Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Introducere
Bolile inflamatorii intestinale (BII) reprezintă afecţiuni cu incidenţă în continuă creştere nu doar în zonele
cu incidenţă raportată anterior înaltă ci mai ales în zone unde până nu demult acestea erau considerate boli rare.
În plus îmbunătăţirea metodelor de investigare utilizate în vederea stabilirii diagnosticului dar şi introducerea
unor terapii menite să modifice cursul natural al acestora au schimbat expresia fenotipică dar şi evoluţia
patologiei respective. În plus evidenţierea acelor factori clinici prezenţi la diagnostic ce prezic un anumit tip de
evoluţie în CU pot identifica subgrupuri de pacienţi ce ar putea beneficia de terapie mai agresivă şi de
monitorizare mai atentă încă de la debut.
Diagnosticarea BII poate constitui de cele mai multe ori o provocare, mai ales în cazurile cu activitate
clinică moderată, datorită suprapunerii cu simptomatologia patologiei funcţionale. Întârzierea diagnosticului se
asociază nu doar cu afectarea calităţii vieţii acestor pacienţi, dar şi cu reducerea răspunsului la terapia
medicamentoasă. În plus, întârzierea diagnosticului în BII poate avea un impact extrem de important asupra
riscului de complicaţii şi intervenţii chirurgicale care reprezintă un moment important al istoriei naturale a
acestor patologii.
Cercetările tot mai elaborate în vederea stabilirii etiopatogenezei bolilor inflamatorii intestinale au
identificat o serie de substraturi genetice şi imunologice diverse menite să ajute la identificarea unor terapii
individualizate, ţintite. Astfel, implicarea autofagiei în procesul de recunoaştere a alergenilor intestinali a fost
recunoscut ca proces promotor al pierderii toleranţei imune în boala Crohn. În plus, în ultima perioadă a fost
foarte mult studiat impactul genelor implicate în autofagie asupra expresiei fenotipice şi asupra riscului de
complicaţii și s-a încercat elaborarea unui scor predictiv combinat- clinic- serologic- genetic.
Identificarea unor predictori genetici ai răspunsului la terapie constituie preocuparea de bază a
farmacogenomicii, ramură atât de dezvoltată în alte domenii ale medicinii. De ce reprezintă un aspect atât de
important? Pentru că cel puţin teoretic în această patologie există posibilitatea accesării unui tip diferit de
management- „step-up versus top-down” şi identificarea acelui subgrup de pacienţi care ar beneficia cel mai
mult de pe urma unui tratament ar trebui identificat încă de la diagnostic. Dacă vorbim despre costul ridicat al
terapiei biologice dar şi de efectele secundare ale acesteia, acest aspect devine şi mai important de elucidat.
Metodologie generală
Pacienţi
Toate studiile cuprinse în capitolul “Contribuţia Personală”, cu excepţia celui de al treilea studiu, s-au
desfăşurat în cadrul Institutului Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie “Prof. Dr. Octavian Fodor” Cluj-
Napoca. Cel de al treilea studiu a fost efectuat beneficiind de date din baza IBD Prospect – baza naţională de boli
inflamatorii intestinale care întruneşte pacienţi din mai multe centre universitare din ţară. Pacienţii din studiile
efectuate prospectiv, respectiv studiile trei, patru şi cinci au fost incluşi după ce şi-au dat consimţământul
informat, semnând un formular ce a fost aprobat în prealabil de către Comisia de Etică a Universităţii de
Medicină şi Farmacie ”Iuliu Haţieganu”, împreună cu fiecare protocol de studiu (pentru studiile patru si cinci),
respectiv consimţământ informat pentru includere în baza IBD Prospect aprobat în prealabil de Comitetul
ştiinţific al Clubului Român de Colită şi Crohn.
Investigaţii de laborator
Au fost determinaţi următorii parametri: viteza de sedimentare a hematiilor-VSH (prin metoda
Westergren, adaptată la valorile Seditainer), proteina C reactivă-PCR (cu ajutorul analizorului de biochimie
Konelab 60) şi hemoleucograma (pe analizorul de hematologie Mindray 6800). Determinările serologice au fost
efectuate utilizând tehnica Elisa, după centrifugarea prealabilă a sângelui prelevat de la pacienţi şi izolarea
serului. Au fost determinate IgA, respectiv IgG ASCA şi pANCA. Nivelul anticorpilor a fost exprimat în unităţi/ml
cu stabilirea unei valori cut-off de pozitivitate conform specificaţiilor producătorului.
Testarea genetică
Aceste testări au fost efectuate utilizând tehnici de genetică moleculară, respectiv PCR-RFLP (polymerase
chain reaction-restriction fragment length polymorphism), pentru determinarea polimorfismelor genelor ce
codifică TNF-alfa, IL 23R si ATG16L1. Această metodă constă din amplificarea PCR a fragmentelor dorite
utilizând primeri specifici. Produşii de amplificare au fost trataţi prin enzime de restricţie, ulterior a fost
efectuată electroforeza în gel de agar. Vizualizarea fragmentelor a fost efectuată după colorarea cu ethidium
bromide, transiluminare UV şi captura de imagine. Diagnosticul molecular a fost stabilit bazându-se pe numărul
şi lungimea fragmentelor obţinute în timpul electroforezei.
Evaluarea endoscopică
Evaluarea endoscopică a fost efectuată cu ajutorul endoscoapelor Olympus CL 160, respectiv 180 şi
Olympus Exera II. În timpul endoscopiei au fost prelevate biopsii în vederea efectuării examenului histopatologic
şi a coloraţiei imunohistochimice.
Analiza histologică şi imunohistochimică
Biopsiile obţinute endoscopic au fost fixate în formalină 4% şi ulterior în parafină pentru analiza
morfologică. Pentru evaluarea fragmentelor bioptice a fost utilizat microscopul Olympus R CX31 (Olympus SUA).
Secţiunile seriate au fost utilizate pentru detecţia prin imunofluorescenţă a apoptozei epiteliale prin metoda
Tunnel.
Analiza statistică
Analiza statistică a fost efectuată utilizând programului ”R for Windows” versiunea 3.0.1. şi SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versiunea 20 pentru Windows. Datele au fost comparate folosind
testul independent T pentru eşantioane, respectiv Mann–Whitney pentru variabile continue şi testul χ2 pentru
cele categoriale. Diferenţele dintre mai mult de 2 grupuri independente au fost testate prin testul ANOVA sau
Kruskal–Wallis. Relaţiile dintre parametri au fost caracterizate prin coeficienţii de corelaţie Spearman. Pentru
analizele de supravieţuire s-au folosit curbele Kaplan-Meier. În analizele de supravieţuire predictorii au fost
evaluaţi prin regresie Cox univariată iar pentru predicţia variabilelor binare s-a utilizat regresia logistică.
Performanţa diagnostică a parametrilor studiaţi s‐a evaluat utilizând curbele receiver operating characteristic
(ROC).
Ipoteza de lucru
Evoluţia CU variază foarte mult de la un pacient la altul. Evidenţierea unor factori predictivi clinici
pentru un anumit tip de evoluţie ar putea ajuta la delimitarea unui subset de pacienţi cu boală mai agresivă care
ar putea beneficia de un management aparte. Ne propunem ca în acest studiu să evaluăm pattern-ul evolutiv al
pacienţilor cu CU internaţi într-un centru terţiar de Gastroenterologie într-o perioadă de 10 ani. De asemenea, ne
propunem să evaluăm rata recăderilor, ratele de colectomie şi mortalitate pe aceeaşi cohortă de pacienţi în
perioada mai sus menţionată, dar şi factorii predictivi pentru fiecare parametru în parte.
Material şi metodă
Studiul a fost efectuat retrospectiv în perioada 1.01.2003-31.12.2013 în Institutul Regional de
Gastroenterologie şi Hepatologie „Prof. O. Fodor” Cluj-Napoca. Chestionarele de urmărire ale pacienţilor conţin
date demografice, statutul de fumător, apendicectomie, antecedente heredo-colaterale de BII. Din foile de
observaţie au fost extrase date privind diagnosticul, spitalizările, simptomatologia, localizarea, severitatea
puseelor, medicaţia administrată şi modificarea acesteia, intervenţiile chirurgicale, MEI. Localizarea și
severitatea bolii au fost stabilite conform clasificării Montreal. Au intrat în analizele de supravieţuire numai
pacienţii la care s-au putut identifica date despre primul puseu. S-a urmărit timpul până la următorul puseu,
timpul până la intervenţia chirurgicală.
Rezultate
În studiu au intrat un număr de 588 pacienţi, dintre care 355 au fost urmăriţi de la momentul
diagnosticului. Caracteristicile lotului pacienţilor urmăriţi de la debutul bolii sunt similare cu ale lotului general.
Localizarea cea mai fecventă este reprezentată de colita stângă şi doar 17.3% dintre pacienţi au prezentat un
prim puseu sever. 6.9% din întreg lotul de pacienţi cu CU au necesitat intervenţie chirurgicală în cursul bolii.
Incidenţa primei recurențe este maximă în primul an(28/100 pacienţi-an) şi scade apoi progresiv.
Pacienţii care au prezentat prima recurenţă până într-un an de la diagnostic au prezentat un număr mai
mare de pusee comparativ cu cei cu prima recurenţă apărută între 1-2 ani sau peste 2 ani de la diagnostic. Aceste
diferenţe au fost semnificative statistic (p<0.001). Un procent mai mare din rândul pacienţilor de sex feminin
prezintă prima recurenţă sub 6 luni comparativ cu cei de sex masculin. Un procent mai mare dintre pacienţii
diagnosticaţi sub vârsta de 40 ani prezintă prima recurenţă într-un interval sub 6 luni comparativ cu cei
diagnosticaţi peste această vârstă.
Timpul median până la primul puseu este 7.16 ani, de la al doilea la al treilea 2.05 ani, de la al treilea la al
patrulea 1.14 ani. Diferenţele între curbe sunt semnificative(p<0.01, test Log Rank). Analiza univariată şi ulterior
multivariată a identificat ca predictori independenţi ai recurenţei următorii parametri: apendicectomia,
localizarea E3 şi administrarea de corticosteroizi la puseul anterior.
Dintre toţi pacienţii, 47(8.27%) au suferit o intervenţie chirurgicală de colectomie/rezecţie colonică în
evoluţia bolii. 20 de pacienţi (42.55%) au efectuat intervenţia chirurgicală în primii 2 ani de la diagnostic. Dintre
predictorii pe care i-am evaluat, au avut un efect semnificativ asupra timpului până la intervenţie: localizarea-
clasa Montreal (p = 0.01) şi severitatea primului puseu (p < 0.01)-teste Log Rank.
S-au analizat separat cazurile de CU cu indicaţie chirurgicală de urgenţă - 22 pacienţi (46.81% dintre cei
operaţi), respectiv electivă- 25 pacienţi (53.19% dintre pacienţii cu CU operaţi). 6 dintre pacienţii cu CU au
dezvoltat neoplazie colorectală pe parcursul evoluţiei bolii; aceasta reprezintă 1.1% din întreg lotul de pacienţi,
respectiv 12.77% dintre cei care au necesitat intervenţie chirurgicală. Clasa Montreal şi severitatea sunt
predictori ai necesităţii de colectomie de urgenţă, dar după efectuarea regresiei multivariate se menţine doar
localizarea Montreal cu semnificaţie marginală.
Din totalul de 256 pacienţi urmăriţi de la debutul bolii care la primul puseu au prezentat localizare distal
de flexură stângă, 12.89% au prezentat extinderea bolii. Astfel, 9.68% dintre pacienţii cu proctită, 22.89% dintre
cei cu proctosigmoidită şi 6.25% dintre cei cu colită stânga la debut au prezentat localizări mai extinse la finalul
perioadei de urmărire.
Ipoteza de lucru
Având în vedere lipsa studiilor epidemiologice din majoritatea ţărilor est europene şi creşterea constant
raportată a incidenţei BC, cu o modificare a raportului CU/BC, ne-am propus să investigăm modificările ce au
survenit în ultima decadă în Institutul Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie Cluj-Napoca în incidenţa BC
şi în raportul dintre cele două tipuri predominante de BII, modificarea localizării și a pattern-ului la diagnostic, a
ratei intervențiilor chirurgicale.
Material şi metodă
În studiu au fost incluşi toţi pacienţii cu BC internaţi în perioada 1 ianuarie 2003 şi 31 decembrie 2013 în
Institutul Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie “O Fodor” Cluj-Napoca. Pacienţii au fost identificaţi
retrospectiv şi au fost urmăriţi până în 30 iunie 2014 sau până la deces. Din fişele de observaţie ale pacienţilor au
fost extrase atât date demografice cât şi date legate de patologie. Fenotipul BC (vârsta la diagnostic, localizarea şi
pattern-ul) BC au fost stabilit atât la diagnostic cât şi la finalul perioadei de urmărire şi a fost definit conform
clasificării Montreal. A fost notată de asemenea modificarea pattern-ului- din inflamator în stenozant sau
penetrant. Pacienţii au fost ulterior împărţiţi în două grupe: cei diagnosticaţi în perioada 1.01.2003-31.12.2007 şi
cei din perioada 1.01.2008-31.12.2013. Au fost ulterior comparate pattern-ul, localizarea bolii, medicaţia
utilizată, necesarul de intervenţii chirurgicale, modificarea pattern-ului între cele două perioade studiate.
Rezultate
Există o tendinţă crescătoare a internărilor datorate atât CU [coeficient de corelaţie = 0.79 (0.35 – 0.94), p
< 0.01], cât şi BC [coeficient de corelaţie = 0.75 (0.28 – 0.93), p = 0.01]. Dacă se analizează procentul internărilor
datorate BII, CU şi BC din totalul de internări pe un an înainte şi după 2008, se poate observa o diferenţă
semnificativă statistic: pentru BC (p = 0.01), pentru CU (p < 0.01), BII global (p < 0.01). Nu se observă însă nici o
tendinţă consistentă de variaţie a raportului BC/CU cu timpul [coeficient de corelaţie. = -0.16 (-0.69 - 0.49), p =
0.64].
Există o uşoară creştere a medianei vârstei la diagnostic în cazul pacienţilor cu BC diagnosticaţi după
2008, de la 35 la 38 de ani, dar fără semnificaţie statistică. Când se compară însă clasa A din clasificarea
Montreal, există diferenţe semnificative în încadrarea în clasele A1, A2 respectiv A3 între pacienţii cu BC
diagnosticaţi înainte şi după 2008
Distribuţia la diagnostic în cele 3 clase B ale clasificării Montreal diferă semnificativ între cele 2 perioade
studiate, cu creşterea ponderii pattern-ului inflamator şi a celui penetrant şi cu scăderea celui stenozant la
pacienţii diagnosticaţi în a doua perioadă( după 2008) comparativ cu prima( până în 2008).
Localizarea BC la diagnostic diferă semnificativ la pacienţii diagnosticaţi după 2008 comparativ cu cei
diagnosticaţi anterior. Astfel se observă o tendinţă de creştere a localizării colonice (L2) şi a celei ileale (L1),
comparativ cu cea ileo-colonică (L3) care începe să scadă. În ceea ce priveşte afectarea tractului digestiv superior
(L4) atât singură cât şi în combinaţie cu celelalte localizări, aceasta se observă exclusiv în a doua perioadă (2009-
2013).
Se poate observa că pe măsură ce creşte frecvenţa administrării imunosupresoarelor şi apare iniţierea
terapiei biologice, scade frecvenţa administrării derivaţilor de 5 ASA şi a corticoterapiei în BC. Pe parcursul
perioadei de urmărire o parte dintre pacienţi şi-au modificat pattern-ul. Astfel, 9 dintre pacienţii cu pattern B1 la
diagnostic şi-au modificat pattern-ul în B2, în timp ce 4 dintre aceştia în B3. În plus 2 dintre pacienţii cu pattern
B2 iniţial au prezentat la finalul perioadei de urmărire pattern B3. Fumatul reprezintă factor de risc pentru
agravarea pattern-ului, derivaţii 5-ASA şi steroizii factori de protecţie.
Analizând rata chirurgiei în funcţie de perioada diagnosticului, se poate observa că cei cu diagnostic mai
recent se operează mai puţin, semnificaţia fiind însă marginală (p = 0.057, test LogRank). Timpul median până la
prima intervenţie chirurgicală este de 11.6 ani pentru cei diagnosticaţi înainte de 2008.
Ipoteza de lucru
Există mai multe studii în literatură care investighează rolul factorilor demografici şi de mediu în
modificarea prezentării clinice a BII. Astfel unul dintre scopurile acestui studiu este să identifice acei factori
asociaţi cu întârzierea diagnosticului în BII. În plus actualul studiu îşi doreşte să evalueze impactul imediat al
acestei întârzieri diagnostice asupra apariţiei complicaţiilor şi asupra necesarului de intervenţii chirurgicale.
Material şi metodă
Proiectul IBD Prospect a fost iniţiat în anul 2006, prin parteneriatul a două centre medicale de referinţă.
Scopul iniţial al proiectului a fost generarea unei infrastructuri informatice de bază pentru colectarea de date
despre BII la nivel naţional, dorindu-se extinderea sa într-un număr cât mai mare de centre terţiare de diagnostic
de gastroenterologie din România. IBD Prospect reprezintă o bază de pacienţi cu BII şi este prima de acest gen în
România. Pacienţii au fost introduşi prospectiv în această bază începând din iunie 2006. Chestionarele cuprind
informaţii demografice, clinice, paraclinice, iar introducerea acestora în IBD Prospect necesită iniţial obţinerea
unui consimţământ informat.
Întârzierea diagnosticului a fost definită ca o perioadă de timp în luni de la debutul simptomelor atribuite
ulterior BII şi stabilirea diagnosticului. Am încercat să evaluăm corelaţia între întârzierea diagnosticului şi
factori ce ţin de pacient şi boală. Factorii care au fost analizaţi sunt: sex, vârstă la diagnostic, mediu de
provenienţă regiune geografică, grup etnic, localizare boală, fumat la diagnostic, prezenţa MEI, debutul
simptomelor în timpul lunilor de vară,
În a doua parte a studiului ne-am referit doar la grupul cu BC. Am utilizat modelul de regresie logistică
pentru a stabili dacă întârzierea diagnosticului în BII are un efect asupra următorilor parametri: apariţia
complicaţiilor: stenoze intestinale, fistule (entero-enterale, enterocutanate, entero-vezicale), boală perianală
(fistulele perianale), intervenţii chirurgicale (rezecţie intestinală, colectomie, colostomie, ileostomie), intervenţii
chirurgicale pentru tratamentul fistulelor şi/sau abceselor perianale (drenaj abces, fistulotomie sau
fistulectomie).
Rezultate
Un număr total de 1495 pacienţi au intrat în baza IBD Prospect. Datele privitoare la întârzierea
diagnosticului au fost disponibile pentru 1196 pacienţi. Mediana timpului de la diagnostic la intrarea în bază a
fost de 4 luni pentru toate cele 3 patologii studiate. Întârzierea diagnosticului a diferit semnificativ între grupul
cu BC şi CU (p≤0.001) şi între grupul cu CU şi CN (p≤0.01); diferenţa a fost nesemnificativă între pacienţii cu BC şi
CN (p=0.51). 50% dintre pacienţii cu BC au fost diagnosticaţi în primele 5 luni de la debutul simptomelor, faţă de
numai 1 lună pentru CU şi 4 luni în CN.
La analiza de regresie logistică univariată pentru pacienţii cu BC localizarea extraileală se corelează
negativ cu întârzierea mare a diagnosticului (p=0.002), în timp ce statutul de fumător activ la momentul
diagnosticului şi debutul simptomatologiei în timpul lunilor de vară( spre deosebire de celelalte luni ale anului)
au fost ambele factori de risc pentru diagnostic tardiv al BC (p=0.05, respectiv p<0.001). În grupul cu CU regresia
logistică univariată a identificat vârsta la debut peste 40 ani ca factor protector pentru stabilirea tardivă a
diagnosticului( p=0.04); semnificaţia se menţine după includerea în analiza multivariată.
Întârzierea diagnosticului s-a asociat semnificativ cu dezvoltarea stenozelor intestinale(OR; 3.38, p<0.001
pentru subgrupul situat peste percentila 75) împreună cu antecedentele de apendicectomie (OR: 2.12, p=0.01) şi
durata bolii (OR: 1.04, p=0.04). Pentru fistulele intestinale întârzierea diagnosticului a fost un predictor
semnificativ (OR: 2.64, p=0.08 pentru grupul >percentila 75), la fel şi apendicectomia în antecedente (OR: 4.1;
p=0.000). Vârsta peste 40 de ani la diagnostic a reprezentat un factor protector pentru dezvoltarea fistulelor
intestinale (OR: 0.29, p=0.01).
În legătură cu fistulele perianale, apartenenţa la un alt grup etnic decât român reprezintă un factor de risc
(OR: 2.13, p=0.05); întârzierea diagnosticului- grupul cuprins între percentila 25-50% se asociază de asemenea
cu acest risc (OR: 4.32, p=0.01). Durata bolii( OR: 1.04, p=0.02), apendicectomia (OR: 2.23, p<0.001) şi
subgrupurile de întârziere cuprinse între 50-75%(OR: 1.86, p=0.05) şi > 75% (OR: 1.96, p=0.03) s-au asociat cu
un risc mai mare de intervenţie chirurgicală pentru orice complicaţie datorată BC. Sexul feminin a reprezentat un
factor protector pentru acest risc(OR: 0.63, p=0.04). Cu riscul de intervenţie chirurgicală pentru patologia
perianală nu s-a asociat semnificativ nici una dintre variabilele studiate. Rezecţia intestinală în BC a fost prezisă
de istoricul de apendicectomie(OR: 2.6, p<0.001), durata bolii(OR: 1.07, p<0.001) şi întârzierea diagnosticului
subgrupul 50-75%(OR: 2.24, p=0.04). Etnia diferită de cea română s-a asociat cu acest risc dar fără a prezenta
semnificaţie statistică(OR: 1.82, p=0.07)
Ipoteza de lucru
Cercetarea de faţă a pornit de la premisa că autofagia joacă un rol central în patogeneza BC şi că există
corelaţii genotip- fenotip demonstrate în câteva studii din literatura de specialitate. În plus afectarea autofagiei
se poate asocia cu pierderea toleranţei la antigenele microbiene şi apariţia anticorpilor microbieni pe de o parte
şi cu prezenţa granuloamelor pe piesele de biopsie la pacienţii cu BC. Studiul de faţă are mai multe obiective:
genotiparea ATG16L1 la pacienţii cu BC şi la martori, determinarea ASCA IgA şi IgG şi a pANCA la pacienţii cu BC,
corelaţii genotip-fenotip, corelaţii genotip-markeri serologici.
Material şi metodă
Populaţia studiată include 83 pacienţi cu BC şi 104 voluntari sănătoşi. Grupul voluntarilor a fost similar cu
cel al pacienţilor cu BC din punct de vedere al vârstei şi sexului. S-a urmărit ulterior asocierea între prezența
polimorfismului ATG 16 L1 și a markerilor serologici și caracteristicile fenotipice ale BC.
Rezultate
Distribuţia genotipului ATG16L1 în lotul nostru a fost următoarea: 30.1% sunt homozigoţi pentru această
mutaţie, 50.6% heterozigoţi, iar 19.3% prezintă varianta normală. In ceea ce priveşte markerii serologici, 32.5%
dintre pacienţi au prezentat IgG ASCA si 72.3% IgA ASCA pozitivi, în timp ce doar 13.3% au prezentat pANCA.
Localizarea bolii a fost diferită comparând categoriile mai sus menţionate(p<0.01, respectiv p=0.01) cu
predominanţa netă a localizării la nivelul ileonului terminal la homozigoţii (GG) si heterozigoţii (GA) pentru
mutaţia ATG16L1 comparativ cu cei ce prezintă varianta normală. Afectarea tractului digestiv superior( L4 în
clasificarea Montreal) nu a diferit în funcţie de genotipul ATG16L1. Dintre toate variantele de combinaţii
posibile, interacţiunea între polimorfismul ATG şi clasa B din clasificarea Montreal se obţine semnificaţie
statistică doar comparând grupul GG cu AA între B1 şi restul lotului (p = 0.02, test Fisher).
MEI sunt mult mai frecvente la purtătorii a cel puţin a unei alele de risc; astfel comparaţiile genotipului GG
versus AA şi AA versus non AA au atins semnificaţia statistică. Corelaţia genotip ATG16L1- pattern BC atinge
doar semnificaţia marginală când se compară grupul homozigot pentru această mutaţie cu grupul cu varianta
normală, cu predominenţă genotipului GG în cazul pattern-ului complicat. Procentul pacienţilor operaţi cu
recidivă postoperatorie a fost mai mare în cadrul grupului cu genotip GG comparativ cu restul lotului;
semnificaţia este însă marginală.
Valorice serice ale ASCA (atât IgA cât şi IgG) au fost mai mici la pacienţii cu pattern inflamator (B1)
comparativ cu cel complicat( stenozant-B2 sau penetrant-B3), dar fără ca diferenţa să atingă semnificaţia
statistică. Nivelul IgA ASCA a fost semnificativ mai mare în cazul pacienţilor cu vârsta de debut mai mică. Valorile
ASCA IgG (p= 0.01) şi ASCA IgA (p < 0.01) au fost semnificativ mai mari la pacienţii care au necesitat intervenţie
chirurgicală comparativ cu cei neoperaţi. Nivelul ASCA IgG fost semnificativ mai mare la pacienţii cu BC operaţi
care au prezentat recidivă postoperatorie comparativ cu restul pacienţilor. Nivelul pANCA diferă semnificativ
între categoriile fumător/nefumător/fost fumător, p= 0.02. Deşi se observă sume de cvartile mai mari la cazurile
complicate, diferenţa nu atinge semnificaţia statistică (p = 0.44, test Cochran-Mantel-Haenszel).
Studiul 5. Rolul markerilor serologici și a polimorfismelor genetice în
predicţia răspunsului la terapia anti-TNF alfa în bolile inflamatorii
intestinale
Ipoteza de lucru
Cercetarea de faţă a pornit de la premisa că nu există o rată de răspuns de 100% după administrarea
terapiei anti TNF-alfa şi că răspunsul la terapie într-o afecţiune atât de heterogenă ca BII este influenţat de o
multitudine de factori ca durata bolii, fenotip, severitate. Au fost identificate și polimorfisme asociate nu doar cu
creşterea riscului de efecte secundare induse de o anumită terapie, ci şi cu tipul de răspuns. În cest context,
studiul de faţă s-a desfăşurat în mai multe etape, având următoarele obiective: stabilirea efectului terapiei anti
TNF-alfa (IFX şi ADA) asupra apoptozei celulelor intestinale la pacienţii cu boli inflamatorii intestinale, stabilirea
unei corelaţii între predictorii clinici şi genetici de răspuns la terapia anti TNF-alfa, stabilirea unei corelații între
scăderea ratei apoptotice induse de terapia anti TNF-alfa și vindecarea mucozală.
Material şi metodă
În acest studiu au fost incluşi pacienţi cu BII cu indicaţie de terapie anti TNF- alfa internaţi în cadrul
Institutului Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie şi în cadrul Centrului Medical de Gastroenterologie şi
Hepatologie Cluj-Napoca în perioada 2010-2014.
Parametrii urmăriţi înaintea și după administrarea terapiei anti TNF-alfa au constat din: date demografice,
date despre boală(durata bolii, localizarea, pattern-ul evolutiv, indicaţia pentru terapia anti TNF-alfa, tratament
medicamentos anterior/concomitent cu terapia actuală, severitate), markeri serici uzuali: hemoglobina, VSH,
proteina C reactivă, markeri serologici(ASCA și pANCA) și markeri genetici( IL23R, TNF alfa). S-a efectuat
colonoscopie cu ileoscopie terminala cu prelevarea de biopsii din ariile inflamate( pentru determinarea
activităţii histologice şi imunohistochimie), înainte și după terapia de inducție. Ulterior s-a urmărit dacă există o
modificare a ratei apoptotice după terapia biologică şi dacă scăderea ratei apoptotice se corelează cu vindecarea
mucozală.
Pentru întreg lotul de pacienţi a fost evaluat răspunsul la terapia de inducţie. Ulterior, grupul de pacienţi
care au fost urmăriţi şi pe perioada terapiei de menţinere a fost analizat pentru pierderea răspunsului la terapia
biologică şi pentru necesitatea escaladării dozei.
Rezultate
În perioada studiată 87 de pacienţi au prezentat indicaţie pentru administrarea terapiei anti TNF-alfa, 40
pacienţi cu BC şi 47 pacienţi cu CU. Se poate observa că există o scădere a medianei probelor inflamatorii (VSH,
PCR) la finalul terapiei de inducţie şi o creştere a valorii Hgb. Distribuţia celor două polimorfisme studiate (TNF
alpha 308 şi IL23R rs 10889677) diferă semnificativ între pacienţii cu CU şi BC.
Polimorfismul TNF-alfa 308 (varianta homozigotă- AA) este semnificativ mai frecvent printre non-
responderii la TB comparativ cu responderii la această terapie. În ceea ce priveşte polimorfismul IL23R studiat,
variantele mutante (homozigot-CC, respectiv heterozigot-AC) sunt mult mai frecvente la pacienţii responderi
comparativ cu non-responderii la TB (p<0.001).
Dintre predictorii studiaţi pentru lipsa primară a răspunsului la terapia de inducţie, în cazul pacienţilor cu
CU au atins semnificaţie statistică doar mediul rural care se asociază cu lipsa primară de răspuns şi prezenţa
polimorfismului IL23R (grupul format din variantele homozigotă şi heterozigotă) ca factor protector. Factorii de
risc pentru lipsa de răspuns în grupul cu BC sunt: etnia diferită de cea română, mediul de provenienţă rural,
valoarea mică a Hgb pre-TB şi valoarea serică scăzută a ASCA IgA. Prezenţa variantelor mutante ale IL23R creşte
şansa de răspuns, chiar dacă nesemnificativ şi în acest subgrup.
Un total de 10 pacienţi au necesitat intervenţie chirurgicală pe parcursul urmăririi- 5 în timpul inducţiei, 5
în timpul terapiei de menţinere. Dintre predictorii studiaţi doar valoarea VSH-ului şi a Hgb înainte de iniţiere s-
au corelat semnificativ cu necesarul de chirurgie din timpul terapiei biologice( pentru pacienţii cu CU). Astfel, o
valoare mai mare a VSH-ului, respectiv o valoare mai mică a Hgb înaintea terapiei de inducţie cresc riscul
intervenţiei chirurgicale.
Opt pacienţi (9.25% din întreg lotul) au necesitat creşterea dozelor în cursul terapiei biologice pentru
menţinerea răspunsului. Dintre predictorii studiaţi pentru subgrupul cu CU, nici una dintre variabile nu s-a
corelat semnificativ cu acest risc; totuşi durata bolii la iniţiere peste 2 ani şi asocierea la terapia biologică de
imunosupresoare scad riscul escaladării dozei, dar nivelul seric crescut al ASCA IgA creşte acest risc. În cazul
pacienţilor cu BC fumatul creşte semnificativ riscul creşterii dozei de agenţi anti TNF-alfa, iar categoria de vârstă
A3, valoarea crescută a VSH-ului şi PCR înainte de iniţierea terapiei se asociază dar nesemnificativ cu acest
eveniment. În schimb valoarea crescută a Hgb înainte de iniţierea terapiei biologice scade acest risc.
Dintre cei 69 de pacienţi care au fost urmăriţi pe perioada terapiei de menţinere, 9 au prezentat pierderea
secundară a răspunsului la terapia biologică. Dintre predictorii evaluaţi, s-au corelat cu acest aspect,
nesemnificativ însă, următorii parametri: nivelul crescut al VSH-ului pretratament, nivelul seric crescut al ASCA
şi vârsta tânără la iniţiere(pentru pacienţii cu CU) şi valoarea crescută a PCR înainte de iniţiere (pentru pacienții
cu BC).
Determinarea ratei apoptotice pe epiteliul intestinal a fost posibilă doar pentru 27 pacienţi cu CU; această
determinare a fost efectuată înainte şi după terapia de inducţie. Există o scădere clară a ratei apoptozei celulare
intestinale pe biopsiile obţinute după terapia de inducţie comparativ cu biopsiile prelevate înainte. Astfel,
valoarea medie a ratei apoptotice înainte de iniţierea terapiei biologice a fost de 74.67% (44-94%), iar după
terapia de inducție a fost de 24.33% (5-45%). Diferenţa între aceste două valori a fost semnificativă: OR: 50.33
(CI95%: 43.29-57.38), p<0.001. Acest aspect este reprezentat grafic în figura 3. Scăderea ratei apoptotice a fost
semnificativ mai mare la pacienții la care s-a obținut vindecare mucozală (mediana-62%) comparativ cu cei fără
vindecarea mucoasei (mediana – 39.5%), p<0.001.
CONCLUZII GENERALE
1. Până la 96% dintre pacienţii cu colită ulcerativă recad în primii 5 ani de la diagnostic. Incidenţa primei
recurenţe este maximă în primul an şi scade apoi progresiv. Pacienţii cu un interval scurt până la prima
recurenţă vor prezenta un număr mai mare de recăderi în perioada următoare.
2. Ca şi predictori independenţi ai recurenţei, studiul nostru a identificat următorii factori: apendicectomia,
colita extinsă şi administrarea de corticosteroizi la puseul anterior.
3. 8.27% din întreg lotul au suferit o intervenţie chirurgicală de colectomie în evoluţia bolii. Jumătate
dintre indicaţiile de intervenţie au fost de urgenţă şi doar un procent relativ mic de a prezentat cancer
colo-rectal ca indicaţie a intervenţiei chirurgicale.
4. Puseul iniţial sever reprezintă singurul predictor independent al colectomiei. Localizarea bolii( colita
extinsă) şi severitatea bolii sunt predictori ai colectomiei în urgenţă.
5. Nu se observă nici o tendinţă consistentă de variaţie a raportului boală Crohn /colită ulcerativă cu
timpul, dar există o creştere constantă a proporţiei de internări datorate bolii Crohn din totalul de
internări în perioada studiată.
6. Există diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte pattern-ul bolii la diagnostic între cele 2
perioade studiate, cu creşterea ponderii pattern-ului inflamator şi a celui penetrant şi cu scăderea celui
stenozant şi modificări ale localizării bolii în funcţie de perioada în care a fost stabilit diagnosticul. Astfel
se poate observa creşterea frecvenţei afectării colonice şi la nivelul ileonului terminal, cu scăderea
afectării ileo-colonice, în timp ce afectarea tractului digestiv superior se observă doar în a doua
perioadă.
7. Există diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte terapia utilizată; astfel se poate observa că pe
măsură ce creşte frecvenţa administrării imunosupresoarelor şi apare iniţierea terapiei biologice, scade
frecvenţa administrării derivaţilor 5- ASA şi a corticoterapiei în boala Crohn.
8. Se poate observa o uşoară scădere a ponderii pacienţilor operaţi la diagnostic- de la 13.2% dintre cei
diagnosticaţi până în 2008 la 8.8% dintre cei diagnosticaţi în a doua perioadă. Dacă se analizează rata
chirurgiei în funcţie de perioada diagnosticului, se poate observa că cei cu diagnostic mai recent se
operează mai puţin, semnificaţia fiind însă marginală.
9. Întârzierea diagnosticului este mai importantă la pacienţii cu boală Crohn comparativ cu cei cu colită
ulcerativă.
10. Vârsta tânără la diagnostic(<40 ani) în cazul pacienţilor cu colită ulcerativă şi localizarea ileală, debutul
simptomatologiei în cursul lunilor de vară şi statutul de fumător activ în momentul diagnosticului în
cazul pacienţilor cu boală Crohn se asociază cu un interval de timp mai lung între debutul simptomelor
şi diagnostic.
11. Întârzierea diagnosticului s-a asociat semnificativ cu dezvoltarea stenozelor şi fistulelor intestinale şi a
patologiei perianale. Acest factor s-a asociat semnificativ şi cu riscul de rezecţie intestinală.
12. Diferenţa dintre frecvenţele alelelor genei de autofagie studiate- ATG 16 L1 între martori şi lotul de
pacienţi cu boală Crohn a fost nesemnificativă.
13. Legătura între afectarea procesului de autofagie şi fenotipul bolii Crohn a fost relevat de faptul că
prezenţa cel puţin a unei alele conferă risc crescut de localizare ileală. În plus absenţa acestei mutaţii se
corelează cu prezenţa pattern-ului inflamator.
14. Nu există nici o relaţie între prezenţa granuloamelor pe piesele de biopsie ale pacienţilor cu boală Crohn
şi variantele genei ATG16L1.
15. Markerii serologici ASCA IgA şi IgG se evidenţiază mai frecvent în cazurile complicate, ce necesită
intervenţie chirurgicală şi ce prezintă recidivă postoperatorie comparativ cu cazurile necomplicate.
Forma colonică prezintă însă mai frecvent pANCA pozitivi.
16. 10.34% din întreg lotul de pacienţi nu au răspuns la terapia de inducţie şi un procent egal de pacienţi au
prezentat pierderea secundară a răspunsului la terapia biologică.
17. Dintre caracteristicile demografice studiate, doar provenienţa din mediul rural şi vârsta tânără la
diagnostic s-au corelat negativ, respectiv pozitiv cu răspunsul la terapia de inducţie. Continuarea
fumatului la pacienţii cu boală Crohn s-a corelat cu evoluţia nefavorabilă pe parcursul tratamentului.
18. Valorile crescute al probelor inflamatorii( VSH, PCR) înainte de iniţierea terapiei biologice s-au asociat
cu o evoluţie nefavorabilă, reflectată prin necesarul de colectomie, necesitatea escaladării dozei de
biologice şi pierderea secundară a răspunsului. Valoarea scăzută a hemoglobinei s-a asociat cu lipsa
primară a răspunsului, cu necesarul escaladării dozei, dar şi cu riscul de intervenţie chirurgicală.
19. Prezenţa pANCA s-a asociat cu lipsa primară de răspuns şi cu lipsa renunţării la corticoterapie, în timp
ce prezenţa ASCA sau titrul crescut al acestui marker se asociază cu o rată mai mare de răspuns primar
şi de renunţare la corticoterapie.
20. Varianta homozigotă a mutaţiei TNF-alfa 308 este semnificativ mai frecventă printre non-responderi
comparativ cu responderii la terapia biologică. Variantele mutante( homozigot, respectiv heterozigot)
ale genei IL23R rs 10889677 sunt mult mai frecvente la pacienţii responderi comparativ cu non-
responderii.
21. Terapia biologică induce apoptoza celulelor epiteliale intestinale, cu o scădere semnificativă a ratei
apoptotice intestinale la finalul terapiei de inducţie.
SUMMARY OF THE Ph.D. THESIS
5. STUDY 3. DIAGNOSIS DELAY IN THE INFLAMMATORY BOWEL DISEASES - RISK FACTORS AND
IMPACT ON THE OCCURANCE OF COMPLICATIONS AND THE NEED FOR SURGERY – IBD PROSPECT ........ 76
5.1 Introduction .................................................................................................................... 77
5.2 Objectives of the research ................................................................................................. 78
5.3 Material And Methods ...................................................................................................... 78
5.4 Results ............................................................................................................................. 80
5.5 Discussions ....................................................................................................................... 86
5.6 Conclussions .................................................................................................................. 89
7. STUDY 5. THE ROLE OF SERIOLOGIC MARKERS AND GENETIC POLYMORPHISMS IN THE PREDICTION OF
THE RESPONSE TO ANTI-TNF THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASES ................................ 111
7. 1 Introduction ................................................................................................................... 111
7.2 Objectives of the research .............................................................................................. 112
7. 3 Material And Methods.................................................................................................... 112
7. 4 Results ........................................................................................................................... 114
7.5. Discussions .................................................................................................................. 124
7.6. Conclusions ................................................................................................................... 128
Key Words: inflammatory bowel diseases (IBD), ulcerative colitis (UC), Crohn’s disease (CD),
indeterminate colitis (IC), recurrence, colectomy, complications, extraintestinal manifestations
(EIM), phenotype, genotype, autophagy, biological therapy, apoptosis.
Introduction
The inflammatory bowel diseases(IBD) represents a pathology with a continuously increasing incidence,
not only in the high incidence areas reported previously, but especially in areas where they had been regarded as
rare diseases no so long ago. Moreover, the improvement of the investigation methods used in order to
determine the diagnosis and the introduction of therapies meant to change their natural evolution, changed the
phenotype expression, as well as the evolution of that pathology. Moreover, underlining the clinical factors of the
diagnosis that predict a certain type of evolution in the UC can identify patient subgroups that could benefit from
a more aggressive therapy and close monitoring from the start.
The diagnosis of IBD can be, most of the times, a challenge, especially in the cases with moderate clinical
activity, due to the interference with the functional pathology symptomatology. The diagnosis delay is associated
not only with the impact on the life quality of these patients, but also with the reduction of the response to
therapy. Moreover, IBD diagnosis delay can have an extremely important impact on the risk for complications
and surgery that represents an important moment of the natural history of these diseases.
The more elaborate researches to determine IBD etiopathogenesis have identified a series of diverse
genetic and immunologic basis, meant to help identify individualized, targeted therapies. Thus, involving the
autophagy in the process of recognizing the intestinal allergens was recognized as a process promoting the
immune tolerance loss in Crohn’s disease. Moreover, the impact of the genes involved in the autophagy on the
phenotype expression and on the risk for complications was very much studied lately and one tried to create a
combined predictive clinical-serologic-genetic score.
Identifying the genetic predictors of response to therapy is a basic concern of the pharmacogenomics, a
branch that is so evolved in other fields of medicine. Why is this an important concern? Because, at least
theoretically, in this pathology, there exists the possibility of accessing a different type of management – “step-up
versus top-down” – and the subgroup of patients that would benefit mostly of the treatment should be identified
at the diagnosis. If we take into account the high cost of the biological therapy, but also its side effects, this aspect
requires even more clarifications.
General Methodology
Patients
All studies included in the chapter “Personal Contributions”, except for the third study, were performed at
“Octavian Fodor” Regional Institute for Gastroenterology and Hepatology, Cluj-Napoca. The third study was
performed with the use of the IBD Prospect data basis – the national data basis for IBD that includes patients
from more university centers in the country. The patients in the prospective studies, i.e. the 3rd, 4th and 5th study
were included after giving their informed consent, signing a form that was previously approved by the Ethics
Committee of “Iuliu Hatieganu” University of Medicine and Pharmacy, together with each study protocol (for the
4th and 5th study), i.e. the informed consent for the inclusion into the IBD Prospect data basis, previously
approved by the Scientific Committee of the Romanian Crohn’s and Colitis Club.
Laboratory tests
The following parameters were determined: the erythrocyte sedimentation rate - ESR (using the
Westergren methods, adapted to the Seditainer values), C reactive protein – CRP (with the biochemical analyzer
Konelab 60) and the complete blood count (on Mindray 6800 hematology analyzer). The serologic
determinations were performed using the Elisa technique, after the previous centrifugation of the blood sampled
from patients and isolating the serum. The IgA, i.s. IgG ASCA and pANCA were determined. The level of
antibodies was expressed in units/ml, determining a positivity cut-off value as per manufacturer’s specifications.
Genetic Testing
These testings were performed using molecular genetic techniques, i.e. PCR-RFLP (polymerase chain
reaction - restriction fragment length polymorphism), to determine the gene polymorphisms that codify TNF-
alfa, IL 23R and ATG16L1. This method consists of PCR amplifying of certain fragments, using specific polymers.
The amplification products were treated with restriction enzymes; afterwards the electrophoresis in agarose gel
was performed. The visualization of the fragments was performed after coloring with ethidium bromide, UV
transillumination and image capturing. The molecular diagnosis was determined based on the number and
length of the fragments obtained during the electrophoresis.
Endoscopic Evaluation
The endoscopic evaluation was performed with the Olympus CL 160, i.e. 180 and Olympus Exera II
endoscopes. During the endoscopy, biopsies were sampled, in order to determine the histopathological activity
and to perform immunohistochemical analysis.
Histological and Immunohistochemical Analysis
The biopsies obtained with the endoscope were fixed in 40% formalin and later in paraffin, for the
morphological analysis. For the evaluation of the bioptic fragments, the microscope Olympus R CX31 (Olympus
SUA) was used. The series sections were used to detect by immunofluorescence the epithelial apoptosis using
the Tunnel method.
Statistical Analysis
The statistical analysis was made using the “R for Windows” program, version 3.0.1. and SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences), version 20 for Windows. The data were compared with the independent T for
samples, i.e. Mann–Whitney for continuous variables and χ2 for the categorical variables. The differences
between parameters were characterized by Spearman correlation coefficients. For the survival analyses, the
Kaplan-Meier curves were used. In the survival analyses, the predictors were evaluated with the univariate Cox
regression, and for the prediction of the binary variables, the logistic regression was used. The diagnosis
performance of the studied parameters was evaluated using the receiver operating characteristic (ROC) curves.