Haemophilus influenza

A fost considerat agentul etiologic al gripei n pandemia de grip din anii 1890-1892 (Pfeiffer). A fost izolat n 1892.
Numele a fost stabilit n 1917, n amintirea erorii din 1892.

56. 2. 1. Caractere generale

56. 2. 1. 1. Habitat

Se poate gsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza i mucoasa conjunctival, precum i
tractul genital la 30-70% din persoanele sntoase. ntr-un studiu recent la care au participat n mod voluntar colegii
tineri aflai n finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studeni au fost purttori
de Staphylococcus aureus, nazal i / sau faringian dar nici un student nu a fost purttor de H. influenzae. Am
identificat un caz de portaj pentru H. parainfluenzae.

56. 2. 1. 2. Caractere morfologice

n produsul patologic germenii sunt prezeni sub form de cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3mm), uneori
dispui n lanuri scurte. n cazul anumitor tulpini pot aprea forme filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru
depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru c hemofilii nedecolorai corect s-ar putea confunda
cu Streptococcus pneumoniae, iar recolorarea nu se face cu safranin (care nu coloreaz bine hemofilii), ci numai cu
fucsin bazic 0,1% sau cu fucsin Ziehl diluat 1/10, timp de 5 minute.

n culturi apar n funcie de vrsta culturii i de mediul de cultur:

- n medii bogate, la 6-8 ore, predomin formele cocobacilare, care au i capsul.

- n culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pierderea capsulei (probleme de diagnostic diferenial
microbiologic). Polimorfismul apare odat cu mbtrnirea culturii i este caracteristic tulpinilor n curs de trecere
la forma R.

56. 2. 1. 3. Caractere de cultur

Haemophilus influenzae necesit pentru iniierea creterii 5-10% CO2, atmosfer umed, la 35-37C, pH=7,6
incubat pentru o perioad de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de cretere precum (factorii
X i V). Factorul X, termostabil (rezist 45 minute la 120C), este protoporfirina IX sau o protohem cu fier,
prezent n snge sau n derivatele sale cu hemin i asigurat n mediile de cultur prin adaos de 5% snge
chocolatat, de suplimente XV, Fildes sau Levinthal, care conin aproximativ 500 mg/ml factor X i 150 mg/ml factor
V, sau prin suplimentare cu hemin. Haemophilus influenzae necesit pentru dezvoltare 0,1-10 mg/ml factor X,
iar H. ducreyi 200 mg/ml hemin. Factorul V, termolabil (rezist numai 15 minute la 90C), este nicotin-amid-
adenin dinucleotidul (NAD) sau NADPH (fosfat), prezent n hematii, dar eliberat, este distrus de pirofosfataz i
NAD-az, prezente n sngele de om, ovine, caprine, ori bovine (enzime inactivate prin chocolatizare). Surse de
factor V sunt suplimentele XV, extractul de drojdie, de cartof sau tomate, diferite bacterii: stafilococ, Enterococcus
faecalis, Pseudomonas aeruginosa mucos, Sarcina lutea, Escherichia coli, levuri i preparatele de NAD sau
NADPH. Necesitile de factor V pentru H. influenzae sunt de 0,2-1 mg/ml, pentru H. parainfluenzae de 1-5 mg/ml
sau, pentru unele tulpini, de 25 mg/ml. Ambii factori se obin din eritrocite, ns este necesar eliberarea coninutului
acestora n mediu (de exemplu prin cldur, sau prin digestie peptic). Factorul V este sintetizat i de stafilococul
auriu, astfel c pe geloz-snge coloniile deHaemophilus influenzae sunt mai numeroase n jurul unor colonii de
stafilococ (fenomenul de satelitism); util n identificare.

Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore
prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliz. Pe geloz-chocolate, coloniile ating 1-3 mm abia dup
36-48 ore, avnd aspectul unor picturi de rou.

56. 2. 1. 4. Caractere biochimice i de metabolism

Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesit pentru dezvoltare factorii X i V. Fermenteaz inconstant
carbohidraii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol-pozitive (transform triptofanul n indol). Pe baza unor teste
biochimice specia a putut fi mprit n 8 biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacieni se ncadreaz n
biotipurile I-IV; majoritatea tulpinilor cu capsul de tip b fac parte din biotipul I.

56. 2. 1. 5. Aciunea agenilor fizici i chimici

Rezistena n mediu este sczut. Prin uscare sunt distrui rapid. n sput pot rezista pn la 48 de ore. Sunt distrui
de dezinfectanii obinuii sau de meninerea timp de 30 minute la 56C. Datorit viabilitii reduse, cultura trebuie
repicat pe mediu proaspt la un interval de 5-6 zile. Totui, n tuburi nchise (cu geloz-chocolate), cultivate din
abunden, culturile de H. influenzae ar putea rezista pn la 4-5 sptmni, la temperatura camerei. Cele mai bune
metode de conservare sunt reprezentate de a. liofilizare i de b. meninerea la -70C (dup cultivare n mediu lichid,
mbogit, cu 20% glicerol).

56. 2. 1. 6. Structur antigenic

Tulpinile virulente prezint o capsul polizaharidic ce are o compoziie diferit, n funcie de tipul serologic.
Tipurile (a-f) se pot diferenia prin reacii de umflare a capsulei i de imunofluorescen folosind seruri specifice.
Cel mai rspndit i mai patogen este tipul b, la care antigenul este poliribozil-ribitol-fosfat (PRP) i prezint
nrudiri antigenice cu Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes, Stafiloccocus epidermidis, Enteroccocus
feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora normal a tractului respirator nu prezint
capsul). Totui, rspunsul imun fa de structura capsular de tip beste slab, ineficient, n primii ani de via (0-2
ani), exact n perioada n care infeciile cu H. influenzae au potenialul cel mai grav.

Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puin dou proteine: substana M, un antigen de suprafa labil i
substana P, care constituie o parte nsemnat a corpului bacterian.

Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate n mediu lichid, dar natura ei antigenic
nu este foarte clar.

Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezint activitate fa de tulpini
capsulate de alte tipuri, fa de tulpinile necapsulate, fa de alte specii de Haemophilus i fa de unele
enterobacterii.

56. 2. 1. 7. Rspuns imun

La nou-nscui i la sugarii sub 3 luni exist o stare de imunitate, anticorpii provenind de la mam. Dup aceast
vrst, concentraia de anticorpi scade. n SUA, Haemophilus influenzae este cea mai frecvent cauz de meningit
la copii ntre 5 luni i 5 ani. Diferite studii demonstreaz c la vrsta de 3-5 ani un numr important de copii au
anticorpi anti-PRP care contribuie la realizarea lizei dependent de complement i stimuleaz fagocitoza.

Exist o corelaie (insuficient de bine precizat practic) ntre anticorpii bactericizi i rezistena la infecii grave
cu Haemophilus influenzae.
 56. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate

Haemophilus influenzae este un microorganism condiionat patogen. Prezint adezine de suprafa (filamentoase).
Endoxina are un rol redus n patogenitate. Rolul antigenelor somatice urmeaz s fie clarificat.

Rolul esenial l are capsula, iar din cele ase tipuri, tipul b apare n circa 90% din cazurile severe de infecie
cu Haemophilus influenzae.

H. influenzae mai produce IgA proteaz i 2 proteine pentru achiziia de fier.

Tulpinile necapsulate se pare c i exercit virulena datorit structurii peptidoglicanului (cu aciune pro-
inflamatorie), LOZ, Cu i Zn-super oxid dismutaza.

56. 2. 2. Patogenie i principalele boli produse

Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare i invazie.

Microorganismul ptrunde pe cale respiratorie. Boala debuteaz ca o rinofaringit acut, probabil n asociere cu o
infecie viral la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmat de epiglotit, laringotraheit, otit, sinuzit, mai
rar de pneumonie, dar i de meningit acut purulent la copiii mici precolari.

Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie local (se poate nota faptul c Haemophilus influenzae tip
b i pneumococul se numr printre agenii etiologici comuni ai otitei medii bacteriene i ai sinuzitelor acute).

Dac microorganismul ptrunde n torentul sanguin, pe aceast cale poate infecta meningele.

Ocazional infecia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheit obstructiv fulminant care necesit traheotomie
sau intubare prompt a copilului respectiv.

56. 2. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Haemophilus

influenzae
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Haemophilus influenzaeeste bacteriologic, direct.

n vederea discutrii examenului de laborator vom avea n vedere meningita. n meningita produs de H.
influenzae diagnosticul este urgent(risc de evoluie cu sechele i / sau deces), de importan maxim fiind recoltarea
i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac
pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este
util n stabilirea etiologiei.

Tulpinile capsulate (prezint Ag de tip K) se pot identifica n produsul patologic (LCR sau urin, dup
centrifugare) prin contraimunoelectroforez, latex aglutinare, coaglutinare sau ELISA. Pot aprea reacii fals-
pozitive datorit unor nrudiri antigenice, pentru c antigenele capsulare tip a, b, c i f, conin acizi teichoici. O
alt problem tehnic este reprezentat de faptul c exist i tulpini autoaglutinabile.

1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape
de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al
tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Haemophilus
influenzae se pot recolta secreii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreii din sfera ORL, lichide
recoltate prin puncie, snge, LCR etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de LCR (vezi i
anexa nr. 6). Aa cum am mai menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central
a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce
este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR
pentru examenul citologic i biochimic (vezi i anexa nr. 6). n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre
laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C, refrigerarea este
contraindicat). H. influenzaear putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc.
Din punct de vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.

2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic
recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR
este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR.
Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite)
i prezenacocobacililor Gram-negativi, fini, capsulai, dispui separat sau n grmezi aranjate n aceeai direcie,
uneori dispui n lanuri scurte, situai intra sau extraleucocitar. Datorit faptului c aceste microorganisme se
coloreaz relativ slab n coloraia Gram, ar putea fi necesar colorarea frotiului de rezerv printr-o alt metod sau,
recolorarea prelungit cu fucsin (vezi i 31.2.1.2.).

3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi anexa nr. 2). Haemophilus influenzae este un
microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite. Unele tulpini
de Haemophilus influenzae necesit pentru iniierea creterii 5-10% CO2. Este necesar pentru incubare o atmosfer
umed, la 35-37C, i o durat de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de cretere precum
hemina (factor X) i factorul V care poate fi nlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime. Ambii factori se obin din
eritrocite, ns este necesar eliberarea coninutului acestora n mediu (de exemplu prin cldur, sau prin digestie
peptic). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz-snge coloniile de Haemophilus
influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin
hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe de alt parte, atunci cnd produsele nsmnate
sunt potenial contaminate, este necesar folosirea mediilor selective (ex. cu bacitracin, vancomicin, clindamicin
i amfotericin B). Coloniile sunt de tip S sau M i ating un diametru de 0,5-0,8 mm dup 24 de ore, respectiv 1-2
mm la 48 de ore, avnd aspectul unor picturi de rou pe geloz-chocolate. Pe geloz-snge cu infuzie de inim-
creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice.
Nu apare hemoliz.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 mm), dispui separat sau n grmezi,
uneori dispui n lanuri scurte. n medii complexe, la 6-8 ore, predomin formele cocobacilare, care au i capsul. n
culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pierderea capsulei (dificulti de diagnostic diferenial
microbiologic).

Caractere de cultur: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm dup 24 de ore, respectiv
1-2 mm la 48 de ore, avnd pe geloz-chocolate aspectul unor picturi de rou. Necesit prezena n mediul de
cultur a factorilor de cretere (X i V). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz-snge
coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a
fost nsmnat o tulpin hemolitic deStaphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe geloz-snge cu infuzie
de inim-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice,
caracteristice. Nu apare hemoliz.

Caractere biochimice:

Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesitile de factor X.

Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transform triptofanul n indol).

Fermenteaz inconstant diferii carbohidraii. Pe baza unor teste biochimice (ex. indol, ureaz, ornitin decarboxilaz)
specia a putut fi mprit n opt biotipuri.

Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii deNeisseria, Haemophilus i Branhamella catarrhalis, n
numai 4 ore.

Caractere antigenice:

Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin tehnici
imunologice, n funcie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenia prin reacii de umflare a capsulei,
imunofluorescen, aglutinare, latex-aglutinare i coaglutinare.

Tiparea LOZ poate fi realizat prin Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare n gel. Au fost
caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae.

Prin aceleai tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare n gel), tipul b capsular poate fi subtipat
(11 subtipuri).

Tulpinile necapsulate se pot identifica i tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) sauprin tipizarea
antigenelor OMP (electroforez n gel de poliacrilamid; aceast metod poate fi utilizat i pentru subtiparea
tulpinilor cu capsul de tip b).

Alte teste: exist sonde nucleotidice i amorse (pentru PCR) produse comercial pentru identificarea H.
influenzae (att din cultur ct i din produse patologice).

5. Antibiograma (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este

necesar i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Este recomandat utilizarea unui mediu special,
respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza i truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu
citire i interpretare dup 18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire i interpretare dup 4-5 ore incubare). Determinarea
CMI i CMB poate fi necesar i se realizeaz prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7).

Identificarea rspunsului imun fa de Haemophilus influenzae

Identificarea prezenei de anticorpi fa de H. influenzae ar putea fi util pentru verificarea rspunsului imun n urma
vaccinrii. n acest scop au fost utilizate RIA i ELISA.

56. 2. 4. Tratament
Deoarece se estimeaz c mortalitatea datorit meningitei cu Haemophilus influenzae, n lipsa tratamentului, poate fi
de pn la 90%, la copii, punerea diagnosticului i instituirea tratamentului corect reprezint un deziderat major.
Diagnosticul prompt i tratamentul antimicrobian sunt eseniale i pentru scderea implicrii ulterioare neurologice
i intelectuale. Multe din tulpini sunt nc sensibile la ampicilin (circa 25% produc lactamaze sub control
plasmidic). Pentru infeciile grave, pn la obinerea rezultatelor antibiogramei se poate administra ceftriaxon.

56. 2. 5. Epidemiologie. Prevenire. Control

Haemophilus influenzae tip b se transmite pe cale aerian, interuman.

Deoarece vaccinurile polizaharidice care conin i polimeri aparinnd peretelui celular, sunt slab imunogenice la
copiii sub 2 ani, s-a realizat un vaccin la care polizaharidul este cuplat cu anatoxina difteric. Acest vaccin conjugat
se administreaz la copiii n vrst de peste 18 luni. La minimum 2 luni dup prima doz se poate administra a doua
doz (ntre 18 i 23 de luni).

Deoarece vaccinul nu mpiedic portajul, n situaii epidemiologice se pot administra antibiotice n scop profilactic
(ex. rifampicin 20 mg/kg-corp, timp de patru zile).

n Romnia nu se raporteaz (s-au nu s-au raportat) infeciile invazive meningeale, produse de H. influenzae. Se
raporteaz n schimb pneumoniile la care agentul etiologic este acest microorganism. Dac n 1998 au fost raportate
425 cazuri iar n 2003 au fost raportate 307 cazuri, cel mai mare numr de cazuri s-a nregistrat n 2004 (969 cazuri,
cu o inciden de 4,50/0000). n anul 2005 au fost nregistrate 263 cazuri iar n anul 2006, 313 cazuri (incidena fiind
1,50/0000). Subiectul diagnosticul de laborator n infecii cu H. influenzae a fost de asemenea tratat n cursul de
pregtire pe care dr. M. Popa l-a coordonat n 2004 (proiectul Phare, aprobat pentru Romnia n anul 2000); din
pcate, rezultatele nu sunt, nc, remarcate.

Chiar i dup introducerea recomandrii vaccinrii anti - H. influenzae la copii, n SUA au fost nregistrate infecii
invazive cu acest microorganism. Incidena acestor manifestri a atins n 1996 cifra de 0,450/0000, cu 1.170 cazuri
raportate, n 1998 s-au nregistrat 1.194 cazuri (inciden 0,440/0000) iar n 1999, 1.309 cazuri (inciden 0,480/0000). n
urmtorii ani, incidena s-a situat n jurul valorii de 0,700/0000 (0,7 n 2003; 0,72 n 2004 i respectiv 0,78 n 2005, cu
2.304 cazuri raportate la nivel naional). Autoritile de sntate public americane supravegheaz n mod special
meningitele cu H. influenzae la copiii cu vrsta mai mic de 5 ani, situaie pentru care sunt raportate i serotipurile
mai frecvent identificate (serotipul b este identificat ntr-un procent mai mic dect alte serotipuri; au existat i tulpini
ne-tipabile, n 2005).