Dr.

BANU OTILIA
Formator acreditat MSP
Metode de diagnostic :
 Diagnosticul microbiologic (direct)
 Diagnostic imunologic (indirect)
 Diagnosticul infectiilor si identificarea
agentilor patogeni cu ajutorul tehnicilor
moleculare.
I. Etapele Diagnosticului microbiologic (direct)

 Prelevarea si transportul produselor patologice;

 Examenul direct al produselor : macroscopic si microscopic (preparat
L/l);
 Izolarea in cultura pura a agentului patogen prin insamântare pe un
mediu de cultura adecvat
 Identificarea agentului patogen
 Caractere de cultura si de colonie
 Ex. microscopic permite determinarea tipului morfologic si afinitatilor
tinctoriale (coloratie Gram; Ziehl Neelsen, s.a.)
 Caractere biochimice (metabolice);
 Caractere de patogenitate si virulenta:
 Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice al tulpinii
bacteriene izolate, prin metoda antibiogramei
 Serotipizarea agentului patogen prin reactii serologice
 COCI GRAM + Bacili GRAM-

TESTUL CATALAZEI TESTUL OXIDAZEI

Catalazo + Catalazo- Oxidazo+ Oxidazo-

Fam.Enterobacteriaceae
Insamantare
Fam. Micrococcaceae Fam. Streptococcaceae Fam. Pseudomonadaceae
Genul Staphylococcus aspectul hemolizei Insamantare Familia Vibrionaceae Mac Conkey
Insamantare EMB
Cled
Chapman β hemoliza α hemoliza Cetrimid aglutinare ser polivalent TSI
Baird Parker API 20NE anti Vibrio cholerae O1 MIU
Grup A MILF
Streptococcus pyogenes Grup B CIT
Testul PYR,Bacitracina Streptococcus agalactiae Identificare biochimica API 20 E
Testul CAMP, HIP (Glc, Lac, Zah, Mn, Mz, In,
Ad, Ar, ODC, LDC, ADH)
Grup C,G,F
Streptococcus equi
Strep. gr. Milleri (sp. anginosus, sp. constellatus)

Streptococcus pneumoniae Testul la OPTOCHIN

Strep. Grup D- Enterococcus fecalis

Enterococcus fecium
API STREP
Biotipizarea este accesibila majoritatii laboratoarelor si utilizata
deoarece proprietatile biochimice ale bacteriilor sunt date de
determinanti genetici cromozomali, fiind mai stabile decât cele
conferite de determinanti genetici plasmidiali. Testele biochimice au
inregistrat o evolutie in timp.

 Teste individuale

 Sisteme de identificare biochimica multitest - medii speciale in

volume mici (repartizare in tuburi), care permit efectuarea si
interpretarea mai multor teste biochimice in acelasi tub: TSI, MILF
,MIU.

 Sisteme microtest - microvolume de mediu care asociaza un numar

mare de teste in aceeasi placa/tub care sunt destinate realizarii unei
identifcari precise. Ex.: API 20E, API Staph; API NH; API Candida;
Enterotube II, Micro-ID, MicroScan.
Secretiile mucoasei cailor respiratorii superioare
Eexudatul nazal - Ziua 1

 Recoltare pe tampon steril

 Nu se recomanda Frotiu

 Insamantare:
Mediu cu sange
Medii cromogene
 Metode moleculare
 Semnificatie clinica: portajul de S. aureus

Testul coagulazei
Latex aglutinare
Repicare colonii izolate
– cultura pura

 Screening MRSA

Metoda Disc difuzimetrica cu Fox (30µg)si Ox (1µg)

 Secretiile mucoasei cailor respiratorii superioare
 Eexudatul faringian - Ziua 1
 Recoltare dimineata pe namancate si inaintea periajului dentar su la 2
ore dupa ingerarea de alimente, cu tampon steril de la nivelul
rinofaringelui zona amigdalelor

 Insamantare in poligon deschis

pe: medii cu sange si chocolate
Frotiu in cazul suspiciunii de angina fuso-spirilara
Frotiu Gram din cultura (x100) - Corynebacterium diphteriae
 Examinarea cresterii pe mediu cu sange (aspect mono sau polimorf,
prezenta hemolizei. Repicare numai colonii hemolitice- (,  hemoliza) in
cazul microbiotei polimorfe / orice tip de colonie (in cazul microbiotei
monomorfe):
- Mediu cu sange
- mediu Chocolate
- Cetrimide Agar (CTA)

Cultura bacteriana din tampon faringian:stanga- microbiota

comensala cu Streptococi viridans;
dreapta -microbiota comensala si Streptococi beta hemolitici

 Frotiu din colonii hemolitice (coloratia Gram x 100).

Coci Gram pozitivi in lanturi
1. Identificare bacteriologica
Testul catalazei/bacitracina din colonii
repicate pe mediu cu sange

2. Identificare biochimica- Sisteme microtest –

(API STREP; sistemele MicroID 32:
ID 32 Strep, API CORYNE; API NH, etc.)

3. Identificare antigenelor bacteriene (serologica) - latex aglutinare;

factori de virulenta (prin testul coagulazei libere, coagulazei legate,
termonucleazei)

4. Testrea sensibilitatii
la antibiotice (metoda
disc difizimetrica)
 Secretii traheo-bronsice si sputa
Recoltare:
- direct in recipient pentru sputa
- prin aspiratie pe sonda de IOT evitandu-se
contaminarea faringiana
- spalatura bronsica recoltata prin lumenul
bronhoscopului
 Examen macroscopic
Produsul patologic primit la laborator este atent examinat
macroscopic, aspectul acestuia fiind particular în anumite
afecţiuni:

• spută mucoasă, aerată - în bronşite acute şi astm

bronşic;
• spută mucopurulentă - în traheobronşite cronice,
bronhopneumonii;
• spută purulentă - în abcese pulmonare,
bronşiectazii;
• spută sanghinolentă - în TBC şi neoplasme.
 Examenul bacteriologic propriu-zis

- Dupa spalarea succesiva în 3 băi de AFS,dintr-

un fragment mucopurulent, se fac 3 frotiuri care
se colorează:
• Giemsa pentru evidentierea reacţiei
inflamatorii (PMN);
• Gram pentru evidentierea bacteriilor;
• Ziehl-Neelsen pentru evidentierea
bacililor acido-alcoolo- rezistenţi
  Examenul bacteriologic propriu-zis
Examenul microscopic stabileşte calitatea
produsului patologic, hotărând care vor fi
probele supuse însămânţării pe medii de
cultură.

Pentru acest lucru se examinează frotiul colorat Gram

cu obiectivul 10x. Raportul celule inflamatorii/celule
malpighiene (< 5) indică o probă nesatisfăcătoare
(contaminare oro-faringiană masivă).
Secretii traheo-bronsice si sputa- Ziua 1

Prelucrare: - spalare de 3 ori in SF steril

- 2 frotiuri – triaj citologic:

Grupa Celule epiteliale Celule inflamatorii

scuamoase
>25 <10
1
>25 10-25
2
>25 >25
3*
10-25 >25
4
<10 >25
5**
<25 <25
6
*Bolnavi cu metaplazie malpighiana
**Bolnavi imunocompetenti cu afectiuni acute (cea mai buna categorie)
19
 Examenul microscopic

Probele găsite corespunzatoare vor fi examinate în

continuare cu obiectivul imersie.

Ex. Asocierea semnificativa a cocilor Gram pozitivi in

diplo cu celulele inflamatorii, orientează rapid
tratamentul antimicrobian al pacienţilor pneumonici.
Suspiciunea unei anumite etiologii trebuie comunicată laboratorului de
către medicul curant, deoarece orientează microbiologul asupra alegerii
mediilor de cultură
Examenul microscopic

Frotiuri din sputa, colorate Gram: stanga- coci Gram pozitivi in diplo si lanturi
scurte (Streptococcus pneumoniae); centru- bacili Gram negativi intra si
pericelular (Haemophilus influenzae ); dreapta- levuri (x100)
 Examenul bacteriologic propriu-zis

Insamantare
 - Medii cu sange
 - Mediu Chocolate
 - Medii lactozate ( Cled; Mac Conkey)
 - Sabouraud
Sputa :

1. Crestere Haemophillus
influenzae pe mediu Chocolate
2. Frotiu Gram

1 2
Haemophilus influenzae – Frotiu Gram
Testul de Satelitism – evidentiaza cresterea
H.influenzae in jurul coloniilor de stafilococ pe
geloza sange
 Sputa :
Moraxella catarrhalis

1 2

1- Crestere pe mediu cu sange 2- Frotiu Gram

Sputa :

1 2

Moraxella catarrhalis
Crestere pe chocolate agar 1) H.influenzae comparativ cu
2) Moraxella catarrhalis
Sputa :

Cresterea
Streptococcus
pneumoniae pe
geloza sage
 Sputa :

1 2

Streptococcus pneumoniae

• Reactia catalazei- negativa

2. Streptococcus pneumoniae – Reactia de umflare a capsulei
Sputa :

Dispersie pe mediu cu sange:

1- Klebsiella pneumoniae
2- Pseudomonas aeruginosa

1
2
 Sputa :

GELOZA SANGE
 Nocardia spp.
Rectia catalazei Rectia oxidazei

Cultura bacteriana H2O2 Cultura Microbiana

Banda de hirtie de filtru
impregnata cu reativ

Efervescenta (Catalaza+) Violet intens, in maximum 7

secunde (oxidazo+)
Absenta efervescentei
(Catalaza-) Incolor sau violet tardiv
( oxidazo- )
Teste screening folosite pentru diferentierea cocilor Gram pozitivi:
1. si 2. Rectia catalazei; 3. Reactia coagulazei; 4. Testul fermentarii manitei

1 3

2 4
Repicarea Streptococcus pneumoniae pe mediu cu
sange pentru testarea la optochin:
- alfa hemoliza (zona verde in jurul coloniilor)
- zona de inhibitie in jurul discului de optochin
Testarea sensibilitatii la
antibiotice prin metoda
Disc Difuzimetrica
(antibiograma)

-Mediu MUELLER HINTON-

Stafilococ, BGN

-Mediu cu SANGE- Streptococi

-HTM - Haemophili
 Urina -Ziua 1
Examen macroscopic (culoare, sediment,
turbiditate, miros)
Examen citologic calitativ din sedimentul urinar
(centrifugare la 1200-1800 rpm/10 min.) pe
preparat lama/lamela si frotiu colorat Gram
Urocultura
- dilutii 1/10 si 1/100 insamantat cate 0.1 ml
cu pipeta de sticla sau
- cu ansa calibrata pe mediu:
- lactozat (Mac Conkey; Cled;...)
- Geloza sange (GS)
Urina -Ziua 1
Examen citologic calitativ din sedimentul urinar

Cristale de Cystina

T.vaginalis in sediment urinar

 Secretiile cailor urinare
 Urocultura – Ziua a2-a
 Examinare aspect placi (prezenta/absenta microorganismelor,
monocultura sau crestere polimicrobiana)
1. Crestere pe GS monocultura, absenta pe MC
Determinare UFC, coloratie Gram
2. Crestere pe GS, polimorfism, absenta pe MC
Contaminare, eliminarea probei
3. Crestere pe GS si MC, policultura
Contaminare, eliminarea probei
4. Crestere pe GS si MC, monocultura- bacteriurie semnificativa clinic
- Testul oxidazei
- Determinare UFC de pe MC
- Repicarea pentru Identificare pe medii diferentiale si multitest
TSI, MIU, MILF, Citrat
- API 20 E
- sistem automat
 Urocultura Ziua a2-a:

Dispersie Escherichia
coli pe mediu:
1- lactozat (Cled )
1. 2- cu sange

2
Urocultura Ziua a2-a:
Identificare pe Medii lactozate;
1. bacili Gram negativi-lactozo pozitivi
2. bacili Gram negativi-lactozo negativi

1. 2. 1. 2.
 Urocultura Ziua a2-a:

Dispersie Pseudomonas
aeruginosa pe mediu:
1 1- lactozat (Cled )
2- cu sange

2
 Urocultura Ziua a2-a:
Klebsiella pneumoniae -
dispersie pe mediu:
1
1- lactozat (Cled)
2- cu sange

2
Urocultura Ziua a2-a:
Stanga - Cresterea Serratia marcescens pe medii lactozate:Muller Hinton si
CLED
Dreapta- Proteus mirabilis - dispersie pe mediu cu sange
Urocultura Ziua a2-a:

Testarea caracterelor de virulenta:

Stanga- Streptococcus agalactiae (dispersie – mediu cu sange)
Dreapta- Enterococcus faecalis (dispersie – mediu cu sange)
 Urocultura Ziua a 3-a

 Testul oxidazei
 Identificare
Citirea rezultatelor
- de e mediile multitest: TSI, MIU, MILF, Citrat,
- sisteme microtest (API, Enterotest;)
- sisteme automate
 Testarea sensibilitatii la antibiotice
Urocultura – Ziua a3-a
Rectia oxidazei

Cultura Microbiana Banda (rondea) de hirtie de filtru impregnata

cu reativ

Violet intens, in maximum 7 secunde (oxidazo+)

Incolor sau violet tardiv (oxidazo-)

 Urocultura – Ziua a3-a

1.
Identificare pe
MEDII POLITROPE SI LACTOZATE:
1.TSI, SIM, Uree, Citrat
2. Mac Conky
3.
3. CLED
2. (Culturi - Serratia marcescens)
 Urocultura – Ziua a3-a

Cultivarea si diferentierea
membrilor Fam.
Enterobacteriaceaepe pe
Medium MILF(Mobilitate
Indol Lyzina Fenilalanina)

1. Control negativ
2. Proteus vulgaris
1 3
2 3. Klebseilla pneumoniae
 Urocultura – Ziua a3-a
Diferentierea unei varietatri
de microorganisme in special
din Fam. Enterobacteriaceae,
actinomycete aerobe,
streptococci si bacterii
Gram-negative
nonfermentative, pe baza
producerii de ureaza pe Agar
Urea Christensen:
1 2
1. Escherichia coli (negativ)
2. Proteus mirabilis (positiv)
 Urocultura – Ziua a3-a
Diferentierea
bacteriilor Gram-
negative pe baza
utilizarii citratului ca
unica sursa de carbon
pe mediul Agar
Simmons’ Citrate

1. Escherichia coli
(negativ)
2. Klebsiella
pneumoniae
1 2 (positiv)
Urocultura – Ziua a3-a
Teste screening folosite pentru diferentierea cocilor Gram pozitivi:
1. si 2. Rectia catalazei; 3. Reactia coagulazei; 4. Testul fermentarii manitei

1 3

2 4
 Urocultura – Ziua a3-a

 Testarea enterococilor pe
Mediul ABE
1. Reactie negativa
1 2 2. Reactie pozitiva (culoare
neagra)
Urocultura – Ziua a3-a

GELOZA MUELLER HINTON

Testarea sensibilitatii la
antibiotice prin metoda
Disc- Difuzimetrica
(antibiograma)
 Secretiile tractului intestinal

 Materii fecale _ Ziua 1

Examinare macroscopica: consistenta, paraziti, melena
Suspensie in AFS
Examinare microscopica
Preparat lama/lamela
Frotiu coloratie Gram
Frotiu coloratie albastru metilen (fungi)
 Coprocultura
Insamantare direct din coprorecoltor/imbogatire
selenit
Insamantare pe:
- Mediu cu sange (GS)
- ADCL
- Cled
- Mac Conkey cu / fara inhibitor
- Bile Salts Agar (BSA)
- Campylobacter agar medium
Examen microscopic materii fecale- Ziua 1
Preparat lama/lamela
Coloratie: Gram , Albastru de metilen

1. Chist 2.Trofozoit

Giardia intestinalis :
1.Chisturi- coloratie Gram
2. Trofozoit -coloratie albastru de metilen
 Examen microscopic materii fecale- Ziua 1
Preparat lama/lamela

1. 2.

1.Ou de oxiur -coloratie albastru de 2. Ou de Trichuris trichiura - coloratie

metil
albastru de metil
Examen microscopic materii fecale- Ziua 1
Preparat lama/lamela

1.Ou de Ancylostoma spp. -coloratie 2.Ou de Strongyloides spp. -

albastru de metil coloratie Lugol
Examen microscopic materii fecale –Ziua 1
Preparat lama/lamela

2
1

Oua de paraziti in preparat Kato-Miura:

1. Ascaris lumbricoides; 2. Trichuris trichiura
Examen microscopic materii fecale- Ziua 1
Preparat lama/lamela

Ou de Taenis spp. in preparat Kato- Miura

Coprocultura -_Ziua 1

1
2

Examen microscopic Frotiu Gram din materii fecale:

1. Bacterii (Shigella spp); 2. PMN ; 3. hematii
 Secretiile tractului intestinal
 Coprocultura - Ziua a 2-a
Examinarea cresterii bacteriene :
◦ Culturi polimicrobiene
 Examinare Geloza sange (prezenta coloniilor hemolitice)
- Frotiu
- Identificare
- testul catalazei, coagulazei
- sisteme microtest (API ,MicroID, sisteme automate)
- testul la Novobiocin etc.,
- Insamantare pe Geloza simpla (G)
 Examinare mediilor lactozate
- Dispersii pentru purificarea culturii
- Identificare prin
- insamantare pe medii multitest (TSI, MIU, MILF, Citrat);
- sisteme microtest ( Enterotube; API etc.,)
- sisteme automate
TCBS (colonii galbene, de tip S)
Suspiciune Vibrio cholerae
COPROCULTURA – Ziua a2-a

Identificare bacterii patogene:

Salmonella spp.
1. Crestere in bulion selenit
2. Cresterea pe SS agar

2
1
 COPROCULTURA- Ziua a 2-a
Identificare bacterii patogene:
1. Frotiu Gram din cultura
2. Crestere pe mediu cu sange
Salmonella spp.
1 3. Crestere Salmonella spp.
pe mediu SS

3
2 3
COPROCULTURA Ziua a 2-a

 Crestere pe
mediul ADCL

Shigella spp.
 COPROCULTURA- Ziua a2-a

Identificare bacterii patogene:

1. Frotiu Gram din cultura
2. Crestere Shigella spp.
pe mediu cu sange;
3. Crestere Shigella spp.pe mediu
1 lactozat

3
2
 COPROCULTURA- ziua a 2-a
1. Crestere Escherichia coli.
pe mediu cu sange;
2.Crestere Escherichia coli.
pe Mac conkey;
3. Frotiu Gram din cultura
33

1 2
Coprocultura – Ziua a2-a
Campylobacter intestinalis :Stanga- Frotiu Gram; Dreapta- Cultura

Bacili de forme curbate

asemanatori Helicobacter
pylori- Colotatia Gram
(x100).
Cultura de Campylobacter
intestinalis pe Mediu CAMP
 Secretiile tractului intestinal

 Coprocultura- ziua a 3-a

 Identificare (biochimica)
 Citirea rezultatelor de e mediile multitest: TSI, MIU, MILF,
Citrat,
 Citire rezultate sisteme microtest (API 20E; API 20NE;
Enreotube, sisteme automate)
 Identificare antigenelor bacteriene (serologica) latex
aglutinare;

 Testarea sensibilitatii la antibiotice

Coprocultura- ziua a 3-a

GELOZA MUELLER HINTON

Testarea sensibilitatii la
antibiotice prin metoda
Disc- Difuzimetrica
(antibiograma)
 În multe infecţii, morbiditatea şi mortalitatea
pot fi reduse semnificativ dacă se instituie în
timpul cel mai scurt un tratament adecvat;

 În alte infecţii, spitalizarea poate fi evitată sau

scurtată şi intervenţiile chirurgicale specifice
pot fi evitate, dacă un tratament
antimicrobian este administrat rapid (la timp).
 Ordin MSP 1301/2007 /MO 617/06.11.2007 privind aprobarea Normelor privind
functionarea laboratoarelor de analize medicale
 Standard 15189 Laboratoare medicale. Cerinte particulare pentru calitate si competenta
 Contract- cadru privind conditiile acordarii asistentei medicale in cadrul sistemului de
asigurari sociale de sanatate pentru anul 2010
 ORDIN MSP 1301/20.07.2007; SECŢIUNEA a 9-a. Managementul calităţii. Controlul intern
de calitate şi evaluarea externă a calităţii în laboratorul de analize medicale.
 Bacteriologie medicala volumul I si II, editia 1985, Balbaie si Pozsgi
 Pocket guide to Clinical Microbiology ; 2-nd Edition Patrick R. Murray, ASM-Press,
Washington DC1998
 Clinical Manual of microbiology Patrick R. Murray, 2007
 Clinical Microbiology –Procedures Handbook ; Second Edition, Henry D. Isenberg, vol 1,2 si
3, 2004
 CLSI – 2012, Performance Standards for Antimicribial Susceptibility Testing ; Clinical and
Laboratory Standard Institute
 EUCAST ( The European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing)
 Asigurarea calităţii microorganismelor Păstrare • Procesare • Întreţinere MICROBIOLOGICS