Cultivarea micobacteriilor

Daniela Homorodean
Întrebări la începutul sesiunii de curs:
Care din următoarele afirmații privind cultivarea micobacteriilor nu
este adevărată?
1. Cultivarea este necesara deoarece creste cu 20% cazurile confirmate, in plus
fata de microscopie
2. Are avantajul evidentierii viabilitatii bacteriilor
3. Metodele de decontaminare cu NaOH /HCl si NALC/OH sunt recomandate
pentru folosire in tara noastra.
4. Cultura in mediul solid are rezultat exprimat calitativ
5. Probele de sputa necesita prelucrare prealabila in vederea cultivarii
 Plan de prezentare
• Istoric
• Necesitatea cultivarii

• Avantajele si limitele metodelor de cultivare

• Metode de decontaminare

• Sisteme automate de cultivare

• Citirea, interpreterea rezultatelor- mediul solid

• Erori- fals pozitiv, fals negativ
 ISTORIC- cultura in mediul solid

1900s: Cultivarea pe cobai

1932: Lowenstein Jensen- mediul solid pe baza de ou

1947: Dubos Middlebrook- mediul agar solid

CULTIVAREA IN MEDIUL LICHID - istoric

1946: Dubos Davis- mediu lichid

1977: Middlebrook si col: sistem radiometric (BACTEC 460)

- sistem colorimetric (Bact-Alert/MB-BacT)
- sistem fluorimetric (Bactec MGIT 960)
- sistem bazat pe gazometrie (VersaTrek)
 Necesitatea cultivarii micobacteriilor

 in scop diagnostic se aplica pacientilor ST, pentru bolnavii infectati cu

HIV/SIDA, copii, prelevate extrapulmonare
 pentru monitorizare
 pentru identificarea Complexului M.tuberculosis
 pentru testarea sensibilitatii micobacteriilor la subst anti-TB (ABG)
 pentru retratamente, cronici, esecuri terapeutice-pentru decelare M/XDR.
 Avantaje - CULTURA IN MEDIUL LJ
• 10-100 BAAR/inocul - Sensibilitate mai mare decat microscopia
• Distinge bacilii viabili
• Cantitativa: numar de colonii
• Necesara pentru monitorizarea tratamentului la pacientii MDR-TB.
• Ofera diagnosticul definitiv de Tb
• Creste numarul cazurilor confirmate cu 20%, in plus fata de M
• Permite detectarea cazurilor inainte ca ele sa devina infectioase
• Ofera izolate pentru teste de sensibilitate, inclusiv teste genetice.
 Limitari - CULTURA IN MEDIUL LJ

 Mai complexa si mai scumpa decat microscopia

 Necesita facilitati pentru procesarea probelor, incubare, echipament
 Personal indemanatic, instruit, antrenat
 Specimenele trebuie sa fie prelucrate- decontaminate
 Nu este 100% sensibila.
 Necesita conditii de biosiguranta cel putin de nivel 2
 Rezultatele se obtin cu intarziere (crestere lenta!):21-60z
Avantaje- CULTIVAREA IN MEDIUL LICHID

• 10-100 BAAR/inocul
• Rezultatele mai rapid decat in mediul solid (17 zile- media)
• Sensibilitate inalta
• Informatii despre viabilitate
• Ofera bacterii pentru identificare si ABG, teste genetice
• Confirma cazurile BAAR negativ
• ABG in mediul lichid
 Limitari - CULTURA IN MEDIUL LICHID
 Complexa
 Costisitoare
 Necesita personal instruit, antrenat
 Nu ofera informatii asupra numarului de colonii
 Contaminare mai mare decat in mediul solid
 Necesita echipament / service / intretinere
 Necesita conditii de biosiguranta de nivel 3
 Este mai scumpa decat cultura in mediul solid
 OMOGENIZARE-DECONTAMINARE

Metoda
 Centrifugare- Forta Relativa de Centrifugare: 3000xg-20 min
 Cu picatura

Substante folosite pentru decontaminare

 NALC-OH
 NaOH-HCl/ NaOH-KH2PO4 (Petroff)
 Decontaminarea -remarci

• Scop eliberarea bacililor din mucusul şi detritusurile celulare care

îi înconjoară si omorarea microbilor de asociere

• Substantele folosite trebuie sa afecteze viabilitatea bacteriilor

contaminante dar nu trebuie să afectateze si MTB mai mult decât
este necesar nici prin omogenizare, nici prin decontaminare sau
centrifugare

• La omogenizare şi decontaminare trebuie să avem în vedere

rezistenţa MT la soluţii de baze şi acizi; durata expunerii la aceste
substanţe; temperatura din timpul centrifugării; eficienţa centrifugii
pentru sedimentarea bacililor.
 Decontaminarea –remarci- 2

• Nici una dintre metodele de decontaminare folosite nu reuşeşte să

conserve micobacteriile în totalitate, chiar în condiţiile unei tehnici
de lucru impecabile

• Trebuie să stabilim echilibru între pierderea unei părţi a MTB şi rata

acceptabilă de contaminare a culturilor.

• Alegerea tehnicii pentru decontaminare trebuie să ţină seama de

dotarea tehnică a laboratorului şi de calificarea personalului.

• Vor fi folosite doar metode verificate şi validate.

 Pregătirea spațiului de lucru

1. executantul să poarte EPP (halat cu mâneci lungi,

închis la spate, mănuși, mască FFP2 cu supapă,
capelină)
2. pregătește suprafața de lucru din CPM prin ștergere
cu alcool 70%, și asteaptă cel puțin 3 minute, după
care șterge cu șervet de hârtie
3. așează pe aria de lucru din interiorul CPM hârtie
fără acoperirea orificiilor pentru recircularea aerului
 Pregătirea spațiului de lucru - 2

4. pune în CPM strict materiale necesare, fără aglomerare

5. pornește CPM și așteaptă 3- 5 min stabilizarea fluxului de aer

Nu ține mai multe tuburi deschise la un moment dat pentru a evita

contaminarea încrucișată între probe

Tine înclinate tuburile deschise, la cel puțin 15 cm de fanta frontală.

 Însămânţarea tuburilor cu
mediu de cultură

Lucrează în hotă de protecţie microbiologică clasa 2, cu echipament de

protecţie suplimentară. Tubul se ţine inclinat şi nu există mai multe tuburi
deschise deodată pentru evitarea contaminării încrucişate.
Zona de lucru- la aproximativ 15-20 cm de deschiderea frontală.
 Metoda de decontaminare cu NaOH (Petroff)

Principiu
• NaOH în soluţie 4% (concentraţie finală 2%) are atât efect mucolitic cât
şi bactericid asupra majorităţii microbilor.

• Înainte de însămânţare este necesară neutralizarea NaOH cu soluţie de

HCl 8% sau fosfat monopotasic 15% în prezenţa unui indicator de pH.
• Avantaj: Metoda este accesibilă din punct de vedere tehnic, reactivii
sunt ieftini şi stabili câteva luni.

• Dezavantaje: timpul de contact cu NaOH trebuie să fie strict respectat;

este agresivă, distruge până la 60% din bacilii tuberculozei, la care
se adaugă bacilii omorâţi în timpul centrifugării (efectul încălzirii şi
eficienţa centrifugii).

• Timpul necesar prelucrării unei probe este de aprox. 60 min, iar

prelucrarea a 20 probe durează aprox 120 min, capacitatea centrifugii
fiind elementul limitativ.
 Procedura de lucru - 1
1. pune în CPM probele de prelucrat ordinea numerelor

2. pune în CPM stativul cu tuburi de centrifugă marcate cu nr probelor de

prelucrat
3. transferă cu pipetă Pasteur sterilă, de unică folosință, cu pară integrată o
cantitate cât mai mare din proba de prelucrat (ideal 10 ml, minim 2 ml) în
tubul de centrifugă

Pentru fiecare probă folosește câte o pipetă.

Nu atinge cu pipeta gura tubului pentru centrifugă- risc contam incrucisata
 Procedura de lucru -2
4. repartizează în fiecare tub o cantitate egală cu a produsului, din sol NaOH 4%
fără să atingi cu dispenserul gura sau peretele interior al tubului.
5. închide tuburile și agită manual energic sau cu vortex la 2500 rpm. 15-30 sec.,
pentru lichefiere. Inversează de câteva ori tubul pentru ca soluția să vină în
contact și cu produsul de pe pereții tubului. Reașează tuburile în stativ
6. fixează ceasul la 15 min de la adăugarea sol NaOH la prima probă
7. după 10 min verifică dacă probele sunt complet lichefiate. Dacă este necesar,
mai agită manual sau la vortex inca 15-30 secunde.

Timpul total de contact produs/decontaminant să nu depășească 20 minute

 Procedura de lucru - 3
8. Dupa 15 min neutralizează cu sol HCl 8% sau sol Na2KPO4, în
prezența de indicator de pH (albastru de bromtimol),
9. completează cu TFS sau AD până la capacitatea tubului, pune tuburile
în centrifuga cu răcire setată la temperatura cuprinsă între 4-120 C, la
FRC 3000xg și durata de 20 minute
10. la terminarea centrifugării scoate tuburile din centrifugă, decantează
complet supernatantul (în recipient cu pâlnie, care conține substanță
tuberculicidă) apoi adaugă maxim 2,5 ml TFS pH 6,8 sau AD în care
resuspenzi sedimentul prin agitare ușoară și prin pipetare fără barbotare.
Lucrează steril, cu pipetă nouă pentru fiecare probă.
11. însămânțează mai întâi in 2 tuburi cu mediul LJ și un tub cu mediul
lichid, apoi, cu aceeași pipetă, efectuează frotiul
 Decontaminare/omogenizare cu NALC-NaOH

Principiu
N-acetil-L-cisteina (NALC) este agent mucolitic utilizat pentru digestia rapidă
si permite ca agentul decontaminant (NaOH) să aibă o concentrație finală
de 1%.
Tamponul fosfat neutralizează NaOH și diluează omogenatul pentru a
reduce vâscozitatea anterior centrifugării.
Avantaj: sunt omorâte doar circa 30% din micobacteriile din proba clinică.

Dezavantaje:

NALC își pierde repede activitatea, soluția de lucru trebuie preparată zilnic.
Ionii metalelor grele prezenți în spută afectează efectul mucolitic al NALC
şi pentru legarea lor este necesar adaosul de soluţie de citrat de sodiu.

Agitarea energică cu aerarea soluţiei scade activitatea mucolitică a NALC.

Centrifugarea probei se face la FRC de 3000xg, 20 minute, la 4-120 C.

Timpul necesar procesării unei probe este de aproximativ 40 minute, iar
procesarea a 20 de probe durează aproximativ 60 minute, elementul
limitativ fiind capacitatea centrifugii.
 Remarci pentru metoda NALC-NaOH

• poate fi folosită doar dacă laboratorul este dotat cu centrifugă

conformă, personalul a fost instruit

• metoda a fost verificată şi validată în laborator, acest lucru

trebuind să fie documentat.

• etapa de centrifugare este obligatorie dacă se foloseşte această

metodă pentru decontaminare.

• este recomandată pentru folosire în cazul cultivării in mediul

Middlebrook 7H9.
 Însămânţarea
• Probe prelucrate/ decontaminate cu NaOH 4%
• Însămânțează câte 4 picături (0,2 ml) în câte 2 tuburi cu mediul LJ și
0,5 ml într-un tub cu mediul lichid, (sau 3 tuburi cu mediul LJ) apoi, cu
aceeași pipetă efectuează frotiul, în cazul metodei cu centrifugare.

• Dacă nu s-a folosit centrifugarea, ci metoda „cu picătura”,

însămânţează din omogenatul rezultat câte 4 picături (0,2 ml) în câte 2
tuburi cu mediul LJ și 0,5 ml într-un tub cu mediul lichid (sau 3 tuburi cu
mediul LJ).

Sistem de cultivare automat: în funcţie de recomandarea producătorului

se insamanteaza 0,5 pana la max 1 ml proba prelucrata.
 Însămânţarea

• CIC-elimina tuburile cu contaminare, sparte

• Numeroteaza tuburile cu numarul probei / cod bare generat de sist intranet

• Nu masca prin numerotare zona de crestere /examinare a culturii

 Incubarea - Mediul LJ
• Inundă suprafaţa mediului cu inoculul şi aşează tuburile înclinat, cu
suprafaţa mediului în sus, într-un suport special pentru incubare în
primele 48-72 ore, cu capacul parţial deşurubat (o spiră).
• După 48-72 ore exam. tuburile, elimină cele cu contaminare (scrie în
caietul de lucru) şi incubează celelalte tuburi în poziţie verticală până
la pozitivare sau până la maxim 60 de zile de la însămânţare. Se
închid complet capacele.
 Incubarea
Mediul lichid Middlebrook 7H9 în sistem automat

• Respectă instrucţiunile producătorului

 Citirea

Mediul LJ
• Manual, la 21, 30, 45, 60 zile.
• Dacă volumul de lucru permite, se poate citi săptămânal.

Mediul lichid
• Automat, indiferent de sistemul de cultivare, cu raport pozitiv (la 1-42 zile)
sau negativ (la 42 zile).
 Interpretarea rezultatelor
• Apreciază morfologia macroscopică a coloniilor (descrie în caietul de
lucru pentru citirea culturilor)
• Prepară frotiu colorat ZN pentru a evidenţia prezenţa BAAR

• Efectuează obligatoriu test imunocromatografic rapid AgMPT64

pentru confirmarea apartenenţei la complexul M. tuberculosis
 Raportarea rezultatelor
• Rezultatele culturilor pe mediul LJ se exprimă semicantitativ iar cele ale
culturilor în mediul lichid, calitativ: pozitiv / negativ.

• Raportarea se face pe buletinele de solictare tip PNPSCT, imediat dupa

onstatarea cresterii si identificarea MTB/ alte micobacterii/ contaminat

• Trebuie marcată metoda folosită.

 Exprimarea semicantitativă a rezultatelor
culturii pe mediul solid
CRESTEREA MTB* NOTAREA REZULTATULUI
Creștere bacteriană absentă Cultura MTB NEGATIV
Sub 30 colonii POZITIV MTBC - număr exact de
colonii
30-100 colonii POZITIV MTBC 1+
Peste 100 colonii izolate POZITIV MTBC 2+
Colonii confluente POZITIV 3+
nenumarabile
Creșterea altor microbi decât Cultură contaminată
micobacterii