CERCETĂRI HISTOPATOLOGICE ŞI IMUNOHISTOCHIMICE

ASUPRA ROLULUI ŞI A IMPORTANŢEI MICROMEDIULUI

MEZENCHIMAL ÎN COLITA ULCERATIVĂ

Conducător ştiinţific,
Prof. Dr. Florica Stăniceanu

Doctorand,
Cristiana Gabriela Popp

2015
Cele mai sincere mulțumiri și recunoștință
Doamnei Profesor Universitar Doctor
Florica Stăniceanu pentru ajutorul
neprețuit pe care mi l-a acordat în calitate
de PROFESOR, de MEDIC, de MENTOR, de
OM, şi, nu în ultimul rând, de coordonator
științific al tezei mele de doctorat.

VĂ MULŢUMESC, DOAMNA DOCTOR!

 Context general
 Colita ulcerativă este o afecţiune inflamatorie colonică cronică
idiopatică.
 Boala apare la adulţii tineri sau la adolescenţi şi evoluează pe
toata durata vieţii, cu perioade de remisiune şi recăderi repetate.
 Evoluţia bolii este, în prezent, impredictibilă şi influenţată de
factori incomplet cunoscuţi.
 Principalul eveniment care declanşează inflamaţia este pierderea
toleranţei imune normale la flora intestinală la indivizi susceptibili
genetic care sunt expuşi la factori declanşatori de mediu.
 Boala se manifestă cu diaree sanghinolentă trenantă pe fond
inflamator general.
 Reprezintă un factor de risc pentru dezvoltarea carcinomului
colonic şi, în mai mică măsură, a limfoamelor colonice.
 Context general
 Prevalenţa mondială a bolii este de 0,5–24,5/100,000
persoane (conform Center for Disease Control and
Prevention). Incidenţa maximă se înregistrează în ţările
occidentale, în special din zonele nordice.
 În România, prevalența este în creștere din cauza adoptării tot
mai largi a modului de viață occidental care însumează mai
mulți factori de risc:
 Igiena riguroasă cu scăderea numărului de infecții digestive și parazitoze
intestinale în copilărie;
 Alimentația bogată în zahăr rafinat, acizi grași polisaturați și aditivi chimici;
 Stres psihologic îndelungat;
 Reducerea perioadei de alăptare;
 Adiministrarea abuzivă de antibiotice și antiinflamatorii nesteroidiene.
În România, în prezent, se estimează că există
aproximativ 600 de pacienți cu diagnostic confirmat
de colită ulcerativă.
 Scop

Stabilirea unor factori histopatologici,

aparținând micromediului mezenchimal al
mucoasei colonice, care:
 să permită stratificarea pacienților în clase
de risc
 să poată face parte dintr-un scor compozit,
clinic, endoscopic, serologic, imagistic și
histopatologic, de apreciere a riscului de
evoluție nefavorabilă și recădere
Acest demers răspunde unor necesități complexe:
 Necesității pacientului de a ști care sunt riscurile cu care se confruntă și
care este desfășurarea pe termen mediu și lung a bolii lui cronice;
 Necesității medicului curant de a avea argumente științifice în alegerea
unui tratament sau în schimbarea planului terapeutic în caz de rezultate
suboptimale;
 Nevoii echipei medicale de a avea dovezi medicale pentru alegerea și
modelarea unui program de supraveghere care să răspundă necesităților
bolii și ale pacientului, dar care se nu reprezinte o povară prea mare
pentru pacient și pentru sistemul de sănătate;
 Nevoii sistemului de sănătate și asigurări de sănătate de a cunoaște
informații despre pacienții cronici pentru a formula programe de sănătate
utile și pentru a adapta facilitățile instituționale, nevoile de personal și
bugetele la necesitățile de îngrijire ale acestor pacienți;
 Necesității cercetătorilor din domeniul farmaceutic de a stratifica pacienții
în funcție de risc și evoluție, în încercarea de a găsi tratamente
personalizate, cu specificitate înaltă pentru fiecare grup de pacienți,
tratamente care să influențeze semnificativ evoluția generală a bolii și să
diminueze morbiditatea legată de aceasta.
 Material și metodă
Studiu prospectiv de cohortă incluzând 45 de pacienți cu
diagnostic cert de colită ulcerativă.
Primul studiu amplu morfologic al modificărilor
histopatologice și imunohistochimice în colita ulcerativă,
interpretate în context clinic și endoscopic.
Pacienții au fost evaluați complet (clinic, serologic,
endoscopic și histopatologic) de două ori, la interval de 12
luni.
Parametrii histopatologici au fost analizați statistic pentru a
stabili dacă au valoare prognostică pentru:
 Evoluție favorabilă (absența unei recăderi în timpul
celor 12 luni de supraveghere; absența oricărei
complicații a colitei ulcerative; încadrarea clinică la a doua
prezentare într-o clasă mai puțin severă de afectare
conform clasificării Truelove şi Witts).
 Recădere
 Evoluție nefavorabilă: 16 pacienți,
astfel:
 recădere: 14 pacienți
 aspect clinic și endoscopic mai
sever al bolii: 2 pacienți
Dintre pacienții cu recădere, doi au
avut și complicații suplimentare: un
pacient colită tuberculoasă, iar alt
pacient displazie epitelială simplă,
identificată cromo-endoscopic și
confirmată histopatologic

Riscul de recădere al pacienţilor cu CU, fără tratament, era considerat a fi

de 70% în 12 luni fără tratament, dar tratamentul reuşeşte să reducă
semnificativ acest risc.
În prezent, riscul anual de recădere în CU este variabil, considerându-se că
toţi pacienţii vor recădea în maxim 9-10 ani, cu un risc mai mare de
recădere în primii ani de la diagnostic.
Numărul de recăderi din studiul nostru (14 pacienţi, reprezentând
aproximativ 31% din cohorta studiată) se înscrie în datele generale ale
frecvenţei anuale a recăderii pentru CU, prezentând concordanţă cu
literatura medicală.
 Parametri evaluați
 Histologici
 Scorul Geboes
 Distorsionarea arhitecturală
 Numărul de neutrofile în lamina propria
 Numărul de eozinofile în lamina propria
 Plasmocitoza bazală
 Leziunile de criptită
 Prezenţa abceselor criptice
 Fibroza în corion
 Leziunile vasculare în lamina propria
 Displazia epitelială
 Parametri evaluați
 Imunohistochimici
 Markeri limfocitari: CD3, CD7, CD20, CD56, CD57
 Proteina anti-apoptotică bcl-2
 Endoglina
 Proto-oncogenele p53 și p21
 TGFβ (factorul de creștere și transformare β)
 VEGF (factorul de creștere derivat din endoteliul
vascular)
 Colagenul I și IV
 Metaloproteinazele matriceale
 CMV (citomegalovirusul)
Rezultate și discuții
 Scorul Geboes
Singurul scor histopatologic
semicantitativ care evaluează
severitatea inflamației indiferent de
extensia bolii sau afectarea clinică a
pacientului și care a fost validat ca
având valoare prognostică.
HE200x

Corelaţia efectuată cu evoluţia pacienţilor a relevat

valori fără semnificaţie statistică (t test two-tailed
p=0,3022), ca şi corelaţia efectuată cu riscul de
recădere (t test two-tailed p=0,2129).
 Lipsa de semnificaţie statistică şi, implicit, de valoare
predictivă a scorului Geboes pentru evoluţia pacienţilor şi
riscul lor de recădere, discordantă faţă de literatură, poate fi
explicată prin faptul că valoarea optimă a scorului Geboes
este reprezentată de utilizarea sa la pacienţii cu remisiune
clinică pentru a evalua riscul de recădere în condiţiile unui
aspect endoscopic relativ normal.
La pacienţii din cohorta noastră, scorul Geboes a fost
calculat pe fragmente biopsice prelevate din ariile de maximă
inflamaţie, pacienţii aflându-se la momentul biopsiei în diferite
stadii ale bolii, practic nici unul nefiind în remisiune clinică.
Aceste observaţii subliniază necesitatea utilizării cu
prudenţă a scorului Geboes în evaluarea prognosticului
pacienţilor şi importanţa găsirii de noi factori cu valoare
predictivă pentru evoluţia CU.
 Corelația scorului Geboes (histologic) cu
scorul Mayo (clinic și endoscopic)
Scorul Geboes se corelează înalt semnificativ cu scorul Mayo, ceea ce arată că
inflamaţia, cuantificată histologic, reprezintă principalul determinant al simptomelor
şi al semnelor clinice, precum şi al aspectului endoscopic (t test two-tailed 0,0006)
Corelaţia foarte bună între valoarea
scorului Mayo cu cea a scorului
Geboes permite utilizarea scorului
Mayo ca surogat pentru evaluarea
activităţii histologice a bolii, în
special în primii ani de evoluţie a
bolii, când riscul de displazie şi
malignitate este foarte redus.
Această observație subliniază încă o
dată oportunitatea unor scoruri
mixte, clinice, endoscopice,
serologice şi histopatologice în
evaluarea riscului de recădere şi/sau
evoluţie nefavorabilă în colita
ulcerativă.
Corelaţii ale numărului de eozinofile cu riscul de recădere
şi cu evoluţia
Acest studiu confirmă mai multe studii anterioare
conform cărora eozinofilele nu sunt un simplu
actor al inflamaţiei cu roluri limitate în eliberarea
de mediatori vasodilatatori şi proinflamatori, ci
sunt jucători activi, care iniţiază, modulează,
menţin şi agravează procesele inflamatorii.
HEx100
Specificitatea mare a
identificării pacienţilor cu
evoluţie favorabilă, respectiv
cu risc de recădere în funcţie
de numărul de eozinofile din
corion susţine rolul extrem de
important pe care aceste
componente ale
micromediului stromal îl deţin
în menţinerea inflamaţiei şi în
potenţarea efectelor acesteia.
 Persistența eozinofilelor după dispariția
neutrofilelor din micromediul stromal
Eozinofilele au o remanenţă prelungită
în ariile de inflamaţie din CU, chiar
după dispariţia polimorfonuclearelor
neutrofile şi diminuarea semnificativă
a infiltratului inflamator cronic.
Persistenţa eozinofilelor după
dispariţia polimorfonuclearelor
neutrofile din infiltratul stromal are
semnificaţie statistică pe lotul studiat
(Fisher test two-tailed p=0,0194)

Persistenţa eozinofilelor pe biopsiile pacienţilor cu CU în remisiune clinică şi

endoscopică este concordantă cu datele din literatură. Unele studii consideră că
eozinofilele întreţin şi modulează inflamaţia, în timp ce altele susţin că eozinofilele
ar putea fi implicate în repararea epitelială.
Această întârziere a dispariţiei eozinofilelor reprezintă cel mai probabil unul din
factorii centrali ai răspunsului suboptimal la terapie şi al recăderilor precoce la
pacienţii cu CU.
 Rolul prognostic al plasmocitozei bazale

Giemsa 100x

Corelaţia valorii plasmocitozei bazale iniţiale cu evoluţia pacienţilor pe durata celor 12 luni de
supraveghere a indicat o înaltă semnificaţie statistică (t test two-tailed p=0,0089), ca şi
corelaţia plasmocitozei bazale cu riscul de recădere în 12 luni (t test two tailed p=0,0018).

Plasmocitoza bazală trebuie inclusă de rutină în decizia terapeutică la

pacienţii cu CU deoarece reprezintă cel mai fidel factor predictor al
recăderii, evoluţia acestor pacienţi putând fi probabil ameliorată printr-un
tratament mai agresiv. Din fericire, acest parametru prezintă o
reproductibilitate buna inter- şi intra-observator şi este relativ facil de
cuantificat semicantitativ pe coloraţii uzuale.
 Imunofenotipul infiltratului limfocitar stromal

În colita ulcerativă, deși limfocitele B, T și NK stromale sunt crescute, ele

nu se corelează semnificativ nici cu evoluţia, nici cu riscul de recădere şi
nu au o variaţie semnificativă statistică pe perioada anului de
supraveghere la care se referă studiul nostru, demonstrând un rol minor în
controlul şi modularea răspunsului imun în CU.
S-a identificat pierderea expresiei CD7 într-un subset semnificativ de
limfocite T (CD3+)
Scăderea semnificativă a expresiei CD7+
de către limfocitele T CD3+ se întâlneşte în
mai multe afecţiuni, cum ar fi boala Kikuci,
infecţia HIV şi neoplazii ale limfocitelor T.
Scăderea semnificativă a expresiei CD7 în
limfocitele T din infiltratul inflamator stromal
din CU este un prim pas al selecţiei
anumitor clone limfocitare, proces care
poate duce spre oligoclonalitate şi
momoclonalitate limfoidă în CU.
Pierderea expresiei pentru CD7 a
limfocitelor T CD3+ este un eveniment
precoce dar reversibil cu rol în selecţia de
populaţii limfocitare oligo- şi monoclonale.
 Supraexpresia corelată a bcl-2, p53 și p21
Proteina anti-apoptotică bcl-2 și proteinele p53 și p21 sunt
supraexprimate corelat în celulele epiteliale și în limfocite
indicând acumularea de mutaţii sub acţiunea stresului oxidativ
şi a acumulării de produşi toxici în micromediul stromal, fiind
necesari în algoritmul de stabilire a unui prognostic pe termen
lung la pacienţii cu colită ulcerativă, algoritm care trebuie să
ţină seamă de riscul de displazie şi malignitate.

p53

bcl-2 p21
Corelația distorsionării arhitecturale cu expresia p53 și p21

HEx40

Distorsionarea arhitecturală este un surogat bun al expresiei p53 şi p21,

în special dacă examinarea preparatelor de rutină nu ridică suspiciunea
de displazie. O agravare semnificativă a distorsionării arhitecturale sau
menţinerea unei distorsionări arhitecturale severe la două examinări
succesive impune efectuarea imunomarcajului pentru p53 şi/sau p21
pentru excluderea unei evoluţii spre displazie.
Distorsionarea arhitecturală este un indicator bun al evoluţiei spre
displazie şi carcinogeneză, putând înlocui în evaluările de rutină
imunomarcajul pentru p53 şi p21, la pacienţii fără displazie certificată
histopatologic.
 Leziunile tind să-şi păstreze topografia, astfel zona cea mai sever
afectată endoscopic şi histologic s-a menţinut între cele două examinări
la 78% din pacienţi.
 Evoluţia pacienţilor vârstnici este mai bună, grevată de mai puţine
recăderi şi de o severitate mai redusă a leziunilor inflamatorii.
 Criptita este un parametru cu importanţă prognostică fiind un bun
indicator al severităţii afectării inflamatorii şi al suferinţei epiteliale induse
de inflamaţie.
 Fibroza în colita ulcerativă este un marker al inflamaţiei cronice, putând
fi folosită cu succes ca parametru de evaluare a duratei bolii în scorurile
histopatologice.
 Expresia stromală a endoglinei (CD105) şi a factorului de creştere
derivat din endoteliul vascular (VEGF) sunt concordant crescute la
pacienţii cu colită ulcerativă, cei doi factori având rol proinflamator şi
putând reprezenta ţinte terapeutice importante.
 Infecţia cu citomegalovirus a fost absentă la pacienţii din studiu pe durata
celor 12 luni luate în considerare, susţinând o prevalenţă relativ redusă a
acesteia la bolnavii cu colită ulcerativă din România
Concluzii
Rezultatul histopatologic al unui pacient cu colită ulcerativă va
cuprinde:
I. diagnosticul pozitiv,
II. eventuale elemente de diagnostic diferenţial;
III. factori de prognostic
• obligatorii:
• prezenţa şi severitatea distorsionării arhitecturale,
• prezenţa şi extensia leziunilor de criptită,
• numărul polimorfonuclearelor neutrofile şi eozinofile din corion (în
evaluare semicantitativă sau cantitativă, exprimată pe suprafaţa
obiectivului mare, în zona cu densitate maximă),
• prezenţa şi severitatea plasmocitozei bazale (exprimată
semicantitativ),
• prezenţa şi extensia fibrozei (exprimată semicantitativ);
• opţionali:
• scorul Geboes,
• procentul celulelor epiteliale şi inflamatorii care exprimă bcl-2, p53 şi
p21,
• expresia stromală a CD105, VEGF şi TGFβ,
• expresia metaloproteinazelor matriceale în stromă şi epiteliu.
 Ipoteze pentru cercetări ulterioare
CORELAREA CU CERCETĂRI SIMILARE CLINICE, ENDOSCOPICE
ȘI SEROLOGICE PENTRU IDENTIFICAREA UNUI SCOR
INTERDISCIPLINAR DE PROGNOSTIC ÎN COLITA ULCERATIVĂ

 Stabilirea caracteristicilor specifice ale bolii în România

(prevalența mult crescută la femei, severitatea mai mare a
afectării la acestea, incidența redusă a infecției CMV, riscul
de tuberculoză intestinală supraadăugată).
 Care este rolul eozinofilelor în bolile inflamatorii digestive și
care este implicarea lor în carcinogeneza esofagiană,
gastrică și colonică?
 Validarea unor potențiale ținte terapeutice pentru
tratamentele biologice: TGFβ, VEGF, endoglină.
 Profesor Doctor Florica Stăniceanu,
Profesor Doctor Ileana Rebedea, Profesor
Doctor Adrian Streinu Cercel, Profesor
Doctor Sabina Zurac, Conferențiar Doctor
Bogdan Mateescu, Profesor Doctor
Cristian Băicuș, Profesor Doctor Radu
Voiosu, Profesor Doctor Maria Florescu,
Dr. Gianina Micu, Dr. Theodor Voiosu

Profesor Doctor Simona Fica, Profesor Doctor Simona Stolnicu, Cercetător

Științific Principal gradul I Doctor Mihail Alecu

Dr. Eliza Grămadă, Dr. Alexandra Bastian, Dr. Luciana Nichita, Dr. Răzvan
Andrei, Dr. Claudiu Socoliuc, Dr. Alina Stoica, Dr. Liana Sticlaru, Dr. Mirela
Cioplea, Dr. Andreea Dumitru, Dr. Marius Nițu, Dr. Alexandra Oniga, Dr.
Maria Bosa, Dr. Alexandra Drăgușin, Dr. Simona Iacob, Dr. Andreea Stan,
Dr. Patricia Stîngă, Dr. Delia Michire, Dr. Gabriel Pop, Dr. Mihai Bușcă, Dr.
Vlad Mageriu, Dr. Cristinel Neacșu, Dr. Sorin Duțulescu, Dr. Caterina Popa,
Dr. Oana Ghinescu, Dr. Andreea Benguș, Dr. Mihai Rimbaș, Dr. Bogdan
Busuoic, Dr. Paul Bălănescu …