Programul Cercetare de Excelenta - CEEX Nr.

înregistrare _______/________________
Modul: Sănătate Pagina:
Tip proiect: P-CD
Contractor: UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI Contract nr. 77/2006

APROBAT,
DIRECTOR PROGRAM
Prof. Univ. Leon Zagrean

AVIZAT,
RESPONSABIL DE PROIECT

RAPORT DE CERCETARE – DEZVOLTARE

Denumirea proiectului: Studii la nivel celular şi molecular privind activităţile biologice ale curcuminei
în vederea evaluării potenţialului terapeutic
Perioada raportată (Nr. fază/perioada de derulare) Faza I/ 1.09.2006- 10.12.2006

Autori/Coautori

RECTOR, DIRECTOR DE PROIECT,

Prof. Dr. Ioan Pânzaru Lector Dr. Anişoara Cîmpean

COLECTIV DE LUCRU,
(Nume şi prenume)
Lector Dr. Anişoara Cîmpean şi colectivul

CONTABIL ŞEF DELEGAT,

Ec. Florentina Paraschiv Dr. Braşoveanu Lorelei CS I şi colectivul
(Nume şi prenume, semnătură) Dr. Liliana Puiu CS II şi colectivul
Conf Dr. Ion Romulus Scorei şi colectivul

1
Programul Cercetare de Excelenta - CEEX Nr. înregistrare _______/________________
Modul: Sanatate Pagina:
Tip proiect: P-CD
Contractor:UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI Contract nr. 77/2006

I. Denumirea Proiectului: Studii la nivel celular şi molecular privind activităţile biologice ale
curcuminei în vederea evaluării potenţialului terapeutic

Categoria de proiect Modul I Sanatate; Proiect P-CD/ Nr. fază: I

Denumirea fazei: Studii in vitro pe linii celulare tumorale mamare privind influenţa curcuminei asupra reglării
expresiei MMP de către factori transcripţionali
Obiectiv planificat: Un studiu complex la nivel celular şi molecular pe linii celulare tumorale din carcinomul
mamar (MDA-MB-231 şi MDA-MB-435) privind activităţile biologice ale curcuminei (CM) în vederea
evaluării potenţialul.ui său terapeutic.

II. Descrierea activităţii (desfăşurate în cadrul fazei cu utilizare de cuvinte cheie şi DESCRIPTORI):
Pentru realizarea obiectivelor propuse s-au utilizat tehnici de biologie celulară şi moleculară şi tehnici de
biochimie:
- culturi de celule;
- teste de citotoxicitate (MTT şi LDH);
- metode de chemotaxie (MigrationIInvasion assay);
- western-blot;
- zimografie;
- tehnici de amplificare genică (RT-PCR);
- tehnici de transfecţie cu vectori de supraexpresie pentru proteinele cJun, cFos;
- silencing – transfecţii cu molecule ARN de interferenţă anti-cJun.
- EMSA (electrophoretic mobility assay) metodă de evidenţiere a activităţii funcţionale a factorilor de
transcripţie
Rezultate obţinute (se nominalizează rezultatele cuantificabile/indicatori tehnici, economici, sociali, etc.- efecte economice
înregistrate la unitatea de CD):
Studiile întreprinse pe celule tumorale mamare au evidenţiat că: activităţile factorilor transcripţionali
AP-1, NFkB şi CRE cresc odată cu scăderea densităţii celulare ceea ce conduce la activităţi proteolitice
MMP crescute; supraexprimarea şi inhibarea proteinelor complexului AP-1 au efecte complementare astfel
încât supraexprimarea factorului AP-1 induce expresia MMP şi inhibă pe cea a inhibitorilor TIMP iar
silencing pentru proteina c-Jun reduce expresia MMP şi induce pe cea a inhibitorilor TIMP; transfecţia cu
vectorul de expresie c-fos a determinat o inducţie semnificativă a invazivităţii celulelor MDA-MB-231 şi
MDA-MB-435 dar cu o mai mică amploare comparativ cu efectele induse de c-jun. Curcumina exercită
efecte citotoxice ce se manifestă mai pregnant asupra culturilor subconfluente. Totodată ea determină
inhibarea expresiei şi activităţii MMP precum şi a potenţialului invaziv al celulelor tumorale mamare.
Efectele citotoxice şi anti-invazive demonstrate ale curcuminei constituie baza studiilor următoare
din cadrul acestui proiect în vederea evaluării potenţialului său terapeutic în procesele tumorale.

Stadiul realizării obiectivului planificat/forma de finalizare (a activităţii în cadrul fazei):

Obiectivele etapei de cercetare au fost îndeplinite în totalitate fără abateri de la activităţile planificate.

III. Elemente de noutate

Brevet

Lucrare Ştiinţifică

2
 1 Comunicare Ştiinţifică

(se descriu elementele de noutate, nominalizându-se după caz, titlul de brevet, lucrare sau comunicare ştiinţifică)
Cercetarea realizată reprezintă un element de noutate în ceea ce priveşte reglarea expresiei MMP de către
curcumină în celulele tumorale MDA-MB-231 şi MDA-MB-435. Studiile au fost comunicate la „2nd
International Congress of The Romanian Society for Cell Biology”, Iaşi 2006.

IV. Metode de valorificare si eficienta economica a aplicarii rezultatelor

(se descrie domeniul, beneficiarul şi/sau activitatea specifică vizată, efectele economice obţinute de agentul economic beneficiar al
rezultatelor)
Cercetările întreprinse au o importanţă deosebită în terapia anti-tumorală. Curcumina poate reprezenta o
sursă de principii naturale ce ar putea fi valorificate în industria farmaceutică. Beneficiarul direct al
rezultatelor obţinute este populaţia afectată de cancer mamar.

V. Perspective
(se pun în evidenţă posibilităţile de extindere a aplicării rezultatelor la mai mulţi beneficiari şi/sau în alte domenii)
Proprietăţile biologice ale curcuminei pot fi testate şi pe alte sisteme celulare tumorale, aplicaţiile sale
terapeutice putând fi extinse.

VI. Înregistrări
(se nominalizează documentele care se anexează pentru susţinerea RCD:, documentaţii de execuţie, buletine de
măsurare/testare/analiză, planuri de afaceri, diagnoze, evaluări, prognoze etc.) Nu este cazul.

I. Date din literatură privind acţiunea curcuminei în diferite stări patologice

3
 În ultimii ani au fost descrişi mai mulţi compuşi biologici naturali şi sintetici cu
acţiune inhibitoare asupra metaloproteinazelor matriceale cu scopul de a stopa acţiunea
pro-metastazică a acestor enzime şi de a creea posibile tratamente cu importanţă clinică
în terapia anticanceroasă. Un astfel de compus intens studiat în diverse modele celulare
de cancer uman este curcuminei.
Modularea expresiei MMP şi a potenţialului invaziv al celulelor tumorale de către
curcumină (diferuloiImetan), principiul activ al şofranului, pare a fi o posibilitate importantă
de investigare a mecanismelor supresoare asupra creşterii celulelor tumorale.
Curcumina este un compus biologic activ, polifenolic obţinut din rizomul unei
plante medicinale, Curcuma longa. Curcumina este pigmentul galben extras din şofran,
care este larg folosit ca aditiv în alimentaţie (în condimente, muştar, budinci, gelatine,
îngheţate, supe, margarină, băuturi alcoolice şi ne-alcoolice, etc). Constituenţii săi activi
sunt uleiuri volatile de culoare galbenă-portocalie, numite curcuminoide. Curcumina
[diferuloilmetan; 1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadien-3,5-dionă] exercită
proprietăţi anti-inflamatorii, anti-oxidante şi anti-carcinogenice. Această plantă indiană
conţine 77% curcumin, 17% demetoxicurcumin şi 3% bis-demetoxicurcumin.
Expunerea populaţiei la curcumină şi utilizările sale multiple au avut ca rezultat
întreprinderea de numeroase studii la nivel mondial privind activităţile sale biologice.
Astfel, cercetări intense din ultimii 50 de ani au demonstrat că acest compus acţionează
ca scavenger de radicali liberi şi anti-oxidant [Ruby şi colab., 1995] inhibând peroxidarea
lipidelor şi alterarea oxidativă a ADN. Inhibarea lipoxigenazei şi cicloxigenazei ce
determină eliberarea scăzută de acid arahidonic împreună cu capacitatea de a inhiba
activarea NF-kB [Singh şi Aggarwal, 1995] pot contribui la activitatea anti-inflamatorie a
acestui compus şi a unor derivaţi ai săi (curcuminoide). O altă proprietate manifestată de
către curcumină este aceea de a inhiba funcţia c-jun/AP-1 [Huang şi colab., 1991] şi
activarea JNK. Inhibarea activării JNK a fost asociată cu inducerea mediată de
chimioterapie a apoptozei în celulele tumorale. Curcuminoidele s-au dovedit a fi inhibitori
ai citocromului P450 [Oetari şi colab., 1996] şi manifestă capacitatea de a induce
glutation-S-transferaza şi în consecinţă li s-a atribuit un rol de chemoprevenţie. Deoarece
curcumina inhibă formarea tumorilor în ţesuturi murine şi antagonizează atât iniţierea cât
şi promovarea tumorilor pe modele de cancer epitelial şi de colon, interesul privind
implicarea acestui compus în chemoprevenţie a devenit din ce în ce mai mare. De

4
asemenea, au fost demonstrate proprietăţile anti-angiogenice în câteva laboratoare şi pe
modele in vivo.
Activitatea de chemoprevenţie a curcuminei pe modele animale a condus pe o
serie de cercetători la studierea impactului său asupra creşterii celulelor tumorale şi
apoptozei. Astfel, a fost raportat efectul anti-proliferativ al curcuminei pe celule în cultură
în cancerul de colon [Hanif şi colab., 1997] şi cancerul de sân [Ramachandran şi You,
1999]. Acesta s-ar putea datora în parte morţii celulare programate deoarece la
concentraţii mari curcumina poate induce apoptoza, ca de exemplu în celulele leucemice
umane. Dimpotrivă, în alte sisteme curcumina poate inhiba apoptoza, ca de exemplu în
cazul limfocitelor T şi protejează plămânii de vătămarea indusă de bleomicină şi
miocardul de şobolan de adriamicină. Totuşi, impactul său asupra aplicaţiilor terapeutice
ale medicamentelor anti-neoplazice nu a fost studiat în detaliu. Deoarece speciile reactive
de oxigen par a îndeplini roluri importante în apoptoza indusă de medicamente se poate
presupune că curcumina, în calitate de anti-oxidant sau scavenger de ROS ar putea
inhiba capacitatea medicamentelor chemoterapeutice de a induce apoptoza.
Farmacologic, curcumina a fost gasită fără risc pentru organism. Tratamente
clinice pe om arată lipsa toxicităţii independent de doză, când s-a administrat la doze
până la 10g\zi. Toate aceste studii au sugerat că curcumina are potenţial enorm în
prevenţia şi terapia cancerului.
Peste 50 de ani de investigaţii indică faptul că curcumina reduce colesterolul
sanguin, previne oxidarea LDL, inhibă agregarea plachetelor sangvine, previne tromboza
şi infarctul miocardic, supreseaza simptome asociate cu diabetul tip II, artrita reumatoidă,
scleroza multiplă şi Alzheimer [Lim şi colab., 2001], inhibă replicarea HIV [Jordan şi
colab., 1996], stimulează vindecarea rănilor, protejează ficatul împotriva leziunilor, creşte
secreţia biliară, protectie faţă de modificările patologice care conduc la cataractă,
protecţie împotriva toxicităţii pulmonare şi a fibrozei [Venkatesan, 1995], anti-
aterosclerotic. În plus, există o bogată literatură care sugerează că acest produs natural
are un potenţial în prevenirea şi tratarea cancerului.

II.1. Linii celulare şi tratamente

5
 Studiile au fost realizate pe linii celulare de carcinom uman mamar (obţinute prin
donaţie din partea Dr. Bachmeier, Ludwig Maximilian Universitat Munchen, Germania).
Sunt linii celulare izolate prin efuzii pleurale ale unor pacienţi cu carcinom mamar.
Celulele MDA-MB-231 au fost descrise ca fiind negative pentru receptorii de
estrogen. Celulele au o morfologie epitelial-like, rotunde, crescând în monostrat. Sunt
invadatoare şi moderat metastazice, in vivo.
Celulele MDA-MB-435 au o morfologie epitelial-like, rotunde cu scurte prelungiri,
crescând în monostrat cu pierderea inhibiţiei de contact. Celulele MDA-MB -435 sunt cele
mai agresive, invadatoare şi metastatice dintre toate liniile de carcinom mamar, in vivo.
Condiţii de cultivare: Cultura se menţine în mediu de creştere MEM suplimentat
(ser fetal bovin 5%, vitamine, aminoacizi neesenţiali, piruvat de sodiu, antibiotice) la 37oC
în atmosferă de CO2 5%, umiditate 95% şi în flascuri de cultură Falcon.

II. 2. Tratamentul celulelor cu curcumină

Pentru toate experimentele curcumina a fost utilizată într-o unică concentraţie,
25µM, soluţia stoc de 2,5mM a fost diluată în mediul de cultură.
Tratamentul a durat diferite perioade de timp, de la o oră până la 48 de ore, după
care s-a stopat efectul prelevând mediul de cultură, celulele au fost recuperate şi supuse
mai multor teste ce au avut ca scop studiul efectului acestei substanţe ce afectează
metabolismul normal al celulelor de carcinom mamar în cultură. Pentru fiecare
experiment a fost ales un eşantion de celule ce au fost prelucrate in aceleaşi condiţii ca
mai sus cu o singură excepţie, in mediul lor de cultură nu a fost aplicat tratament, acest
eşantion este considerat control şi este util în interpretarea rezultatelor folosindu-se ca
etalon.

II.3. Testul de viabilitate celulară (MTT)

Principiul metodei: Tratarea celulelor cu [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliu] MTT permite evaluarea metabolismului oxidativ şi a răspunsului unei
populaţii celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vieţii
celulelor în cultură. Din acest motiv testul MTT este folosit ca test pentru studii de
viabilitate, citotoxicitate şi proliferare celulară.

6
 • Celulele au fost însămânţate în placă ELISA de 96 godeuri într/un volum de 0,2 ml
şi incubate pentru 24 ore la 37oC au fost tratate cu 25µM curcumin mai multe
perioade de timp (0, 2, 4, 24 ore);
• Mediul de cultură a fost îndepărtat, iar celulele au fost spălate de două ori cu PBS
şi tratate cu soluţie MTT 1mg/ml. După incubare la 37oC cristalele de formazan
sunt solubilizate în izopropanol iar soluţia obţinută este densitometrată la 570nm.

II.4. Testul de citotoxicitate (LDH)

Citotoxicitatea, de regulă, se studiază prin testul activităţii LDH (lactat

dehidrogenaza), evaluată spectrofotometric prin urmărirea oxidării NADH în prezenţa
piruvatului.
Reacţia este monitorizată prin scăderea absorbanţei la 340 nm. Scăderea
viabilităţii celulare este urmărită prin creşterea activităţii enzimatice în mediul de cultură.
În această tehnică s-a studiat activitatea LDH.

II.5. Metoda de chemotaxie (Migration\Invasion Assay)

Principiul metodei: Scopul metodei de chemotaxie este de a determina dacă
anumite molecule de interes biologic au activitate chemotactică pentru un anumit tip
celular. Chemotaxia este proprietatea unei proteine de a direcţiona migrarea unor celule
specifice. Această metodă se bazează pe premiza creării unui gradient a agentului
chemotactic permiţând celulelor să migreze printr-o membrană către agentul chemotactic.
Suspensia celulară se pune peste un filtru (membrană) căptuşit cu colagen tip IV (în
cazul migrării) sau cu o soluţie de matrigel (în cazul invaziei), sub acest filtru existând o
soluţie ce conţine chemoatractant, totul într-o cameră Boyden-Chamber. Dacă celulele au
capacitate migratoare respectiv invazivă vor trece prin acest filtru, iar cele care au trecut
sunt colorate şi numărate, bineînţeles raportate la control (fără chemoatractant-control
negativ; fără tratament cu curcumin- control pozitiv).

• Se prepară o suspensie celulară în mediu şi se aplică într-o cameră Boyden–

Chamber peste filtrul căptuşit cu membrană artificială şi sub care a fost
adăugată în prealabil soluţia de chemoatractant. După incubare la 37oC diferite

7
 perioade de timp se cuantifică numărul de celule de pe faţa internă a
membranei colorate în prealabil cu albastru de toluidină.

II.6. Zimografie
Principiul metodei: Această metodă permite evidenţierea activităţii unor enzime
proteolitice separate electroforetic în geluri de poliacrilamidă (PAA) ce conţin substratul
lor. Gelurile de poliacrilamidă vor evidenţia plaje de liză situate corespunzător masei
moleculare a enzimelor testate în prezenţa unor markeri de masă moleculară.
• Mediul de cultură condiţionat recoltat de pe celule tumorale şi lizatul celular au fost
aplicate pe geluri ce conţin gelatină sau cazeină şi supuse migrării electroforetice
în prezenţă de markeri de MM
• După electroforeză, gelurile sunt spălate pentru îndepărtarea SDS în soluţie Triton
x 100 ceea ce permite enzimei să se renatureze.
• Gelurile se incubează la 37°C peste noapte în tampon de activare ceea ce permite
degradarea substratului.
• Colorarea gelurilor se realizează cu o soluţie de Comassie Brilliant Blue şi este
urmată de o etapă de decolorare având ca rezultat clarificarea benzilor de liză.

II.7. Western blotting

Principiul metodei: Metoda este utilizată pentru identificarea şi determinarea
mărimii unor antigene (proteine) care reacţionează cu un anticorp specific. Proteinele, la
început, sunt separate electroforetic în geluri de SDS-PAGE şi apoi transferate
electroforetic de pe gel pe un substrat solid, ca nitroceluloza, difluorid polivinidil (PVDF)
sau membrană cationică de nylon. Apoi situsurile de legare nespecifice nereacţionate de
pe membrană sunt blocate pentru a supresa adsorbţia nespecifică a anticorpilor,
proteinele imobilizate reacţionând specific cu anticorpi monoclonali sau policlonali.
Complexele antigen-anticorp sunt localizate radiografic, cromogenic sau prin reacţii
chemiluminiscente.
• Probele (mediu de cultură condiţionat sau lizat celular) migrate electroforetic sunt
supuse transferului pe membrana de nitroceluloză.
• Situsurile libere ale membranei sunt blocate pentru a suprima adsorbţia ulterioară
a anticorpului primar, cu o soluţie de lapte degresat în tampon TTBS. Anticorpul

8
 primar diluat se incubează cu membrana cel puţin 2 ore. Membrana este spălată
cu tampon TTBS.
• Anticorpul secundar, cuplat cu fosfataza alcalină, diluat se incubează cu
membrana.
• Pentru detecţia cromogenică cu fosfataza alcalină, se prepară o soluţie de
developare care conţine substratul fosfatazei alcaline NBT şi BCIP. Membrana se
spală, usucă şi păstrează într-un mediu ferit de lumină

II.8. EMSA (electrophoretic mobility assay)

Principiul metodei: EMSA (electrophoretic mobility assay) este metoda de studiu a
interacţiilor ADN-proteine. Se bazează pe mobilitatea diferită a complexelor ADN-
proteină, în timpul migrării electroforetice, faţă de proteinele care nu leagă ADN. Această
diferenţă poate fi vizualizată pe geluri de poliacrilamidă folosind ADN marcat radioactiv în
formarea complexelor ADN-proteine. EMSA este o metodă electroforetică de punere în
evidenţă a activităţii funcţionale a unor proteine nucleare (factori transcripţionali) prin
formarea unor complexe proteine ţintă-secvenţe ADN marcate radioactiv, complexe care
vor fi analizate radiografic după migrarea electroforetică. Secvenţa ADN marcată
radioactiv, specifică pentru un anumit factor transcripţional este incubată cu extractul
nuclear din celulele de interes, unde se presupune existenţa proteinei urmărite,
complexul format este migrat electroforetic în prezenţa unui control negativ (secvenţa
ADN marcată radioactiv, pusă pe gel ca atare necomplexată cu proteina nucleară ţintă).
Complexul rezultat este vizualizat după expunerea gelului la un film radiografic urmată de
developarea acestuia, intensitatea benzii obţinute fiind dependentă de gradul de
radioactivitate utilizat.
• Se realizează electroforeza probelor (extract nuclear proteic din celule tumorale şi
oligonucleotide marcate radioactiv cu secvenţă specifică pentru proteinele de
interes) în geluri de PAA 5%.
• După migrare, gelul este transferat pe o hârtie de filtru şi uscat într-un incubator la
75-80oC, se acoperă cu o folie transparentă de celofan şi este expus unui film
radiografic într-o cameră întunecoasă în cutie specială, pentru perioade de timp
diferite în funcţie de intensitatea semnalului radioactiv.

9
II.9. Reacţia de amplificare PCR
ADNc obţinut prin revers transcriere a fost amplificat prin reacţii PCR, folosind Taq
ADN polimeraza. Prin definiţie, reacţia PCR este o reacţie în lanţ. Produsul unui ciclu de
amplificare serveşte ca substrat pentru următorul ciclu. Ca urmare, cantitatea de produs
de reacţie (amplimer) creşte exponenţial şi nu linear, ca în majoritatea proceselor
enzimatice.
Cinetica reacţiei PCR poate fi urmărită în timp real (Real-Time PCR) prin
introducerea în amestecul de reacţie a unor compuşi fluorescenţi. SybrGreen I este un
colorant fluorescent, specific pentru molecule dublu catenare. În timpul fiecărei faze a
sintezei ADN, colorantul SybrGreen I se intercalează în fosa minoră a moleculelor de
ADN dublu catenare, iar amplimerul este detectat prin fluorescenţa sa. Reacţiile RT-PCR
cantitative, în segmentul exponenţial de amplificare, au fost realizate folosind Light Cycler
FastStart Master SybrGreen I kit -Roche, respectând condiţiile de lucru cerute de furnizor.
Specificitatea reacţiei este dată de analiza curbei de topire determinată automat la
sfârşitul reacţiei PCR.

II.10. Tehnica de atenuare „Silencing” a proteinei c-Jun

Principiul metodei: Procesul de silencing se bazează pe introducerea în celule
(prin transfecţie sau microinjecţie) a unor molecule mici de interferenţă dublu catenare de
ARN (small interfering RNA). Moleculele de ARNsi sunt tipic făcute din 2 matriţe sintetice
complementare conţinând 19 baze ARN urmate de 2 baze ADN (de preferinţă timina T).
ARNsi, în celulă, se leagă complementar la ARN mesager şi intervine în dereglarea
proceselor celulare, permite analiza funcţiilor genice a celulelor mamaliene. Moleculele
de ARNsi pentru c-jun, introduse în celule prin permeabilizarea acestora cu lipofectamină,
interferă cu translaţia ARN mesager pentru proteina c-Jun, creând o regiune loop în
structura acestuia sau ducând chiar la degradarea moleculei de ARNm.
• Celulele au fost însămânţate la o confluenţă de 40%;
• Mediul de cultură este schimbat şi se adaugă următorul amestec ce conţine mediu
de cultură simplu, lipofectamină, ARNsi, iar pentru control acelaşi amestec
conţinând în loc de ARNsi, o secvenţă ARN non-si conjugată cu fluoresceină.

10
 • Se extrage ARN total, se obţine ADN complementar prin revers transcriere iar
acesta din urmă este supus experimentelor de RT-PCR. Mediul de cultură este
supus experimentelor de western blot şi zimografie.

II.11. Supraexprimarea proteinelor c-Jun/c-Fos

Principiul metodei: Transfecţia este un proces, în general, de introducere a unei
molecule de ADN străin în celule, monitorizând apoi expresia proteică. Transfecţia ADN
este esenţială pentru studiul funcţiei şi reglării genice. Acest proces presupune utilizarea
unor vectori de expresie pentru proteinele ţintă (c-Jun, c-Fos), care introduşi în celula
gazdă vor permite inserarea secvenţelor ADN specifice în structura ADN gazdă şi să
exprime proteinele de interes.
• Au fost creaţi vectori plasmidiali ce conţin gene de cjun şi cfos pentru
supraexprimarea proteinelor corespunzătoare:
• S-a realizat un amestec din 3µl FuGene, 50 µl mediu de cultură fără suplimente şi
2µg ADN total al vectorilor de expresie c-jun/c-fos, care a fost preincubat 30
minute înaintea aplicării pe celule; în paralel a fost realizat şi un amestec similar
(control) dar cu vectori de transfecţie care nu conduc la expresia proteinelor
studiate
• Se extrage ARN total, se obţine ADN complementar prin revers transcriere iar
acesta din urmă este supus experimentelor de RT-PCR. Mediul de cultură este
supus experimentelor de western blot şi zimografie.

III. REZULTATE ŞI DISCUŢII

Experimentele au fost efectuate pe linii celulare de carcinom mamar, cu grade

diferite de malignitate MDA-MB-231<MDA-MB-435.

11
 A B

C D
Figura 2. Aspectul citomorfologic al liniilor celulare de carcinom mamar în cultură. Celule MDA-MB-
231 la densitate celulară mică, 24ore după însămânţare (A); Celule MDA-MB-231 la confluenţă, 48
ore după însămânţare (B); Celule MDA-MB-435 la densitate celulară mică, 6 ore după însămânţare
(C); Celule MDA-MB-435 la confluenţă, 24 ore dupa însămânţare (D).

Culturile celulare au fost menţinute la diferite stadii de confluenţă (Fig. 2), stadiul
de densitate celulară având un efect major asupra observaţiilor experimentale ulterioare
(stadiul subconfluent = 50-55% confluenta; confluent = 75-95%). În funcţie de densitatea
celulară, liniile celulare studiate au prezentat o citomorfologie diferită. Pe masură ce
potenţialul invaziv al celulelor creşte, celulele işi pierd parţial caracteristicile celulelor
epiteliale. Astfel, celulele MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 devin fuziforme, işi pierd inhibiţia
de contact formând la densităţi celulare mari “formaţiuni tumorale”. Aceste celule au rată
mare de proliferare.
Tratamentele cu curcumină asupra liniilor celulare tumorale mamare umane
determină efecte diferenţiate în funcţie de stadiul de densitate celulară. Imaginile
microscopice următoare arată modificările morfologice ale celulelor în cultură, care sunt

12
mult mai evidente în culturile rare şi în funcţie de prelungirea timpului de acţiune al
curcuminei, acestea devin progresiv observabile şi în culturile confluente (Fig. 3 şi 4).

Subconfluentă Confluentă

Figura 3. Micrografie în contrast de fază: linia celulară MDA-MB-231 în cultura subconfluentă (partea
stangă) şi confluentă (partea dreaptă) după tratament cu 25µM curcumină la 6 şi 24 de ore. Sunt
evidenţiate modificările morfologice induse de tratamentul cu curcumină dar şi fenomenul de
inhibare a proliferării celulare.

13
 Subconfluentă Confluentă

Figura 4. Micrografie în contrast de fază: linia celulara MDA-MB-435 în cultura subconfluentă (partea
stangă) şi confluentă (partea dreaptă după tratament cu 25µM curcumină la 6 şi 24 de ore. Nu sunt
observate modificări morfologice induse de tratamentul cu curcumină. Proliferarea celulară scade
foarte puţin, vizibil după 24 de ore.

Celulele MDA-MB-231 în stadiul de densitate mică încep să-şi modifice

caracteristicile morfologice la scurt timp după tratamentul cu curcumină. După şase ore

14
de tratament proliferarea celulară scade, încep să apară celule în suspensie, celulele
sunt mai mici şi subţiri cu membrana celulară neregulată. După 24 de ore, celulele sunt
rotunde, majoritatea aflandu-se în apoptoză. La densitate mare, celulele îşi schimbă
morfologia abia după 24 de ore de tratament, celulele au acelaşi profil morfologic ca cel
indus de curcumin asupra celulelor subconfluente, după 6 ore de tratament.
Celulele MDA-MB-435 suferă modificări morfologice foarte slabe, vizibile doar
după 24 de ore de tratament, mai pronunţate în culturile cu densitate mică. Proliferarea
celulară începe să scadă, iar celulele au tendinţă mai mică de a forma “formaţiuni
tumorale”.

Influenţa densităţii celulare asupra factorilor de transcripţie AP-1, NFkB

şi activităţii MMP

Se ştie că celulele carcinomului mamar, în general invadează ţesuturile învecinate,

în clustere mici celulare desprinse din masa tumorală principală iar densitatea celulară
joacă un rol important în mecanismele celulare.
Fenotipul invaziv al celulei tumorale ar putea depinde şi de micromediul tumorii şi
este de aşteptat ca celulele situate la distanţă de tumora primară să aibă o capacitate
invazivă mai mare faţă de celulele din masa tumorală principală. Diferenţele în potenţialul
metastazic pot fi asociate printre alţi factori cu interacţiile celulă-celulă. În consecinţă, una
din activităţile întreprinse este optimizarea densităţii celulare în vederea evaluării cât mai
corecte a studiilor ulterioare.
Publicaţii pe sisteme model de linii celulare de carcinom mamar arată că există o
asociere între producţia de MMP şi comportamentul biologic al celulelor. Aceleaşi surse
susţin că o creştere semnificativă în cantitatea de MMP sintetizate este corelată cu
creşterea invazivităţii şi a creşterii metastazice [Bachmeier si colab., 2001]. Mai multi
autori au descris că enzimele proteolitice sunt produse exclusiv de celule stromale
peritumorale mai degrabă decât de celule tumorale. Ei susţin că celulele tumorale
eliberează citokine şi factori de creştere care determină celulele stromale să sintetizeze şi
să elibereze enzime degradative. Într-o analiză extensivă recentă a carcinoamelor
mamare, studii de biologie moleculară (hibridizare in situ) au arătat că MMP-2, MMP-9 şi
MMP-3 sunt sintetizate atât de celule stromale cât şi de celule tumorale; oricum acestea

15
nu arată cu certitudine ce tip celular contribuie la proteoliza matricei sau cu ce intensitate.
Şi pentru alte tipuri tumorale (carcinom celular scuamos) au fost obţinute aceleaşi
observaţii [Nerlich si colab., 1998]. Aceste analize arată că producţia de MMP în celule
tumorale contribuie semnificativ la activitatea proteolitică.
Studiile de zimografie, pe cele trei linii celulare de carcinom mamar au arătat că
activităţile proteolitice ale gelatinazelor (MMP-2, MMP-9) s-au redus cu creşterea
densităţii celulare pentru linia celulară MDA-MB-231, MDA-MB-435 (Fig.5) şi că
activităţile proteolitice au fost considerabil mai mari în grupurile celulare tumorale mai
puţin dense comparativ cu celulele confluente.
Acestea ne-au condus la ipoteza că densitatea celulară ar putea influenţa reglarea
transcripţională a MMP şi prin testarea activităţilor funcţionale ale factorilor transcripţionali
AP-1, NFkB şi CRE am arătat dacă factorii transcripţionali implicaţi în reglarea MMP sunt
influenţaţi de gradul de densitate celulară.

1 2 3

Figura 5. Efectele densităţii celulare asupra activităţii proteolitice a gelatinazelor, prin zimografie.
Zimogramele indică reducerea activităţii enzimatice cu creşterea densităţii celulare, în cultura
subconfluentă (linia 1) comparativ cu cultura confluentă (linia 3), din mediu de cultură condiţionat al
celulelor MDA-MB-231 (A), MDA-MB-435 (B). Co-migrarea gelatinazelor în prezenţa markerilor de
masă moleculară (linia 2) ne-a permis determinarea MM ale gelatinazelor exprimate (săgeţi).

Asocierea dintre densitatea celulară şi expresia celulară a celor mai importante

MMP în carcinogeneză a fost descrisă până acum foarte puţin. Investigaţii in vivo pe
probe de ţesut tumoral, prin evaluare morfologică cantitativă şi semicantitativă, au arătat
că grupuri celulare tumorale crescute în formaţiuni mai puţin dense au nivele mai mari de
MMP. Xie şi colab. [1994] au arătat că celulele de carcinom epidermal uman secretă
MMP-9 ca răspuns la citokine şi factori de creştere numai când sunt crescute la
confluenţă. Menashi şi colab. [1998] au investigat asocierea MMP-2 cu suprafaţa celulelor

16
de carcinom mamar uman şi au demonstrat că situsurile de legare ale MMP-2 sunt
exprimate în celule însămânţate la densitate mică şi dispar progresiv pe măsură ce
celulele ating stadiul de confluenţă şi că acest proces este independent de nivelul de
expresie al MT1-MMP, TIMP-2 sau αv integrină. Analizele lor zimografice au arătat că
activităţile gelatinolitice mari ale MMP-2 sunt asociate cu culturile celulare de densităţi
mici şi că activităţile enzimatice sunt reduse gradat pe măsura creşterii densităţii celulare,
aceste activităţi enzimatice fiind foarte slabe sau chiar nedetectabile la confluenţă, însă
mecanismele acestor observaţii nu au fost investigate.
Factorul NF-κB (Nuclear Factor-KappaB) este o proteină heterodimerică compusă
din combinaţiile diferite ale membrilor familiei Rel de factori transcripţionali. Această
familie de factori transcripţionali este în principal implicată în stresul indus, răspunsurile
imune şi antiinflamatorii. Mai mult, aceste molecule au roluri importante în timpul
dezvoltării câtorva celule hematopoietice, keratinocitelor şi structurilor organelor limfoide.
Mai recent, membrii familiei NF-κB sunt implicaţi în progresia neoplazică şi formarea
sinapselor neuronale. Factorul NF-κB este de asemenea un reglator important în soarta
celulelor, ca apoptoza şi controlul proliferării şi este critic în procesul de tumorigeneză
[Schwabe şi Rhodes, 1991].
Inducţia transcripţională ca răspuns la PMA, citokine şi factori de creştere este
stimulată prin activitatea situsului AP-1 dar nu depinde în întregime de el, această
inducţie rezultă din cooperarea dintre seriile de elemente cis-acting localizate în
promotorii MMP. Expresia genică pentru MMP nu depinde numai de situsul AP-1. Astfel,
promotorul pentru MMP-9 este reglat de o secvenţă de 670 pb ce conţine o serie de
elemente cis activatoare, care includ situsuri AP-1, PEA3, Sp1 şi NFkB. Analizele după
deleţii sau mutaţii au arătat că situsul AP-1 localizat la -70pb nu este suficient pentru
stimularea de către PMA. Inducerea necesită cooperarea fie cu proteinele de legare
NFkB (-600 pb) fie cu Sp1 (-588 pb) situate upstream de situsul AP-1 (-79 pb).
Expresia MMP este diferită în funcţie de tipul celular dar şi de stările de
transformare ale celulei. Linii celulare embrionare de şoarece transformate metastazic
exprimă nivele mari de MMP-3 şi MMP-10 în timp ce linii celulare non-metastazice
exprimă nivele mici sau nedetectabile ale acestor enzime. Mai mult, reglarea pozitivă şi
negativă a genei MMP-1 de către TGFβ, în fibroblaste şi keratinocite a fost atrbuită

17
expresilor diferenţiate ale membrilor familiei Fos şi Jun. Inhibiţia MMP-1 în fibroblaste
este mediată prin JunB, în timp ce activarea acestei gene, în keratinocite de către TGFβ,
este determinată de nivele mari de c-Jun. Probabil raportul dintre cantitatea c-Jun şi Jun
B conteaza pentru reglarea genei MMP-1 de către TGFβ. Într-adevăr, supraexprimarea
proteinei c-Jun duce la cresterea expresiei MMP-1 în ambele tipuri celulare.
Proteinele Jun au abilitatea de a forma dimeri (Jun-Jun) stabili şi capabili de a
recunoaşte şi lega secvenţele consensus AP-1 de la nivelul moleculelor de ADN mediind
expresia genică. Proteinele Fos, pe de altă parte, nu pot forma homodimeri stabili. În
schimb, ele mediază expresia genică prin formarea heterodimerilor cu variate proteine
Jun. Aceştia sunt mult mai stabili decât dimerii Jun-Jun şi posedă o activitate mai mare de
legare la ADN. Astfel, compoziţia subunităţilor influenţează şi modulează afinitatea de
legare a proteinelor AP-1. De exemplu, în timp ce heterodimerizarea proteinelor c-Jun şi
c-Fos este mai stabilă şi transcripţional activă, formarea heterodimerului c-Jun-Jun B
descreşte activitatea de legare la ADN [Ryseck şi Bravo, 1991].
Am investigat legarea oligonucleotidelor specifice factorilor transcripţionali AP-1 şi
NFkB, prin metoda EMSA (electrophoretic mobility assay) de proteinele din extractele
nucleare pentru a evalua dacă efectul generat de densitatea celulară se corelează cu
creşterea legării acestor factori transcripţionali la secvenţa ADN consensus în regiunile
promotor ale diferitelor MMP.
10 µg extract proteic nuclear preparat din celulele subconfluente şi confluente, au
32
fost incubate cu P şi cu oligonucleotide dublu catenare specifice factorilor
transcripţionali AP-1, NFkB iar complexele ADN-proteine rezultate au fost supuse
electroforezei în gel de poliacrilamidă. Benzile radioactive de pe gelurile uscate au fost
vizualizate în sistem de detecţie radiografic.
În extractele nucleare din celulele subconfluente ale tuturor liniilor celulare testate,
a fost observată o creştere a legării proteinelor nucleare la fragmentele de ADN marcate
radioactiv (Fig. 6) pentru factorii transcripţionali AP-1(A) şi NFkB (B), comparativ cu
extractele nucleare din celulele confluente.

MDA-MB-231 MDA-MB-435 MDA-MB-231 MDA-MB-435

S C S C S C S C

18
 A-AP-1 B-NFkB

Figura 6. Legarea crescută a proteinelor nucleare din culturi celulare subconfluente la secvenţele
AP-1, NFkB la diferiţi promotori ai MMP. Experimentele EMSA realizate pentru culturi subconfluente
(S) şi confluente (C) de celule MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 folosind 10µg proteină nucleară
incubată cu oligonucleotide marcate cu 32P, au arătat un conţinut mai mare al proteinei AP-1 (A),
NFkB (B), în celule subconfluente (săgeata arată complexul ADN-proteină). Experimentele au fost
repetate de trei ori.

Aceste rezultate arată că nucleii celulelor canceroase mamare subconfluente

conţin nivele constitutive mai mari ale proteinelor active AP-1 şi NFkB .

Bachmeier şi colab. [2005] au arătat că fenomenul de reglare negativă a unui

număr de MMP în diferite linii celulare de carcinom mamar de către densitatea celulară
este însoţit de o scădere a expresiei proteinelor c-Jun şi c-Fos în celulele confluente.
Acest fapt sugerează că densitatea celulară afectează în general factorii de transcripţie la
diferiţi promotori ai MMP, rezultat demonstrat prin experimentele EMSA .

Rolul AP-1 în modularea expresiei MMP, TIMP şi a potenţialului invaziv al celulelor

tumorale prin supraexprimare şi silencing a componentelor c-Jun şi c-Fos

Ţinând cont de rezultatele anterioare obţinute privind influenţa densităţii celulare

asupra activităţii factorilor transcripţionali şi asupra activităţilor enzimatice ale
metaloproteinazelor, am încercat să arăt veridicitatea rezultatelor prin experimentele de
supraexprimare şi silencing ale factorului transcripţional AP-1, investigând totodată
reglarea posibilă a expresiei MMP şi a inhibitorilor TIMP dependentă de stadiul de
confluenţă. S-a pus problema dacă procesul de supraexprimare a proteinelor c-Jun şi c-
Fos este capabil să inducă expresiile acelor MMP care sunt exprimate în mod normal la
valori scăzute, în celule confluente.

19
 Complementar cu acest experiment, am realizat procedee de atenuare (silencing)
a expresiei proteinelelor c-Jun şi c-Fos folosind tehnici de transfecţie, cu scopul de a
analiza dacă acestea conduc la reducerea expresiei acelor MMP ce sunt exprimate la
nivele mari în celule subconfluente. Într-un mod similar am analizat şi expresia
inhibitorilor TIMP. De asemenea am investigat dacă expresia MMP modificată, obţinută
după procesul de supraexprimare a proteinelor complexului AP-1, prin transfecţie cu
construcţi plasmidiali sau după inhibiţia aceloraşi proteine ţintă, c-Jun şi c-Fos, prin
procedeul de silencing folosind molecule ARNsi, conduce la un potenţial invaziv diferit al
celulelor tumorale.

Supraexprimarea proteinelor c-Jun/c-Fos în cultura confluentă de celule

MDA-MB-231

Linia de celule MDA-MB-231 a fost transfectată cu plasmide ce contineau vectori

de transfecţie pentru genele c-jun/c-fos. După transfecţie, celulele încep să supraexprime
proteinele factorului transcripţional AP-1. Expresiile proteinelor c-Jun şi c-Fos au fost
cuantificate prin metoda RT-PCR.
În urma experimentelor de supraexpresie, ARNm pentru proteinele c-Jun şi c-Fos
a fost cuantificat rezultând o creştere drastică a expresiilor celor două proteine, de 1472
de ori pentru c-Jun şi respectiv 398 de ori pentru c-Fos (Fig. 7).
Supraexprimarea proteinelor complexului transcripţional AP-1 a condus la
supraexprimarea ARNm pentru MMP şi a inhibării ARNm specific inhibitorilor TIMP.
Reglarea negativă a inhibitorului TIMP-1 a fost observată numai în celulele transfectate
pentru proteina c-Jun, după 21 ore şi mai evident după 40 ore (0,44ori) în timp ce
expresia ARNm pentru inhibitorul TIMP-2 a fost redusă în celulele tranfectate pentru
proteina c-Fos dar nu şi în cele pentru proteina c-Jun (Fig. 8).
După transfecţie, pentru proteina c-Jun, s-a observat revenirea la nivelul iniţial a
expresiei inhibitorului TIMP-2, după 40 ore de la transfecţie, când nivelele transgenice
erau oricum mici (Fig. 8). Mai târziu, după transfecţie, celulele transfectate cu gena c-jun
au aratat o expresie indusă a inhibitorului TIMP-2 care a însoţit inducţia puternică a MMP-
9

20
Fig. 7. Supraexprimarea proteinelor c-Jun şi c-Fos ale factorului transcripţional AP-1 în cultura
confluentă de celule MDA-MB-231. Cuantificarea ARNm la diferite perioade de timp (21 şi 40 ore)
după transfecţie cu vectori de supraexprimare a proteinelor c-Jun şi c-Fos a arătat expresia
crescută a acestor proteine (de 1472 de ori şi respectiv 398 de ori).

Figura 8. Efectul supraexprimării proteinelor c-Jun şi c-Fos ale factorului transcripţional AP-1 în
cultura confluentă de celule MDA-MB-231, asupra expresiilor inhibitorilor TIMP-1 şi TIMP-2. Expresia
inhibitorului TIMP-1 este redusă în celulele transfectate cu gena c-fos, la 21ore, cu o revenire la
nivelul iniţial după 40 ore, celulele transfectate cu gena c-jun arată o inducţie a expresiei TIMP-1
după 40 ore. Expresia inhibitorului TIMP-2 arată nivele reduse în celulele transfectate pentru
supraexprimarea proteinei c-Jun. Toate valorile sunt normalizate la nivele de expresie în raport cu
celulele control transfectate (1=neschimbat; a se observa bara orizontală) şi indică gradul de
modificare faţă de control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de erori indică deviaţia
standard SD; *=p<0.05, ***= p<0.001.
Aceste rezultate indică efecte diferenţiate ale partenerilor dimerului AP-1 a căror
activitate ar putea fi bazată pe interacţii specifice cu parteneri de dimerizare exprimaţi
endogen.

21
 Experimentele RT-PCR pe celulele MDA-MB-231 au arătat o corelaţie clară între
supraexprimarea proteinei c-Jun şi expresia crescută a MMP-2 şi MMP-9, şi cu un mai
mic efect pentru MMP-3. Supraexprimarea proteinei c-Fos a condus semnificativ la
creşterea expresiilor MMP-1, MMP-3 şi MMP-13 (Fig. 9) dar nu şi cea a MMP-9.
Smith şi colab. [1999] au arătat că supraexprimarea proteinei c-Jun în celule
mamare MCF7 determină schimbări biologice şi biochimice ce mimează caracteristicile
clinice observate în cancerul mamar. Ei susţin că se produc alterări în compoziţia
complexului transcripţional AP-1 prin reducerea expresiei proteinei junB şi creşterea
expresiei proteinei fra-1, ce au ca rezultat creşterea agresivităţii biologice. Autorii arată că
celulele MCF7 ce supraexprimă proteina c-Jun nu mai raspund la efectele stimulatoare
de creştere ale estrogenului sau la efectele inhibitoare ale proliferării generate de
tamoxifen.

22
 B
Figura 9. Efectele supraexprimării proteinelor c-Jun şi c-Fos în cultura confluentă de celule MDA-
MB-231, asupra nivelelor de ARNm pentru MMP
A: Expresia MMP-2 şi a MMP-9 a fost puternic indusă după transfecţie.
B: MMP-1, MMP-3, MMP-13 au fost induse în celulele c-fos transfectate dar numai expresia MMP-3 a
fost indusă prin supraexprimarea proteinei c-Jun. Toate valorile sunt normalizate la nivele de
expresie în raport cu celulele control transfectate (1=neschimbat; a se observa bara orizontală) şi
indică gradul de modificare faţă de control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de
erori indică deviaţia standard SD; *=p<0.05, ***= p<0.001.

Procesul de atenuare (silencing) pentru proteina c-Jun în cultura subconfluentă de

celule MDA-MB-231
Prin procedeul de silencing pentru proteina c-Jun mi-am propus să afectez
expresia acelor MMP care sunt exprimate la nivele mari în cultura subconfluentă.
În celulele MDA-MB-231 subconfluente s-au introdus molecule ARN de interferenţă care
să induca o inhibare a expresiei proteinei ţintă. Cantitatea de ARN total, dupa transfecţie,
a fost revers transcrisă în ADN complementar şi supusă ulterior analizelor de RealTime
PCR pentru studiul expresiilor proteinelor c-Jun, MMP-3, MMP-9, MMP-13 şi a
inhibitorilor TIMP-1 şi TIMP-2.
Astfel, transfecţia celulelor tumorale cu oligonucleotide ARN dublu catenare,
specifice pentru silencing c-Jun, a determinat reducerea expresiei ARNm pentru proteina
c-Jun cu un vârf de activitate la 24 ore (Fig. 10). La acest interval de timp s-a înregistrat o
scădere maximă a expresiei proteinei c-Jun de aproape 90%. Din acest motiv, am
analizat expresia MMP la acest interval de timp.

23
Figura 10. Profilul expresiilor ARNm pentru proteina c-Jun după transfecţia (silencing) cu molecule
ARNsi şi ARN non-si în celule MDA-MB-231 subconfluente, la diferite perioade de timp.
Cuantificarea ARNm la intervale de timp diferite (6, 24 si 48 ore) după transfecţie cu oligonucleotide
ARNsi pentru silencing c-Jun comparativ cu controale non-silncing irelevante, a arătat o scădere a
expresiei proteinei c-Jun cu un efect maxim după 24 ore, de aproape 90%.

Figura 11. Efectul silencing al proteinei c-Jun în culturi subconfluente de celule MDA-MB-231 asupra
cunantificării ARNm pentru MMP-3, -9 şi -13. Expresiile proteinazelor MMP-3, MMP-9 şi MMP-13 au
fost reduse până aproape de 100% dupa 24ore.Toate valorile sunt normalizate cu nivele de expresie
pentru celulele control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de eroare indică deviaţia
standard SD; ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferroni’s post test)

24
 Expresiile ARNm au arătat o inhibiţie semnificativă (p<0.001), 90% pentru MMP-3
şi aproape 100% pentru MMP-9 şi MMP-13, la 24 ore după transfecţie comparativ cu
controalele irelevante non-silencing (Fig. 11).

Figura 12. Efectul silencing al proteinei c-Jun în culturi subconfluente de celule MDA-MB-231
asupra cuantificării ARNm pentru inhibitorii tisulari ai MMP, TIMP-1 şi -2. Nivelele inhibitorilor TIMP-
1 şi TIMP-2 au fost induse de aproape 3 ori după 24ore. Toate valorile sunt normalizate cu nivele de
expresie pentru celulele control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de eroare indică
deviaţia standard SD; ***=p<0.001 (one way Anova with Bonferroni’s post test)

Expresiile ARNm pentru inhibitorii TIMP-1 şi TIMP-2 au crescut semnificativ

(p<0.001) de 3 ori după 24 ore (Fig. 12) de la tranfecţia prin silencing a proteinei c-Jun.
Aceste observaţii complementare sunt în legătură cu rezultatele de la
experimentele de supraexprimare unde expresia MMP a fost indusă iar expresia
inhibitorilor TIMP represată. Datele susţin ipoteza de modulare a factorului transcripţional
AP-1 în vederea modificării statusului de exprimare a MMP în cancerul mamar

Efectele procesului de silencing anti-cJun asupra sintezei MMP, TIMP şi asupra

activităţii enzimatice

Am realizat analize de western blot a unor cantităţi egale de proteină din mediu de
cultură condiţionat, de pe celulele ce au suferit c-Jun silencing, pentru a fi siguri că
efectele observate după procesul de silencing pentru proteina c-Jun asupra expresiilor
ARNm pentru MMP şi TIMP sunt de asemenea verosemile la nivel proteic.

25
Figura 13. Efectul silencing al proteinei c-Jun în culturi subconfluente de celule MDA-MB-231 asupra
sintezei/ secreţiei MMP. Analizele de Western Blot au arătat reducerea cantităţilor de MMP-1
(stanga), MMP-3 (mijloc), MMP-9 (dreapta) în mediul de cultură condiţionat al celulelor MDA-MB-231,
transfectate cu oligonucleotide ARNsi pentru c-Jun (liniile 2) comparativ cu controalele non-
silencing (liniile 1).

Astfel, prin tehnica amintită am arătat că mediul de cultură de pe celulele MDA-

MB-231, transfectate cu ARNsi pentru proteina c-Jun, a conţinut numai aproximativ 50%
din cantitatea de MMP-1 secretată comparativ cu mediul de cultură al celulelor non-
silencing. Efectul silencing asupra sintezei MMP-3 a fost chiar de 90% şi asupra MMP-9
de aproximativ 30% iar sinteza inhibitorului TIMP-1 a fost indusă peste 50% (Fig.13).
Activităţile enzimatice ale MMP testate, MMP-2, MMP-9 şi MMP–1 din mediul de
cultură al celulelor MDA-MB-231, au fost de asemenea verificate prin tehnica zimografică,
după procedeul de silencing pentru proteina c-Jun, analiză care permite detecţia lor pe
geluri continând substrate de gelatină (pentru identificarea activităţilor specifice MMP-2,
-9) sau cazeină (MMP-1). Proteinazele MMP au fost identificate pe baza
comportamentului lor de migrare electroforetică în comparaţie cu preparaţiile MMP
control (Fig. 14). Aşa cum s-a observat şi pentru sinteza proteică, activitatea enzimatică a
MMP a fost inhibată datorită inhibiţiei expresiei proteinei c-Jun.

Figura 14. Analiza zimografică a efectului de procedeu silencing c-Jun, în culturi subconfluente de
celule MDA-MB-231, privind activităţile funcţionale ale gelatinazelor MMP. Zimograma pentru
gelatinaze, MMP-2 şi MMP-9 ca şi cazeinograma pentru MMP-1 au arătat o reducere a activităţilor
proteolitice prezente în mediul de cultură din MDA-MB-231 subconfluente după silecing (liniile 2)
comparativ cu controalele non-silencing (liniile 1). MMP au fost identificate în raport cu migrarea lor
efectroforetică faţă de markeri de masă moleculară (M, nearatati pentru MMP-2, -9) şi faţă de un
control MMP-1 (linia C).

26
 Aceste date arată că procesul de silencing pentru proteina c-Jun conduce la
descreşterea sintezei şi a secreţiei enzimatice (Fig. 13 şi 14, liniile 2) comparativ cu
mediile de cultură (control) de pe celulele transfectate cu secvenţa non-silencing c-Jun
(liniile 1).
Când comparăm expresia genică cu datele despre expresia proteică şi activitatea
enzimatică trebuie să avem în vedere că rezultatele RealTime-PCR reflectă nivele ale
unei stări stabile, constante, în timp ce prin analizele de western blot şi zimografie,
utilizând medii celulare de cultură, evaluăm nivelele proteice ca fiind accumulate după
mai multe perioade de timp şi trebuie luat în calcul efectul de acumulare. Aceast fapt este
important în particular pentru MMP-2 pentru care în general am detectat nivele de
expresie a ARNm absolut foarte mici dar se acumulează nivele considerabile de enzima
secretată.

Determinarea potenţialului invaziv al celulelor tumorale după

supraexprimarea şi atenuarea expresiei proteinelor factorului AP-1

După modularea activităţii funcţionale a celor doi membrii c-Jun şi c-Fos ai

factorului transcripţional AP-1, pentru a determina rolul lor în reglarea expresiilor MMP şi
TIMP, prin studii de supraexprimare în culturi confluente şi de inhibare în culturi
subconfluente, am examinat consecinţele funcţionale ale creşterii sau descreşterii
expresiilor MMP prin evaluarea potenţialului invaziv al celulelor transfectate.
Transfecţia cu vectori de expresie pentru proteina c-Jun a fost realizată pe celule
confluente cu o capacitate invazivă scazută iar celulele subconfluente puternic invasive
au suferit silencing. Aceste două categorii celulare au fost testate prin metode de
chemotaxie.
Supraexprimarea proteinei c-Jun a dus la o creştere semnificativă (p<0.001) a
invazivităţii celulelor MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 (de 2 ori fiecare) comparativ cu
controalele (Fig. 15). Supraexprimarea proteinei c-Jun în celulele MCF-7, celule cu o
capacitate minimă să invadeze prin membrana bazală artificială, a rezultat într-o şi mai
mare creştere a invazivităţii celulare (p<0.001).
Transfecţia aceloraşi tipuri celulare cu vectorul de expresie al proteinei c-Fos, de
asemenea a determinat o inducţie semnificativă a invazivităţii în celulele MDA-MB-231 şi

27
MDA-MB-435 dar cu o mai mică amploare comparativ cu efectele induse de proteina c-
Jun (Fig. 16).
Procesul de silencing al proteinei c-Jun în culturile subconfluente MDA-MB-231 a
fost suficient pentru a reduce capacitatea invazivă a acestor celule tumorale (p<0.001)
(Fig. 17). Silencing c-Jun a redus potenţialul invaziv al celulelor MDA-MB- 231 mai mult
de 60% faţă de celulele control transfectate. Aceasta sugerează ca modularea proteinei
c-Jun poate constitui o posibilă abordare în terapia de inhibiţie a potenţialului metastazant
al celulelor tumorale.

Figura 15: Influenţa supraexprimării proteinei c-Jun asupra potenţialului invaziv al celulelor de
carcinom mamar. Liniile celulare MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 au fost transfectate cu vector
de expresie c-Jun. Supraexpresia c-jun a condus la o creştere de aproximativ 2 ori a capacităţii
invazive a celulelor. Numărul celulelor invadatoare per câmp microscopic a fost normalizat, raportat
la valorile obţinute pentru celulele tansfectate cu vectori control. Experimentele au fost realizate în
triplicat; barele de erori indică deviaţia standard SD. ***=p<0.01 (one-way ANOVA with
Bonferronis’post-test).(C=control; T=transfectat). Invasion index = controlul este setat la valoarea 1
iar celelalte valori sunt generate din numarul de celule migratoare/ invadatoare per camp
microscopic raportate la control.

28
Figura 16: Influenţa supraexprimării proteinei c-Fos asupra potenţialului invaziv al celulelor de
carcinom mamar. Liniile celulare MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 au fost transfectate cu vector
de expresie c-Fos. Efectul de stimulare a potenţialului invaziv celular indus de proteina c-Fos a fost
mai slab comparativ cu c-Jun, dar semnificativ . Numărul celulelor invadatoare per camp
microscopic a fost normalizat, raportat cu valorile obţinute pentru celulele tansfectate cu vectori
control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de erori indică deviaţia standard SD.
*=p<0.05, ***=p<0.01 (one-way ANOVA with Bonferronis’post-test).

Figura 17: Influenta silencing c-Jun asupra potenţialul invaziv al celulelor de carcinom mamar MDA-
MB- 231. Linia celulară MDA-MB- 231 a fost transfectată cu ARNsi pentru proteina c-Jun. Silencing
c-Jun a redus potenţialul invaziv al celulelor MDA-MB- 231 mai mult de 60% (231 SI) faţă de celulele
control transfectate (non-silencing-231 NO), p<0.001(t-test). Numărul celulelor invadatoare per camp
microscopic a fost normalizat, raportat la valorile obţinute pentru celulele tansfectate cu vectori
control. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de erori indică deviaţia standard
SD.***=p<0.01 (one-way ANOVA with Bonferronis’post-test).

29
 Expresiile MMP şi a inhibitorilor TIMP sunt reglate în direcţii opuse prin activarea
transcripţională a genelor lor. Lein şi colab., [1999] au arătat că supraexprimarea
factorului transcripţional AP-1 este corelată cu descreşterea activităţii receptorilor
estrogenici facând ca tumorile mamare să fie mai agresive, invazive şi chemorezistente,
nerăspunzând la terapia hormonală.
În experimentele prezentate am arătat creşterea funcţiei de legare a factorilor
transcripţionali NFkB şi AP-1 în culturi rare de celule de carcinom mamar uman.
Supraexprimarea proteinelor c-Jun şi c-Fos în culturi dense induce transcripţia mai multor
MMP, în timp ce procesul de silencing c-Jun reduce transcipţia în culturi subconfluente.
Supraexprimarea şi silencing au efecte complementare în sensul că supraexprimarea
factorului AP-1 în celule confluente stimulează expresia MMP, activitatea proteolitică şi
invazivitatea dar şi reglează negativ expresia inhibitorilor TIMP iar procesul de silencing
pentru proteina c-Jun, în culturi rare reglează negativ MMP şi induce expresia inhibitorilor
TIMP comparativ cu celulele control.
Am arătat că densitatea celulară influentează potenţialul invaziv al celulelor
tumorale prin reglarea MMP şi TIMP de către factorii transcripţionali AP-1 şi NFkB .
Aceste rezultate pot contribui la explicarea mecanismului prin care celulele tumorale
capătă un potenţial invaziv.
Deoarece activităţile poteolitice ale MMP reglează compoziţia matricei
extracelulare, ele joacă un rol central în controlul semnalelor eliberate de moleculele
matriceale, reglând astfel proliferarea, diferenţierea şi moartea celulară. În acest context,
studiile ulterioare privind influenţa densităţii celulare şi a factorilor de transcripţie, asupra
MMP, au ajutat la înţelegerea complexităţii mecanismelor de reglare ale creşterii
potenţialului tumoral şi metastazic. Astfel, orice nivel al reglării expresiei MMP în celule
tumorale poate fi considerat ca o ţintă pentru intervenţia terapeutică.

Stabilirea potenţialului citotoxic al curcuminei prin MTT şi LDH

După tratarea celulelor cu curcumin 25µM diferite perioade de timp, am măsurat

eliberarea, din celule, în mediul de cultură, lactat dehidrogenazei LDH. Metoda bazată pe
activitatea LDH, este folosită pentru monitorizarea, in vitro, a citotoxicităţii substanţelor
testate în culturile celulare, prin măsurarea cineticii activităţii enzimatice, a enzimei

30
eliberate de celule în mediul de cultură. LDH este o enzimă citosolică stabilă care este
eliberată din celule în urma lizei celulare.
Am monitorizat citotoxicitatea indusă de curcumin timp de 24 de ore pentru două
stadii de densitate celulară, subconfluenţă şi confluenţă. Eliberarea lactat dehidrogenazei
a fost observată pentru ambele linii celulare după 24 de ore de tratament cu curcumină.
Pentru linia celulară MDA-MB-231, aşa cum preconizam datorită studiilor
anterioare, stadiul de densitate celulară a influenţat gradul de citotoxocitate indus de
curcumină (Fig. 18). Celulele cultivate la un stadiu de densitate mai mic sunt mai
sensibile la curcumin. Eliberarea LDH în mediul de cultură al celulelor subconfluente
creşte de patru ori, după 24 de ore de tratament, cu 25µM curcumin faţă de celulele
netrate, şi de numai două ori în mediul de cultură al celulelor confluente.
Pentru linia celulară MDA-MB-435, de asemenea, stadiul de densitate celulară a
influenţat gradul de citotoxocitate indus de curcumină (Fig. 19). Celulele cultivate la o
densitate celulară mai mică sunt mai sensibile la curcumină, eliberarea enzimei în mediul
de cultură fiind uşor mai pronunţată. Eliberarea LDH în mediul de cultură al celulelor
subconfluente creşte cu numai 1,5 ori, după 24 de ore de tratament cu 25µM curcumină
faţă de celulele netrate, iar în mediul de cultură al celulelor confluente, creşterea este
foarte mică, statistic nesemnificativă.

Figura 18: Profilul citotoxicităţii induse de tratamentul cu curcumină asupra liniei celulare MDA-MB-
231 în stadiul de subconfluenţă (231 sub) şi la confluenţă (231 con). Eliberarea LDH în mediul de
cultură al celulelor subconfluente creşte de patru ori, după 24 de ore de tratament, cu 25µM
curcumină faţă de celulele netrate, şi de numai două ori în mediul de cultură al celulelor confluente.

31
Figura 19: Profilul citotoxicităţii induse de tratamentul cu curcumină asupra liniei celulare MDA-MB-
435 în stadiul de subconfluenţă (435 sub) şi la confluenţă (435 con). Eliberarea LDH în mediul de
cultură al celulelor subconfluente creşte cu numai 1,5 ori, după 24 de ore de tratament cu 25µM
curcumină faţă de celulele netrate, iar în mediul de cultură al celulelor confluente, creşterea este
foarte mică nesemnificativă
Metoda MTT a arătat că în urma tratamentului cu curcumină, a fost inhibată
activitatea mitocondrială a celulelor MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 într-o manieră
dependentă de timpul de acţiune al curcuminului şi de stadiul de densitate celulară,
confluenţă şi subconfluenţă. Menţionez că aceste linii celulare nu manifestă inhibiţie de
contact.

Figura 20: Influenţa tratamentului cu 25µM curcumină asupra proliferării celulare pentru linia
celulară MDA-MB-231 în stadiul de subconfluenţă (231 sub) şi în stadiul de confluenţă (231 con).
Viabilitatea celulelor cu densitate mică scade după tratamentul cu curcumină în proporţie de
aproximativ 50% după numai două ore ajungând la 53% după 24 de ore de tratament, în timp ce
pentru celulele confluente viabilitatea scade cu o mai mică intensitate, cu 50% după 24 de ore de
tratament

32
Figura 21: Influenţa tratamentului cu 25µM curcumină asupra proliferării celulare pentru linia
celulară MDA-MB-435 în stadiul de subconfluenţă (435 sub) şi în stadiul de confluenţă (435 con).
Gradul de proliferare celulară scade odată cu prelungirea timpului de actiune al curcuminei. Profilul
viabilităţii celulare pentru celulele MDA-MB-435 este asemanator pentru cele două stadii de
densitate celulară cu un maxim de inhibitie după 24 de ore de aproximativ 25%

Curcumina a redus proliferarea celulară la 50% după 2 ore în celulele MDA-MB-

231 subconfluente. Tratamentul prelungit cu curcumin nu a condus la reducere
semnificativă faţă de cea înregistrată după 2 ore de tratament, 53% (Fig. 20).
Celulele confluente sunt mai puţin sensibile la tratamentul cu curcumină decât
celulele subconfluente. În acest caz proliferarea celulară a fost redusă de aproximativ
30% după 2 ore şi ulterior la aproape 50% după 24 de ore de tratament.
Răspunsul celulelor MDA-MB-435 este de asemenea rapid dar mult mai slab,
nesemnificativ statistic (p≥0.5), dar spre deosebire de linia MDA-MB-231 viabilitatea
scade mai mult odată cu prelungirea timpului de acţiune al curcuminei. Profilul viabilităţii
celulare pentru celulele MDA-MB-435 este asemănător pentru cele două stadii de
densitate celulară cu un maxim de inhibitie după 24 de ore de aproximativ 25% (Fig. 21).
Reducerea activităţii mitocondriale şi a proliferării celulare induse de tratamentul cu
curcumină, este mult mai pronunţată în celule subconfluente decât în cele confluente.

Acţiunea curcuminei asupra activităţii şi exprimării unor enzime MMP

Activităţile enzimatice prezente în mediile de cultură de pe celulele tratate şi

netratate cu curcumină 25µM, au fost detectate ca benzi translucide pe un fond albastru,
dat de coloraţia cu Comassie brilliant blue, a gelurilor de poliacrilamidă ce conţin

33
substratul enzimelor proteazice, gelatina pentru MMP-2 şi MMP-9 şi respectiv cazeina
pentru MMP-1.
Analizele zimogramelor celulelor de carcinom mamar MDA-MB-231 şi MDA-MB-
435 au arătat că atât activităţile gelatinolitice cât şi cele cazeinolitice au înregistrat o
reducere, din mediul de cultură, în urma tratamentului cu curcumină, comparativ cu
controlul. Celulele MDA-MB-231 au răspuns la tratamentul cu curcumină printr-o inhibiţie
tranzitorie a activităţii enzimatice a MMP-2 şi o supresie persistentă a activităţii MMP-1
(Fig. 22, 23), în timp ce activitatea gelatinazei B, MMP-9 a rămas neafectată de
tratament, posibil această enzimă ramânând stocată în compartimentul celular. Oricum
se observă că expresia constitutivă a MMP-9 în celulele MDA-MB-231 este mai scazută
decât cea a MMP-2. Acest lucru se explică, posibil prin faptul că MMP-9 este o enzimă
corelată cu creşterea gradului de malignitate iar această linie celulară MDA-MB-231 are
un grad mediu de metastazare.
Influenţa tratamentului cu curcumină asupra activităţii enzimatice a MMP-1, o
proteinază cu specificitate de substrat atât pentru gelatină dar mai mult pentru cazeină, a
fost pusă în evidenţă pe cazeinogramă. Se observă un efect pronunţat de inhibiţie a
activităţii enzimatice a MMP-1 determinat de curcumină. MMP-1 este enzima care iniţiază
prima un efect de proteoliză prin degradarea moleculelor de colagen native, iar prin acest
efect de inhibiţie observat, determinat de către curcumină, este posibil ca într-o anumită
etapă a procesului de migrare celulară pentru metastazare, MMP-1 să aibă un rol critic.
În mediul de cultură MDA-MB-435 expresia constitutivă a MMP-9 este mult mai
mare decât cea obsevată la linia celulară MDA-MB-231, acest fapt întărind ipoteza
amintită mai sus, că celulele cu potenţial invaziv mai mare secretă cantităţi mai mari de
MMP-9.
Activităţile enzimatice ale MMP-9 şi MMP-2 au descrescut în urma tratamentului
cu curcumin, dar cu o mai mare intensitate pentru MMP-9 faţă de MMP-2. Acţiunea
inhibitoare a curcuminei asupra activităţii MMP-9 este redresată după 15 ore de la
tratament, celulele MDA-MB-435 având un grad maxim de malignitate sunt astfel mult
mai rezistente la tratamentul cu curcumină (Fig. 24). În aceste celule activitatea
enzimatică a MMP-1 nu a putut fi detectată deloc (Fig. 25).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

34
 MMP-9

MMP-2

MMP-1

Figura 22: Gelatin zimografie din mediu de cultură al celulelor MDA-MB-231 Numere impare-celule
tratate cu curcumină/Numere pare-celule netratate (control).; 1,2: după 2ore; 3,4: după 3ore; 5,6:
după 4ore; 7: MMP-9-control; 8: MMP-2 –control; 9,10 după 5ore; 11,12: după 6 ore.

1 2 3 4 5 6 7 8 C 9 10 11 12 13 14 15 16

MMP-1
MMP-1

Figura 23: Cazein zimografie din mediu de cultură al celulelor MDA-MB-231 Numere impare- celule
tratate cu curcumină/ Numere pare- celule netratate (control). C- MMP-1control; 1,2: după 2 ore; 3,4:
după 3 ore; 5,6: după 4 ore; 7,8 după 5 ore; 9,10: după 6ore; 11,12: după 7 ore; 13,14: după 15 ore;
15,16: după 24 ore MMP-1

M C 1 2 3 4 5 6 7 8

MMP-1

Figura 24: Cazein zimografie din mediu de cultură al celulelor MDA-MB-435 Numere impare-celule
tratate cu curcumină/ Numere pare-celule netratate (control). C- MMP-1 control; 1,2: după 2 ore; 3,4:
după 6 ore; 5,6: după 15 ore; 7,8 după 24 ore

Interesant, efectul inhibitor al curcuminului asupra reducerii activităţii MMP în

mediul de cultură este dependent de tipul celular ca şi de tipul de protează. Aceste

35
rezultate susţin ideea că tratamentul in vitro cu curcumin ar putea fi eficient în stoparea
migrării celulare induse de către MMP, în cazul unor celule cu grad mediu de malignizare.
1 2 3 4 5 6 7 8

MMP-9

MMP-2

M 9 10 11 12 13 14

MMP-9

MMP-2

15 16 17 18 19 20 21 22

MMP-9

MMP-2

Figura 25: Gelatin zimografia din mediul de cultură al celulelor MDA-MB-435 Numere impare- celule
tratate cu curcumină/ Numere pare- celule netratate (control). 1,9,15 -MMP-9 control; 2,10,16- MMP-
2 control; M- markeri de masă moleculară 3,4: după 2 ore; 5,6: după 3 ore; 7,8: după 4 ore; 11,12
după 5 ore; 13,14: după 6 ore; 17,18: după 8 ore; 19,20: după 15 ore; 21,22: după 24 ore

Analize de western blotting pe medii celulare condiţionate (Fig. 26) arată o

puternică supresie a proteinelor MMP după tratamentul cu acest polifenol. A fost
monitorizată în prezenţa sau în absenţa unei concentraţii de 25µM curcumin acumularea
unor cantităţi noi de MMP eliberate în mediul de cultura fără ser.

36
 Celulele MDA-MB-231 eliberează extracelular MMP-1, -2 si -3, iar numai după trei
ore de incubare, cantitatea de proteină MMP-1 secretată în mediul celulelor a fost
complet suprimată în prezenţa curcuminei faţă de control (cantitatea de proteina MMP-1
secretată în mediul celulelor netratate)(Fig. 26A). Efectul asupra MMP-2 a fost similar,
deşi nivelul de expresie a fost mai scăzut şi a atins un maxim de detecţie după 15 ore
(Fig. 26B). Chiar şi după 24 de ore proteinele MMP-1 şi MMP-2 nu au fost detectabile în
mediul de cultură al celulelor tratate cu curcumină. MMP-3, atât forma inactivă cât şi
forma activă a fost detectată numai după 24 de ore de acumulare în mediul de cultură al
celulelor netratate. Ambele benzi corespunzatoare formelor MMP-3 au disparut în
celulele tratate cu curcumină (Fig. 26C). MMP-9, proteina majoră exprimată în mediul de
cultură al celulelor MDA-MB-435 a fost detectată cu cele două forme, inactivă şi activă,
după 3 ore în celulele control dar nu şi în celulele tratate cu curcumină (Fig. 26D).
Pentru a vedea dacă tratamentul cu curcumină va afecta şi la nivel citoplasmatic
expresia MMP, am analizat prin tehnica de western blot aceleaşi proteaze care se găsesc
stocate intracelular. Concentraţiile proteice din extractele celulare obţinute după
tratamentul cu curcumină asupra liniilor celulare MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 au fost
verificate prin efectuarea unui western blot şi pentru actină, o proteină intracelulară
constitutivă (Fig. 29). Benzile proteice obţinute pentru actină au acelaşi profil, ceea ce a
indicat că am folosit cantităţi egale de proteină pentru experimentele de westen bloting
din extracte celulare. MMP-2 nu a putut fi detectată în extractele celulare în ambele linii
celulare, posibil datorită secretării sale imediate după sinteză.
În acest sens am detectat proteazele MMP-9 (Fig. 27) şi MMP-1 (Fig. 28) din
extractele celulare. Pentru MMP-9, atât forma inactivă cât şi forma activă au fost
detectate în lizatele celulelor netratate şi tratate. Ambele benzi corespunzatoare formelor
MMP-9 au rămas nemodificate în urma tratamentului cu curcumină. Monitorizarea s-a
realizat după 4 ore până la 15 ore. Pentru MMP-1 a fost detectată numai forma activă dar
şi în acest caz tratamentul cu curcumina nu a acţionat asupra proteazei intracelulare. Nu
s-au constatat diferenţe intre celulele tratate cu curcumin şi cele netratate .

Analizele de imunoblot ale extractelor citosolice şi a mediilor de cultură ale

celulelor MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 au arătat că curcumina nu are efect asupra
enzimelor MMP stocate intracelular dar are un efect inhibitor asupra proteazelor
secretate.

37
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

MMP-1

A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16

MMP-2

B
12 13 15 16 3 4 5 6 7 8

MMP-3 MMP-9

C D
Figura 26: Analiza western blot din medii de cultură a celulelor MDA-MB 231 şi MDA-MB-435:
A: MMP-1, celule MDA-MB-231; B: MMP-2, celule MDA-MB-231; C: MMP-3, celule MDA-MB-231; D:
MMP-9, celule MDA-MB-435. Numere impare- celule tratate cu curcumină; Numere pare- celule
netratate (control); M- markeri de masă moleculară; 1,2: după 2 ore; 3,4: după 3 ore; 5,6: după 4 ore;
7,8 după 5 ore; 9,10: după 6 ore; 11,12: după 7 ore; 13,14 după15 ore; 15,16: după 24 ore

M C 1 2 3 4 5 6 3 4 5 6

MMP-9

A B
Figura 27: Analiza western blot pentru MMP-9 din extracte celulare; A: Celule MDA-MB 231; B:
Celule MDA-MB 435 Numere impare- celule tratate cu curcumină; Numere pare- celule netratate
(control); M- markeri de masă moleculară; C- MMP-9 control 1,2: după 4 ore; 3,4: după 6 ore; 5,6:
după 15 ore.

M 1 2 3 4 5 6
MMP-1

Figura 28: Analiza western blot pentru pentru MMP-1 din extracte celulare din MDA-MB-231; Numere
impare- celule tratate cu curcumină; Numere pare-celule netratate(control)1,2: după 4 ore; 3,4: după
6 ore; 5,6: după 15 ore.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

38
 A B
Figura 29. Analiza western blot pentru actina din extracte celulare. A: Celule MDA-MB 231 ; B: celule
MDA-MB 435. Numere impare-celule tratate cu curcumină Numere pare-celule netratate(control); 1,2:
după 4 ore; 3,4: după 6 ore; 5,6: după 15 ore

Influenţa curcuminei asupra expresiei ARNm pentru MMP

Deoarece tratamentul cu curcumină asupra liniilor celulare de carcinom mamar

uman a condus la inhibarea activităţii enzimatice a MMP, am investigat influenţa acestui
polifenol la nivel transcripţional. Am determinat expresia ARNm pentru mai multe MMP
prin PCR semicantitativ iar valorile expresiilor MMP au fost normalizate prin raportare la
control– expresia unei gene constitutive obţinută în paralel.
Analize anterioare au arătat că MMP-1, -2, -3 şi -9 sunt exprimate de către celulele
MDA-MB-231, ultima enzimă, MMP-9, fiind secretată numai în cantităţi foarte mici.
Proteina MMP-2 este secretată în cantităţi considerabile dar transcripţional au putut fi
detectate numai cantităţi mici, posibil datorită instabilităţii moleculelor de ARNm.
Tratamentul cu curcumină pe celule MDA-MB-231 a determinat o reducere
puternica a expresiilor ARNm pentru MMP-1 si MMP-2 la numai 2 ore dupa tratament
conducând după 24 de ore de tratament la o reducere a expresiei MMP-1 de 3,45 ori şi a
MMP-2 de 2,5 ori (Fig. 30). Din contră, expresiile ARNm pentru MMP-9 şi MMP-3 nu au
fost modificate considerabil de către tratament.
Celulele MDA-MB-435, în principal, exprimă MMP-9 şi MMP-3 şi în cantităţi mai
mici MMP-1. Expresiile MMP-9 şi MMP-1 sunt inhibate de tratamentul cu curcumin într-o
manieră dependentă de timp, în timp ce pentru MMP-3 nu am observat nici un efect
asupra expresiei sale determinată de tratamentul cu curcumin (Fig. 31).

39
Figura 30: Efectul curcuminei asupra expresiei MMP şi a proteinei c-Jun în culturi celulare
subconfluente MDA-MB-231. Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru MMP din celule tumorale
mamare MDA-MB-231 tratate cu 25μM Curcumină. Tratamentul cu curcumină a dus la o descreştere
semnificativă a expresiei MMP-1 şi MMP-2 în celulele MDA-MB-231. Experimentele au fost realizate
în triplicat; barele de erori indică deviaţia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way
Anova with Bonferroni’s post test).

Figura 31: Efectul curcuminei asupra expresiei MMP şi a proteinei c-Jun în culturi celulare
subconfluente MDA-MB-435.Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru MMP din celule tumorale
mamare MDA-MB-435 tratate cu 25μM Curcumină. Tratamentul cu curcumină a dus la o descreştere
semnificativă a expresiei MMP-1 şi MMP-9 în celulele MDA-MB-435), efectul începând după 2 ore de
tratament şi potenţându-se până la 20 de ore. Experimentele au fost realizate în triplicat; barele de
erori indică deviaţia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way Anova with
Bonferroni’s post test).

40
 Am măsurat, de asemenea, în celule control (netratate) şi în celule tratate cu
curcumin expresia ARNm pentru subunitatea c-Jun a factorului transcripţional AP-1, al
cărui situs de legare este prezent în regiunea promotor a mai multor MMP. Polifenolul
reduce puternic expresia c-Jun în ambele tipuri celulare, MDA-MB-231 şi MDA-MB-435
(Fig. 32).

Figura 32: Efectul curcuminei asupra expresiei proteinei c-Jun în culturi celulare subconfluente
MDA-MB-231 şi MDA-MB-435. Cuantificarea prin RT-PCR a ARNm pentru proteina c-Jun din celule
tumorale mamare tratate cu 25μM Curcumină. Expresia proteinei c-Jun a fost redusă în proporţie de
60% după 2 ore de tratament comparativ cu celule netratate. Experimentele au fost realizate în
triplicat; barele de erori indică deviaţia standard, SD; *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 (one way
Anova with Bonferroni’s post test).

Analizele Western blot au arătat că este o reglare post-transcripţională a

expresiilor MMP. Expresia ARNm pentru MMP-3 nu a fost afectată de curcumină în
celulele MDA-MB-231 dar expresia proteinei corespunzatoare, după translaţie a fost
afectată. Nivelele de MMP-1 şi MMP-2 par a fi mai puternic reglate la nivel proteic (Fig.
26) decât la nivel de ARNm (Fig. 30).

Efectul curcuminei asupra capacităţii invazive a celulelor tumorale mamare

Pentru a vedea dacă reducerea exocitozei MMP, datorată aplicării de curcumină

pe celule, a fost suficientă să modifice capacitatea invazivă/migratoare a celulelor
tumorale, am realizat metode de chemotaxie. Migrarea celulelor individuale poate fi
observată în camere Boyden, în care chemoatractantul este plasat în compartimentul
inferior al camerei. Filtrul este acoperit cu o membrană bazală artificială (colagen IV sau

41
Matrigel), migrarea/invazia celulară şi digestia proteolitică a matricei este necesară
celulelor tumorale să raspundă la stimul (chemoatractantul).
Tratamentul ambelor linii celulare MDA-MB 231 şi respectiv MDA-MB-435 cu 25µ
M curcumină pentru 16 ore a avut ca rezultat o semnificativă reducere (p<0.001) a
capacităţii de migrare (Fig. 32) şi o descreştere semnificativă (p<0.001) a capacităţii
invazive (Fig. 33) comparativ cu celule netratate. Atât capacitatea de migrare cât şi cea
invazivă au fost modificate de curcumină în ambele linii celulare, mai puternic în linia
MDA-MB-231.

Figura 32: Studii de migrare celulară. Mediu condiţionat de fibroblaste a fost folosit ca şi
chemoatractant şi colagen IV ca o matrice extracelulară echivalentă. Tratamentul celulelor MDA-MB-
231 şi MDA-MB-435 cu 25μM curcumină timp de 16 ore conduce la o reducere semnificativă a
capacităţii de migrare în ambele linii celulare, comparativ cu controlul.

Deoarece viabilitatea celulelor MDA-MB-231 tratate cu curcumină a scăzut la scurt

timp de la tratament, s-au realizat metodele de chemotaxie înainte ca celulele să devină
apoptotice. Astfel, am măsurat capacitatea migratoare şi invazivă a celulelor tratate
numai 6 ore cu curcumină. Din nou, o reducere semnificativă a fost observată (Fig. 34)

42
Figura 33: Studii de invazivitate celulară. Mediu condiţionat de fibroblaste a fost folosit ca şi
chemoatractant şi Matrigel ca o matrice extracelulară echivalentă. Tratamentul celulelor MDA-MB-
231 şi MDA-MB-435 cu 25μM curcumină timp de 16 ore conduce la o scădere semnificativă a
capacităţii invazive în ambele linii celulare, comparativ cu controlul. Inhibiţia a fost mai slabă pentru
celulele MDA-MB-435.

Figura 34: Studii de migrare şi invazie celulară prin chemotaxie. Mediu condiţionat de fibroblaste a
fost folosit ca şi chemoatractant şi colagen IV/Matrigel ca o matrice extracelulară echivalentă.
Tratamentul celulelor MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 cu 25μM curcumină timp de 6 ore conduce la o
scădere semnificativă a capacitaţilor migratoare şi invazive în ambele linii celulare, comparativ cu
controlul. Inhibiţia a fost mai slabă pentru celulele MDA-MB-435. Experimentele au fost realizate în
triplicat, barele de erori indică deviaţia standard. ***= p<0.001(one-way ANOVA with Bonferroni’s
post-test).

43
IV. Concluzii

Activităţile funcţionale ale factorilor de transcripţie AP-1 şi NFkB cresc odată cu

scăderea densităţii celulare ceea ce conduce la activităţi proteolitice MMP crescute.
Celulele de carcinom mamar exprimă nivele mai mari de MMP în culturi rare,
similar cu celulele de la periferia tumorii principale, faţă de celulele compacte, crescute la
confluenţă, similar cu celulele din centrul masei tumorale
Supraexprimarea şi inhibarea (silencing) proteinelor complexului AP-1 au efecte
complementare asupra expresiei MMP, inhibitorilor TIMP şi asupra potenţialului invaziv .
S-a observat că expresia crescută a proteinei c-Jun in vitro a avut ca rezultat i) creşterea
activităţii factorului transcripţional AP-1 cu modificarea expresiilor genelor cuplate cu
factorul AP-1; ii) creşterea expresiilor enzimelor MMP; iii)creşterea motilităţii şi invazivităţii
celulelor tumorale. Supraexprimarea proteinelor c-Jun şi c-Fos induce transcripţia mai
multor MMP iar procedeul de silencing pentru c-Jun reduce transcripţia MMP induce pe
cea a inhibitorilor TIMP în cultura subconfluentă. Această reglare are un clar efect asupra
comportamentului invaziv al celulelor evaluat in vitro prin metode de chemotaxie.
Transfecţia aceloraşi tipuri celulare cu vectorul de expresie al proteinei c-Fos, de
asemenea a determinat o inducţie semnificativă a invazivităţii în celulele MDA-MB-231 şi
MDA-MB-435 dar cu o mai mică amploare comparativ cu efectele induse de proteina c-
Jun. Supraexprimarea proteinei c-Jun a dus la o creştere semnificativă a invazivităţii
celulelor MDA-MB-231 şi MDA-MB-435 (de 50% fiecare) comparativ cu controalele.
Aceastea sugerează ca modularea proteinei c-Jun poate constitui o posibilă
abordare în terapia de inhibiţie a potenţialului metastazant al celulelor tumorale.
Reducerea activităţii mitocondriale şi a proliferării celulare, induse de curcumin,
este mult mai pronunţată în celule subconflunte decât în cele confluente.
Rezultatele analizelor asupra expresiilor MMP au arătat o influenţă semnificativă a
curcuminei la nivel de ARNm, proteic sau a activităţii enzimatice eliberate din celule
Efectul inhibitor al curcuminei asupra reducerii activităţii MMP secretate în mediul de
cultură este dependent de tipul celular şi de tipul de protează.
Tratamentul cu curcumină nu are efect asupra enzimelor MMP stocate intracelular
Activităţile enzimatice gelatinolitice cât şi cele cazeinolitice au scăzut în mediul de
cultură, în urma tratamentului cu curcumină, comparativ cu controlul, pentru ambele linii
celulare. Celulele MDA-MB-231 au răspuns printr-o inhibiţie tranzitorie a activităţii

44
enzimatice a MMP-2 şi o supresie persistentă a activităţii MMP-1, în timp ce activitatea
gelatinazei B, MMP-9 a rămas neafectată de tratament, posibil această enzimă ramânând
stocată în compartimentul celular. În celulele MDA-MB-435 activităţile enzimatice ale
MMP-9 şi MMP-2 au scăzut în urma tratamentului cu curcumină, dar cu o mai mare
intensitate pentru MMP-9 faţă de MMP-2. Acţiunea inhibitoare a curcuminei asupra
activităţii MMP-9 este redresată după 15 ore de la tratament.
Potenţialul migrator şi cel invaziv al celulelor tumorale mamare au fost inhibate de
către curcumină, mai puternic în linia celulară MDA-MB-231.

V. Bibliografie
Bachmeier, B.E., Nerlich, A., Lichtinghagen, R., Sommerhoff, C.P. Matrix metalloproteinases
(MMPs) in breast cancer cell lines of different tumorigenicity. Anticancer Res. 21:3821-3828, 2001.
Bachmeier, B. E., Albini, A., Vene, R., Benelli, R., Noonan, D., Weigert, C., Weiler, C.,
Lichtinghagen, R., Jochum, M., Nerlich, A. G. Cell density-dependent regulation of matrix metalloproteinase
and TIMP expression in differently tumorigenic breast cancer cell lines. Exp.Cell Res., 305: 83-98, 2005.
Hanif, R., Qiao, L., Shiff, S. J., Rigas, B., Curcumin, a natural plant phenolic food additive, inhibits
cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-
independent pathway, J. Lab. Clin. Med., 130: 576-584, 1997.
Huang, M.T., Lysz, T, Ferraro, T., Abidi, T.F., Laskin, J.D., Conney, A.H. Inhibitory effects of
curcumin in in vitro lipoxygenase and cyclooxygenase activities in mouse epidermis. Cancer Res. 51: 813-
9, 1991
Jordan, W.C. şi Drew, C.R. Curcumin-a natural herb with anti-HIV activity. J.Natl.Med. Assoc.
88:333, 1996.
Lein, M., Nowak, L., Jung, K., Laube, C., Ulbricht, N., Schnorr, D., Loeening, S.A.
Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases in Plasma of Patients with Prostate
Cancer and in Prostate Cancer Tissue Ann. N Y Acad. Sci. 878: 544 – 546, 1999.
Lim, G.P., Chu, T., Yang, F., Beech, W., Frautscky, S.A., Cole, G.M. The curry spice curcumin
reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J.Neurosci. 21:8370-
7, 2001.
Menashi, S., Dehem, M., Souliac, I., Legrand, Y., Fridman, R. Density-dependent regulation of cell-
surface association of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in breast-carcinoma cells. Int.J.Cancer 75:259-
65, 1998.
Nerlich, A., Lebeau, A., Hagedorn, H.G., Sauer, U., Schleicher, E.D. Morphological aspects of
altered basement membrane metabolism in invasive carcinomas of the breast and the larynx. Anticancer
Res. 18:3515-3520, 1998.
Oetari, S., Sudibyo, M., Commandeur, J. N., Samhoedi, R., Vermeulen, N. P., Effects of curcumin
on cytochrome P450 and glutathione S-transferase activities in rat liver, Biochem. Pharmacol., 51: 39-45,
1996.
Ramachandran, C., You, W., Differential sensitivity of human mammary epithelial and breast
carcinoma cell lines to curcumin, Breast Cancer Res. Treat., 54: 269-278, 1999.
Ruby, A. J., Kuttan, G., Babu, K. D., Rajasekharan, K. N., Kuttan, R., Antitumor and antioxidant
activity of natural curcuminoids, Cancer Lett., 94: 79-83, 1995.
Ryseck, R.P. şi Bravo R. c-JUN, JUN B, and JUN D differ in their binding affinities to AP-1 and
CRE consensus sequences: effect of FOS proteinsOncogene 6, 533-542, 1991.
Schwabe, J.W. şi Rhodes, D. Beyond zinc fingers: steroid hormone receptors have a novel
structural motif for DNA recognition. Trends Biochem. Sci. 16: 291-296, 1991.
Singh, S. şi Aggarwal, B. B. Activation of transcription factor NF-κB is supressed by curcumin
(diferuloylmethane) [published erratum appears in J. Biol. Chem. 270: 30235, 1995]. J. Biol. Chem., 270:
24995-25000, 1995.

45
 Smith, L.M., Wise, S.C., Hendricks, D.T., Sabichi, A.L., Bos, T., Reddy, P. et al. c-Jun
overexpression in MCF7 breast cancer cells produces a tumorigenic, invasive and hormone resistant
phenotype. Oncogene 18: 6063-70, 1999.
Venkatesan, N. şi Chandrakasaan, G. Modulation of cyclophosphamide-induced early lung injury
by curcumin, an anti-inflamatory antioxidant. Mol.Cell. Biochem. 142: 79-87, 1995.
Xie, B., Bucana, C.D., Fidler, I.J. Density-dependent induction of 92-kd-type-IV-collagenase activity
in cultures of A431 human epidermoid carcinoma cells. Amer.J.Pathol. 144:1058-1067, 1994.

46