Sunteți pe pagina 1din 22

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Factori modulatori ai evoluţiei bolilor


inflamatorii intestinale

Doctorand Delia Roxana Zaharie

Conducător de doctorat Prof. dr. Vasile Andreica


Cuvinte cheie: boli inflamatorii intestinale (BII), colită ulcerativă (CU), boală Crohn (BC), colita
nedeterminată (CN), recurenţă, colectomie, complicaţii, manifestări extraintestinale (MEI), fenotip,
genotip, autofagie, terapie biologică, apoptoză.

Introducere
Bolile inflamatorii intestinale (BII) reprezintă afecţiuni cu incidenţă în continuă creştere nu doar în zonele
cu incidenţă raportată anterior înaltă ci mai ales în zone unde până nu demult acestea erau considerate boli rare.
În plus îmbunătăţirea metodelor de investigare utilizate în vederea stabilirii diagnosticului dar şi introducerea
unor terapii menite să modifice cursul natural al acestora au schimbat expresia fenotipică dar şi evoluţia
patologiei respective. În plus evidenţierea acelor factori clinici prezenţi la diagnostic ce prezic un anumit tip de
evoluţie în CU pot identifica subgrupuri de pacienţi ce ar putea beneficia de terapie mai agresivă şi de
monitorizare mai atentă încă de la debut.
Diagnosticarea BII poate constitui de cele mai multe ori o provocare, mai ales în cazurile cu activitate
clinică moderată, datorită suprapunerii cu simptomatologia patologiei funcţionale. Întârzierea diagnosticului se
asociază nu doar cu afectarea calităţii vieţii acestor pacienţi, dar şi cu reducerea răspunsului la terapia
medicamentoasă. În plus, întârzierea diagnosticului în BII poate avea un impact extrem de important asupra
riscului de complicaţii şi intervenţii chirurgicale care reprezintă un moment important al istoriei naturale a
acestor patologii.
Cercetările tot mai elaborate în vederea stabilirii etiopatogenezei bolilor inflamatorii intestinale au
identificat o serie de substraturi genetice şi imunologice diverse menite să ajute la identificarea unor terapii
individualizate, ţintite. Astfel, implicarea autofagiei în procesul de recunoaştere a alergenilor intestinali a fost
recunoscut ca proces promotor al pierderii toleranţei imune în boala Crohn. În plus, în ultima perioadă a fost
foarte mult studiat impactul genelor implicate în autofagie asupra expresiei fenotipice şi asupra riscului de
complicaţii și s-a încercat elaborarea unui scor predictiv combinat- clinic- serologic- genetic.
Identificarea unor predictori genetici ai răspunsului la terapie constituie preocuparea de bază a
farmacogenomicii, ramură atât de dezvoltată în alte domenii ale medicinii. De ce reprezintă un aspect atât de
important? Pentru că cel puţin teoretic în această patologie există posibilitatea accesării unui tip diferit de
management- „step-up versus top-down” şi identificarea acelui subgrup de pacienţi care ar beneficia cel mai
mult de pe urma unui tratament ar trebui identificat încă de la diagnostic. Dacă vorbim despre costul ridicat al
terapiei biologice dar şi de efectele secundare ale acesteia, acest aspect devine şi mai important de elucidat.

Metodologie generală
Pacienţi
Toate studiile cuprinse în capitolul “Contribuţia Personală”, cu excepţia celui de al treilea studiu, s-au
desfăşurat în cadrul Institutului Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie “Prof. Dr. Octavian Fodor” Cluj-
Napoca. Cel de al treilea studiu a fost efectuat beneficiind de date din baza IBD Prospect – baza naţională de boli
inflamatorii intestinale care întruneşte pacienţi din mai multe centre universitare din ţară. Pacienţii din studiile
efectuate prospectiv, respectiv studiile trei, patru şi cinci au fost incluşi după ce şi-au dat consimţământul
informat, semnând un formular ce a fost aprobat în prealabil de către Comisia de Etică a Universităţii de
Medicină şi Farmacie ”Iuliu Haţieganu”, împreună cu fiecare protocol de studiu (pentru studiile patru si cinci),
respectiv consimţământ informat pentru includere în baza IBD Prospect aprobat în prealabil de Comitetul
ştiinţific al Clubului Român de Colită şi Crohn.
Investigaţii de laborator
Au fost determinaţi următorii parametri: viteza de sedimentare a hematiilor-VSH (prin metoda
Westergren, adaptată la valorile Seditainer), proteina C reactivă-PCR (cu ajutorul analizorului de biochimie
Konelab 60) şi hemoleucograma (pe analizorul de hematologie Mindray 6800). Determinările serologice au fost
efectuate utilizând tehnica Elisa, după centrifugarea prealabilă a sângelui prelevat de la pacienţi şi izolarea
serului. Au fost determinate IgA, respectiv IgG ASCA şi pANCA. Nivelul anticorpilor a fost exprimat în unităţi/ml
cu stabilirea unei valori cut-off de pozitivitate conform specificaţiilor producătorului.
Testarea genetică
Aceste testări au fost efectuate utilizând tehnici de genetică moleculară, respectiv PCR-RFLP (polymerase
chain reaction-restriction fragment length polymorphism), pentru determinarea polimorfismelor genelor ce
codifică TNF-alfa, IL 23R si ATG16L1. Această metodă constă din amplificarea PCR a fragmentelor dorite
utilizând primeri specifici. Produşii de amplificare au fost trataţi prin enzime de restricţie, ulterior a fost
efectuată electroforeza în gel de agar. Vizualizarea fragmentelor a fost efectuată după colorarea cu ethidium
bromide, transiluminare UV şi captura de imagine. Diagnosticul molecular a fost stabilit bazându-se pe numărul
şi lungimea fragmentelor obţinute în timpul electroforezei.
Evaluarea endoscopică
Evaluarea endoscopică a fost efectuată cu ajutorul endoscoapelor Olympus CL 160, respectiv 180 şi
Olympus Exera II. În timpul endoscopiei au fost prelevate biopsii în vederea efectuării examenului histopatologic
şi a coloraţiei imunohistochimice.
Analiza histologică şi imunohistochimică
Biopsiile obţinute endoscopic au fost fixate în formalină 4% şi ulterior în parafină pentru analiza
morfologică. Pentru evaluarea fragmentelor bioptice a fost utilizat microscopul Olympus R CX31 (Olympus SUA).
Secţiunile seriate au fost utilizate pentru detecţia prin imunofluorescenţă a apoptozei epiteliale prin metoda
Tunnel.
Analiza statistică
Analiza statistică a fost efectuată utilizând programului ”R for Windows” versiunea 3.0.1. şi SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versiunea 20 pentru Windows. Datele au fost comparate folosind
testul independent T pentru eşantioane, respectiv Mann–Whitney pentru variabile continue şi testul χ2 pentru
cele categoriale. Diferenţele dintre mai mult de 2 grupuri independente au fost testate prin testul ANOVA sau
Kruskal–Wallis. Relaţiile dintre parametri au fost caracterizate prin coeficienţii de corelaţie Spearman. Pentru
analizele de supravieţuire s-au folosit curbele Kaplan-Meier. În analizele de supravieţuire predictorii au fost
evaluaţi prin regresie Cox univariată iar pentru predicţia variabilelor binare s-a utilizat regresia logistică.
Performanţa diagnostică a parametrilor studiaţi s‐a evaluat utilizând curbele receiver operating characteristic
(ROC).

Studiul 1. Evoluţia colitei ulcerative într-un centru terţiar de


Gastroenterologie şi Chirurgie din România- influenţa fenotipului la
diagnostic și a altor factori prognostici asupra cursului natural al bolii

Ipoteza de lucru
Evoluţia CU variază foarte mult de la un pacient la altul. Evidenţierea unor factori predictivi clinici
pentru un anumit tip de evoluţie ar putea ajuta la delimitarea unui subset de pacienţi cu boală mai agresivă care
ar putea beneficia de un management aparte. Ne propunem ca în acest studiu să evaluăm pattern-ul evolutiv al
pacienţilor cu CU internaţi într-un centru terţiar de Gastroenterologie într-o perioadă de 10 ani. De asemenea, ne
propunem să evaluăm rata recăderilor, ratele de colectomie şi mortalitate pe aceeaşi cohortă de pacienţi în
perioada mai sus menţionată, dar şi factorii predictivi pentru fiecare parametru în parte.
Material şi metodă
Studiul a fost efectuat retrospectiv în perioada 1.01.2003-31.12.2013 în Institutul Regional de
Gastroenterologie şi Hepatologie „Prof. O. Fodor” Cluj-Napoca. Chestionarele de urmărire ale pacienţilor conţin
date demografice, statutul de fumător, apendicectomie, antecedente heredo-colaterale de BII. Din foile de
observaţie au fost extrase date privind diagnosticul, spitalizările, simptomatologia, localizarea, severitatea
puseelor, medicaţia administrată şi modificarea acesteia, intervenţiile chirurgicale, MEI. Localizarea și
severitatea bolii au fost stabilite conform clasificării Montreal. Au intrat în analizele de supravieţuire numai
pacienţii la care s-au putut identifica date despre primul puseu. S-a urmărit timpul până la următorul puseu,
timpul până la intervenţia chirurgicală.
Rezultate
În studiu au intrat un număr de 588 pacienţi, dintre care 355 au fost urmăriţi de la momentul
diagnosticului. Caracteristicile lotului pacienţilor urmăriţi de la debutul bolii sunt similare cu ale lotului general.
Localizarea cea mai fecventă este reprezentată de colita stângă şi doar 17.3% dintre pacienţi au prezentat un
prim puseu sever. 6.9% din întreg lotul de pacienţi cu CU au necesitat intervenţie chirurgicală în cursul bolii.
Incidenţa primei recurențe este maximă în primul an(28/100 pacienţi-an) şi scade apoi progresiv.
Pacienţii care au prezentat prima recurenţă până într-un an de la diagnostic au prezentat un număr mai
mare de pusee comparativ cu cei cu prima recurenţă apărută între 1-2 ani sau peste 2 ani de la diagnostic. Aceste
diferenţe au fost semnificative statistic (p<0.001). Un procent mai mare din rândul pacienţilor de sex feminin
prezintă prima recurenţă sub 6 luni comparativ cu cei de sex masculin. Un procent mai mare dintre pacienţii
diagnosticaţi sub vârsta de 40 ani prezintă prima recurenţă într-un interval sub 6 luni comparativ cu cei
diagnosticaţi peste această vârstă.
Timpul median până la primul puseu este 7.16 ani, de la al doilea la al treilea 2.05 ani, de la al treilea la al
patrulea 1.14 ani. Diferenţele între curbe sunt semnificative(p<0.01, test Log Rank). Analiza univariată şi ulterior
multivariată a identificat ca predictori independenţi ai recurenţei următorii parametri: apendicectomia,
localizarea E3 şi administrarea de corticosteroizi la puseul anterior.
Dintre toţi pacienţii, 47(8.27%) au suferit o intervenţie chirurgicală de colectomie/rezecţie colonică în
evoluţia bolii. 20 de pacienţi (42.55%) au efectuat intervenţia chirurgicală în primii 2 ani de la diagnostic. Dintre
predictorii pe care i-am evaluat, au avut un efect semnificativ asupra timpului până la intervenţie: localizarea-
clasa Montreal (p = 0.01) şi severitatea primului puseu (p < 0.01)-teste Log Rank.
S-au analizat separat cazurile de CU cu indicaţie chirurgicală de urgenţă - 22 pacienţi (46.81% dintre cei
operaţi), respectiv electivă- 25 pacienţi (53.19% dintre pacienţii cu CU operaţi). 6 dintre pacienţii cu CU au
dezvoltat neoplazie colorectală pe parcursul evoluţiei bolii; aceasta reprezintă 1.1% din întreg lotul de pacienţi,
respectiv 12.77% dintre cei care au necesitat intervenţie chirurgicală. Clasa Montreal şi severitatea sunt
predictori ai necesităţii de colectomie de urgenţă, dar după efectuarea regresiei multivariate se menţine doar
localizarea Montreal cu semnificaţie marginală.
Din totalul de 256 pacienţi urmăriţi de la debutul bolii care la primul puseu au prezentat localizare distal
de flexură stângă, 12.89% au prezentat extinderea bolii. Astfel, 9.68% dintre pacienţii cu proctită, 22.89% dintre
cei cu proctosigmoidită şi 6.25% dintre cei cu colită stânga la debut au prezentat localizări mai extinse la finalul
perioadei de urmărire.

Studiul 2. Modificarea incidenţei și istoriei naturale a Bolii Crohn în ultima


decadă- experienţa unui centru terţiar de Gastroenterologie din România

Ipoteza de lucru
Având în vedere lipsa studiilor epidemiologice din majoritatea ţărilor est europene şi creşterea constant
raportată a incidenţei BC, cu o modificare a raportului CU/BC, ne-am propus să investigăm modificările ce au
survenit în ultima decadă în Institutul Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie Cluj-Napoca în incidenţa BC
şi în raportul dintre cele două tipuri predominante de BII, modificarea localizării și a pattern-ului la diagnostic, a
ratei intervențiilor chirurgicale.
Material şi metodă
În studiu au fost incluşi toţi pacienţii cu BC internaţi în perioada 1 ianuarie 2003 şi 31 decembrie 2013 în
Institutul Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie “O Fodor” Cluj-Napoca. Pacienţii au fost identificaţi
retrospectiv şi au fost urmăriţi până în 30 iunie 2014 sau până la deces. Din fişele de observaţie ale pacienţilor au
fost extrase atât date demografice cât şi date legate de patologie. Fenotipul BC (vârsta la diagnostic, localizarea şi
pattern-ul) BC au fost stabilit atât la diagnostic cât şi la finalul perioadei de urmărire şi a fost definit conform
clasificării Montreal. A fost notată de asemenea modificarea pattern-ului- din inflamator în stenozant sau
penetrant. Pacienţii au fost ulterior împărţiţi în două grupe: cei diagnosticaţi în perioada 1.01.2003-31.12.2007 şi
cei din perioada 1.01.2008-31.12.2013. Au fost ulterior comparate pattern-ul, localizarea bolii, medicaţia
utilizată, necesarul de intervenţii chirurgicale, modificarea pattern-ului între cele două perioade studiate.
Rezultate
Există o tendinţă crescătoare a internărilor datorate atât CU [coeficient de corelaţie = 0.79 (0.35 – 0.94), p
< 0.01], cât şi BC [coeficient de corelaţie = 0.75 (0.28 – 0.93), p = 0.01]. Dacă se analizează procentul internărilor
datorate BII, CU şi BC din totalul de internări pe un an înainte şi după 2008, se poate observa o diferenţă
semnificativă statistic: pentru BC (p = 0.01), pentru CU (p < 0.01), BII global (p < 0.01). Nu se observă însă nici o
tendinţă consistentă de variaţie a raportului BC/CU cu timpul [coeficient de corelaţie. = -0.16 (-0.69 - 0.49), p =
0.64].
Există o uşoară creştere a medianei vârstei la diagnostic în cazul pacienţilor cu BC diagnosticaţi după
2008, de la 35 la 38 de ani, dar fără semnificaţie statistică. Când se compară însă clasa A din clasificarea
Montreal, există diferenţe semnificative în încadrarea în clasele A1, A2 respectiv A3 între pacienţii cu BC
diagnosticaţi înainte şi după 2008
Distribuţia la diagnostic în cele 3 clase B ale clasificării Montreal diferă semnificativ între cele 2 perioade
studiate, cu creşterea ponderii pattern-ului inflamator şi a celui penetrant şi cu scăderea celui stenozant la
pacienţii diagnosticaţi în a doua perioadă( după 2008) comparativ cu prima( până în 2008).
Localizarea BC la diagnostic diferă semnificativ la pacienţii diagnosticaţi după 2008 comparativ cu cei
diagnosticaţi anterior. Astfel se observă o tendinţă de creştere a localizării colonice (L2) şi a celei ileale (L1),
comparativ cu cea ileo-colonică (L3) care începe să scadă. În ceea ce priveşte afectarea tractului digestiv superior
(L4) atât singură cât şi în combinaţie cu celelalte localizări, aceasta se observă exclusiv în a doua perioadă (2009-
2013).
Se poate observa că pe măsură ce creşte frecvenţa administrării imunosupresoarelor şi apare iniţierea
terapiei biologice, scade frecvenţa administrării derivaţilor de 5 ASA şi a corticoterapiei în BC. Pe parcursul
perioadei de urmărire o parte dintre pacienţi şi-au modificat pattern-ul. Astfel, 9 dintre pacienţii cu pattern B1 la
diagnostic şi-au modificat pattern-ul în B2, în timp ce 4 dintre aceştia în B3. În plus 2 dintre pacienţii cu pattern
B2 iniţial au prezentat la finalul perioadei de urmărire pattern B3. Fumatul reprezintă factor de risc pentru
agravarea pattern-ului, derivaţii 5-ASA şi steroizii factori de protecţie.
Analizând rata chirurgiei în funcţie de perioada diagnosticului, se poate observa că cei cu diagnostic mai
recent se operează mai puţin, semnificaţia fiind însă marginală (p = 0.057, test LogRank). Timpul median până la
prima intervenţie chirurgicală este de 11.6 ani pentru cei diagnosticaţi înainte de 2008.

Studiul 3. Întârzierea diagnosticului în bolile inflamatorii intestinale-


factori de risc și impact asupra apariţiei complicaţiilor şi necesarului de
chirurgie- experienţa IBD Prospect

Ipoteza de lucru
Există mai multe studii în literatură care investighează rolul factorilor demografici şi de mediu în
modificarea prezentării clinice a BII. Astfel unul dintre scopurile acestui studiu este să identifice acei factori
asociaţi cu întârzierea diagnosticului în BII. În plus actualul studiu îşi doreşte să evalueze impactul imediat al
acestei întârzieri diagnostice asupra apariţiei complicaţiilor şi asupra necesarului de intervenţii chirurgicale.
Material şi metodă
Proiectul IBD Prospect a fost iniţiat în anul 2006, prin parteneriatul a două centre medicale de referinţă.
Scopul iniţial al proiectului a fost generarea unei infrastructuri informatice de bază pentru colectarea de date
despre BII la nivel naţional, dorindu-se extinderea sa într-un număr cât mai mare de centre terţiare de diagnostic
de gastroenterologie din România. IBD Prospect reprezintă o bază de pacienţi cu BII şi este prima de acest gen în
România. Pacienţii au fost introduşi prospectiv în această bază începând din iunie 2006. Chestionarele cuprind
informaţii demografice, clinice, paraclinice, iar introducerea acestora în IBD Prospect necesită iniţial obţinerea
unui consimţământ informat.
Întârzierea diagnosticului a fost definită ca o perioadă de timp în luni de la debutul simptomelor atribuite
ulterior BII şi stabilirea diagnosticului. Am încercat să evaluăm corelaţia între întârzierea diagnosticului şi
factori ce ţin de pacient şi boală. Factorii care au fost analizaţi sunt: sex, vârstă la diagnostic, mediu de
provenienţă regiune geografică, grup etnic, localizare boală, fumat la diagnostic, prezenţa MEI, debutul
simptomelor în timpul lunilor de vară,
În a doua parte a studiului ne-am referit doar la grupul cu BC. Am utilizat modelul de regresie logistică
pentru a stabili dacă întârzierea diagnosticului în BII are un efect asupra următorilor parametri: apariţia
complicaţiilor: stenoze intestinale, fistule (entero-enterale, enterocutanate, entero-vezicale), boală perianală
(fistulele perianale), intervenţii chirurgicale (rezecţie intestinală, colectomie, colostomie, ileostomie), intervenţii
chirurgicale pentru tratamentul fistulelor şi/sau abceselor perianale (drenaj abces, fistulotomie sau
fistulectomie).
Rezultate
Un număr total de 1495 pacienţi au intrat în baza IBD Prospect. Datele privitoare la întârzierea
diagnosticului au fost disponibile pentru 1196 pacienţi. Mediana timpului de la diagnostic la intrarea în bază a
fost de 4 luni pentru toate cele 3 patologii studiate. Întârzierea diagnosticului a diferit semnificativ între grupul
cu BC şi CU (p≤0.001) şi între grupul cu CU şi CN (p≤0.01); diferenţa a fost nesemnificativă între pacienţii cu BC şi
CN (p=0.51). 50% dintre pacienţii cu BC au fost diagnosticaţi în primele 5 luni de la debutul simptomelor, faţă de
numai 1 lună pentru CU şi 4 luni în CN.
La analiza de regresie logistică univariată pentru pacienţii cu BC localizarea extraileală se corelează
negativ cu întârzierea mare a diagnosticului (p=0.002), în timp ce statutul de fumător activ la momentul
diagnosticului şi debutul simptomatologiei în timpul lunilor de vară( spre deosebire de celelalte luni ale anului)
au fost ambele factori de risc pentru diagnostic tardiv al BC (p=0.05, respectiv p<0.001). În grupul cu CU regresia
logistică univariată a identificat vârsta la debut peste 40 ani ca factor protector pentru stabilirea tardivă a
diagnosticului( p=0.04); semnificaţia se menţine după includerea în analiza multivariată.
Întârzierea diagnosticului s-a asociat semnificativ cu dezvoltarea stenozelor intestinale(OR; 3.38, p<0.001
pentru subgrupul situat peste percentila 75) împreună cu antecedentele de apendicectomie (OR: 2.12, p=0.01) şi
durata bolii (OR: 1.04, p=0.04). Pentru fistulele intestinale întârzierea diagnosticului a fost un predictor
semnificativ (OR: 2.64, p=0.08 pentru grupul >percentila 75), la fel şi apendicectomia în antecedente (OR: 4.1;
p=0.000). Vârsta peste 40 de ani la diagnostic a reprezentat un factor protector pentru dezvoltarea fistulelor
intestinale (OR: 0.29, p=0.01).
În legătură cu fistulele perianale, apartenenţa la un alt grup etnic decât român reprezintă un factor de risc
(OR: 2.13, p=0.05); întârzierea diagnosticului- grupul cuprins între percentila 25-50% se asociază de asemenea
cu acest risc (OR: 4.32, p=0.01). Durata bolii( OR: 1.04, p=0.02), apendicectomia (OR: 2.23, p<0.001) şi
subgrupurile de întârziere cuprinse între 50-75%(OR: 1.86, p=0.05) şi > 75% (OR: 1.96, p=0.03) s-au asociat cu
un risc mai mare de intervenţie chirurgicală pentru orice complicaţie datorată BC. Sexul feminin a reprezentat un
factor protector pentru acest risc(OR: 0.63, p=0.04). Cu riscul de intervenţie chirurgicală pentru patologia
perianală nu s-a asociat semnificativ nici una dintre variabilele studiate. Rezecţia intestinală în BC a fost prezisă
de istoricul de apendicectomie(OR: 2.6, p<0.001), durata bolii(OR: 1.07, p<0.001) şi întârzierea diagnosticului
subgrupul 50-75%(OR: 2.24, p=0.04). Etnia diferită de cea română s-a asociat cu acest risc dar fără a prezenta
semnificaţie statistică(OR: 1.82, p=0.07)

Studiul 4. Autofagia și markerii serologici în Boala Crohn

Ipoteza de lucru
Cercetarea de faţă a pornit de la premisa că autofagia joacă un rol central în patogeneza BC şi că există
corelaţii genotip- fenotip demonstrate în câteva studii din literatura de specialitate. În plus afectarea autofagiei
se poate asocia cu pierderea toleranţei la antigenele microbiene şi apariţia anticorpilor microbieni pe de o parte
şi cu prezenţa granuloamelor pe piesele de biopsie la pacienţii cu BC. Studiul de faţă are mai multe obiective:
genotiparea ATG16L1 la pacienţii cu BC şi la martori, determinarea ASCA IgA şi IgG şi a pANCA la pacienţii cu BC,
corelaţii genotip-fenotip, corelaţii genotip-markeri serologici.
Material şi metodă
Populaţia studiată include 83 pacienţi cu BC şi 104 voluntari sănătoşi. Grupul voluntarilor a fost similar cu
cel al pacienţilor cu BC din punct de vedere al vârstei şi sexului. S-a urmărit ulterior asocierea între prezența
polimorfismului ATG 16 L1 și a markerilor serologici și caracteristicile fenotipice ale BC.
Rezultate
Distribuţia genotipului ATG16L1 în lotul nostru a fost următoarea: 30.1% sunt homozigoţi pentru această
mutaţie, 50.6% heterozigoţi, iar 19.3% prezintă varianta normală. In ceea ce priveşte markerii serologici, 32.5%
dintre pacienţi au prezentat IgG ASCA si 72.3% IgA ASCA pozitivi, în timp ce doar 13.3% au prezentat pANCA.
Localizarea bolii a fost diferită comparând categoriile mai sus menţionate(p<0.01, respectiv p=0.01) cu
predominanţa netă a localizării la nivelul ileonului terminal la homozigoţii (GG) si heterozigoţii (GA) pentru
mutaţia ATG16L1 comparativ cu cei ce prezintă varianta normală. Afectarea tractului digestiv superior( L4 în
clasificarea Montreal) nu a diferit în funcţie de genotipul ATG16L1. Dintre toate variantele de combinaţii
posibile, interacţiunea între polimorfismul ATG şi clasa B din clasificarea Montreal se obţine semnificaţie
statistică doar comparând grupul GG cu AA între B1 şi restul lotului (p = 0.02, test Fisher).
MEI sunt mult mai frecvente la purtătorii a cel puţin a unei alele de risc; astfel comparaţiile genotipului GG
versus AA şi AA versus non AA au atins semnificaţia statistică. Corelaţia genotip ATG16L1- pattern BC atinge
doar semnificaţia marginală când se compară grupul homozigot pentru această mutaţie cu grupul cu varianta
normală, cu predominenţă genotipului GG în cazul pattern-ului complicat. Procentul pacienţilor operaţi cu
recidivă postoperatorie a fost mai mare în cadrul grupului cu genotip GG comparativ cu restul lotului;
semnificaţia este însă marginală.
Valorice serice ale ASCA (atât IgA cât şi IgG) au fost mai mici la pacienţii cu pattern inflamator (B1)
comparativ cu cel complicat( stenozant-B2 sau penetrant-B3), dar fără ca diferenţa să atingă semnificaţia
statistică. Nivelul IgA ASCA a fost semnificativ mai mare în cazul pacienţilor cu vârsta de debut mai mică. Valorile
ASCA IgG (p= 0.01) şi ASCA IgA (p < 0.01) au fost semnificativ mai mari la pacienţii care au necesitat intervenţie
chirurgicală comparativ cu cei neoperaţi. Nivelul ASCA IgG fost semnificativ mai mare la pacienţii cu BC operaţi
care au prezentat recidivă postoperatorie comparativ cu restul pacienţilor. Nivelul pANCA diferă semnificativ
între categoriile fumător/nefumător/fost fumător, p= 0.02. Deşi se observă sume de cvartile mai mari la cazurile
complicate, diferenţa nu atinge semnificaţia statistică (p = 0.44, test Cochran-Mantel-Haenszel).
Studiul 5. Rolul markerilor serologici și a polimorfismelor genetice în
predicţia răspunsului la terapia anti-TNF alfa în bolile inflamatorii
intestinale

Ipoteza de lucru
Cercetarea de faţă a pornit de la premisa că nu există o rată de răspuns de 100% după administrarea
terapiei anti TNF-alfa şi că răspunsul la terapie într-o afecţiune atât de heterogenă ca BII este influenţat de o
multitudine de factori ca durata bolii, fenotip, severitate. Au fost identificate și polimorfisme asociate nu doar cu
creşterea riscului de efecte secundare induse de o anumită terapie, ci şi cu tipul de răspuns. În cest context,
studiul de faţă s-a desfăşurat în mai multe etape, având următoarele obiective: stabilirea efectului terapiei anti
TNF-alfa (IFX şi ADA) asupra apoptozei celulelor intestinale la pacienţii cu boli inflamatorii intestinale, stabilirea
unei corelaţii între predictorii clinici şi genetici de răspuns la terapia anti TNF-alfa, stabilirea unei corelații între
scăderea ratei apoptotice induse de terapia anti TNF-alfa și vindecarea mucozală.
Material şi metodă
În acest studiu au fost incluşi pacienţi cu BII cu indicaţie de terapie anti TNF- alfa internaţi în cadrul
Institutului Regional de Gastroenterologie şi Hepatologie şi în cadrul Centrului Medical de Gastroenterologie şi
Hepatologie Cluj-Napoca în perioada 2010-2014.
Parametrii urmăriţi înaintea și după administrarea terapiei anti TNF-alfa au constat din: date demografice,
date despre boală(durata bolii, localizarea, pattern-ul evolutiv, indicaţia pentru terapia anti TNF-alfa, tratament
medicamentos anterior/concomitent cu terapia actuală, severitate), markeri serici uzuali: hemoglobina, VSH,
proteina C reactivă, markeri serologici(ASCA și pANCA) și markeri genetici( IL23R, TNF alfa). S-a efectuat
colonoscopie cu ileoscopie terminala cu prelevarea de biopsii din ariile inflamate( pentru determinarea
activităţii histologice şi imunohistochimie), înainte și după terapia de inducție. Ulterior s-a urmărit dacă există o
modificare a ratei apoptotice după terapia biologică şi dacă scăderea ratei apoptotice se corelează cu vindecarea
mucozală.
Pentru întreg lotul de pacienţi a fost evaluat răspunsul la terapia de inducţie. Ulterior, grupul de pacienţi
care au fost urmăriţi şi pe perioada terapiei de menţinere a fost analizat pentru pierderea răspunsului la terapia
biologică şi pentru necesitatea escaladării dozei.
Rezultate
În perioada studiată 87 de pacienţi au prezentat indicaţie pentru administrarea terapiei anti TNF-alfa, 40
pacienţi cu BC şi 47 pacienţi cu CU. Se poate observa că există o scădere a medianei probelor inflamatorii (VSH,
PCR) la finalul terapiei de inducţie şi o creştere a valorii Hgb. Distribuţia celor două polimorfisme studiate (TNF
alpha 308 şi IL23R rs 10889677) diferă semnificativ între pacienţii cu CU şi BC.
Polimorfismul TNF-alfa 308 (varianta homozigotă- AA) este semnificativ mai frecvent printre non-
responderii la TB comparativ cu responderii la această terapie. În ceea ce priveşte polimorfismul IL23R studiat,
variantele mutante (homozigot-CC, respectiv heterozigot-AC) sunt mult mai frecvente la pacienţii responderi
comparativ cu non-responderii la TB (p<0.001).
Dintre predictorii studiaţi pentru lipsa primară a răspunsului la terapia de inducţie, în cazul pacienţilor cu
CU au atins semnificaţie statistică doar mediul rural care se asociază cu lipsa primară de răspuns şi prezenţa
polimorfismului IL23R (grupul format din variantele homozigotă şi heterozigotă) ca factor protector. Factorii de
risc pentru lipsa de răspuns în grupul cu BC sunt: etnia diferită de cea română, mediul de provenienţă rural,
valoarea mică a Hgb pre-TB şi valoarea serică scăzută a ASCA IgA. Prezenţa variantelor mutante ale IL23R creşte
şansa de răspuns, chiar dacă nesemnificativ şi în acest subgrup.
Un total de 10 pacienţi au necesitat intervenţie chirurgicală pe parcursul urmăririi- 5 în timpul inducţiei, 5
în timpul terapiei de menţinere. Dintre predictorii studiaţi doar valoarea VSH-ului şi a Hgb înainte de iniţiere s-
au corelat semnificativ cu necesarul de chirurgie din timpul terapiei biologice( pentru pacienţii cu CU). Astfel, o
valoare mai mare a VSH-ului, respectiv o valoare mai mică a Hgb înaintea terapiei de inducţie cresc riscul
intervenţiei chirurgicale.
Opt pacienţi (9.25% din întreg lotul) au necesitat creşterea dozelor în cursul terapiei biologice pentru
menţinerea răspunsului. Dintre predictorii studiaţi pentru subgrupul cu CU, nici una dintre variabile nu s-a
corelat semnificativ cu acest risc; totuşi durata bolii la iniţiere peste 2 ani şi asocierea la terapia biologică de
imunosupresoare scad riscul escaladării dozei, dar nivelul seric crescut al ASCA IgA creşte acest risc. În cazul
pacienţilor cu BC fumatul creşte semnificativ riscul creşterii dozei de agenţi anti TNF-alfa, iar categoria de vârstă
A3, valoarea crescută a VSH-ului şi PCR înainte de iniţierea terapiei se asociază dar nesemnificativ cu acest
eveniment. În schimb valoarea crescută a Hgb înainte de iniţierea terapiei biologice scade acest risc.
Dintre cei 69 de pacienţi care au fost urmăriţi pe perioada terapiei de menţinere, 9 au prezentat pierderea
secundară a răspunsului la terapia biologică. Dintre predictorii evaluaţi, s-au corelat cu acest aspect,
nesemnificativ însă, următorii parametri: nivelul crescut al VSH-ului pretratament, nivelul seric crescut al ASCA
şi vârsta tânără la iniţiere(pentru pacienţii cu CU) şi valoarea crescută a PCR înainte de iniţiere (pentru pacienții
cu BC).
Determinarea ratei apoptotice pe epiteliul intestinal a fost posibilă doar pentru 27 pacienţi cu CU; această
determinare a fost efectuată înainte şi după terapia de inducţie. Există o scădere clară a ratei apoptozei celulare
intestinale pe biopsiile obţinute după terapia de inducţie comparativ cu biopsiile prelevate înainte. Astfel,
valoarea medie a ratei apoptotice înainte de iniţierea terapiei biologice a fost de 74.67% (44-94%), iar după
terapia de inducție a fost de 24.33% (5-45%). Diferenţa între aceste două valori a fost semnificativă: OR: 50.33
(CI95%: 43.29-57.38), p<0.001. Acest aspect este reprezentat grafic în figura 3. Scăderea ratei apoptotice a fost
semnificativ mai mare la pacienții la care s-a obținut vindecare mucozală (mediana-62%) comparativ cu cei fără
vindecarea mucoasei (mediana – 39.5%), p<0.001.

CONCLUZII GENERALE
1. Până la 96% dintre pacienţii cu colită ulcerativă recad în primii 5 ani de la diagnostic. Incidenţa primei
recurenţe este maximă în primul an şi scade apoi progresiv. Pacienţii cu un interval scurt până la prima
recurenţă vor prezenta un număr mai mare de recăderi în perioada următoare.
2. Ca şi predictori independenţi ai recurenţei, studiul nostru a identificat următorii factori: apendicectomia,
colita extinsă şi administrarea de corticosteroizi la puseul anterior.
3. 8.27% din întreg lotul au suferit o intervenţie chirurgicală de colectomie în evoluţia bolii. Jumătate
dintre indicaţiile de intervenţie au fost de urgenţă şi doar un procent relativ mic de a prezentat cancer
colo-rectal ca indicaţie a intervenţiei chirurgicale.
4. Puseul iniţial sever reprezintă singurul predictor independent al colectomiei. Localizarea bolii( colita
extinsă) şi severitatea bolii sunt predictori ai colectomiei în urgenţă.
5. Nu se observă nici o tendinţă consistentă de variaţie a raportului boală Crohn /colită ulcerativă cu
timpul, dar există o creştere constantă a proporţiei de internări datorate bolii Crohn din totalul de
internări în perioada studiată.
6. Există diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte pattern-ul bolii la diagnostic între cele 2
perioade studiate, cu creşterea ponderii pattern-ului inflamator şi a celui penetrant şi cu scăderea celui
stenozant şi modificări ale localizării bolii în funcţie de perioada în care a fost stabilit diagnosticul. Astfel
se poate observa creşterea frecvenţei afectării colonice şi la nivelul ileonului terminal, cu scăderea
afectării ileo-colonice, în timp ce afectarea tractului digestiv superior se observă doar în a doua
perioadă.
7. Există diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte terapia utilizată; astfel se poate observa că pe
măsură ce creşte frecvenţa administrării imunosupresoarelor şi apare iniţierea terapiei biologice, scade
frecvenţa administrării derivaţilor 5- ASA şi a corticoterapiei în boala Crohn.
8. Se poate observa o uşoară scădere a ponderii pacienţilor operaţi la diagnostic- de la 13.2% dintre cei
diagnosticaţi până în 2008 la 8.8% dintre cei diagnosticaţi în a doua perioadă. Dacă se analizează rata
chirurgiei în funcţie de perioada diagnosticului, se poate observa că cei cu diagnostic mai recent se
operează mai puţin, semnificaţia fiind însă marginală.
9. Întârzierea diagnosticului este mai importantă la pacienţii cu boală Crohn comparativ cu cei cu colită
ulcerativă.
10. Vârsta tânără la diagnostic(<40 ani) în cazul pacienţilor cu colită ulcerativă şi localizarea ileală, debutul
simptomatologiei în cursul lunilor de vară şi statutul de fumător activ în momentul diagnosticului în
cazul pacienţilor cu boală Crohn se asociază cu un interval de timp mai lung între debutul simptomelor
şi diagnostic.
11. Întârzierea diagnosticului s-a asociat semnificativ cu dezvoltarea stenozelor şi fistulelor intestinale şi a
patologiei perianale. Acest factor s-a asociat semnificativ şi cu riscul de rezecţie intestinală.
12. Diferenţa dintre frecvenţele alelelor genei de autofagie studiate- ATG 16 L1 între martori şi lotul de
pacienţi cu boală Crohn a fost nesemnificativă.
13. Legătura între afectarea procesului de autofagie şi fenotipul bolii Crohn a fost relevat de faptul că
prezenţa cel puţin a unei alele conferă risc crescut de localizare ileală. În plus absenţa acestei mutaţii se
corelează cu prezenţa pattern-ului inflamator.
14. Nu există nici o relaţie între prezenţa granuloamelor pe piesele de biopsie ale pacienţilor cu boală Crohn
şi variantele genei ATG16L1.
15. Markerii serologici ASCA IgA şi IgG se evidenţiază mai frecvent în cazurile complicate, ce necesită
intervenţie chirurgicală şi ce prezintă recidivă postoperatorie comparativ cu cazurile necomplicate.
Forma colonică prezintă însă mai frecvent pANCA pozitivi.
16. 10.34% din întreg lotul de pacienţi nu au răspuns la terapia de inducţie şi un procent egal de pacienţi au
prezentat pierderea secundară a răspunsului la terapia biologică.
17. Dintre caracteristicile demografice studiate, doar provenienţa din mediul rural şi vârsta tânără la
diagnostic s-au corelat negativ, respectiv pozitiv cu răspunsul la terapia de inducţie. Continuarea
fumatului la pacienţii cu boală Crohn s-a corelat cu evoluţia nefavorabilă pe parcursul tratamentului.
18. Valorile crescute al probelor inflamatorii( VSH, PCR) înainte de iniţierea terapiei biologice s-au asociat
cu o evoluţie nefavorabilă, reflectată prin necesarul de colectomie, necesitatea escaladării dozei de
biologice şi pierderea secundară a răspunsului. Valoarea scăzută a hemoglobinei s-a asociat cu lipsa
primară a răspunsului, cu necesarul escaladării dozei, dar şi cu riscul de intervenţie chirurgicală.
19. Prezenţa pANCA s-a asociat cu lipsa primară de răspuns şi cu lipsa renunţării la corticoterapie, în timp
ce prezenţa ASCA sau titrul crescut al acestui marker se asociază cu o rată mai mare de răspuns primar
şi de renunţare la corticoterapie.
20. Varianta homozigotă a mutaţiei TNF-alfa 308 este semnificativ mai frecventă printre non-responderi
comparativ cu responderii la terapia biologică. Variantele mutante( homozigot, respectiv heterozigot)
ale genei IL23R rs 10889677 sunt mult mai frecvente la pacienţii responderi comparativ cu non-
responderii.
21. Terapia biologică induce apoptoza celulelor epiteliale intestinale, cu o scădere semnificativă a ratei
apoptotice intestinale la finalul terapiei de inducţie.
SUMMARY OF THE Ph.D. THESIS

Modulating factors in the evolution of


Inflammatory Bowel Diseases

Ph.D. Student Delia Roxana Zaharie

Scientific supervisor Prof. Vasile Andreica, Ph.D.


TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION .................................................................................................................. 13
REVIEW OF THE LITERATURE ...............................................................................................................15

1. INFLAMMATORY BOWEL DISEASES – EPIDEMIOLOGY ANF NATURAL HISTORY ...... 17


1.1. Nosology .......................................................................................................................... 17
1.2. Epidemiology............................................................................................................................................... 17
1.3. Natural History ........................................................................................................................................ 18

2. MODULATING FACTORS IN THE EVOLUTION OF INFLAMMATORY BOWEL


DISEASES.............................................................................................................................................................. 23
2.1 Environmental factors............................................................................................................................. 23
2.2 Therapuetic factors ................................................................................................................................... 26

3. PREDICTIVE FACTORS OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASES EVOLUTION.................. 29


3.1 Clinical Factors........................................................................................................................................... 29
3.2 SEROLOGIC MARKERS ........................................................................................................... 35
1. WORK HYPOTHESIS/OBJECTIVES ...................................................................................................... 37

2. GENERAL RESEARCH METHODOLOGY ............................................................................................ 49


2.1 Patients ........................................................................................................................................................ 39
2.2 Laboratory tests ............................................................................................................... 39
2.3. Genetic Testing ........................................................................................................................................ 49
2.4. Endoscopic Evaluation .......................................................................................................................... 40
2.5 Histological and Immunohistochemical Analysis ......................................................................... 40
2.6. Statistical Analysis .................................................................................................................................. 40

3. STUDY 1. EVOLUTION OF THE ULCERATIVE COLITIS IN A TERTIARY CENTER OF


GASTROENTEROLOGY AND SURGERY IN ROMANIA – THE INFLUENCE OF THE
PHENOTYPE AT DIAGNOSIS AND OF OTHER PROGNOSTIC FACTORS ON
DISEASE COURSE ......................................................................................................................................... 41
3.1. Introduction ............................................................................................................................................... 41
3.2.Objectives of the research ....................................................................................................................... 42
3.3. Material And Methods ............................................................................................................................. 42
3.4. Results ......................................................................................................................................................... 43
3.5. Discussions ................................................................................................................................................ 55
3.6. Conclusions .............................................................................................................................................. 58

4. STUDY 2. CHANGING THE INCIDENCE AND NATURAL HISTORY OF CROHN’S


DISEASE IN THE LAST DECADE – THE EXPERIENCE OF A TERTIARY CENTER OF
GASTROENTEROLOGY IN ROMANIA ....................................................................................59
4.1. Introduction...................................................................................................................... 59
4.2. Objectives of the research ................................................................................................ 59
4.3. Material And Methods .................................................................................................... 60
4.4. Results .............................................................................................................................. 60
4.5. Discussions ....................................................................................................................... 71
4.6 Conclusions ..................................................................................................................... 75

5. STUDY 3. DIAGNOSIS DELAY IN THE INFLAMMATORY BOWEL DISEASES - RISK FACTORS AND
IMPACT ON THE OCCURANCE OF COMPLICATIONS AND THE NEED FOR SURGERY – IBD PROSPECT ........ 76
5.1 Introduction .................................................................................................................... 77
5.2 Objectives of the research ................................................................................................. 78
5.3 Material And Methods ...................................................................................................... 78
5.4 Results ............................................................................................................................. 80
5.5 Discussions ....................................................................................................................... 86
5.6 Conclussions .................................................................................................................. 89

6. STUDY 4. AUTOPHAGY AND SEROLOGIC MARKERS IN CROHN’S DISEASE ........................ 91


6.1. Introduction..................................................................................................................... 91
6.2 Objectives of the research ............................................................................................... 92
6.3. Material And Methods .................................................................................................... 92
6.4 Results ........................................................................................................................... 94
6.5. Discussions ..................................................................................................................... 106
6.6. Conclusions ................................................................................................................... 110

7. STUDY 5. THE ROLE OF SERIOLOGIC MARKERS AND GENETIC POLYMORPHISMS IN THE PREDICTION OF
THE RESPONSE TO ANTI-TNF THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASES ................................ 111
7. 1 Introduction ................................................................................................................... 111
7.2 Objectives of the research .............................................................................................. 112
7. 3 Material And Methods.................................................................................................... 112
7. 4 Results ........................................................................................................................... 114
7.5. Discussions .................................................................................................................. 124
7.6. Conclusions ................................................................................................................... 128

8. GENERAL CONCLUSIONS ............................................................................................... 129

9.THE ORIGINALITY AND INNOVATIVE CONTRIBUTIONS OF THE THESIS 133


REFERENCES .................................................................................................................................. 135

Key Words: inflammatory bowel diseases (IBD), ulcerative colitis (UC), Crohn’s disease (CD),
indeterminate colitis (IC), recurrence, colectomy, complications, extraintestinal manifestations
(EIM), phenotype, genotype, autophagy, biological therapy, apoptosis.

Introduction
The inflammatory bowel diseases(IBD) represents a pathology with a continuously increasing incidence,
not only in the high incidence areas reported previously, but especially in areas where they had been regarded as
rare diseases no so long ago. Moreover, the improvement of the investigation methods used in order to
determine the diagnosis and the introduction of therapies meant to change their natural evolution, changed the
phenotype expression, as well as the evolution of that pathology. Moreover, underlining the clinical factors of the
diagnosis that predict a certain type of evolution in the UC can identify patient subgroups that could benefit from
a more aggressive therapy and close monitoring from the start.
The diagnosis of IBD can be, most of the times, a challenge, especially in the cases with moderate clinical
activity, due to the interference with the functional pathology symptomatology. The diagnosis delay is associated
not only with the impact on the life quality of these patients, but also with the reduction of the response to
therapy. Moreover, IBD diagnosis delay can have an extremely important impact on the risk for complications
and surgery that represents an important moment of the natural history of these diseases.
The more elaborate researches to determine IBD etiopathogenesis have identified a series of diverse
genetic and immunologic basis, meant to help identify individualized, targeted therapies. Thus, involving the
autophagy in the process of recognizing the intestinal allergens was recognized as a process promoting the
immune tolerance loss in Crohn’s disease. Moreover, the impact of the genes involved in the autophagy on the
phenotype expression and on the risk for complications was very much studied lately and one tried to create a
combined predictive clinical-serologic-genetic score.
Identifying the genetic predictors of response to therapy is a basic concern of the pharmacogenomics, a
branch that is so evolved in other fields of medicine. Why is this an important concern? Because, at least
theoretically, in this pathology, there exists the possibility of accessing a different type of management – “step-up
versus top-down” – and the subgroup of patients that would benefit mostly of the treatment should be identified
at the diagnosis. If we take into account the high cost of the biological therapy, but also its side effects, this aspect
requires even more clarifications.
General Methodology
Patients
All studies included in the chapter “Personal Contributions”, except for the third study, were performed at
“Octavian Fodor” Regional Institute for Gastroenterology and Hepatology, Cluj-Napoca. The third study was
performed with the use of the IBD Prospect data basis – the national data basis for IBD that includes patients
from more university centers in the country. The patients in the prospective studies, i.e. the 3rd, 4th and 5th study
were included after giving their informed consent, signing a form that was previously approved by the Ethics
Committee of “Iuliu Hatieganu” University of Medicine and Pharmacy, together with each study protocol (for the
4th and 5th study), i.e. the informed consent for the inclusion into the IBD Prospect data basis, previously
approved by the Scientific Committee of the Romanian Crohn’s and Colitis Club.
Laboratory tests
The following parameters were determined: the erythrocyte sedimentation rate - ESR (using the
Westergren methods, adapted to the Seditainer values), C reactive protein – CRP (with the biochemical analyzer
Konelab 60) and the complete blood count (on Mindray 6800 hematology analyzer). The serologic
determinations were performed using the Elisa technique, after the previous centrifugation of the blood sampled
from patients and isolating the serum. The IgA, i.s. IgG ASCA and pANCA were determined. The level of
antibodies was expressed in units/ml, determining a positivity cut-off value as per manufacturer’s specifications.
Genetic Testing
These testings were performed using molecular genetic techniques, i.e. PCR-RFLP (polymerase chain
reaction - restriction fragment length polymorphism), to determine the gene polymorphisms that codify TNF-
alfa, IL 23R and ATG16L1. This method consists of PCR amplifying of certain fragments, using specific polymers.
The amplification products were treated with restriction enzymes; afterwards the electrophoresis in agarose gel
was performed. The visualization of the fragments was performed after coloring with ethidium bromide, UV
transillumination and image capturing. The molecular diagnosis was determined based on the number and
length of the fragments obtained during the electrophoresis.
Endoscopic Evaluation
The endoscopic evaluation was performed with the Olympus CL 160, i.e. 180 and Olympus Exera II
endoscopes. During the endoscopy, biopsies were sampled, in order to determine the histopathological activity
and to perform immunohistochemical analysis.
Histological and Immunohistochemical Analysis
The biopsies obtained with the endoscope were fixed in 40% formalin and later in paraffin, for the
morphological analysis. For the evaluation of the bioptic fragments, the microscope Olympus R CX31 (Olympus
SUA) was used. The series sections were used to detect by immunofluorescence the epithelial apoptosis using
the Tunnel method.
Statistical Analysis
The statistical analysis was made using the “R for Windows” program, version 3.0.1. and SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences), version 20 for Windows. The data were compared with the independent T for
samples, i.e. Mann–Whitney for continuous variables and χ2 for the categorical variables. The differences
between parameters were characterized by Spearman correlation coefficients. For the survival analyses, the
Kaplan-Meier curves were used. In the survival analyses, the predictors were evaluated with the univariate Cox
regression, and for the prediction of the binary variables, the logistic regression was used. The diagnosis
performance of the studied parameters was evaluated using the receiver operating characteristic (ROC) curves.

Study 1. Evolution of the ulcerative colitis in a tertiary center of


Gastroenterology and Surgery in Romania – influence of the phenotype at
diagnosis and of other prognostic factors on disease course

Objectives of the research


UC evolution varies a lot from one patient to another. Underlining clinical predictive factors for a certain
type of evolution could help to delimitate a subset of patients with a more aggressive form of disease, which
could benefit by a special management. We intend in this study to evaluate the evolution pattern of the patients
suffering from UC, in a tertiary care center of gastroenterology, during 10 years. At the same time, we intend to
evaluate remission, colectomy and mortality rates on the same patient cohort in the above-mentioned period
and also the predictors of each parameter.
Material and methods
The study took place during January 1, 2003 – December 31, 2013, at “O. Fodor” Regional Institute for
Gastroenterology and Hepatology in Cluj-Napoca. The follow-up questionnaires of the patients contain
demographic data, smoker status, appendectomy, family history of IBD. The information concerning the
diagnosis, hospitalizations, symptoms, location, severity, medication and its changes, surgeries, EIM were
obtained from the medical charts. The location and severity of the disease were determined according to the
Montreal classification. Only the patients for whom data concerning disease onset could be gathered were
included in the survival analyses. The time until the next relapse, the time until surgery were determined.
Results
588 patients were included in the study, out of which 355 were followed from the time of diagnosis. The
general features of the patients followed from the onset of the disease are similar to those of the general sample.
The more frequent location is the left sided colitis and only 17.3% of the patients had a severe first relapse. 6.9%
of the entire patient sample suffering from UC needed surgery during the disease course. The incidence of the
first recurrence is maximum during the first year (28/100 patients – year) and decreases progressively
afterwards.
The patients who had the first recurrence within the first year after the diagnosis showed more relapses,
as compared to those with the first recurrence within 1-2 years or after 2 years from the diagnosis. These
differences were statistically significant (p<0.001). A larger percentage of the female patients has their first
recurrence within the first 6 months, as compared to the male patients. A greater percentage of the patients
diagnosed under 40 had their first recurrence within 6 months, as compared to those diagnosed after that age.
The median time until the first relapse is 7.16 years, from the second to the third 2.05 years, from the third
to the fourth is 1.14 years. The differences between the curves are significant (p<0.01, Log Rank test). The
univariate analysis and later the multivariate analysis identified as independent predictors of the recurrence the
following parameters: appendectomy, E3 location and corticosteroids for the previous relapse.
Out of all the patients, 47 (8.27%) underwent colectomy/colon resection in the evolution of the disease.
20 patients (42.55%) underwent surgery during the first 2 years from the diagnosis. Out of the predictors that
we evaluated, a significant effect on the time until the intervention had the location – Montreal class (p = 0.01)
and the severity of the first attack(p < 0.01) - Log Rank tests.
The patients with emergency surgery were analyzed separately - 22 patients (46.81% of the ones who
underwent surgery), i.e. elective surgery - 25 patients (53.19% of the patients with UC with surgery). 6 of the
patients with UC developed colorectal neoplasia during the evolution of the disease; this means 1.1% of the
entire patient sample, i.e. 12.77% of those who needed surgery. The Montreal class and the severity are
predictors of emergency colectomy, but after the multivariate regression, only the Montreal location had
marginal significance.
Out of the 256 patients followed from the disease onset, who at the first attack had left location, 12.89%
showed the disease extension. Thus, 9.68% of the patients suffering from proctitis, 22.89% of those suffering
from proctosigmoiditis and 6.25% of those with left colitis upon onset had more extended locations at the end of
the observation period.

Study 2. Changing the incidence and natural history of Crohn’s disease in


the last decade – the experience of a tertiary center of Gastroenterology in
Romania

Objectives of the research


Given the lack of epidemiological studies in most Eastern European countries and the consistently
reported increase of CD incidence, with a change in UC/ CD ratio, we aimed to investigate the changes that
occurred in the last decade at the Regional Institute of Gastroenterology and Hepatology Cluj Napoca as related
to the incidence of CD and the ratio between the two predominant types of IBD, change of location and pattern at
diagnosis and of surgery rate.
Material and methods
The study included all patients suffering from CD, admitted in the period 1 January 2003 - 31 December
2013 at the Regional Institute of Gastroenterology and Hepatology “O. Fodor”, Cluj-Napoca. The patients were
identified retrospectively and were monitored until 30 June 2014 or until death. From the observation files of
the patients, we took both demographic data and the pathology related data. The CD phenotype (age at diagnosis,
location and pattern) was established both at diagnosis and at the end of the follow-up period and it was defined
according to the Montreal classification. It was also noticeable change in the pattern– from inflammatory to
stenosing or penetrating. Later, the patients were divided into two groups: those diagnosed in the period
1.01.2003-31.12.2007 and those diagnosed in the period 1.01.2008-31.12.2013. Later, the pattern, location of
the disease, medication used, the need for surgery, the pattern change between the two periods studied were
compared.
Results
There is an increasing trend of hospitalizations due to both UC [correlation coefficient = 0.79 (0.35 - 0.94),
p <0.01] and CD [correlation coefficient = 0.75 (0.28 - 0.93), p = 0.01]. When analyzing the percentage of
admissions due to IBD, UC and CD of all admissions per year before and after 2008, we may notice a statistically
significant difference: for the CD (p = 0.01), for UC (p <0.01), overall IBD (p <0.01). But, we do not notice any
consistent variation tendency of the ratio CD / UC in time [correlation coefficient. = -0.16 (-0.69 - 0.49), p = 0.64].
There is a slight increase in the median age at diagnosis in CD patients diagnosed after 2008, from 35 to 38
years, but without statistical significance. When comparing the A class of Montreal classification, there are
significant differences in classification in classes A1, A2 respectively A3 between patients suffering of CD
diagnosed before and after 2008.
The distribution of diagnosis in the 3 B classes of the Montreal classification differs significantly between
the two periods studied, with the increase in the ratio of the inflammatory pattern and penetrating pattern and
with the decrease of the stenosing pattern in patients diagnosed in the second period (after 2008) compared to
the first period (until 2008).
The location of CD at diagnosis is significantly different in patients diagnosed after 2008 than those
diagnosed previously. Thus, there is a tendency in the increase of colonic location (L2) and the ileal one (L1)
compared to the ileo-colonic (L3) that begins to decrease. The concern for upper gastrointestinal tract (L4)
disorders alone as well as in combination with other locations is noticed only in the second period (2009-2013).
We may notice that with increasing frequency in administration of immunosuppressants and biological
treatment occurs, the frequency in the administration of 5-ASA derivatives and corticosteroid decreases. During
follow-up period, some patients changed their pattern. Thus, 9 patients with B1 pattern at diagnosis modified the
pattern in B2, while 4 of them in B3. In addition, 2 of the patients, initially with pattern B2, presented at the end
of the follow-up period pattern B3. Smoking is a risk factor for worsening the pattern, 5-ASA derivatives and
steroids - protective factors.
Analyzing the surgery rate, depending on the time of diagnosis, we may notice that those with more recent
diagnosis need less surgery, but the significance is marginal (p = 0.057, LogRank test). The median time to first
surgery is 11.6 years for those diagnosed before 2008.

Study 3. Diagnosis delay in inflammatory bowel diseases - risk factors and


impact on the occurrence of complications and the need for surgery – IBD
prospect

Objectives of the research


There are several studies in the literature investigating the role of demographic and environmental factors
in the change of clinical presentation of IBD. Thus, one aim of this study is to identify these factors associated
with delayed diagnosis in IBD. In addition, the current study aims to assess the immediate impact of this
diagnosis delay on complications and the need for surgery.
Material and methods
IBD Prospect project was initiated in 2006, through the partnership of two reference medical centers. The
initial goal of the project was to generate a basic computer infrastructure to collect data about IBD at national
level, wishing to expand it into a larger number of tertiary diagnosis gastroenterology centers in Romania. IBD
Prospect is a IBD data basis and it is the first of its kind in Romania. Patients have been included prospectively in
this data basis since June 2006. The questionnaires include demographic, clinical, laboratory information, and
their introduction in IBD Prospect initially requires to obtain the patient informed consent.
Diagnosis delay was defined as the time in months from the onset of symptoms subsequently imputed to
IBD and disease diagnosis. We tried to evaluate the correlation between diagnosis delay and patient-related
factors and disease. The factors that were analyzed are: sex, age at diagnosis, origin, geographic region, ethnic
group, location of disease, smoking at diagnosis, presence of EIM, the onset of symptoms during the summer
months.
In the second part of the study, we referred only to the CD group. We used logistic regression model to
determine whether the delay of IBD diagnosis has an effect on following parameters: occurrence of
complications- intestinal stenosis, fistulas (entero-enteral, enterocutaneous, entero-bladder fistulas), perianal
disease (perianal fistulas); intestinal surgery (intestinal resection, colectomy, colostomy, ileostomy), perianal
surgery (abscess drainage, fistulotomy or fistulectomy).
Results
A total of 1495 patients were included in IBD Prospect. Data regarding the diagnosis delay was available
for 1196 patients. The time median from diagnosis to the registration into the data base was 4 months for all 3
diseases studied. Late diagnosis differed significantly between the group suffering of CD and the group suffering
of UC (p≤0.001) and between the group suffering of UC and the group suffering of IC (p≤0.01); the difference was
not significant between the patients with CD and IC (p = 0.51). 50% of patients with CD were diagnosed in the
first 5 months from the onset of symptoms, compared to only 1 month for UC and 4 months for IC.
In the univariate logistic regression analysis for patients with CD, the location is negatively correlated with
long delay diagnosis (p = 0.002), while active smoker status on diagnosis and onset of symptoms during the
summer months (as opposed to the other months of the year) were both risk factors for delayed diagnosis in CD
patients(p = 0.05, respectively p <0.001). In the group of UC, the univariate logistic regression identified the age
of onset over 40 years as a protective factor for the determination of late diagnosis (p = 0.04); the significance
persists after the inclusion in the multivariate analysis.
Long diagnosis delay was significantly associated with the development of bowel stenosis (OR: 3.38, p
<0.001 for the subgroup above the 75 percentile) along with a history of appendectomy (OR: 2.12, p = 0.01) and
disease duration (OR: 1.04, p = 0.04). For intestinal fistulas, diagnosis delay was a significant predictor (OR: 2.64,
p = 0.08 for group> 75 percentile), as well as a history of appendectomy (OR: 4.1; p = 0.000). Age over 40 years at
diagnosis was a protective factor for the development of intestinal fistulas (OR: 0.29, p = 0.01).
As related to perianal fistulas, belonging to a different ethnic group than the Romanian group is a risk
factor (OR: 2.13, p = 0.05); diagnosis delay – the group between 25-50% percentile is also associated with the
risk (OR: 4.32, p = 0.01). Disease duration (OR: 1.04, p = 0.02), appendectomy (OR: 2.23, p <0.001) and delay
subsets between 50-75% (OR: 1.86, p = 0.05) and > 75% (OR: 1.96, p = 0.03) were associated with a higher risk
of surgery for any complications due to CD. Female gender was a protective factor for the risk (OR: 0.63, p =
0.04). None of the variables studied was significantly associated with the risk of perianal surgery. Intestinal
resection was predicted by the history of appendectomy (OR: 2.6, p <0.001), disease duration (OR: 1.07, p
<0.001) and delayed diagnosis subgroup 50-75% (OR: 2.24, p = 0.04). Different ethnicity from the Romanian one
was associated with this risk but not statistically significant (OR: 1.82, p = 0.07).

Study 4. Autophagy and serologic markers in Crohn’s disease

Objectives of the research


This research has started from the prerequisite that autophagy plays a central role in the pathogenesis of
the CD and that there are genotype-phenotype correlations demonstrated in a few studies in the literature. In
addition, autophagy damage may be associated with the loss of tolerance to microbial antigens and the
occurrence of microbial antibodies on the one side, and the presence of granulomas on the biopsy samples in
patients with CD. The present study has several objectives: ATG16L1 genotyping in CD patients and controls,
determination of ASCA IgA and IgG and pANCA in CD patients, genotype-phenotype correlations, genotype-
serological markers correlations.
Material and methods
The study population included 83 patients with CD and 104 healthy volunteers. The group of volunteers
was similar to that of patients with CD in terms of age and sex. Subsequently, we assessed the association
between the presence of polymorphism ATG 16 L1 and serological markers and phenotypic characteristics of CD.
Results
The distribution of ATG16L1 genotype in our cohort was as follows: 30.1% are homozygous for this
mutation, 50.6% heterozygous and 19.3% have normal variant. In terms of serological markers, 32.5% of
patients had positive ASCA IgG and 72.3% ASCA IgA, while only 13.3% had pANCA.
The location of the disease was different comparing the above-mentioned categories (p <0.01, respectively
p = 0.01) with the net predominance of the location in the terminal ileum for homozygous (GG) and heterozygous
(AG) for mutation ATG16L1 compared to those that present normal variant. The impairment of upper
gastrointestinal tract (L4 in Montreal classification) did not differ according to ATG16L1 genotype. Of all the
possible combinations, the interaction between the ATG polymorphism and class B of the Montreal classification
give statistical significance only comparing group GG with group AA from B1 and the remaining cohort (p = 0.02,
Fisher's test).
EIM are more common in carriers of at least one risk allele; thus, the comparisons of genotype GG versus
AA and AA versus non-AA reached statistical significance. The correlation of ATG16L1 genotype – CD pattern
reaches only marginal significance when comparing the homozygous group for this mutation with normal
variant group, with predominance of GG genotype in the case of complicated pattern. The percentage of patients
operated with postoperative recurrence was higher in the group with GG genotype compared with the rest of the
cohort; but the significance is marginal.
ASCA serum values (both IgA and IgG) were lower in patients with inflammatory pattern (B1) compared
with the complicated one (stenosing-B2 or penetrating-B3), but the difference does not have statistical
significance. ASCA IgA level was significantly higher in the case of patients with lower age of onset. ASCA IgG
values (p = 0.01) and ASCA IgA values (p <0.01) were significantly higher in patients who required surgery
compared with those who were not operated on. ASCA IgG level was significantly higher in patients with CD
operated on, who experienced postoperative recurrence compared with the remaining patients. pANCA level
differs significantly between the categories smoker/non-smoker/ex-smoker, p = 0.02. Although we notice higher
amounts of quartiles in complicated cases, the difference does not reach statistical significance (p = 0.44, test
Cochran-Mantel-Haenszel).

Study 5. The role of serologic markers and genetic polymorphisms in the


prediction of response to anti-TNF therapy in the inflammatory bowel
diseases

Objectives of the research


This research started from the premise that there is no 100% response rate to anti TNF-alpha therapy and
that the response to the therapy in such heterogeneous disorder as IBD is influenced by several factors such as
disease duration, phenotype, severity. We have also identified polymorphisms associated not only with an
increased risk of side effects induced by a particular treatment, but also with the type of response. In this
context, the present study was conducted in several phases, with the following objectives: to establish the effect
of anti TNF-alpha (IFX and ADA) therapy on the apoptosis of bowel cells in patients with IBD, to establish a
correlation between clinical and genetic predictors in the response to anti-TNF-alpha therapy, to establish a
correlation between the decrease in the rate of apoptosis induced by anti-TNF-alpha therapy and mucosal
healing.
Materials and methods
In this study, we included patients with IBD with indication for anti TNF- alpha therapy admitted to the
Regional Institute of Gastroenterology and Hepatology and Medical Center of Gastroenterology and Hepatology
Cluj-Napoca between 2010-2014.
The parameters monitored before and after the administration of anti TNF-alpha therapy consisted of:
demographic data, IBD- related data(disease duration, location, evolutive pattern, indication for anti TNF-alpha
therapy, medical treatment before/concomitant with the current therapy, severity), usual serum markers:
hemoglobin, ESR, C reactive protein, serological markers (ASCA and pANCA) and genetic markers (IL23R, TNF
alpha). We performed colonoscopy with terminal ileoscopy for taking biopsies of inflamed areas (to determine
the histological activity and immunohistochemistry) before and after induction therapy. Later, we monitored if
there is a change in the apoptotic rate after the biological therapy and whether the decrease of apoptotic rate
correlates with mucosal healing.
For the entire cohort of patients, we evaluated the response to induction therapy. Subsequently, the
cohort of patients, who were also monitored during the maintenance therapy, was analyzed for loss of response
to biological therapy and necessity of dose escalation.
Results
In the period studied, 87 patients had indication for administration of anti TNF-alpha therapy, 40 patients
suffering of CD and 47 patients suffering of UC. We may notice that there is a decrease in the median of
inflammatory sample (ESR, CRP) at the end of induction therapy and an increase in Hgb value. The distribution
of the two polymorphisms studied (TNF alpha 308 and IL23R rs 10889677) differ significantly between patients
with UC and CD.
TNF-alpha 308 polymorphism (AA homozygous variant) is significantly more common among non-
responders than among responders. As related to the IL23R polymorphism studied, mutant variants
(homozygous-CC, respectively heterozygous-AC) are more common in responders versus non-responders(p
<0.001).
Out of the predictors studied for the primary lack of response to induction therapy, in the case of patients
with UC, they reached statistical significance only rural areas that associate with the lack of primary response
and the presence of IL23R polymorphism (group consisting of homozygous and heterozygous variants) as
protective factor. Risk factors for the lack of response in CD group are: different ethnicity from the Romanian,
rural origin, pretreatment low Hgb and low serum of ASCA IgA. The presence of mutant variants of IL23R
increases the chance of response, although insignificant in this subgroup.
A total of 10 patients required surgery during follow-up – 5 during induction, 5 during maintenance
therapy. Out of the predictors studied, only the value of ESR and Hgb before initiation were significantly
correlated with the need of surgery during anti TNF-alpha therapy(for patients with UC). Thus, a higher value of
ESR, i.e. a lower value of Hgb before the induction therapy increases the risk of surgery.
Eight patients (9.25% of the entire cohort) required increasing doses during therapy to maintain the
response. Out of the predictors studied for the subgroup with UC, none of the variables correlated significantly
with the risk; however, disease duration from initiation over 2 years and the association of immunosuppressants
decrease the risk of dose escalation, but the increased serum level of ASCA IgA increases this risk. In CD patients,
smoking increases significantly the risk of dose escalation and age category A3, the increased ESR and CRP
values before therapy initiation is associated with the event, but not significantly. Instead, the increased value of
Hgb before initiating anti TNF-alpha therapy decreases this risk.
Out of the 69 patients who were monitored during the maintenance therapy, 9 had secondary loss of
response. Out of the evaluated predictors, the following parameters were correlated with this aspect, however
insignificantly: pretreatment high levels of ESR, increased serum levels of ASCA and young age at initiation (for
patients with UC) and the increased value of CRP before initiation (for patients with CD).
The determination of the apoptotic ratio on the epithelium was only possible for 27 patients with UC; this
determination was performed before and after induction therapy. There is a clear decrease in the apoptosis rate
of intestinal cell on the biopsies obtained after the induction therapy compared to the biopsies taken before.
Thus, the average rate of apoptosis before the initiation of anti TNF-alpha therapy was 74.67% (44-94%), and
after initiation of TB, it was 24.33% (5-45%). The difference between these two values was significant: OR: 50.33
(CI95%: 43.29-57.38), p <0.001. The decrease of the apoptotic rate was significantly higher in patients who
achieved mucosal healing (median, 62%) compared with those without mucosal healing (median - 39.5%), p
<0.001.
GENERAL CONCLUSIONS
1. Up to 96% of the patients with ulcerative colitis relapse during the first 5 years after diagnosis. The
incidence of first recurrence is highest in the first year and then decreases gradually. The patients with a
short term to first recurrence will present a greater number of relapses in the future.
2. As independent predictors of recurrence, our study has identified the following factors: appendectomy,
extended colitis and administration of corticosteroids at the previous attack.
3. 8.27% of the entire group underwent colectomy in the disease course. Half of the colectomies had
emergency indications and only a relatively small percentage had colorectal cancer as an indication of
surgery.
4. The initial severe attack is the only independent predictor of colectomy. The location of the disease
(extended colitis) and the severity of the disease are predictors of emergency colectomy.
5. We do not notice any consistent trend in the variation of the ratio CD/UC in time, but there is a steady
increase in the percentage of hospitalizations due to CD aut of the total admissions in the studied period.
6. There are statistically significant differences regarding the pattern of the disease at diagnosis between
the two periods studied, with the increase in the number of the inflammatory pattern and the
penetrating one and decrease in the stenosing pattern and changes in the location of the disease
according to the period when it was diagnosed. Thus, it may be noticed the increase in the frequency of
colon and terminal ileum location, with the decrease in the ileo-coloniclocation, while the damage of the
upper gastrointestinal tract is noticed only in the second period.
7. There are significant differences in terms of the therapy used; so we may notice that as frequency of
immunosuppressants administration increases and the biological treatment initiation occurs, the
frequency of administration of 5-ASA derivatives and corticosteroid therapy in CD decreases.
8. We may notice a slight decrease in the number of patients operated on diagnostic- from 13.2% of those
diagnosed by 2008 to 8.8% of those diagnosed in the second period. If we consider the surgery rate by
period of diagnosis, we may notice that the patients with most recent diagnosis are lesser operated on,
but the significance is marginal.
9. Diagnosis Delay is more important in patients with CD compared to those with UC.
10. Young age on diagnosis (<40 years) in patients with UC and ileal location, the onset of symptoms during
the summer months and active smoking status at diagnosis in patients with CD are associated with a
longer time between the onset of symptoms and diagnosis.
11. The delay in diagnosis was significantly associated with the development of bowel stenosis, fistulas and
perianal pathology. This factor was significant associated with the risk of bowel resection.
12. The difference between the allele frequencies of the autophagy genes studied – ATG 16 L1 between the
group of CD patients and control group was insignificant.
13. The relationship between the effect on the autophagy process and the CD was revealed by the fact that
the presence of at least one allele confers increased risk of ileal location. In addition, the absence of this
mutation correlates with the presence of inflammatory pattern.
14. There is no relationship between the presence of granulomas on biopsy samples of the patients with CD
and ATG16L1 gene variants.
15. ASCA IgA and IgG are most frequently distinguished in complicated cases that require surgery and
present postoperative relapse versus uncomplicated cases. However, colonic form presents more
frequently positive pANCA.
16. 10.34% of the entire group of patients did not respond to induction therapy and an equal percentage of
patients had secondary loss of response to anti TNF-alpha therapy.
17. Of the demographic characteristics studied, only the origin in the rural environment and young age at
diagnosis correlated negatively, respectively positively with the response to the induction therapy.
Continued smoking in CD patients correlated with unfavorable evolution during treatment.
18. Elevated levels of inflammatory tests (ESR, CRP) before initiating anti TNF-alpha therapy were
associated with a poor outcome reflected through the need for colectomy, necessity of biological dose
escalation and secondary loss of response. The low hemoglobin level was associated with primary lack
of response, dose escalation necessity, and the risk of surgery.
19. The presence of pANCA associated with the primary lack of response and the lack of renunciation to
corticotherapy, while the presence of ASCA or increased titre of this marker is associated with a higher
rate of primary response and renunciation to cortico-therapy.
20. The homozygous variant of TNF-alpha 308 mutation was significantly more frequent among non-
responders than among responders. The mutant variants (homozygous or heterozygous) of IL23R rs
10889677 gene are more common in responders versus non-responders.
21. Anti TNF-alpha therapy induces apoptosis of intestinal epithelial cells with a significant decrease in
intestinal apoptosis rate at the end of induction therapy.