate pe suprafaţa cărnii şi pete de mucegaiuri;
- culoarea este mai închisă, mată în comparaţie cu cea a
cărnii proaspete;
- în secţiune carnea este umedă fără a fi lipicioasă, iar sucul
muscular este tulbure;
- în ceea ce priveşte consistenţa, carnea este moale atât la
suprafaţă cît şi în secţiune, iar prin apăsare cu degetul, îşi revine
complet;
- mirosul este uşor acid, sau de mucegai. În profunzime nu
se sesizează miros de mucegai;
uneori la suprafaţa cărnii se simte un miros greu de carne
neaerisită.
 Carne alterată:
- suprafaţa poate fi uscată, sau umedă şi lipicioasă, deseori
acoperită cu pete de mucegai. Grăsimea are aspect mat şi culoare
cenuşie-murdară, consistenţă slabă, gust şi miros rânced;
- suprafaţa cărnii este cenuşie sau verzuie. În secţiune carnea
este umedă şi foarte lipicioasă, uneori decolorată, alteori cenuşie sau
verzuie;
- carnea nu este elastică, nu revine repede la forma iniţială,
dacă o presăm cu degetul.
- mirosul caracteristic de putrefacţie se simte atât la
suprafaţă, cât şi în profunzimea cărnii.
Examenul cultural
Pregătirea extractului. Din porţiunea de carne recoltată
aseptic, se cântăresc în mod steril 10-11 g carne, se triturează cu
88
nisip steril, sau se mărunţeşte cu ajutorul unui dispozitiv special de
tocat. La carnea mărunţită se adaugă 89-90 ml apă sterilă şi se
obţine un extract, care se trece într-un balon steril prevăzut cu dop
de sticlă. Balonul se agită de 50-100 ori şi apoi se fac diluţii şi
însămânţări în medii optime de cultură pentru a evidenţia titrul sau
numărul probabil de microorganisme – indicatorii sanitari.
a) Determinarea numărului de microorganisme

Din extractul de carne se fac diluţii, apoi însămânţări în
placa Petri folosind ca mediu nutritiv bulion-geloză pentru
cultivarea bacteriilor şi malţ-geloză și Sabouraud pentru drojdii şi
mucegaiuri. Pentru a pune în evidenţă atât bacteriile mezofile cât şi
cele psihrofile se însămânţează două serii de plăci Petri, care se
termostatează la temperaturi diferite; o serie la temperatura de 20 C
timp de 72 h, iar cealaltă la - 37 C timp de 24 h. Însămânţările
făcute pe malţ-geloză sau Sabouraud se termostatează 5 zile la
temperatura de 25 C sau 7 zile la 20 C. După conţinutul în bacterii
psihrofile se poate aprecia mai bine limita de păstrare în camerele
frigorifice a cărnii.
Din sursele bibliografice numărul total de germeni la 1g
carne de vită variază între 102 – 105 în funcţie de condiţiile de
igienă, iar la carnea de porc, între 5.10 3 şi 106
microorganisme/gram.
b) Determinarea testelor HIL - evidenţierea prezenţei

bacteriilor proteolitice
Testul H I L se efectuează după medoda descrisă în compartimentul
Determinarea microorganismelor patogene, agenţi ai
contaminate
Testul H pune în evidenţă prezenţa hidrogenului sulfurat, rezultat
din degradarea proteinelor.
89
Testul I se efectuează pentru punerea în evidenţă a indolului.
Apariţia inelului de culoare roşie la interfaţa mediu-reactiv la
lumină indică prezenţa indolului.
Testul L se recomandă pentru a pune în evidenţă bacteriile care
lichefiază gelatina.
c) Metoda blocului parafinat

Metoda blocului parafinat furnizează date ce sunt luate în
considerare la aprecierea calităţii cărnii.
Metoda de lucru. După ce se recoltează în mod steril un cub
de carne cu latura de 6-10 cm, se introduce pentru 5 minute în
parafina adusă la fierbere. În aceste condiţii se realizează o
sterilizare a stratului extern al cărnii, temperatura în interiorul
cubului nedepăşind 45-46 C. Apoi, proba cu parafină se aşază pe o
sită metalică, în prealabil flambată şi răcită, se introduce în placa
Petri şi se termostatează 24 de ore la temperatura de 37 C. După
termostatare, mostra de carne parafinată se secţionează în mod steril
şi se prelevează probe prin amprentă. Se efectuează frotiuri colorate
după Gram. Astfel se depistează dacă în aceste condiţii a avut loc
putrefacţia cărnii, care indică prezenţa bacteriilor în profunzimea
cărnii.
d) Determinarea clostridiilor sulfitoreducătoare

Clostridiile sulfitoreducătoare sunt bacterii strict anaerobe,
Gram pozitive, sporulate, care pot fi puse în evidenţă printr-un test
prezumtiv şi un test de confirmare.
Testul prezumtiv. Se însămânţează diluţiile (10 -1, 10-2, 10-3)
din extractul de carne în medii cu sulfit de sodiu şi sulfat feros.
Apoi eprubetele se încălzesc pe baie de apă la temperatura de 70 C,
timp de 10 minute, marcând timpul din momentul în care mediul are
temperatura de 70 C.
După această pasteurizare, timp în care sunt distruse formele
vegetative ale bacteriilor, urmează incubarea probelor la
90
temperatura de 37 C 0,5 C timp de 7 zile, urmărindu-se zilnic
înnegrirea probelor, ce indică un test pozitiv (prezenţa bacteriilor
sulfitoreducătoare).
Conform normelor din ţara noastră, nu se admite la 1g de
carne recoltată din profunzime prezenţa bacteriilor
sulfitoreducătoare.
e) Determinarea numărului probabil de stafilococi

coagulazo-pozitivi
Din extractul produsului luat în analiză şi din diluţii (10-1,
10 , 10-3) se fac însămânţări în mediul selectiv hiperclorurat lichid,
-2
apoi se termostatează la temperatura de 37 C timp de 48 h.

În carne și produsele din carne se admit până la 10
stafilococi coagulazo-pozitivi la 1g produs.
5.2. Controlul microbiologic al cărnii tocate

În timpul tocării şi omogenizării microorganismele de la
suprafaţa cărnii sunt răspândite în toată masa de carne. În plus, în
carne ajung şi alte microorganisme de pe utilaje, de pe mâinile celor
care o manipulează. De cele mai multe ori carnea tocată are o
încărcare microbiană de 106 microorganisme /g, ceea ce reduce
timpul de păstrare în condiţii de refrigerare, până la 24 h.
Examenul microbiologic al cărnii tocate constă în depistarea
Salmonellelor şi a numărului de stafilococi coagulazo-pozitivi
(Staphylococcus aureus). Carnea în care este prezent
Staphylococcus aureus în cantitate de106 /g elimină enterotoxină,
care poate pune în pericol sănătatea consumatorilor.
După Mossel B.M. (1977) se acceptă livrarea în consum a
cărnii tocate cu maximum 106/g carne şi un conţinut maxim de 103
stafilococi coagulazopozitivi per gram de carne tocată.
În ţara noastră standardele prevăd lipsa salmonelelor în 25g
carne tocată, HG nr. 221 [25].
91
5.3. Controlul microbiologic al cărnii de peşte
 Examenul microbiologic al peştelui proaspăt
În cadrul controlului microbiologic al peştelui se recomandă:
examen bacterioscopic; examen cultural; determinarea prezenţei şi a
titrului bacteriilor indicatori sanitari; determinarea coliformilor și a
enterococilor; bacteriilor din genul Proteus.
 Examenul microbiologic al peştelui congelat
Peştele congelat conţine microorganisme care se găsesc în
apa din care s-a pescuit, plus alte microorganisme contaminate din
diferite manipulări. Deşi numărul total de germeni nu are o influenţă
prea mare în aprecierea calităţii peştelui congelat, totuşi în peştele
congelat numărul de bacterii trebuie sa fie mai mic de 3000/g. În
cadrul examenului microbiologic se recomandă determinarea
prezenţei și a numărului probabil de indicatori sanitari, mai
semnificativ fiind determinarea streptococilor fecali.
 Examenul microbiologic al peştelui sărat
Microbiota peştelui sărat provine din sol, apă, de pe
suprafaţa peştelui nativ, din sarea utilizată şi din diverse manipulări.
În număr mare microorganismele din genul Serratia şi Micrococcus
pot produce alterări. La aprecierea calităţii peştelui sărat se iau în
considerație bacteriile - indicatorii sanitari: Escherichia coli,
Streptococcus faecalis, Enterobacter aerogenes şi Proteus, care
indică contaminarea recentă. De asemenea, la aprecierea calităţii
peştelui sărat se ia în consideraţie conţinutul de microorganisme în
saramură. În saramura cu concentraţia 10% NaCl, alterarea peştelui
începe atunci când numărul de microorganisme depăşeşte 10-20×
106 /cm3.
92
5.4. Controlul microbiologic al mezelurilor
Mezelurile sunt preparate din carne în membrane, obţinute
prin fierbere, (prospături) şi afumate (semiafumate), crud-afumate şi
uscate (salamuri de durată).
Recoltarea probelor
În vederea examenului microbiologic, pentru crenvurşti se
preleviază 2-3 perechi, pentru salamuri semiafumate şi de durată se
prelevează 10-15 cm dintr-un baton.
 Examen bacterioscopic
În vederea unei recoltări sterile, se cauterizează suprafaţa
învelişului cu o spatulă înroşită la flacără şi, cu un bisturiu steril, se
secţionează această porţiune a produsului. Apoi, se fac frotiuri la
suprafaţa secţiunii, din straturile superioare şi centrale, sau din
porţiunile suspecte ale examenului organoleptic. Lamele folosite
vor fi degresate şi flambate. Frotiul se fixează cu ajutorul căldurii,
se degresează cu xilol, apoi cu alcool de 96% şi se colorează Gram.
În examinarea frotiului se foloseşte obiectivul de imersie. Se
stabileşte numărul mediu de microorganisme pe un câmp
microscopic şi ce tipuri de bacterii prevalează.
Folosind ca indice de apreciere a numărului de germeni pe
un câmp microscopic, preparatele din carne se clasează astfel:
- preparatele proaspete – când numărul de germeni pe un
câmp microscopic este sub 10 coci sau bacili Gram pozitivi;
- preparate relativ proaspete – în cazul în care numărul de
germeni pe un câmp microscopic variază între 10-15 celule, cu
predominarea formelor coc;
- preparate alterate – sunt preparatele în care sunt prezente
20-30 microorganisme pe un câmp microscopic, predominând
formele Gram pozitive, sau când în câmpul microscopic sunt
prezente în medie 10-15 bacterii Gram negative.
Examen cultural. Examenul cultural, bazat pe însămânţări în
medii nutritive pentru stabilirea unor indicatori mirobiologici
similari şi a prezenţei bacteriilor patogene, necesită mai întâi
pregătirea unui extract.
93
Pregătirea extractului . Se recoltează cu un foarfece steril 10-
11g preparat de carne şi se triturează cu nisip steril, într-un mojar
steril, adăugându-se 90 ml apă sterilă sau ser fiziologic. Din mojar,
lichidul se trece într-un balon steril cu dop rodat şi se agită intens
(circa 100 ori).
 Din extract se efectuează un preparat umed, pentru a pune în
evidenţă bacteriile mobile, şi de asemenea se prepară un frotiu
colorat prin metoda Gram.
 Se stabileşte numărul total de germeni folosind tehnica
recomandată pentru carne.
La interpretarea rezultatului privind numărul total de
germeni pe un gram produs trebuie să se ţină seama de unele
aspecte particulare ale tehnologiei – materie primă variată, folosirea
unui număr mare de substanţe auxiliare, maturarea tehnologică,
folosirea culturilor starter (Lactobacillus + Micrococcus) ş.a.
Efectuarea testului HIL pentru punerea în evidenţă a

bacteriilor care acţionează asupra proteinelor
Testul menţionat se stabileşte ca şi la analiza cărnii.
Interpretarea rezultatelor:
- la preparatele proaspete – testul HIL este negativ;
- la preparatele relativ proaspete – testul H este pozitiv;
- în cazul mezelurilor alterate – testul HIL bazat pe
însămânţări în apă peptonată este pozitiv. Se dezvoltă bacterii care
produc H2S, indol, germeni patogeni şi anaerobi de putrefacţie.
94
 Criteriile microbiologice de siguranţă alimentară şi igienă
Criterii de igienă a procesului de producere
Tabelul 5.1. Carcase de porcine, bovine, ovine,

caprine, cabaline [25]
Plan de Valorile
Analizele care prelevare
Nr. limită admisibile
trebuie efectuate de probe
n c m M
Carcase de bovine, ovine, caprine, cabaline
3,5 log/cm2 5,0 log/cm2
Numărul total de
1 media log. media log.
germeni
zilnică zilnică
2
1,5 log/cm 2,5 log/cm2
2. media log. media log.
Enterobacteriaceae
zilnică zilnică
Absentă în aria
3. Salmonella 50 2
testării/carcasă
Carcase de porcine
Număr total de
4. media log. media log.
germeni
zilnică zilnică
5. Enterobacteriaceae media log. media log.
zilnică zilnică
Absentă în aria
6. Salmonella
testată/carcasă

95
Tabelul 5.2. Criterii de igienă a prelucrării [25]
Rezultat
Nr. Indicatorul
satisfăcător acceptabil nesatisfăcător
1 Enterobacteria dacă media dacă media dacă media

ceae în carcase logaritmică logaritmică logaritmică
de bovine, zilnică este < m zilnică este zilnică este >M
ovine, caprine, între m şi M
cabaline şi
suine
2 NTG în carcase dacă media dacă media dacă media

de bovine, logaritmică logaritmică logaritmică
ovine, caprine, zilnică este < m zilnică este zilnică este >M
cabaline şi între m şi M
suine
Salmonella se Salmonella se
3 Salmonella în depistează într- depistează într-un
carcase de un număr număr mai mare
bovine, ovine, maxim de probe de probe
caprine, c/n (din 50 de c/n (din 50 de
cabaline şi probe analizate probe analizate
suine prezenţa prezenţa
Salmonellei se Salmonella se
depistează în depistează în mai
maxim 2 probe). mult de 2 probe).
E. coli în dacă toate dacă dacă una sau mai
4. carnea tocată, valoarile maximul multe valori
produse din observate valorii c/n observate sunt >
carne şi carne sunt < m este între m M sau mai multe
separată şi M, iar valori c/n sunt
mecanic restul valori- între m şi M
lor sunt < m
NTG în carnea dacă toate dacă dacă una sau mai
5 tocată, produse valoarile maximul multe valori
din carne şi observate valorii c/n observate
carne separată sunt < m este între m sunt > M sau mai
mecanic şi M, iar multe valor c/n
restul valori- sunt între m şi M
lor sunt < m
96
Criterii de siguranţă a produselor alimentare
Tabelul 5.3. Carne tocată şi carne preparată destinată să fie

consumată crudă [25]
Plan de prelevare Valorile
Analizele care trebuie
Nr. de probe limită admisibile
efectuate
n c m M
1.
5 0 Absentă în 25g
Salmonella
2.
Listeria monocytogenes 5 0
Absentă în 25 g
Tabelul 5.4. Carne tocată şi carne preparată de la alte

specii decât pasăre, destinată să fie consumată gătită [25]
Valorile
Plan de prelevare
Analizele care trebuie limită
Nr. de probe
efectuate admisibile
n c m M
5 0
1. Salmonella Absentă în 25g
5x105u 5x106uf
5 0
2. Număr total de germeni fc/g c/g
50ufc/g 500ufc/g
3. E.coli
4. Determinarea speciei
1 - -
atunci când este cazul
97
Tabelul 5.5. Carne separată mecanic [25]
Plan de
Valorile
Analizele care trebuie prelevare
Nr. limită admisibile
efectuate de probe
n c m M
1. Salmonella typhimurium Absentă în 10g
5 0
Salmonella enteritidis
2. Număr total de germeni 5x105 5x106
5 0
ufc/g ufc/g
3. E.coli 5 0 50ufc/g 500ufc/g
4. Determinarea speciei
1 - -
atunci când este cazul
Tabelul 5.6. Produse din carne destinate a fi consumate

Analizele care Plan de prelevare Valorile
Nr. trebuie de probe limită admisibile
efectuate n c m M
consumate crude
1. Salmonella 5 0 Absentă în 10g
consumate preparate
2. Salmonella 5 0 Absentă în 10g
Preparate din carne
E.coli 500ufc/g 5000 ufc/ g
5 0
sau cm2 sau cm2
Enterobacteriaceaele, Salmonella, E.coli, NTG, din

carcasele de bovine, ovine, caprine, cabaline şi suine reprezintă
criterii de igienă a prelucrării. Rezultatele testelor demonstrează
calităţile microbiologice ale produselor tehnologic testate.
98
6. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
CONSERVELOR
6.1. Controlul microbiologic al conservelor din carne

În vederea aprecierii calităţii conservelor se recomandă:
 controlul ermeticităţii recipientelor;
 controlul rezistenţei termostatice;
 examenul microbiologic propriu-zis (bacterioscopic şi
cultural).
Controlul ermeticităţii. Se introduc recipientele în apă la
85 C şi se menţin 5-7 minute. În cazul în care recipientul este
neermetic, sunt eliberate în mod continuu bule de aer. Cantitatea de
apă în care se introduc recipientele luate la control trebuie să
reprezinte de 4 ori greutatea acestora.
Controlul rezistenţei termostatice. O parte din recipientele
din lot (2%) luate la control se incubează 5-7 zile la temperatura de
37 C, iar altele - 10 zile la 55 C. În timpul termostatării se
controlează zilnic recipientele schimbându-li-se poziţia. Se
urmăreşte dacă în aceste condiţii este posibilă apariţia bombajelor.
Examenul microbiologic propriu-zis. După dezinfecţia
recipientului cu alcool şi apoi cu hipoclorit de sodiu 2%, care se lasă
să stea un minut pe capacul ce urmează a fi deschis şi, după o
prealabilă flambare la flacără, se introduce perforatorul steril în
capac care asigură o deschidere cu diametrul de circa un centimetru.
Orificiul respectiv se astupă cu capacul unei plăci Petri sterile.
În cazul recipientelor bombate deschiderea se face cu
precauţie folosind un dispozitiv pregătit în prealabil şi anume: o
pâlnie mare de sticlă, bine înfruntată cu vată, prin ţeava căreia se
trece o bară de oţel cu vârful ascuţit, cu diametrul de 4-5 mm. Acest
99
dispozitiv împachetat în hârtie, este sterilizat înainte de folosire.
Recipientul bombat se aşază pe o tavă în care se găseşte soluţie 5%
de hipoclorit de sodiu. Pâlnia de sticlă se pune peste capacul
recipientului şi, prin intermediul barei de oţel, recipientul se
perforează.
Examenul bacterioscopic. Acest examen, deşi nu este
obligatoriu, totuşi se recomandă în situaţia în care sunt suspiciuni
asupra calităţii materiei prime. Chiar dacă examenul cultural nu
pune în evidenţă forme viabile de bacterii, iar examenul
bacterioscopic evidenţiază numeroase forme de stafilococi, care au
fost distruşi prin tratamentul termic, este totuşi posibil pericolul
toxiinfecţiilor cu enterotoxina stafilococică termorezistentă.
Examenul bacterioscopic se realizează examinând la microscop
frotiuri colorate Gram sau simplu, preparate prin amprentă din
partea solidă a conţinutului conservei sau din suc.
După unele aprecieri, se admit 1-2 microorganisme moarte
pe un câmp microscopic.
Examenul cultural. Are drept scop să pună în evidenţă
prezenţa microorganismelor viabile aerobe şi anaerobe – folosindu-
se medii adecvate. Normele din ţara noastră prevăd pentru conserve
următoarele cerinţe:
- lipsa formelor vegetative de microorganisme (care ar fi
prezente în cazul neetanşeităţii recipientelor);
- absenţa microflorei anaerobie şi facultativ anaerobe;
- absenţa bombajului microbiologic.
 Controlul microbiologic al conservelor sterilizate din
carne şi peşte
Conservele sterilizate reprezintă tipul de conserve obţinute în
urma unui tratament termic realizat între 117-121 C, în timp
100
variabil, în funcţie de specificul conţinutului şi dimensiunea
ambalajelor. Tratamentul termic al conservelor sterilizate distruge
formele vegetative ale microorganismelor şi sporii speciilor
mezofile de Bacillus şi Clostridium, inclusiv şi speciile C.
botulinum. Pot rămâne însă speciile termofile din genurile Bacillus
şi Clostridium, care pot germina şi se pot dezvolta în recipiente, în
condiţiile unei temperaturi peste 40 C, alterând produsul. Astfel de
alterări pot fi evitate dacă depozitarea conservelor se face la o
temperatură sub 25 C, condiţii în care sporii reziduali ai speciilor
termofile nu germinează. Trebuie subliniat, însă, că un tratament
termic aplicat unui anumit tip de conserve poate fi eficace doar
atunci când produsul a fost contaminat înainte de sterilizare.
6.2. Controlul microbiologic al conservelor vegetale

Pentru conserve vegetale sterilizate sau pasteurizate,
controlul constă din aceleaşi etape; în cazul conservelor repartizate
în ambalaje de sticlă se fac suplimentar constatări privind
limpiditatea, sedimentul/voalul, aspectul fructelor, în cazul
compoturilor, bombajul, scurgerea de lichid ş. a. După examenul
microscopic direct, se pot determina prin metode culturale
următoarele grupe de microorganisme:
numărul total de bacterii mezofile aerobe (NTG);
bacterii sporulate aerobe şi anaerobe, mezofile sau termofile,
prin cultivare pe mediul TEGA şi termostatare fie la 35 C, fie
la 55 C;
numărul total de drojdii şi mucegaiuri pe medii MMA sau
Sabouraud cu evidenţierea tulpinilor de mucegaiuri termotolerante
(Byssochlamys fulva, Pleospora, Aspergillus glaucus ş. a);
101
drojdii osmotolerante prin cultivare pe mediu selectiv
hiperglucidic pentru analiza microbiologică a gemurilor,
dulceţurilor, siropurilor, mierii ş. a.
În cazul conservelor pe bază de tomate (pastă, suc, roşii în
bulion, ş. a) se recomandă aprecierea calităţii materiei prime folosite
la fabricarea produselor, prin metoda HOWARD.
 Metoda Howard de numărare a fragmentelor de
mucegai
Prezenţa unui număr mare de filamente de mucegai în
produsele vegetale prelucrate şi conservate poate să indice fie
utilizarea unor materii prime mucegăite sau s-a produs
contaminarea în timpul prelucrării tehnologice. Metoda studiază pe
cale microscopică prezenţa în produs a hifelor de mucegai,
caracterizate prin diametru uniform (sunt tubulare), capetele
filamentelor sunt drepte în secţiune, pot prezenta ramificaţii și
septuburi, prezintă granulaţii caracteristice în funcţie de specie.
Aparatura necesară. Refractometru pentru determinarea
conţinutului de substanţa uscată solubilă în produsul analizat.
Microscop astfel calibrat încât prin reglarea sistemului optic
(diafragmă, ocular şi sistem de tuburi), diametrul câmpului
microscopic să fie de 1,382 mm (suprafaţa câmpului 1,5mm2).
În acest scop se folosesc obiective de imersie, se deplasează
tubul interior al microscopului şi se verifică diametrul câmpului cu
ajutorul micrometrului obiectiv.
Cameră Howard sau camera Thoma
Tehnica de lucru. Proba analizată se amestecă cu apă sterilă
astfel încât substanţa uscată solubilă determinată refractometric să
fie cuprinsă între 7,9-8%. Din amestec se recoltează cu ansa şi se
repartizează uniform pe suprafaţa lamei (sau camerei), apoi
preparatul se acoperă cu lamelă. Din fiecare probă se fac două
preparate şi se studiază la microscop maximum 50 de câmpuri alese
arbitrar. Se consideră câmp pozitiv, dacă lungimea unei hife
singulare sau lungimea însumată a 2-3 hife, prezente în acelaşi
câmp microscopic, depăşeşte 1/6 din diametrul câmpului.
102
Interpretarea rezultatelor. Se calculează indicele Howard
care reprezintă raportul dintre numărul câmpurilor pozitive şi
numărul câmpurilor analizate, 100 %. Pentru produse de calitate
acest indice trebuie să fie mai mic de 40.
Criterii de igienă a procesului de producere a
conservelor din fructe şi legume[25]
Tabelul 6.1. Criterii de igienă a procesului de producere

Plan de prelevare Valorile
Analizele care
Nr. de probe limită admisibile
trebuie efectuate
n c m M
Fructe şi legume tăiate anterior (gata pentru consum)
1 E.coli 5 2 100ufc/g 1000 ufc/g
Sucuri de fructe şi legume nepasteurizate
(gata pentru consum)
2 E.coli 5 2 100ufc/g 1000 ufc/g
Tabelul 6.2. Criterii de igienă a prelucrării [25]

Interpretarea rezultatelor testului
Indicatorul
satisfăcător nesatisfăcător
E. coli în legumele şi
fructele tăiate anterior În cazul în În cazul în care una sau
(gata pentru consum) care toate mai multe dintre valorile
şi în sucurile de fructe valorile observate sunt > M sau
şi legume observate mai mult de c/n valori
nepasteurizate (gata sunt ≤ m
pentru consum) sunt între m şi M
103
7. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL VINULUI
La fabricarea şi păstrarea vinului în urma contaminării

accidentale cu microorganisme nedorite pot apărea alterări specifice
ale calităţii produsului. Pentru efectuarea controlului microbiologic
al produsului finit se recoltează sticle îmbuteliate din lot şi, după
caz, sticle al căror conţinut prezintă modificări de aspect (tulburare,
sediment, voal etc.). Pentru vinul păstrat în cisterne sau bidoane,
recoltarea probei se face cu flacon steril de la nivel diferit al masei
de lichid în scopul obţinerii unei probe medii. Pentru analiza
microbiologică a probelor de vin se parcurg următoarele etape:
Examinarea calităţii senzoriale cu aprecieri privind
limpiditatea, prezenţa sau absenţa sedimentului, voalului sau a
modificărilor de miros şi gust.
Examinarea microscopică a probei. În cazul probelor cu
defect se execută preparate umede, când se pot pune în evidenţă
levurile prin studiu la microscop cu grosisment 450. Aceste
preparate se pot executa din sediment, prin recoltare cu pipeta
sterilă, sau din voal, prin recoltare cu ansa şi suspendarea celulelor
în ser fiziologic steril. În cazul analizei drojdiilor din sediment se
recoltează 5 cm3 probă şi se amestecă cu 5 cm3 soluţie diluată de
albastru de metilen şi în preparatul umed se observă starea
fiziologică a celulelor de drojdie (celule vii, celule înmugurite,
celule în stare de autoliză). Dacă în preparatul umed este sesizată
prezenţa bacteriilor, în continuare se execută frotiuri fixate şi
colorate după metoda Gram. Prin studiu microscopic se urmăreşte
forma bacteriilor (micrococi, pediococi, lactobacili) precum şi
afinitatea tinctorială. Dintre microorganisme - agenţi pasibili de
alterare a berii, lactobacilii şi pediococii sunt Gram-pozitivi în timp
ce bacteriile din g. Acetobacter şi Flavobacterium sunt Gram-
negative.
Metode culturale. Pentru determinarea numărului de celule
vii prezente în proba de analizat sau pentru izolarea şi studiul
microorganismelor din probe de vin alterate, se fac însămânţări din
104
probă sau diluţii decimale, în medii de cultură generale sau
selective. Pentru vinurile de calitate bună, cu un conţinut redus de
microorganisme, pentru determinarea numărului de celule vii se
poate folosi metoda filtrării unui volum de 100 cm3 vin prin
membrană filtrantă sterilă care se transferă pe suprafaţa mediilor de
cultură solidificate, ceea ce permite dezvoltarea şi numărarea
coloniilor. În absenţa membranelor filtrante, în scopul concentrării
celulelor existente în vin, se recomandă centrifugarea şi recoltarea
din sediment a probei pentru însămânţare în medii de cultură. La
analiza microbiologică a vinurilor se pot determina următoarele
grupe de microorganisme:
Determinarea numărului de drojdii
Medii de cultură: Must de malţ agar, Must de struguri pasteurizat.
Din probă sau diluţii decimale se inoculează câte 1cm3 în
plăci Petri sterile şi se face omogenizarea cu mediu MMA
fluidificat şi răcit la 45 C. Mediul lichid de must de struguri se
foloseşte pentru determinarea concentraţiei de celule prin metoda
diluţiilor limită sau metoda titrului.
Bacteriile lactice se pot determina prin cultivare pe mediul
nutritiv folosind metoda diluţiilor limită, cu incubarea eprubetelor la
35 C timp de 48-72 h. Eprubetele pozitive se caracterizează printr-
un lichid tulbure fără voal, cu o aciditate crescută comparativ cu cea
a mediului iniţial.
Pediococii se dezvoltă prin cultivare pe mediu glucozat prin
inoculare în plăci Petri sterile şi incubare la temperaturi de 28-30 C
timp de 48-72 h. Se face analiza cantitativă şi calitativă a plăcilor cu
evidenţierea pediococilor prin executarea de preparate fixate şi
colorate (tetradă, Gram pozitive).
Bacteriile acetice se determină prin cultivare pe mediul
Hayers repartizat în vase Fermbach astfel încât lichidul să fie în
strat subţire şi să se asigure o bună circulaţie a aerului la suprafaţa
mediului. Incubarea se face la 30 C timp de 5-7 zile când se poate
urmări dinamica de acumulare a acidului acetic, format prin
105
fermentaţie, pe cale titrimetrică. Pe lângă acidifiere, probele
pozitive prezintă la suprafaţa mediului lichid un voal caracteristic.
Testul de creştere prin termostatare
Pentru a favoriza creşterea microorganismelor existente în
proba de analizat se poate face termostatarea la 28 C timp de 6-30
zile a probelor de vin şi periodic se consemnează modificările care
apar ca urmare a activităţii microbiene (tulburare, sediment, voal,
degajare de dioxid de carbon) cu stabilirea prin examen microscopic
sau examen cultural a microflorei predominante.
8. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL MATERIILOR

PRIME ŞI AUXILIARE DIN INDUSTRIA DE MORĂRIT ŞI
PANIFICAŢIE
8.1. Controlul microbiologic al cerealelor
Microorganismele componente ale microflorei externe şi
interne a cerealelor diferă mult în funcţie de structura anatomică a
boabelor, condiţiile de recoltare, transport şi depozitare. Microflora
specifică a cerealelor este formată din bacterii, mai frecvent
întâlnite sunt Pseudomonas herbicola, Pseudomonas fluorescens,
Lactobacillus delbrueckii, bacterii sporulate ale genului Bacillus
(B.subtilis, B.cereus var.mycoides, B.mesentericus ş.a) şi în număr
mai redus mucegaiuri aparţinând genurilor: Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium ş.a).
Evidenţierea mucegaiurilor şi localizarea pe bob
În plăci Petri cu must de malţ agar, cu ajutorul unei pipete
sterile se presează în mediu boabe, distanţate între ele. Plăcile se
termostatează la 25 C timp de 3-5 zile. Se analizează şi se identifică
coloniile dezvoltate în jurul boabelor şi se face interpretarea
rezultatelor. Dacă predomină colonii ale mucegaiurilor din genul
Alternaria, Cladosporium, Fusarium se poate aprecia că cerealele
analizate sunt proaspăt recoltate; când în zona embrionului sunt
prezente mucegaiuri ale genului Aspergillus sau g. Penicillium,
boabele provin din recolte mai vechi şi au o putere mică de
106
germinare ca urmare a secţiunii distructive a mucegaiurilor asupra
germenelui.
Determinarea numărului total de microorganisme
Din proba medie se cântăresc aseptic 10 g boabe şi se
introduc în 90 cm3 ser fiziologic steril. Prin agitare intensivă
microorganismele, care se găsesc la suprafaţa boabelor, trec în
lichid şi în continuare se fac diluţii decimale (I-V). Din trei diluţii
succesive se inoculează câte 1cm3 în medii Geloză peptonată de
carne şi se face termostatarea la 35 C timp de 48 ore. Pentru
determinarea numărului de mucegaiuri, inocularea se face în mediul
Sabouraud cu termostatare la 25 C timp de 3-5 zile.
Interpretarea rezultatelor. Prezenţa în cantitate mare a
bacteriilor nesporulate Gram-negative din g. Pseudomonas
herbicola (colonii galbene) denotă prospeţimea cerealelor şi o
calitate bună a acestora. Când păstrarea cerealelor are loc în
depozite cu umezeală relativă mai ridicată în microfloră pot să
predomine bacteriile genului Micrococcus. Bacteriile sporulate nu
trebuie să depăşească 1% din totalul acestora, prezente pe cereale,
iar numărul lor să fie sub valoarea de 103/g. În cazul cerealelor de
bună calitate, numărul de mucegaiuri se află în limitele de 10 2-
103/g.
8.2. Controlul microbiologic al făinurilor
Determinarea bacteriilor sporulate din g. Bacillus subtilis
Pentru aprecierea gradului de contaminare a făinii cu
bacterii sporulate agenţi ai bolii întinderii pâinii se efectuează
deluții. Diluţiile I şi II se pasteurizează la 75 C timp de 10 min,
perioadă care asigură omorârea formelor vegetative în timp ce
endosporii rezistă la acest tratament. Din probele pasteurizate se fac
inoculări în plăci Petri cu mediu Geloză peptonată de carne. Plăcile
se termostatează cu capacul în jos la 37 C timp de 48 h după care se
face analiza cantitativă şi calitativă.
Interpretarea rezultatelor. Coloniile care aparţin bacteriilor
aerobe sporulate sunt colonii extinse, crateriforme, Gram pozitive şi
107
care prezintă în frotiu atât celule vegetative cât şi endospori tip
bacillus. În funcţie de numărul de bacterii sporulate dezvoltate în
plăci se apreciază calitatea făinii în funcţie de următoarele valori
(tabelul 8.1.).
Tabelul 8.1. Calitatea făinii faţă de numărul de bacterii

sporulate
Calitatea făinii Numărul de bacterii
sporulate /g făină
Făină calitate normală 0 - 200
Făină mediu contaminată 200 - 1000
Făină puternic contaminată peste 1000
Metoda coacerii. Pentru aprecierea gradului de contaminare

cu bacterii sporulate, în laboratorul întreprinderii se poate aplica
fabricarea de probe de pâine cu respectarea factorilor tehnologici
urmată de termostatarea probelor imediat după coacere la 37 C timp
de 3 zile cu urmărirea diurnă a aspectului pâinii şi a modificărilor în
miez. În cazul în care făina are o concentraţie ridicată de bacterii
sporulate ca urmare a faptului că la coacere endosporii nu sunt
distruşi, prin germinare în timpul termostatării pâinii se produce
hidroliza parţială a amidonului şi glutenului aşa încât la ruperea
pâinii miezul este lipicios şi se întinde în fire, având un miros
specific. Dacă aceste modificări apar după 24 h, rezultă că făina este
puternic infectată, iar dacă sunt constatate după 72 h infectarea
făinii este slabă. În funcţie de rezultatele controlului microbiologic
se iau măsuri tehnologice pentru prevenirea alterării pâinii.
Determinarea bacteriilor heterolactice. În cazul făinurilor
folosite la fabricarea pastelor făinoase se recomandă determinarea
prezenţei bacteriilor, care pot produce fermentarea zaharurilor din
făină cu formarea de acid lactic şi gaze (CO2 , H2), ce aparţin
genurilor Enterobacter (E.aerogenes, Bacterium levans) şi
Escherichia, folosind metoda titrului de determinare a bacteriilor
coliforme cu inoculări din diluţii decimale succesive în mediu
108
bulion lactozat, repartizat în eprubete cu plutitori. Se consideră
eprubetă pozitivă dacă după termostatare la 37 C timp de 48-72 h
apar bule de gaz în plutitor. Prezenţa în număr mare a acestor
bacterii în făină poate conduce la acrirea pastelor făinoase în timpul
uscării lente şi apariţia unor bule de gaz, inestetice.
8.3. Controlul microbiologic al drojdiei comprimate

Controlul are ca scop studiul purităţii drojdiei şi a capacităţii
fermentative a acesteia în vederea utilizării în industria panificaţiei.
Controlul macroscopic. Drojdia comprimată de calitate
bună se prezintă ca o masă compactă de culoare cenuşiu-gălbue
deschis, uniformă şi în secţiune prezintă o suprafaţă striată fără
incluziuni străine, cu miros caracteristic.
Controlul microscopic direct poate evidenţia prezenţa
microorganismelor de contaminare, cum ar fi mucegaiurile, care
dau pete caracteristice la suprafaţa calupului de drojdie, sau bacterii
lactice, de putrefacţie ş.a.
Determinarea numărului de celule autolizate. Celulele
moarte în urma autolizei îşi pierd proprietăţile fermentative. Pentru
numărare se execută diluţii prin cântărirea unui gram de drojdie
comprimată şi suspendarea uniformă a celulelor într-un litru de apă.
Din suspensia omogenă se recoltează 10 cm3 şi se amestecă cu 10
cm3 soluţie albastru de metilen cu citrat. După un repaus de 5-10
minute se face numărarea cu camera Thoma a numărului total de
celule şi separat a celulelor autolizate (colorate în albastru). Se face
exprimarea în % a celulelor moarte în funcţie de diluţie şi a
numărului de celule per gram drojdie comprimată.
Evidenţierea mucegaiurilor de contaminare a drojdiei se
poate face prin executarea de preparate umede din zone ale
calupului unde se observă dezvoltarea coloniilor caracteristice,
urmată de izolarea şi separarea coloniilor prin metode scarificate de
obţinere a culturilor pure.
Metode de determinare a puterii de fermentare a drojdiei
comprimate. În laboratorul fabricii se pot executa lucrări practice,
109
simple, prin care se apreciază puterea de dospire a drojdiei. Mai
uzuală fiind metoda bilei de aluat.
Metoda bilei de aluat. Cunoscută şi ca metoda Ostrovski,
determină durata de ridicare a unei bile de aluat preparată în condiţii
standard, ca urmare a creşterii de volum prin degajarea de CO 2 prin
fermentaţie şi reţinut în masa de aluat.
Tehnica de lucru. Se cântăresc 3,12 g drojdie comprimată şi
se amestecă în 50 cm3 apă. După omogenizare într-un mojar se
întroduc 5 cm3 de suspensie de drojdie şi se amestecă cu 7,5 g făină.
Se frământă timp de 5 minute formându-se o bilă de aluat, care se
introduce într-un pahar Berzelius cu 200 cm3 apă cu temperatura de
32 C şi se notează timpul. Prin cronometrare se determină durata de
ridicare a bilei la suprafaţa apei şi se apreciază calitatea drojdiei
astfel:
Tabelul 8.2. Calitatea drojdiei faţă de timpul de

ridicare a bilei de aluat
Timpul de ridicare a bilei de Calitatea drojdiei
aluat, min
10-15 foarte bună
15-22 bună
22-30 satisfăcătoare
peste 30 slabă
Metoda de dospire determină durata de creştere a volumului

de aluat în condiţii determinate.
Tehnica de lucru. Se cântăresc 5 g drojdie comprimată, care
se amestecă cu 160 cm3 soluţie de sare 2,5% cu temperatura de
35 C. Se frământă un aluat cu 280 g făină de grâu păstrată la
termostat la aceeaşi temperatură. Aluatul se introduce într-o formă
specială şi se cronometrează durata de creştere a aluatului până la
înălţimea de 70 mm.
110
8.4. Controlul microbiologic al maielelor şi aluatului la
fabricarea pâinii
Microflora maielelor folosite la fabricarea pâinii prin
procedeul indirect este formată din celule de drojdie
(Saccharomyces cerevisiae), care se pot prezenta în stare activă (în
care se constată prezenţa glicogenului), în stare înmugurită sau sub
formă autolizată când cultura de drojdie folosită la fabricare a fost
de calitate slabă. În maiele se mai întâlnesc bacterii lactice provenite
din făină (g. Lactobacillus) sau din cultura însămânţată la
prepararea maielei aparţinând speciei Lactobacillus delbruecki.
Pentru aprecierea calităţii microbiologice a maielei sau aluatului se
pot efectua următoarele analize:
- se execută preparate umede din maia folosind drept lichid
de suspensie soluţia diluată de Lugol. Prin studiul la microscop în
grosisment 10x45 se observă granulele de amidon colorate în
albastru şi se diferenţiază uşor celulele de drojdie. Se fac observaţii
asupra stării celulelor, care se pot afla în stare înmugurită, iar
celulele active din punct de vedere fiziologic prezintă intracelular
incluziuni de glicogen colorate în brun;
- se execută preparate umede în soluţie 0,1% albastru de
metilen şi se studiază preparatul la microscop. Granulele de amidon
în aceste condiţii nu se colorează, în schimb se pot observa celulele
de drojdie aflate în stare de autoliză, care se colorează în albastru
intens;
- se execută preparate fixate şi colorate simplu din proba de
maia. Se observă atât celulele de drojdie cât şi celulele bacteriene
colorate. Prin numărarea lor se determină raportul dintre celule, care
pentru o maia de calitate bună trebuie să fie de 1:10. Pentru
determinări cantitative se pot folosi metode directe de numărare
(metoda Breed).
111
9. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ZAHĂRULUI
Zahărul destinat consumului ca atare sau folosit ca materie

primă în industria alimentară conţine o microfloră heterogenă
provenită din materia primă (sfeclă de zahăr sau trestie de zahăr) şi
prin contaminare în diverse etape ale procesului tehnologic, la
ambalare, transport.
Recoltarea probelor se face cu ajutorul unei scafe metalice
sterilizată în prealabil prin treceri repetate prin flacără. Aproximativ
250 g zahăr se introduc în borcan steril. Fiecare probă recoltată
pentru analiza microbiologică trebuie sigilată şi prevăzută cu o
etichetă pe care se vor menţiona următoarele date:
- denumirea şi adresa întreprinderii producătoare;
- denumirea produsului, numărul lotului şi data fabricaţiei;
- destinaţia produsului data recoltării probei, numele şi
semnătura persoanelor care au recoltat proba.
Pentru analiza microbiologică, din proba de zahăr se
cântăresc cu precizie l0 g zahăr pe o sticlă de ceas sterilă şi se
dizolvă în 90 cm3 ser fiziologic steril. Din diluţia 1/10 astfel
obţinută se continuă seria diluţiilor decimale în funcţie de gradul
presupus de încărcare şi destinaţia produsului.
METODELE APLICATE LA CONTROLUL

MICROBIOLOGIC AL ZAHĂRULUI
9.1. Determinarea numărului de bacterii aerobe mezofile

Se stabileşte prin încorporarea unei cantităţi de probă în
mediu nutritiv solid şi prin termostatare la 32 C în condiţii de aerare
timp de 48 ore, se numără coloniile dezvoltate care se raportează la
1g produs. Din fiecare diluţie (I-IV) se însămânţează în paralel câte
112
1 cm3 în câte 2 plăci Petri sterile. În fiecare placă se introduc
aproximativ 15 cm3 mediu TEGA și mediu agar nutritiv fluidificat
şi răcit la 45 C. Conţinutul plăcii se omogenizează prin mişcări de
rotaţie în sensuri opuse după care se lasă în repaus la temperatura
camerei până la solidificare. Plăcile Petri însămânţate se plasează cu
capacul în jos în termostat la 32 C ±1 C unde se menţin 48h 3h.
Exprimarea rezultatelor. Coloniile dezvoltate se
examinează cu ochiul liber sau lupa şi se aleg pentru numărare
plăcile care conţin între 30-300 colonii. Se calculează media
aritmetică a numărului stabilit pentru plăcile paralele ale aceleiaşi
diluţii şi se înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzător,
rezultatul obţinut reprezentă numărul de germeni aerobi mezofili la
1 g zahăr analizat.
9.2. Determinarea numărului de drojdii şi mucegaiuri

Din diluţia I-a se însămânţează câte 2 cm3 în câte 5 plăci
Petri sterile şi se adaugă în fiecare placă cîte 15 cm3 must de malţ
agar cu termostatarea plăcilor 3-5 zile în termostat la 25(32) C. Se
numără coloniile de drojdii şi mucegaiuri dezvoltate în cele 5 plăci
(care au provenit dintr-un gram zahăr) şi rezultatul se raportează la
l0 g probă. În continuare se face analiza calitativă a plăcilor cu
evidenţierea speciilor predominante.
9.3. Determinarea bacteriilor sporulate

 Bacterii sporulate aerobe mezofile
Din proba analizată se execută în condiţii aseptice diluţia 1/5
prin cântărirea a 20 g zahăr şi dizolvarea în 80 cm3 apă sterilă.
Pentru inactivarea termică a formelor vegetative se face
pasteurizarea prin menţinerea diluţiei 1/5 pe baie de apă la 80 C
timp de 20 min şi răcirea sub jet de apă rece.
Tehnica de lucru. Din proba pasteurizată și răcită se fac
însămânţări cu câte 2 cm3 în 5 plăci Petri sterile, se adaugă câte
15 cm3 din unul din mediile propuse - mediul TEGA sau mediul,
113
agar nutritiv după fluidizare, şi răcire la 45 C, cu o bună
omogenizare în momentul repartizării în plăci. După gelificarea
mediului se toarnă un nou strat subţire de mediu şi se lasă din nou
să se solidifice la temperatura camerei. Apoi plăcile se
termostatează cu capacul în jos la 32 1 C timp de 48h 3h.
Exprimarea rezultatelor. Coloniile dezvoltate se
examinează din punct de vedere macroscopic şi microscopic.
Numărul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raportează la 10 g
zahăr, prin numărarea coloniilor dezvoltate în cele 5 plăci şi
multiplicarea cu 5.
 Bacterii sporulate termofile, bacterii sporulate –
agenţi de alterare a conservelor prin acrire fără
bombaj
Prin însămânţarea unei cantităţi de probă în mediu specific,
după inactivarea prin pasteurizare a formelor vegetative, se pot
determina bacteriile sporulate termofile prin incubarea plăcilor la
temperatura de 55 C.
Tehnica de lucru. Din diluţia 1/5 pasteurizată se fac
însămânţări a câte 2 cm3 în câte 5 plăci Petri şi se omogenizează cu
10-15 cm3 mediu Peptonă dextoză purpur de bromorezol fluidificat
şi răcit la 45 C. După solidificare, plăcile se termostatează cu
capacul în jos, ambalate în pungi din material plastic, timp de 48h la
55 1 C.
Exprimarea rezultatelor. Se efectuează studiul cantitativ şi
calitativ al coloniilor dezvoltate. Rezultatul obţinut prin însumarea
coloniilor dezvoltate pe suprafaţa şi în profunzimea mediului din
cele 5 plăci Petri înmulţit cu 5 reprezintă numărul de bacterii
sporulate termofile raportat la 10 g zahăr. Din totalul coloniilor,
numărul de bacterii sporulate termofile de acrire fără bombaj este
dat de numărul de colonii care, prin fermentarea glucozei, virează
culoarea mediului de la violet la galben.
114
 Bacterii sporulate anaerobe termofile producătoare de H2S
Se determină prezenţa bacteriilor sporulate anaerobe sulfito -
reducătoare prin însămânţarea unei cantităţi din proba analizată în
mediu specific după inactivarea formelor vegetative şi incubarea la
55 C în condiţii de anaerobioză.
Tehnica de lucru. Din diluţia 1/5 pasteurizată se fac
însămânţări a câte 4 cm3 în eprubete cu mediu fluidificat şi răcit
(Sulfit de sodiu agar și mediu cu tioglicolat) la 45 C şi, după
omogenizare, conţinutul fiecărei eprubete se toarnă în câte un tub
pentru anaerobi de 10/250 mm astfel încât coloana de mediu să fie
de aproximativ 15 cm şi se răceşte sub jet de apă până la
solidificarea mediului. Tuburile însămânţate se incubează la 55 C
timp de 72h 3h.
Exprimarea rezultatelor. Se consideră pozitive tuburile în
care, datorită bacteriilor care produc H2S, apar colonii de culoare
neagră sau s-a produs înnegrirea întregii coloane de mediu.
Rezultatul se exprimă prin raportul dintre numărul de tuburi
pozitive şi numărul de tuburi însămânţate sau cantitativ în funcţie de
numărul de colonii sulfitoreducătoare dezvoltate raportate la
cantitatea de probă luată în analiză.
9.4. Determinarea bacteriilor din genul Leuconostoc

Se stabileşte prezenţa bacteriilor din g. Leuconostoc prin
evidenţierea dezvoltării unor colonii caracteristice pe mediu solid
specific după o prealabilă îmbogăţire a bacteriilor şi incubarea la
temperatura camerei în condiţii de aerobioză.
Tehnica de lucru. Se execută două diluţii cu concentraţia de
5% şi respectiv 15%, realizate în condiţii aseptice în mediu de
îmbogăţire şi mediu cu zaharoză (pentru Leuconostoc
mesenteroides). Probele se menţin la temperatura camerei timp de
5 zile. Apoi din aceste probe se fac treceri cu ansa prin însămânţări
scarificate pe suprafaţa zvântată a mediului cu zaharoză solidificat
în plăci Petri.
115
Interpretarea rezultatelor. Dezvoltarea pe mediu solidificat
a unor colonii sticloase, filante şi observarea în preparatele
microscopice a unor coci şi diplococi încapsulaţi indică prezenţa
bacteriilor din g. Leuconostoc în 5 g şi respectiv 15 g probă de zahăr
analizată.
9.5. Determinarea drojdiilor osmotolerante

Se realizează prin efectuarea de însămânţări din diluţii
decimale în mediu pentru drojdii osmofile (mediu Czapek),
incubare la 25 C timp de 72 h şi numărarea coloniilor de drojdii cu
raportarea la 1g probă de zahăr în analiză.
9.6. Norme microbiologice de apreciere a zahărului

Normele microbiologice pentru zahărul utilizat în
industria conservelor prevăd a lua din acestea 5 probe ale unui lot,
media numărului de bacterii sporulate termofile să nu depăşească
125 spori/10 g, iar în probele izolate nici una să nu conţină mai mult
de 15 spori la l0 g. Bacteriile sporulate termofile anaerobe să fie
absente în cel puţin 2 probe din cele 5 luate în analiză. Bacteriile
sporulate producătoare de H2S pot fi admise în cel mult 2 probe din
5 luate în analiză, iar în probele pozitive numărul maxim de celule
să fie de 5 colonii /l0 g zahăr.
116
BIBLIOGRAFIE
1. Aida Vasile, Microbiologia specială, Galaţi 2009, 86 p.
2. Bahrim G., Evaluarea calităţii microbiologice a alimentelor prin utilizarea
petrifilmelor. Buletinul AGIR nr. 3/2003 http://www.agir.ro/buletine/40.pdf
3. Dan V., Oancea I., ş.a. Controlul microbiologic al produselor alimentare,
Galaţi,1991, 111p.
4. Rubţov S., Sandulachi L., Chilat A. Controlul microbiologic în industria
alimentară, Chişinău 2004, 67p.
5. Sandulachi L., Popescu L., Bulgaru V. Microbiologia generală, Note de curs.
Partea II, Chişinău, Editura Tehnica-UTM, 2015.
6. Sandulachi L., Bulgaru V. Microbiologia generală, Note de curs. Partea III,
Chişinău, Editura Tehnica-UTM, 2016.
7. Simona Ivana MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR Volumul I
http://bibliotecafmvb.ro/doc-site/ma1bib.pdf
8. SM SR EN ISO 707:2012 Lapte şi produse lactate. Ghid pentru eşantionare.
9. SM EN ISO 4833-1:2014 Microbiologia lanţului alimentar. Metoda orizontală
pentru enumerarea microorganismelor. Partea 1: Tehnica de numărare a
coloniilor la 30°С prin metoda turnării în plăci.
10. SM EN ISO 4833-2:2014 Microbiologia lanţului alimentar. Metoda orizontală
pentru enumerarea microorganismelor. Partea 2: Tehnica de numărare a
coloniilor la 30°С prin metoda însămânţării la suprafaţa plăcii.
11. SM EN ISO 6579:2013 Microbiologia produselor alimentare şi furajelor.
Metoda orizontală pentru detectarea bacteriilor de genul Salmonella spp.
12. SM CEN ISO/TS 6579-2:2013 Microbiologia produselor alimentare şi
furajelor. Metoda orizontală pentru detectarea, numărarea şi tipizarea
serologică a bacteriilor de genul Salmonella. Partea 2: Metoda de numărare
miniaturizată a numărului cel mai probabil.
13. SM SR EN ISO 6887-1:2011 Microbiologia produselor alimentare şi
furajelor. Pregătirea probei pentru analiză, a suspensiei iniţiale şi a diluţiilor
decimale pentru examenul microbiologic. Partea 1: Reguli generale pentru
pregătirea suspensiei iniţiale şi a diluţiilor decimale.
117
14. SM SR EN ISO 6887-5:2014 Microbiologia produselor alimentare şi
furajelor. Pregătirea probelor, a suspensiei iniţiale şi a diluţiilor decimale
pentru examenul microbiologic. Partea 5: Reguli specifice pentru pregătirea
laptelui şi a produselor lactate.
15. SM EN ISO 22160:2015 Lapte şi băuturi pe bază de lapte. Determinarea
activităţii fosfatazei alcaline. Metoda (EPAS) cu sistem de fotoactivare
enzimatică.
16. HG nr. 435 din 28.05.2010 Reguli specifice de igienă a produselor alimentare
de origine animală.
17. Reglementarea tehnică „Lapte şi produse lactate‖, Hotărârea Guvernului Nr.
611, din 05.07.2010.
18. Prelevarea probelor şi pregătirea lor pentru analiza microbiologică, conform
SM SR EN ISO 6887-1, SM SR EN ISO 6887-5:2014.
19. Determinarea numărului de bacterii mezofile aerobe şi facultativ anaerobe,
conform SM EN ISO 4833-1, SM EN ISO 4833-26.14.
20. Determinarea conţinutului de microorganisme patogene, inclusiv Salmonella,
conform SM EN ISO 6579 sau SM CEN ISO/TS 6579-2. 6.1518.
21. Determinarea numărului de celule somatice, conform SM SR EN ISO 13366-
2 sau SM SR EN ISO 18330.
22. Determinarea pasteurizării (proba fosfatazei), conform SM EN ISO 22160
sau GOST 3623.
23. Hotărîrea Guvernului nr. 208 din 20.03.2013 cu privire la aprobarea
metodelor de prelevare a probelor pentru determinarea nivelului de
micotoxine în produsele alimentare (Monitorul Oficial al Republicii Moldova
nr. 64-68, art. nr. 262 din29.03.2013).
24. Norma sanitar-veterinară privind prelevarea probelor oficiale de la animalele
vii şi din produsele de origine animală, aprobată prin Hotărîrea Guvernului
nr. 782 din 01.09.2010 (Monitorul Oficial al Republicii Moldova nr. 160-
162,art. nr. 871 din 07.09.2010).
25. Reguli privind criteriile microbiologice pentru produse alimentare, aprobate
prin Hotărîrea Guvernului nr.221 din 16.03.2009 (Monitorul Oficial al
Republicii Moldova nr.59-61,art.nr. 272 din 24.03 2009).
26. Reguli generale de igienă a produselor alimentare, aprobate prin Hotărîrea
Guvernului nr. 412 din 25.05.2010 (Monitorul Oficial al Republicii Moldova
nr. 83-84, art. nr. 484 din 28.05.2010).
27. Norma sanitar-veterinară privind stabilirea unor metode de analiză şi testare a
laptelui materie primă şi acelui tratat termic, aprobată prin ordinul
118
Ministerului Agriculturii şi Industriei Alimentare nr.159 din 07.07.2006
(Monitorul Oficial al Republicii Moldova nr. 025,art. nr. 114 din 23.02.2007).
28. Controlul microbiologic al alimentelor, băuturilor şi produselor farmaceutice
http://www.sartorom.ro/sites/default/files/produse/documente/control_microbi
ologic_ro.pdf.
29. Instrucţiuni privind modul şi periodicitatea controlului asupra conţinutului de
impurităţi microbiologice şi chimice în carne, păsări, ouă şi produse de
prelucrare a acestora
http://www.ansvsa.ro/documente/admin/INSTRUCTIUNI%20CONTROL%2
0microbiologic%20si%20chimic_31725ro.pdf
30. Manual analitic bacteriologic (BAM). FDA. Food & Drug.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm200
6949.htm
31. American Public Health Association. 1984. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 2nd ed. APHA, Washington, DC.
32. American Public Health Association. 1993. Standard Methods for the
Examination of Dairy Products, 16th ed. APHA, Washington, DC.
33. Association of Official Analytical Chemists. 1990. Official Methods of
Analysis, 15th ed. AOAC, Arlington, VA.
34. International Dairy Federation. 1987. Milk and Milk Products: Enumeration
of Microorganisms—Colony Count at 3°C. Provisional IDF Standard 100A.
IDF, Brussels, Belgium.
35. Prelevarea probelor şi pregătirea lor pentru analiza microbiologică, conform
SM SR EN ISO 6887-1, SM SR EN ISO 6887-5:2014.
36. Implementarea standardului HACCP în firmele de curăţenie. Module1.
Hygiene and Microbiologyhttp://hygiene-for cleaners.eu/media/Modules
RO/Module-1-RO- Final.pdf?wb_session_id=cb0136638fc737456 ed29eb
15146ddb
37. Microbial physiology. Microbial metabolism microbio.ucoz.com/
Prelegeri//Lecture_3.ppt https://www.google.com/search?q=4.%09Microbial
+physiology.Microbial+metabolism+microbio.uc oz.com%2FPrelegeri%2F
%2FLecture_3.ppt+&ie=utf-8&oe=utf-8&client=firefox-b
38. PPT Drawing Toolkit-Microbiology http://motifolio.com/microbiology.html
39. http://www.geniebio.ac-aixmarseille.fr/zimages/spip.php?article162
40. http://www.scritub.com/biologie/FIZIOLOGIEBACTERIANA11983.ph
41. E. coli, http://emedicine.medscape.com/article/217485-workup
42. Reseau STI- Biotechnologies http://www.geniebio.ac-aix
marseille.fr/zimages/spip.php?article162
119
43. Staphylococcus aureus http://www.medioscultivo.com/baird-parker-agar-
base-polvo-2/
44. https://www.google.com/search?q=Salmonella,&client=firefox-
b&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjWhpXA4fTRAhUI7xQK
HR-vDq8Q_AUICSgC&biw=990&bih=635
45. Clostridium perfringers, http://www.eolabs.com/tsc-agar-pp1950.html
46. http://www.infektionsnetz.at/BakterienClostridiumBotulinum.phtml
47. Factori care influentează producerea micotoxinelor.
http://www.scrigroup.com/afaceri/agricultura/Factori-care-influenteaza-
prod61753.php
48. Controlul microbiologic al laptelui, produselor lactate acide şi a brânzeturilor
http://www.foodpack.ro/produse/controlul-microbiologic-al-laptelui--
produselor-lactate--acide-si--a-branzeturilor/
49. Analize pentru industria carnii http://laboratorsupremia.ro/carne.html
50. Analize pentru industria laptelui http://laboratorsupremia.ro/lapte.html
51. Analize pentru industria panificatiei
http://laboratorsupremia.ro/panificatie.html
52. http://documents.tips/documents/laborator-microbiologie-speciala2012-
2013.html
53. Regulamentul (CE) nr.2073/2005 din 2005 privind criteriile microbiologice
pentru produsele alimentare, publicat în Official Jurnal of the European
Union.Realizat la Brussels, la15 Noiembrie 2005.
54. Regulamentul (CE) nr.853/2004 al Parlamentului European şi al consiliului
din 29 aprilie 2004 de stabilire a unor norme specifice de igienă care se aplică
alimentelor de origine animală.
55. Regulamentul (CE) nr.852/2004 al Parlamentului European şi al consiliului
din 29 aprilie 2004 privind igiena produselor alimentare.
56. Food poisoning: new detection method for bacterial toxin, 01.04.2015,
Research news https://www.tum.de/en/about-tum/news/press-
releases/short/article/32318/
57. https://www.google.com/search?q=Cultur%C4%83+de+Candida+albicans,+m
ediu+Sabouraud&client=firefox-
b&biw=990&bih=635&tbm=isch&imgil=LKUmewhjzxfMqM%253A%253B
0XipCEnai3S73M%253Bhttp%25253A%25252F%25252Fatlas.microumftgm
.ro%25252Fbacteriologie%25252Fbactgen%25252Fcc.php&source=iu&pf=m
&fir=LKUmewhjzxfMqM%253A%252C0XipCEnai3S73M%252C_&usg=__
2SmJOacwX-eJavaGYqsmSL-MwVw%3D&ved
120
ANEXE
Anexa A1
Tabelul A 1. Tipuri de Petrifilme comerciale [2]

Tip Grup de Condiţii de Particularităţi
Petrifilm microorganisme termostatare
analizate
1 2 3 4
(Petrifilmy east/ Determinarea numărului
PYM mould) 72-120 ore, total de drojdii şi
D rodjii şi 25 ±1ºC mucegaiuri; nu necesită
mucegaiuri adăugarea de antibiotice
sau acid tartric.
Determinarea numărului
PAC Bacterii aerobe 48 ± 2 ore, total de bacterii aerobe;
(Petrifilm mezofile 30 ± 1ºC analiza este eficientă
aerobic prin prezenţa unui
count) indicator, care colorează
coloniile în roşu.
Evidenţierea coliformilor
PCC Bacterii 24 ± 2 ore, totali; analiza este
(Petrifilm coliforme 35 ± 1ºC sau înlesnită de prezenţa unui
coliforms 37 ± 1ºC indicator ce colorează
count) coloniile în roşu;
filmul superior reţine
gazele rezultate prin
fermentaţia substratului
lactoză, cu apariţia
specifică a bulelor de
gaz în jurul coloniilor.
Evidenţierea bacteriilor
PHSCC Bacterii 24 ± 2 ore, coliforme la diluţii mari
(Petrifilm coliforme 32 ...35 ºC în probele de analizat
high (1- 2 celule g-1);
sensivity permite inocularea a 5ml
coliforms probă, sau diluţii ale
count) acesteia; evaluare
similară ca şi în cazul
utilizării Petrifilmelor tip
PCC.
121
Anexa A1(continuare)
1 2 3 4
Dezvoltarea rapidă
P 2000 CC Bacterii 24 ± 2 ore, a bacteriilor coliforme;
(Petrifilm coliforme 35 ± 1ºC indicator de pH foarte
rapid sensibil, cu evidenţierea
coliforms producerii de acid, chiar
count) de la începutul formării
coloniilor;
reducerea timpului de
analiză prin asigurarea
unei creşteri accelerate;
rezultate test prezumtiv
în 6 -14h, cu confirmare
în 18-24h .
Două teste în unul
PEC Escherichia coli 48 ± 2 ore, singur: evaluarea
(Petrifilm 35 ± 1ºC cantitativă a coliformilor
E.coli) sau fecali şi a E. coli;
24 ± 2 ore, conţine indicator
42 ± 1ºC β-glucoronidază pentru
evidenţierea selectivă a
tulpinilor de E. coli;
rezultate pozitive în 24 -
48 h; înaltă selectivitate.
Evidenţierea serotipu-
Petrifilm Kit Escherichia coli 48 ± 2 ore, rilor E. coli
HEC Tientero- 35 ± 1ºC enteropatogene (O1 57:
hemoragic sau H 7 ), care produc
24 ± 2 ore, glucuronaze; se bazează
42 ± 1ºC pe utilizarea membranei
active ELISA, care se
menţine 2 min în contact
cu Petrifilmul, iar după
18h de termostatare
testul pozitiv se
evidenţiază prin
apariţia unor pete gri
pe membrană.
122
Anexa A1(continuare)
1 2 3 3
Evidenţierea bacteriilor
Petrifilm Enterobacterii 24 ± 2 ore, din familia
Enterobacteri 30 ± 1ºC sau Enterobacteriaceae,
aceae 37 ± 1ºC producerea de acid este
pusă în evidenţă
cu ajutorul unui indicator
de pH, ce virează în
galben în mediu acid;
evidenţierea formării de
gaz prin fermentaţia
heterolactică a lactozei.
Petrifilm Staphylococcus 24 ± 2 ore, Evidenţierea selectivă a
Staph Express aureus 37 ± 1,5ºC tulpinilor de
Count System Staphylococcus aureus
(Petrifilm prin formarea de colonii
Staph Express de culoare roşu - violet;
Count Plate + confirmarea prezenţei
Petrifilm Staphylococcus aureus
Staph Express cu ajutorul discului,
Disk) care conţine albastru -
toluidină-O , ce
facilitează
developarea unei zone de
culoare roz (reacţie DN –
ază pozitivă), în jurul
coloniilor specifice.
123
Anexa A 2
Tabelul A 2. Validarea oficială a utilizării Petrifilmelor pentru
evaluarea calităţii microbiologice a alimentelor [2]
Organizaţia Produse pentru Indicator microbiologic
internaţională* care s-a realizat
validarea
Drojdii şi mucegaiuri
AOAC Majoritatea Bacterii aerobe mezofile
alimentelor Bacterii coliforme şi Escherichia
coli
Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC)
pentru determinarea rapidă a
bacteriilor coliforme
Bacterii aerobe mezofile
ANFOR Majoritatea Bacterii coliforme şi Escherichia
alimentelor coli
Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC)
pentru determinarea rapidă a
bacteriilor coliforme
Enterobacterii
Majoritatea Bacterii aerobe mezofile
NMKL alimentelor Bacterii coliforme şi Escherichia
coli
VDIA Lapte şi produse Bacterii coliforme
lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
Evaluarea calităţii mediului
HPB Alte alimente Drojdii şi mucegaiuri
Bacterii coliforme şi Escherichia
coli
Test Kit HEC *
AOAC – Association of Official Analytical Chemists (SUA);
AFNOR– French Standardization Associa ion (Franţa);
NMKL– Nordic Committee of Food Analysis;
VDIA– Victorian dairy Industry Authority (Australia);
HPB– Health Protection Branch, Compendium of Analytical Methods.
124
Anexa A 3
Tabelul A 3. Rezultatele evaluărilor cantitative, prin analiza

microbiologică cu Petrifilme, comparativ cu tehnicile culturale
clasice (Jordano şi colab., 1995)
Produse Indicatori log10 ufc g–1(ml–1) a)
Lapte Bacterii aerobe mezofile 2,69 2,30

pasteurizat Bacterii coliforme 1,30 1,0
Escherichia coli absentă absentă
Drojdii şi mucegaiuri 1,30 1,60
Îngheţată Bacterii aerobe mezofile 5,17 5,08
Bacterii coliforme absente absente
Drojdii şi mucegaiuri absente absente
Ouă Bacterii aerobe mezofile 2,53 absente
Bacterii coliforme absente absente
Carne Bacterii aerobe mezofile 5,81 5,69
tocată Bacterii coliforme 5,60 5,58
a)
Valori medii, pentru cinci probe în paralel (n= 5 ), stabilite prin
analiză statistică(P>0,05).
125
Anexa A4
Controlul microbiologic al
produselor alimentare
Aparat numararea coloniilor - numara

https://www.google.com/search?q=microbiologia+produselor+alim
entare+industria+alimentara&biw=1024&bih=605&source=lnms&t
bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiLgfrciIfLAhUinXIKHXxZCDcQ
_AUIBigB#tbm=isch&q=+colonii+de+microorganisme&imgrc=7X
ZLd0HIjNtqEM%3A
Analizatoare de apă | MultiLab
https://www.youtube.com/watch?v=eBoTtttQ_
126
CUPRINS
INTRODUCERE.................................................................... 3
1. GENERALITĂŢI ............................................................. 5
1.1.Enumerarea și identificarea microorganismelor
realizată într-un laborator acreditat ...................... 5
1.2.Medii nutritive utilizate în controalele microbiologice
oficiale ale produselor alimentare.......................................... 6
1.3. Descrierea şi rezultatele tipice de evaluare a creşterii
microorganismelor .............................................................. 14
2 ETAPE ALE ANALIZEI MICROBIOLOGICE ................. 25

2.1. Sisteme de analiză a probelor...................................... 25
2.2. Interpretarea rezultatelor în analiza microbiologică....... 25
3. METODE DE ANALIZĂ A PRINCIPALELOR GRUPE

DE MICROORGANISME.................................................... 26
3.1. Determinarea microorganismelor-indicatori sanitari........ 26
3.2. Determinarea microorganismelor patogene, agenţi ai
contaminate ....................................................................... 44
3.3. Evidenţa mucegaiurilor producătoare de aflatoxine........ 54
3.4. Determinarea bacteriilor, agenţi de alterare a produselor 56
alimentare
3.5. Determinarea drojdiilor în alimente.................................. 62
3.6. Determinarea mucegaiurilor în alimente.......................... 66
4. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL LAPTELUI ŞI

PRODUSELOR DERIVATE.................................................. 72
4.1 Controlul microbiologic al laptelui crud ......................... 72
4.2 Aprecierea calităţii microbiologice a laptelui.................. 74
4.3.Criteriile microbiologice de siguranţă alimentară şi
igienă a prelucrării laptelui şi a produselor lactate......... 79
4.4. Numărarea selectivă a bacteriilor lactice ..................... 84
127
5. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL CĂRNII ŞI
PREPARATELOR DIN CARNE ........................................ 86
5.1 Controlul microbiologic al cărnii crude şi refrigerate...... 86
5.2. Controlul microbiologic al cărnii tocate ........................ 91
5.3. Controlul microbiologic al cărnii de peşte ..................... 92
5.4 Controlul microbiologic al mezelurilor ......................... 93
6. CONTROLUL MIROBIOLOGIC AL CONSERVELOR 99

6.1. Controlul microbiologic al conservelor din carne........ 99
6.2. Controlul microbiologic al conservelor vegetale.......... 101
7. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL VINULUI........... 104
8. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL MATERIILOR

PRIME ŞI AUXILIARE DIN INDUSTRIA DE
MORĂRIT ŞI PANIFICAŢIE ............................................. 106
8.1 Controlul microbiologic al cerealelor ........................... 106
8.2 Controlul microbiologic al făinurilor............................ 107
8.3. Controlul microbiologic al drojdiei comprimate....... 109
8.4. Controlul microbiologic la maielelor la fabricarea
pâinii ........................................................................... 111
9. CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ZAHĂRULUI.... 112

9.1. Determinarea numărului de bacterii aerobe mezofile. 112
9.2. Determinarea numărului de drojdii şi mucegaiuri........ 113
9.3.Determinarea bacteriilor sporulate ............................... 113
9.4. Determinarea bacteriilor din genul Leuconostoc.......... 115
9.5. Determinarea drojdiilor osmotolerante ....................... 116
9.6. Norme microbiologice de apreciere a zahărului ......... 116
BIBLIOGRAFIE ................................................................... 117

ANEXE ................................................................................... 121
128

Controlul Microb Produselor Alim Ind Metod DS7179627069196830627 PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Controlul Microb Produselor Alim Ind Metod DS7179627069196830627 PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Digitally signed by

UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI

Indicaţii metodice privind

FACULTATEA TEHNOLOGIA ALIMENTELOR

Indicaţii metodice privind

Autori: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

Redactor responsabil: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

DESCRIEREA CIP A CAMEREI NAŢIONALE A CĂRŢII

Cerinţele mereu în creştere ale consumatorilor privind

1.1. Enumerarea şi identificarea microorganismelor realizată

Figura 1.1. Identificarea microorganismelor în probele prelevate [36]

Tabelul 1.1. Indexul mediilor conform BAM

Figura 1.2. Metode de inoculare a probelor prelevate [28]

 Numărul total de colonii

 CMN Standard TTC , Tip 14055; 14005

 Bacterii patogene nefecale

 Microorganisme alterante ale produselor

Figura 1.3. Identificarea în laborator a diferitor specii de

2.1. Sisteme de analiză a probelor

2.2. Interpretarea rezultatelor în analiza microbiologică

3. METODE DE ANALIZĂ A PRINCIPALELOR GRUPE

3.1. Determinarea microorganismelor - indicatori sanitari

Figura 3.1. Modalităţi de efectuare a diluţiilor [52]

Se notează pe capacul plăcii: proba, mediul, diluţia, data.

Rezultatele se exprimă, după caz, în unităţi formatoare de

în care: ΣC – suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;

(prin rotunjire la două cifre semnificative*)

2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai

Conform ISO 4833, pentru o abatere medie pătratică

3) În plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d=1,

4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii,

Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru

Tabelul 3.3. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

Figura 3.5. Plăci Petri compatibile şi incompatibile în testări

Figura 3.6. Proprietăţile culturale ale microorganismelor [39]

Figura 3.7. Caractere culturale ale bacteriilor [39]

 Evidenţierea prezenţei bacteriilor de origine fecală

 Certificarea prezenţei speciilor E.coli

Diferenţierea între specii se face pe baza proprietăţilor după

Calculul şi interpretarea rezultatelor. Folosind, metoda

Escherichia coli, colorarea după Escherichia coli cultivată pe Agar

Figura 3.8. Escherichia coli, proprietăţi culturale şi morfologice [41

Salmonella typhi E.coli + Salmonella SS + E.coli

Staphylococcus aureus Colonii tipice de Staphylococcus aureus

Figura 3.11. Bacillus cereus, proprietăţi morfologice şi culturale [56]

Interpretarea rezultatelor. Se numără coloniile care prezintă

Vedere la microscop Creştere pe placa

Clostridium botulinum izolat pe

 Determinarea bacteriilor de putrefacţie

Determinarea acestora are la bază două principii:

Tabelul 3.6. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

3.3. Evidenţa mucegaiurilor producătoare de aflatoxine

Faza latentă Faza exponenţială Faza exponenţială

Figura 3.14. Fazele de crestere fungică şi localizare a sintezei

3.4. Determinarea bacteriilor, agenţi de alterare a produselor

b) Bacterii sporogene anaerobe, sulfito - reducătoare

c) Bacterii sporogene anaerobe

 Grupele principale de produse pentru care

 Sisteme de cultivare în anaerobioză

Figura 3.16. Sisteme anaerobioză (GASPACK) [52]

3.5. Determinarea drojdiilor în alimente

 Grupele principale de produse pentru care se recomandă

Tabelul 3.9. Compoziţia mediilor de cultură recomandate