LP2 Sterilizare Medii de Cultura Prelevare2

DOCUMENT : L.P.
- Microbiologie Generală DATA : 09/10/2020

TITLU :
Sterilizare_Medii de Cultura_Prelevare PAGE : 1/31
3. METODE DE STERILIZARE ȘI INHIBARE A

MICROORGANISMELOR
Microorganismele sunt răspândite pretutideni în natură: apă, aer, sol, pe tegumentele și

mucoasele viețuitoarelor, pe obiectele pe care le utilizăm. Numeroase microorganisme au un rol
important în dezvoltarea planetei noastre și numai un număr mic din totalul celor cunoscute exercită
efecte dăunătoare, cum ar fi alterarea alimentelor sau a altor produse comerciale, producerea unor boli
la om, animale și plante.
Prima condiție necesară pentru a putea studia un microorganism în cultură pură, pe medii
artificiale, în afara mediului natural, este cunoașterea metodelor care să permită îndepărtarea sau
distrugerea germenilor contaminanți din mediile de cultură, din recipiente și de pe suprafața
instrumentelor cu care se lucrează. Există numeroase metode, alegerea metodei potrivite depinde de
natura și proprietățile materialului care va fi sterilizat (sticlărie, cauciuc, metal).
Termeni de bază:
STERILIZAREA COMPLETĂ: ansamblul de procedee care au ca scop distrugerea virusurilor și
microorganismelor vii prezente într-un mediu, pe instrumente sau obiectele de laborator, atât în
forma lor vegetativă, cât și sub formă de spori;
STERILIZAREA INCOMPLETĂ: ansamblul de procedee care permit distrugerea formelor
vegetative ale microorganismelor;
ASEPSIA: ansamblul de măsuri și metode prin care se evită contaminarea, introducerea din exterior
într-un mediu steril sau cu microbiotă specifică, a microorganismelor viabile;
DEZINFECȚIA: metode chimice prin care sunt distruse toate formele vegetative ale
microorganismelor, dar nu și formele sporulate;
ANTISEPSIA: metode de înlăturare sau distrugere a formelor vegetative microbiene, existente pe
tegumente, mucoase, plăgi, utilizând substanțe antiseptice.
În practică, sunt utilizați deseori și alți termeni:

Substanța microbiocidă sau germicidă (bactericidă, fungicidă) are efect dezinfectant, de distrugere a
microorganismelor în formă vegetativă. O substanță este germicidă dacă efectul ei se produce cu o
viteză mare și se produce la concentrații foarte mici de substanță. În această categorie intră
substanțele dezinfectante. Aceste substanțe distrug microbii de pe diferite obiecte neanimate sau de
pe suprafețe și au toxicitate ridicată, ceea ce face contraindicată aplicarea lor pe țesuturile vii.
Exemple: formol, fenol, cloramină. Alcoolul etilic de 96% este un dezinfectant foarte slab, el
acţionând prin coagularea proteinelor.
Substanța microbiostatică (bacteriostatică, fungistatică) are efect antimicrobian, de inhibare a
activității și a procesului de multiplicare celulară. O substanță este microbiostatică, dacă efectul ei
se produce la concentrații relativ mari de substanță, iar viteza de omorâre a celulelor este mică. În
general, antisepticele au acţiune microbiostatică și acţionează în concentraţii mici şi pentru timp
scurt, ce face posibilă aplicarea lor și pe ţesuturi vii. Exemple: alcool etilic de 70%, KMnO4 0,1%,
tinctură de iod, albastru de metilen, verde malachit, acidul boric, H2O2, detergenţi, conservanți
alimentari etc.
1
DOCUMENT : L.P. - Microbiologie Generală DATA : 09/10/2020
TITLU :
3.1. Clasificarea metodelor de distrugere și inhibare a microorganismelor
Căldură uscată Incinerare, încălzire la roșu,

sterilizare în etuvă, flambare
Căldură umedă Autoclavare, tindalizare,
Metode de distrugere
pasteurizare, fierbere
Agenți chimici Gaze sterilizante, substanțe
dezinfectante
Radiații UV, X, γ, β etc
Filtrare Filtre cu porozitate diferită în

funcție de categoria de
Metode de separare
microorganisme de eliminat
Ultracentrifugare Sedimentare
Supunere la Refrigerare, congelare

temperaturi joase
Deshidratare Conservarea alimentelor prin
deshidratare
Liofilizare Deshidratare sub vid la
Metode de inhibare temperatură joasă
Mărirea presiunii
Saramură, sirop
osmotice
Agenții chimici Substanțe microbiostatice
(dezinfectanți diluați, coloranți,
conservanți, antibiotice)
3.1.1. Sterilizare prin căldură uscată
Incinerarea
Incinerarea (metodă de sterilizare completă) constă în arderea materialelor folosite și
nerecuperabile, în cuptoare speciale sau crematorii, la temperaturi de 300-500°C.
Utilizări
Metoda se aplică pentru: cadavre și carcase de animale infectate utilizate în experimente,
reziduuri organice solide, produse patologice, materiale de unică folosință din plastic, vată și
pansamente infectate, etc.
Încălzirea la roșu
Metoda constă în menținerea obiectului metalic în partea superioară a flacării unui bec de gaz,
până la înroșirea completă a acestuia, înainte și după utilizare. Deși prezintă marele dezavantaj al
degradării în timp a obiectelor metalice, aceasta rămâne una dintre metodele cele mai frecvent utilizate
în microbiologie. Este o metodă de sterilizare completă.
Utilizări
Metoda se aplică la sterilizarea obiectelor metalice de dimensiuni mici: firul de platină al ansei
și al acului de însămânțare (înainte și după folosire).
2
TITLU :
Flambarea
Metoda constă în trecerea de câteva ori, timp de câteva secunde, prin flacara unui bec de gaz a
obiectelor de mici dimensiuni și cu suprafață netedă. Flambarea este o sterilizare incompletă. În unele
cazuri se utilizează flambarea cu alcool (sau alcool flambarea), care constă în imersia obiectului de
sterilizat în alcool, urmată de flambarea lui la flacăra becului de gaz.
Utilizări
Prin aceasta metodă se sterilizează: portansa (ansei și a acului de însămânțare), suprafața
externă a pipetelor gradate, a pipetelor Pasteur (de sticlă), gâtul flacoanelor Erlenmeyer, gura
eprubetelor, suprafața lamelor pentru fixarea frotiurilor etc. Flambarea cu alcool este folosită la
sterilizarea anselor de etalare (ansa Drigalski) și a obiectelor de metal (spatulă, pense, foarfeci).
Sterilizarea cu aer cald

Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficientă măsură de sterilizare și se realizează în aparate
metalice (etuvă, cuptor Pasteur sau Poupinel).
Etuva (a se vedea Anexa 1) poate fi de diferite capacități și dimensiuni, cu pereţi dubli din
tablă, termoizolanţi. Aparatul este prevăzut cu o sursă de căldură, de obicei o rezistenţă electrică şi un
termostat, ce permite menținerea constantă a temperaturii selectate, uniformizată în incinta de
sterilizare printr-un sistem de ventilație, iar produșii de combustie sunt eliminați printr-un orificiu,
situat în partea inferioară a aparatului. În interior se găsesc rafturi de sită metalică, pentru așezarea
obiectelor de sterilizat.
Mod de lucru:
1. Materialele curate, perfect uscate sunt împachetate în hârtie de ambalaj, rezistentă la temperaturi
ridicate;
2. Obiectele astfel pregătite se așează pe rafturile metalice din interiorul aparatului, lăsând spaţii mici
între ambalaje pentru a facilita circulația aerului cald și pentru a asigura o încălzire omogenă. De
asemenea, se va evita contactul cu pereții interni ai etuvei, pentru ca hârtia de împachetat să nu se
carbonizeze;
3. Se pornește sursa de căldură și se reglează timpul și temperatura necesare sterilizării. Timpul de
sterilizare este de 60 minute din momentul atingerii temperaturii de 180°C. Prin această metodă se
realizează o sterilizare completă.
4. După terminarea sterilizării, deschiderea aparatului se realizează doar după scăderea temperaturii
interioare la valoarea de 70°C, pentru a evita accidentele, dar și pentru a proteja sticlăria, care, la
contactul cu aerul rece din exterior s-ar putea sparge, ca urmare a răcirii bruște.
5. Eficiența sterilizării cu aer cald la etuvă se verifică în mod indirect, observând culoarea hârtiei de
împachetat. Îngălbenirea hârtiei și a vatei indică o sterilizare completă. Culoarea maron a
ambalajului arată faptul că temperatura a fost mai mare de 180°C și că sterilizarea a fost
compromisă. Sub acțiunea căldurii, hârtia și vata se descompun, degajând un gudron bogat în
substanțe antiseptice, care vor împiedica dezvoltarea microorganismelor ce urmează a fi cultivate
în recipientul respectiv. Recipientele trebuie spălate cu alcool și apoi cu apă, uscate și sterilizate
din nou.
Utilizări
Această metodă este aplicată la sterilizarea: sticlăriei de laborator (eprubete, baloane, pipete
3
TITLU :
gradate, pipete Pasteur, plăci Petri, anse de etalare din sticlă, fiole de recoltare), obiecte din metal
(pense, bisturie), obiecte din porțelan (mojare, capsule), tampoane de vată pentru recoltare, etc.
Obiectele astfel sterilizate pot fi păstrate timp de maximum două săptămâni, în dulapuri bine închise.
!!!ATENȚIE: prin acest procedeu nu se sterilizează: obiecte din cauciuc, din plastic, seringi
cu armătură metalică sau din plastic, medii de cultură.
3.1.2. Sterilizare prin căldură umedă
Fierberea
Este o metodă de sterilizare incompletă, care nu asigură distrugerea sporilor și se realizează în
fierbătoare electrice sau cu gaze, în care temperatura apei ajunge la 90-100°C. Se recomandă utilizarea
apei distilate, pentru a evita depunerea sărurilor. O fierbere timp de 10-15 minute în apă distilată,
asigură distrugerea majorității germenilor patogeni. Pentru siguranță, fierberea se realizează timp de
30-60 minute. Se recomandă adăugarea a 4-5% carbonat de sodiu sau potasiu sau borat de sodiu, care
ridică cu câteva grade punctul de fierbere a apei şi împiedică ruginirea. Obiectele sterilizate prin
fierbere se recomandă a fi imediat utilizate.
Utilizări
Metoda este aplicată rareori în microbiologie, dar se folosea în medicină pentru sterilizarea
obiectelor din metal de dimensiuni mici: foarfeci, seringi cu armătură metalică, pense, bisturie, etc.
Pasteurizarea
Pasteurizarea, procedeu descris de Pasteur, este o metodă de sterilizare incompletă, puțin
folosită în microbiologie, deoarece asigură numai distrugerea microorganismelor nesporogene, dar
utilizată cu mare succes în industria alimentară.
Există două tipuri de pasteurizări:
- Pasteurizarea înaltă (2-3 minute la 90°C)
- Pasteurizarea joasă (30 minute la 63°C)
În prezent, în industria alimentară sunt utilizate umătoarele variante ale pasteurizării:
- Flash-pasteurizarea (high temperature-short time - HTST): încălzirea produsului la 75°C timp
de câteva secunde, urmată de răcirea instantanee a acestuia;
- Ultra-pasteurizarea (ultra high temperature - UHT): încălzirea produsului la 141°C timp de 2
secunde, urmată de răcirea bruscă a acestuia.
Utilizări
În industria alimentară există instalații speciale pentru sterilizarea parțială a anumitor lichide
(lapte, suc de fructe, bere, vin, conserve).
Tindalizarea
Este o metodă descrisă de Tyndall în 1877, care se utilizează pentru sterilizarea fracționată a
mediilor și soluțiilor ce conțin substanțe termolabile, ce pot fi denaturate sub acțiunea temperaturilor
ridicate. Este o metodă de sterilizare completă.
Tindalizarea constă în trei pasteurizări succesive, de câte 30-60 minute, efectuate la intervale
de 24 ore, prin imersia recipientelor cu substanțe termolabile în băi cu apă sau într-un autoclav special
la temperatură constantă (60-90°C). Încălzirile repetate ale mediilor și soluțiilor termolabile omoară
4
TITLU :
atât formele vegetative existente inițial, cât și pe cele germinate din spori în intervalele dintre încălziri.
Mod de lucru:
1. Prima pasteurizare distruge toate formele vegetative existente inițial în mediul de sterilizat;
2. Incubare la temperatura de dezvoltare adecvată: după 24 ore de incubare în condiții optime,
eventualii spori prezenți în mediu și nedistruși în prima etapă germinează (ajungând în stare
vegetativă);
3. A doua pasteurizare distruge sporii care au germinat;
4. Incubare din nou: este posibil ca uneori, unii spori să nu germineze înainte de a doua pasteurizare,
de aceea mediile se incubează iarăși în condiții optime de germinare;
5. A treia pasteurizare: asigură distrugerea tuturor sporilor germinați.
6. Controlul sterilizării prin tindalizare se verifică prin incubarea în termostat la temperatura de 28-
37°C timp de 24 de ore, a mediilor și lichidelor cu substanțe termolabile sterilizate prin acest
procedeu.
Utilizări
Se utilizează în laboratoare pentru sterilizarea unor lichide termolabile care se degradează la
temperaturi înalte: medii de cultură cu lapte sau must, ser, sânge, soluții de zaharuri, de vitamine,
pentru inactivarea unor vaccinuri sau sterilizarea antibioticelor etc.
Autoclavarea
Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune (autoclavarea) este o metodă de sterilizare completă
care se realizează într-un aparat special, numit autoclav. Este cea mai folosită în practica
microbiologică.
Autoclavul (a se vedea Anexa 1) este un cazan cilindric, așezat orizontal sau vertical, prevăzut
cu pereți groși, dubli (rezistenți la presiuni ridicate) și cu un capac greu, gros care se închide ermetic.
Pe capac sau pe învelișul extern al autoclavului se află așezate un termometru și un manometru, care
indică temperatura și presiunea din interiorul autoclavului.
Cu vapori de apă sub presiune, se obţin temperaturi de peste 100oC, având un puternic efect
sterilizant, deoarece denaturează proteinele celulare și în special enzimele. Durata sterilizării depinde
de temperatură și presiune:
115oC.......................0,5 atm.......................90 min.
121oC..........................1 atm.......................20-30 min.
134oC..........................2 atm.......................10 min.
Parametrii de sterilizare de care trebuie să se țină cont sunt:
- Temperatura: pentru distrugerea florei microbiene trebuie atinse valori foarte mari (121°C sau
134°C).
- Timpul de expunere la abur cu temperatură mare poate fi cuprins între 10 și 90 de minute, în funcție
de volumul și natura soluțiilor, a mediilor de cultură sau a obiectelor aflate la sterilizat. Dacă nu sunt
expuse suficient, este afectat procesul de sterilizare.
- Presiunea – aburul la presiune ridicată permite atingerea unor temperaturi ridicate pentru distrugerea
microorganismelor.
5
TITLU :
Mod de lucru:
1. Autoclavul se umple cu apă distilată până la nivelul grătarului și se așază coșurile de sârmă cu
materialele de sterilizat. În prealabil, materialele se acoperă cu hârtie sau folie de aluminiu, pentru
ca apa rezultată din condensarea vaporilor să nu ude dopurile și astfel să conducă la o contaminare
ulterioară;
2. După închiderea etanșă a aparatului, se pornește sursa de căldură, având grijă ca supapa pentru
eliberarea aerului să fie deschisă. Deoarece amestecul vapori-aer la o presiune dată are o
temperatură mai mică decât cea a vaporilor de apă puri, aerul din interiorul autoclavului trebuie să
fie eliminat în prealabil, pentru o bună autoclavare;
3. Când vaporii ies din autoclav în jet continuu, supapa se închide și se așteaptă până la obținerea
presiunii dorite;
4. Când s-a atins presiunea corespunzătoare temperaturii dorite se reglează sursa de căldură pentru a
păstra această presiune constantă. Autoclavele moderne sunt prevăzute cu o supapă de siguranță
care se deschide în mod automat, asigurând astfel păstrarea constantă a presiunii în aparat;
5. Se asigură menținerea temperaturii dorite un anumit interval de timp;
6. După terminarea timpului de sterilizare, autoclavul se deschide numai după ce temperatura ajunge
la 70-80°C și presiunea la zero. Deschiderea aparatului înainte de scăderea completă a presiunii
poate fi periculoasă și, în plus, conduce la decompresie bruscă, fapt care poate provoca spargerea
sticlăriei, aruncarea dopurilor și proiectarea lichidelor din recipiente;
7. Se scot din aparat materialele supuse sterilizării.
Controlul eficienței sterilizării prin autoclavare, conform anexei nr 5 din Ordinul 961/2016 se
poate realiza prin mai multe metode:
- cu indicatorii fizico-chimici: virarea culorii la benzile adezive cu indicator fizico-chimic,
fixate pe exteriorul unui pachet supus sterilizării. Simpla virare a indicatorului fizico-chimic nu
garantează o sterilizare corectă, folosirea acestui indicator nefiind suficientă pentru un control
eficient al sterilizării.
- cu testul de verificare a penetrării aburului (testul Bowie & Dick): este un test foarte sensibil
folosit pentru evidențierea aerului rezidual periculos sau a gazelor inerte din camera de sterilizare.
Aerul rezidual sau gazele inerte pot periclita procesul de sterilizare. Evacuarea suficientă a
aerului/gazelor inerte este indicată prin schimbarea culorii uniforme, din albastru în verde foarte
închis a pachetului-test de unică folosință, Bowie & Dick. Testul Bowie & Dick este obligatoriu a
se folosi la sterilizarea la autoclav, alături de indicatorii fizico-chimici și biologici
- cu indicatorii biologici: stripuri impregnante sau fiole de plastic care conțin spori din familia
Bacillus stearothermophilus, de exemplu Geobacillus stearothermophilus și Bacillus atrophaeus.
Indicatorul biologic specific indică îndeplinirea tuturor condițiilor pentru efectuarea corectă a
sterilizării (temperatură, presiune, timp). Un ciclu de sterilizare corect se efectuează la temperaturi
de 121°-134° C.
De asemenea, reușita sterilizării prin autoclavare se verifică prin incubarea la termostat a
mediilor și lichidelor sterilizate, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore.
Utilizări
Metoda este aplicată la sterilizarea: tuturor substanțelor și obiectelor care nu se degradează la
temperaturi mai mari de 100°C: apa distilată, soluție fiziologică, ulei de parafină, medii de cultură,
medii contaminate, instrumente metalice, obiecte cu garnituri sau tuburi de cauciuc, obiecte din plastic
6
TITLU :
rezistent la temperatură (vârfurile de la micropipetă automată, pipetele Pasteur), membrane filtrante,

vată, tifon etc.
3.1.3. Sterilizarea cu ajutorul radiațiilor
Metoda se bazează pe acțiunea germicidă a radiațiilor ionizante sau neionizante, fiind utilizată
în special în sterilizarea suprafețelor și a încăperilor.
Radiațiile UV sunt radiații neionizante, cu efect maximum la lungimea de undă de 260 nm,
determinând distrugerea microorganismelor, prin reacții fotochimice primare și secundare pe care le
generează la nivelul substratului, concomitent cu alterarea structurii acizilor nucleici – ADN și ARN.
Radiațiile ultraviolete sunt nocive pentru formele vegetative, având o acțiune mai redusă asupra
sporilor. Lampa germicidă (lampa UV) este, de fapt, un tub din sticlă specială, în care descărcările
electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur la presiune joasă generează radiații ultraviolete. Se
folosește la sterilizarea suprafețelor și la reducerea încărcăturii microbiene a spațiilor de lucru.
Utilizări
Radiațiile UV (260 nm) sunt letale, dar au o putere scăzută de penetrare, motiv pentru care sunt
utilizate la sterilizarea aerului din laborator, a hotelor, a boxelor de lucru, a suprafețelor plane, a
meselor de lucru etc. În prezent, majoritatea laboratoarelor de microbiologie sunt dotate cu hotă cu
flux laminar (a se vedea Anexa 1), o incintă în care manipularea materialului biologic se realizează în
condiții de maximă siguranță și sterilitate. În această incintă, aerul este sterilizat cu ajutorul unei lămpi
UV și recirculat continuu cu ajutorul unor filtre speciale, de tip HEPA (High Efficiency Particulate Air
Filtres), în timp ce vaporii nocivi sunt îndepărtați cu ajutorul filtrelor din carbon activ sau de tip
HEPA.
Alte tipuri de radiații:
γ - sunt unde emise cu viteză și energie foarte mare, care produc radiații ionizante la nivelul
substratului. Sursă de radiații gamma sunt, în principal, izotopii de cobalt (Co60). Aceste radiații se
utilizează la sterilizarea la rece a sticlăriei, instrumentelor și mănușilor de unică folosință, a
pansamentelor, a firelor de sutură, a antibioticelor și a hormonilor etc.;
X - au efect mutagen și sunt rar utilizate în sterilizare;
α - au eficiență ridicată, dar o putere slabă de penetrare;
Neutronii - sunt agenți sterilizanți foarte eficienți, însă, din cauza costului foarte ridicat și a
radioactivității, sunt foarte puțin utilizați;
Electronii - au o putere de penetrare foarte slabă, dar se pot folosi pentru sterilizarea suprafețelor
netede.
3.1.4. Sterilizarea cu ultrasunete
Ultrasunetele sunt vibrații acustice, cu frecvență de peste 20 kHz și sunt utilizate în așa-numita
metodă de sonicare, care asigură o sterilizare completă. Sonicarea are la bază dezintegrarea rapidă a
celulelor microbiene, prin ruperea peretelui celular. Ultrasunetele sunt obținute în aparate speciale,
numite băi de sterilizare prin ultrasonare (a se vedea Anexa 1) și sunt generate prin trecerea unui
curent alternativ de frecvență înaltă printr-un cristal de cuarț, care generează vibrații.
Utilizări
Metoda se folosește la sterilizarea mediilor de cultură termolabile, a vaselor de laborator din
materiale plastice, a unor instrumente diverse.
7
TITLU :
3.1.5. Metode de sterilizare cu substanțe chimice
Sterilizarea (completă sau incompletă) cu substanțe chimice se practică în laboratoarele de

microbiologie pentru sterilizarea materialelor și a obiectelor întrebuințate sau infectate accidental.
Cele mai utilizate substanțe chimice, cu efect sterilizant, sunt: oxidul de etilenă, β-
propiolactona și formaldehida. Metoda este aplicată la sterilizarea, prin fumigație cu ajutorul unor
aparate speciale, a aerului din încăperi, a suprafețelor și aparatelor de dimensiuni mari, a unor
instrumente, pulberi, uleiuri, medicamente.
Dintre substanțele chimice cu efect dezinfectant, cele mai folosite sunt: detergenții, săpunurile,
halogenii, alcoolii, sublimatul coroziv etc.
3.1.5.1. Metode de sterilizare completă cu substanțe chimice
Sterilizarea cu oxid de etilenă

Oxidul de etilenă este un gaz, care poate distruge germenii, prin fixarea la proteinele celulare
din produsele termolabile. Este o metodă de sterilizare completă și se realizează la 54°C timp de 3-4
ore, sau la 38°C, timp 5-8 ore și o umiditate de 40-50%, într-o incintă de tip autoclav, adaptată special
acestui scop, în care se introduc produsele de sterilizat și oxidul de etilenă (în concentrație de 700
mg/L). Deşi oxidul de etilenă nu este coroziv, el este iritant şi extrem de toxic, de aceea instrumentele
sterilizate prin acest procedeu trebuie bine aerisite, pentru eliminarea gazului rezidual. Întrucât, în
stare pură, oxidul de etilenă este un gaz exploziv, de obicei se folosește în combinație cu dioxid de
carbon (80-90%) sau cu diclorofluorometan.
Utilizări
Metoda este utilă în chirurgie și în stomatologie, iar în microbiologie se folosește la sterilizarea
materialelor din plastic și a produselor termolabile: seringi, cutii Petri, pipete sau numai vârfuri de
pipete, anse de plastic etc.
În prezent, oxidul de etilenă este autorizat de către FDA (Food and Drug Administration), fiind
utilizat ca agent de afumare pentru condimente, folosit pentru conservarea produselor alimentare, în
concentrație de 700 ppm.
Sterilizarea cu β-propiolactonă (BPL)

β-propiolactona se aplică prin fumigație, în concentrații de 1-5 mg/L, la umiditate de 75-80%
și temperatura de 25°C, pentru sterilizarea completă a suprafețelor plane. BPL are o eficiență ridicată,
reușind să distrugă, în câteva minute, bacteriile și sporii acestora, însă puterea de penetrare este
scăzută, comparativ cu oxidul de etilenă.
Utilizări
Metoda este aplicată la sterilizarea camerelor de spital, a incintelor, etc. În soluție apoasă, BPL
poate fi utilizată pentru sterilizarea serurilor și a vaccinurilor.
8
TITLU :
3.1.5.2 Dezinfecția
Dezinfecția este o metodă de sterilizare incompletă. Dezinfectantele sunt substanțe chimice cu

efect germicid, care se aplică în mod obișnuit pe obiecte neanimate, în scopul distrugerii
microorganismelor contaminante.
Aprecierea estimativă a activității antimicrobiene a unei substanțe se realizează comparativ cu
cea a fenolului, considerat etalon.
Coeficientul fenolic (IF) este un indice, care exprimă puterea microbiocidă a unei substanțe
față de cea a fenolului, care are coeficientul fenolic 1, raportată la două specii de microorganisme-test:
Salmonella typhi și Staphylococcus aureus. Substanțele cu coeficienți fenolici mai mari de 1 au putere
antimicrobiană mai mare decât cea a fenolului și, implicit, și invers.
Utilizări
În laboratorul de microbiologie sunt folosite numeroase substanțe dezinfectante și produși cu
rol dublu, dezinfectant și antiseptic, dintre care cele mai importante sunt enumerate în cele ce
urmează:
Dezinfectanți care alterează permeabilitatea peretelui celular

• Detergenții și amoniul cuaternar: sunt substanțe tensioactive, care emulsifiază lipidele. Au efect
bun de curățire mecanică și o puternică acțiune germicidă, fiind utilizați la spălarea și curățarea
sticlăriei de laborator.
• Săpunurile: sunt săruri de sodiu sau de potasiu ale acizilor grași, care acționează prin emulsifierea
grăsimilor și îndepărtarea mecanică a murdăriei și, implicit, a germenilor.
• Fenolul şi derivatii fenolici (fenoli): derivati fenolici au activitate bactericidă, fungicidă (dar nu și
sporicidă), virulicidă slabă sau nulă. Folosirea dezinfectanților pe bază de fenol este limitată doar
pentru dezinfectia mediului (suprafeţe, aer). Nu este recomandată utilizarea fenolilor pentru
dezinfectia instrumentarului, din cauza corozivității şi nici utilizarea ca antiseptice, fiind toxici și
iritanti puternici ai pielii.
Dezinfectanți care denaturează proteinele (alcooli, acizi, alcali), dintre care cei mai utilizați sunt:
• Etanol (alcool etilic de 70%): este mai eficient, comparativ cu alcoolul dublu rafinat (96°
alcoolice), deoarece acționează mai lent, dar mai profund. Este utilizat la dezinfecția mâinilor, a
instrumentarului, etc.
• Izopropanolul (în soluție apoasă 70%) are eficiență similară cu a etanolului.
Ambele soluții sunt bactericide și fungicide, dar nu și sporicide.
9
TITLU :
Dezinfectanți care acționează asupra grupărilor active ale proteinelor

• Sublimatul coroziv (biclorura de mercur 1%): este o substanță dezinfectantă cu o mare putere
bactericidă (IF=827), dar toxică. În soluție apoasă de 5o/oo, are efect bactericid, folosindu-se la
dezinfectarea obiectelor. În soluție diluată 1:200.000 sau 1:100.000 are efect bacteriostatic și se
poate utiliza la dezinfecția mâinilor.
• Clorul (soluție apoasă și gazoasă) și cloraminele (IF=200): clorul sub formă gazoasă sau în
soluție apoasă este un agent dezinfectant eficient, dar nu și sub formă de sare (NaCl). Sub formă
gazoasă, clorul este toxic. Soluțiile apoase de clor sunt folosite la dezinfecția halatelor, a unor
obiecte de îmbrăcăminte, a încăperilor și suprafețelor, a apei potabile (1-3 mgo/oo), a apelor
reziduale, a grupurilor sanitare, a piscinelor etc. Hipocloritul de sodiu are o gamă largă de utilizări
și este un excelent agent dezinfectant / antimicrobian.
• Iodul: are efect bactericid, folosindu-se în soluție alcoolică (soluțiile farmaceutice conțin 2% iod
și sub 70% alcool) pentru dezinfecția rănilor ușoare.
• Fluorul: este eficient sub formă de fluorură de sodiu, fiind utilizat în produse destinate
dezinfecției cavității bucale (1-4 ppm). În concentrații mari, fluorul reprezintă o otravă.
• Borul (sub formă de perborat de sodiu): este dezinfectant lejer, utilizat și pentru mucoase.
• Permanganatul de potasiu (KMnO4): compus puternic oxidant utilizat în diluție de 1:1.000 -
1:5.000 are efect bactericid, folosit pentru răni ușoare.
• Apa oxigenată (H2O2): în concentrație de 3% are un efect bactericid.
• Amestecul sulfocromic: este un dezinfectant foarte puternic, utilizat în mod constant în laboratorul
de microbiologie la dezinfecția pipetelor și a lamelor contaminate.
• Formaldehida: are acțiune dublă, dezinfectantă și sterilizantă, fiind utilizată atât sub formă lichidă
(soluția de aldehidă formică 40%, numită formol), la dezinfecția suprafețelor de ciment, sticlă sau
faianță, cât și sub formă de aerosoli, la sterilizarea prin fumigație a încăperilor. La o concentrație
de 3,8%, formaldehida are efect letal pentru formele vegetative și de rezistență. La prepararea
vaccinurilor se folosește formaldehidă în concentrație de 0,04-0,1%.
3.1.6. Metode de separare (eliminare mecanică)
3.1.6.1. Filtrarea sterilizantă
Filtrarea sterilizantă constă în trecerea aerului sau a substanțelor printr-un filtru sau o
membrană filtrantă, cu pori de dimensiuni foarte mici, care rețin toate microorganismele.
Există două categorii de filtre sterilizante:
Membrane filtrante care lucrează în profunzime - rețin microorganismele în toată grosimea
membranei și sunt confecționate din materiale fibroase (azbest, celuloză, fibre de sticlă, vată, etc.) sau
din materiale tasate artificial (caolin poros, sticlă sinterizată).
Principalele filtre utilizate în microbiologie sunt:

 Filtrele Chamberland: sunt confecționate din porțelan și sunt notate cu L (din care doar L5-L7
rețin toate bacteriile, cu excepția rickettsiilor);
10
TITLU :
 Filtre Berkefeld: sunt confecționate din pământ de infuzorii și sunt notate în funcție de porozitatea
lor cu V, N și W. Dezavantajul acestor filtre este imposibilitatea de sterilizare și refolosire, din
cauza fragilității lor;
 Filtre din sticlă poroasă: sunt notate cu G (G0-G5), în funcție de porozitate. Exemplu: filtrele G5
sunt confecționate din granule de sticlă cu porozitatea de 0,1-1,5 µm și sunt sterilizante.
Avantajele acestui tip de filtre: rezistă la agenții fizici si chimici; nu modifică pH-ul mediului
filtrat; pot fi refolosite de mai multe ori (după curățarea și sterilizarea lor), cu condiția de a se
lucra cu grijă pentru a evita fisurarea lor;
 Filtrele Seitz: sunt confecționate din azbest amalgamat cu celuloză și pot avea efect clarifiant,
adică de limpezire a unui lichid (notate EK) sau sterilizant (notate EKS).
Utilizări: în industria alimentară (vinuri, sucuri, bere etc.), chimico-farmaceutică (seruri,
vaccinuri, medicamente).
Membrane filtrante tip „ecran”, care rețin particulele și germenii la suprafața lor, sunt
confecționate din polimeri de celuloză. Porozitatea lor poate fi cuprinsă între 0,01 µm și 8 µm.
Un astfel de exemplu îl constituie membranele filtrante Millipore, care au porozități cuprinse
între 0,025 µm și 1 µm și sunt alcătuite din acetat de celuloză. Majoritatea bacteriilor pot fi reținute cu
ajutorul membranelor cu pori de Ø=0,22 µm, în timp ce pentru drojdii sunt necesare membrane cu pori
de Ø=0,45 µm.
Un sistem de filtrare (figura 3.1) este alcătuit dintr-o pâlnie din sticlă gradată sau simplă și o
membrană filtrantă sterilă care se așază pe un suport de susținere a membranei. Suportul membranei se
cuplează la un balon de colectare (balon Kitasato) prin intermediul unui dop de cauciuc sau cu ajutorul
unei cleme de prindere. Pentru ca filtrarea să se realizeze eficient și rapid, întregul sistem este cuplat la
o pompă de vid.
În vederea executării unei filtrări corecte, este necesar să se respecte următoarele reguli:
 Înainte de începerea filtrării, sticlăria folosită și membranele filtrante se sterilizează separat, prin
autoclavare la 115°C timp de 20 minute;
 Sistemul de filtrare se montează corect, în condiții aseptice, în apropierea flăcării becului de gaz;
 Se conectează balonul de recoltare la pompa de vid;
 La început, presiunea exercitată la filtrare este mică (100-200 mmHg) și va fi crescută treptat,
dar numai până la 400 mmHg, pentru a evita deformarea porilor sau ruperea membranei filtrante,
la presiuni mai mari;
 Timpul de filtrare nu trebuie să depășească 30 minute, deoarece pot fi antrenate prin filtru și
bacteriile mici sau cele foarte mobile;
 Se va evita alternanța de presiune normală și compresiune, care poate afecta capacitatea filtrului
de a reține bacteriile;
 Lichidul filtrat se recoltează în condiții aseptice.
11
TITLU :
Figura 3.1. Sistem de filtrare

A - părțile componente ale unui sistem de filtrare Millipore dezasamblat; B - grăbirea filtrării prin crearea de
vid cu ajutorul pompei de vid (prelucrare după http://georges.dolisi.free.fr/Microbio/TP/Millipore.html)
Pentru sterilizarea unei cantități mici de lichid, sunt mai utile membranele filtrante montate
într-un suport de polipropilenă (filtre Whatman Polydisc) (figura 3.2), care sunt livrate în ambalaje
sterile și pot fi adaptate la seringi.
Figura 3.2. Filtre Whatman Polydisc
Controlul eficienței sterilizării

Lichidul filtrat poate fi controlat prin incubare la termostat la 28-37°C, timp de 24-48 ore.
Utilizări
Această metodă este aplicată pentru: sterilizarea mediilor de cultură lichide sau a soluțiilor care
conțin substanțe termolabile (exemplu: soluții de antibiotice, glucide, vitamine, ser, a medii de cultură
ce conțin lapte, mediu cu must); sterilizarea unor reactivi; examenul de rutină al apei sau al laptelui;
12
TITLU :
izolarea microorganismelor din produse sărace în microorganisme; determinarea numărului

microorganismelor la unitatea de volum filtrată, concentrarea unui număr redus de microorganisme
dintr-un produs lichid.
Pentru decontaminarea bacteriană și fungică a aerului se utilizează aparate speciale care
combină mai multe metode de sterilizare: iradierea cu raze UV, ozonizarea și filtrarea aerului prin
filtre HEPA.
3.1.6.2. Centrifugarea
Centrifugarea este o tehnică rapidă și eficientă de separare a microorganismelor de lichidele în

care sunt suspendate, sau a unor substanțe cu densități diferite, cu ajutorul forței centrifuge, care este
mult mai mare decât cea gravitațională, accelerând sedimentarea. Forța gravitațională este un
parametru de construcție caracteristic fiecărei centrifugi, care se exprimă în unități gravitaționale (g)
sau rotații per minut (rpm).
Pentru a accelera procesul de separare a microorganismelor, se folosesc centrifuga și
ultracentrifuga. Centrifugele moderne (a se vedea Anexa 1), denumite și „unghiulare”, asigură o
poziție fixă a tuburilor de centrifugă, la un unghi de 45°, care permite o separare mai bună a
particulelor, dar și o diminuare a încălzirii tuburilor, datorită frecării cu aerul în timpul centrifugării.
Mod de lucru:
1. Tuburile de centrifugă conținând proba de analizat, care au greutate egală, sunt așezate diametral
opus în rotorul centrifugei;
2. Se reglează turația și timpul de centrifugare, în conformitate cu valorile dorite;
3. La sfârșitul centrifugării, capacul se va deschide numai după oprirea completă a rotorului.
4. După centrifugare, partea care a sedimentat se numește sediment, iar partea limpede se numește
supernatant.
Viteza de sedimentare a particulelor la centrifugare depinde de o serie de factori:
 Mărimea particulelor de sedimentat: cu cât particulele sunt mai mici, cu atât forța centrifugală și
durata centrifugării trebuie să fie mai mari;
Exemple: fungii (drojdiile și mucegaiurile) sedimentează la minimum 1.000-2.000 rpm, bacteriile la
2.000-4.000 rpm, iar virusurile la 50.000 – 150.000 rpm;
 Vâscozitatea mediului: cu cât vâscozitatea mediului este mai mare, cu atât sedimentarea este mai
dificilă (este necesar ca forța centrifugală și durata centrifugării să fie mai mari);
Exemplu: microorganismele dintr-un suc sedimentează mai ușor față de cele din lapte (fiind mediu
bogat în proteine, grăsimi).
Utilizări
− Limpezirea unor lichide sau medii de cultură;
− Concentrarea unor lichide sărace în microorganisme;
− Separarea unor microorganisme de dimensiuni diferite.
13
TITLU :
3.1.7. Metode de inhibare a activității microbiene
Antisepsia reprezintă ansamblul de procedee prin care sunt inhibate activitatea și multiplicarea
microorganismelor pentru o anumită perioadă de timp și se realizează prin metode fizice sau chimice.
O substanță chimică sau un procedeu fizic pot fi încadrate în categoria bacteriostaticilor sau
fungistaticilor, dacă bacteriile sau fungii își pot relua activitatea vitală la mai puțin de o oră de la
dispariția sau încetarea acțiunii agentului.
Principalele metode de inhibare a activității microbiene sunt:
Refrigerarea / Congelarea: temperatura scăzută (în frigider la 4°C și în congelator la -20°C)
determină inhibarea dezvoltării microorganismelor pentru un timp limitat.
Utilizări: păstrarea alimentelor, păstrarea microorganismelor pentru o perioadă determinată.
Deshidratarea: dezvoltarea microorganismelor este inhibată în medii cu conținut scăzut de apă.
Utilizări: păstrarea prin uscare a fructelor, a legumelor, a mezelurilor, etc.
Desicarea: procedeu de uscare sub vid, în exicator, a tulpinilor microbiene.
Utilizări: conservarea microorganismelor.
Liofilizarea: tehnică de uscare sub vid, a suspensiilor congelate în prealabil, realizată în
liofilizator.
Utilizări: conservarea timp îndelungat a tulpinilor microbiene.
Creșterea presiunii osmotice din celulă prin supraconcentrarea mediului: prin adaos de glucide
(în siropuri, dulcețuri) sau de sare.
Utilizări: conservarea fructelor, a legumelor, a cărnii, a peștelui, etc.
Folosirea agenților microbiostatici: principalele categorii de agenți microbiostatici:
- antibiotice și agenți chemoterapeutici sintetici, cu spectru specific de acțiune;
- coloranți (violet de gențiană, albastru de metilen, verde malachit);
- conservanți (acid benzoic sau acid acetic);
- dezinfectanți diluați.
Utilizări: în medicină, în industria alimentară, în cosmetică.
3.1.8. Factorii care influențează eficiența sterilizării și dezinfecției
Alegerea metodei de dezinfecție sau de sterilizare trebuie să țină cont de următoarele:

 caracteristicile microorganismelor: microorganismele sunt constituite din substanțe organice
complexe (majoritatea proteine), pot fi înconjurate de substanțe protectoare sau pot să producă
forme de rezistență (spori). Bacteriile nesporulante pot fi distruse prin fierbere timp de 5-10
minute. În schimb, bacteriile sporulante și sporii acestora sunt eliminate prin sterilizare cu aer
uscat (180°C timp de 1 oră), cu căldură umedă (în general la 121°C, timp de 15-20 minute),
dar și prin sterilizare cu substanțe chimice (oxid de etilenă sau β-propiolactonă, formol), atunci
când tratamentele termice nu se pretează. Formarea de biofilm (un strat subţire de
microorganisme, care aderă și se fixează puternic pe suprafeţe) determină rezistența la unele
substanţe biocide;
 în funcție de natura chimică, agentul utilizat poate să prezinte efect microbiostatic sau
microbiocid. Exemple: clorul sub formă de sare (NaCl) are efect microbiostatic, însă compușii
care eliberează clor (exemplu hipoclorți, cloramine etc.) au efect dezinfectant. Formaldehida
sub formă lichidă are acțiune dezinfectantă, însă sub formă de aerosoli are efect sterilizant.
14
TITLU :
Acizii și bazele tari au acțiune bactericidă ridicată, însă efectul lor coroziv limitează utilizarea
lor;
 alegerea agentului utilizat: este recomandată folosirea dezinfectanților necoagulanți în cazul
materiei organice (sânge, ser, etc.). Grăsimile împiedică acțiunea dezinfectantului, prin urmare
este necesară o spălare și o degresare prealabilă a obiectelor;
 gradul de periculozitate a agenților chimici (toxic, nociv, coroziv, iritant, oxidant, sau
inflamabil) impune cunoașterea efectelor nedorite asupra instrumentarului, a obiectelor și a
suprafețelor supuse dezinfecției sau sterilizării, precum și asupra țesuturilor vii;
 respectarea dozelor și concentrațiilor de administrare: produsele dezinfectante sunt de obicei
concentrate, ceea ce necesită efectuarea de diluții; este de preferat ca soluția respectivă să se
prepare în cantitatea strict necesară și să se utilizeze imediat. De asemenea, este importantă
respectarea întocmai a indicațiilor de utilizare de pe eticheta produsului dezinfectant;
 timpul de contact: timpul necesar pentru inactivarea sau distrugerea microorganismelor
depinde de tipul microorganismului şi de procesul ales;
 temperatura: sterilizarea cu căldura umedă, sub formă de vapori de apă sub presiune, distruge
microorganismele prin denaturarea proteinelor acestora. Căldura uscată din etuvă distruge
microorganismele prin procesul de oxidare, care este mult mai lent. În unele cazuri, eficiența
unui tratament chimic crește odată cu temperatura, ca urmare a diminuării tensiunii superficiale
și a sporirii energiei cinetice a moleculelor;
 susceptibilitatea dezinfectanților chimici de a fi neutralizați de diferite substanțe organice: în
cazul acesta se impune creșterea dozei de germicid.
15
TITLU :
4. MEDII DE CULTURĂ
4.1. Noțiuni generale

Mediul de cultură (mediul nutritiv) reprezintă orice substrat (lichid sau solid, organic sau
anorganic), obținut prin amestecarea mai multor substanțe cu proprietăți și compoziție specifice, ce
poate asigura dezvoltarea și multiplicarea microorganismelor, în afara mediului lor natural (a se
vedea Anexa 3).
Mediile nutritive sunt utilizate la izolarea, creșterea, înmulțirea și conservarea timp îndelungat
a microorganismelor, precum și pentru studierea proprietăților lor (caractere de cultură, proprietăți
biochimice), în vederea identificării taxonomice.
Pentru ca microorganismele să se poate dezvolta, mediile de cultură trebuie să îndeplinească
următoarele condiții:
 Să asigure microorganismelor cultivate cantitățile optime de apă și de substanțe nutritive specifice,
care pot avea rol de sursă de carbon și de energie, sursă de azot, săruri minerale sau factori de creștere
(tabel 4.1).
 sursa de carbon și de energie este necesară reacțiilor de biosinteză, creșterii și multiplicării
microorganismelor; este reprezentată de compuși organici și anorganici:
1. monozaharide (arabinoză, glucoză sau dextroză, fructoză, galactoză, manoză, ramnoză,
xiloză);
2. di- şi oligozaharide (celobioză, lactoză, maltoză, rafinoză, trehaloză, zaharoză sau
sucroză);
3. polizaharide (amidon, celuloză, chitină, glicogen etc.);
4. acizi organici (citric, oxalic, tartric etc.);
5. lipide.
 sursa de azot este necesară biosintezei de proteine și de acizi nucleici; microorganismele
utilizează surse de azot organic și anorganic:
1. substanţe anorganice azotate (nitraţi, nitriţi, săruri de amoniu);
2. peptide şi proteine (peptonă, hidrolizat de cazeină, gelatină, keratină, ovalbumină);
3. aminoacizi (glicină, glutamină, histidină, triptofan, etc.);
4. uree.
 sărurile minerale sunt necesare în cantități mici și au rolul de a menține echilibrul ionic al
celulei:
- substanţe minerale (sub formă de săruri care să conţină Na, K, Mg, Ca, Fe, Cu, Zn, Co, P,
S, etc.).
 factorii de creștere sunt necesari în cantități mici acelor tulpini microbiene, numite tulpini
auxotrofe, care sunt incapabile sa îi sintetizeze, pornind de la substanțele cu rol de sursă de carbon
sau azot:
1. vitamine (tiamină, acid nicotinic, inozitol etc.);
2. acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (12-24 atomi de C), necesari pentru
dezvoltarea drojdiilor lipodependente.
Aceste substanțe trebuie să corespundă indicațiilor tehnice, să fie cântărite exact și să fie
introduse în ordinea indicată în compoziția mediului respectiv. De asemenea, sterilizarea nu trebuie să
altereze compoziția mediului; mediul trebuie să rămână steril până în momentul însămânțării.
 Să ofere condiții optime de aerobioză sau de anaerobioză corespunzătoare microorganismului de
analizat;
16
TITLU :
 Să asigure un grad de umiditate optim microorganismului cultivat;

 Să aibă un anumit grad de alcalinitate sau aciditate, corespunzător necesităților microorganismului
cultivat;
 Să fie repartizat în recipiente, care să asigure menținerea sterilității și protecția față de lumină;
 Să fie cât mai limpede, pentru a permite studierea cât mai facilă a caracterelor microorganismului
aflat în cultură.
Tabel 4.1. Ingrediente utilizate frecvent în prepararea mediilor nutritive

Ingrediente Obținere Compoziție/Utilizare
Peptonă Prin hidroliza cărnii cu ajutorul Proteine cu greutate moleculară mare
pepsică pepsinei conținute de mucoasa
gastrică de porc, la 45-55ºC și la
pH acid = 1,7-2,2
Peptonă Prin acțiunea tripsinei extrase la 37- Amestec de oligolipide și aminoacizi (în
tripsică 40ºC și la pH = 7-8, timp de 12-24 proporție mai mică decât în peptona pepsică)
ore
Peptonă Prin acțiunea pancreatinei Amestec de oligolipide și aminoacizi
pancreatică (tripsină+lipază+amilază)
Peptonă Din soia Conținut ridicat de vitamine și aminoacizi;
papainică de pentru cultivarea fungilor și germenilor
soia pretențioși; nu se recomandă pentru studiul
fermentației
Sânge Se recoltează în condiții aseptice de Se poate păstra la frigider la 4°C timp de 2-3
la animale sănătoase (berbec, cal, săptămâni; se adaugă ca ingredient, în
iepure), într-un balon cu perle de proporție de 5-10 %, într-un mediu agarizat
sticlă pentru defibrinare (lichefiat în prealabil și răcit la 45-50ºC)
Ser Prin decantarea sângelui defibrinat Se folosește ca ingredient de îmbogățire a unor
și apoi sterilizare prin filtrare sau medii de cultură
tindalizare timp de 5-8 zile
Bilă de bou Prin puncție, din vezica biliară și Are acțiune selectivă față de Salmonella sp.
apoi sterilizare la 100ºC, timp de
30 minute, 3 zile consecutive
Gelatină Prin hidroliza colagenului din os și Este agent solidificator al mediilor de cultură
piele
Agar Extras din algele marine Este agent solidificator al mediilor de cultură
(se adaugă 1,5-2 %)
Extract de Prin cultivarea controlată a Reprezintă o sursă importantă de aminoacizi și
drojdie drojdiilor vitamine; studiul drojdiilor și bacteriilor
De porumb Cultivarea bacteriilor și ciupercilor fitopatogene
Extracte
De fasole Cultivarea bacteriilor din genul Rhizobium
vegetale
De cartof Cultivarea mucegaiurilor
Extract de Prin deshidratarea decoctului de Reprezintă o sursă de azot (conține cantități
carne carne de vită importante de creatină, xantină, hipoxantină,
uree, glicocol, acid uric, glutamină, acid
adenilic) dar și sursă de carbon (acid lactic,
glicogen, hexozofosfați); permite studierea în
principal a bacteriilor
17
TITLU :
În practica curentă din laboratoarele de microbiologie, se utilizează medii multitest de

identificare (de exemplu galeriile API), ce sunt medii de cultură deshidratate, cu o compoziție chimică
bine definită (a se vedea subcapitolul 9.7.7.1).
Compozițiile principalelor medii de cultură utilizate în laboratoarele de microbiologie sunt
prezentate în Anexa 3.
În prezent, majoritatea laboratoarelor folosesc medii deshidratate, care, pentru pregătirea lor,
necesită numai adăugarea de apă distilată, conform rețetei fiecărui mediu. Compoziția mediilor
deshidratate variază în funcție de nomenclatorul fiecărui producător, dar există echivalențe între
mediile de cultură a principalelor firme producătoare din acest domeniu. Temperatura și timpul de
sterilizare trebuie respectate conform recomandărilor producătorilor. De asemenea, sunt
comercializate medii repartizate în plăci sau în eprubete, gata de a fi utilizate în experimente.
4.2. Pregătirea şi sterilizarea mediilor

Prepararea mediilor este o etapă extrem de importantă, care condiţionează creșterea și
multiplicarea, precum și exprimarea fenotipică a tuturor caracterelor culturale ale microorganismelor.
Calitatea ingredientelor și modul de solubilizare a acestora, succesiunea adăugării lor, ajustarea pH-
ului, repartizarea mediilor în vederea sterilizării și metoda de sterilizare aplicată sunt factori importanți
în reușita unui experiment.
În prepararea unui mediu de cultură se parcurg următoarele etape:
1. Cântărirea ingredientelor (conform rețetei) cu ajutorul balanței analitice și farmaceutice, dizolvarea
completă și omogenizarea acestora în jumătate din cantitatea de apă, apoi adăugarea restului de apă
până la volumul dorit. În unele cazuri, substanțele se dizolvă prin încălzire.
2. Determinarea pH-ului și corectarea acestuia, în funcție de specia ce urmează a fi cultivată; pH-ul se
poate determina prin:
o metoda colorimetrică (cu ajutorul substanțelor-indicator: albastru de bromtimol, metil-oranj,
roșu de metil, fenolftaleină) sau hârtia de pH (impregnată cu indicatori de diferite culori):
o metoda electrometrică, utilizând pH-metrul (măsoară diferența de potențial electric generat
de diferența de concentrație a ionilor de hidrogen dintre cei doi electrozi).
3. Filtrarea mediului de cultură pentru a îndepărta eventualele precipitate și recorectarea pH-ului (dacă
este cazul);
4. Sterilizarea se realizează în funcție de compoziția mediului, pentru evitarea degradării anumitor
componente. Majoritatea mediilor de cultură se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15-
20 de minute. În cazul mediilor ce conțin zaharuri, sterilizarea se realizează prin autoclavare la
110°C, timp de 10-15 minute sau prin filtrare sterilizantă; soluțiile conținând glucide se pot
introduce separat, prin filtrare, cu ajutorul filtrelor Puradisc. În cazul mediilor conținând substanțe
termolabile (ser, sânge, lapte, must, vitamine, etc.), sterilizarea se realizează prin tindalizare sau
prin filtrare sterilizantă;
5. Reajustarea pH-ului, dacă este cazul (după autoclavare, pH-ul poate scădea cu aproximativ 0,3
unități);
6. Repartizarea mediului nutritiv în recipiente sterile (eprubete, tuburi Weinberg, tuburi Roux, baloane
Erlenmeyer sau plăci Petri) se face în apropierea becului de gaz sau în hota cu flux laminar, în
condiții aseptice, dar numai după ce mediul a fost deja sterilizat. Mediul de cultură steril poate fi
păstrat câteva săptămâni, la 4°C.
7. Înainte de folosirea mediilor, controlul sterilității se realizează prin incubare la temperatura de 28-
37°C, timp de 24 de ore.
18
TITLU :
4.3. Clasificarea mediilor de cultură
Diversitatea compoziției mediilor de cultură impune realizarea unei clasificări care să țină cont
de mai multe criterii, după cum urmează:
1. După proveniență
 Medii naturale, care conțin produse de origine:
 vegetală (fragmente de tulpină, must de malț, tuberculi, rădăcini, etc.);
 animală (bilă, lapte etc).
 Medii artificiale sau sintetice, care conțin ingrediente cu compoziție chimică nedeterminată sau
definită (exemple: mediile Czapek-Dox, M.R.S. (Man-Rogosa și Sharpe), MacConkey, Sabouraud
etc.).
2. După consistență
 Medii lichide;
 Medii semisolide: sunt medii cu 0,2-0,6% agar;
 Medii solide - se subclasifică în:
• Medii solide propriu-zise, care prin însăși compoziția lor sunt în stare solidă, (exemple: cele
preparate din semințe, fragmente de tulpină, tuberculi, rădăcini, etc);
• Medii solidificate cu ajutorul gelatinei, silicagelului sau agarului; agarul este cel mai utilizat
agent de solidificare a mediilor, deoarece nu este metabolizat de către microorganisme, nu
modifică pH-ul mediului și are proprietatea că la 40°C se prezintă sub formă de gel, iar la
100°C sub formă lichidă.
3. După compoziție
 Medii minimale: utilizate la cultivarea microorganismelor cu necesități nutriționale scăzute;
 Medii complexe: folosite la cultivarea și conservarea microorganismelor care necesită numeroși
factori de creștere (în această categorie intră majoritatea mediilor de cultivare a patogenilor):
 solidificate: geloză-sânge, geloză-ser;
 lichide: bulion-sânge, bulion-ser.
4. După scopul utilizării

 Medii uzuale simple: folosite în mod curent pentru cultivarea unui număr mare de
microorganisme. Exemple: bulion nutritiv, apă peptonată, geloză simplă, agar cu tripticază din
soia);
 Medii speciale, care, prin compoziția lor complexă, permit creșterea preferențială a unor anumite
specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme, sau punerea în evidență a anumitor
caractere metabolice ale microorganismelor:
♦ Mediile de îmbogățire: favorizează dezvoltarea unei specii de microorganisme dintr-un amestec
19
TITLU :
heterogen, în care numărul germenilor este redus; nu conțin substanțe bacteriostatice, dar,
prin compoziția lor, asigură condiții preferențiale de creștere pentru anumite specii bacteriene
(tratamentele termice, pH-ul mediului, anumite substanțe nutritive), care se pot înmulți și
dezvolta mai rapid decât alte specii (exemplu: mediul cu ou Löwenstein favorizează
dezvoltarea speciei de Mycobacterium tuberculosis);
♦ Mediile selective: conțin unul sau mai mulți agenți inhibitori (coloranți, antibiotice, săruri
biliare etc.), pentru a limita multiplicarea anumitor microorganisme dintr-un amestec și
pentru a favoriza creșterea altor specii microbiene, față de care agenții inhibitori respectivi nu
au efect. Unele medii (cunoscute ca medii cromogene) conțin anumite substraturi artificiale,
care sunt hidrolizate de către enzimele bacteriene, cu producere de compuși colorați.
Exemple: un mediu ce conține cristal violet (1:500.000) sau penicilină (50 UI/mL mediu)
inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive. Azida de sodiu și teluritul de potasiu inhibă
creșterea bacteriilor Gram-negative și permit dezvoltarea celor Gram-pozitive. Sărurile
biliare inhibă microorganismele, cu excepția bacteriilor coliforme;
♦ Mediile elective: nu conțin inhibitori, dar, prin compoziția lor specifică, satisfac necesitățile
minime ale unei anumite specii microbiene. Exemplu: mediul Loeffler este folosit pentru
izolarea speciei de Corynebacterium diphteriae;
♦ Mediile de conservare sau de menținere: sunt destinate conservării timp îndelungat a
microorganismelor. Ele trebuie să asigure o bună viabilitate a microorganismelor cultivate
pentru un timp mai îndelungat. Exemple: mediul geloză simplă pentru bacterii, mediul YPG
(Yeast Peptone Glucose) pentru drojdii și mediile Sabouraud, Czapek-Dox, PDA (Potato
Dextrose Agar) pentru fungi;
♦ Mediile de transport: permit supraviețuirea tulpinilor microbiene ce nu pot fi însămânțate
imediat după recoltare. Exemplu: mediul Carry-Blair pentru vibrionul holerei;
♦ Mediile de diagnostic preferențial: prin compoziția lor, evidențiază anumite particularități
metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme. Exemple: speciile de drojdii care
fermentează substratul glucidic se recunosc prin acidifierea mediului, evidențiată cu ajutorul
unei substanțe-indicator de pH și prin producerea de gaz. Pe geloza MacConkey (conține
lactoză și roșu neutru), coloniile unor specii care fermentează lactoza se coloreză în roșu sau
roz. Ele se diferențiază de cele care nu fermentează lactoza și rămân necolorate.
5. După prezența sau absența oxigenului

 Medii pentru cultivarea microorganismelor aerobe;
 Medii pentru cultivarea microorganismelor anaerobe:
• pot avea aceeași compoziție ca și mediile pentru microorganismele aerobe, dar li se adaugă
substanțe cu efect reducător (acid ascorbic, cisteină, fragmente proaspete de organe vegetale
(boabe de orez în curs de germinare, boabe de strugure) sau animale (fragmente de ficat, splină);
• pentru eliminarea aerului dizolvat în ele, mediile din această categorie trebuie fierte înainte de
însămânțare;
• pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii lichide, după însămânțare se adaugă la
suprafață un strat de ulei de parafină;
• pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii solide, acestea se repartizează în
coloană, pentru a evita difuzia oxigenului.
20
TITLU :
5. PRELEVAREA ȘI PREPARAREA PROBELOR PENTRU TESTAREA

MICROBIOLOGICĂ
5.1. Prelevarea probelor
Orice probă, destinată testării microbiologice, trebuie să îndeplinească anumite condiții:

• Proba trebuie să prezinte caracteristicile generale ale lotului din care a fost prelevată, motiv pentru
care aceasta trebuie prelevată atât din profunzime, cât și de la suprafață;
• Stabilirea punctelor de prelevare a probelor se face în funcție de configurația lotului, recoltând în
zig-zag, în diagonală, sau în alte moduri, care să asigure uniformitatea recoltării (figura 5.1).
Figura 5.1. Mod de recoltare a probelor în zig-zag (A) sau în diagonală (B)
(sursa www.alcedoltd.ro)
• Prelevarea trebuie să se facă în condiții aseptice, în apropierea flăcării unei spirtiere, în recipienți și
cu ustensile sterile (care pot fi flambate pe loc, sau sunt sterilizate în prealabil prin autoclavare:
bisturie, scalpele, pense, spatule din inox);
• Etichetarea corectă a probei permite identificarea ușoară a acesteia. În unele cazuri, se completează
o fișă de prelevare în care trebuie precizate următoarele: lotul din care a fost prelevată, locul, data,
numărul probei, precum și alte caracteristici particulare utile testării microbiologice;
• Transportul probelor în recipiente izoterme și depozitarea acestora în frigider (0-4°C) au ca scop
conservarea tuturor caracteristicilor probei, în principal a microflorei prezente în produs, la
momentul recoltării probei (atât din punct de vedere calitativ cât și cantitativ), până la efectuarea
analizelor ce se impun (cât mai rapid posibil).
În continuare, sunt prezentate câteva exemple referitoare la modul în care se poate face
recoltarea probelor.
• Prelevarea probelor de sol:
− se face în fiole de sticlă, sau altfel de recipiente cu închidere ermetică (inclusiv pungi) sterile;
− se folosesc spatule, care se flambează, la flacăra unei spirtiere, în momentul recoltării probei,
atunci când proba provine de la mică adâncime sau sonde special destinate extragerii de la
diferite adâncimi (figura 5.2).
21
TITLU :
Figura 5.2. Sonde destinate prelevării probelor de sol

(sursa www.multilab.ro)
• Prelevarea probelor de apă:

 Din rețeaua de apă potabilă (de la robinet):
− se folosesc sticle de 100-150 mL, cu dop rodat sau de cauciuc, sterile;
− se deschide robinetul şi se lasă să curgă apa în jet puternic, timp de 5-10 minute, după care se
închide robinetul şi se flambează;
− se deschide din nou robinetul şi se reglează debitul apei, astfel încât să se formeze o coloană de
apă continuă cu diametrul de maximum 1 cm;
− se scoate dopul flaconului, se aşază vertical sub coloana de apă, se umple şi se acoperă cu dopul;
 Din râuri, lacuri, bazine, de acumulare sau alte surse de adâncime:
− se folosesc recipiente speciale, fixate pe tije sau prevăzute cu dispozitive de scufundare (figura
5.3).
Pentru analiza microbiologică, probele de apă recoltate vor avea un volum de minimum 500
mL, iar flacoanele vor fi umplute până la aproximativ 2 cm sub dop.
Figura 5.3. Sonde de prelevare manuală/automată a apelor de suprafață și subterane/de adâncime

22
TITLU :
 Analiza aerului (determinarea aeroflorei):

Are drept scop îndeplinirea şi realizarea criteriilor de igienă şi a criteriilor de siguranţă a
alimentelor din diverse spaţii de procesare, transport şi comercializare, destinate industriei alimentare,
farmaceutice, localurilor publice și mediului spitalicesc.
O metodă clasică cu minimum de dotare o reprezintă metoda Koch. Această metodă constă în
expunerea la aer, timp de 10 minute, a unor cutii Petri conținând mediu nutritiv și astfel, colectarea, pe
suprafața acestuia, a particulelor microbiene, care se depun gravitațional, urmată de incubarea
materialului. În funcție de dimensiunile încăperii, numărul cutiilor Petri utilizate poate să varieze între
7 și 12. Plăcile se aşază astfel:
- repartizarea lor în încăpere trebuie să fie cât mai uniformă;
- la o distanță de 1-1,5 m față de pereți și de 2 m unele față de altele;
- în încăperile de lucru, la nivelul suprafeţelor de lucru;
- în depozite: la înălţimea de 0,8 – 1,0 m.
După 10 minute, plăcile se acoperă cu capacele lor și se incubează la 37°C, timp de 48 de ore).
În prezent, se folosesc tot mai des aparate care aspiră un volum determinat de aer din incinta de
analizat pe suprafața unui mediu de cultură solid care, după incubare, va face posibilă aprecierea
numărului de unități formatoare de colonii (UFC), adică a germenilor viabili din volumul de aer
aspirat (figura 5.4).
Figura 5.4. Aparat pentru prelevarea probelor de aer

 Prelevarea probelor de lichide, solide și pulberi industriale:

Activitățile industriale îmbracă forme foarte variate, iar volumul produselor (materii prime și
finite) care trebuie controlat, este foarte mare, motiv pentru care, în prezent, tehnicile de prelevare
a eșantioanelor destinate controlului sunt extrem de performante și foarte bine adaptate situațiilor
(figura 5.5).
Figura 5.5. Instrumente pentru recoltarea probelor lichide, solide și pulberi industriale (sursa
www.multilab.ro)
23
TITLU :
 Prelevarea probelor pentru determinarea microflorei de pe fructe sau de pe legume:

Se recoltează fructele de analizat în pungi de plastic sterile, se trec apoi în baloane cu apă distilată
sterilă, fie întregi, fie bucăți, în cazul celor mai mari. Prin agitarea lor în balon, microorganismele
trec în apa distilată din balon, din ea urmând a se recolta probe, în fiole sterile, cu ajutorul unor
pipete sterile;
 Prelevarea produselor patologice (secreții și exudate, sânge, urină, materii fecale, etc.) se
realizează conform unor tehnici care presupun anumite reguli stricte pentru fiecare categorie de
produs în parte și o anumită pregătire medicală:
o prelevarea unei probe provenind din organe sau din țesuturi:
- cauterizarea suprafeței organului cu o spatulă, special destinată acestui scop;
- aspirarea lichidului cu o pipetă Pasteur sterilă, înțepând ușor organul de analizat;
- însămânțarea probei pe un mediu de cultură adecvat, steril, prin una dintre metodele prezentate
mai sus;
o prelevarea unor probe din produse patologice fluide:
- recoltarea sângelui cu o pipetă Pasteur, prin puncții cu instrumente (ace, seringi) sterile, la
nivelul cordului pentru animalele mici sau prin puncții venoase la cele mari;
- recoltarea exudatelor (puroi, lichid pleural, peritoneal etc) cu acul sau pipeta Pasteur prin
puncții sterile ale cavității respective;
- recoltarea secrețiilor și excrețiilor cu sonde sterile;
- însămânțarea probelor pe medii de cultură adecvate, sterile, prin una dintre metodele prezentate
mai sus;
o prelevarea unei probe provenind de pe suprafața mucoaselor:
- recoltarea cu tampoane sterile, urmând însămânțarea directă cu tamponul pe suprafața mediului
sau diluarea probei într-un lichid diluant (soluție fiziologică sterilă, apă peptonată) și apoi
etalarea suspensiei obținute prin una din tehnicile descrise anterior.
Abordarea aprofundată a acestor metode face obiectul unei discipline de microbiologie
specială (Microbiologie medicală).
24
TITLU :
ANEXA 3
PRINCIPALELE MEDII DE CULTURĂ UTILIZATE ÎN MICROBIOLOGIE
1. Medii de cultură pentru bacterii
Bulion nutritiv
Peptonă 10,0 g
Extract de carne 10,0 g
NaCl 5g
Apă distilată 1000 mL
Ingredientele se dizolvă la cald, iar după răcire pH-ul se ajustează la 7,6 cu NaOH. Mediul se
filtrează prin hârtie și se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Mediul geloză simplă
Bulion nutritiv 1000 mL
Agar 20 g
Amestecul se încălzește pe baie de apă până la dizolvarea agarului și se sterilizează prin
autoclavare la 121°C, timp de 30 minute. Pentru a izola bacteriile acetice se folosește mediul geloză
simplă, la care se adaugă pentru fiecare 10 mL de mediu câte 0,1 mL soluție de penicilină 0,25% și 0,2
mL soluție de natamicină 0,25%. Mediul se autoclavează timp de 10-15 minute la 110°C sau se
filtrează prin membrană sterilizantă.
Mediul Luria-Bertani – cultivarea și conservarea bacteriilor
Extract de drojdie Difco 5g
Peptonă Difco 10 g
Glucoză 20 g
Agar 20 g
pH = 7,0
Mediul se autoclavează la 120°C, timp de 15 minute.
Agar tripticaza din soia - pentru cultivarea unei largi game de bacterii
Extract pancreatic de cazeină 15 g
Extract papaic de soia 5g
NaCl 5g
Agar 15 g
pH = 7,3
Apă peptonată
Peptonă 10-20 g
NaCl 5g
Mediul cu gelatină
Peptonă 5,0 g
Gelatină 120,0 g
25
TITLU :

Se sterilizează la 110°C, 20 minute.
Mediul de Carr
Cazeină hidrolizată 5g
Extract de drojdie 4g
Fosfat acid de potasiu 0,55 g
Clorură de potasiu 0,425 g
Clorură de calciu 0,125 g
Clorură de magneziu 0,125 g
Clorură de fier 0,0025 g
Sulfat de mangan 0,0025 g
Glucoză 40 g
Acid L-malic 5g
Mediul se repartizează în flacoane sau eprubete și apoi se sterilizează 10 minute la 120°C.
Mediul cu suc de roșii
Acest mediu este folosit mai ales pentru cultura lactobacililor. Mediul cu suc de roșii agarizat
se repartizează în eprubete. Se sterilizează în autoclavă 20 minute la 120°C.
Mediul Clark și Lubs
Peptonă tripsică sau polipeptonă 5,0 g
Glucoză 5,0 g
KH2PO4 5,0 g
Se dizolvă ingredientele prin încălzire la 100°C. se filtrează, se răcește și se completează la
1000 mL cu apă distilată. Mediul se sterilizează prin tindalizare (autoclavare 20 minute la 100°C, timp
de trei zile consecutive).
Mediul bulion-glucoză-fosfat
D-glucoză 5,0 g
KH2PO4 5,0 g
Peptonă Difco 5,0 g
pH final 7,5
Mediul Simmons (citrat-agar)
Albastru de bromtimol 1% 8 mL
NH4H2PO4 1g
K2HPO4 1g
Agar 20,0 g
Citrat de sodiu 5,0 g
MgSO4 7 H2O 0,2 g
NaCl 5,0 g
26
TITLU :
Toate ingredientele, cu excepția indicatorului, se dizolvă în apă distilată, la cald. Se ajustează

pH-ul la 7,0 și se adaugă indicatorul albastru de bromtimol. Mediul se autoclavează la 121°C, timp de
15 minute.
Mediu Lafon-Lafourcade pentru bacterii acetice
Aminoacizi din cazeină 5g
Glucoză 10 g
Agar 20 g
Mediul se repartizează câte 5 ml în eprubete și se sterilizează la 115°C timp de 15 minute.
Pentru eliminarea bacteriilor lactice se adaugă 0,1 mL soluție de penicilină 0,25%, iar contra drojdiilor
și mucegaiurilor se adaugă 0,2 ml soluție de piramicină 0,25%.
Mediul M.R.S. (Man-Rogosa-Sharpe) pentru izolarea E. coli
Triptonă 10,0 g
Extract de drojdii 5g
Fosfat acid de potasiu 2g
Acetat de sodiu 5g
Sulfat de amoniu 2g
Sulfat de magneziu 0,2 g
Sulfat de mangan 0,05 g
Acid citric 2g
Glucoză 2g
Fructoză 2g
Arabinoză 2g
Xiloză 2g
Acid malic 5g
pH = 4,2
Autoclavare la 120°C, timp de 15 minute.
Mediu Gauze (pentru Actinomycetes)
KNO3 1,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 0,5 g
NaCl 0,5 g
FeSO4 10,0 g
Amidon 20,0 g
Agar 20,0 g
pH = 7,0
Mediul Emerson (pentru Streptomyces, fungi și testarea producerii de antibiotice)
Peptonă 4,0 g
NaCl 2,5 g
Extract de drojdii 1,0 g
27
TITLU :
Glucoză 10,0 g
Agar 20,0 g
pH = 7,0
Mediul OMS modificat- pentru recoltarea bacteriilor
Bactopeptonă 10,0 g
Extract de carne pulbere 3,0 g
Glucoză 1,0 g
NaCl 5,0 g
Peptonă 1,0 g
Agar 20,0 g
pH = 7,0-7,2
Mediul se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 20 minute.
Mediul Drigalski - mediu de diagnostic diferențial între coloniile de Salmonella (bacterii lactozo-
negative), care produc virarea culorii mediului în albastru, de cele de Escherichia, Shigella,
Staphylococcus (lactozo-pozitive), care produc virarea culorii în roșu
Peptonă 10 g
NaCl 5g
Lactoză 15 g
Turnesol (soluție 10%) 60 ml
Agar 30 g
Bulion de carne 1000 mL
pH = 7,4
Se autoclavează la 121°C, 20 minute.
Mediul Istrati-Meitert - mediu de diagnostic diferențial între coloniile aparținând genului Shigella
care apar verzi-albăstrui, relativ transparente de cele de E. coli care apar galbene opace și de cele de
Proteus care sunt albastru-verzi și au centru mai opac înegrindu-se în timp.
Bilă uscată de bou 8g
Lactoză 15 g
Citrat de sodiu 8g
Tiosulfat de sodiu 8g
Citrat de fier 2g
Soluție apoasă 0,1 % albastru bromtimol 40 mL
Geloză 3% 1000 mL
pH = 7,8
Mediul MacConkey - mediu selectiv și diferențial între anumite genuri (Escherichia, Enterobacter și
Klebsiella) care fermentează lactoza și se coloreză în roșu sau roz de cele Salmonella, Proteus,
Pseudomonas, Shigella care nu fermentează lactoza și rămân necolorate.
Extract pancreatic de gelatină 17,0 g
Extract pancreatic de cazeină 1,5 g
Extract peptic de ţesut de origine animală 1,5 g
Lactoză 10 g
Săruri biliare 1,5 g
Clorură de sodiu 5g
Roşu neutru 0,03 g
28
TITLU :
Cristal violet 0,001 g

Agar 13,5 g
pH = 7,2
Autoclavare la 121°C, timp de 15 minute
29
TITLU :
2. Medii de cultură pentru fungi
Mediul YPG – cultivarea și conservarea drojdiilor

Extract de drojdie Difco 5-10 g
Peptonă Difco 10 g
Glucoză 20 g
Agar 20 g
Mediul se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Mediul Czapek-Dox – pentru cultivarea fungilor saprobionte
Sucroză 30,0 g
NaNO3 3, 0 g
K2HPO4 0,35 g
MgSO4 0,5 g
KCl 0,5 g
Sulfat feros 0,01 g
pH = 7,3
Mediul Czapek-pentru recoltarea fungilor
Glucoză 30,0 g
Extract de drojdie 5,0 g
NaNO3 3,0 g
MgSO4 x 7H2O 1,0 g
KCl 0,5 g
Sulfat feros 0,01 g
Agar 20,0 g
pH = 6,0
Dacă se adaugă 40µg streptomicină/mL de mediu răcit la 45-50°C, mediul devine selectiv
pentru mucegaiuri și drojdii. Mediul se sterilizează prin autoclavare, la temperatura de 121°C, timp de
15 minute.
Mediul nutritiv cu amidon
Amidon solubil 40 g
Agar 20 g
Agar nutritiv (geloză Martin) 1000 mL
Mediul se sterilizează la 121°C, timp de 15 minute.
Mediu cartof- glucoză-agar
Infuzie de cartofi 200 g
Glucoză 20 g
Agar 15 g
30
TITLU :
Componentele se pun în suspensie și se amestecă cu grijă. Se încălzește suspensia până la

fierbere, agitând continuu. Se repartizează în flacoane și se sterilizează în autoclavă la 118°C timp de
15 minute.
Mediul Sabouraud – pentru cultivarea drojdiilor
Glucoză 30 g
Peptonă 5-10 g
Agar 20 g
pH = 5,5-5,7
Mediul Sabouraud slab agarizat va conține numai 1% agar. Dacă se adaugă streptomicină sau
penicilină, mediul devine selectiv pentru fungi. Dacă se adaugă telurit, săruri biliare sau diferiți
coloranți, mediul devine foarte selectiv pentru fungii patogeni. Mediul se sterilizează prin autoclavare,
la temperatura de 111°C, timp de 15 minute.
Suc de struguri agarizat

Se obține astfel:
o Suc de struguri sterilizat și diluat de două ori, adus la pH = 3
o Se adaugă 2% agar;
o În fiecare cutie Petri se adaugă 0,1 mL soluție 0,25% de penicilină (pentru eliminarea
bacteriilor lactice) și 0,15 mL de soluție alcoolică de difenil 0,75% pentru eliminarea
mucegaiurilor.
Mediu DRBC (Dichloran Rose Bengale Chloramphenicol Agar) - pentru izolarea fungilor
Glucoză 10 g
Bacto-peptonă 5g
Hydrogenofosfat dipotasique 1g
Sulfatde magneziu, 7 H2O 0,5 g
Dichloran 2 mg
Rose Bengale 3 mg
Solutiei de oligoelemente * 1 mL
Agar 15 g
Apă disitilată pană la 1000 mL
* Compozitia solutiei de oligoelemente
Molybdat de potasiu 50 mg
Borat de sodium, 10 H2O 50 mg
Nitrat de cobalt, 6 H2O 50 mg
Sulfat de cadmiu, H2O 50 mg
Sulfat de cupru, 5 H2O 50 mg
Sullfat de zinc, 7 H2O 50 mg
Sulfat de manganeziu, H2O 50 mg
Perclorură de fier, 10% 1 picătură
Apă disitilată pană la 1000 mL
-1
Cloramfenicol (5g.L în etanol de 95°) 20mL
Adăugarea de cloramfenicol inhibă bacteriile și face ca mediul să devină foarte selectiv pentru
izolarea fungilor. Adăugarea Rose Bengale în compoziția mediului determină creşterea lentă a
mucegaiurilor.
31

LP2 Sterilizare Medii de Cultura Prelevare2

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LP2 Sterilizare Medii de Cultura Prelevare2

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DOCUMENT : L.P.

- Microbiologie Generală DATA : 09/10/2020

3. METODE DE STERILIZARE ȘI INHIBARE A

Microorganismele sunt răspândite pretutideni în natură: apă, aer, sol, pe tegumentele și

În practică, sunt utilizați deseori și alți termeni:

3.1. Clasificarea metodelor de distrugere și inhibare a microorganismelor

Căldură uscată Incinerare, încălzire la roșu,

Filtrare Filtre cu porozitate diferită în

Supunere la Refrigerare, congelare

3.1.1. Sterilizare prin căldură uscată

Sterilizarea cu aer cald

3.1.2. Sterilizare prin căldură umedă

rezistent la temperatură (vârfurile de la micropipetă automată, pipetele Pasteur), membrane filtrante,

3.1.3. Sterilizarea cu ajutorul radiațiilor

3.1.4. Sterilizarea cu ultrasunete

3.1.5. Metode de sterilizare cu substanțe chimice

Sterilizarea (completă sau incompletă) cu substanțe chimice se practică în laboratoarele de

3.1.5.1. Metode de sterilizare completă cu substanțe chimice

Sterilizarea cu oxid de etilenă

Sterilizarea cu β-propiolactonă (BPL)

Dezinfecția este o metodă de sterilizare incompletă. Dezinfectantele sunt substanțe chimice cu

Dezinfectanți care alterează permeabilitatea peretelui celular

Dezinfectanți care acționează asupra grupărilor active ale proteinelor

3.1.6. Metode de separare (eliminare mecanică)

3.1.6.1. Filtrarea sterilizantă

Principalele filtre utilizate în microbiologie sunt:

Figura 3.1. Sistem de filtrare

Figura 3.2. Filtre Whatman Polydisc

Controlul eficienței sterilizării

izolarea microorganismelor din produse sărace în microorganisme; determinarea numărului

Centrifugarea este o tehnică rapidă și eficientă de separare a microorganismelor de lichidele în

3.1.7. Metode de inhibare a activității microbiene

3.1.8. Factorii care influențează eficiența sterilizării și dezinfecției

Alegerea metodei de dezinfecție sau de sterilizare trebuie să țină cont de următoarele:

4.1. Noțiuni generale

 Să asigure un grad de umiditate optim microorganismului cultivat;

Tabel 4.1. Ingrediente utilizate frecvent în prepararea mediilor nutritive

În practica curentă din laboratoarele de microbiologie, se utilizează medii multitest de

4.2. Pregătirea şi sterilizarea mediilor

4.3. Clasificarea mediilor de cultură

4. După scopul utilizării

5. După prezența sau absența oxigenului

5. PRELEVAREA ȘI PREPARAREA PROBELOR PENTRU TESTAREA

5.1. Prelevarea probelor

Orice probă, destinată testării microbiologice, trebuie să îndeplinească anumite condiții:

Figura 5.2. Sonde destinate prelevării probelor de sol

• Prelevarea probelor de apă:

Figura 5.3. Sonde de prelevare manuală/automată a apelor de suprafață și subterane/de adâncime

 Analiza aerului (determinarea aeroflorei):

Figura 5.4. Aparat pentru prelevarea probelor de aer

 Prelevarea probelor de lichide, solide și pulberi industriale:

 Prelevarea probelor pentru determinarea microflorei de pe fructe sau de pe legume:

Apă distilată 1000 mL

Toate ingredientele, cu excepția indicatorului, se dizolvă în apă distilată, la cald. Se ajustează

Cristal violet 0,001 g

2. Medii de cultură pentru fungi

Mediul YPG – cultivarea și conservarea drojdiilor

Componentele se pun în suspensie și se amestecă cu grijă. Se încălzește suspensia până la

Suc de struguri agarizat

S-ar putea să vă placă și