TUBERCULOZA DEFINITIE.

ETIOLOGE MONICA POP Istoric Tuberculoza- boala infectocontagioasa Identificata la mumiile egiptene si schelete din epoca de piatra Hippocrate gaseste legatura cauzala intre ftizie-hemoptizie, si intuieste caracterul contagios evul mediu -localizare pulmonara insotita de casexie Renasterea demostreaza extensia si la alte organe Percival Pott (1720) descrie tuberculoza osoasa cu localizare vertebrala Braille (1810) descriu tuberculii si evolutia spre ulcerare Istoric 2 Laennec intemeietorul metodei anatomoclinice precizeaza caracterul leziunilor tuberculoase( materia tuberculoasa cenusie ,ulterior galbena opaca) Ranke sistematizeaza in 3 stadii evolutia tuberculozei: -afect primar, -perioada secundara de diseminare -perioada tertiara de ftizie Villlemin stabileste transmisibilitatea maladiei 1865 Koch 1882 evidentiaza bacilul tuberculozei, cultivarea lui, punctul de plecare in studiul imunitatii, primul plan de profilaxie Istoric 3 Rontgen 1896 a evidentiat Razele X(premiu Nobel 1902 !) Cl von Pirquet utilizeaza tuberculina la cutireactie 1920 Uniunea Internationala Contra Tuberculozei la Paris 1921 Calmette si Guerin prepara vaccinul antituberculos dupa 13 ani de cercetare 1943:ERA MEDICANETELOR ANTITUBERCULOASE !!! Waksman decopera SM 1943, HIN 1952, RMP 1965 Babes 1887 in Romania Ioan Cantacuzino 1926 conserva tulpina originala de BCG !926 primul dispensar antituberculos la Cluj-Daniello 1942 Leon Daniello -prof titular la catedra de Ftiziologie

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA Ordinul ACTINOMYCETALES: structura citologica si citochimica similara bacteriilor tipice; au analogii cu micetele filamentoase, 4 genuri: actinomycetaceae, streptomycetaceae, actinoplanaceae, mycobacteriaceae, Genul Mycobateriaceae: acidoacoolerezistenta, aspectul de bastonas ( myces=ciuperca, mucegai bacterion=bastonas).

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA CLASIFICARE: 1. dupa patogenitate: -patogene exclusiv pt om: M leprae -patogene ptr.om, animale si pasari: Complexul M.t.( hominis, bovis,africanum), -oportuniste majore: kansasii, avium, xenopi, scrofulaceum, -oportuniste minore: ranae, chelonei, terrae, -saprofite: gordonae, flavescens, phei, smegmatis. CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA 2. dupa viteza de crestere (dezvoltare de colonii): -cu crestere lenta: strict patogene-compl.M.t, -M.leprae, grupul fotocromogenekansasii, marinum, simiae, africanum, grupul scotocromogenescrofulaceum, szulgai, gordonae, grupul necromogene-comp.avium intracel, ulcerans, xenopi, -cu crestere rapida: grI-necromogene (fortuitum, chelonei), gr.II-termofile ( smegmatis, phei), gr.III-scotocromogene ( flavescens), gr. IV-aletele ( vacae). MORFOLOGIA MICROSCOPICA MICROSCOPUL OPTIC: -acido-alcoolorezistenta - bastonase drepte sau incurbate cu capete rotunjite, - lungime: 1-5, - grosime: 0,2-0,4, - necapsulate, nesporulate,imobili - dispozitia in gramezi( un plus de rezistenta) sau filamente MICROSCOPUL ELECTRONIC: Perete celular tristratificat Dublat pe fata interna de m.celulara, Membranainvaginatii citoplasmatice cu rol de mitocondrii ( mezosomi), Citoplasma: structura nucleara: AND, granulatii, vacuole, incluzii citoplasmatice. DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA PARAZITISM OBLIGATORIU: indiv.Genului M, Cultivarea M. se face pe medii artificiale speciale: Lwenstein Jensen, Compozitie: saruri minerale, glicerina (sursa de C), asparagina, clorura de amoniu ( sursa de N), ou, amidon ( fecula de cartof), verde malachit ( indicator de pH), Medii sintetice: Youmans, Sula, Dubos, Conditii de dezvoltare: T=37,5-38C, pH=7-7,5, aerobioza obligatoriu,

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA Cresterea: lenta ( durata de viata a unei generatii=18-24 h), Primele microcolonii punctiforme: 10-15 zile, maturarea dupa 3-4 saptamani (tipul bovin dupa 2 luni), Aspectul coloniilor: IDENTIFICAREA MYCOBACTERIEI, M.t.hominis: colonii, proeminete, verucoase, uscate, rugoase ( tip R= rough), culoare galbuie, dezvoltarea este eugonica pe toata suprafata mediului , DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA M.t.bovis: coloniile sunt netede, plate, culoare albicioasa, aspect cremos ( tip Ssmouth), cresterea mai putin luxurianta ( caracter disgonic), lent in 2 luni. M.t.hominis sub actiunea medicamentelor antituberculoase: aspect disgonic, Din cultura maturafortiu ( col. Z-N): prezenta cord factor asigura dispunerea in forma de benzi serpuitoare ( substratul virulentei) Absenta cord factor: M.t.bovis, hominis ( tratat cu medic) dispunere in gramezi compacte STRUCTURA BIOCHIMICA 80-85%: apa, 15-20% reziduu uscat, Saruri minerale, substante organice: lipide ( 30-40%), proteine, glucide, Lipide: -caracterul .hidrofob al peretelui celular, -fixeaza colorantii greu colorantii( fuxina fenicata, fluorcromii), -acidoalcoolorezistenta la acizi, eteri, acetona, (in special prin ac micolic), -etc. STRUCTURA ANTIGENICA ANTIGENE PASIVE incapabile sa produca Ac, dar actioneaza specific cu Ac Proteinele: reprezentantul tuberculina, IDR: dg. Infectiei tuberculoase, Este netoxica ptr. Org. animal neinfectat, Produce hipersensibilitate de tip intarziat la org. alergizate sp. Prin M.bacilare, Glucidele: legate de prot, lipide, ac.nucleici, Enzime: amilaze, transaminaze, ureaze, fosfolipaze, lipaze, catalaze. ANTIGENE ADEVARATE produc Ac in vivo si reproduc leziuni anatomopatologice REZISTENTA LA AG.FIZICI, CHIMICI Rezistenta deosebita: lipide ( hidrofobia), gruparea in gramezi, invelis organic ( saliva), Rezistenta la frig: - 180C, rezistenta la uscaciune, DISTRUGERE: 1. UV: componenta UV a luminii albe mor in 10 min 2. caldura umeda: fierbere, autoclavare ( timp raportat la gradul de infectare), 2 min prin fierbere, 3. substante antiseptice: formol la 50 grade, cloramina 5-10%, lizol, detergenti cationici, clorura de var20%, 4. medicamente antituberculoase ( bactericide ). DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

PRODUSUL PATOLOGIC: 1. EXPECTORATIA( sputa, saliva): A. Recoltarea corecta: recipiente speciale, identitate, Dimineata, a jeun, inainte de mancare, toaleta, inainte de inceperea tratamentului Spontan: tuse provocare a tusei: aerosoli, spalatura bronsica, iritatia faringe, ef.fizic cu glota inchisa, Dirijat: endoscopie bronsica, sondaj gastric matinal, Se recolteaza cel putin 3 esantioane din produsul patologic ( 10-12), in zile consecutiv,

Produsul patologic 2.Urina de dimineata 3.Sperma sau sange menstrual sau sange bioptic dupa chiuretaj 4.Lichid pleural 5.LCR 6. Aspirat de maduva osoasa 7. Lichid ascitic, pericardic 8. Fragmente de peritoneu, intestin , ganglioni DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2. Transportul si prelucrarea: cat mai rapid ( pastrare la +4C, max.5 zile, transport in cutii spaciale-lemn, metal) in laboratoare dotate in acest sens, Decontaminare cu fosfat trisodic15%, antibiotice cu spectru larg EVIDENTIEREA M.T. SE FACE PRIN: metode clasice (ex.M direct, dezvoltarea pe mediile de cultura, inocularea la animalul de laborator), metode moderne de evidentiere a M.t. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT: Metoda simpla, rapida, ieftina, usor repetabila,fara aparatura sofisticata si personal superspecializat DESCOPARA RAPID MARII ELIMINATORI DE B: criterii ptr. Inceperea traatmentului, izolarea bolnavului, Controlul sterilitatiiexpectoratiei Metode: coloratia Ziehln Neelsen ( fuxina fenicata la cald, flurocromi la rece), Sensibilitatea metodei creste prin: concentrarea produsului patologic ( centrifugare, flotatie), omogenizare ( fluidificare cu NaOH), Limite: sensibilitate (nr. mare de bacili 5.000-10.000pe ml ), Nu ofera inf. asupra viabilitatii bacililor, identitatii, sensibiltatii la medic.antitub, Interpretarea rezultatelor.

Examenul microscopic Se bazeaza pe proprietatea comuna tuturor speciilor de mycobacteriumacidoalcoolorezistenta

In celula patrund greu coloranti ( se folosesc mordanti sau caldura), dar odata intrati pot fi greu de extra cu ajutorul acizilor, alcoolului si a altor substante de decolorare BAAR este o rezistenta la decolorare persista si la cadavrele de bacili Poate disparea prin procese enzimatice, tratamente tuberculostatice, UV METODA ZIEHL-NEELSEN Colorarea la cald a frotiului cu fuxina fenicata Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric Recolorare cu sol de albastru de metilen(verde malachit, acid picric) Bacili rosii, subtiri, incurbati pe fond albastru (verde sau galben) Tehnica Margineanu coloreaza la rece folosind xilol amestecat cu fuxina fenicata Tehnica cu auramina-rodamina Examenul microscopic in lumina fluorescenta Colorare la rece cu ajutorul fluorocromilor ( auramina sau rodamina) Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric Recolorare cu permmmanganat de potasiu pentru diminuarea fluorescentei nespecifece Examinare cu obiectiv uscat, la microscop dotat cu examinare pentru fluorescenta la care se anexeaza sursa UV, in camera intunecata

Examinarea frotiurilor La coloratiile obisnuite obiectiv de 100x si un ocular de 10x, in imersie cu ulei de cedru Rezultatul examinariise exprima cantitativ9Nr de bacili pe 300, 100 sau 25 de campuri microscopice examinate BAAR/100 campuri-1-9 BAAR/100 camp BAAR 1+ -10-99b/100 camp BAAR2+ -1-10b/100camp BAAR3+ >10b/100 campuri Examinarea frotiurilor In fluorescenta permite evidentierea bacililor cu un obiectiv slab maritor(25), cu obiectiv de 20x si ocular de 10x, iar campul microscopului acopera o suprafata mai mare de aproape 16x, ceea ce scurteaza timpul de examinare Bacili portocalii stralucitori pe fond intunnecat Examinarea frotiului 1-2 min permite parcurggerea a 30 de campuri, ce coincide cu examinarea a cel putin 300 de camopuri la M cu imersie Rezultate 0 BAAR/30 camp negativ 1-5 bacili se noteza nr exact Se imparte nr de BAAR la 10 Cauze de eroare fals pozitive -particule alimentare, precipitate, zgarieturi -precipitate de coloranti, granule de polen in sputa - spori de Bacillus subtilis, nocardia, alte micabacterii saprofite -transferul de pe o lama pozitiva pe una negativa la colorare, saubacili aderenti in uleiul de cedru Erori fals negative

Recoltare incorecta a expectoratie ( saliva) Expunerea directa la soare a produsului patologic sau dupa mai mult de o saptamana Fixarea necorespunzatoare a frotiului Supraincalzirea sau contact insuficient cu fuxina Citirea prea rapida sau superficiala a lamelor( sau daltonismul examinatorului) Dezvoltarea pe medii de cultura Mycobacteriile sunt pretentioase, necesitand medii speciale complexe, aerobioza obligatorie, temperatura optima de 37 grade si au dezvoltare lenta Sursa de carbon( hidrocarbonate ca glucoza, glicerol) Sursa de azot ( aminoacizi ca asparaginina, sau acidul glutamic, sau oua ser sau bulion de carne) Ioni esentiali (Fierul si magneziu) Verde malachit ca indicator de ph , bactericid si colorare de mediu facand mai vizibile coloniile de M Mediu solid Lovenstein Jensen Medii lichide Youmans, dubos, Middlebrook DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMINAREA PRIN CULTURI. Insamantarea produsului patologic pe mediul de cultura, Incubare la 37C, Citirea tuburilor la 3-7-14 -21-30-45-60 Aspectul coloniilor mature: identificarea tipului ( tipizarea coloniei), Avantaje: sensibilitate ( produse paucibacilare ce contin 10-100 bacili), Procedeu selectiv de confirmare al dg. etiologic M.t, Viabilitatea bacililor, identificarea b, sensibilitatea (ABG), Dezavantaje: metoda laborioasa, costisitoare, latenta rezultatelor de 2 luni, Micobacterii atipice Fotocromogene nu se pigmenteaza la intuneric, la lumina determinand aparitia pigmentului galben Scotocromogeni au colonii colorate in portocaliu atat la intuneric cat si la lumina Nefotocromogeni absenta pigmentarii sau pigment gri sau crem neinfluentat de lumina Micobacterii cu crestere rapida se dezvolta in 2-5 zile Testul catalazei pozitive si testul Konno negativ Interpretarea rezultatelor la culturi Absenta coloniilor - negativ Mai putin de 30 de col -Nr exact/tub 30-100 coloni- cultura 1+ >100 colonii izolate -2+ Colonii confluente- 3+ Colonii de suprainfectie - cultura suprainfectata Testarea sensibilitatii la tuberculostatice Metode directe- insamantarea produselor patologice pe medii de cultura ce contin diferite concentratii de tuberculostatice,

Metode indirecte-Din cultura pura izolata se inoculeaza pe tuburi cu tuberculostatice, Avantajele si dezavantajele insamantarii prin culturi AVANTAJE Mult mai sensibila decat microscopi 10 bacili/ml sputa) depisteaza asimptomatici diferentierea de cadavrele de bacili identificarea tipului de mycobacterii prin inglobbarea tuberculostaticelor testarea sensibilitatii DEZAVANNTAJEccostisitoare rezultate finale peste 60 de zile (pentru medii solide). DIAGNOSTIC POZITIV

METODE MODERNE DE DETECTIE A M.T. 1. Detectia rapida a diviziunii (BACTEC): Principiu: masurarea CO2 marcat cu carbon radioactiv (14 C), eliberat in timpul multiplicarii in cultura lichida ( sursa de C este ac. Palmitic marcat cu 14 ), Metoda este sensibila ( detectarea unor cant. Minime de 14C, in timp scurt 10-2128 zile.

MB Bact Utilizeaza mediile lichide si un sistem computerizat de citire pe principii colorimetrice, ceea ce permite obbtinerea mai rapida a rezultatelor DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC INOCULAREA LA ANIM. DE LABORATOR: Metoda sensibila, inocularea prod.patol. la animale de experienta ( cobai, iepure), Metoda laborioasa, costisitoare, Metoda de alternativa: nesigura la bolnavii tratati, utilizata in situatii de exceptie ( Tub. extrapulmonara) Pentru cercetare DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2. NAP-test. Principiu: NAP: nitro acetil amino hidroxipropiofenon) inhiba dezvcltarea M.t. h. si b. dar nu si pe cele atipice, Dg.# cu M.atipice ( in 5 zile). 3. Cromatografia ac. Micolici. Principiu: determinarea. profilului ac.micolici ( sunt specifici cant. Si calit. fiecarei specii ai g. My), Identificarea in 24 h, doar M.t. in cultura pura. 4. Sonde genetice. Principiu: separarea lant de AND sub act. Caldurii, Fiecare lant, la temp. se reasociaza ( hibrideaza) specific cu lantul specific, fiecare secventa nucleotidica cu secventa nucleotidica complementara, Sonde genetice: secvente nucleotidice artificialese hibrideaza cu secv. Complementara, Sondele permit in cateva ore identificarea col. M.t,

Un singur produs patologic.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 5. Detectarea ac. tuberculostearic. Pricinpiu:prin cromatografie gazoasa ( spectrofotometrie de masa), Ac. Micolic este prezent la toate M.t, Evidentierea ac. Tuberculostearic indica o infectie tuberculoasa, Metoda este sensibila, dar necesita un volum mare de munca si costisitoare. 6. Serodiagnosticul in detectarea antigenelor M.t. Principiu: RFC, hemaglutinarea, hemagregarea, precipitarea si difuziunea in gel, imunofluorescenta, ELISA, Antic. Monoclonali si antig.recombinate, Se apreciaza gradul de activitate a tuberculozei. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 7. amplificarea genomica prin reactia de polimerizare in lant ( PCR). Principiu: AND polimeraza respons. de replicarea AND e capabila sa copieze in vitro secv. Sp. Ale AND cu cond. De a dispune de tipare, ele insele specifice, Utilizarea AND polimeraza sp-Taq polimeraza a carei termoresistenta ii confera rezistenta la temperaturi inalte se poate amplifica pana la 1.000.000 X secventa de AND pe care dorim sa-l detectam, Metoda: este laborioasa, costisitoare, prea sensibila ( uneori se inregistreaza o amplificare nespecifica sau contaminarea prod. Patol. De catre AND exogen).