Bibliografie

Autorii: Maria Bălășoiu, Adriana Turculeanu, Carmen Silva Avramescu

Bacteriologie Generală și Specială, Editura Medicală, Craiova, 2013

Bibliografie

Autorii: Carmen Avramescu, Adriana Turculeanu, Maria Bălășoiu, Oana Ionete

Îndrumar Practic de Microbiologie

Bibliografie

Autorii: Dr. I. Alteraș, conf. N. Cajal, dr. I. Cojocaru, dr. S. Comoroșan, dr. P. Dăncescu, dr. T.
Ieremia, dr. V. Kondi, chim. Natalia Mitrică

Editura Medicală, București, 1994

 DIAGNOSTICUL INFECȚIILOR CU COCI PATOGENI

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL

INFECȚIILOR

STAFILOCOCICE

Familia: Micrococcaceae. Genul: Staphylococcus. Specia tip: Staphylococcus aureus

Generalități

Stafilococii sunt agenți cauzali ai unor variate stări patologicepredominant de natură

supurativă, care afectează diferite țesuturi și organe ale organismului. Sunt obișnuit agenții
etiologici ai furunculelor, furunculelor antracoide și osteomielitei; constituie flora de infecție a
plăgilor și arsurilor și pot fi agenți primari sau în asociație cu alte microorganisme; pot fi întâlniți
de asemenea într-o serie de cauzri de pneumonie, meningită, septicemie, endocardită, pioartroză,
conjunctivită, abcese renale și alte colecții purulente.

În ultimii ani, o dată cu apariția antibioticelor, stafilococii au căpătat o importanță

deosebită în spitalele de chirurgie și maternități, fiind răspunzători de apariția izbucnirilor de
Pemphigus neonatorum, numeroase cazuri de pneumonii la nou-născuți și mastite la mame.
Stafilococii sunt de asemenea cauzatorii unor izbucniri de toxiinfecții alimentare și în ultimul
timp au fost incriminați în etiologia enteritelor care survin după administrarea terapeutică a
antibioticelor.

Stafilococii patogeni sunt obișnuit paraziți și se întâlnesc frecvent pe pielea și mucoasa

organismului, unde pot exista sub formă tranzitorie sau să facă parte din flora proprie a țesutului.
Stafilococii potențial patogeni pot fi izolați prin cultură din rinofaringele indivizor sănătoși în
proporție de 50% și în culturi de pe piele în proporție de 20%. Stafilococii se pot găsi uneori în
număr mare în mediul înconjurător, de exemplu, în praf, în aer sau pe obiectele uzuale; ei se
găsesc deosebit de numeroși în vecinătatea persoanelor infectate mesiv; se poate așadar
presupune că prezența lor în mediul înconjurător este generată de prezența unei surse umane,
purtătorul de stafilococ.
 Stafilococii patogeni sunt reprezentați de căteva specii limitate ale unui larg grup de
micrococi cu distribuție universală. Deși majoritatea speciilor din grupul micrococilor sunt
nepatogene, unele dintre ele prezintă asocieri apropiate cu stafilococii patogeni, atăt din punct de
vedere morfologic și tinctorial, căt și prin cultură. Unele dintre aceste specii nepatogene se
întălnesc pe pielea și mucoasele organismului.

Din aceste considerente, în diagnosticul de laborator al infecție stafilococice, apare ca

deosebit de important să putem diferenția varietățile patogene de cele nepatogene din mediul
ambiant.

Caractere morfologice și tinctoriale

La microscop, stafilococii apar ca celule sferice, așezate izolat și în grămezi neregulate.

Acest mod de grupare apare mai ales în frotiurile colorate, preparate dintr-o cultură pe agar. În
culturile în bulion grămezile de coci sunt mai caracteristice, asemănându-se cu boabele unui
ciorchine de strugure, de aici și denumirea de "staphylo". Se întâlnesc deseori și coci izolați, în
perechi sau în lanțuri scurte; lanțuri lungi nu se întâlnesc niciodată la stafilococi. dimensiunile
cocilor sunt de 0,8 – 1 µ diametru; în general tendința stafilococilor într-o cultură este de a fi
uniformi ca diametru și așezare. În produsele patologice, datorită influenței antibioticelor,
uniformitatea de dimensiune și așezare este modificată. În culturile proaspete de 18 – 24 de ore
cocii sunt gram – pozitivi.

Gruparea în grămezi nu este o caracteristică exclusivă a stafilococilor; ea poate fi întâlnită

și la alți micrococi și uneori la enterococi, când sunt cultivați pe medii solide. Stafilococii sunt
microbi imobili, nu formează spori și nici capsulă. Frotiurile din exudatele purulente se pot
colora, pe lângă metoda Gramși cu o colorație simplă cu albastru de metilen sau albastru de
toluidină, pentru a putea observa mai bine citologia exudatului și relațiile dintre microbi și
fagocitele micro- și macrofage.
 Caractere de cultură

Stafilococii cresc bine pe mediile uzuale și pe aproape toate mediile de cultură

bacrteriologice în condiții de aerobioză și condiții de microaerofilie. Temperatura optimă de
creștere este 37°. În mediile lichide creșterea se manifestă prin tulburarea uniformă a mediului și
depunerea pe fundul tubului de cultură. Pe mediile solide, ca, de pildă, geloza, se dezvoltă sub
formă de colonii rotunde, ușor bombate de 1 – 2 mmdiametru, opace, lucioase, cu margini
regulate de tip smooth. Creșterea este însoțită de secretarea unui pigment, care colorează
coloniile cu nuanțe intermediare, de la auriu intens la galben ca lămâia și alb ca porțelanul.
Pigmentogeneza este influențată de o serie de factori, printre care compoziția mediului și
temperatura joacă un rol precumpănitor. Pigmentația apare pe mediile obișnuite după o incubare
de 24 de ore la 37°; ea se intensifică însă dacă păstrăm cultura la temperatura camerei încă 1 – 2
zile. Pigmentogeneza este evidențiată în condiții optime dacă însămânțăm tulpina de stafilococ
pe un mediu din geloză nutritivă cu adaos de 10% lapte. Proapăt izolate din produsul patologic,
majoritatea tulpinilor însămânțate pe agar – sânge dezvoltă o zonă netă de hrmoliză în jurul
coloniilor. Stafilococii priduc câteva hemolizine, dintre care două sunt mai importante: α - și β –
hemolizina.

Hemolizina α este activă asupra eritrocitelor de iepure și oaie; hematiile umane sunt
rezistente la acțiunea ei. Pe agar – sânge de iepure α – hemolizina produce o zonă de hemoliză
completă în jurul coloniilor, după o incubare de 18 – 24 de ore la 37°. Proaspăt izolate din
produsul patologic, tulpinile de stafilococ care produc hemoliza eritrocitelor de iepure sunt
considerate ca prezumtiv patogene.

Hemoliza β produce liza hematiilor de oaie, bou și om. Pe agar – sânge de oaie produce în
jurul coloniei o zonă centrală mică de hemoliză clară, înconjugată de o zonă largă întunecată de
hemoliză parțială caracteristică β – hemolizinei stafilococice. Acest aspect de β – hemoliză se
accentuează prin păstrarea culturii peste noapte la ghețar și a fost denumit hemoliză de tip cald –
rece. Acțiunea hemolitică de tip cald – rece a hemolizinei β – stafilococice se poate evidenția
mai net prin amestecarea într-o eprubetă a unei suspensii de eritrocite de oaie cu o cantitate de
filtrat de cultură de stafilococ. Hemoliza nu apare după incubarea de 24 de ore la 37°, dar devine
evidentădar devine evidentă după păstrarea peste noapre la ghețar sau la temperatura camerei. β
– hemoliza espe produsă în special de tulpinile de stafilococ de origine bovină.
 Ambele hemolizine sunt elaborate de stafilococ în condiții optime, dacă incubarea
culturilor se face în atmosferă cu conținut de 30% CO2.

Majoritatea stafilococilor sunt aerobi, facultativ anaerobi. Tulpini de stafilococ patogen

strict anaerobe sunt extrem de rare și prezintă o importanță redusă pentru diagnosticul infecțiilor
stafilococice.

Caractere biochimice

Stafilococii fermentează numeroși carbohidrați, printre care glucoza, lactoza, maltoza,

zaharoza, etc. Tulpinile patogene fermentează în plus manita. Coagulează laptele prin
fermentarea lactozei, iar cheagul este deseori proteolizat.

Structura antigenică

Stafilococii au antigene de natură glucidopolipeptidică. Cercetările lui Julianelle și

Wieghard au permis separarea stafilococilor în două grupuri mari, pe baza unor reacții de
precipitare cu polizaharizii specifici de grup. Grupul A cuprinde stafilococii patogeni, iar grupul
B pe cei saprofiți. În grupul stafilococilor patogeni, Cowan și Oeding au reușit să delimiteze 3
subgrupuri serologice. Metodele serologice însă nu permit evidențierea tulpinilor de stafilococ
din același subgrup. Aceasta face ca metodele de diferențiere a stafilococilor să aibă deocamdată
numai o importanță teoretică, rămânând ca carcetări ulterioare să permită folosirea lor la
diagnostic.

Cercetările lui Blair și Dowing au demonstrat că se pot stabili anumite asemănări și

deosebiri între tulpinile de stafilococ patogen, pe baza sensibilității lor la o serie de bacteriofagi
antistafilococici de origine lizogenă.

Această metodă, cunoscută sub numele de lizotipie bacteriofagică, este oarecum

comparabilă cu lizotifia bacililor tifici; ea poate fi aplicată numai tulpinilor patogene de
stafilococ, coagulazo – pozitive nu sunt susceptibile la acțiunea preparatelor bacteriofagice
folosite în lizotipie. În prezent se folosesc aproximativ 20 de tipuri fundamentale de bacteriofagi
pentru lizotipia de rutină. Prin tipizare fagică s-a ajuns la constatarea că stafilococii patogeni se
pot împărți în 3 grupe mari, care corespund cu grupele serologice Cowan. Lizotipia stafilococică,
în practică, stabilește mai mult un diagnostic individual de tulpină și mai puțin un diagnostic de
tip, pentru că o tulpină de izolată dintr-un produs patologic poate fi lizată de câțiva din
bacteriofagii standard folosiți în lizotipie. Din cauza acestui aspect, nici lizotipia stafilococică nu
este o metodă de clasificare, deci de diferențiere netă între diferitele tulpini de stafilococi
patogeni. Cu toate acestea, ea are o mare valoare în cercetările epidemiologice, deoarece s-a
constatat că o tulpină de stafilococ își păstrează constant tipul bacteriofagic chiar și ăn condițiile
trecerii succesive de la bolnav la purtător și invers. Aceasta permite o judicioasă urmărire a
filiației cazurilor într-o epidemie și o organizare a măsurilor de depistare și combatere a
purtătorilor de stafilococ patogen.

Metaboliți bacterieni

Stafilococii pot determina infecții la om prin intermediul a două proprietăți și anume: prin
capacitatea lor de înmulțire și de invazie și prin producerea de metaboliți pe care îi secretă în
cursul dezvoltării lor. Printre acești metaboliți cei mai importanți sunt:

Exotoxina – substanță filtrabilă termolabilă, care injectată la animale este letală, produce
necroza dermului și conține hemolizine solubile. Exotoxina tratată cu formol se transformă în
anatoxină stafilococică, un produs netoxic dar antigenic, care se folosește la om pentru
stimularea imunității antitoxice față de stafilococ.

Leucocidina – substanță solubilă, care distruge leucocitele de la numeroase specii

animale. Este antigenică dar mai puțin rezistentă la caldură decât exotoxina. Datorită
leucocidinei stafilococii patogeni fagocitași sunt capabili să se înmulțească în interiorul
leucocitului și prin secreția de leucocidină, să-i distrugă. Această proprietate lipsește
stafilococilor nepatogeni care sunt repede distruși în interiorul celulei prin enzime leucocitare.

Enterotoxina – produs solubil, secretate de unele tulpini de stafilococ patogen.

Enterotoxina rezistă la − 30° și la fierbere. Se deosebește de exotoxină prin rezistența termică
marcată, prin structura antigenică deosebită și prin tropismul accentuat pentru mucoasa
intestinală. Enterotoxina este secretată de stafilococ când acesta contaminează alimentele bogate
în carbohidrați și de consistență semifluidă, păstrate la temperatura camerei. Ingestia acestor
alimente provoacă la om o toxiinfecție alimentară acută sau se manifestă prin vărsături și diaree.
Aceleași simptome pot fi reproduse experimental administrând per os enterotoxina la voluntari
umani sau la maimuțe, sau prin injectare intraperitoneală la pisici tinere.

În laborator se poate evidenția producerea de enterotoxină prin însămânțarea tulpinii de

stafilococ în geloză nutritivă semisolidă 0,5% și incubare la 37° în atmosferă cu 30% CO 2. Filtrul
acestor culturi, încălzit 30 de minute la 100°, reprezintă enterotoxina. Injectat ultraperitoneal la
pisică produce vărsături.

Coagulaza – majoritatea stafilococilor patogeni pentru om produc această substanță de

natură enzimatică, care coagulează plasma oxalată sau citrat de om, cal sau iepure. Datorită
coagulazei, stafilococii patogeni pătrunși în organism își creează un înveliș de fibrină, care îi
protejează de acțiunea litică a enzimelor fagocitelor.

Alți metaboliți de natură enzimatică, secretați de stafilococi în cursul dezvoltării lor sunt:
hialuronidaza sau factorul de difuziune, o stafilocokinază sau fibrinolizina, care acționează însă
mult mai lent decât fibrinolizina streptococică. De asemenea, mai produce și proteinaze,
fosfataze, lipaze și carbohidraze, cu importanță secundară în metabolismul bacteriilor.

Stabilirea caracterelor de patogenitate

Întrucât stafilococii sunt răspândiți peste tot în mediul extern, todeauna când se izolează o
tulpină de stafilococ dintr-un produs patologic și mai ales de la purtători se pune problema
diferențierii ei de stafilococii saprofiți ubicuitari, care pot contamina cu ușurință produsul
patologic. În acest scop se folosesc o serie de teste in vivo și in vitro, caracteristice stafilococilor
patogeni.

Testul hemolizei. Stafilococii patogeni sunt hemolitici. Se evidențiază în special α –

hemolizina, care determină o hemoliză de tip cald-rece și este secretată mai ales de tulpinile de
proveniență animală.
 Testul fermentării manitei. Se folosește, fie un mediu lichid (apă peptonată turnesolată
cu manită, 1%), fie mediul Chapman solid. Fermentarea manitei se traduce prin acidificarea
mediului și virajul de culoare al indicatorului de pH.

Testul coagulazei. Proprietatea de a coagula plasma umană, de iepure sau de cal este o
caracteristică importantă a stafilococilor patogeni. Stafilococii nepatogeni și ceilalți micrococi nu
coagulează plasma sanguină. Majoritatea autorilor consideră capacitatea de coagulare a plasmei
ca unul din testele cele mai importante de stabilire a caracterelor de patogenitate in vitro a
stafilococilor. Testul se realizează astfel: se aspiră într-o pipetă sterilă de 10 ml, o cantitate de 1
ml dintr-o soluție sterilă de oxalat de K sau citrat Na 2% și apoi se completează până la 10 ml cu
sânge de iepure, de om sau de cal, se centrifughează la 3000 de turații și se decantează steril
plasma. Plasma oxalată se distribuie în cantitate de 0,5 ml în tuburi de hemoliză sterilă și se
adaugă, fie 0,5 ml dintr-o cultură de 16 – 20 de ore în bulion, fie conținutul unei anse dintr-o
cultură de 18 – 20 de ore pe agar înclinat. În paralel cu tulpina de testat se realizează un martor
cu o tulpină de stafilococ coagulazopozitivă și un alt martor cu o tulpină sigur
coagulazonegativă.

Se incubează tuburile la 37° și se examinează pentru pentru apariția coagulării, din 30 în

30 de minute, până la 6 ore. Dacă după intervalul de 6 ore nu a apărut coagularea și martorul
pozitiv aratăm ca o coagulare netă, se continuă incubația și se examinează încă o dată după 18
ore, înainte de a considera rezultatele testului ca negativ.

Majoritatea tulpinilor de stafilococ coagulazopozitive produc coagularea în interval de 3

ore de la începutul incubației. Stafilococii care au fost expuși o perioadă mai îndelungată acțiunii
antibioticelor manifestă tendința de a coagula lent plasma. Din aceste motive se prelungește
incubația până la 18 ore, deși în acest interval coagulul de plasmă poate fi dizolvat prin acșiunea
fibrinolizei stafilococice. Deci, tulpinile care coagulează lent plasma pot fi eronat considerate cu
tulpini coagulazonegative.

Bazați pe aceste constatări, este bine ca în practica de laborator să interpretăm ca test

pozitiv chiar și o coagulare incipientă, reprezentată de un coagul mic, care plutește în amestecul
lichid. În ceea ce privește sursa de plasmă pe care o utilizăm în testul de coagulare, este
preferabil sa utilizăm plasma de iepure și de cal și mai puțin plasma umană, deoarece primele
două pot fi păstrate în potime condiții 7 – 10 zile la ghețar, pe câtă vreme plasma umană nu mai
poate fi folosită dacă depășește 3 zile de păstrare. Plasma poate fi folosită ca atare sau diluată
1/10 în ser fiziologic steril.

Testul fibrinolizei. Prezența fibrinolizei stafilococice se pune în evidență prin

însămânțarea tulpinii izolate în plăci Petri care conțin un mediu alcătuit din 7 părți geloză
nutritivă 1,5% și o parte plasmă oxalată. După o incubație de 12 – 18 ore la 37°se observă o zonă
clară în jurul coloniilor de stafilococi, datorită acțiunii fibrinolizei, de topire a coagulului de
plasmă produs de coagulază.

Testul creșterii pe medii hiperclorurate. Se folosește mai ales în cazul depistării

purtătorilor sănătoși de stafilococi patogeni în nas și gât. Tampoanele cu exudat din nas se
însămânțează pe mediul de îmbogățire hiperclorurat lichid , cu o concentrție de CINa de 75‰,
care datorită conținutului crescut în CINa, inhibează flora de asociere și nu permite înmulțirea
decât pentru stafilococ. După incubare 36 de ore la 37 ° pe acest mediu, se fac treceri pe mediul
hiperclorurat solid Chapman, care conține în plus față de mediul anterior, agar, manită și roșu de
fenol. Din coloniile galbene, manito-pozitive, se fac subculturi pe geloză înclinată și se studiază
celelalte caractere de patogenitate.

Testul fosfatazei. Scindarea moleculei de fosfat prin fosfataza stafilococică corespunde cu

producerea de coagulază și poate fi utilizată ca test de patogenitate. Testul se realizează
adăugănd unui mediu de cultură solid sau lichid fosfat de fenolftaleină în proporție de 0,01%,
care este incolor în mediul ușor alcalin. După însămânțarea stafilococului și incubarea la 37°
timp de 24 de ore, fosfataza stafilococică realizează scindarea moleculei de fosfat și pune în
libertate fenolftaleina. Dacă se adaugă câteva picături dintr-o soluție puternic alcalină sau se
pune mediul în contact cu vapori de amoniac, se produce virajul de culoare spre roz, caracteristic
fenolftaleinei în mediu alcalin. În caz că molecula de fosfat de fenolftaleină nu a fost clivată de
fosfatază,, fenolftaleina nu mai este pusă în libertate și reacția de culoare nu mai are loc.

Testul pigmentogenezei. Se realizează prin însămânțarea tupinii de cercetat pe ser

coagulat sau pe geloză nutritivă cu 10% lapte și incubare 24 de ore la 37° pentru creștere și apoi
2 – 3 zile la temperatura camerei pentru evidențierea pigmentului. Stafilococii patogeni dezvoltă,
în majoritatea cazurilor, un pigment de culoare galben – auriu. Pigmentația de culoare galben –
citrin până la alb ca porțelanul se întâlnește mai frecvent la stafilococii nepatogeni, deși n u
constituie o regulă absolută. Testul pigmentogenezei are o valoare ajutătoare în cadrul celorlalte
teste de patogenitatein vitro.

Testul de patogenitate pe animal. Iepurele este cel mai sensibil dintre toate animalele de
laborator. Pe cale intravenoasă se realizează o septicemie mortală; pe cale subcutanată și
intramusculară apar abcese localizate. Prin injectația intradermică la iepure a toxinei
stafilococice se evidențiază acțiunea dermonecrotică. Șoarecele fiind mai rezistent poate fi
injectat experimental pe cale intraperitoneală dacă la inocilul de cultură se adaugă o cantitate de
mucină, care împiedică acțiunea de apărare celulară și favorizează astfel pătrunderea infecției.
Șoarecele mai poate fi infectat experimental prin injectarea intravenoasă sau intrapleurală de 0,2
ml cultură stafilococică, de 18 ore.

Atât șoarecelui, cât și cobaiului li se pot modifica reactivitatea față de stafilococ, prin
hipotrmie sau administrarea prealabilă de cortizon. Ambele favorizează difuzarea infecției
stafilococice în țesuturi și contribuie la diseminarea stafilococilor în organism.

Diagnosticul de laborator

La recoltarea produselor patologice din variate localizări pe care le determină stafilococii

patogeni la om trebuie să luăm totdeauna cele mai riguroase precauții pentru a evita
contaminarea produsului patologic cu stafilococi de pe piele sau din mediul înconjurător.

În colecțiile purulente închise, abcese, flegmoane, se recoltează puroiul prin puncție cu o

seringă sterilă prevăzută cu un ac gros, după o riguroasă antiseptizare prealabilă a pielii în locul
unde se face puncția. În meningite, și pleurezii se recoltează prin puncție cu seringa sterilă și ac
special lichidul cefalo – rahidian sau cel pleural, în condiții de asepsie riguroasă. Din colecțiile
superficiale și din plaăgile deschise se recoltează, cu pipeta Pasteur, cu ansa bacteriologică, cu un
tampon, cu o compresă sterilă, sau orice instrument chirurgical steril, respectând precauția de a
nu atinge pielea. În septicemii se recoltează sânge după tehnica hemoculturii, cu precauții
deosebite de antisepsie și asepsie, cu simplificarea la maximum a tehnicii de recoltare și
însămânțare a sângelui, pentru a preveni contaminările secundare. În mediul de cultură este util
să se adauge acid paraaminobenzoic (1 ml soluție sterilă 1‰ de acid paraaminobenzoic la 100 ml
mediu de cultură sau 1 ml dintr-o soluție de 1% de novocaină) sau penicilinază (1 ml dintr-umn
filtrat de cultură de 5 zile de Esch. Coli în bulion, la 100 ml mediu), în caz că recoltarea s-a făcut
de la un bolnav sub tratament cu sulfamide și penicilină. În toxiinfecțiile alimentare se recoltează
vomismentele, materiile fecale de la bolnav și o porțiune din alimentul incriminat în producerea
toxiinfecției. Pentru depistarea purtătorilor de stafilococ patogen în rinofaringe se recoltează
exudat faringian sau nazal, cu tampoane sterile.

Etapele diagnosticului. Din produsele purulentese face obișnuit un frotiu pe care îl

colorăm după metoda Gram, în care stabilim prezența cocilor gram – pozitivi izolați sau în
grămezi, fagocitați sau extracelulari și nenumărate celule polimorfonucleare distruse sau intacte.

Însămânțările produsului patologic se fac pe geloză înclinată și bulion. Dintr-o colonie

izolată pe geloză înclinatăcu caracteristicile de creștere a stafilococului se face un frotiu de
control colorat Gram, care arată prezența cocilor gram – pozitivi în grămezi și ciorchine
caracteristice și o subcultură în bulion și pe geloză înclinată pentru antibiograma și testele de
patogenitate. În cazul unui produs alimentar incriminat într-o toxiinfecție sau în cazul depistării
purtătorilor de stafilococ, se însămânțează în mediul de îmbogățire hiperclorurat lichid
(Chapman) și după 48 de ore de termostatare la 37° se fac treceri pe mediul solid selectiv
Chapman.

Coloniile manito – pozitive, de culoare galbenă, pe mediul Chapman, sunt selecționate și

trecute în subculturi pentru efectuarea testelor de patogenitate in vitro și in vivo.

În cazul toxiinfecțiilor alimentare este util să se efectueze un frotiu direct și diluții pentru
numărătoarea de microbi din alimentul incriminat. Prezența în număr mare a stafilococilor în
aliment oferă un criteriu de prezumție pentru considerarea ca aliment contaminat.

Diagnosticul de laborator în cazul toxiinfecțiilor alimentare nu trebuie să se limiteze doar

la stabilirea testelor de patogenitate in vivo și in vitro, pentru că nu toți stafilococii stafilococii
patogeni nu au capacitatea de a secreta enterotoxina. Este necesar să completăm , în aceste
cazuri, diaxină prin însămânțarea tulpinii izolate în geloză semisolidă 0,5% și incubare în
atmosferă cu 20% CO2. Filtratul acestor culturi, obținut prin trecere de filtre Seitz EKS și încălzit
30 de minute la 100°, reprezintă enterotoxina, pe care o identificăm experimental prin
intermediul testului Dolman (inoculare intraperitoneală 1 – 3 ml filtrat la pisici tinere de 500 –
800 g), care evidențiază enterotropismul toxinei prin apariția, după 15 – 120 de minute, a unei
stări de neliniște, urmată de somnolență, vărsături și diaree; testul pentru evidențierea acțiunii
enterotoxinei pe pisică poate fi efectuat și după o tehnică mai simplificată, descrisă de Hammon:
tulpina de stafilococ de cercetat se cultivă într-un tub cu 20 ml de bulion timp de minimum 5
zile. Apoi se fierbe cultura timp de 30 de minute. Se transvasează într-un tub de centrifugă steril,
apoi se centrifughează timp de 10 minute la 3000 de turații/minut . Se decantează steril
supernatantul. Se injectează la pisică intravenos, în vena safenă, 2 ml supernatant. Vom lua
precauția de a da animalului o mică cantitate de măncare înaintea injectării. Prezența
enterotoxinei este indicată prin apariția vomismentelor în interval de 15 minute până la 2 ore,
obișnuit la 30 de minute după injecție. Frisoane, febră și ușoară diaree pot să urmeze vărsăturilor
în intervalul de 2 – 4 ore după injectarea enterotoxinei. În 24 – 48 de ore, animalul își revine la
normal.

În cazul purtătorilor de stafilococ și mai ales în cazul studiului epidemiologic al unei

izbucniri epidemice intraspitalicești cu stafilococ, sunt de mare utilitate completarea
diagnosticului prin lizotipie bacteriofagică și încadrarea în cele IV grupuri fagice de stafilococ a
tipurilor corespunzătoare.

Testarea sensibilității la antibiotice și chimoterapice

O serie întreagă de compuși sulfamidați și antibiotice au efect asupra stafilococilor, iar

testarea sensibilității in vitro a microbului izolat prin antibiogramă este foarte utilă, pentru că
permite alegerea agentului terapeutic cel mai activ și o eventuală asociere a două sau trei
substanțe active, care acționează sinergic. Cu toate acestea, în cazul infecțiilor stafilococice în
special, posibilitatea rapidă a microbului de a dezvolta o rezistanță la orice chimioterapie și în
special la cele cu folosință largă face deosebit de dificilă eradicarea stafilococilor patogeni de la
indivizi infectați. Infecții stafilococice ale pielii, furunculoze, apar în special la adolescenți, unde
sunt favorizați de factori hormonali. Infecții similare se întâlnesc deseori și la indivizi sub
tratament îndelungat cu hormoni corticoizi.
 Epidemiologie și profilaxie

Principalele surse de infecție sunt leziunile umane, obiectele contaminate cu puroiul din
leziuni și căile respiratorii superioare ale omului. Infecțiile aeriene prin tuse, vorbit și strănut au
căpătat o importanță deosebită în spitale, unde o mare proporție de bolnavi și din personalul
medical și auxiliar sunt purtători de stafilococi patogeni în nas și gât. Neglijarea măsurilor de
igienă individuală, curățenie și asepsie riguroasă, ca și a controlului circuitului bolnavilor în
spitale, favorizează întinderea infecțiilor în toată colectivitatea spitalicească. Aerosolii cu
antibiotice și radiațiile ultraviolete au o valoare limitată. În multe spitale, din cauza folosirii pe
scară întinsă a antibioticelor celor mai variate, apar în rinofaringele purtătorilor tulpini de
stafilococi rezistenți la toate antibioticele uzualeși care aparțin aceluiași tip fagic. Tipizarea prin
fag, selecționarea și sterilizarea purtătorilor de stafilococ, asociate cu riguroase măsuri de igienă,
antisepsie, controlul circuitului funcțional, al spitalului și păstrarea a 1 – 2 antibiotice de rezervă
pot stabili dufuzarea unei infecții stafilococice intraspitalicești.

Tehnica preparării unui autovaccin antistafilococic

Se folosește tulpina de stafilococ izolată de la un bolnav, cultivată în bulion 4 – 5 zile, la

37°, pentru a putea încorpora în vaccin ți toxinele secretate de microbi lent, în mediul de cultură.
Cultura se poate face și pe geloză înclinată: în acest caz, după o incubașie de 24 de ore la 37° se
aspiră, cu o pipetă Pasteur sterilă, lichidul de condensare din tubul de cultură și se aruncă într-un
pahar conic cu amestec oxidant. Apoi, cu opipetă sterilă, se adaugă peste cultură 3 ml de ser
fiziologic steril și se aspiră de căteva ori, pentru a realiza o suspensie densă a microbilor în serul
fiziologic. Trebuie să ne ferim de a zgăria sau a rupe geloza pe care s-a făcut cultura, pentru a nu
antrena în vaccin și părțile de mediu. Suspensia densă de bacterii astfel realizată este transferată
într-o eprubetă sterilă cu perle de sticlă; aici agităm suspensia, pentru a desprinde eventualele
conglomerate de microbi. Pentru a realiza concentrația dorită, un miliard de bacterii pe ml,
folosim metoda nefelometrică. Din suspensia realizată se ia 1 ml cu o pipetă sterilă și se trece în
tubul comparator sau într-o eprubetă comparatoare a scarei nefelometrice Brown. Un etalon
improvizat se poate adăugând, la 8 ml vaccin antitifoparalitic, 4 ml de ser fiziologic, obținându-
se o suspensie cu opacitate echivalentă cu 1 miliard de bacterii pe ml. În eprubetă comparatoare
se adaugă cantități măsurate de ser fiziologic, până când obținem aceeași opacitate cu a tubului
din scara nefelometrică, care indică 1 miliard de bacterii/ml. Aceasta înseamnă că la opacitatea
realizată de noi prin diluarea suspensiei inițiale corespunde o concentrație de de 1 miliard de
bacterii pe ml. În acest fel se poate calcula ușor ce cantitate de suspensie și ser fiziologic.
Trebuie să folosim pentru a prepara 20 ml de vaccin. De exemplu, la 1 ml suspensie inițială s-au
adăugat 5 ml de ser fiziologic, pentru a obține concentrația de 1 miliard pe ml. Pentru 20 de
vaccin se vor lua 4 ml de suspensie și 20 ml de suspensie ( cei 4 ml în plus sunt necesari pentru
eventuale pierderi prin evaporare, la inactivare). Se realizează apoi, în condiții de sterilitate,
diluția stabilită prin nefelometrie și se inactivează vaccinul, o ora la 60 °, în baie de apă, luând
precauția ca apa fierbinte să depășească nivelul diluției de vaccin. După inactivare, se
însămânțează cate o picătură de vaccin un tub cu geloză înclinată și câte un tub cu bulion (aerob
și anaerob) pentru controlul inactivării și sterilității. Tuburile de control se păstrează o
săptămânîă la termostat la 37° și vaccinul la ghețar. Dacă după intervalul de o săptămână tuburile
de control rămân sterile, vaccinul se fenolează în proporție de o picătură din soluția 1% fenol la 2
ml de vaccin și se repartizează steril în fiole de 1 ml sau într-o fiolă de penicilină folosită. Pe
cutia de fiole sau pe cutia de penicilină se vor nota pe io etichetă numele și prenumele
bolnavului, autovaccin stafilococic 1 miliard/ml și indicații asupra dozajului 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ml,
subcutanat, etc.

SCHEMA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR ÎN INFECȚIILE STAFILOCOCICE

Schema A

Produs patologic: puroi, spută, exudat, lichid pleural, articular, peritoneal,

cefalorahidian, urină, etc.

- Frotiu direct din produs pe 2 lame, colorație Gram și albastru de metilen. În cazul
exudatului seroaselor lichidului cefalorahidian și urinei, frotiurile se efectuează din
sedimentul de centrifugare. Se colorează cu Gram, Giemsa pentru formula citologică.
- Însamânțare pe bulion și geloză sânge pentru obținerea coloniilor izolate.
- Treceri pe geloză înclinată și bulion dintr-o jumătate colonie izolată. Din cealaltă
jumătate de colonie se face un frotiu colorat cu Gram.
 După 24 de ore se poate elibera un buletin provizoriu de analiză, în care se indică
rezultatul examenului microscopic direct , eventual formula citologică și interpretarea ei,
aspectul coloniei și hemolizei precum și a frotiului din colonia izolată, colorat Gram.

- Din cultura în bulion, se efectuează antibiograma și eventual se inoculează intraperitoneal

la 2 șoareci sau intradermic la iepure.
- Din cultura pe geloză înclinată se fac treceri pentru testele de patogenitate in vitro:
- testul hemolizei;
- testul fibrinolizei;
- testul coagulazei;
- testul fermentării manitei (Chapman);
- testul creșterii pe medii hiperclorurate (Chapman);
- testul pigmentogenezei.
- Citirea testelor de patogenitate in vivo și in vitro și a antibiogramei.

Formularea buletinului definitiv de analiză cu indicarea spectrului de sensibilitate la

antibiotice.
 SCHEMA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR ÎN INFECȚIILE STAFILOCOCICE

Schema B

Produs patologic: sânge din septicemie recoltat prin tehnica hemoculturii

↓ ↓

10 – 20 ml sânge recoltat aseptic prin puncție Eventual frotiu direct din sânge în strat subțire
venoasă direct într-un balonaș cu 250 – 300 ml colorat cu Giemsa.

de bulion. (Eventual cu adaos de liquoid,

peniciliază sau PABA, dacă este cazul).

↓
Eventual incubarea unui al II-lea balonaș cu 10 ml de
sânge în 250 – 300 ml bulion în condiții de
microaerofilie.

Controlul creșterii microbiene în hemocultură:

- prin urmăriea apariției bulionului și al aspectului caracteristic

alformării de microcheaguri, datărită coagulazei stafilococice;
- prin treceri pe geloză – sănge și bulion;
- prin examen microscopic între lamă și lamelă.

↓ ↓

În cazul trecerilor negative, se În cazul transplantelor Se eliberează un buletin

urmărește hemocultura zilnic prin
treceri și examen microscopic.
Abia după 14 zile de incubare se
consideră hemocultura negativă.
pozitive pe geloza înclinată și
bulion se controlează puritatea
culturilor prin frotiu, se fac
însămânțări din bulion pentru
antibiogramă pe placi de
provizoriu de analiză în care
se indică prezența unui
micrococ gram – pozitiv
hemolitic în hemocultură.
 geloză – sânge.

Pe geloză – sânge se Se eliberează buletinul

controlează testul hemolizei și definitiv de ananliză, în care
se însămânțează pentru restul se indică toate caracterele
testelor de patogenitate in stafilococului patogen izolat și
vitro și se inoculează sensibilitatea la antibiotice.
intraperitoneal la 2 șoareci,
sau intradermic la iepure. Sen
citește antibiograma și restul
testelor de patogenitate in vivo
și in vitro.

Când testele de patogenitate nu sunt edificatoare pentru o tulpină de stafilococ patogen, se

recomandă efectuarea hemoculturii pentru că este posibil ca printr-o deficiență de asepsie să se fi
recoltat.

SCHEMA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR ÎN INFECȚIILE STAFILOCOCICE

Schema C

Produs patologic: exudatul rinofaringian și amigdalian pentru diagnosticul stării de purtător

Însămânțarea tampoanelor cu exudat rinofaringian și amigdalian, chiar la locul recoltării

sau cel mult după o oră de la recoltare, în tuburi cu mediul de ămbogățire Chapman lichid.
Incubare timp de 48 de ore, la 37°.

Se scot tampoanele din tuburi și din mediul de îmbogățire, se fac treceri în striuri paralele,
prin tehnica epuizării ansei pe mediul Chapman solid, pentru a obține colionii izolate.

Se face citirea plăcilor cu mediul Chapman. Coloniile manito – pozitive de culoare galbenă
sunt trecute în bulion și pentru testele de patogenitate in vitro.
 Se efectuează testele de patogenitate in vitro. Din bulion se însămânțează pe plăci cu
geloză – sânge pentru antibiogramă și se inoculează 2 șoareci intrapleural, sau intradermic la
iepure.

Se citesc testele de patogenitate, se citește antibiograma și se eliberează buletinul de

analiză care cornfirmă starea de purtător de stafilococ patogen cu mențiunea spectrului de
sensibilitate la antibiotice a tulpinii.

În cazurile de infecții intraspitalicești cu stafilococ, tulpinile izolate de la purtător vor fi

trimise pentru lizotipie la Centrul national de bacteriofag referință, de pe lângă Institutul "Dr. I.
Cantacuzino", în vederea investigațiilor epidemiologice și a aplicării măsurilor de combatere și
profilaxie.

SCHEMA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR ÎN INFECȚIILE STAFILOCOCICE

Schema D

Produs patologic în cazurile de toxiinfecție alimentară: materii fecale, vomismentele,

alimentele contaminate, exudate rinofaringiene, puroi din leziuni deschise de la persoanele care
mânuiesc alimente și presupune ca surse de contaminare a alimentelor.

- Se fac frotiuri directe din produs și se colorează cu albastru de metilen și Gram.

- Se fac suspensii în apă distilată sterilă din produsele patologice sau alimente lichide și
după triturare din cele solide și se însămânțează pe mediul de imbogățire lichid (eventual
în situații de necesitate urgentă se renunță la etapa de îmbogățire).
- Se fac subculturi din mediul de îmbogățire lichid prin epuizarea ansei pe mediul solid
hiperclorurat Chapman, pentru a obține colonii izolate. Atât coloniile manito – pozitive
galbene, cât și cele manito – pozitive roz se trec pe geloză și bulion pentru studiul testelor
de patogenitate și prepararea enterotoxinei.
- Culturile în bulion în vârstă de 5 – 8 ore se însămânțează în geloză moale 0,5% și se
incubează timp de 48 de ore la 37° , atmosferă 20% cu CO2. Se taie aopi geloza în bucăți
și se stoarce prin tifon. Lichidul obșinut se filtrează prin Seitz. Filtratul se fierbe timp de
30 de minute, apoi se injectează intraperitoneal la pisică după tehnica Dolman sau
Hammon.

Se eliberează buletinul de analiză, prin care se confirmă existența unei tulpini

enterotoxice de stafilococ, în produsul patologic sau alimente suspecte.