CAPITOLUL 5

Scopul cercetării și noțiuni introductive

Ţara noastră se găseşte printre ţările cu prevalenţă încă redusă a bolilor inflamatorii
intestinale, dar, urmând tendinţa ţărilor din Europa, incidenţa şi prevalenţa colitei ulcerative
sunt în creștere în România. Acest aspect se datorează mai ales modificării modului de viață,
cu adoptarea unui mod de viață occidental, care, prin mai mulți factori influențează incidența
CU (dietă, măsuri igienico-sanitare, reducerea infecțiilor digestive în copilărie, stres psihic).
Probabil incidența este crescută și de îmbunătățirea diagnosticului acestor pacienți, care tot
mai frecvent intră în atenția unor centre de diagnostic și tratament care le asigură diagnostic
de certitudine, supraveghere pe termen lung și tratament. Totodată prevalența acestei boli în
România este în creștere ca urmare a unei mai bune monitorizări a pacienților cu CU.
Prevalenţa raportată de un studiu multicentric a CU în România este de 2,42 cazuri/100.000
de persoane, adică de 10-50 de ori mai mică decât în ţările din Europa occidentală şi America
de Nord. [338; 339;340]
În aceste condiții se ridică problema unor factori de prognostic pentru acești pacienți,
factori care să ne ajute să îi încadrăm în clase de risc. Acest demers ar răspunde mai multor
nevoi, astfel:
 Necesității pacientului de a ști care sunt riscurile cu care se confruntă și care este
desfășurarea pe termen mediu și lung a bolii lui cronice;
 Necesității medicului curant de a avea argumente științifice în alegerea unui tratament
sau în schimbarea planului terapeutic în caz de rezultate suboptimale;
 Nevoii echipei medicale de a avea dovezi medicale pentru alegerea și modelarea unui
program de supraveghere care să răspundă necesităților bolii și ale pacientului, dar care se nu
reprezinte o povară prea mare pentru pacient și pentru sistemul de sănătate;
 Nevoii sistemului de sănătate și asigurări de sănătate de a cunoaște informații despre
pacienții cronici pentru a formula programe de sănătate utile și pentru a adapta facilitățile
instituționale, nevoile de personal și bugetele la necesitățile de îngrijire ale acestor pacienți;
 Necesității cercetătorilor din domeniul farmaceutic de a stratifica pacienții în funcție
de risc și evoluție, în încercarea de a găsi tratamente personalizate, cu specificitate înaltă
pentru fiecare grup de pacienți, tratamente care să influențeze semnificativ evoluția generală a
bolii și să diminueze morbiditatea legată de aceasta.
În acest scop, în Spitalul Clinic Colentina se derulează o cercetare prospectivă de tip
cohortă care include toți pacienții cu boli inflamatorii intestinale și care realizează o
1
supraveghere atentă și multidisciplinară a acestora. Utilizând pacienții din această cohortă, am
examinat numeroase trăsături histopatologice și imunohistochimice în vederea identificări
unor modificări cu rol prognostic, modificări care să fie folosite în viitor pentru stabilirea unui
algoritm clinic, endoscopic, serologic și histopatologic de evaluare a prognosticului
pacienților cu CU.
Scopul acestei cercetări este identificarea factorilor histopatologici și
imunohistochimici din micromediul stromal care au rol prognostic în CU.
În această lucrare sunt folosiți mai muli termeni legați de boală, care sunt definiți în
cele ce urmează:
Evoluția favorabilă a fost definită ca îndeplinirea concomitentă a următoarelor
condiții:
1. Absența unei recăderi în timpul celor 12 luni de supraveghere;
2. Absența oricărei complicații a colitei ulcerative;
3. Încadrarea clinică la a doua prezentare într-o clasă mai puțin severă de afectare
conform clasificării Truelove şi Witts (sau în remisiune). [341]
Toate cazurile în care nu au fost îndeplinite condițiile din tabelul de mai sus au fost
considerate ca având evoluție nefavorabilă, considerându-se arbitrar ca fiind o evoluție
nedorită faptul că pacientul, după 12 luni, se găsește în aceeași stare, fără să beneficieze de
ameliorări.
În cele 12 luni de supraveghere, din lotul studiat, 16 pacienți (~35%) au avut evoluție
nefavorabilă, iar 29 de pacienți (~65%) evoluție favorabilă.

Graficul 1 Evoluţia pacienşilor cu CU în cele 12 luni de supraveghere

2
 Recăderea este definită ca reapariţia simptomelor după minim 6 luni de remisiune,
fiind cel mai frecvent dintre evenimentele negative care intervin în evoluția pacienților cu CU.
[342] Orice factor de prognostic trebuie să răspundă cât mai bine necesității de predicție a
riscului de recădere, cu o sensibilitate și o specificitate suficiente pentru a putea fi utilizat de
rutină în îngrijirea pacienților.
În lotul studiat, în timpul celor 12 luni de supraveghere, au apărut recăderi la 14
pacienți (din cei 16 cu evoluție nefavorabilă), astfel că recăderea a fost principala cauză de
evoluție nefavorabilă la pacienții cu CU. Doar doi pacienți au avut alte cauze de evoluție
nefavorabilă, respectiv un aspect clinic și endoscopic mai sever al bolii la evaluarea de după
un an. Dintre pacienții cu recădere, doi au avut și complicații suplimentare în timpul anului de
supraveghere (un pacient colită tuberculoasă, iar alt pacient a dezvoltat displazie epitelială
simplă, identificată cromo-endoscopic și confirmată histopatologic, la evaluarea de
supraveghere.

Graficul 2 Detalii privind evoluţia pacienţilor cu CU în cele 12 luni de supraveghere

Riscul de recădere al pacienţilor cu CU, fără tratament, era considerat a fi de 70% în

12 luni fără tratament, dar tratamentul reuşeşte să reducă semnificativ acest risc. În prezent,
riscul anual de recădere în CU este variabil, considerându-se că toţi pacienţii vor recădea în
maxim 9-10 ani, cu un risc mai mare de recădere în primii ani de la diagnostic. [343] Numărul
de recăderi din studiul nostru (14 pacienţi, reprezentând aproximativ 32% din cohorta
studiată) se înscrie în datele generale ale frecvenţei anuale a recăderii pentru CU, prezentând
concordanţă cu literatura medicală.

3
Graficul 3 Incidenţa recăderii în decurs de 12 luni

4
 CAPITOLUL 6
Material şi metodă

6.1. Lotul studiat: caracteristici

Pacienţii incluşi în studiu s-au adresat Serviciului de Gastroenterologie şi Endoscopie
al Spitalului Clinic Colentina şi au fost diagnosticaţi pe criterii clinice, endoscopice,
imagistice şi histopatologice cu colită ulcerativă. Fiecare a fost informat privind studiul care
se desfăşoară în spitalul nostru (un studiu prospectiv care include pacienţii cu boli inflamatorii
intestinale şi prevede evaluarea clinică, serologică, endoscopică şi histologică anuală cu
înregistrarea datelor într-o bază de date unică, utilizată pentru cercetare). Pe tot parcursul
studiului pacienţii au primit tratamentul considerat optim pentru fiecare caz în parte.

6.1.1 Criterii de excludere:

o Diagnostic incert de colită ulcerativă;
o Prezenţa unei malignităţi în momentul diagnosticului;
o Lipsa acordului scris de participare la studiu.
Astfel, în acest studiu au fost incluşi primii 45 de pacienţi înscrişi în cohorta mare de
pacienţi. Nu au fost excluşi ulterior pacienţi. În decursul anului de studiu, nu au fost pierduţi
din supraveghere pacienţi şi nici nu s-a înregistrat vreun deces.

6.1.2 Lotul de control

Pentru evaluarea aspectului „normal” al mucoasei colonice, au fost selectate 12
fragmente de mucoasă colonică normală, prelevate din piese de colectomie pentru tumori
colonice sporadice, de la mai mult de 5 cm distanţă de limita tumorii. Acestea au fost
prelucrate histopatologic în aceleaşi condiţii, efectuându-se toate coloraţiile speciale şi testele
imunohistochimice lucrate pe probele din cohorta de studiu. Aspectul lor histopatologic şi
imunohistochimic a fost similar, prin urmare a fost considerat normal şi a fost luat drept reper
pentru evaluarea semicalitativă a parametrilor histologici şi imunohistochimici.

6.2. Etapa preanalitică

Fiecare pacient a primit un număr de identificare (ID) şi a fost înregistrat într-o bază
de date, alături de data diagnosticării, vârsta pacientului, durata bolii, precum şi scorurile
colonoscopice corespunzătoare fiecărei investigaţii în parte. În cursul endoscopiei au fost
prelevate biopsii multiple, din arii cu aspect macroscopic normal şi lezional. Toţi pacienţii au
5
fost rechemaţi după 12 luni şi au fost reexaminaţi clinic şi colonoscopic, cu prelevare de
biopsii din zonele lezate şi normale (dacă au fost identificate). Biopsiile au fost prelucrate
similar, examinate şi s-a formulat diagnostic histopatologic.

6.2.1 Prelucrarea histopatologică:

Toate fragmentele tisulare primite au fost prelucrate de rutină conform protocoalelor
interne ale Serviciului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Colentina. Astfel,
fragmentele tisulare au fost fixate imediat după prelevare în formol tamponat 10% pentru
etapa de fixare care a durat între 6 şi 18 ore în funcţie de momentul prelevării şi momentul
începerii prelucrării histopatologice. După fixare, excesul de formol a fost îndepărtat prin
spălare cu apă de la robinet timp de 60 de minute, urmând prelucrarea histopatologică
automatizată cu ajutorul histoprocesorului Microm STP 420 D.

Tabelul 8. Etapele prelucrării histopatologice automate a ţesuturilor incluse în studiu.

Reactiv Durată Temperatură Presiune/Vacuum Timp scurgere
SPĂLARE
Apă 10 min. 23°C P/V 60 sec.
DESHIDRATARE
Alcool etilic 70° 90 min. 37°C P/V 60 sec.
Alcool etilic 80° 105 min. 37°C P/V 60 sec.
Alcool etilic 96° 105 min. 37°C P/V 60 sec.
Alcool etilic absolut 60 min. 37°C P 60 sec.
Alcool etilic absolut 90 min. 37°C P/V 60 sec.
Alcool etilic absolut 90 min. 37°C P/V 60 sec.
CLARIFICARE
Xilen 120 min. 52°C P 60 sec.
Xilen 120 min. 52°C P 60 sec.
Xilen 120 min. 55°C P/V 60 sec.
PARAFINARE
Parafină 45 min. 58°C P 60 sec.
Parafină 75 min. 58°C P 60 sec.
Parafină 120 min. 58°C P 60 sec.
Parafină 120 min. 58°C P 60 sec.

6
 Blocurile de parafină au fost secţionate cu un microtom rotativ semiautomat,
obţinându-se secţiuni de 3 µm, care au fost colorate hematoxilină-eozină conform reţetei
următoare:
Coloraţia hematoxilină-eozină
Etapele de colorare
I. Deparafinare
II. Hematoxilină Mayer – 2-5 minute
III. Spălare
IV. Diferenţiere rapidă - alcool-acid clorhidric
V. Spălare
VI. Eozină - 10-15 secunde
VII. Deshidratare - trei băi de alcool etilic (70°, 96°, absolut)
VIII. Clarificare – 3-5 băi toluen
IX. Montare
Reactivi
Hematoxilină Mayer: hematoxilina 1,5 g + alaun de potasiu 75 g + iodat de sodiu 0,3 g + apă
distilată 1 litru.
Eozină: eozină galbenă 6 g + eozină albastră 6 g + orange G 0,4 g + alcool etilic 70° 700 ml +
soluţie carbonat de litiu 80 ml + acid acetic glacial 3 ml.
Alcool-acid clorhdric: 99 ml alcool etilic 70° + 1 ml acid clorhidric 1N

6.2.2. Constituirea blocurilor multitisulare:

În vederea coloraţiilor speciale şi a testelor imunohistochimice, s-a decis efectuarea de
blocuri multitisulare folosind materialul inclus în blocuri convenţionale de parafină, astfel: au
fost identificate şi extrase din blocoteca Spitalului Clinic Colentina blocurile de parafină
incluzând fragmentele biopsice recoltate de la fiecare pacient la momentul admisiei în studiu
şi la evaluarea de rutină de la 1 an. Fragmentele tisulare reprezentative au fost extrase din
blocuri şi incluse în blocuri multitisulare, astfel: {348; 349]
- în fiecare bloc multitisular au fost incluse biopsii de la 3 pacienţi, fiind incluse, pe
aceeaşi linie două biopsii de la acelaşi pacient;
- fragmentele tisulare au fost numerotate, numerotare care s-a regăsit pe blocul de
parafină;

7
 - toate fragmentele tisulare au fost incluse la acelaşi nivel, pentru a se putea regăsi
integral pe toate secţiunile efectuate ulterior.
- fiecărui bloc multitisular i s-a ataşat un document care a indicat exact numărul
fiecărui fragment tisular, ca şi numărul de identificare al pacientului şi data prelevării biopsiei.

Figura 2. Alegerea şi poziţionarea blocurilor de parafină în vederea efectuării de blocuri

multitisulare

Figura 3 Bloc multitisular incluzând 6 biopsii provenind de la 3 pacienţi, în cele două

momente ale evaluării

8
 A fost aleasă această metodă din mai multe motive:
- economie de reactivi, materiale şi timp de lucru pentru tehnicieni: astfel, 6 grupuri biopsice,
cate două de la trei pacienţi au fost incluse într-un singur bloc, fiind necesară o singură
manevră de tăiere, colorare şi montare. [350]
- reproductibilitatea tehnicii: testele imunohistochimice au fost efectuate concomitent pentru
câte 6 grupuri biopsice, asigurând rezultate concludente, fără diferenţe provenite din
diferenţele de tehnică, reactivi, condiţii de mediu. [351]
- experienţa examinatorului care a folosit această tehnică în cursul unor studii anterioare cu
rezultate foarte bune. [352]
Din fiecare bloc multitisular astfel constituit au fost secţionate mai multe lame, după
secţionare fragmentele tisulare fiind reincluse în blocurile corespunzătoare, pentru a fi
păstrate conform normelor legale. Astfel, s-a asigurat material biopsic necesar pentru acest
studiu, fără a fi afectat diagnosticul pacientului şi fără a epuiza ţesutul sau a deteriora
ireversibil blocul. Pe lamele obţinute astfel s-a repetat coloraţia uzuală (hematoxilină-eozină)
pentru evaluarea nivelului nou la care se găsesc secţiunile şi au fost efectuate coloraţii
speciale (Giemsa, Masson şi PAS – acid periodic şi Schiff) şi teste imunohistochimice.

Figura 4 Bloc multitisular şi lame cu cele 4 coloraţii obţinute din acesta.

9
6.2.3. Coloraţii speciale utilizate
Colorația Giemsa
Etapele de colorare
I. Deparafinare
II. Hidratare
III. Apă distilată
IV. Giemsa (1 parte Giemsa - KIT/ 4 părţi apă) -20-30 minute
V. Spălare în apă distilată + 7-8 picături de acid acetic glacial la 100 ml apă distilată
VI. Diferenţiere cu alcool 96% (până coloraţia devine roz)
VII. Deshidratare şi clarificare în alcool izopropilic
IX. Clarificare în toluen
X. Montare
Reactivi
Kit Giemsa – 1 parte / apă – 4 părți sau
Soluție Giemsa 4 ml (Giemsa pulbere 4 g, Glicerol 250 ml, Metanol pur 250 ml se dizolvă
pulberea în glicerol la 60ºC, amestecând constant; se adaugă metanolul, se agită amestecul și
se lasă la maturare timp de 7 zile; se filtrează înainte de utilizare)
Acetat tamponat cu apă distilată, pH 6,8 – 96 ml

Figura 5 Biopsii colonice de la pacienţi cu colită ulcerativă colorate Giemsa. Se evidenţiază

celulele caliciforme, detaliile nucleare şi prezenţa celulelor inflamatorii intraepitelial

Coloraţia cu acid periodic şi Schiff (PAS)

Etapele de colorare
I. Deparafinare
II. Hidratare
10
III. Apă distilată
IV. Oxidare cu acid periodic 0,5-1% - 5 -10 minute
V. Apă distilată
VI. Reactiv Schiff - 5-15 minute
VII. Apă robinet – 10 minute
VIII. Hematoxilină Mayer – 2-5 minute
IX. Apă robinet
X. Contrastare în soluție saturată de Li2CO3
XI. Apă robinet
XII. Deshidratare
XIII. Clarificare
XIV. Montare
Reactivi
Reactiv Schiff - se aduc 100 ml apă distilată la fierbere; se dizolvă 0,5 g fuxină bazică
mojarată (diamant fuxină); se răceşte la 50ºC şi se adaugă 10 ml acid clorhidric 1N; se răceşte
la 25ºC şi se adaugă 0,5 g metabisulfit de natriu sau potasiu; se etanşează vasul, se înveleşte în
hârtie neagră şi se păstrează 24 h la întuneric (la temperatura camerei sau la frigider la 4ºC); a
doua zi se adaugă 0,5-1 g cărbune activ, se agită şi se lasă 2 minute în repaus; se filtrează; se
păstrează în sticle brune la frigider; culoarea reactivului trebuie să fie de la galben pai la
incolor.

Figura 6 Coloraţie PAS evidenţiind, în roşu-carmin, mucusul din celulele caliciforme. Se

observă, în stânga, numeroase celule PAS+, relativ regulat distribuite în epiteliul colonic. În
imaginea din dreapta se observă o scădere a numărului de celule caliciiforme care sunt inegal
distribuite în epiteliul colonic (depleţie mucipară regenerativă)

11
 Coloraţia MASSON
Etapele de colorare
I. Deparafinare
II. Apă distilată
III. Hematoxilină Weigert - 10 minute
IV. Spălare - în apă , Li2CO3 – 5 secunde
V. Ponceau fuxină – 4 minute (2 părţi Ponceau 1%, 1 parte fuxină acidă 1%, 1 parte acid
acetic glacial)
VI. Spălare (în apă distilată)
VII. Acoperire cu acid fosfomolibdenic 1% - 10 minute
VIII. Anilină orange - 5 minute
IX. Spălare (în apă distilată)
X. Deshidratare rapidă (în alcool absolut)
XI. Clarificare
XII. Montare
Reactivi
Ponceau 1% : Roşu Ponceau 1 g în 99 ml apă distilată
Fucsină acidă 1%: 1 g fuxină acidă în 99 ml apă distilată
Acid fosfomolibdenic 1%: 1 g acid fosfomolibdenic în 99 ml apă distilată
Anilin orange: 0,5 g anilină blue, 2 g orange G, 2,5 ml acid acetic glacial, 95 ml apă distilată

Figura 7 Coloraţie Masson evidenţiind minimă îngroşare a membranei bazale epiteliale prin
depunere de colagen (albastru)

12
6.2.4. Caracteristici ale coloraţiilor uzuale şi speciale folosite:
Coloraţia hematoxilină-eozină (HE) este coloraţia de rutină folosită pentru examinarea
diagnostică a secţiunilor tisulare. A fost folosită ulterior pentru examinarea preliminară în
vederea stabilirii parametrilor histopatologici de prognostic şi formularea scorului Geboes.
Utilizată pentru prima dată în 1863, coloraţia HE este încă utilizată de rutină pentru studierea
morfologiei tisulare, deoarece este o coloraţie cu un contrast foarte bun: nucleii sunt coloraţi
în albastru, prin hematoxilina Mayer, eozina - folosită la contracolorare, colorând citoplasmă
celulară în roz, iar ţesutul muscular şi colagenul în roșu. [344].
Coloraţia Periodic Acid Schiff (PAS) a pus în evidenţă încărcătura cu mucină a
celulelor epiteliale, celulele caliciforme, precum şi membrana bazală. Folosind această
coloraţie a fost evaluată depleţia mucipară întâlnită în CU, precum şi prezenţa
polimorfonuclearelor neutrofile (a căror citoplasmă este PAS pozitivă). Un alt aport al
coloraţiei a fost excluderea prezenţei unor fungi, filamente sau spori, care să complice
evoluţia pacienţilor cu CU în contextul imunosupresiei secundare bolii şi tratamentului. [345]
Coloraţia Giemsa este o modalitate bună de punere în evidenţă a mastocitelor din
infiltratul inflamator, precum şi a nucleilor celulelor. În această coloraţie, nucleii sunt albaştri,
citoplasma - roz, eritrocitele – roşii, granulele mastocitelor – de asemeni, roşii, iar H. pylori se
colorează în albastru [150].
Coloraţia tricromică Masson a fost folosită pentru evidenţierea prezenţei şi a
distribuţiei fibrozei, colagenul fiind colorat în albastru, citoplasmele sunt colorate în roşu-
cărămiziu, iar nucleii în negru (sau albastru foarte închis). [346]

6.2.5 Tehnica imunohistochimică

Generic, imunohistochimia reprezintă combinaţia dintre două ştiinţe: imunologia şi
histochimia, având ca scop evidenţierea proprietăţilor antigenice ale unor substanțe într-un
ţesut, utilizând anticorpi monoclonali sau seruri polireactive.
Am folosit o tehnică de imunohistochimie indirectă tristadială. S-au folosit anticorpi
primari care se leagă de proteinele cu rol antigenic de pe suprafaţa celulelor şi anticorpi
secundari care sunt cuplaţi cu enzime care catalizează o reacţie cromogenică. Enzima este
cuplată covalent cu porţiunea Fc a anticorpului primar; pe ea se plasează substratul
cromogenic care va da reacţia de culoare pentru celulele care poartă proteina căutată. [186;
347]
Etapele tehnicii imunohistochimice
Lamele au fost deparafinate şi hidratate automat (pe un colorator automat).
13
 După hidratare au fost efectuate următoarele etape:
1. spălare cu tampon TBS, pH 7.4, 3 spălări a câte 5 min
2. pretratamente prin fierbere la cuptorul cu microunde în tampon citrat pH8 sau tampon
EDTA pH10 - în funcţie de specificaţiile fiecărui anticorp au fost efectuate diferite tipuri de
3. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
4. inhibarea peroxidazei endogene (Hydrogen Peroxide Block, Labvision, timp de 15
min).
5. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
6. blocarea antigenicităţii nespecifice cu protein block (ultra V block Lab Vision) 10 min
7. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
8. anticorp primar 1 h în cameră umedă la temperatura camerei
9. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
10. anticorp secundar biotinilat antispecie 10 min (anticorp biotinilat anti iepure respectiv
anti şoarece Ultravision detection System Lab Vision)
11. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
12. streptavidin complex (streptavidin peroxidase Lab Vision), 10 min
13. spălare cu tampon TBS, 3 spălări a câte 5 min
14. developare cu diaminobenzidină DAB (DAB plus substrate system, Labvision)
15. spălare apă de robinet
16. contracolorare cu hemalaun Meyer
17. deshidratare şi uscare la colorator automat
18. montare în Entellan.

6.3. Etapa analitică

Fiecare secţiune colorată cu hematoxilină-eozină, Giemsa, PAS, Masson a fost
examinată şi s-a formulat un diagnostic histopatologic complet. Suplimentar, au fost căutate
eventualele criterii de excludere (vezi mai sus).

6.3.1 Parametrii studiaţi:

Studiul s-a structurat complex, incluzând numeroşi parametri clinici, endoscopici,
histopatologici şi imunohistochimici.
Pentru fiecare investigaţie în parte, am primit un protocol de examinare din care am
extras următoarele date:

14
Tabelul 8. Date demografice, clinice şi endoscopice incluse în studiu.
Sexul şi vârsta pacientului
Extensia bolii Proctită
Colită stângă
Pancolită
Starea la momentul examinării Remisiune
Recădere
Boală cronică
Evoluţia în cele 12 luni de supraveghere* Favorabilă
Nefavorabilă
Prezenţa recăderii în cele 12 luni de Prezentă
supraveghere* Absentă

Localizarea fiecărei biopsii Segmentul colonic din care s-a prelevat

biopsia
Scorul Mayo pentru momentul respectiv
* vezi Capitolul 5

Pentru fiecare biopsie, în diagnosticul histopatologic au fost precizate următoarele:

numărul şi dimensiunile fragmentelor examinate (stabilite prin examinare macroscopică,
imediat după prelevare, înaintea fixării), descrierea microscopică completă a
compartimentului epitelial, stromal (mezenchimal) şi a infiltratului inflamator, diagnosticul de
certitudine şi, la nevoie, elemente de diagnostic diferenţial. În vederea cercetării actuale
pentru fiecare pacient s-a evaluat semicantitativ prezenţa leziunilor inflamatorii folosind
scorul Geboes. (vezi mai sus) Au fost identificaţi în literatura medicală alţi parametri
histopatologici cu rol prognostic şi au fost evaluaţi, folosindu-se următoarele modele:

Tabelul 9 Parametri histopatologici evaluaţi

Distorsionarea arhitecturală Absentă 0
Uşoară 1
Moderată, difuză sau multifocală 2
Severă 3
Numărul de neutrofile în lamina În limite normale 0
propria Uşor crescut, fără echivoc 1

15
 Moderat crescut 2
Marcat crescut 3
Numărul de eozinofile în lamina În limite normale 0
propria Uşor crescut, fără echivoc 1
Moderat crescut 2
Marcat crescut 3
Plasmocitoza bazală Absentă 0
Minimă 1
Moderată 2
Marcată 3
Leziunile de criptită Absente 0
Minime, focale 1
Moderate 2
Extinse, severe 3
Prezenţa abceselor criptice Absente 0
Rare 1
Frecvente, sub 10% din criptele prezente 2
Foarte frecvente, peste 10% din criptele 3
prezente
Fibroza în corion Absentă 0
Minimă 1
Moderată 2
Marcată 3
Leziunile vasculare în lamina Absente 0
propria Prezente 1
Displazia epitelială Absentă 0
Prezentă 1

Evaluarea testelor imunohistochimice efectuate s-a făcut conform protocoalelor

interne ale serviciului de anatomie patologică şi au fost cuantificate conform Anexei.
- CD20 este primul antigen de diferenţiere limfocitară B identificat. Imunomarcajul pentru
CD20 este intens pozitiv citoplasmatic în limfocitele B mature, dar negativ în plasmocite.
Unele limfocite T prezintă pozitivitate citoplasmatică slabă pentru CD20 [353]. Prin urmare,

16
au fost evaluate doar celulele cu pozitivitate intensă (limfocite B mature). Dispoziţia
limfocitelor B a fost apreciată astfel: nodular, vag nodular, difuz, focal, intraepitelial.
- imunomarcajul pentru CD3 este pozitiv citoplasmatic în limfocitele T mature şi în celulele
natural killer (NK). Dispoziţia limfocitelor T a fost apreciată astfel: nodular, în coroană, vag
nodular, difuz, focal, intraepitelial. Prezenţa limfocitelor T în CU prezintă o importanţă
deosebită, deoarece există un tratament cu anticorpi anti-CD3 recomandat în CU severă. [354]
- imunomarcajul pentru CD56 este pozitiv citoplasmatic în limfocitele NK, într-un subset de
limfocite T şi în celulele neurale. CD56, numit şi molecula de adeziune a celulelor neurale
(NCAM), face parte din familia moleculelor de adeziune celulară (alături de caderine). În mod
normal, în mucoasa colonică se găsesc puţine celule NK mature cu rol semnificativ în
răspunsul inflamator. [355] Mai multe studii au obţinut rezultate contradictorii şi
neconcludente pentru prezenţa şi rolul celulelor CD56+ în bolile inflamatorii intestinale.
Totuşi, se observă o creştere a celulelor NK în mucoasa pacienţilor cu boli inflamatorii
intestinale, atât în ariile lezate, cât şi în ariile fără leziuni inflamatorii evidente. [356]
- CD57 este pozitiv în citoplasma unei părţi a celulelor NK, precum şi în citoplasma unui
subset de limfocite T (circa 10-20%). Ca şi CD56, este o glicoproteină cu rol de moleculă de
adeziune celulară. În mucoasa normală colonică există un număr redus de celule CD57+, dar
studiile au relevat o creştere semnificativă a numărului acestora în ariile inflamate din CU, dar
nu şi în ariile de mucoasă normală sau la pacienţii cu CU inactivă. [357]
- imunomarcajul pentru CD7 este pozitiv în limfocitele T şi NK. Pierderea expresiei pentru
CD7 a limfocitelor se întâlneşte în limfoamele T şi poate fi un marker al oligoclonalităţii
acestora în contextul inducţiei proliferării limfoide de către inflamaţia cronică. [358]
- bcl-2 este o proteină anti-apoptotică exprimată de limfocitele B şi T, dar şi de celulele
epiteliale supuse stresului oxidativ. Are rol în protecţia celulelor de apoptoza indusă de
radicalii activi de oxigen, expresia sa fiind invers proporţională cu concentraţia acestora în
micromediul stromal. În colita ulcerativă, supraexpresia bcl-2 este asociată cu inhibiţia
apoptozei, chiar şi pentru celulele cu mutaţii genetice, cu prelungirea duratei de viaţă a
limfocitelor dar şi cu favorizarea transformării lor maligne. [359] A fost raportată atât în
celulele epiteliale cât şi în limfocite, ca indicator al stresului oxidativ la care acestea sunt
supuse.
- imunomarcajul pentru citomegalovirus (CMV) a fost efectuat de rutină pe toate biopsiile
colonice, pentru excluderea unei infecţii supraadăugate cu citomegalovirus, care este raportată
ca fiind frecventă şi reprezentând un motiv de evoluţie nefavorabilă. [304]

17
- CD105 (endoglina) este un marker foarte sensibil pentru celulele endoteliale. A fost folosit
pentru a stabili densitatea de capilare, în contextul creşterii angiogenezei ca parte a
răspunsului inflamator şi a remodelării tisulare din CU.
- p53 şi p21 au fost folosiţi pentru a evalua efectul stresului oxidativ asupra celulelor
epiteliale. În mucoasa colonică normală, p53 şi p21 sunt negativi, dar în ariile de inflamaţie,
celulele epiteliale suferă mutaţii ale celor două proteine induse de speciile reactive de oxigen,
pozitivitatea pentru cei doi markeri apărând după o perioadă de evoluţie a inflamaţiei cronice.
Acest mecanism stă la baza riscului crescut de carcinom colorectal întâlnit la pacienţii cu
inflamaţie cronică de lungă durată. [360]
p21 (CDKN1A) este un membru al familiei inhibitorilor kinazelor cyclin-dependente
cu efect de inhibiţie a activităţii mitotice, funcţionând ca supresori tumorali. Mutaţia p21 este
identificată în numeroase cancere (carcinom esofagian, pancreatic, urotelial, sarcoame,
glioblastom). În colita ulcerativă, celule epiteliale supraexprimă p21, ca semn al proliferării şi
al apoptozei crescute care predispun la leziuni ale ADN cu risc crescut de displazie şi
malignitate. [361]
p53 este o proteină cu rol fundamental atât în proliferarea celulară cât şi în moartea
celulară programată. În CU, în celulele epiteliale colonice se acumulează alele mutante ale
genei p53, indicând probabil progresia către carcinogeneză în micromediul inflamator. [324]
- TGFβ (factorul de creştere şi transformare β) este o proteină multifuncţională care
controlează proliferarea şi diferenţierea celulare şi are rol cheie în homeostazia imunologică şi
în reglarea răspunsului imun. În CU, limfocitele din lamina propria sintetizează cantităţi
crescute de TGFβ, dar acesta are funcţionalitate redusă, contribuind astfel la întreţinerea
reacţiei inflamatorii. Nivelurile plasmatice şi tisulare ale TGFβ sunt crescute în formele severe
de CU şi scad în cursul tratamentului, corelându-se cu activitatea clinică şi endoscopică a
bolii. [362]
- VEGF (factorul de creştere al endoteliului vascular) este un factor angiogenic care
stimulează creşterea celulelor endoteliale, angiogeneza şi permeabilitatea capilară. [363] A
fost evaluată expresia sa stromală şi epitelială ca indicator al stresului oxidativ şi hipoxic.
- Colagenul este o componentă a matricei extracelulare care suferă remodelări extensive în
cursul colitei ulcerative. Studii serologice au corelat valorile serice ale diferitelor componente
ale colagenului cu gradul activităţii inflamatorii şi al distrucţiei tisulare în CU. Au fost
determinate colagenul I şi IV în lamina propria. Colagenul I este o formă fibrilară de colagen
care se găseşte în structurile conjunctive dense; colagenul IV este o formă nefibrilară, care
alcătuieşte, alături de laminină, membrana bazală.
18
- Metaloproteinazele matriceale sunt enzime cu rol în remodelarea matriceală atât în
condiţii fizologice cât şi în context inflamator sau tumoral. Au fost evaluate expresiile
stromale ale MMP1, MMP2, MMP9 şi MMP13, ca indicatori ai severităţii distrucţiei şi
regenerării matricei extracelulare. [186; 188]

6.3.2 Prelucrarea statistică a datelor

Pentru analiza statistică a datelor am folosit programele Microsoft Excel şi SPSS

versiunea 16, alegând parametrii obişnuiţi de semnificaţie statistică (p<0,05 şi interval de
încredere de 95%). Am folosit atât variabile categorice cât şi variabile continue şi am precizat,
pe parcursul lucrării, funcţiile statistice folosite. Pentru descrierea grupurilor am folosit
media; pentru compararea a două grupuri am folosit testul t Student şi testul Fisher, iar pentru
cuantificarea asocierii unor variabile am folosit corelaţia Pearson.

6.3.3 Probleme etice

Studiul a fost aprobat de Comisia de Etică a Spitalului Clinic Colentina şi s-a

desfăşurat cu respectarea integrală a prevederilor legale şi deontologice privind drepturile
pacienţilor şi cercetarea medicală.

19
 CAPITOLUL 7
Rezultate

7.1. Date demografice despre lotul studiat

Am efectuat un studiu prospectiv, de cohortă, incluzând 45 de pacienți consecutivi
diagnosticați cu CU, pe baze clinice, endoscopice, serologice și histopatologice. Datele
demografice ale pacienţilor sunt prezentate mai jos.

Tabelul 10 Datele demografice ale pacienţilor incluşi în studiu

Nr.crt Vârstă Nr.crt Vârstă Nr.crt Vârstă Nr.crt Vârstă Nr.crt Vârstă
/Sex /Sex /Sex /Sex /Sex
1 34/B 10 42/F 19 57/B 28 62/B 37 55/B
2 31/B 11 56/B 20 33/B 29 40/B 38 28/B
3 38/F 12 42/B 21 53/B 30 26/F 39 41/B
4 19/F 13 32/F 22 70/F 31 45/B 40 71/B
5 57/B 14 27/B 23 31/B 32 40/B 41 72/B
6 45/B 15 24/B 24 38/F 33 31/F 42 37/B
7 59/B 16 33/B 25 39/F 34 22/F 43 38/F
8 35/B 17 27/B 26 33/B 35 33/B 44 56/B
9 28/F 18 36/F 27 41/B 36 54/B 45 57/F

7.1.1. Sexul
Lotul a cuprins 31 de bărbați și 14 femei, raportul dintre sexe fiind de peste 2:1 în
favoarea bărbaților.

20
Graficul 4 Distribuția în funcție de sex a pacienților cu colită ulcerativă incluși în studiu.

Aceste date nu concordă cu datele din literatură care raportează o prevalență ușor mai
crescută a bolii la bărbați, dar fără semnificație statistică, atât în România cât şi în ţările
europene (maxim 1,5:1 în favoarea bărbaţilor) şi o prevalenţă mai crescută la femei în unele
ţări asiatice şi ale Americii Centrale. [364; 365; 366] Există un studiu de mari dimensiuni care
a identificat o tendinţă specială a incidenţei CU şi anume faptul că din anii 1960, în fiecare
decadă, incidenţa bolii la bărbaţi a fost semnificativ mai crescută decât la femei. Toţi pacienţii
din studiul nostru sunt diagnosticaţi cu colită ulcerativă după 1990, prin urmare ar putea ca
lotul nostru să se înscrie natural în această tendinţă. [367]
Raportat la distribuția pe sexe a populației României (1,05:1 în favoarea femeilor),
prevalenţa CU la bărbați este foarte mare, semnificativă statistic (test Fisher two-tailed
p=0,0142), reprezentând o problemă care trebuie investigată suplimentar. Reamintim că
studiul nostru a inclus 45 de pacienţi consecutivi în funcţie de momentul prezentării lor la
medic pentru examinare în cadrul unei CU deja diagnosticate anterior sau în curs de
diagnosticare, fără a se realiza o selecţie a pacienţilor după criterii alese arbitrar.

7.1.2. Vârsta
În ceea ce privește distribuția pe vârstă a pacienților din studiul actual, aceasta respectă
aspectul bimodal al prevalenței generale, având un vârf în decada a patra de viață și un vârf
mai mic în decada a șasea. Graficul de mai jos ilustrează vârsta pacienților la momentul
includerii în studiu, și nu la momentul diagnosticării, prin urmare vârfurile de prevalență sunt
ușor decalate de cele raportate pentru incidența bolii în literatură.

21
Graficul 5 Distribuţia în funcţie de vârstă a lotului studiat

Datele obţinute concordă cu prevalenţa generală a bolii, care este mai frecventă şi mai
severă la adulţii tineri, în toate studiile pacienţii sub 40 de ani reprezentând peste jumătate din
grupul de pacienţi (57,7% în studiul nostru). [29; 368]
Corelând distribuția pe vârstă în funcție de sexul pacienților din studiu, se observă că,
pentru bărbați, prevalența urmează tendința generală, cu două vârfuri, unul mai mare la
bărbații din a patra decadă de viață și altul mai mic mai tardiv. Pentru femei însă, prevalența
prezintă un singur vârf, în decada a patra de viață, corespunzător cu cel întâlnit la populația de
sex masculin. După aceea, prevalența scade, menținându-se în platou.

Graficul 6 Distribuţia în funcţie de sex şi vârstă a lotului studiat

22
 Corelat cu aceste date, s-a examinat riscul de recădere în funcţie de sex şi vârstă în
cohorta studiată, observându-se că femeile incluse în studiu au prezentat un risc de recădere
mai mare decât bărbații la vârste mai tinere. Astfel, femeile cu vârsta de peste 40 de ani nu au
prezentat recăderi, în timp ce bărbaţii din aceeaşi grupă de vârstă au prezentat recădere în 4
cazuri, fără ca valoarea să aibă semnificaţie statistică (test Fisher two-tailed p=0,4909).

Graficul 7 Frecvenţa recăderilor în funcţie de vârstă şi sex în lotul studiat

Deşi pacienţii mai vârstnici pot asocia patologii suplimentare care să le agraveze
prognosticul, evoluția generală a pacienților vârstnici din studiu a fost mai bună, ei având o
proporție mai mare de evoluții favorabile și o incidență mai scăzută a recăderilor. 11 pacienți
cu vârsta sub 40 de ani au evoluat nefavorabil, reprezentând 39% din numărul pacienților din
acest grup de vârstă cuprinși în studiu, în timp ce doar 5 pacienți cu vârsta peste 40 de ani,
reprezentând 28,5% din grupul lor de vârstă, au avut evoluția nefavorabilă. Totuși, diferența
observată în acest studiu între cele două grupuri de vârstă în ceea ce privește modul de
evoluție nu prezintă semnificație statistică (test Fisher two-tailed p=0,7245).

23
Graficul 8 Reprezentarea evoluţiei în funcţie de vârsta pacienţilor

Aceeași tendință a fost observată și pentru recădere, principalul eveniment responsabil

de evoluția nefavorabilă a pacienților cu CU pe parcursul celor 12 luni de supraveghere
efectuată în cadrul acestui studiu. Astfel, 9 pacienți din grupul cu vârsta sub 40 de ani
(reprezentând 32,1% din grupul lor de vârstă) și 5 pacienți din grupul cu vârsta peste 40 de ani
(reprezentând 28,5% din grupul lor de vârstă) au prezentat recădere. Nici această diferență pe
grupe de vârstă a riscului de recădere nu prezintă semnificație statistică (test Fisher two-tailed
p=0,7245).

Graficul 9 Reprezentarea riscului de recădere în funcţie de vârsta pacienţilor

24
7.2. Date clinice şi endoscopice
7.2.1 Extensia bolii
Unul dintre cei mai importanți factori care influențează prognosticul pacienților cu CU
este extensia bolii. Pacienții cu pancolită au o evoluție mai nefavorabilă, cu mai multe
internări și o morbiditate mult crescută, pe când pacienții cu proctită au o evoluție mai bună.
Am examinat acest factor de prognostic și în studiul nostru. Astfel, am observat că majoritatea
pacienților, 31, reprezentând 68,69% au avut leziuni extinse, încadrate endoscopic în
categoria pancolită, în timp ce doar 5 pacienți (11,11%) au prezentat proctită și 9 pacienți
(20%) au prezentat colită stângă.

Graficul 10 Distribuţia extensiei bolii în lotul studiat

Pacienţii cu vârsta sub 40 de ani au avut mai frecvent leziuni mai restrânse
(aproximativ 65% pancolită, comparativ cu un procent de 86% în rândul pacienţilor cu vârsta
de peste 40 de ani), ceea ce vine în aparentă contradicţie cu evoluţia mai bună a pacienţilor
vârstnici, situaţie care trebuie investigată în studii ulterioare. Totuşi această asociere nu
prezintă semnificaţie statistică.

25
Graficul 11 Corelaţii între extensia bolii şi vârsta pacienţilor

Ulterior, am examinat corelațiile între extensia bolii și evoluția pacienților. Astfel, 15

pacienți cu colită stângă și pancolită au prezentat evoluție nefavorabilă, in timp ce numai 2
pacienți cu proctită au evoluat nefavorabil. Această corelație prezintă semnificație statistică
(test Fisher two-tailed p=0,036).

Graficul 12 Corelaţii între extensia bolii şi evoluţia pacienţilor în cele 12 luni ale studiului

Analiza riscului de recădere corelată cu extensia a relevat rezultate concordante cu

evoluţia. Astfel, doar un pacient cu proctită a prezentat recădere în cele 12 luni de
supraveghere, în timp ce recăderea a fost prezentă la 11 pacienţi cu colită extinsă. Aceste date
nu prezintă semnificaţie statistică (test Fisher two-tailed p=1,000).

26
Graficul 13 Corelaţii între extensia bolii şi riscul de recădere în cele 12 luni ale studiului

Astfel, proctita izolată poate fi considerată factor de prognostic pozitiv în CU. Această
observație poate fi explicată prin faptul că o boală mai puțin extinsă este, cu siguranță, mai
puțin severă decât o boală cu extensie mare. În plus, pacienții cu proctită pot beneficia
suplimentar de tratament local prin clisme și supozitoare, care ajută vindecarea leziunilor și
îmbunătățesc evoluția.
Corelațiile extensiei cu evoluția şi recăderea au fost investigate suplimentar pentru a
încerca să verificăm ipoteza că proctita izolată ar avea o altă evoluţie naturală decât colita
ulcerativă extinsă. Astfel au fost investigate corelațiile dintre extensia bolii și scorurile Mayo
și Geboes la prima evaluare. Scorul Mayo, fiind un scor compozit care asociază evaluarea
obiectivă endoscopică cu evaluări subiective ale stării generale și ale simptomelor, este un
indicator al stării clinice a pacientului; scorul Geboes este un scor semicantitativ strict
histopatologic care evaluează severitatea inflamației indiferent de extensia bolii sau afectarea
clinică a pacientului.
Cum era de așteptat, scorul Mayo la prima prezentare este semnificativ mai crescut la
pacienții cu colită extinsă decât la cei cu proctită (scorul Mayo mediu 4,75 versus 1,8), o
afectare mai extinsă a colonului asociindu-se cu o severitate mai mare a afectării clinice și a
simptomatologiei specifice. Această asociere este semnificativă statistic (t test two-tailed
p=0,0491).

27
 Corelaţie scor Mayo - extensie

Proctită Colită extinsă

Graficul 14 Corelaţii între extensia bolii şi scorul Mayo

Scorul Geboes la prima prezentare este uşor mai mic la pacienții doar cu proctită
(scorul Geboes mediu 4,48 versus 4,53), indicând o activitate histologică mai mică a bolii,
fapt ce se corelează cu scorul Mayo la prezentare. Totuşi, valoarea scorului Geboes nu atinge
semnificaţia statistică (t test two-tailed p=0,9490).

Graficul 15 Corelaţii între extensia bolii şi scorul Geboes

Aspectul corelat al celor două scoruri în funcţie de extensia leziunilor în CU este

prezentat în graficele următoare, în care se observă lipsa corelaţiei dintre cele două scoruri
pentru extensii diferite ale bolii. Astfel, practic toţi pacienţii, indiferent de extensia bolii au un
scor Geboes constant, cu variabilitate minimă, scor care nu se reflectă în starea lor clinică
(evaluată de scorul Mayo) mult mai bună la pacienţii cu proctită decât la cei cu colită extinsă.

28
Graficul 16 Corelaţii între extensia bolii şi scorurile Mayo şi Geboes

7.2.2. Concordanţa zonei cu cea mai severă afectare

Pentru acest studiu, a fost aleasă întotdeauna biopsia din zona cea mai afectată
endoscopic. Deoarece leziunile displazice apar întotdeauna pe ariile cu inflamaţie cronică de
lungă durată, considerăm că prezintă importanţă analiza concordanţei ariilor cu cea mai severă
inflamaţie la cele două investigaţii endoscopice (efectuate la interval de 12 luni).
În mod cert, la ambele biopsii, aria cel mai frecvent afectată sever a fost rectul, 18
dintre biopsiile de la prima prezentare şi 17 dintre cele de la a doua prezentare fiind prelevate
de la acest nivel (circa 40% din totalul biopsiilor prelevate).

A B

Figura 8 Afectare inflamatorie severă la pacienţi cu colită ulcerativă activă cu marcat infiltrat
inflamator polimorf stromal. A, Aspect de distrucţie a unei cripte colonice prin extensia
intraepitelială a infiltratului inflamator polimorf stromal. B, Criptită, abcese criptice şi
modificări regenerative epiteliale semnificative.

29
 Afectarea mai severă a rectului este previzibilă în CU, boală în care majoritatea
pacienţilor au în primul rând afectare rectală care se extinde proximal. Astfel, inflamaţia
severă a mucoasei rectale este patognomonică în CU, fiind o caracteristică constantă a bolii,
care se pierde arareori, după o evoluţie foarte îndelungată. [10]

Graficul 17 Zona cu cea mai severă afectare – aspect comparativ la cele două biopsii.

Graficul 18 Segmentele colonice cu cea mai severă afectare identificată prin biopsii efectuate
la interval de 12 luni.
Examinarea concordanţei ariei celei mai sever afectate între cele două examinări a
relevat o menţinere a segmentului afectat de la o biopsie la alta de 78% (cu alte cuvinte, la 35

30
de pacienţi, segmentul cel mai sever afectat endoscopic a coincis la cele două biopsii, sediul
celei mai severe leziuni inflamatorii menţinându-se pe parcursul celor 12 luni de
supraveghere, în timp ce numai 10 pacienţi au prezentat o variaţie a ariei celei mai sever
afectate).

Graficul 19 Concordanţa zonei cu cea mai severă afectare

De asemenea, se observă din graficele de mai sus că această concordanţă a zonei cu

maximă afectare inflamatorie identificabilă endoscopic este foarte înaltă pentru biopsiile
rectale şi mai redusă pentru biopsiile sigmoidiene, concordanţa redevenind foarte înaltă pe
măsură ce segmentul cel mai afectat este situat mai proximal.

7.2.3. Scorul Mayo este un scor compozit, alcătuit din parametri care ţin de aprecierea semi-
subiectivă sau obiectivă pacientului (numărul anormal de scaune pe zi, prezenţa sângelui în
scaun), de evaluarea endoscopică şi evaluarea semi-subiectivă globală a medicului. Scorul
Mayo are valori între 0 şi 12, datele obţinute la cele două evaluări fiind indicate în graficul de
mai jos.

31
 Graficul 20 Scorul Mayo

Reprezentarea grafică a scorului Mayo ne indică o mai largă distribuţie a acestuia la

prima prezentare şi o concentrare a valorilor în stânga axei (valori mai mici) pentru cea de-a
doua prezentare, indicând o eficienţă relativă a tratamentului cu reducerea previzibilă a
severităţii afectării clinice şi endoscopice.
În studiul nostru, scorul Mayo efectuat la cele două prezentări ale pacienţilor a
prezentat o înaltă concordanţă (test Student two-tailed p<0,001), valoarea sa la prima
prezentare având semnificaţie predictivă înaltă pentru valoarea sa la a doua prezentare.

Graficul 21 Evoluţia scorului Mayo în cele 12 luni de supraveghere

Deoarece scorul Mayo a prezentat o concordanţă mare între valorile obţinute la cele
două investigaţii, am examinat în continuare corelaţia acestuia cu riscul de recădere.

32
 Astfel, pacienţii fără recădere au avut o valoare mai mică a scorului Mayo la prima
prezentare comparativ cu cei care au prezentat recădere în timpul celor 12 luni de
supraveghere (3,50 comparativ cu 4,76). Această valoare nu prezintă valoare statistică (t test
p=0,2586)

Graficul 22 Corelaţia scorului Mayo cu riscul de recădere

În ceea ce priveşte evoluţia, scorul Mayo a fost mai mic la prima prezentare la
pacienţii care au avut ulterior evoluţie favorabilă (3,54 versus 4,79), corelaţie de asemenea
fără semnificaţie statistică (t test p=0,2517).

Graficul 23 Corelaţia scorului Mayo cu evoluţia

33
 Lipsa de semnificaţie statistică a corelaţiei între scorul Mayo la prezentare şi evoluţia
pacienţilor precum şi riscul lor de recădere este susţinută şi de alte studii şi se datorează
probabil erorilor determinate de subiectivismul pacientului în aprecierea unor componente ale
scorului). Deşi un instrument util în prognosticul general al pacientului, scorul Mayo nu se
dovedeşte la fel de util în predicţia unor parametri obiectivabili cum este evoluţia şi recăderea.
Prin urmare, reprezintă un parametru cu utilitate redusă în cercetarea CU, fiind totuşi necesar
la fiecare evaluare a pacientului pentru a avea o imagine a evoluţiei sale atât obiective cât şi
subiective. Valoarea sa predictivă este extrem de limitată şi este necesară folosirea de rutină a
altor markeri minim invazivi pentru încadrarea pacienţilor cu CU în clase de risc.

7.3. Parametri histopatologici

7.3.1. Scorul Geboes este un scor histopatologic creat şi validat pentru a oferi un instrument
viabil şi reproductibil de evaluare a severităţii histologice a inflamaţiei în CU, instrument care
să aibă şi valoare predictivă.
Scorul Geboes cuantifică într-o manieră simplă mai mulţi parametri histopatologici,
epiteliali şi stromali, reprezentând o evaluare globală a leziunilor semnificative în colita
ulcerativă.

Graficul 24 Scorul Geboes

Reprezentarea grafică a scorului Geboes la cele două prezentări indică o distribuţie

oarecum echivalentă a acestuia în cele două jumătăţi ale axei orizontale indicând lipsa unei
ameliorări evidente a acestuia în cursul celor 12 luni de tratament. Aceasta informaţie,

34
coroborată cu evidenta ameliorare a scorului clinico-endoscopic Mayo, ne arată că există o
remanenţă semnificativă a leziunilor histologice după scăderea severităţii afectării clinice şi
endoscopice, remanenţă care subliniază necesitatea utilizării microscopiei ca unealtă în
afirmarea vindecării în CU, evaluarea clinică şi endoscopică aducând informaţii incomplete
despre severitatea reală a afectării inflamatorii.
Am investigat gradul de corelaţie al valorilor scorului Geboes la cele două prezentări,
verificând în ce măsură acesta are valoare predictivă pentru severitatea inflamaţiei
microscopice. Am observat absenţa corelaţiei semnificative statistic în ceea ce priveşte scorul
Geboes (test Student two-tailed p=0,4723), ceea ce înseamnă că valorile iniţiale ale acestuia
nu prezic valorile obţinute la investigaţia efectuată la 12 luni, severitatea leziunilor
histopatologice evoluând variabil.

Graficul 25 Evoluţia scorului Geboes

Am efectuat în continuare corelaţii ale scorului Geboes cu scorul Mayo pentru a vedea
concordanţa acestora şi, implicit, valoarea scorului Geboes în evaluarea globală a pacienţilor
cu CU, scorul Mayo dovedindu-se un indicator bun al stării clinice a pacienţilor.
Totodată am efectuat corelaţii între evoluţia celor două scoruri de la prima la a doua
prezentare. Cele două scoruri au evoluat corelat, legătura dintre ele prezentând o semnificaţie
statistică foarte înaltă (t test two-tailed 0,0006).

35
Graficul 26 Corelaţii ales scorurilor Mayo şi Geboes

Corelarea suplimentară a scorului Geboes cu evoluţia a obţinut, surprinzător, valori

mai scăzute ale acestuia la pacienţii cu evoluţie ulterioară nefavorabilă (4,18 faţă de 4,70) şi
valori mai mari la pacienţii care nu au suferit recădere în următoarele 12 luni (4,72)
comparativ cu cei cu recădere (4,09). De asemenea, aceste rezultate sunt lipsite de
semnificaţie statistică (p=0,3022 pentru corelaţia cu evoluţia şi p=0,2129 pentru corelaţia cu
riscul de recădere).

Graficul 27 Corelaţia scorului Geboes cu evoluţia

36
Graficul 28 Corelaţia scorului Geboes cu riscul de recădere

În contextul acestor observaţii contradictorii cu literatura medicală [261] am stabilit o

valoare de cut-off pentru scorul Geboes la 3,1 şi am investigat prezenţa corelaţiilor în acest
context.
Corelaţia efectuată cu evoluţia pacienţilor a relevat valori fără semnificaţie statistică (t
test two-tailed p=0,3022), ca şi corelaţia efectuată cu riscul de recădere (t test two-tailed
p=0,2129).

Graficul 29 Corelaţia scorului Geboes cu evoluţia pentru valoarea de cut-off de 3,1

37
Graficul 29 Corelaţia scorului Geboes cu riscul de recădere pentru valoarea de cut-off de 3,1

Corelaţia valorii medii a scorurilor Mayo şi Geboes la pacienţi împărţiţi în funcţie de

prezenţa recăderii a arătat o creştere corelată a acestor valori pentru pacienţii care au recăzut
în cele 12 luni de urmărire, corelaţie care nu s-a menţinut şi în ceea ce priveşte împărţirea
pacienţilor în funcţie de modul de evoluţie (favorabilă sau nefavorabilă). Această observaţie
este explicabilă prin faptul că severitatea afectării clinice, endoscopice şi histopatologice este
mult mai amre în timpul afectării de tip boală activă – puseu acut decât în orice altă fază a
bolii.

Graficul 30 Corelaţii ale scorurilor Mayo şi Geboes cu evoluţia şi riscul de recădere

7.3.2. Distorsionarea arhitecturală

Distorsionarea arhitecturală din CU este urmarea inflamaţiei prelungite cu ulceraţie şi
reepitelizare şi a remodelării permanente a matricei extracelulare. Prin urmare, distorsionările
arhitecturale sunt direct corelate cu compartimentul stromal şi anume cu componenta de

38
matrice extracelulară a acestuia. Doar 3 dintre cele 90 de biopsii evaluate în acest studiu nu au
prezentat distorsionare arhitecturală semnificativă.

Figura 9 Imagini de distorsionare arhitecturală la pacienţi cu colită ulcerativă incluşi în

studiu. Se observă inegalitatea criptelor precum şi a distanţei dintre acestea, precum şi
aspectul pseudo-fuzionat al unor cripte (stânga). Ambele biopsii prezintă activitate
inflamatorie redusă, cea din stânga prezentând un infiltrat inflamator nodular în corionul
profund. Suplimentar, se observă marcată hiperplazie a muscularei mucoasei (dreapta).

Distorsionare
arhitecturală severa
Distorsionare
arhitecturală moderată
Distorsionare
arhitecturală minimă
Fara distorsionare
arhitecturala

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 31 Prezenţa distorsionării arhitecturale pe cele două biopsii din studiu

Evaluarea semicantitativă a distorsionării arhitecturale întâlnite la pacienţii cu colită

ulcerativă a indicat agravarea distorsionării arhitecturale în cele 12 luni ale supravegherii.

39
 Variaţia valorii medii a
distorsionării arhitecturale

Distorsionare
arhitecturala 1
Distorsionare
arhitecturala 2

Graficul 32 Variaţia distorsionării arhitecturale în intervalul de 12 luni al studiului.

Cele două valori atribuite severităţii distorsionării arhitecturale nu se corelează între

ele, distorsionarea arhitecturală neevoluând liniar. Astfel, deşi în medie distorsionarea
arhitecturală a pacienţilor s-a accentuat în timp, această accentuare nu a fost proporţională cu
severitatea distorsionării arhitecturale iniţiale.

Graficul 33 Evoluţia distorsionării arhitecturale la pacienţii incluşi în studiu

Faptul că distorsionarea arhitecturală nu evoluează liniar arată că ea nu este un proces

de sine stătător, ci este influenţată de factori externi, fiind doar un răspuns al epiteliului la
modificări care au loc în compartimentul mezenchimal. Epiteliul în sine, deşi declanşator
probabil al răspunsului inflamator, rămâne doar martor ar inflamaţiei, arhitectura sa fiind
remaniată proporţional cu aceasta. Pentru a examina această ipoteză am investigat corelaţia

40
distorsionării arhitecturale cu variaţia scorului Geboes, fără a obţine rezultate semnificative
statistic (t test two-tailed p=0,4846).

Graficul 34 Corelaţii ale scorului Geboes cuevoluţia distorsionării arhitecturale

Dat fiind că remodelarea matricei extracelulare se face mai ales sub acţiunea
polimorfonuclearelor neutrofile, am corelat evoluţia distorsionării arhitecturale cu numărul
acestora. Această corelaţie s-a dovedit a fi semnificativă statistic (t test two-tailed p=0.0067),
indicând faptul că numărul de neutrofile în lamina propria influenţează distorsionarea
arhitecturală în mod direct.

Graficul 35 Corelaţii ale numărului de polimorfonucleare neutrofile stromale cu

distorsionarea arhitecturală

41
 Deoarece mai multe studii corelează prezenţa de eozinofile în micromediul stromal al
mucoasei în CU cu remodelarea mucoasei şi explică acest fapt prin toxicitatea exercitată de
granulele din citoplasma eozinofilelor asupra celulelor epiteliale şi asupra micromediului
mezenchimal, am corelat prezenţa eozinofilelor cu remodelarea arhitecturală. [369; 370; 371]

Corelaţie între evoluţa distorsionării

arhitecturale şi evoluţia numărului de
eozinofile

Evolutie arhitectura
Evolutie eozinofile

Graficul 36 Corelaţii între numărul de polimorfonucleare eozinofile stromale şi

distorsionarea arhitecturală

Analiza statistică a datelor obţinute a indicat că numărul de eozinofile la prima

prezentare nu se corelează semnificativ cu evoluţia remodelării epiteliale ulterioare (t test
two-tailed p=0,5974). Nici variaţia numărului de eozinofile nu s-a corelat statistic cu variaţia
distorsionării arhitecturale (t test two-tailed p=0,7726).

În continuare, s-a căutat corelaţia distorsionării arhitecturale cu evoluţia. S-a observat

că distorsionarea arhitecturală se accentuează indiferent de evoluţia pacienţilor, fiind corelată
mai mult cu durata bolii, decât cu evoluţia acesteia. Cele două grafice ale variaţiei
distorsionării arhitecturale au un traseu aproape paralel, observându-se doar că în cazul
pacienţilor cu evoluţie nefavorabilă distorsionarea arhitecturală este mai severă, atât la
prezentare cât şi la evaluarea de la un an. Această diferenţă nu este semnificativă statistic (t
test two-tailed p=6056).

42
Graficul 37 Corelaţii ale distorsionării arhitecturale cu evoluţia pacienţilor

Această evoluţie nefavorabilă a distorsionării arhitecturale, previzibilă în contextul

prelungirii inflamaţiei cronice şi deci a remodelării epiteliale continue, nu are totuşi
semnificaţie statistică (t test two-tailed p=0,1986).

Graficul 38 Variaţia distorsionării arhitecturale în funcţie de evoluţia pacienţilor

În ceea ce priveşte corelaţia distorsionării arhitecturale cu riscul de recădere, aceasta

urmează acelaşi model ca şi cea de mai sus, cele două grafice fiind paralele, cu o mai severă
distorsionare arhitecturală la pacienţii care au suferit recădere, dar fără semnificaţie statistică.
(t test two-tailed p=0,7052).

43
Graficul 39 Corelaţii ale distorsionării arhitecturale cu riscul de recădere

Accentuarea distorsionării arhitecturale la pacienţii cu CU este un eveniment previzibil

în timp şi este remarcat de toate studiile care au examinat această problemă. [10; 140] Ea
reprezintă un factor de risc pentru displazie şi carcinom recto-colonic şi este considerată un
parametru care trebuie raportat de rutină pentru toate biopsiile colonice din bolile inflamatorii
intestinale. Lipsa semnificaţiei statistice a evoluţiei distorsionării arhitecturale din acest studiu
este determinată cel mai probabil de durata scurtă a perioadei de supraveghere, arhitectura
epitelială fiind alterată de perioade mai lungi de evoluţie a inflamaţiei, cu episoade repetate de
ulceraţie şi vindecare.

Figura 10 Ulceraţii şi distorsionări arhitecturale severe la pacienţi cu colită ulcerativă activă.

În ambele imagini se observă marcat infiltrat inflamator polimorf în corion, severe modificări
regenerative epiteliale şi depleţie mucipară. Suplimentar, atrofia mucoasei şi marcată fibroză
în corion (stânga)

44
7.3.3. Eozinofilele din lamina propria
Importante componente ale micromediului mezenchimal, eozinofilele şi-au dovedit
implicarea în menţinerea homeostaziei compartimentului mezenchimal, în răspunsul imun
înnăscut, în remodelarea mucoasei, în angiogeneză şi în întreţinerea răspunsului inflamator în
CU. 84 dintre cele 90 de biopsii examinate au prezentat creşterea numărului de eozinofile în
lamina propria, câte 42 din fiecare set.

Figura 11 Numeroase polimorfonucleare eoezinofile în corionul mucoasei (stânga) şi într-un

ţesut de granulaţie care însoţeşte o ulceraţie (dreapta) în colita ulcerativă.

Graficul 40 Variaţia numărului de eozinofile din corion în cele 12 luni cuprinse în studiu.

Am investigat corelaţiile numărului de eozinofile cu evoluţia pacienților şi cu riscul lor

de recădere.

45
Graficul 41 Corelaţia numărului de eozinofile stromale cu evoluţia pacienţilor

Am observat o creştere a numărului de eozinofile între cele două investigaţii ale

pacienţilor cu CU, creştere mai importantă la pacienţii cu evoluţie nefavorabilă. Numărul de
eozinofile din lamina propria poate prezice cu o specificitate înaltă, de 93%, (dar o
sensibilitate foarte redusă) evoluţia nefavorabilă a pacienţilor cu CU. Astfel, pacienţii cu un
număr mic de eozinofile în lamina propria vor evolua cel mai probabil favorabil, în timp ce
numărul mare de eozinofile din lamina propria nu este obligatoriu corelat cu o evoluţie
nefavorabilă.
În ceea ce priveşte corelaţia numărului de eozinofile cu riscul de recădere la pacienţii
din studiul nostru, valorile obţinute au fost asemănătoare cu cele privind evoluţia. Pacienţii
care au recăzut au prezentat un număr mai mare de eozinofile decât cei care nu au suferit
recăderi, numărul de eozinofile crescând aproximativ paralel în ambele grupuri de la prima la
a doua biopsie. Numărul de eozinofile din lamina propria poate prezice, de asemenea, cu
specificitate înaltă (92%) riscul de recădere.
Corelaţiile între numărul de eozinofile şi evoluţia pacienţilor, respectiv riscul lor de
recădere au evidenţiat că acestea prezintă semnificaţie statistică înaltă. Astfel, pentru ambele
variante, valoarea P a testului t a fost de sub 0,0001, indicând o strânsă corelaţie între numărul
de eozinofile şi riscul de recădere, respectiv de evoluţie nefavorabilă la pacienţii cu CU.

46
Graficul 42 Corelaţia numărului de eozinofile stromale cu riscul de recădere

O observaţie din studiul nostru, confirmată de literatură, este aceea că eozinofilele au o

remanenţă prelungită în ariile de inflamaţie din CU, chiar după dispariţia
polimorfonuclearelor neutrofile şi diminuarea semnificativă a infiltratului inflamator cronic.
Astfel, absenţa neutrofilelor din infiltratul inflamator din lamina propria a fost
observată pe 19 biopsii (11 din primul grup şi 8 din cel de-al doilea). Dintre acestea, 15
biopsii au prezentat un număr crescut de eozinofile în lamina propria (7 din primul grup şi
toate cele 8 din al doilea grup). Persistenţa eozinofilelor după dispariţia polimorfonuclearelor
neutrofile din infiltratul stromal are semnificaţie statistică pe lotul studiat (Fisher test two-
tailed p=0,0194)

Graficul 43 Remanenţa eozinofilele în micromediul stromal după dispariţia neutrofilelor

47
 Deoarece eozinofilele circulante şi din lamina propria colonică au fost incriminate în
declanşarea şi severitatea simptomelor din CU, precum şi în întreţinerea inflamaţiei stromale,
[369] am investigat corelaţia numărului de eozinofile cu scorul Mayo, respectiv cu scorul
Geboes. Corelarea globală a celor a numărului de eozinofile şi corionul mucoasei colonice şi
scorul Mayo, fără a ţine cont de momentul biopsiei, a indicat o valoare extrem de
semnificativă statistic (t test two-tailed p<0,0001), susţinând înalta concordanță a celor doi
parametri.
Pe de altă parte, corelarea globală a numărului de eozinofile cu scorul Geboes a
indicat, de asemenea, o valoare extrem de semnificativă statistic (t test two-tailed p<0,0001),
arătând că inflamaţia generală este strâns legată de numărul de eozinofile din lamina propria.

În continuare, am corelat evoluţia numărului de eozinofile cu evoluţia scorului Mayo

obţinând, de asemenea o valoare cu înaltă semnificaţie statistică (t test two-tailed p=0,0008).
În schimb, corelaţia evoluţiei numărului de eozinofile cu scorul Geboes nu a oferit o valoare
semnificativă statistic (test two-tailed p=0,9087).

Graficul 44 Corelaţii ale numărului de eozinofile din micromediul stromal şi evoluţia

scorurilor Mayo şi Geboes

7.3.4. Neutrofilele din lamina propria şi din epiteliu

Principalul indicator al activităţii inflamaţiei în CU este numărul de neutrofile din
infiltratul inflamator, atât stromal cât şi epitelial. Atrase în focar de mai multe mecanisme,
polimorfonuclearele neutrofile întreţin inflamaţia, determină toxicitate asupra celulelor

48
epiteliale şi declanşează degradarea matricei extracelulare. Importanţa lor în CU este dovedită
şi de efectele pozitive pe care tratamentul cu afereză absorptivă a neutrofilelor îl are în
formele acute ale bolii. [372] Neutrofilele au fost prezente în număr crescut în lamina propria
pe 71 de biopsii din cele 90 examinate.

Figura 12 Numeroase polimorfonucleare neutrofile în corion şi intraepitelial la paxienţi cu

colită ulcerativă.

Graficul 44 Evoluţia numărului de neutrofile din infiltratul inflamator stromal pe durata celor
12 luni ale studiului

Am examinat, astfel, rolul predictiv al neutrofilelor din lamina propria, respectiv din
epiteliu (oglindite de leziunile de criptită) pentru evoluţia pacienţilor cu CU. Corelaţia între
numărul de neutrofile din lamina propria şi evoluţia pacienţilor nu prezintă semnificaţie
statistică (t test two-tailed p=0,3245), ca şi corelaţia dintre numărul de neutrofile şi riscul de
49
recădere (t test two-tailed p=0,7306). Astfel, numărul neutrofilelor din corion nu prezintă
valoare predictivă pentru evoluţie.

Graficul 45 Corelaţii între numărul de neutrofile din corion şi evoluţia pacientului

Pentru a identifica dacă numărul de neutrofile din corion este legat de severitatea
afectării clinice şi endoscopice, am realizat corelaţii între acesta şi scorul Mayo, iar pentru
evaluarea corelării răspunsului inflamator al mucoasei cu numărul de neutrofile am realizat
corelaţii cu scorul Geboes.
Evaluarea globală a scorului Mayo corelat cu numărul de neutrofile din lamina
propria, indiferent de momentul biopsiei, respectiv a scorului Geboes a indicat corelaţii înalt
semnificative între aceşti parametri (t test two-tailed p<0,0001 în ambele situaţii).

Corelaţie între evoluţia scorurilor

Mayo şi Geboes şi evoluţia numărului
de neutrofile din corion

Geboes
Neutrofile
Mayo

Graficul 46 Corelaţii între nu,ărul neutrofilelor din corion şi scorurile Mayo şi Geboes

50
 Criptita a fost prezentă pe 60 din cele 90 de biopsii examinate, astfel: pe 27 de biopsii
prelevate la prima examinare (60%) şi pe 33 din cele prelevate la a doua examinare (73%),
observându-se o uşoară creştere a incidenţei leziunilor de criptită în lotul examinat, fără
semnificaţie statistică. În acelaşi timp, se observă o severitate mai redusă a leziunilor de
criptită (evaluată în funcţie de numărul glandelor afectate şi extensia afectării) la a doua
examinare, pe biopsiile prelevate în cursul acesteia identificându-se mai ales leziuni minime
ca severitate.

Figura 13 Leziuni de criptită evidenţiate pe fragmente biopsice prelevate de la pacienţii cu

colită ulcerativă

Graficul 47 Evoluţia severităţii leziunilor de criptită în cele 12 luni ale studiului

În ceea ce priveşte valoarea predictivă a evoluţiei a leziunilor de criptită, evaluarea

statistică a relevat că absenţa criptitei este corelată cu o evoluţie favorabilă şi un risc redus de
51
recădere, riscul de evoluţie nefavorabilă crescând cu extensia leziunilor de criptită. Corelaţia
între prezenţa criptitei şi riscul de recădere prezintă semnificaţie statistică foarte înaltă (Fisher
test two-tailed p=0,0002). Cu alte cuvinte, cu cât leziunile de criptită sunt mai severe şi mai
extinse, cu atât riscul de recădere este mai mare.

Graficul 48 Corelaţii între severitatea leziunilor de criptită şi evoluţia pacienţilor

Criptita este o leziune specifică bolilor inflamatorii intestinale, deşi uneori poate fi
observată în colitele infecţioase. Melson et al. [373] au afirmat că prezenţa criptitei este, la
anumite grupuri de vârstă, un predictor bun al necesităţii de colectomie. Observaţia conform
căreia, în această cohortă, criptita este semnificativ statistic corelată cu riscul de recădere vine
să suplimenteze datele cunoscute şi să includă leziunile de criptită între factorii cu rol
prognostic în CU.

7.3.5. Plasmocitoza bazală

Este, fără îndoială factorul care a întrunit cele mai multe dovezi ca având valoare
predictivă pentru riscul de recădere şi pentru evoluţia pacienţilor. Se consideră că
plasmocitoza bazală rectală la pacienţii aflaţi în remisiune clinic şi endoscopică indică un risc
înalt de recădere şi evoluţie nefavorabilă. [259;261] Doar trei din cele 90 de biopsii examinate
nu au prezentat plamocitoză bazală, toate din primul set de biopsii.

52
Graficul 49 Evoluţia plasmocitozei bazale în cele 12 luni ale studiului

Prin urmare, ne-am îndreptat atenţia asupra corelaţiilor între plasmocitoza bazală şi
evoluţia pacienţilor, respectiv riscul de recădere. Plasmocitoza bazală s-a dovedit un factor
predictiv cu o specificitate de 88% pentru evoluţia nefavorabilă şi de 85% pentru riscul de
recădere. Sensibilitatea acestui parametru pentru cele două caracteristici evolutive este foarte
redusă. Asta înseamnă că pacienţii fără plasmocitoză bazală au un risc foarte redus de
recădere şi evoluţie nefavorabilă, acest risc fiind susţinut de datele statistice.
Corelaţia valorii plasmocitozei bazale iniţiale cu evoluţia pacienţilor pe durata celor 12
luni de supraveghere a indicat o înaltă semnificaţie statistică (t test two-tailed p=0,0089), ca şi
corelaţia plasmocitozei bazale cu riscul de recădere în 12 luni (t test two tailed p=0,0018).

Graficul 50 Corelaţii ale severităţii plasmocitozei bazale cu evoluţia pacienţilor

53
 Ulterior am corelat plasmocitoza bazală cu scorul Mayo şi am obţinut o valoarea
semnificativă statistic. Astfel, plasmocitoza bazală este un predictor specific al evoluţiei
scorului Mayo, având o specificitate de 77% (adică pacienţii fără plasmocitoză bazală au un
risc redus de a avea în următoarele 12 luni valori mari ale scorului Mayo de severitate clinică
şi endoscopică).

7.3.6. Fibroza
Fibroza laminei propria în CU rezultă prin depunerea de colagen în matricea
extracelulară de către miofibroblastele din micromediul stromal stimulate imun. Apariţia
fibrozei semnificative este un rezultat tardiv al inflamaţiei cronice din CU, care afectează
funcţiile colonului şi reprezintă un eveniment nedorit în evoluţia bolii. Spre deosebire de
boala Crohn, fibroza în CU nu reprezintă o complicaţie severă care să întunece prognosticul
pacienţilor per se.

Figura 14 Grade diferite de fibroză a matricei extracelulare la pacienţi cu colită ulcerativă:

minimă (stânga); marcată (dreapta) (coloraţie Masson).

Pacienţii din cohorta noastră nu au prezentat fibroză foarte severă, dar grade variabile
de fibroză (minimă şi moderată) au fost identificate pe 63 din cele 90 de biopsii evaluate.

54
Graficul 51 Evoluţia fibrozei matricei extracelulare în timpul celor 12 luni ale studiului

Evaluarea statistică a indicat că fibroza din corion este semnificativ statistic corelată
cu evoluţia pacienţilor (test Fisher two-tailed p=0,0185). Astfel, pacienţii fără fibroză la
momentul biopsiei au o probabilitate foarte înaltă de a evolua favorabil şi un risc mai mic de
recădere (fără semnificaţie statistică).

7.3.7. Leziunile vasculare

În colita ulcerativă, deşi rar raportate, leziunile vaselor mici din corion sunt prezente la
majoritatea pacienţilor (în studiul nostru au fost identificate pe 48 de biopsii, reprezentând
aproximativ 53% din totalul biopsiilor evaluate). Proporţia prezenţei leziunilor vasculare este
mai mare pe biopsiile din a doua etapă, sugerând că există corelaţii între durata evoluţiei
inflamaţiei şi prezenţa acestora (fără semnificaţie statistică, Fisher test two-tailed p=0,3518).

Figura 15 Leziuni ale vaselor sanguine de calibru mic din corion cu îngroşarea peretelui
vascular şi prezenţa de arii de necroză fibrinoidă şi polimorfonucleare neutrofile intramural în
colita ulcerativă.

55
Graficul 52 Leziuni vasculare în colita ulcerativă

Am examinat semnificaţia corelaţiei dintre prezenţa leziunilor vasculare şi evoluţia

pacienţilor, respectiv riscul de recădere. Dacă în ceea ce priveşte evoluţia, leziunile vasculare
nu prezintă semnificaţie statistică, ele sunt corelate semnificativ cu riscul de recădere (t test
two-tailed p=0,0968).

Graficul 53 Corelaţii ale leziunilor vaselor mici şi evoluţia colitei ulcerative

Distorsionarea arhitecturii vasculare din corionul superficial este una dintre

caracteristicile endoscopice frecvent întâlnit şi cu utilitate diagnostică în CU. Prezenţa

56
leziunilor vaselor mici, capilare din corion este adesea identificată pe biopsiile de mucoasă
colonică din regiunile inflamate, fără ca modificările înregistrate sa prezinte specificitate, ele
fiind leziuni nespecifice inflamatorii. În acest context, leziunea vasculară este mai degrabă un
indicator al severităţii inflamaţiei, corelaţia sa cu riscul de recădere traducând de fapt relaţia
dintre severitatea inflamaţiei şi acesta. [14]

7.3.8. Displazia epitelială a fost identificată într-un singur caz pe o leziune plană suspectată
endoscopic la cea de-a doua examinare, deci practic este lipsită de semnificaţie în acest
studiu.

Figura 16 Modificări regenerative (stânga) versus displazie epitelială simplă (dreapta) în

colita ulcerativă. În imaginea din stânga se observă păstrarea arhitecturii criptice, a polarităţii
nucleare şi a raportului nucleo-citoplasmatic. În imaginea din dreapta se observă
distorsionarea rhitecturii criptice, tendinţa la pierderea polarităţii nucleare şi la egalizarea
raportului nucleo-citoplasmatic.

Absenţa displaziei epiteliale la marea majoritate a pacienţilor incluşi în studiu indică o

evoluţie de relativ scurtă durată a bolii acestora (displazia apare după minim 8 ani de
evoluţie), precum şi un răspuns relativ bun la terapie (displazia apare în ariile în care stresul
inflamator sever este continuu lungi perioade de timp, nepermiţând corectarea leziunilor ADN
în celulele epiteliale).

57
 Prezenţa displaziei

Fără displazie
Displazie

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 54 Prezenţa displaziei epiteliale în lotul studiat.

7.4. Factori imunohistochimici

7.4.1. Infecţia cu CMV

Pentru toate biopsiile aflate în studiu am efectuat imunomarcaj pentru
cytomegalovirus, chiar în absenţa suspiciunii clinice sau histopatologice de prezenţă a
infecţiei. Toate biopsiile examinate s-au dovedit negative pentru CMV, indicând faptul că
infecţia CMV este rară la pacienţii cu CU din România.

7.4.2. Markerii imunohistochimici ai limfocitelor T

Răspunsul exagerat al limfocitelor T la bacteriile din lumenul intestinal este considerat
elementul central al patogeniei CU. [11] Evaluarea numărului şi a distribuţiei limfocitelor T
din corionul mucoasei colonice a fost efectuată utilizând coloraţiile imunohistochimice CD3
şi CD7.
Imunomarcajul pentru CD3 a evidenţiat o creştere a numărului de limfocite T din
corion pe toate biopsiile examinate şi o prezenţă ocazională a acestora intraepitelial (în 29 de
biopsii din primul lot şi în 16 biopsii din al doilea lot).

58
Figura 17 Imunomarcaj pentru CD3 evidenţiind numeroase limfocite T (CD3+) în corionul
mucoasei colonice, cu rare limfocite T intraepitelial

Limfocite CD3+ în corion

Moderat crescute
Uşor crescute

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 55 Evoluţia numărului de limfocite T CD3+ în corion în cele 12 luni ale studiului

Figura 18 Limfocite T CD3+ în număr crescut în corion, focal cu marcată extensie în

epiteliul criptic (stânga)
59
 Limfocite CD3+ intraepitelial

Absente
Prezente

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 56 Evoluţia limfocitelor T CD3+ intraepiteliale în cele 12 luni ale studiului

Dispoziţia limfocitelor T CD3+ a evidenţiat dispunerea lor variabilă, atât difuză cât şi
nodulară. Numărul şi distribuţia limfocitelor T nu au prezentat corelaţii semnificative cu
evoluţia pacienţilor sau riscul lor de recădere.

Graficul 57 Distribuţia limfocitelor T CD3+ în micromediul stromal

Imunomarcajul pentru CD7 a prezentat o variabilitate semnificativă faţă de CD3,

observându-se un număr mediu mai redus de limfocite T CD7+. Astfel, 56 de biopsii au

60
prezentat un număr de limfocite T CD7+ normal. Nu au fost identificate limfocite T CD7+
intraepitelial. Distribuţia acestora a urmat modelul observat la imunomarcajul cu CD3.

Figura 19 Imunomarcaj pentru CD7 evidenţiind un numări semnificativ mai redus de celule
CD7+ comparativ cu numărul de limfocite T CD3+

Graficul 58 Evoluţia numărului de limfocite T CD7+ în micromediul stromal în cele 12 luni

ale studiului

Corelaţia limfocitelor T CD3, respectiv CD7 pozitive a arătat că atunci când este mai
mare decât normalul, numărul de celule CD3+ şi CD7+ din corion este proporţional crescut,
dar limfocitele care exprimă CD7 sunt semnificativ mai reduse cantitativ.

61
Graficul 59 Corelaţii ale numărului de limfocite CD3+ şi CD7

7.4.3. Markerii imunohistochimici ai limfocitelor B

Am utilizat imunomarcajul pentru CD20 care a evidențiat o creştere a numărului de
limfocite B în corion pe toate biopsiile examinate. Intraepitelial au fost identificate relativ
frecvente limfocite B CD20+ (pe 55% din biopsiile examinate).

Figura 20 Imunomarcaj pentru CD20 evidenţiind foarte numeroase limfocite B CD20+

dispuse difuz (stânga) şi nodular (dreapta) în corionul mucoasei colonice la pacienţi cu colită
ulcerativă

62
Graficul 60 Evoluţia numărului de limfocite B CD20+ în micromediul stromal în cele 12 luni
ale studiului

Figura 21 Frecvente limfocite B CD20+ intraepitelial în colita ulcerativă

Limfocite CD20+ intraepitelial

Absente
Prezente

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 61 Evoluţia numărului de limfocite B CD20+ intraepiteliale în cele 12 luni ale

studiului

63
 Creşterea numărului de limfocite B CD20+ nu este corelată statistic cu creşterea
numărului de limfocite T CD3+ (t test two-tailed p=0,2699) sau CD7+ (t test two-tailed
p=0,5469). De asemenea, evoluţia numărului de limfocite B şi T între cele două biopsii nu
este semnificativă statistic (t test two-tailed p=0,4226).
Corelarea numărului de limfocite B cu evoluţia sau riscul de recădere nu a oferit
rezultate semnificative statistic.

7.4.4. Markerii imunohistochimici ai limfocitelor Natural Killer (NK)

Au fost utilizaţi în prezentul studiu CD56 şi CD57. S-a observat o creştere
semnificativă a numărului de limfocite pozitive pentru ambii markeri pe majoritatea biopsiilor
evaluate. Astfel, 31 de biopsii din primul grup au prezentat creşterea numărului de limfocite
CD56+ şi 20 a celor CD57+. Din al doilea grup, toate biopsiile au prezentat creşterea
numărului de limfocite CD56+ (45), iar 34 au prezentat creşterea numărului de limfocite
CD57+.

Figura 22 Imunomarcaj pentru CD56 (stânga), respectiv CD57 (dreapta) evidenţiind relativ
frecvente limfocite NK în corion

Corelaţia între numărul de limfocite NK CD56+ şi cele CD57+ este semnificativă

statistic (t test two-tailed p=0,0808), ceea ce indică faptul că limfocitele NK îşi păstrează
expresia celor doi markeri.

64
 CD56 în corion

Marcat crescute
Moderat crescute
Uşor crescute
Normal

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 62 Evoluţia numărului de limfocite NK CD56+ din corion în cele 12 luni ale
studiului

CD57 în corion

Moderat crescute
Uşor crescute
Normal

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 63 Evoluţia numărului de limfocite NK CD57+ din corion în cele 12 luni ale
studiului

Prezenţa limfocitelor NK pe prima biopsie nu are valoare predictivă pentru cea de-a
doua biopsie (t test two-tailed p=0,8012 pentru CD56 şi p=0,4262 pentru CD57).
Corelaţia numărului de limfocite NK cu evoluţia şi riscul de recădere nu a evidenţiat
semnificaţie statistică a asocierii (t test two-tailed p=0,7368 pentru evoluţie şi p=0,1287
pentru riscul de recădere). De asemenea, variaţia numărului de limfocite NK nu este corelată
cu evoluţia sau recăderea.

65
7.4.5. Proteina anti-apoptotică bcl-2
bcl-2 este o proteină exprimată de limfocite, cu rol anti-apoptotic şi antiinflamator care
a fost studiată în bolile inflamatorii cronice şi propusă chiar ca ţintă terapeutică în bolile
inflamatorii intestinale. [327; 374] Studiile anterioare au arătat că la pacienţii cu CU şi boală
Crohn, proteina bcl-2 este supraexprimată în limfocitele din corionul mucoasei colonice,
expresia acestei scăzând dramatic după tratament. [375] Pozitivitatea epitelială a bcl-2 este
foarte rar întâlnită, epiteliul colonic fiind unul din puţinele epitelii pozitive la bcl-2 din cauza
prezenţei în epiteliul colonic a celulelor stem şi a celulelor sensibile la factori de creştere
responsabile de hiperplazia reactivă. Efectul anti-apoptotic al proteinei bcl-2 poate scăpa de
sub controlul mecanismelor inhibitorii şi determina transformarea malignă a celulelor
epiteliului colonic supuse stimulării îndelungate a factorilor de creştere pro-regenerativi prin
creşterea duratei de viaţă a celulelor şi, deci, a posibilităţii acestora de a acumula mutaţii.
[376;377]
În acest context, am studiat expresia proteinei bcl-2 la pacienţii cu CU, atât în celulele
epiteliale cât şi în limfocitele din micromediul stromal.

Figura 23 Imunomarcaj pentru bcl-2 evidenţiind pozitivitate atât în celulele epiteliale cât şi în
limfocitele stromale

Creşterea expresiei bcl-2 în celulele epiteliale a fost identificată în 32 de biopsii din

primul grup şi în 16 biopsii din grupul al doilea. Se observă o scădere semnificativă a
expresiei epiteliale a bcl-2 în cele 12 luni de supraveghere, probabil ca urmare a
tratamentului. Scăderea pozitivităţii bcl-2 în celulele epiteliale în cele 12 luni de supraveghere
prezintă o înaltă semnificaţie statistică (test Fisher p=0,0006).

66
Figura 24 Imunomarcaj pentru bcl-2 evidenţiind pozitivitatea a numeroase limfocite din
micromediul stromal şi a puţine celule epiteliale colonice

Graficul 64 Evoluţia expresiei bcl-2 în celulele epiteliului colonic în cele 12 luni ale studiului

În ceea ce priveşte expresia bcl-2 în limfocite, aceasta a fost prezentă în medie în 45%
din celulele inflamatorii din micromediul stromal pe prima biopsie şi în 35% din celulele
inflamatorii pe a doua biopsie. Această scădere nu a prezentat semnificaţie statistică (t test
two-tailed p=0,4521).

67
 Expresia bcl-2
35

30

25

20
Prima biopsie
15
A doua biopsie
10

0
bcl-2 în celulele epiteliale bcl-2 în limfocite

Graficul 65 Evoluţia concordantă a expresiei bcl-2 în celulele epiteliale şi în limfocite în cele

12 luni ale studiului

Pozitivitatea bcl-2 nu are valoare predictivă pentru valoarea aceluiaşi marker la

interval de 12 luni. Valoarea bcl-2 în celulele epiteliale şi inflamatorii nu se corelează
semnificativ statistic cu evoluţia pacienţilor (t test two-tailed p=0,4121) sau cu riscul lor de
recădere (t test two-tailed p=0,4577).

Graficul 66 Evoluţia globală a expresiei bcl-2

În ceea ce priveşte localizarea preponderentă a limfocitelor pozitive pentru bcl-2, s-a

observat o dispoziţie difuză a acestora, fără o preferinţă anume pentru corionul superficial sau

68
profund (53 de biopsii din cele 90 examinate, reprezentând aproximativ 59% din total au
evidenţiat o dispoziţie difuză a limfocitelor bcl-2 pozitive).
Corelarea expresiei bcl-2 în celulele epiteliale şi în limfocitele din corion a relevat o
valoare înalt semnificativă statistic (t test p=0,0078), indicând că există o puternică legătură a
expresiei bcl-2 în acelaşi mediu, indiferent de celulele în care acesta se exprimă.
Supraexpresia proteinei anti-apoptotice bcl-2 este indusă de modificările inflamatorii cronice
din micromediul stromal, fiind implicate în regenerarea şi remodelarea tisulară, dar şi în
evoluţia spre malignizare atât epitelială cât şi limfoidă sub stimul inflamator cronic.

7.4.6. Proteinele supresoare tumorale p53 şi p21/WAF-1

p53 este un semafor celular cu rol de oprire a ciclului celular pentru a permite celulei
repararea leziunilor ADN înainte de diviziune. În cazul eşuării reparării ADN-ului p53 induce
moartea celulară programată (apoptoza). p21 este un inhibitor kinazic indus de p53 care
inhibă activitatea ciclinelor şi reglează ciclul celular având rolul de a inhiba diviziunea
celulelor care au acumulat mutaţii genetice. Expresia p53 şi p21 în celulele epiteliului colonic
în CU este corelată cu evoluţia spre displazie a acestor celule (imunomarcajul identifică
celulele cu mutaţii ale p53 şi p21). [378; 379]
Astfel, am cuantificat procentul de celule cu pozitivitate certă pentru p53 şi p21 din
epiteliul colonic pe ambele seturi de biopsii.

Figura 25 Imunomarcaj pentru p53 (stânga) şi p21 (dreapta) în celulele epiteliului colonic şi
în limfocitele din micromediul mezenchimal în colita ulcerativă

Au fost identificate 16 biopsii complet negative pentru p53, pe restul de 74

identificându-se între 5% şi 90% celule epiteliale pozitive pentru p53 (valoarea maximă a fost

69
identificată în cazul cu displazie epitelială simplă). În acelaşi timp, 27 de biopsii nu au
prezentat expresie pentru p21, restul de 63 înregistrând o expresie cuprinsă între 5% şi 50%.
S-a observat, în general, o expresie mai intensă şi mai extinsă a p53 decât a p21. Expresia şi
evoluţia p53 şi p21 nu s-au corelat semnificativ cu riscul de recădere sau cu evoluţia
pacienţilor.

Graficul 67 Evoluţia expresiei p53 şi p21 în celulele epiteliului colonic în cele 12 luni ale
studiului

Media celulelor epiteliale pozitive pentru p53 a fost de 17% pentru prima biopsie şi de
21% pentru cea de-a doua, creştere fără semnificaţie statistică. Pentru p21, media numărului
de celule pozitive a fost de 7,33% pentru primul grup de biopsii şi de 10,67% pentru al doilea
grup de biopsii, variaţie lipsită, de asemenea, de semnificaţie statistică.

Figura 26 Imunomarcaj pentru p53 (stânga) şi p21 (dreapta) în celulele epiteliului colonic

70
 Mituhashi et al. [380] au identificat o corelaţie semnificativă între expresia p53 şi p21
şi distorsionarea arhitecturală din CU, concluzionând că acumularea de mutaţii genetice se
întâmplă paralel cu distorsionarea arhitecturii mucoasei colonice, sub efectul stresului
oxidativ produs asupra stromei şi a epiteliului.
Am examinat şi noi, în studiul efectuat, prezenţa acestei corelaţii. Astfel, prezenţa
distorsionării arhitecturale pe biopsiile din mucoasa colonică inflamată la pacienţii cu CU s-a
corelat semnificativ statistic cu expresia p53 în celulele epiteliale (t test two-tailed p=0,0251)
şi cu expresia p21 în celulele epiteliale (t test two-tailed p=0,0035).

Graficul 68 Evoluţia corelată a distorsionării arhitecturale şi a expresiei proteinelor

supresoare tumorale

7.4.7. CD105 şi VEGF

CD105 (endoglina) este un factor angiogenic indus de hipoxia tisulară. Este intens
exprimată în celulele endoteliale din ţesuturile tumorale şi din ariile inflamate care realizează
remodelare tisulară cu neoangiogeneză. În colita ulcerativă, endoglina acţionează ca
angiomodulator în strânsă conexiune cu VEGF (factorul de creştere derivat din endoteliile
vasculare), o citokină proangiogenetică implicată în angiogeneza fizologică şi patologică. Un
studiu recent [381] a demonstrat pe modele animale importanţa semnificativă în modularea
inflamaţiei şi a angiogenezei deţinută de cuplul CD105-endoglină în bolile inflamatorii
intestinale. Mai multe studii au arătat că VEGF şi, implicit CD105, sunt foarte importante în
patogeneza răspunsului inflamator şi angiogenetic responsabil de leziunile tisulare

71
inflamatorii, existând chiar rezultate încurajatoare ale tratamentului cu anticorpi anti-VEGF în
bolile inflamatorii intestinale. [203; 382; 383]
În acest context, am investigat expresia CD105 şi VEGF în stroma corionului
mucoasei colonice la pacienţii incluşi în prezentul studiu.

Figura 27 Expresie variabilă ca intensitate şi extensie a CD105 în micromediul mezenchimal

al mucoasei colonice în colita ulcerativă

Expresia CD105 a fost crescută în stromă pe 75 din cele 90 de biopsii evaluate (83%),
iar expresia VEGF în 60 din cele 90 de biopsii evaluate (66,67%). Pozitivitatea celor doi
markeri în stromă se corelează semnificativ statistic (t test two-tailed p=0,0139) confirmând
implicarea lor concordantă în patogeneza leziunilor inflamatorii din CU.

Figura 28 Expresie variabilă ca intensitate şi extensie a CD105 în micromediul mezenchimal

şi în epiteliul colonic în colita ulcerativă

72
Graficul 69 Evoluţia corelată a expresiei stromale a CD105 şi VEGF

De asemenea, evoluţia celor doi markeri pe perioada celor 12 luni este concordantă (t
test p=0,0085), observându-se o scădere paralelă a intensităţii expresiei lor stromale, probabil
ca efect al tratamentului.

Figura 29 Expresie variabilă a VEGF în micromediul mezenchimal şi în epiteliul colonic în

colita ulcerativă

Evoluţia pacienţilor se corelează pozitiv cu intensitatea expresiei CD105 în stromă şi

riscul de recădere (t test two-tailed p=0,0156, respectiv p=0,0097), pe când intensitatea
expresiei stromală a VEGF nu este corelată nici cu evoluţia (t test two-tailed p=0,1667), nici
cu riscul de recădere (t test two-tailed p=0,1643).

73
 Observând pozitivitate epitelială semnificativă pentru VEGF indusă de stresul oxidativ
şi hipoxie, [384] am verificat ulterior corelaţia acesteia cu expresia stromală a CD105 şi
VEGF. Astfel, expresia epitelială a VEGF a fost identificată 65 de biopsii din cele 90
evaluate, nefiind concordantă cu expresia stromală a CD105 (t test two-tailed p=0,3467) sau a
VEGF (t test two-tailed p=0,5078). Expresia epitelială a VEGF nu se corelează nici cu
evoluţia şi nici cu riscul de recădere.

7.4.8. Colagenul I şi colagenul IV sunt secretate de către miofibroblastele din micromediul

stromal al mucoasei în urma degradării şi reparării matricei extracelulare şi a membranei
bazale. Am examinat cantitatea de colagen I şi IV, precum şi distribuţia acestuia în corion.
Am observat că expresia ambelor variante de colagen a crescut de la prima la doua biopsie,
creşterea fiind mai mare pentru colagenul IV, dar fără semnificaţie statistică.

Figura 30 Expresia mezenchimală a colagenului I (stânga) şi IV (dreapta) în colita ulcerativă

Graficul 70 Evoluţia acumulării de colagen în stromă în colita ulcerativă

74
 Nu au fost identificate corelaţii între cantitatea de colagen I şi IV depusă (t test two-
tailed p=0,4299) şi între acestea şi evoluţia, respectiv riscul de recădere al pacienţilor.
Colagenul I şi IV nu prezintă valoare predictivă pentru depunerea ulterioară de colagen
stromal (t test p=0,7241 pentru colagenul I şi p=0,8674 pentru colagenul IV).
S-a observat că colagenul I se depune preponderent în corionul profund (38 din
biopsiile examinate reprezentând 42%) şi mai rar pericriptic şi subepitelial. Colagenul IV se
dispune mai frecvent subepitelial (pe 46 din biopsii, reprezentând 50%) şi mult mai rar
pericriptic şi în corionul profund.

7.4.9. TGFβ (factorul de creştere şi transformare β) este o proteină exprimată de

amjoritatea celulelor care controlează proliferarea şi diferenţierea celulară. În colita ulcerativă
acesta joacă un rol important în întreţinerea şi modularea inflamaţiei, activând limfocitele B şi
inhibând acţiunea limfocitelor T helper. În acest fel, contracarează efectele TNFα şi are rol
anti-inflamator. Pe căi necunoscute, în BII, TGFβ favorizează reepitelizarea şi remodelarea
arhitecturală şi stimulează fibroza matricei extracelulare. [385]

Figura 31 Expresie variabilă a TGFβ în stroma, celulele inflamatorii şi epiteliul mucoasei

colonice în colita ulcerativă

Am examinat expresia TGFβ în colonocite, în celulele inflamatorii şi în fibroblastele

stromale. Am observat o scădere a expresiei TGFβ în toate cele trei compartimente evaluate
între cele două biopsii. Evoluţia TGFβ a fost concordantă, expresia scăzând în paralel în cele
trei compartimente, rămânând totuşi semnificativ crescută faţă de valoarea identificată în
mucoasa colonică normală (peritumorală) folosită ca martor.

75
Graficul 71 Evoluţia coordonată a expresiei TGFβ în cele 12 luni ale studiului

Intensitatea expresiei TGFβ la un anumit moment are valoare predictivă pentru

expresia aceluiaşi marker după 12 luni (t test two-tailed p=0,0398 pentru expresia epitelială,
p=0,0291 pentru expresia în fibroblastele stromale şi p=0,0281 pentru expresia în celulele
inflamatorii).

Figura 32 Expresia TGFβ: concordantă, intensă atât în epiteliu cât şi în stromă (stânga) sau
discordantă, negativă în epiteliu şi intens pozitivă în stromă (dreapta)

Expresia TGFβ nu prezintă corelaţie cu evoluţia pacienţilor sau cu riscul de recădere

în nici unul dintre compartimentele examinate.

76
 În ceea ce priveşte corelaţia expresiei TGFβ cu distorsionarea arhitecturală, aceasta nu
s-a dovedit semnificativă statistic (t test two-tailed p=0,1309 pentru compartimentul epitelial,
p=0,0550 pentru cel inflamator şi p=0,1038 pentru cel stromal).

7.4.10. Metaloproteinazele matriceale (MMP) sunt un grup de peptide cu rol enzimatic

implicate în proliferarea celulară, migrarea şi adeziunea celulelor, angiogeneză, apoptoză şi
imunitate. În CU expresia MMP este legată de severitatea şi evoluţia inflamaţiei. [386]
Am examinat expresia stromală, din punct de vedere al intensităţii şi al extensiei,
pentru MMP1, MMP2, MMP9 şi MMP13. Toate cele patru metaloproteinaze au avut valori
crescute la ambele biopsii atât pentru extensie cât şi pentru intensitate (care a fost minimă pe
fragmentele martor de mucoasă colonică normală).

Graficul 72 Evoluţia extensiei metaloproteinazelor matriceale în micromediul mezenchimal

în cele 12 luni ale studiului

Extensia şi intensitatea MMP au variat corelat, astfel: pentru MMP1, MMP9 şi

MMP13 au scăzut în cele 12 luni de supraveghere, iar pentru MMP2 au crescut. Expresiile
iniţiale ale MMP1, MMP2 şi MMP13 au avut valoare predictivă pentru expresiile ulterioare
ale aceloraşi MMP. Variaţiile expresiei diferitelor metaloproteinaze nu s-au corelat
semnificativ statistic, astfel încât evoluţia fiecărei MMP a fost independentă de celelalte.

77
Figura 33 Expresie variabilă ca intensitate şi extensie a MMP1 îm micromediul mezenchimal
al mucoasei colonice în colita ulcerativă

Variaţia extensiei expresiei MMP1 s-a corelat semnificativ statistic cu riscul de

recădere (t test two-tailed p=0,0083) şi cu evoluţia pacienţilor (t test two-tailed p=0,0224).
Astfel, cu cât extensia expresiei stromale a MMP1 este mai mare, cu atât riscul de evoluţie
nefavorabilă şi de recădere al pacientului este mai mare.

Graficul 73 Evoluţia coordonată e extensiei şi a intensităţii expresiei MMP1 în micromediul

mezenchimal al mucoasei colonice în cele 12 luni ale studiului

78
 Corelaţia MMP1 cu evoluţia

MMP1

Evolutie favorabila Evolutie nefavorabila

Graficul 74 Corelaţia expresiei MMP1 cu evoluţia

Variaţia extensiei stromale a expresiei MMP2 nu s-a corelat semnificativ cu riscul de

recădere şi de evoluţie nefavorabilă a pacienţilor cu CU (t test two-tailed p=0,1130 pentru
riscul de recădere şi p=0,2522 pentru riscul de evoluţie nefavorabilă).
De altfel, MMP2 este exprimată mai mult în celulele epiteliale colonice la şoarecii cu
leziuni de tip CU indusă experimental. [387]

Figura 34 Expresie variabilă a MMP2 în micromediul mezenchimal al mucoasei colonice în

colita ulcerativă. În ambele imagini se observă absenţa expresiei MMP2 în celulele epiteliului
colonic.

79
 MMP2 în stromă

Extensie MMP2
Intensitate MMP2

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 75 Evoluţia coordonată a extensiei şi a intensităţii expresiei MMP2 în micromediul

mezenchimal al mucoasei colonice în cele 12 luni ale studiului

În acest context, am examinat expresia MMP2 în celulele epiteliului colonic,

exprimând-o în procent de celule pozitive. Expresia medie a MMP2 pe prima biopsie s-a
situat la 22,67%, iar pentru cea de-a doua biopsie la 21,67% (diferenţă fără semnificaţie
statistică, t test two-tailed p=0,9060), marcând mică scădere a expresiei epiteliale, tendinţă
inversă faţă de variaţia MMP2 în stromă, dar corelată cu evoluţia expresiei stromale şi
epiteliale a celorlalte metaloproteinaze investigate.

Figura 35 Expresie variabilă a MMP2 atât în stromă cât şi în celulele epiteliale colonice

80
 Celule epiteliale pozitive la MMP2

Celule epiteliale pozitive

la MMP2

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 76 Evoluţia expresiei epiteliale a MMP2 în cele 12 luni ale studiului

Corelarea expresiei epiteliale a MMP2 cu riscul de recădere şi evoluţia pacienţilor nu a

oferit valori semnificative statistic (t test two-tailed p=0,8461 pentru riscul de recădere şi
p=0,1612 pentru evoluţie). Concluzionăm astfel că studiul nostru a eşuat în găsirea de
corelaţii semnificative statistic între expresia stromală sau epitelială a MMP2 şi evoluţia
pacienţilor cu CU.

Extensia şi intensitatea expresiei stromale a MMP9 a scăzut pe perioada celor 12 luni

de supraveghere. Scăderea lor nu a fost concordantă şi nici nu s-a corelat semnificativ cu
evoluţia expresiei celorlalte MMP.

Figura 36 Expresie variabilă, epitelială şi stromală, a MMP9 în colita ulcerativă

81
Graficul 77 Evoluţia coordonată a extensiei şi a intensităţii expresiei MMP9 în cele 12 luni
ale studiului

Variaţia extensiei sau a intensităţii expresiei stromale a MMP9 nu s-a corelat cu

evoluţia sau cu riscul de recădere al pacienţilor cu CU.

MMP13 a urmat acelaşi model de scădere a extensiei şi a intensităţii expresiei

stromale de la prima la a doua biopsie ca şi MMP1 şi MMP9. Deşi cei trei parametri au
evoluat în paralel, nu există o corelaţie semnificativă statistic între variaţia lor (exprimată ca
intensitate şi extensie a expresiei stromale) sau variaţia lor şi riscul de recădere sau evoluţia
pacienţilor.

Figura 37 Expresie variabilă, epitelială şi stromală, a MMP13 în colita ulcerativă

82
 De asemenea, expresia stromală şi epitelială a MMP13 nu s-a corelat semnificativ
statistic cu riscul de recădere sau cu evoluţia pacienţilor.

MMP13

Extensie MMP13
Intensitate MMP13

Prima biopsie A doua biopsie

Graficul 78 Evoluţia coordonată a extensiei şi a intensităţii expresiei MMP13 în cele 12 luni

ale studiului

Astfel, studiul prezent a eşuat să confirme importanţa metaloproteinazelor matriceale

ca markeri ai inflamaţiei colonice cronice din colita ulcerativă, ceea ce impune o adâncire a
studiului acestei probleme.

83