Microbiologia Alimentelor Voli

1
MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR
- volumul II -
Patogeni alimentari
Ediie mbuntit i revizuit
Editura Asclepius
Bucureti, 2011
Coordonatori:
Simona Ivana
Autori:
Alexandru T. Bogdan Iulian ogoe Gheorghe Cmpeanu
Simona Ivana Traian Enache Stelian Britreanu
Ipate Iudith Alexandru Popescu
ISBN electronic: 978-606-8236-25-4
2
Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tiprit n Romnia. Nici o
parte din aceast lucrare nu poate f reprodus sub nici o form, prin nici un
mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-o baz de date, fr acordul
prealabil, n scris, al editurii.
All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication
may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in
a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the
editor.
ISBN electronic: 978-606-8236-25-4
Editura Asclepius, Bucureti
Tel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01
Website: www.asclepius.ro, e-mail: editura@aslcepius.ro
3
Cuprins
CAPITOLUL 1
BACTERII PATOGENE CE SE TRANSMIT PRIN ALIMENTE 9
1.1. Patogeni alimentari 9
1.1.1. Introducere 9
1.1.2. Modul de transmitere 10
1.1.3. Patogenitate 11
1.1.3.1. Descrierea Quorum sensing 13
1.1.3.2. Bioflmele 16
1.1.3.3. Factorii sigma alternativi 19
1.1.3.4. Rspunsul la tolerana acid (ATR) 19
1.2. Bacteriile Gram pozitive 21
1.2.1. Listeria monocytogenes 21
1.3. Bacteriile Gram negative 22
1.3.1. Genul Salmonella 22
1.3.2. Escherichia coli 24
1.3.3. Genul Yersinia 25
1.3.4. Genul Shigella 26
1.3.5. Genul Vibrio 26
1.4. Concluzii 27
CAPITOLUL 2
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN
GENUL STAPHYLOCOCCUS 36
2.1. Staphylococcus aureus 36
2.1.1. Istoric 36
2.1.2. Taxonomie 37
2.1.3. Incidena speciilor de staflococi n alimente 38
2.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale 40
2.1.4.1. Temperatura 41
2.1.4.2. Efectul substanelor chimice 41
2.1.5. Caractere morfologice 45
2.1.6. Proprieti biochimice 45
2.1.7. Tipurile de enterotoxine staflococice i incidena lor 47
2.1.7.1. Proprieti chimice i fzice ale enterotoxinelor staflococice 49
2.1.7.2. Modul de aciune al enterotoxinelor staflococice 50
2.1.8. Ecologie 52
4
2.1.8.1. Habitat i distribuire 52
2.1.9. Patogenitatea 54
2.1.10. Structura antigenic 59
2.1.11. Infecia natural 60
2.1.12. Infecia experimental 62
2.1.13. Imunoproflaxie 62
2.1.14. Sindromul gastroenteritelor staflococice 63
2.1.15. Incidena toxiinfeciilor alimentare produse de staflococi i
alimentele vehicul 63
2.1.16. Prevenirea sindroamelor de intoxicaii staflococice i de alte
intoxicaii alimentare 64
2.1.17. Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA) 65
2.1.18. Metode de izolare i identifcare a lui Stp. aureus din alimente 66
CAPITOLUL 3
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL
BACILLUS 78
3.1. Bacillus anthracis 78
3.1.1. Taxonomie 78
3.1.2. Istoric 79
3.1.3. Morfologie 80
3.1.4.1. Aspecte culturale 81
3.1.6. Proprieti antigenice 82
3.1.7. Ecologie 83
3.1.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 83
3.1.12. Diagnosticul la om 86
3.1.12.1. Diagnosticul diferenial 86
3.2. Bacillus cereus 91
3.2.3. Sindromul diareic 92
3.2.4. Sindromul emetic 93
3.2.5. Determinarea numrului cel mai probabil de germeni (most
probable number, MPN) 94
3.3. Bacillus subtilis 100
3.3.1. Taxonomie 100
3.3.2. Caractere generale 100
CAPITOLUL 4
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERIILE DIN
GENUL CLOSTRIDIUM 111
4.1. Clostridium botulinum 111
4.1.2. Istoric 112
4.1.7. Ecologie 117
4.1.10. Intoxicaia botulinic 120
4.1.11. Situaia epidemiologic a botulismului 120
4.1.12. Situaia botulismului n Romnia, ntre anii 2003 i 2009, 122
4.1.13. Metode de izolare i identifcare a speciei 133
Clostridium botulinum din alimente 133
4.1.14. Detectarea lui C. botulinum viabil 135
4.2. Clostridium perfringens 138
4.2.2. Istoric 139
4.2.10. Prevenire i combatere 147
4.2.11. Metode de izolare i identifcare a lui C. perfringens din alimente
148
5
CAPITOLUL 5
IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL LISTERIA N
PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 160
5.1. Listeria monocytogenes 160
5.1.1. Caractere generale 160
5.1.2. Istoric 161
5.1.8. Structura antigenic 170
5.1.10. Izolarea i identifcarea 173
5.1.11. Listerioza uman 173
5.1.12. Epidemiologie 174
5.1.13. Transmiterea prin alimente 176
5.1.14. Transmiterea listeriozei la animale 178
5.1.15. Toxiinfeciile alimentare produse de Listeria monocytogenes
184
5.1.16. Proflaxie i combatere 186
5.1.17. Metoda i schema de lucru utilizat pentru izolarea i identifcarea
lui Lis. monocytogenes 189
CAPITOLUL 6
IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL MYCOBACTERIUM N
6.1. Mycobacterium avium subspecia paratuberculosis 201
6.1.1. Istoric 201
6.1.6. Ecologie 202
CAPITOLUL 7
IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN FAMILIA ENTEROBACTERIA-
CEAE N PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 208
6
CAPITOLUL 8
IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA N
8.1. Caractere generale 214
8.2. Istoric 215
8.3. Taxonomie 216
8.4. Morfologie 218
8.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 218
8.6. Proprieti biochimice 221
8.7. Proprieti antigenice 223
8.8. Nomenclatura salmonelelor 227
8.9. Ecologie 228
8.10. Patogenitate 229
8.11. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 231
8.12. Infecia experimental 231
8.13. Serotipuri de salmonele patogene 232
8.14. Salmoneloza non-tifoidic la om 235
8.15. Epidemiologie 241
8.15.1. Distribuia cazurilor de salmoneloz uman 243
8.15.2. Supravegherea salmonelozelor 244
8.16. Rezervoare i ci de infecie 245
8.17. Contaminarea alimentelor 246
Contaminarea crnii 246
Contaminarea oulor 247
Contaminarea laptelui i produselor lactate 247
Contaminarea n timpul manipulrii alimentelor 248
8.18. Msuri de prevenire i combatere a salmonelozelor 248
8.19. Diagnosticul de laborator al toxiinfeciilor alimentare produse de
salmonele 253
Recoltarea probelor 253
7
Cuvnt nainte,
Anul editorial 2010, n domeniul medicinii veterinare marcheaz apariia unei
lucrri deosebite, a unui tratat remarcabil de Microbiologie a alimentelor, att de
necesar ntr-o perioad, n care, sigurana i controlul alimentelor se impune, att ca
pruden proflactic ct i ca necesitate de aliniere acceptat, la tot ceea ce reprezint
reglementrile UE.
Lucrarea de fa este realizat pe baza unui material bibliografc extrem de bogat
i recent, care poart amprenta experienei profesionale i tiinifce a autoarei, cadru
didactic la disciplina de Microbiologie-Imunologie, din anul 1990.
O lucrare de asemenea dimensiuni (compus din cinci volume), acoperitoare a
domeniului microbiologiei, a nsemnat un adevrat curaj contient, bazat pe competen
i pe obligaia resimit de autor, de a pune la dispoziia celor vizai, nu puini la numr,
medici veterinari, medici umani, oameni de sntate public, cercettori, specialiti
microbiologi.
Nu n ultimul rnd, tratatul se adreseaz studenilor facultilor de medicin
veterinar i medicin uman, chemai s-i neleag importana, din punctul de vedere al
sntii animale i al scopului fnal, Sntatea Public.
O asemenea ntreprindere de lung respir pune la dispoziia generaiilor tinere, un
volum de cunotine selecionate i reprezint rspunsul evident, la acumularea informaiilor
microbiologice i la aplicaiile rezultatelor cercetrii, n domeniul biotehnologiei.
Modul de prezentare, fr repro, fuent, cu grija cadrului didactic i al omului de
tiin, pentru limbaj, exprimarea tiinifc ntr-un stil clar i corect mrturisete calitile
autoarei. Nu-i uor s-i convingi pe cei vizai, s participe la o asemenea lucrare, chiar
dac au motivaia necesar, nu-i uor s dai dovad de perseveren de a ncepe a urmri,
redacta, volumele tratatului, ntr-un stil unitar.
Volumul prim al Microbiologiei Alimentelor, cuprinde Bacteriologia General,
morfologia-structura celulei procariote, elemente de nutriie i metabolism bacterian,
creterea i multiplicarea, utilizri n biotehnologie, infuena factorilor fzici, chimici
i biologici asupra bacteriilor, genuri bacteriene i ciuperci microscopice (mucegaiuri,
levuri) izolate din alimente, sursele principale de microorganisme prezente n alimente,
tipuri de fermentaii i produse alimentare.
Mai puin obinuit, ntr-un asemenea tratat este pledoaria pentru cercetare, pentru
verifcarea ideilor, prin observaii i experimente, care s susin ipoteza de lucru, alturi
de deducie i inducie; sunt enumerate calitile cardinale ale celor chemai s lrgeasc
orizontul cunotinelor noastre (curiozitate, lipsa prejudecilor, scepticismul, creativitatea
i cooperarea, revizuirea opiniilor).
Lucrarea meritorie datorat faptului c pune la ndemn cititorilor avizai
numeroase informaii tiinifce, deosebit de utile n domeniile microbiologiei alimentelor.
Prof. univ. Dr. Constantin CIUFECU,
UMF Carol Davila,
Membru titular al Academiei de tiine Medicale
8
9
CAPITOLUL 1
BACTERII PATOGENE CE SE TRANSMIT
PRIN ALIMENTE
1.1. Patogeni alimentari
1.1.1. Introducere
Cu toate ca multe boli infecioase se pot transmite prin alimente (de
exemplu: listerioza, colita hemoragic), ne vom referi n acest capitol la
cele care produc mbolnviri exclusiv sau predominant prin consumul de
produse alimentare (botulism-intoxicaii staflococice).
Antraxul i bruceloza sunt dou zoonoze temute ce se transmit, ns
foarte rar prin consumul unor produse alimentare de la animalele bolnave.
n categoria patogenilor alimentari recunoscui se ncadreaz bacterii,
virusuri, fungi, prioni, protozoare, precum i parazii animali multicelulari.
Tabelul 1.1.
Patogeni alimentari
Bacterii Gram pozitive
Staphylococcus sp.
Bacillus cereus
B. anthracis
Clostridium botulinum, C. argentinensis
C. perfringens
Listeria monocytogenes
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis
Bacterii Gram negative
Salmonella
Shigella
Escherichia
Yersinia
Vibrio
Campylobacter
Aeromonas (?)
Brucella
Plesiomonas (?)
Virusuri
Hepatita A
Norovirusuri
(Norwalk, etc.)
Rotavirusuri
Prioni
Infecia Creutzfeldt-Jakob
(varianta nou)
1.1.2. Modul de transmitere
Este evident c pentru producerea unei toxiinfecii alimentare trebuie
ingerat fe agentul patogen, fe toxinele preformate ale acestuia. Cu excepia
toxinelor botulinice, aminotoxinelor i a toxinelor ftoplanctonului,
aproape toi agenii patogeni menionai pot f contactai pe cale fecal-
oral. Vehicularea acestora se face fe prin intermediul operatorilor din
industria alimentar, fe prin vectori (exemplu: insectele), fe prin elemente
constituente ale alimentelor, cum ar f ap contaminat (fg. 1.1.).
Figura 1.1.
Rute fecal-orale de transmitere a patogenilor intestinali de origine alimentar

Gur
Obiecte de joac
ale copiilor
Hran, tacmuri
Alimente
Degete
Insecte
Ap
Fecale
10
1.1.3. Patogenitate
Pentru ca gazda s fe invadat sunt necesare o suit de evenimente
nedorite, pe care agentul patogen trebuie s le execute:
1. s supravieuiasc trecerii prin mediul acid conferit de pH-ul gastric.
Unii ageni se protejeaz de acest mediu prin nglobarea n bolul alimentar,
iar alii folosesc mecanisme adaptative proprii de rezistena la pH-ul acid;
2. s se ataeze sau s colonizeze pereii intestinali, n aa fel nct
s-i poat mri populaia; Prima linie de aprare a organismului mpotriva
invaziei patogenilor alimentari este reprezentat de mucoasa intestinal. De
exemplu, Lis. monocytogenes strbate stratul de mucus prin intermediul
listeriolizinei (LLO), iar C. perfringens nu are nevoie s nving aceast
barier pentru c se pare c nu trebuie s se ataeze la esuturile intestinale.
3. s posede arme mpotriva mecanismelor de aprare ale gazdei (de
exemplu: limfonodurile asociate intestinului);
4. s fe pregtit de lupta cu noua armat heterogen a microforei
intestinale. Acest lucru se realizeaz pe principiul excluderii competititve,
prin faptul c microfora inofensiv odat ataat la toate situsurile
disponibile ale pereilor intestinali vor exclude alte microorganisme.
Deasemenea, tractul gastrointestinal reprezint un mediu srac n O
2
i,
de aceea, majoritatea microorganismelor de la acest nivel sunt anaerobe.
Totui, s-a observat c, de exemplu, S. typhimurium poate crete n astfel de
medii datorit capacitii sale de a ptrunde n celulele mamiferelor.
5. s fe capabili, odat ataai, s elaboreze produi toxici, ori s trea-
c de peretele epitelial i s patrund n celulele somatice sau n fagocite (de
exemplu: Lis. monocytogenes).
Capacitatea de a respecta aceste cerine nu este la dispoziia oricrui
agent microbian, majoritatea lor neputnt nvinge mecanismele defensive
ale organismului uman. Aceasta reprezint probabil motivul pentru care nu
se pot ncadra n categoria agenilor patogeni care se transmit prin consumul
de alimente.
Situsurile de ataare i mecanismele de virulen ale patogenilor
alimentari sunt discutate mai jos:
n fgura 1.2 este prezentat o diagram a aparatului digestiv al
omului, iar n tabelul 1.2 este prezentat o list cu agenii patogeni capabili
s colonizeze diferite organe i aparate. n tabelul 1.2 Helicobacter sp. este
prezentat ca find singura bacterie capabil s colonizeze pereii stomacului.
Se tie c Sarcina ventriculi (germen strict anaerob) se dezvolt n stomac,
dar nu este un patogen alimentar. Acelai lucru trebuie demonstrat i despre
H. peglosi. pH-ul stomacului n timpul ingestiei este ntre 3 i 5 putnd
11
ajunge chiar la 1,5 dac este privat de hran.
Figura 1.2.
Diagrama sistemului digestiv uman. Courtesy of John W. Kimball, 1965,
Andover Massachusetts
Dini
Limb
Glande salivare
Faringe
Epiglot
Ficat
Vezic
biliar
Duoden
Cecum
Apendice
cecal
Esofag
Stomac
Sfncterul
piloric
Pancreas
Intestinul gros
Intestinul subire
Rect
Anus
12
Tabelul 1.2.
Tipuri de toxiinfecii alimentare localizate la nivelul diferitelor organe la om
Musculatura scheletic
Trichinella spiralis
Stomac
Helicobacter pylori
Ficat
Clonorchis - viermele de glbeaz
(fascioloz)
Hepatita A i E
Intestinul subire
Astrovirusuri
Bacillus cereus
Campylobacter jejuni (poriunea
distal a ileonului)
Clostridium perfringens
Cryptosporidium parvum
Cyclospora cayetanensis
Escherichia coli - tulpinile EPEC i
ETEC
Giardia lamblia
Hepatita A
Rotavirusuri
Salmonella spp. (nontifoid) - poriunea
terminal a ileonului)
S. Typhi (poriunea distal a intestinului
subire)
Shigella spp. (poriunea terminal a ileonului i
jejunului producnd diareea apoas)
Toxoplasma gondii
Cestode
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia spp.
Intestinul gros/colon
Campylobacter spp. (colon)
E. coli - tulpinile EHEC (enterohemoragic) i
EPEC (enteropatogen) (colonul ascendent i
transvers)
Entamoeba histolytica
Plesiomonas shigelloides (form aparent)
Salmonella Enteritidis
Shigella sp., n special S. dysenteriae
1.1.3.1. Descrierea Quorum sensing
Aceast metod permite exprimarea anumitor funcii fziologice i
fenotipice bazate pe densitatea populaiei bacteriene. Este prezent aici
datorit rolului jucat de densitate n virulena unor bacterii i implicrii
acesteia n alte infecii.
Sistemul prototip pentru detectarea densitii este Lux1-LuxR
(Lux=gena luminiscent) descris prima dat n 1970 la Vibrio fsheri.
n fgura 1.3 este explicat metoda de detectare a densitii la bacteriile
Gram negative.
n partea stng a fgurii 1.3. o celul de V. fsheri secret moleculele
de autoinductor (AI) prin sinteza autoinductorului Lux I.
Se continu (cu un numr mic de celule) producia de AI, far s
apar vreun efect de comunicare ntre celule. AI se ataaz proteinei LuxR
care este un activator transcripional ce declaneaz expunerea genelor. n
tabelul 1.3 sunt prezentate cteva din expresiile fenotipice de la anumite
13
microorganisme.
Fig. 1.3.
Fr transcripia
genei int
Densitate
celular crescut
Densitate
celular sczut
Cu transcripia
genei int
Autoinductor (autoinducer)
Proteina R
Quorum sensing la organismele Gram negative are dou componente: proteina
activator transcripional (proteina R) i molecula AI care este produs prin sinteza
autoinductor. AI se acumuleaz n celul pn la nivelul de umplere al acesteia. n acest
moment se produce cuplarea moleculelor AI i activarea proteinei R inducnd expresia
genei. Proteina R este format din 2 domenii: proteina N-terminal care interacioneaz
cu AI i C-terminal implicat n legarea DNA-ului.
Moleculele AI ale bacteriilor Gram negative sunt N-acyl-HSL, (American Society
of Microbiology).
Tabelul 1.3.
Cteva rspunsuri fenotipice ale bacteriilor Gram negative,
ca o consecin a Quorum Sensing
Bacterii Gram negative Rspunsuri fenotipice
Vibrio fscheri
Escherichia coli
Escherichia coli mutanta LuxS
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli EHEC i EPEC
Serratia liquefaciens
Serratia marcescens
Pantoea stewartii
Pectobacterium carotovorum
Pectobacterium chrysanthemi
Burkholderia cepacia
Aeromonas hydrophila
Pseudomonas aeruginosa
Bioluminiscen
Producia toxinei Stx
ncetinirea vitezei de not
Formarea de att/eff
Rspuns SOS
Sistem secretor tipul III
Mobilitate foarte activ
Producie de prodigiozin; sinteza carbapenului
Creterea produciei de polizaharide
Producie de enzime care degradeaz peretele
celular al plantelor
Producerea liazelor pectate
Proteaze, producerea de siderofori
Producerea de exoproteaze
Structur de bioflm
Dac celula din stnga fgurii 1.3. se presupune a f V. fsheri, este non-
14
luminiscent, cea din dreapta este bioluminiscent datorit dobndirii unui
quorum de AI care se leag de LuxR.
Autoinductorul-2 (AI-2) reprezint un semnal alternativ al
quorumului la V. harveyi unde regleaz bioluminiscena n asociere cu
AI-1. Sistemul AI-2 a fost demonstrat la mai multe bacterii patogene Gram
negative. Numrul minim de celule necesare pentru a crea un quorum a
fost foarte rar raportat. ntr-un studiu al enterobacteriaceelor pshichotrofe de
origine alimentar, pentru a da un rspuns pozitiv biosenzorilor folosii, a fost
necesar un quorum de cel puin 10
6
ufc/g. Cele mai studiate i mai folosite
substane AI pentru bacteriile Gram negative sunt lactonele M-acetil-
homoserine (AHL
s
). Aceti compui sunt formai din homoserine (cu un
inel de lacton) i un lan acil cu 3 pan la 10 atomi de carbon (fg. 1.4.). Nu
toate bacteriile Gram negative folosesc sistemul Lux I-LuxR. De exemplu,
V. harveyi, E.coli i S. typhimurium prezint un sistem de producere diferit
al autoinductorilor. n plus, fa de AHL
S
, unele bacterii Gram negative
produc dipeptide ciclice implicate n detectarea quorumului, fe singure,
fe n combinaie cu AHL
S
.
Fig. 1.4.
Structura a 4 autoinductori quorum sensing (Degrassi et al.)
Legend: A = N-butanoil-L-lacton homoserin; B = N-hexanoil-L-lactoz
homoserin; C = ciclo(L-Tir-L-Pro); D = ciclo(L-Leu-L-Pro).
La patogenii alimentari a fost demonstrat creterea toxinelor Stx, iar
genele pentru Stx au fost induse de detectarea quorumului.
Anumite bacterii Gram negative psichotrofe produc AHL
S
n alimente
contaminate natural, cnd numrul de celule a ajuns la 10
5
-10
7
ufc/g.
Detectarea quorumului este important n formarea bioflmelor, iar
15
acest lucru este prezentat mai jos. n cazul bacteriilor Gram pozitive, AI-
urile sunt reprezentate de peptide, feromoni peptidici i nisin. Reglarea
densitii celulelor din aceste sisteme descrise de ctre Kleerebezen et. al.
se pare c urmeaz o tem comun, n care semnalul molecular este dat de
un peptid procesat post translaional care este secretat de un ATP-bending-
casette-exporter (exportator de casete ce leag ATP-ul).
Feromonul peptidic secretat funcioneaz ca un semnal input (input
signal) pentru un senzor specifc dintr-un sistem de transducie a semnalului
(signal-transduction system) format din dou componente. Este interesant
faptul c unele bacterii Gram pozitive cum ar f Bacillus spp. produc
lactonaze care degradeaz specifc AHL-urile produse de ctre bacteriile
Gram negative. Printre alte activiti fenotipice i fziologice demonstrate
la bacteriile Gram pozitive se numr rspunsul virulent produs de Stp.
aureus, precum i producerea de peptide antimicrobiene, altele dect nisina.
S-a demonstrat c aceasta din urm i induce propria sintez. Detectarea
axonului a fost demonstrat la Stp. aureus i Stp. epidermidis. Cnd cele
dou bacterii au fost cultivate mpreun, Stp. epidermidis s-a prut a f
favorit, ceea ce sugereaz c acest lucru ar putea f motivul pentru care
aceast specie predomin pe piele, unde feromonii autoinductori sunt mai
efcieni dect n interiorul corpului. La Stp. aureus un feromon octopeptidic
i manifest virulena prin activarea locusului agr.
Detectarea quorumului in vivo este problematic din cauza lipsei
generale de oportuniti pentru ca substanele AI s ajung la aceasta.
1.1.3.2. Bioflmele
Un bioflm este reprezentat de bacterii, fungi sau protozoare singure
sau n combinaii legate mpreun de o matrice extracelular ataat de o
suprafa solid sau ferm. Exemplele obinuite includ suprafeele mucoide
(slime surfaces) formate pe pietrele sau butenii din apele curgtoare,
placa dentar i stratul mucos de pe carne, pete, psri care s-au stricat n
frigider. Aceste bioflme ader la suprafeele respective, n special datorit
concentraiei mari de nutrieni. n studiile de laborator aderena la suprafee,
este mai mare n mediile mbogite. Ataarea este facilitat de o excreie
microbian exopolizaharidic ce poart uneori denumirea de glicocalix.
n acest micromediu se formeaz colonii care comunic ntre ele prin
canalele de ap formnd astfel un sistem circulator primitiv n care nutrienii
sunt adui nuntru, iar subprodusele toxice sunt eliminate. Celulele
microbiene din lichide care nu sunt cuprinse n bioflm se af ntr-o stare de
plancton (tree-foating).
16
n timp ce n condiii naturale bioflmele sunt compuse, de obicei, din
culturi mixte, n studiile de laborator acestea sunt formate din culturi pure.
Ca exemple de suprafee solide folosite pentru studiul bacteriilor
patogene din alimente se pot da: adezivul de podea, lamele de sticl, nylon,
policarbonat, polipropilen, cauciuc, oel inoxidabil, tefon, sticl i oel
inoxidabil sunt folosite pe scar larg.
Pe baza numeroaselor studii care au fost fcute pe alimente se pot
trage urmatoarele concluzii:
1. Cu toate c bioflmele de culturi pure apar n mediile de mbogire
(de exemplu: bulion triptic de soia), dup 24 de ore, la temperaturi adecvate
creterii, dezvoltarea maxim apare n 3 zile la 24
o
C. De exemplu Lis.
monocytogenes a crescut la 6-7log
10
/cm.
2. Nu toate tulpinile din aceeai specie sunt capabile n mod egal de
iniierea formrii bioflmului, iar ataarea la suprafee i formarea bioflmului
reprezint procese diferite.
3. Microorganismele din bioflme pot prezenta reacii fziologice
diferite faa de formele planctonice, iar bioflmele pot conine celule viabile,
dar care nu se pot cultiva n condiii de laborator.
4. Microorganismele din bioflme sunt foarte rezistente fa de agenii
de curire i sanitaie. Folosii n combinaie acetia sunt mult mai efcieni
n eliminarea bioflmului.
5. Ataarea unui patogen la diferite suprafee, poate f ajutat de
formarea unui bioflm de cultur mixt, iar un astfel de exemplu este
prezentat mai jos. ntr-un bioflm cu cultur mixt de Lis. monocytogenes
i Flavobacterium sp. pe suprafaa de oel inoxidabil Lis. monocytogenes a
aderat mai bine i a persistat mai mult dect n cultur pur.
Shewanella putrefaciens a format bioflme pe suprafeele inerte de
procesare ale alimentelor, iar cnd s-au adaugat nutrieni au fost formate
mai multe straturi de structuri. Tulpinile de Lis. monocytogenes izolate
din diferite epidemii umane au produs bioflme unice pe oelul inoxidabil.
Acestea erau n form de faguri de miere (honey comb)
Tulpina Scott a fost cea mai interesant prin faptul c nu a format
bioflme n condiii de laborator.
ntr-un alt studiu, tulpinile de Lis. monocytogenes care produc cea mai
mult substan extrapolimeric (EPS) au produs un bioflm tridimensional
n contrast cu tulpinile de control.
Formarea bioflmelor nu a putut f corelat cu serotipul. La
Pseudomonas aeroginosa DNA-ul extracelular a fost esenial pentru
formarea bioflmelor folosind un sistem fow-chamber. Cu toate c sursa
de DNA nu a fost determinat, DNA-aza 1 a dizolvat bioflmul sugernd c
17
DNA-ul reprezint o parte integral din structura bioflmului.
Celulele de Enterococcus faecalis au aderat la celulele cardiace Caco-2
i Girardi, dar mai slab dect cele de control.
Inhibarea formrii bioflmelor de ctre Bacillus subtilis (izolat din
algele marine) a fost demonstrat prin folosirea furanonelor.
Formarea bioflmelor pe echipamentele medicale de ctre bacterii
ca Ps. aeruginosa i Burkholderia cepacia, produc complicaii grave la
pacienii cu fbroz chistic.
Factorii sigma ()
Sigma reprezint una din cele 4 subuniti ale RNA polimerazei, iar
rolul su este acela de recunoatere a protomerului (unde RNA-polimeraza
se leag de DNA i ncepe transcripia). Subunitatea sigma este implicat
numai n formarea complexul iniial DNA-RNA polimeraz. Dup ce a fost
format o cantitate mic de RNA
m
factorul sigma disociaz n sigma A (sau
70
=numrul se refer la greutatea molecular n kilodaltoni) i sigma S.
Sigma A recunoate majoritatea genelor care codifc funciile eseniale ale
celulei. Cei mai cunoscui factori sigma sunt reprezentai de
28
implicat n
sinteza fagelilor la Salmonella i n sistemul de secreie tip III .
32
(RpoH) este implicat n sinteza proteinelor ocului caloric (heat-
shock proteins=HSP
s
).
54
regleaz genele harp (implicate n rspunsul hiperimun i n
patogenicitate) la cteva patovaroruri de Ps. syringae.
Sigma B i confer rezisten lui Lis. monocytogenes la condiiile acide
letale i lui B. subtilis n rspunsul la stres.
Sigma S este prezentat la proteobacteriile din subclasa gamma care
includ vibrionii. l ajut pe V. vulnifcus s reziste la condiiile de mediu
adverse.
Expunerea bacteriilor n condiii acide face ca acestea s dea
urmtoarele rspunsuri:
1. Scderea pH-ului intracelular prin folosirea unor pompe de
protoni, atunci cnd acetia sunt extrdai din citoplasma de PMF (proton
motive force = fora mobilizant de protoni);
2. Repararea unor macromolecule ca DNA i proteinele RecA;
3. Schimbri n componentele membranei celulare (de exemplu acizii
grai);
4. Reglarea exprimrii genelor de ctre factorii sigma alternativi;
5. Densitatea celulelor i formarea bioflmului;
6. Alterarea cilor metabolice.
18
1.1.3.3. Factorii sigma alternativi
Dac apare o schimbare stresant n mediul celular, acest lucru duce
la producerea factorilor sigma alternativi care ajut celulele s reziste n
condiii nefavorabile.
Factorul alternativ, sigma 38 este codifcat de ctre gene rpoS i
regleaz cel puin 30 de proteine. Expunerea la stress acid duce la sinteza de
proteine care protejeaz bacteriile.
n faza logaritmic (log) a creterii celulelor la un pH de 4,5 sunt
induse cel puin 43 de proteine.
n faza staionar la un pH de 4,5 sunt sintetizate 15 proteine.
1.1.3.4. Rspunsul la tolerana acid (ATR)
n cazul a dou tulpini de Lis. monocytogenes cultivate ntr-un mediu
defnit chimic prin folosirea de HCl, pH-ul minim de cretere a fost de
3,5-4.
Mutantele de Lis. monocytogenes care au prezentat ATR crescut au
demonstrat letalitate mare pentru oareci, comparativ cu tulpinile slbatice,
sugernd c n condiii acide acestea ar putea f selective pentru tulpinile cu
virulen crescut.
n mod similar celulele de Yer. enterocolitica adaptate la un pH 5 (de
la un pH de 7,5) au fost mult mai enteropatogene dect celulele de control,
cnd au fost testate pe oarecele sugar.
Factorul sigma B a fost identifcat la Lis. monocytogenes, B. subtilis
i Stp. aureus, iar funcia sa a fost comparat cu cea a lui
5
/RpoS de la
bacteriile Gram negative.
La B. subtilis, sigma B infueneaz reglarea a 100 gene, ca rspuns la
stresul energetic. Mutantele de B. subtilis sunt mai sensibile la cldur, eta-
nol, acid, nghe, uscciune. n mod paradoxal o tulpin de Lis. monocyto-
genes rezistent la presiunea hidrostatic, a manifestat rezisten la cldur,
acid i peroxid de hidrogen.
S-a descoperit c adaptarea lui Lis. monocytogenes la un pH acid ar
putea depinde de ali parametrii de cretere.
Proteina sigma B asigur rezistena maxim a lui Lis. monocytogenes la
doze letale de acid. Sigma B alturi de sigma S sunt asociate cu rspunsurile
la condiiile de stres, att la bacteriile Gram pozitive, ct i la cele Gram
negative.
Sigma B joac un rol important n rezistena acid a celulelor bacteriene
din faza staionar, rezistena la stresul osmotic i oxidativ i la creterea la
19
temperatur joas a Lis. monocytogenes. Adaptarea la mediul acid confer
protecia mpotriva HHP i ngheului.
Tulpinile adaptate la un pH acid de Shi. fexneri i Shi. sonnei au
supravieuit pan la 14 zile n sucul de roii i mere la 7
0
C. pH-ul minim
necesar dezvoltrii n BHI acidifat pentru Shi. fexneri i Shi. sonnei a fost
de 4,75 i respectiv 4,5.
ntr-un studiu pe E. coli adaptat la pH acid s-a demonstrat c aceasta
a rmas pe carcasele de vit, chiar i dup o splare a acestora cu acid acetic
2%.
Rezistena la pH acid a fost foarte bine studiat la Shigella. Gorden
i Small au descoperit n culturile examinate c 9 din 12 bacterii din genul
Shigella erau rezistente la pH acid; 11 din 15 tulpini de E. coli (incluznd
tulpinile K
12
) au manifestat aceeai rezisten, iar din 12 salmonele studiate
toate au prezentat rezisten la pH acid.
Aceiai cercettori au stabilit i motivul pentru care boala poate f
produs de un numr mic de germeni. Ei au ajuns la concluzia c dup ce
aceste microorganisme prsesc colonul, ele intr n faza staionar, n afara
gazdei. n urma ingestiei de ctre alt gazd, ele sunt deja rezistente la pH-
ul acid al stomacului.
ntr-un alt studiu tulpinile de E. coli productoare de Stx, care nu puteau
supravieui la un pH de 2,5 au devenit acidorezistente prin introducerea unei
gene rpoS ntr-o plasmid. Cnd tulpinile de E. coli productoare de Stx
s-au dezvoltat pe diferite alimente la un pH de 4,6-4,7 ele au devenit de 2
ori mai rezistente la radiaii dect culturile de control.
n timp ce doza infecioas de salmonele pentru om este de aproximativ
10
5
, atunci cnd este administrat n condiii defnite, boala poate f provocat
prin consumul de alimente ce conin 50-100 celule (ali cercettori susin c
poate f provocat doar de 10 celule).
O tulpin virulent pentru oareci de S. typhimurium este mult mai
acidorezistent dect tulpina nevirulent.
ntr-un studiu asupra rezistenei relative a lui V. vulnifcus i fagii
si, ambii au fost sensibili la un pH <3, ns fagii s-au dovedit a f mai
acidorezisteni dect celulele lor gazd.
Stresul provocat de frig sau cel provocat de frig i aciditate, la E. coli
0157:H7 nu a avut nici un efect asupra producerii factorilor de virulen,
ns creterea n mediu acid (pH 5,5) au nlesnit exprimarea genelor eaeA i
hlyA. Stresul la frig s-a produs prin expunerea la 4
o
C.
20
1.2. Bacteriile Gram pozitive
n general bacteriile patogene Gram pozitive produc substane
extracelulare responsabile de majoritatea factorilor de virulena (de exemplu
Staphylococus aureus).
Gastroenteritele sunt produse de ctre tulpinile enterotoxigene.
Toxiinfeciile alimentare produse de C. botulinum, C. perfringens i B.
cereus se datoreaz tot producerii de exotoxine.
Botulismul este produs de o neurotoxin puternic elaborat de
bacteriile care se dezvolt n alimentele susceptibile.
Enterotoxina produs de C. perfringens (CPE) este o protein
asociat endosporului produs n timpul sporulrii celulelor bacteriene n
tractul gastrointestinal. Toxina produs de B. cereus este o exotoxin, dar
componentele toxice care cauzeaz sindromul diareic nu sunt foarte bine
cunoscute.
Stp. aureus a fost prima bacterie izolat din alimente creia i s-a stabilit
modul de patogenitate. A fost studiat pentru prima dat de ctre Denys,
n 1894 i apoi de ctre Barder, n 1914 prin reproducerea simptomelor
infeciei alimentare produs de staflococi pe el nsui. Deck, n 1930, a
reprodus boala pe studenii absolveni voluntari, care au consumat alimente
inoculate cu un fltrat de cultur de S. aureus.
1.2.1. Listeria monocytogenes
Cu toate c este o bacterie Gram pozitiv este foarte diferit de
cele menionate mai sus. Diferena notabil const n faptul c este
un patogen intracelular. Aceasta ptrunde n citosol, unde se replic i
folosete acidul lipoic de la gazd pentru replicare. Pentru a invada celulele
epiteliale, internalina interacioneaz cu E-caderina de pe celulele gazd
umane (E-caderinele de la oarece sau obolan nu sunt receptori pentru
internalin).
Cu toate c tulpinile virulente produc listeriolizin O (LLO), o
substan extracelular, activat de ctre tiol, formatoare de pori, nu se
produce sindromul de gastroenterit de origine alimentar, ca atare.
LLO este o hemolizin implicat n invadarea epiteliului intestinal ce
contribuie la rspndirea de la o celul la alta a microorganismului.
Secvena PEST (P = prolin; E = acid glutamic; S = serin; T =
treonin) a LLO este esenial pentru virulena lui Lis. monocytogenes.
Dup ce iese din lizozomi, aceast secven induce macrofagele gazdei s
degradeze LLO. Mutantele fr secvena PEST ptrund n citosol i omoar
21
celula gazd.
Mecanismul de aciune (strbaterea barierei mucoasei intestinale i
ptrunderea n celulele epiteliale) nu este pe deplin cunoscut. De asemenea,
numai 1/3 din oamenii contaminai manifest simptome.
Primul rspuns de aprare al organismului mpotriva listeriilor este
reprezentat de macrofage, n special de celulele Kuppffer din fcat. Ele
ptrund n aceste celule find internalizate n celule M, n mod nedistructiv.
Acest lucru este urmat de inducerea imunitii mediate de celulele T.
Neutroflele polimorfonucleare (PMN) lizeaz celulele parenchima-
toase infectate de Listeria sp. i expun bacteria fagocitelor profesionale.
PMN conin anioni superoxizi, enzime proteolitice i ali factori.
Cnd aceste neutrofle interacioneaz cu Lis. monocytogenes ele
prezint creteri ale citochinelor (interleukina-1beta, interleukina 6, factorul
de necroz tumorala=TNF).
Odat ce listeriile sunt fagocitate, celulele ies prin liza membranei
vacuolare cu LLO, se mic prin citosol prin flamentele de actin, iar apoi
se rspndesc n celulele nvecintate unde procesul se repet. Tulpinile
virulente se deosebesc de cele nevirulente prin capacitatea de aderare i
de ptrundere prin bariera mucoas i epitelial i prin capacitatea de a se
rspndi de la o celul la alta cu ajutorul LLO.
1.3. Bacteriile Gram negative
Mecanismele de virulen ale bacteriilor Gram negative sunt mult mai
complexe i variate faa de cele ale bacteriilor Gram pozitive.
1.3.1. Genul Salmonella
Se presupune c genurile Salmonella i Escherichia s-au desprins
dintr-un strmo comun n urm cu 120-160 milioane de ani. Toate
serovarurile de S. enterica poart insulele de patogenitate 1 i 2 (SPI-1,
SPI-2) care au fost obinute prin transfer orizontal, prin plasmide sau prin
fagi.
La S. typhimurium sunt necesare cel puin 60 de gene pentru virulen.
Prin comparaia dintre secvenele 16s i 23s ale RNAr s-a demonstrat c
salmonelele sunt nrudite cu E. coli i cu shigelele. Serovarurile monofazice
de salmonele sunt adaptate la mamifere, iar cele bifazice la reptile.
S. enterica i E. coli posed un numr mare de fenotipuri mutagene,
ceea ce a dus la mrirea numrului de recombinri ntre diferite specii.
La S. typhimurium a fost demonstrat prezena unei enterotoxine
22
polipeptidice de 29 kDa, care posed urmtoarele trsturi: 1. reacioneaz
cu toxina holeric; 2. activeaz adenilat-ciclaza; 3. receptorul celular preferat
al celulei gazd este gangliozidul GM
1
; 4. testul ansei ileale este pozitiv.
Aceste concluzii sugereaz c toxina ar putea juca un rol n producerea
diareei n sindromul salmonelic, ns rolul n invazia intracelular i n
patogeneza subsecvenial este neclar. Producia altor proteine citotoxice a
fost raportat la salmonelele non-tifoide.
Tulpinile virulente de S. enterica iniiaz infecia n celulele non-
fagocitare, atandu-se la mucoasa intestinal cu ajutorul adezinelor
fmbriale, codate de o gen de pe SPI-1. Aceasta, este urmat de penetrarea
foliculilor limfoizi ai plcilor Peyer din mucoasa intestinal. Iniierea
infeciei are loc n ileon. O dat intrate salmonelele invadeaz celulele M
ale plcilor Peyer. Din veziculele acestor celule ele intr n lizozomi.
Tulpinile virulente de S. enterica secret n citoplasm o protein
(SpiC) care previne fuzionarea veziculelor cu lizozomii.
S. typhimurium conine fmbrii care ader selectiv la celulele M. Pentru
a ptrunde n celulele non-fagocitare sunt ajutate de un sistem de secreie
de tip III.
Dup observaiile lui Galn, acest mecanism de ptrundere implic
o interaciune intim ntre bacterie i celula gazd, care rezult din cross-
talk. Consecina se traduce prin rearanjri ale citoscheletului membranei i
ptrunderea bacteriilor prin macropinocitoz. Are loc producerea de citokine
(interleukina 8) i apariia neutroflelor de-a lungul celulelor epiteliale. Odat
intrate n aceste celule ele rmn n vacuole ataate de membrane pe toat
durata fazei intracelulare. Dup multiplicare, celulele se rup, avnd loc
rspndirea salmonelelor. Ptrunderea acestora n macrofage este nsoit
de schimbri la nivelul membranei i de macropinocitoz. Odat intrate n
membrane, ptrund n interiorul fagozomilor care se mresc n volum. S.
typhimurium induce apoptoz n macrofage.
Serovarurile de salmonele nontifoide au grade diferite de patogenitate
pentru om. S. Pullorum i S. Gallinarum sunt slab patogene, iar S.
Choleraesuis, S. Dublin i S. enteritidis sunt nalt patogene.
Salmonella Choleraesuis se izoleaza mai frecvent din snge, dect din
scaunele bolnavilor. Acest serovar mpreun cu S. Dublin sunt asociate cu o
mortalitate mai mare la om. S. Choleraesuis produce de obicei septicemie.
ntr-un studiu pe 19 cazuri cu salmoneloz cauzat de acest serovar, toate
victimele au fcut septicemie.
23
1.3.2. Escherichia coli
Tulpinile patogene se grupeaz n 5 grupe. Vom aborda n cele ce
urmeaz tulpinile enteropatogene (EPEC) i pe cele enterohemoragice
(EHEC).
Dup cum am mai menionat, Salmonella i Escherichia provin
dintr-un strmo comun i din aceast cauz genele de virulen au fost
schimbate ntre ele prin transfer orizontal. Insula de patogenitate de pe
cromozomul EHEC i EPEC include LEE care conine gene eae care
codifc intimina, esenial pentru ataare-anulare (attachment-effacement,
A-E). Gena eae i LEE sunt transferate orizontal la EHEC.
Tulpinile EPEC conin proteina espB, care le face similare cu EHEC.
Se pare c tulpinile EHEC provin din EPEC prin achiziia toxinelor shiga
codifcate de fagi. n acest sens, exist dovezi care arat evoluia secvenial
a lui EHEC din EPEC O55:H7, dobndind mai nti gene Stx
2
, separate
apoi n dou ramuri. Tulpinile din prima ramur, sorbitol i -glucuronidaz
negative (clona O157:H7), iar cele din cea de-a doua ramur produc
glucuronidaz i sorbitol (clona O157:H7). Acest lucru a fost demonstrat
prin electroforez enzimatic multilocular.
Tulpinile EHEC au nevoie pentru colonizare de intimin (dar nu
este sufcient pentru adeziune). Posibila folosire a vaccinurilor, bazate pe
intimin a fost sugerat pentru protejarea vacilor mpotriva infeciilor cu
EHEC. Patogenitatea acesteia se datoreaz toxinei Stx, endotoxinelor i
citokinelor derivate de la gazd, cum ar f factorul de necroz tumoral
(TNF-) i interleukin 1. Toxinele Stx
1
i Stx
2
inhib sinteza proteinelor
n celulele endoteliale, iar receptorul lor este globotriasilceramida (Gb3).
Stx
2
este mai toxic dect Stx
1
pentru celulele endoteliale microvas-
culare ale intestinului uman, iar aceast descoperire ar putea f relevant
pentru preponderena produciei de Stx
2
n colitele hemoragice infecioase.
Tulpinile EPEC au nevoie pentru aderen i autoaglutinare de
bundle-forming pili (bfp) (pili formatori de grmezi), de tip IV formai
de plasmide. ntr-un studiu pe voluntari umani s-a observat c mutantele
care nu posed bfp au cauzat un sindrom diareic mai puin sever, find de
200 de ori mai puin virulente.
Citrobacter freundii i Hafnia alvei produc leziuni A/E, n special la
unele specii de animale, dar nu s-a demonstrat nc, c ar putea f patogeni
alimentari.
24
1.3.3. Genul Yersinia
Yesinia enterocolitica (i alte specii) posed un determinant
cromozomal implicat n prelucrarea ferului, care este privit ca o insul de
patogenitate (PI). Aceast insul se gsete n special la tulpinile EAggEC
i, mai rar la EPEC, EIEC i ETEC; este absent la EHEC, salmonele i
shigele.
A fost probabil dobndit prin transfer orizontal ntre Yer. pestis i
unele tulpini de E. coli. Cel mai important mecanism de patogenitate la
Yer. enterocolitica, Yer. pestis i Yer. pseudotuberculosis este reprezentat de
virulonul proteic extern (yersiniae outer protein virulon) (Yop).
Acest virulon permite yersiniilor s supravieuiasc i s se multiplice
n esutul limfoid al gazdei find format din 4 componente. Yop este codifcat
de o plasmid de 70kb, pYV i posed insula de patogenitate nalt 1, care
este necesar pentru exprimarea virulenei i determin dependena de
Ca
2+
.
Yop este sintetizat la 37
0
C i translocat n celulele mamiferelor
n momentul contactului cu acestea. Bacteriile Gram pozitive pot secreta
aceste proteine n afara celulei, find lipite de membrana extern.
n sistemul secretor de tip 1 al bacteriilor Gram negative, proteinele
acestora sunt secretate direct din citoplasm n mediu prin dou proteine
citoplasmatice i una din membrana extern.
Aportul de secreie al yersiniilor este n mod normal inut nchis n
membrana extern de ctre YopN care acioneaz ca un dop.
YopN poate f ndeprtat prin eliminarea Ca
2+
, moment n care
proteinele Yop sunt secretate din citoplasm la exterior. Proteina YopP este
responsabil de supresia secreiei de -TNF de ctre macrofagele infectate.
Cnd Yop vine n contact cu celula eucariot se formeaz un mecanism
de microinjecie, ce permite proteinei s treac direct n celul prin sistemul
secretor de tip III. Acest proces a fost descris de ctre Silhavy ca find
moartea macrofagelor prin injecie letal. Falkow a descris plastic acest
proces prin urmatoarele cuvinte: shigelele oblig macrofagele s comit
suicid.
Sistemul secretor de tip III de la S. typhimurium a fost descris ca
structur supramolecular, att a membranei interne, ct i a celei externe.
Bacteriile patogene pentru plante, ca de exemplu, cele din genurile
Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas i Ralstonia posed sistem de tip III.
Un sistem de tip IV l posed Agrobacterium tumefaciens (bacterie patogen
pentru plante).
25
1.3.4. Genul Shigella
Celulele M din plcile Peyer (din ileonul terminal) sunt invadate
de shigele, salmonele, EPEC sau virusuri. Tulpinile invazive de Shigella
fexneri ptrund n celulele M ale colonului i rectului, iar macrofagele mor
prin apoptoz. Rezultatul se traduce printr-un rspuns infamator acut nsoit
de dizenterie. Acest tip de distrugere produce pierderea de snge i mucus
din lumenul intestinal. Datorit faptului c absorbia apei de ctre colon
este inhibat, rezult scaunele dizenterice apoase. Acest lucru se datoreaz
multiplicrii shigelelor n timpul trecerii lor n jejun. Dintre toate speciile
de shigele, Shi sonnei produce cel mai des diaree apoas. n ceea ce privete
doza minim infecioas s-a stabilit ntr-un studiu pe voluntari c doar 10
celule au reprodus boala la 10% dintre acetia, iar o doz de 500 de celule a
produs infecia la 50% dintre subieci.
Toxina Shiga de tip 1de la Shi. disenteriae se combin cu galabioza i
inhib sinteza proteinelor. Sindromul uremic hemolitic (HUS - Hemolytic
Uremic Syndrome) produs de tulpinile EHEC ale lui E. coli, poate f uneori
generat i de Shi. dysenteriae.
1.3.5. Genul Vibrio
La V. parahaemolyticus patogenitatea este asociat cu producerea de
TDH (thermostabile direct hemolysin) (hemolizin termostabil direct).
Aceasta este responsabil de: hemoliza, ptc (pore-forming capacity), efectele
citotoxice, letalitatea la animalele mici i enterotoxigenicitate.
Tulpinile 01 ale lui V. cholerae colonizeaz epiteliul intestinului subire
(n special celulele M), ceea ce duce la diaree profuz. Factorii primari de
virulen ai acestei tulpini sunt reprezentai de: TCP (toxin-coregulated pili),
necesari pentru colonizarea intestinal i de toxina holeric (CT) (cholera
toxin), care este o enterotoxin. Genele pentru CT (ctxAB) fac parte dintr-un
element genetic mai mare, CTX care constituie genomul unui bacteriofag
flamentos, denumit CTX nrudit cu colifagul M13.
Ultimele investigaii au artat c CTX izolat din 10 tulpini de V.
cholerae a infectat tulpinile CT negative. Totui aceti cercettori au
menionat c inducia fagic s-ar putea s nu aib loc n intestinele umane.
Acest locus de patogenitate reprezint un exemplu de transfer orizontal
de gene care poate duce la apariia unor noi tulpini patogene.
O caracteristic neobinuit a lui V. cholerae o reprezint faptul c
posed doi cromozomi circulari. Cel mare conine peste 2,96 milioane de
baze i conine i gene implicate n virulen. Cromozomul mic conine
26
peste 1,07 milioane de baze i multe gene cu funcii necunoscute.
Subunitatea toxinei holerice B (CTB) se ataeaz la gangliozidul GM
1

al receptorilor de suprafa celulari.
Rolul bacteriofagilor n transmiterea genelor de virulen este ilustrat
de elementul genetic CTX.
n cazul patogenilor alimentari, genele sunt mediate fagic pentru
urmtoarele toxine: enterotoxina staflococic A, Stx
1
i Stx
2
de la tulpinile
EHEC de la E. coli i toxinele botulinice.
1.4. Concluzii
n tabelul 1.4 sunt prezentate 8 bacterii Gram negative care posed
cel puin o proprietate ce poate f asociat cu patogeneza bacteriilor din
alimente. Ele nu reprezint ageni patogeni alimentari primari deoarece sunt
incapabili s adere i s invadeze celulele epiteliale.
Aeromonas hydrophila i Plesiomonas shigeloides s-au afat pe lista
de supraveghere a microbiologilor timp de 2 decenii, dar nu s-a putut
demonstra c pot produce gastroenterit n absena unui alt enteropatogen.
n tabelul 1.5 sunt prezentai ultimii 8 patogeni alimentari descoperii.
nvCJD este cea mai nou toxiinfectie alimentar descoperit.
Tabelul 1.4.
Exemple de bacterii Gram negative care posed factori de virulen
Bacterii Gram negative Factor de virulen
Aeromonas caviae
A. hydrophila
Bacteroides fragilis
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
Hafnia alvei
Klebsiella pneumoniae
Plesiomonas shigelloides
Enterotoxin
Enterotoxin citotoxic
Enterotoxin
Enterotoxin termo-stabil; Leziuni A/E (attaching and effacing)
Enterotoxin termo-stabil
Producere leziuni A/E
Tabelul 1.5.
Cei mai receni patogeni de origine alimentar
Patogen/Sindrom Anul n care a fost descoperit
Botulismul la copii
Yersinia enterocolitica
Cyclospora cayetanensis
Norwalk i virusuri nrudite
Vibrio cholerae non-01
E. coli enterohemoragic
Creutzfeldt-Jakob (v CJD) varianta nou
1976
1976
1977
1978
1979
1981
1982
1996
27
Bacteroides sp.: Bacili gram negativi
Mediu Thiosulfate Citrate Bile Salt Su-
crose agar (TCBS) utilizat pentru izolarea
selectiv a Vibrio cholerae i Vibrio para-
haemolyticus din probe clinice. n imagine
colonii de 24 ore, incubate n aerobioz la
35C de Vibrio cholerae (galbene), Vibrio
parahaemolyticus (colonii verzi), Staphy-
lococcus aureus nu a crescut.
Mediu Agar Eosin-Albastru de Metilen
(EMB): difereniaz bacteriile enterice
Gram-negative pe baza fermentrii lactozei.
Bacteriile lactozo-fermentative formeaz
colonii netede verde metalizat sau albastru
nchis pn la brun nchis. Bacteriile care
nu fermenteaz lactoza formeaz colonii
incolore sau transparente uor purpurii. n
imagine cultur aerob de 24 ore, 35C:
colonii E. coli bine crescute, cu luciu verde
metalizat i colonii Klebsiella pneumoniae
bine crescute, purpurii, rugoase.
Mediu Agar Salmonella-Shigella (SS):
mediu selectiv i diferenial pentru bacilii
enterici patogeni (n special salmonele).
Bacteriile lactozo-fermentative (E. coli,
Klebsiella pneumoniae) formeaz colo-
nii mici roz sau roii. Bacteriile lactozo-
nefermentative (Salmonella sp., Proteus
sp., Shigella sp.) formeaz colonii incol-
ore. Prin producia de H
2
S centrul coloni-
ilor produse de salmonele se negrete. n
imagine cultur aerob de 24 ore, 35C:
colonii incolore, cu centrul netru de Salmo-
nella typhi i colonii roz de E. coli.
28
Bibliografe selectiv
Archer, D.L. 1996. Preservation microbiology and safety: Evidence that stress 1.
enhances virulence and triggers adaptive mutations. Trends Food Sci. Technol.
7:91-95.
Bagamboula, C.F., M. Uyttendaele, and J. Debevere. 2002. Acid tolerance of 2.
Shigella sonnei and Shigella fexneri. J. Appl. Bacteriol. 93:479-486.
Bagge, D., M. Hjelm, C. Johansen, I. Huber, and L. Gram. 2001. 3.
Shewanellaputrefaciens adhesion and bioflm formation on food processing
surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 67:2319-2325.
Baumler, A.J., R.M. Tsolis, T.A. Ficht, and L.G. Adams. 1998. Evolution of host 4.
adaptation in Salmonella enterica. Infect Immun. 66:4579-4587.
Berry, E.D., and C.N. Cutter. 2000. Effects of acid adaptation of Escherichia coli 5.
0157:H7 on effcacy of acetic acid spray washes to decontaminate beef carcass
tissue. Appl. Environ. Microbiol. 66:1493-1498.
Bieber, D., S.W. Ramer, and C.-Y. Wu. 1998. IV pili, transient bacterial aggregates, 6.
and virulence of enteropathogenic Escherichia coli. Science 280:2114-2118.
Blackman, I.C., and J.F. Frank. 1996. Growth of 7. Listeria monocytogenes as a
bioflm on various food-processing surfaces. J. Food Protect. 59:827-831.
Boerlin, P., S. Chen, and J.K. Colbourne. 1998. Evolution of enterohemonhagic 8.
Escherichia coli hemolysin plasmids and the locus for enterocyte effacement in
Shiga toxin-producing E. coli. Infect. Immun. 66:2553-2561.
Boland, A., andG.R. Cornells. 1998. Role of YopP in suppression of tumor necrosis 9.
factor alpha release by macrophages during Yersinia infection. Infect. Immun.
66:1878-1884.
Borucki, M.K., J.D. Peppin, D. White, F. Loge, and D.R. Call. 2003. Variation 10.
in bioflm formation among strains of Listeria monocytogenes. Appl. Environ.
Microbiol. 69:73367342.
Bremer, P.J., I. Mond, and CM. Osborne. 2001. Survival of 11. Listeria monocytogenes
attached to stainless steel surfaces in the presence or absence of Flavobacterium
spp. J. Food Protect. 64:1369-1376.
Buchanan, R.L., S.G. Edelson, and G. Boyd. 1999. Effects of pH and acid resistance 12.
on the radiation resistance of enterohemorrhagic Escherichia coli. J. Food Protect.
62:219-228.
Buswell, CM., YM. Herlihy, L.M. Lawrence, J.T. McGuiggan, P.D. Marsh, C.W. 13.
Keevil, and S.A. Leach 1998. Extended survival and persistence of Campylobacter
spp. in water and aquatic bioflms and their detection by immunofuorescent-
antibody and -rRNA staining. Appl. Environ. Microbiol. 64:733-741.
Carpenter, B., and O. Cerf. 1993. Bioflms and their consequences, with particular 14.
29
reference to hygiene in the food industry. J. Appl. Bacteriol. 75:499-511.
Centers for Disease Control and Prevention. 2003. Preliminary FoodNet data on 15.
the incidence of foodborne illnesses Selected sites, United States, 2002. Morb.
Mortal. Wkly. Rep. 52:340-343.
Cheetham, B.F., and M.E. Katz. 1995. A role for bacteriophages in the evolution 16.
and transfer of bacterial virulence determinants. Mol. Microbiol. 18:201-208.
Christensen, H., S. Nordentoft, and J.E. Olsen. 1998. Phylogenetic relationships of 17.
Salmonella based on rRNA sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:605-610.
Chumkhunthod, P., H. Schraft, and M.W. Griffths. 1998. Rapid monitoring 18.
method to assess effcacy of sanitizers against Pseudomonas putida bioflms. J.
Food Protect. 61.1043-1046.
Cloak, O.M., B.T. Solow, C.E. Briggs, C.-Y. Chen, and P.M. Fratamico. 2002. 19.
Quorum sensing and production of autoinducer-2 in Campylobacter spp.,
Escherichia coli 0157:H7, and Salmonella enterica serovar Typhimurium in foods.
Appl. Environ. Microbiol. 68:4666-4671.
Coconnier, M.-H, E. Dlissi, and N. Robard. 1998. 20. Listeria monocytogenes
stimulates mucus exocytosis in cultured human polarized mucosecreting intestinal
cells through action of listeriolysin O. Infect. Immun. 66:3673-3681.
Comelis, G.R., and H. Wolf-Watz. 1997. The Yersinia Yop virulon: A bacterial 21.
system for subverting eukaryotic cells. Mol. Microbiol. 23:861-867.
Costerton, J.W. 1994. Bioflms, the customized microniche./. Bacteriol. 176:2137- 22.
2142.
Cotter, P.D., and C. Hill. 2003. Surviving the acid test: Responses of Gram-positive 23.
bacteria to low pH. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:429^153.
DAoust, J.Y. 1997. Salmonella species. In Food MicrobiologyFundamentals and 24.
Frontiers, ed. M.P. Doyle, L.R. Beuchat, and T.J. Montville, 129-158. Washington,
DC: ASM Press.
Dack, G.M., WE. Cary, O. Woolpert, and H. Wiggers. 1930. An outbreak of food 25.
poisoning proved to be due to a yellow hemolytic staphylococcus. J. Prev. Med.
4:167-175.
Davies, D.G., M.R. Parsek, J.P. Pearson, B.H. Iglewski, J.W. Costerton, and E.P. 26.
Greenberg. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a
bacterial bioflm. Science 280:295-298.
Davis, M.J., P.J. Coote, and C.P. OByrne. 1996. Acid tolerance in 27. Listeria
monocytogenes: The adaptive acid tolerance response (ATR) and growth-phase-
dependent acid resistance. Microbiology 142:2975-2982.
Dean-Nystrom, E.A., B.T. Bosworth, H.W. Moon, and A.D. OBrien. 1998. 28.
Escherichia coli 0157.H7 requires intimin for enteropathogenicity in calves. Infect.
Immun. 66:4560-4563.
Decatur, A.L., and D.A. Portnoy. 2000. A PEST-like sequence in listeriolysin O 29.
30
essential for Listeria monocytogenes pathogenicity. Science 290:992-995.
Degrassi, G., A. Anguilar, M. Bosco, S. Zahariev, S. Pongor, and V. Venturi. 2002. 30.
Plant growth-promoting Pseudomonas putida WCS358 produces and secretes
four cyclic dipeptides: Cross-talk with quorum sensing bacterial sensors. Curr.
Microbiol. 45:250-254.
De Kievit, T.R., and B.H. Iglewski. 2000. Bacterial quorum sensing in pathogenic 31.
relationships. Infect. Immun. 68:4839-4849.
Dong, Y.-H., A.R. Gusti, Q. Zhang, J.-L. Xu, and L.-H. Zhang. 2002. Identifcation 32.
of quorum-quenching N-acyl-homoserine lactonases from Bacillus species. Appl.
Environ. Microbiol. 68:1754-1759.
Donnenberg, M.S., J.B. Kaper, and B.B. Finlay. 1997. Interactions between 33.
enteropathogenic Escherichia coli and host epithelial cells. Trends Microbiol.
5:109-114.
Dunny, G.M., and B.A.B. Leonard. 1997. Cell-cell communication in Gram- 34.
positive bacteria. Ann. Rev. microbiol. 51:527-564.
DuPont, H.L., M.M. Levine, and R.B. Hornick. 1989. Inoculum size in shigellosis 35.
and implications for expected mode of transmission. /. Infect. Dis. 159:1126-
1128.
Elhanaf, D., B. Leenanon, W. Bang, and M.A. Drake. 2004. Impact of cold 36.
and cold-acid stress on poststress tolerance and virulence factor expression of
Escherichia coli 0157:H7. /. Food Protect. 67:19-26.
Falkow, S. 1996. The evolution of pathogenicity in Escherichia, Shigella, and 37.
Salmonella. In Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology,
2nd ed., ed. F.C. Neidhardt, 2723-2729. Washington, DC: ASM Press.
Faruque, S.M., Asadulghani, A.R.M. Abdul Alim, M.J. Albert, K.M.N. Islam, and 38.
J.J. Mekalanos. 1998. Induction of the lysogenic phage encoding cholera toxin
in naturally occurring strains of toxigenic Vibrio cholerae 01 and 0139. Infect.
Immun. 66:3752-3757
Feng, P.K., A. Lampel, and H. Karch. 1998. Genotypic and phenotypic changes in 39.
the emergence of Escherichia coli 0157:H7. J. Infect. Dis. 177:1750-1753.
Ferreira, A., D. Sue, C.P. OByrne, and K.J. Boor. 2003. Role of 40. Listeria
monocytogenes SB in survival of lethal acidic conditions and in the acquired acid
tolerance response. Appl. Environ. Microbiol. 69:2692-2698.
Frank, J.F., and R.A. Koff. 1990. Surface-adherent growth of 41. Listeria
monocytogenes is associated with increased resistance to surfactant sanitizers and
heat. J. Food Protect. 53:550-554.
Fratamico, P.M. 2003. Tolerance to stress and ability of acid-adapted and non-acid 42.
adapted Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 to invade and survive in
mammalian cells in vitro. J. Food Protect. 66:1115-1125.
Fuqua, W.C., S.C. Winans, and E.P. Greenberg. 1994. Quorum sensing in bacteria: 43.
31
The Lux-R-Luxl family of cell density-responsive transcriptional regulators. J.
Bacteriol. 16:269-275.
Galan, J.E. 1996. Molecular genetic bases of Salmonella entry into host cells. Mol. 44.
Gellin, B.G., and C.V. Broome. 1989. Listeriosis. JAMA 261:1313-1320. 45.
Gorden, J., and P.L.C. Small. 1993. Acid resistance in enteric bacteria. Infect. 46.
Immun. 61:364-367.
Gram, L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, and M. Givskov. 1999. Production of 47.
acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae
isolated from foods. Appl. Environ. Microbiol. 65:3458-3463.
Groisman, E.A., and H. Ochman. 1997. How Salmonella became a pathogen. 48.
Trends Microbiol. 9:343-349.
Hacker, J., and J.B. Kaper. 2000. Pathogenicity islands and the evolution of 49.
microbes. Ann. Rev. Microbiol. 54:641-679.
Holden, M.T.G., S.R. Chhabra, R. de Nys, P. Stead, N.J. Bainton, P.J. Hill, M. 50.
Manefeld, N. Kumar, M. Labatte, D. England, S. Rice, M. Givskov, G.P.C.
Salmond, G.S.A.B. Stewart, B.W. Bycroft, S. Kjelleberg, and P. Williams. 1999.
Quorum-sensing cross talk: Isolation and chemical characterization of cyclic
dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and other Gram-negative bacteria. Mol.
Microbiol. 33:1254-1266.
Humphrey, T.J., N.P. Richardson, K.M. Statton, and R.J. Rowbury. 1993. Acid 51.
habituation in Salmonella Enteritidis PT4: Impact of inhibition of protein synthesis.
Lett. Appl. Microbiol. 16:228-230.
Ikeda, J.S., J. Samelis, P.A. Kendall, G.C. Smith, and J.N. Sofos. 2003. Acid 52.
adaptation does not promote survival or growth of Listeria monocytogenes on
fresh beef following acid and nonacid decontamination treatments. J. Food Protect.
66:985-992.
Jacewicz, M.S., D.W.K. Acheson, D.G. Binion, G.A. West, L.L.Lincicome, C. 53.
Fiocchi, and G.T. Keusch. 1999. Responses of human intestinal microvascular
endothelial cells to Shiga toxins 1 and 2 and pathogenesis of hemorrhagic colitis.
Infect. Immun. 67:1439-1444.
Jensen, V.B., J.T. Harty, and B.D. Jones. 1998. Interactions of the invasive 54.
pathogens. Salmonella typhimurium,Lwferia monocytogenes, and Shigella fexneri
with M cells and murine Peyers patches. Infect. Immun. 66:3758-3766.
Ji, G. Y., R.C. Beavis, and R.P. Novick. 1995. Cell density control of staphylococcal 55.
virulence mediated by an octapeptide pheromone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:12055-12059.
Jones, B.D., and S. Falkow. 1994. Identifcation and characterization of a 56. Salmonella
typhimurium oxygen-regulated gene required for bacterial internalization. Infect.
Immun. 62:3745-3752.
32
Karatzas, K.A.G., and M.H.J. Bennikk. 2002. Characterization of a 57. Listeria
monocytogenes Scott A isolate with high tolerance towards high hydrostatic
pressure. Appl. Environ. Microbiol. 68:3183-3189.
Kleerebezem, M., L.E.N. Quadri, O.P. Kulpers, and W.M. de Vos. 1997. Quorum 58.
sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in
Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol. 24:895-904.
Kim, K.Y., and J.F. Frank. 1995. Effect of nutrients on bioflm formation by 59. Listeria
monocytogenes on stainless steel. /. Food Protect.
Koo, J., A. DePaola, and D.L. Marshall. 2000. Impact of acid on survival of Vibrio 60.
vulnifcus and Vibrio vulnifcus phage. /. Food Protect. 63:1049-1052.
Koutsoumanis, K.P., P.A. Kendall, and J.N. Sofos. 2003. Effect of food processing- 61.
related stresses on acid tolerance of Listeria monocytogenes. Appl. Environ.
Microbiol. 69:7514-7516.
Kubori, T., Y. Matsushima, D. Nakamura, J. Uralil, M. Lara-Tejero, A. Sukhan, 62.
J.E. Galan, and S.-I. Aizawa. 1998. Supramolecular structure of the Salmonella
typhimurium type III protein secretion system. Science 280:602-605.
Lecuit, M., S. Vandormael-Pournin, J. Lefort, M. Huerre, P. Gounon, C. Dupuy, C. 63.
Babinet, and P. Cossart. 2001. A transgenic model for listeriosis: Role of internalin
in crossing the intestinal barrier. Science 292:1722-1725.
LcClerc, J.E., B. Li, W.L. Payne, and T.A. Cebula. 1996. High mutation frequencies 64.
among Escherichia coli and Salmonella pathogens. Science 274:1208-1211.
Leuschner, R.G.K., and M.P. Boughtfower. 2001. Standardized laboratory-scale 65.
preparation of mayonnaise containing low levels of Salmonella enterica serovar
Enteritidis. J. Food Protect. 64:623-629.
LeClerc, J.E., B. Li, W.L. Payne, and T.A. Cebula 1996. High mutation frequencies 66.
among Escherichia coli and Salmonella pathogens. Science 274:1208-1211.
7Marsh, E.J., H. Luo, and H. Wang. 2003. Characteristics of bioflm development 67.
by Listeria monocytogenes strains. FEMS Microbiol. Lett. 228:203-210.
Mead, P.S., L. Slutsker, V. Dietz, 1. F. McCaig, J.S. Bresee, C. Shapiro, P.M. 68.
Griffn, and R.V. Tauxe. 1999. Food-related illness and death in the United States.
Emerg. Infect. Dis. 5:607-625.
McLean, R.J.C., M. Whiteley, D.J. Stickler, and W.C. Fuqua. 1997. Evidence 69.
of autoinducer activity in naturally occurring bioflms. FEMS Microbiol. Lett.
154:259-263.
Michiels, C.W, M. Schellekens, C.C.F. Soontjens, and KJ.A. Hauben. 1997. 70.
Molecular and metabolis typing of resident and transient fuorescent pseudomonad
fora from a meat mincer. /. Food Protect. 60:1515-1519.
OBrien, A.D., and R.K. Holmes. 1996. Protein toxins of Escherichia coli and 71.
Salmonella. In Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology,
2nd ed., ed. F.C. Neidhardt, 2788-2802. Washington, DC: ASM Press.
33
ODriscoll, B., C.G.M. Gahan, and C. Hill. 1996. Adaptive acid tolerance response 72.
in Listeria monocytogenes: Isolation of an acid-tolerant mutant which demonstrates
increased virulence. Appl. Environ. Microbiol. 62:1693-1698.
Oh, D.-H, and D.L. Marshall. 1996. Monolaurin and acetic acid inactivation of 73.
Listeria monocytogenes attached to stainless steel. J. Food Protect. 59:249-252.
Otto, M., H. Echner, W. Voelter, and F. Gotz. 2001. Pheromone cross-inhibition 74.
between Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infect. Immun.
69:1957-1960.
ORiordan, M., M.A. Moors, and D.A. Portnoy. 2003. Listeria intracellular growth 75.
and virulence require host-derived lipoic acid. Science 302:462-464.
erna, N.T., G.F. Mayhew, G. Posfai, S. Elliott, M.S. Donnenberg, J.B. Kaper, 76.
and F.R. Blattner. 1998. Molecular evolution of a pathogenicity island from
enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. Infect. Immun. 66:3810-3817.
Phan-Thanh, L., F. Mahouin, and S. Alige. 2000. Acid responses of 77. Listeria
monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 55:121-126.
Pruzzo, C, R. Tarsi, M. del Mar Lleo, C. Signoretto, M. Zampini, R.R. Colwell, 78.
and P. Canepari. 2002. In vitro adhesion to human cells by viable but nonculturable
Enterococcus faecalis. Curr. Microbiol. 45:105-110.
Ren, D., J.j. Sims, and T.K. Wood. 2002. Inhibition of bioflm formation and 79.
swarming of Bacillus subtilis by (5Z)-4-brome-5-(bromomefhylene)-3-butyl-2-
(5//)-furanone. Lett. Appl. Microbiol. 34:293-299.
Richter-Dahlfors, A.A., and B.B. Finlay. 1997. Salmonella interactions with host 80.
cells. In Host Response to Intracellular Pathogens, ed. S.H.E. Kaufmann, 251-270.
Austin, TX: R.G. Landes Co.
Samelis, J., J.N. Sofos, J.S. Ikedak, P.A. Kendall, and G.C. Smith. 2002. Exposure 81.
to non-acid fresh meat decontamination washing fuids sensitizes Escherichia coli
0157:H7 to organic acids. Lett. Appl. Microbiol. 34:7-12.
Samelis, J., J.N. Sofos, P.A. Kendall, and G.C. Smith. 2001. Infuence of the 82.
natural microbial fora on the acid tolerance response of Listeria monocytogenes
in a model system of fresh meat decontamination fuids. Appl. Environ. Microbiol.
67:2410-2420.
Saphra, I., and M. Wassermann. 1954. Salmonella choleraesuis: A clinical and 83.
epidemiological evaluation of 329 infections identifed 1940 and 1954 in the New
York Salmonella Center. Am. J. Med. Sci. 228:525-533.
Sasahara, K.C., and E.A. Zottola. 1993. Bioflm formation by 84. Listeria
monocytogenes utilizes a primary colonizing microorganism in fowing systems. J.
Food Protect. 56:1022-1028.
Schauer, D.B., and S. Falkow. 1993. Attaching and effacing locus of a 85.
Citrobacterfreundii biotype that causes transmissible murine colonic hyperplasia.
Infect. Immun. 61:2486-2492,
34
Schubert, S., A. Rakin, H. Karch, E. Carriel, and J. Heesemann. 1998. Prevalence 86.
of the high-pathogenicity island of Yersinia species among Escherichia coli
strains that are pathogenic to humans. Infect. Immun. 66:480-485.
Sibelius, U., E.-C. Schulz, F. Rose, K. Hattar, T. Jacobs, S. Weiss, T. Chakraborty, 87.
W. Seeger and F. Grimminger. 1999. Role of Listeria monocytogenes exotoxins
listeriolysin and phosphatidylinositol-specifc phospholipase C in activation of
human neutrophils. Infect. Immun. 67:1125-1130.
Silhavy, T.J. 1997. Death by lethal injection. Science 278:1085-1086. 88.
Sperandio, V, A.G. Torres, J.A. Giron, and J.B. Kaper. 2001. Quorum sensing is 89.
a global regulatory mechanism in enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. /.
Bacteriol. 183:5187-5197.
Surette, M.G., M.B. Miller, and B.L. Bassler. 1999. Quorum sensing in Escherichia 90.
coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: A new family of genes responsible
for autoinducer production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1639-1644.
Trucksis, M., J. Michalski, Y.K. Deng, and J.B. Kaper. 1998. The Vibrio cholerae 91.
genome contains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci.USA
95:14459-14464.
van der Velden, A.W.M., A.J. Baumler, R.M. Tsolis, and F. Heffron. 1998. Multiple 92.
fmbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in
mice. Infect. Immun. 66:2803-2808.
Venturi, V. 2003. Control of rpoS transcription in Escherichia coli and Pseudomonas: 93.
Why so different? Mol. Microbiol. 49:1-9.
Waldor, M.K., and J.J. Mekalanos. 1996. Lysogenic conversion by a flamentous 94.
phage encoding cholera toxin. Science 272:1910-1914.
Wallis, T.S., and E.E. Galyov. 2000. Molecular basis of Salmonella induced 95.
enteritis. Mol. Microbiol. 36:997-1005.
Waterman, S.R., and P.L.C. Small. 1996. Characterization of the acid resistance 96.
phenotype and rpoS alleles of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli. Infect.
Immun. 64:2808-2811.
Waterman, S.R., and P.L.C. Small. 1998. Acid-sensitive enteric pathogens are 97.
protected from killing under extremely acidic conditions of pH 2.5 when they are
inoculated onto certain solid food sources. Appl. Environ. Microbiol. 64:3882-
3886.
Wemekamp-Kamphuis, H.H., J.A. Wouters, P.P.L.A. de Leeuw, T. Hain, T. 98.
Chakraborty, and T. Abee. 2004. Identifcation of sigma factor (5B-controlled
genes and their impact on acid stress, high hydrostatic pressure, and freeze survival
in Listeria monocytogenes EGD-e. Appl. Environ. Microbiol. 70:3457-3466.
Whitechurch, C.B., T. Tolker-Nielsen, P.C. Ragas, and J.S. Mattick. 2002. 99.
Extracellular DNA required for bacterial bioflm formation. Science 295:1487
35
CAPITOLUL 2
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE
DE BACTERII DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS
2.1. Staphylococcus aureus
Gastroenterita staflococic este provocat de ingestia unor alimente,
care conin una sau mai multe enterotoxine, produse numai de unele specii
i tulpini staflococice.
Dei producia de enterotoxine este considerat n general ca find
asociat cu tulpinile de Stp. aureus coagulaz i termonucleaz pozitive,
multe dintre speciile de staflococi, care nu produc nici una dintre aceste
enzime produc enterotoxine.
Tabelul 2.1.
Grupa cocilor
Gram pozitivi,
aerobi
Familie Gen Specii
Micrococcaceae Micrococcus
Mic. luteus, Mic. varians, Mic.
lylae, Mic. roseus
Staphylococcaceae Staphylococcus
Stp. aureus aureus, Stp. aureus
anaerobius, Stp. hyicus hyicus,
Stp. hyicus chromogenes, Stp.
intermedius
Streptococcaceae Streptococcus
Stc. agalactiae, Stc. dysgalactiae
dysgalactiae, Stc. dysgalactiae
equisimilis, Stc. equi equi,
Stc. equi zooepidermicus, Stc.
pneumoniae
2.1.1. Istoric
Pentru prima dat staflococii au fost observai de ctre Billroth (1874)
n colecii purulente umane i mai trziu izolai n culturi pure de Pasteur
(1880) i Rosenbach (1884), acesta din urm folosind primul termenul
de staflococ. Studiul staflococilor i a afeciunilor produse de acetia au
36
preocupat numeroi cercettori, cum ar f: Pasteur, Rosenbach, Bang, Meyer,
Hajek, Marsalek, Bayrd-Parker etc. n 1955, Evans, Bradford i Niven
(citai de Brzoi i col.) au propus separarea taxonomic a staflococilor de
micrococi pe baza comportrii lor fa de oxigen.
n 1965, Silvestri i Hill (citai de Brzoi i col.) propun ca deosebirea
ntre staflococi i streptococi s fe fcut pe baza compoziiei acestora n
DNA.
Studii mai recente au stabilit criterii i mai exacte de difereniere care se
bazeaz pe compoziia chimic a peretelui celular, pe existena citocromilor,
pe felul i proporia acizilor grai, pe hibridarea DNA, RNA. Marsalec i
Hajek au efectuat studii amnunite asupra tulpinilor de staflococi de origine
animal. n ara noastr, contribuii importante n studiul staflococilor au
fost aduse de ctre Stamatin, Bica-Popii, Marica, Cernea, Volintir i alii.
2.1.2. Taxonomie
Cuprinde cinci genuri i anume: Staphylococcus, Gemella,
Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus (dup J. P. Euzby, 2006)
Genul Staphylococcus a fost separat din familia Micrococcaceae
datorit coninutului total diferit al bazelor DNA (un coninut G+C de 30-
39 mol% la Staphylococcus fa de 63-73 mol% la Micrococcus) (Silvestri
i Hill), compoziia peretelui celular, al spectrului diferit de sensibilitate la
antibiotice (schema 1.1).
n cadrul genului exist specii patogene pentru om i animale, numai
pentru animale i specii nepatogene. Specia tip a acestui gen este considerat
Staphylococcus aureus.
Genul cuprinde un numr de 40 de specii (conform J.P. Euzby,
2006).
Pentru patologia animal, dup Bergeys Manual of Systematic
Bacteriology, 2
nd
edition, 2004 sunt mai importante urmtoarele specii de
staflococi:
- Staphylococcus aureus:
subsp. anaerobius;
subsp. aureus.
- Staphylococcus hyicus:
subsp. hyicus;
subsp. chromogenes.
- Staphylococcus intermedius.
37
Dintre speciile nepatogene sau cu patogenitate redus izolate de la
animale, fac parte:
- Staphylococcus epidermidis;
- Staphylococcus caprae;
- Staphylococcus felis;
- Staphylococcus gallinarum;
- Staphylococcus delphini.
Schema 2.1
Proprieti biochimice pentru diferenierea cocilor Gram pozitivi aerobi
(dup Rpuntean Gh., 2001)

Coci Gram pozitivi
Glucoz
Oxidativ Fermentativ
catalaza
Genul Micrococcus Genul Staphylococcus Genul Streptococcus
- +
2.1.3. Incidena speciilor de staflococi n alimente
Genul Staphylococcus face parte din familia Staphylococcaceae care
cuprinde cinci genuri. Cuprinde 40 de specii dintre care 16 sunt considerate
ca find patogeni alimentari.
Dintre speciile coagulaz pozitive, Stp. intermedius este binecunoscut
ca productoare de enterotoxine. Aceast specie se gsete n nrile i pe
pielea carnivorelor i cailor, rareori la om. ntr-un studiu efectuat n Brazilia,
din piodermitele cinilor au fost izolate 73 de tulpini de staflococi dintre
care 52 au fost Stp. intermedius. Toate cele 52 de tulpini au fost coagulaz
pozitive pe plasma de iepure, dar negative pe plasma uman, iar 13 dintre
acestea au fost enterotoxigene. Patru dintre ele au produs enterotoxina
staflococic D (SED), cinci au produs SEE i patru au produs SEB, SEC,
SED/ E i SEA/ C. Toate 13 au fost termonucleaz (TN-aza), iar trei dintre
ele au produs toxina sindromului ocului toxic (TSST)(30,40,41).
Un mare numr de tulpini de Stp. hyicus sunt coagulaz pozitive, iar
unele produc enterotoxine. ntr-un studiu tulpinile de Stp. hyicus au fost
38
coagulaz pozitive, iar unele productoare de enterotoxine. Au fost raportate
cazuri de tulpini de Stp. hyicus productoare de enterotoxine la maimuele
Cynomologus, dar tipul de enterotoxin nu a fost identifcat.
La capre, din ase tulpini coagulaz pozitive, dou au produs SEC.
Nu a fost raportat producia de enterotoxine de ctre Stp. delphini,
Stp. simulans, Stp. schleiferi subsp. coagulans.
Cel puin 10 dintre speciile de staflococi coagulaz negativi, produc
enterotoxine: Stp. cohnii, Stp. epidermidis, Stp. haemolyticus si Stp. xylosus
au fost izolai din laptele de oaie mpreun cu Stp. aureus. Un izolat de
Stp. cohnii a produs SEC; trei izolate de Stp. epidermidis au produs SEC i
SEB/C/D/ (dou tulpini); cinci izolate de Stp. haemolyticus au produs SEA,
SED, SEB/C/D i SEC/D (dou tulpini); n timp ce cele patru izolate de
Stp. xylosus au produs SED. Aceti cercettori au observat ca fermentarea
manitolului a constituit cea mai bun reacie pentru diferenierea ntre tulpinile
enterotoxigene pozitive i enterotoxigene negative. n alte studii, unul din
20 de izolate coagulaz negative, s-a dovedit a f o tulpina enterotoxigen
de Stp. haemolyticus care a produs att SEC ct i SED.
ntr-un studiu de izolate staflococice de la capre sntoase 74,3% din
70 de izolate coagulaz pozitive au produs enterotoxine, iar 22% din 272
de izolate coagulaz negative au produs enterotoxine pozitive. SEC a fost
enterotoxin cel mai frecvent izolat de la capre. 7 specii din izolate au produs
mai multe enterotoxine (Stp. caprae, Stp. epidermidis, Stp. haemolyticus,
Stp. saprophyticus, Stp. sciuri, Stp. warneri si Stp. xylosus), iar dou specii
au produs numai o singur enterotoxin (SEC) de Stp. chromogenes i SEE
de ctre Stp. Lentus.
Din carnea de crab fart, gata de consum au fost identifcate aproape
100 de izolate suspecte: Stp. lentus - 31, Stp. hominis - 21, Stp. epidermidis -
10, Stp. kloosi - 8, Stp. capitis - 5 i cte unul de Stp. aureus, Stp. saprophyticus
i Stp. sciuri. Din celelalte specii s-au gsit mai puin de trei.
Din unca spaniol afumat uscat s-a izolat Stp. epidermidis,
productor de SEC.
Din alimente s-au mai izolat i alte specii de staflococi i anume:
Stp. condimenti, Stp. piscifermentans i Stp. feurettii, toate find coagulaz
negative. De asemenea, nu produc TN-az i nici enterotoxine.
Stp. condimenti a fost izolat din sosul de soia, Stp. piscifermentans,
din petele fermentat din Thailanda i Stp. feurettii, din brnza de capr.
Specia Stp. caseolyticus a fost transferat n genul Macrococcus, devenind
M. caseolyticus.
n general staflococii se gsesc n alimentele de origine animal,
netratate termic, manipulate direct de ctre oameni. Exist multe studii n care
39
se arat c staflococii se gsesc n numr mare n alimentele comerciale.
Tabelul 2.2.
Specii i subspecii de staflococi coagulaz, nucleaz i endotoxine pozitive
Specia Coagulaz Nucleaz Enterotoxin Hemoliz Manitol G+C
S. aureus subsp.
anaerobius + TS - + - 31,7
aureus + TS + + + 32-36
S. intermedius + TS + + (+) 32-36
S. hyicus (+) TS + - - 33-34
S. delphini + - + + 39
S. schleiferi
subsp.
coagulans + TS + (+) 35-37
schleiferi - TS + - 37
S. caprae - TL + (+) - 36,1
S. chromogens - -p + - v 33-34
S. cohnii - - + - v 36-38
S. epidermidis - - + v - 30-37
S. haemolyticus - TL + + v 34-36
S. lentus - + - + 30-36
S. saprophytics - - + - + 31-36
S. sciuri - + - + 30-36
S. simulans - V v + 34-38
S. warneri - TL + -p + 34-35
S. xylosus - - + + v 30-36
Legend: + = pozitiv; - = negativ; -p = negativ spre slab pozitiv; (+) = reacie slab; v
= variabil; TS = termostabil; TL = termolabil.
2.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale
Cerinele staflococilor n anumii compui organici sunt caracteristice
celorlalte bacterii Gram pozitive. Aminoacizii sunt necesari ca surse de azot,
iar tiamina i acidul nicotinic sunt recunoscute ca surse de vitamina B. n
cazul creterii anaerobe au nevoie de uracil. ntr-un mediu minim pentru
creterea anaerob i producia de enterotoxine, glutamatul monosodic
servete ca surs de carbon, azot i energie. Acest mediu conine numai trei
aminoacizi (arginin, cistin, fenil-alanin) i patru vitamine (pantotenat,
biotin, niacin, tiamin) pe lng srurile anorganice. Arginina este esenial
40
pentru producerea de enterotoxin B.
2.1.4.1. Temperatura
Stp. aureus este un germen mezofl, ns unele tulpini se pot multiplica
i la temperaturi de numai 6-7C. Cercettorii au descoperit n budinc (ou,
lapte) trei tulpini de staflococi, care au crescut la 45,6C, diminundu-i
creterea n timpul incubrii la 46,7C-48,9C. Unele tulpini de staflococi
s-au multiplicat la temperatura de 44,4C n pui la king, dar nu au crescut
n salata de unc, la aceeai temperatur.
n general multiplicarea are loc ntre 7 i 47,8C, iar producia de
enterotoxine, ntre 10-46C, cu un optim ntre 40 i 45C.
2.1.4.2. Efectul substanelor chimice
Stp. aureus se dezvolt bine n mediul de cultur fr NaCl, dar poate
crete la fel de bine la o concentraie de 7-10% NaCl, iar cteva tulpini sunt
halofle, dezvoltndu-se n medii cu 20% NaCl. n afar de temperatur, pH,
NaCl, creterea bacterian este infuenat i de activitatea hidric (a
w
) i de
potenialul REDOX (E
h
). Stp. aureus prezint o toleran foarte mare fa de
telurit, clorur de mercur, neomicin, polimixin, azidur de sodiu, compui
folosii de obicei ca ageni selectivi n mediile de cultur.
Stp. aureus poate f diferit de alte specii de staflococi prin rezistena
sa mai mare la acrifavin. Acest germen este sensibil la borat, n timp ce
Stp. epidermidis este rezistent.
Stp. saprophyticus este rezistent la novobiocin, n timp ce Stp. aureus
i Stp. epidermidis sunt sensibili.
Capacitatea de tolerare a unor niveluri ridicate de NaCl i de ali
compui este aceeai i la speciile din genul Micrococcus i Kocuria, care
sunt larg distribuite n natur i apar n alimente n numr mai mare dect
staflococii, ceea ce ngreuneaz detectarea acestora din urm.
Stp. aureus se poate dezvolta n limite de pH, cuprinse ntre 4 i 9,
optimul situndu-se ntre 6 i 7.
n maioneza preparat n cas, producia de enterotoxine a avut loc
atunci cnd pH-ul a fost mai mic de 5,15 i nu la un pH de sub 4,7.
SEB a fost produs la un nivel de 158 ng/100 g cu un inocul de
aproximativ 10
5
per gram. n general producia de SEA a fost mai puin
sensibil la pH dect SEB.
Tamponarea unui mediu de cultur la pH 7, duce la o producie mai
mare de SEB, dect atunci cnd mediul este netamponat sau tamponat n
41
limite acide. Un rezultat similar s-a observat i n cazul unui pH controlat
de 6,5 dect de 7,6.
n ceea ce privete a
w
, staflococii sunt unici, prin faptul c au capacitatea
s se multiplice la valorile cele mai joase, fa de bacteriile nehalofle.
Folosind un mediu de hidrolizat de protein, incubat la 37C, timp de
8 zile, creterea i producerea de enterotoxin C s-au produs n limite de pH
4,00-9,83 fr NaCl. n cazul unei concentraii de NaCl 4%, limitele pH-
ului au fost ntre 4,00 i 9,43.
Toxina a fost produs la o concentraie de 10% NaCl, cu un pH de
5,45 sau mai mare, dar nu s-a produs deloc toxin la o concentraie de 12%
NaCl.
Creterea lui Stp. aureus n bulion este inhibat de un pH de 4,8 i la
o concentraie de 5% NaCl.
Creterea i producia de enterotoxin B, de ctre tulpina S-6 s-au
produs la o concentraie de 10% NaCl i la un pH de 6,9, dar nu i la
concentraia de 4% NaCl i un pH de 5,1.
Efectul general al creterii concentraiei de NaCl const n ridicarea
pH-ului minim de cretere. La un pH de 7,00 i la temperatura de 37C,
enterotoxina B a fost inhibat de concentraia de 6% NaCl sau mai mare.
n bulion BHI (Brain Heart Infusion), a fost nsmnat un amestec de
tulpini de Stp. aureus. Mediul coninea NaCl i sucroz ca umectani, la un
pH 4,3 a
w
de 0,85 i la 8C. Creterea bacterian n acest mediu nu a fost
sesizat. De asemenea, nu a avut loc nici n cazul unei asocieri de pH 5,5,
temperatur 12C i un a
w
de 0,93 sau la pH sub 4,9, temperatur 12C i
a
w
0,96.
Tulpina S-6 de Stp. aureus a crescut i a produs enterotoxina B n
unca afumat, n condiii anaerobe, cu un coninut de 9,2% saramur, dar
nu sub un pH de 5,3 i sub o temperatur de 30C, sau sub un pH de 5,58
la 10C.
n condiii aerobe producia de enterotoxine a avut loc mult mai rapid
dect n condiii anaerobe. Pe msur ce concentraia de HNO
2
a crescut,
producia de enterotoxin s-a diminuat.
Cele mai multe specii sunt catalaz-pozitive i facultativ anaerobe, dar
cresc mai bine aerob, cu unele excepii (Stp. aureus, subspecia anaerobius
i Stp. sacharolyticus). Sunt germeni nepretenioi nutritiv, cultivndu-se
bine pe medii uzuale. Tolereaz concentraii de peste 5% NaCl, iar unele
specii sunt chiar halofle (tolereaz concentraii de 10-15% NaCl n mediile
de cultur). Vitamina B
1
i acidul nicotinic reprezint factori indispensabili
pentru cretere.
Culturile bacteriene apar dup 16-24 de ore de incubare la 37 C.
42
Tolereaz variaii mari de pH, dar pH-ul optim este de 7,5.
Pentru izolarea staflococilor din materiale patologice sau din
alimente, se utilizeaz medii selective hiperclorurate, cum ar f Chapman,
Bayrd-Parker sau Vogel-Johnson. Totodat, aceste medii permit ca pe
baza aspectelor culturale sau a reaciilor de culoare s se aprecieze unele
proprieti metabolice sau de patogenitate ale tulpinilor izolate (mediul
Chapman fermentarea manitolului, mediul Vogel-Johnson activitatea
coagulazic). Examinarea caracterelor morfologice i culturale i izolarea pe
medii selective hiperclorurate sunt edifcatoare pentru ncadrarea bacteriilor
n acest gen.
Tabelul 2.3.
Valorile D pentru distrugerea prin cldur a enterotoxinei staflococice B i
pentru nucleaza termostabil
Condiii D (C)
Tampon Veronal
Tampon Veronal
Tampon Veronal
Tampon Veronal
Tampon Veronal, pH 7,4
Bulion de carne, pH 7,4
Nucleaz
D
110
= 29,7*
D
110
= 23,5
D
121
= 11,4*
D
121
= 9,9
D
110
= 18
D
110
= 60
D
110
= 16,5
Legend: * toxin n stare pur;
99+% purificat
Tabelul 2.4.
Valorile D i z pentru distrugerea termic a lui Stp. aureus 196E
Produse D(F) z
Pui a la king 5,37 10,5
Custard (crem fcut din ou i lapte) 7,82 10,5
Sup de mazre verde 6,7-6,9 8,1
Lapte smntnit 3,1-3,4 9,2
NaCl 0,5% 2,2-2,5 10,3
Carne fart 2,2-2,6 10,5
Lapte smntnit simplu 5,34 -
Lapte smntnit + 10% zahr 4,11 -
Lapte smntnit + 6% grsime 4,27 -
Lapte smntnit + 10% grsime 4,20 -
43
Produse D(F) z
Tampon Tris, pH 7,2 2,0 -
Tampon Tris, pH 7,2, NaCl 5,8% 7,0 -
Tampon Tris, pH 7,2 + NaCl 5,8% + MSG 5% 15,5 -
Tris (THAM) = tri(hidroximetil)aminometan - (CH
2
OH)
3
CNH
2
Stp. aureus, specia tip a genului, produce n bulion o turbiditate
intens, un depozit necaracteristic, uor omogenizabil n mediu, unele tulpini
formnd un inel slab la suprafa. Pe suprafaa agarului nclinat formeaz
(obinuit) nite colonii de tip S (netede i lucioase), rotunde, cremoase,
cu diametrul de 2-3 milimetri, cu margini perfecte, uor bombate (Irina
Codi). Tulpinile izolate din infecii staflococice posed microcapsul i
formeaz colonii de tip M (moi, mucoase).
Tulpinile care provin din probe tratate cu substane antimicrobiene
sau care au fost supuse unor tratamente termice formeaz pe medii solide
colonii de tip G (glossy = lucios) sau G-R (rough = rugos), care sunt
pitice, cu margini imperfecte, granulate, nehemolitice. Aceste tipuri de
microorganisme cultivate n mediu lichid, formeaz un depozit granular pe
fundul eprubetei, mediul rmnnd limpede.
Pe agar cu 5-8% snge defbrinat de berbec sau de bou, Stp. aureus i
Stp. haemolyticus produc o zon circular de hemoliz n jurul coloniilor
(Irina Codi).
n tabelul 2.5. este prezentat aspectul coloniilor la Stp. aureus,
S. haemolyticus i S. saprophyticus pe agar cu snge defbrinat de berbec
5-8% i pe mediul Chapman dup 5 zile de incubare la 37
o
C.
Tabelul 2.5.
Aspectul coloniilor unor specii de staflococi pe agar-snge
i pe mediul solid hiperclorurat (Chapman)
Specia
Aspectul
coloniilor pe
agar-snge
Diametrul
coloniei
Pigment
Aspectul coloniilor pe
mediu solid hiperclorurat
Stp. aureus neted cremos 5-10 mm
auriu/citrin
fr pigment
colonii galbene, manitol
pozitive, nglbenesc mediul
Stp.
haemolyticus
neted cremos 3-5 mm fr pigment
colonii nepigmentate,
mediul rmne roz
Stp.
saprophyticus
lucios,
cremos,
foarte convex
5-9 mm
pot f
pigmentate
colonii galbene, manitol
pozitive
44
Pigmenii produi de staflococi sunt de natur carotenoid, nedifuzibili
n mediu, putnd avea diferite culori: alb-cretacee, alb-gri, galben-aurie,
galben-citrin; exist corelaii aproximative ntre felul pigmentului, originea
i patogenitatea tulpinii (Rducnescu, 1973).
Stp. aureus formeaz colonii pigmentate n auriu, iar pigmentarea
se poate observa mult mai bine dac culturile respective, dup incubare,
sunt inute 24 de ore la temperatura camerei. Pigmentogeneza, nu apare n
condiii de anaerobioz i nu se observ n medii lichide, find un caracter
variabil, att genetic, ct i n raport cu sursele de sintez prezente n mediu.
Unele tulpini pot s produc pigment n cantitate mai redus sau acesta
poate aprea modifcat, coloniile find pigmentate palid sau alb-murdare;
altele i pot pierde total capacitatea de a sintetiza pigment. Longevitatea
germenilor n culturile bacteriene este de 2-3 luni.
2.1.5. Caractere morfologice
Bacteriile din genul Staphylococcus sunt coci sferici sau ovali, cu
diametrul de 0,8-1 care se divid n planuri perpendiculare succesive.
Datorit separrii incomplete a celulelor fice de cele parentale, celulele
bacteriene formeaz grmezi neregulate cu aspect caracteristic de ciorchine
de strugure (grec. staphylos = strugure) foarte evidente n culturile pe medii
solide.
Se coloreaz Gram pozitiv, dar n condiii de stress metabolic
(temperatur, pH, presiune osmotic, factori antimicrobieni, etc.) pot
deveni Gram variabili, aprnd n aceeai grmad coci Gram pozitivi i
Gram negativi. O dat cu modifcrile tinctoriale, de regul, apar i anomalii
morfologice, cocii devenind uor alungii sau imperfect conturai.
Sunt bacterii necilogene, nesporogene i necapsulogene. Unele tulpini
de Stp. aureus pot elabora o capsul mucopolizaharidic (glicocalix) vizibil
prin coloraie negativ cu tu de China la microscopul cu contrast de faz.
n general sunt nefmbinogeni, dar au fost evideniate unele tulpini fmbriate
care prezint aderen la mucoase i tegumente.
2.1.6. Proprieti biochimice
n scopul identifcrii speciilor de staflococi, practic se determin
activitatea enzimatic fa de manitol (pus n eviden pe mediul Chapman).
Majoritatea tulpinilor fermenteaz glucoza, lactoza, zaharoza, maltoza, fr
producie de gaz.
Stp. aureus reduce nitraii n nitrii, produce catalaz i este, de
45
regul, hemolitic (produce hemoliz i ). Tulpinile patogene determin
coagularea plasmei citratate.
Stp. hyicus nu fermenteaz manitolul i maltoza, nu produce pigment.
Un numr redus de tulpini sunt coagulaz pozitive. Are activitate hemolitic
numai fa de eritrocitele de iepure.
Stp. intermedius nu produce pigment, fermenteaz tardiv manitolul
i maltoza, produce ureaz (N. Catan). Coaguleaz plasma citratat de
iepure, produce hemoliza globulelor roii de berbec, fermenteaz trehaloza
i riboza.
Stp. epidermidis nu produce pigment, nu coaguleaz plasma citratat
de iepure, nu fermenteaz manitolul i maltoza, nu produce acetoin.
Stp. schleiferi produce hemoliz, acetoin i coaguleaz plasma
citratat. Nu fermenteaz zaharoza, maltoza, manitolul, trehaloza.
Tabelul 2.6
Caractere difereniale ale principalelor specii de staflococi
(dup Catan Nicolae, 2001)
Caractere
Stp. aureus Stp. hyicus
S
t
p
.

i
n
t
e
r
m
e
d
i
u
s
S
t
p
.

e
p
i
d
e
r
m
i
d
i
s
S
t
p
.

g
a
l
l
i
n
a
r
u
m
S
t
p
.

f
e
l
i
s
s
u
b
s
p
.

a
u
r
e
u
s
s
u
b
s
p
.

a
n
a
e
r
o
b
i
u
s
s
u
b
s
p
.

h
y
i
c
u
s
s
u
b
s
p
.

c
h
r
o
m
o
g
e
n
e
s
Pigmentul (carotenoid) +s - - + - - d -
Hemoliza + + - - d -s s -s
Coagulaza liber + + d - + - - -
Coagulaza legat + + - - d - - -
Fermentarea
manitolului
+ - - d d - + d
Fermentarea maltozei
(purple agar + 1%
maltoz)
+ + - d (s) + + -
Ureaz +/- ND d D + + + +
Producerea de acetoin + - - - - + - -
Fosfataza alcalin + - + + + + + +
Fermentarea lactozei + - + + d d d +
Rezistena la
novobiocin
- - - - - - + -
Hialuronidaza + + - - ND D - -
Legend: + = peste 90% tulpini pozitive; - = 90% tulpini negative; d = 11-
89% tulpini pozitive; s = reacie dubioas; -s = reacie slab negativ; +s = reacie slab
pozitiv; () = reacie tardiv; ND = termen nedeterminat; D = termen determinat.
46
2.1.7. Tipurile de enterotoxine staflococice i incidena lor
n 2001 au fost identifcate 13 enterotoxine staflococice (SE
s
). Gena
pentru SEG a fost raportat pentru prima dat n 1992, dar pn n 1998
nu a fost niciodat raportat mpreun cu SEI. SEG a fost raportat n 1995,
SEN n 1995 i SEI n 1998. SEJ a fost raportat n 1998, iar SEK n 2001.
Aceti ultimi autori au raportat dovezi ale existenei SEL, dar date specifce
nu au fost prezentate. Exist informaii extrem de reduse n ceea ce privesc
ultimele 6 SE-uri cu privire la incidena/ prevalena lor n alimente. n ceea
ce privete SEK, 14 din 36 de izolate clinice de Stp. aureus au fost pozitive.
Treceri n revist ale SE-urilor au fost prezentate de Dinges i Balabou i
Rasooly.
SEC 3 este nrudit chimic i serologic, dar nu identic cu SEC 1 i
SEC 2. Anticorpii fa de fecare dintre SEC-uri reacioneaz ncruciat ntre
ei, dei difer uor din punct de vedere antigenic. SEC 3, mparte 98% din
secvenele nucleotidice cu SEC 1, iar SEC 1 i SEB prezint 68% omologie
aminoacid. Exist o reacie ncruciat ntre SEA i SEE, iar unii anticorpi
anti SEB reacioneaz ncruciat cu SEC 5. Ceea ce s-a considerat c este
SEF la nceputul anilor 1980 s-a dovedit a f TSST.
Unele tulpini productoare de enterotoxine produc i TSST, iar unele
dintre simptomele sindromului de oc toxic par s fe provocate de SEA,
SEB i SEC 1. Genele pentru SEA, B1, C1 i E au fost raportate de ctre
unii autori ca find cromozomale, iar SED ca find purtat de ctre plasmide.
Mai recent s-a raportat c SEB i SEK se af pe o insul de patogenitate a
lui Stp. aureus.
n general SEA a fost izolat din epidemii de intoxicaii alimentare,
mai frecvent dect oricare dintre celelalte, SED find a doua ca frecven.
Numrul cel mai mic de epidemii este asociat cu SEE.
Incidena SEA printre 3.109 tulpini i SED printre 1.055 de tulpini
din diferite surse, precum i de un numr mare de cercettori a fost de 23%,
respectiv 14%. Referitor la SEB, SEC i SEE, 11%, respectiv 10% i 3% au
fost izolate din 3.367, 1.581 i 1.072 de tulpini.
Incidena relativ a unor enterotoxine specifce printre tulpinile
recuperate din diverse surse variaz mult, n timp ce peste 50% de izolate
din specimenele umane n SUA secret SEA, singur sau n combinaie.
Din probele umane din Sri Lanka, SEA a fost izolat n proporie de
numai 7,8%.
Spre deosebire de alte rapoarte, ntr-un studiu recent s-au gsit mai
47
muli productori de SEB dect orice alte tipuri. Variaii mari s-au constatat
printre tulpinile de Stp. aureus, izolate din alimente. Harvey i colab.
au observat c SED este asociat mai mult cu izolatele de la psrile de
curte dect cu cele umane. ntr-un alt studiu cercettorii au gsit specii
productoare de SED printre 55 de probe de la psri. Alt studiu prezint
c 2 din 3 izolate atipice de Stp. aureus care au produs o reacie lent, slab
pozitiv sau negativ la coagulaz i au fost negative pentru fermentarea
anaerob a manitolului au produs SED. Izolatele au provenit de la psrile
de curte.
Dintr-o varietate de alimente nigeriene s-au izolat 449 de tulpini de
Stp. aureus coagulaz pozitive, respectiv 57%, 15%, 6% i 5% find SEA,
SEB, SED i SEC.
Din laptele de oaie, SEA i SED au prezentat fecare cte 35% din 124
de tulpini, incluznd 4 tulpini, coagulaz negative.
Din 48 de izolate din produsele lactate i 134 de izolate din produsele
de carne, 46%, respectiv 49% au fost enterotoxigene, iar din 80 de tulpini
provenite din epidemii de intoxicaii alimentare, 96% au produs SEA,
SEC.
ntr-un studiu al unor tulpini de Stp. aureus ce produc SEH, 10 din
21 de tulpini care au provocat vrsturi la maimue au produs SEH la
niveluri cuprinse ntre 13 i 230 ng per ml. Cnd un alt set de 20 de tulpini
productoare de SE a fost examinat, o tulpin de SEC a produs 142 ng/ml
de SEH, iar 2 tulpini de SED au produs 52, respectiv 164 ng/ml. Metoda
ELISA a fost aplicat pentru SEH, iar nivelul su minim de detectare a fost
de 2,5 ng/ml.
n ceea ce privete procentul de tulpini enterotoxigene, acesta a fost
foarte diferit, n funcie de sursa izolatelor. Numai 10% din 236 de izolate
din laptele crud au fost enterotoxigene, n timp ce 62,5% din 200 de izolate
alimentare au fost pozitive.
O epidemie de 50 de cazuri de intoxicaie alimentar staflococic s-a
produs n Brazilia, iar vehiculul a fost brnza de Minos. Agentul etiologic
a fost o tulpin nucleaz termostabil, pozitiv de Stp. aureus i s-au gsit
SEA, SEB i SEC.
O alt epidemie cu 328 de victime a fost pus pe seama consumului de
lapte crud, iar agentul etiologic a fost o specie de staflococ TN-az negativ,
alta dect Stp. aureus. Laptele a coninut SEC i SED i aproximativ 2x10
8

cfu/ml. Mastita bovin i cei care mnuiesc alimentele s-au dovedit a f
sursele microorganismului cauzal.
ntr-un studiu al SE
s
provenind de la vaci cu mastit din Italia (1999),
din cele 2343 de probe, au fost identifcate 160 de izolate de Stp. aureus.
48
Din cele 160 de izolate, 22 au produs SE
s
7,5% find SED, 4,4% SEC i
19% SEC i SEA.
Din 504 alimente din bufetele examinate n Spania, 19 (3,8%) au fost
izolate SE pozitive, 10 find SE
s
, aparinnd SEC, 4 SED, 3 SEB i 2 SEA.
ncercrile de a asocia enterotoxigenicitatea cu alte proprieti biochimice
ale staflococilor, cum ar f producia de gelatinoliz, fosfataz, lizozim,
lecitinaz, lipaz i DN-az sau fermentaia a diferii hidrai de carbon au
euat. Tulpinile enterotoxigene par s fe aproximativ la fel ca alte tulpini,
n aceste privine.
ncercrile de a lega enterotoxigeneza cu diferite tipuri specifce
de bacteriofagi nu au fost ncununate de succes. Majoritatea tulpinilor
enterotoxigene aparin fagilor de grup III, dar se tie c toate grupele de fagi
conin tulpini toxigene.
2.1.7.1. Proprieti chimice i fzice ale enterotoxinelor staflococice
Toate enterotoxinele staflococice sunt proteine simple, de la care,
prin hidroliz s-au obinut 18 aminoacizi, cei mai des ntlnii find acidul
aspartic, glutamic, lizina i tirozina.
Secvena de aminoacizi din SEB, a fost determinat prima. N-
ul terminal al acestuia este acidul glutamic, iar lizina este aminoacidul
C terminal. SEA, SEB i SEE sunt compui din 239-296 de reziduuri de
aminoacizi. SEC 3 conine 236 de reziduuri de aminoacizi, N-terminal find
serina, n timp ce N-ul terminal de SEC 1 este acidul glutamic.
n strile lor activate, enterotoxinele sunt rezistente la enzimele
proteolitice, cum ar f tripsina, chimotripsina, renina i papaina. La pepsin
sunt sensibile la un pH de aproximativ 2. TSST-1 este mult mai susceptibil
la pepsin dect SE
s
. Dei enterotoxinele difer n privina proprietilor
fzico-chimice, fecare are aproximativ aceeai poten.
Dei activitile biologice i reactivitatea serologic sunt n general
asociate, s-a demonstrat c enterotoxina serologic negativ poate f biologic
activ. Pe baza aminoacizilor SEA, SED, SEE i SEI, fac parte dintr-un
grup, n timp ce SEB, SEC
s
i SEG, din altul. SEC
s
sunt separate pe baza
unor epitopi minori.
Enterotoxinele sunt destul de termorezistente. Activitatea biologic
a SEB a fost limitat dup nclzirea la 60C, timp de 16 ore, la pH 7,3.
nclzirea unui preparat de SEC la 60C, 30 minunte, nu a avut drept urmare
nici o modifcare a reaciilor serologice. nclzirea SEA la 80C, 3 minute sau
la 100C, pentru 1 minut a provocat pierderea capacitii sale de a reaciona
serologic. n ser fziologic tamponat cu fosfat, s-a constatat c: SEC a fost
49
n mai mare msur termorezistent dect SEA i SEB. Inactivarea termic
a SEA pe baza unui rspuns emetic la pisic a fost demonstrat de ctre
Denny i colab. ca find de 11 minute, la 120C. Cnd s-au folosit maimue,
inactivarea termic a fost de 8 minute, la 120C.
Aceste preparate de enterotoxine au constat dintr-o concentraie de
13,5x a unui fltrat de cultur de acid casaminic, folosind tulpina 196 E.
Utiliznd testul de difuziune dubl n gel, Read i Bradshow au
constatat c inactivarea termic a 99% SEB pur n tampon veronal este F
250

=
16,4 minute. Punctul fnal pentru inactivarea enterotoxinelor prin difuziune
n gel a fost identic cu acela prin injectarea intravenoas a pisicilor. Panta
curbei inactivrii termice pentru SEA, n bulion de vit, la un pH de 6,2 a
fost gsit ca find n jur de 27,8C (50F), folosind 3 concentraii diferite
ale toxinei (5, 17 i 60 ng/ml).
Tabelul 2.7.
Incidena enterotoxinelor staflococice
Probe
Nr. de
culturi
Procentaj
enterotoxic
Enterotoxine
A B C D E Ref.
Probe umane 582 - 54,5 28,1 8,4 41,0 - 21
Lapte crud 236 10 1,8 0,8 1,2 6,8 - 21
Alimente congelate 260 30 3,4 3,0 7,4 10,4 - 21
Tulpini izolate din
epidemii
80 96,2 77,8 10,0 7,4 37,5 - 21
Diferite alimente 200 62,5 47,5 3,5 12,0 18,5 6,5 85
Carne de pui 139 25,2 1,4 0 0,7 23,7 0 46
Probe umane 293 39 7,8 17,7 7,2 6,8 0,7 83
Carne de pui 55 62 60,0 1,8 3,6 0 0 42
unc afumat spaniol 135 85,9 54,3 2,6 10,3 - - 69
Diferite alimente din
Belgia i Zair
285 16,2 6,5 4,5 2,7 0,5 - 56
Lapte crud din Trinidad 230 40,4 7,5 9,7 34,4 8,6 - 1
2.1.7.2. Modul de aciune al enterotoxinelor staflococice
Toate enterotoxinele staflococice, mpreun cu toxina TSST sunt
superantigeni bacterieni PTS, n raport cu recunoaterea antigenelor in
vivo, n contrast cu antigenele convenionale. Cu acestea din urm, o
celul CD
4
T faciliteaz contactul ntre receptorii antigenici ai celulelor T
i moleculele de clasa a II-a a complexului major de histocompatibilitate.
50
Superantigenele staflococice se leag direct prin legturi beta de celulele T
receptoare. Odat ce s-au legat de moleculele de clasa a II-a ale sistemului
major de histocompatibilitate (MHC), SE
s
stimuleaz celulele T helper s
produc citokine, cum ar f interleukinele (IL), gamainterferonul i factorul
de necroz tumoral.
Superantigenele sunt proteine care activeaz multe clone diferite ale
celulelor T. Printre citokine se produce o abunden excesiv de IL 2, care
s-a dovedit c este responsabil de majoritatea simptomelor de gastroenterit
staflococic.
Activitatea superantigenelor poate f demonstrat n laborator
prin expunerea unor splenocite murine la SE. Un rspuns pozitiv
const n proliferarea celulelor T cu producerea concomitent de IL 2 i
gamainterferon. Administrarea de IL2 produce multe din simptomele
provocate de enterotoxine.
Studiile cu SEC 1 au dus la concluzia c acesta se leag de un helix alfa
a MHC de clasa a II-a, astfel nct interaciunile dintre celulele prezentatoare
de antigen i celulele T se stabilizeaz ducnd la producerea de citokine i la
proliferarea consecvent de limfocite.
Regiunea SE
s
-urilor responsabile de activitatea emetic este neclar,
dei aceast activitate a fost separat de superantigenicitate. SEI-SEL par s
fe slab emetice sau deloc.
n ceea ce privete patogeneza enterotoxinelor la om, majoritatea
simptomelor sunt provocate de IL-2 i includ vrsturi, diaree, simptome
care pot f produse prin injecii intravenoase.
C terminal al moleculelor de enterotoxine staflococice are o
importan decisiv pentru mai multe funcii. ntr-un studiu n care s-a
folosit SEB, distrugerea a numai 9 aminoacizi din aceste regiuni a dus la
plierea complet a activitii de stimulare a celulelor T.
Se consider c punctul C terminal este important pentru confguraia
tridimensional a moleculelor.
Activitatea emetic i activitatea de proliferare a celulelor T pot
f asociate. Cnd SEA este modifcat prin distrugerea a 3 reziduuri C
terminale, activitatea de proliferare a celulelor T este reinut n timp ce
activitatea emetic se pierde. Prin folosirea unor copii mutante de SEA i
SEB s-a constatat c pentru vrsturile la maimue nu este sufcient numai
proprietatea de legare a MHC de clasa a II-a.
n general staflococii nu sunt n competiie cu fora normal din
majoritatea alimentelor. Cele care conin un numr mare de bacterii lactice
favorizeaz creterea staflococilor.
51
Tabelul 2.8.
Efectele pH-ului i ale NaCl n producerea de enterotoxin C, la un inocul de
10
8
celule/ml de Stp. aureus 137, ntr-un mediu de hidrolizat proteic, incubat la 37C,
8 zile
Valorile pH-ului
4,00-9,83 4,4-9,43 4,50-8,55 5,45-7,30 4,50-8,50
Coninutul n NaCl (%) 0 4 8 10* 12
Producia de enterotoxin + + + + -
*enterotoxina a fost detectat i la un inocul de 3,6x10
6
la pH 6,38-7,3 (Genigeorgis
et al., 1971, American Society of Microbiology)
2.1.8. Ecologie
Un numr mare de investigatori au constatat incapacitatea speciei Stp.
aureus de a concura cu alte microorganisme, att n alimentele proaspete,
ct i n cele congelate.
La temperaturi care favorizeaz creterea staflococilor, fora saproft
din hrana normal, confer protecie mpotriva creterii staflococilor prin
antagonism, prin competiie pentru nutrieni i prin modifcarea mediului
nconjurtor, n condiii mai puin favorabile pentru Stp. aureus.
Bacteriile antagoniste, fa de Stp. aureus includ Acinetobacter,
Aeromonas, Bacillus, Pseudomonas, Stp. epidermidis, Enterobacter etc.
2.1.8.1. Habitat i distribuire
Speciile de staflococi sunt adaptate gazdei, iar n jur de jumtate sunt
patogene pentru om (Stp. cohnii subsp. cohnii) sau pentru om i animale (Stp.
aureus). Numrul cel mai mare de germeni se gsete n apropierea orifciilor
de pe suprafaa corpului (nri, axil, regiunea ingvinal i perineal), care
se gsesc n habitate umede, iar numrul per centimetru ptrat poate atinge
ntre 10
3
-10
6
germeni, n timp ce, n habitatele uscate, numrul de germeni
este ntre 10 i 10
3
. Sursele de infecie cele mai importante sunt reprezentate
de purttorii nazali i persoanele care manipuleaz alimentele i ale cror
mini i brae prezint furunculi sau carbunculi.
Majoritatea animalelor domestice sunt gazde pentru Stp. aureus. Dac
laptele de la vacile cu mastit staflococic este consumat sau folosit la
prepararea brnzei, ansele contactrii unei toxiinfecii alimentare sunt foarte
mari. Tulpinile de staflococi izolate din laptele mastitic sunt considerate
de unii cercettori ca find de origine uman, totui ele sunt desemnate n
continuare, ca tulpini animale.
52
ntr-un studiu pe produse crude de porc, staflococii izolai din diferite
pri ale probelor au fost n esen tulpini de origine animal. S-a putut
constata c n timpul preparrii unor produse afumate de porc, tulpinile
animale au fost nlocuite n cursul procesului de prelucrare cu tulpini umane,
astfel nct n produsele fnite nu a mai putut f detectat nici o tulpin de
provenien animal.
Stp. cohnii se gsete pe pielea uman i ocazional n tractul urinar i
n plgi. Pielea uman reprezint att habitatul lui Stp. epidermidis ct i al
lui Stp. haemolyticus, acesta din urm find asociat cu infeciile umane.
Stp. hycus este patogen pentru porc, la care se gsete pe piele.
Au mai fost izolai de la psri i din lapte Stp. xylosus i Stp. simulans.
Stp. schleiferi a fost izolat de la pacienii umani cu rezisten sczut la
infecie, iar subspecia coagulans a fost izolat de la cine, din otite.
Stp. aureus subsp. anaerobius produce mbolnviri la oi, iar Stp.
delphini a fost izolat de la delfni. Stp. sciuri se gsete pe pielea roztoarelor,
iar Stp. lentus i Stp. caprae sunt asociai cu consumul de lapte de capr.
Dei multe dintre speciile coagulaz negative identifcate se adapteaz
n special la gazde non-umane, ele se pot multiplica n alimente, find de
ateptat s produc enterotoxine. Toi aceti contaminani ai alimentelor
cresc n prezen de NaCl 10%.
Deoarece, dintre toate speciile prezentate, Stp. aureus a fost studiat
cel mai mult, n sensul producerii gastroenteritelor staflococice alimentare,
majoritatea informaiilor ce urmeaz, se vor referi la aceast specie.
Staflococii sunt germeni foarte rspndii n natur. Speciile saprofte
se gsesc n aer, ap, pmnt, precum i pe pielea i mucoasele oamenilor i
animalelor, fcnd parte din fora normal a organismului.
Staflococii potenial patogeni (Stp. aureus, Stp. hyicus, Stp.
intermedius) produc mbolnviri la organismele debilitate i se gsesc pe
piele, mucoase, rinofaringe i intestin.
Stp. aureus colonizeaz nrile i colonul, de unde contamineaz
frecvent tegumentul.
Proporia purttorilor sntoi (la om), variaz ntre 10 i 40% n
colectivitatea general i 40-70% n mediul intraspitalicesc.
Stp. epidermidis este omniprezent n biotopurile tegumentare, iar
celelalte specii au tropism fa de anumite zone ale pielii sau mucoaselor:
fa, scalp, urechea extern etc.
Staflococii sunt bacterii rezistente la aciunea factorilor de mediu,
comparativ cu alte specii neformatoare de endospori. Majoritatea celulelor
bacteriene sunt distruse la 60C n 30 de minute, la 70C n 15 minute, unele
celule putnd rezista pn la 80C.
53
Tulpinile slbatice sunt sensibile la o gam larg de antibiotice
(penicilin, tetraciclin, eritromicin, cloramfenicol, neomicin) ns se
constat frecvent apariia de variante antibioticorezistente.
Staflococii sunt sensibili la numeroi bacteriofagi, fapt ce a permis
mprirea lor n lizotipuri.
2.1.9. Patogenitatea
Staflococii i exercit activitatea patogen prin virulen i toxicitate,
atribute care nu au putut f individualizate distinct deoarece se declaneaz
ntr-o succesiune complex de reacii metabolice care se ntreptrund, iar
diversele enzime i toxine elaborate acioneaz mai curnd, ca inele ntr-o
reacie biochimic ramifcat dect ca factori individuali de patogenitate.
Factorii de agresivitate 1. (enzimele extracelulare) favorizeaz
difuziunea staflococilor n esuturi sau neutralizeaz mecanismele de aprare
ale organismului. Principalele enzime extracelulare sunt: coagulazele,
hialuronidaza, fbrinolizina (staflokinaza), deoxiribonucleaza, fosfataza,
lipazele.
Coagulazele sunt proteine care coaguleaz plasma (reacionnd cu
protrombina, convertesc fbrinogenul n fbrin) in vivo i in vitro i
sunt de dou tipuri:
Coagulaza legat (clumping factor) component a
peretelui celular care reacioneaz direct cu fbrinogenul, determinnd
agregarea n grmezi a celulelor bacteriene cu masele de fbrin;
Coagulaza liber , enzim extracelular similar
protrombinei care coaguleaz plasma in vivo i in vitro. In vivo
induce formarea unui manon de plasm coagulat n jurul germenilor cu
rol antichimiotactic fa de fagocite. In vitro staflocoagulaza se pune n
eviden prin adugarea culturii, n bulion de 24 de ore, la plasma oxalat
sau citratat. Tulpinile care coaguleaz plasma n interval de 1-3 ore sunt
considerate coagulaz pozitive. Tulpinile de origine uman coaguleaz
plasma de om i de iepure, n timp ce tulpinile de origine ovin i bovin
coaguleaz plasma tuturor acestor specii.
Ambele tipuri (coagulaza legat i coagulaza liber) au rol n
patogenitate, ns n practica curent se recurge numai la evidenierea
coagulazei libere.
Activitatea coagulazic se poate evidenia i prin cultivarea bacteriei
pe mediile Bayrd-Parker i Vogel-Johnson.
Aciunea coagulazei staflococice asupra fbrinogenului, este similar
plasmatic cu protrombina. Prin aciunea de coagulare a plasmei sanguine,
54
coagulaza staflococic blocheaz n exsudatul infamator accesul factorilor
bactericizi din plasma extravazat i a leucocitelor la locul agresiunii
staflococice.
Hialuronidaza (factorul de difuziune) este o enzim care acioneaz
asupra acidului hialuronic din substana fundamental a esutului conjunctiv,
pe care l descompune n glucozamin, acid gluconic i acid acetic,
favoriznd astfel difuzarea germenilor n esuturi. Staflococii patogeni
produc hialuronidaz n proporie de 90%.
Deoarece infamaia produs la nivelul esutului invadat de staflococi
blocheaz aciunea hialuronidazei, ca factor de difuziune, aciunea acesteia
se limiteaz la fazele iniiale ale infeciei staflococice, find considerat,
factor accesoriu de patogenitate.
Hialuronidaza elaborat de staflococi prezint un mecanism de aciune
asemntor cu al hialuronidazei izolat de la streptococi, pneumococi i
Clostridium perfringens, find ns distinct imunologic de acestea.
Fibrinolizina (staflokinaza) este o enzim proteolitic care se
cantoneaz n exsudatul infamator din esutul invadat prin lezarea reelei de
fbrin. Permite difuzarea staflococului n esutul sntos find rspunztoare
de producerea emboliilor n formele septicemice ale infeciei.
Deoxiribonucleaza (termonucleaza) acioneaz asupra DNA-ului
din celulele diferitelor esuturi. Este o enzim termorezistent elaborat de
tulpinile patogene coagulaz pozitive n proporie de 90-95%. Din punct
de vedere biochimic este o fosfodiesteraz, putnd desface att molecula
de DNA ct i pe cea de RNA, cu producerea de fosfomononucleotizi. Este
deinut antigenic i de nucleazele streptococice, iar dup inoculare la iepure
produce, n organismul acestuia, anticorpii antinucleaz, care inhib specifc
activitatea enzimatic. Evidenierea deoxiribonucleazei poate f utilizat ca
test screening pentru tulpinile enterotoxigene.
Fosfataza este elaborat de majoritatea tulpinilor patogene de
staflococ, find capabil s coboare pH-ul la locul infeciei. Aceast
caracteristic biochimic este foarte important pentru diagnosticul unor
tulpini patogene de staflococ, servind n special la testarea staflococilor
din alimente.
Lipazele acioneaz asupra lipidelor plasmatice i tegumentare,
ceea ce explic tropismul staflococilor fa de piele, unde glandele sebacee
sunt mai active.
2. Factorii de toxicitate (toxinele staflococice) au o structur prote-
ic, posed proprieti antigenice, producnd alterri morfologice i funci-
onale ale esuturilor. Cele mai importante toxine staflococice sunt: hemo-
lizinele, enterotoxinele, leucocidinele, toxina epidermolitic i exfoliant i
55
proteina A. Sunt considerai factori majori ai patogenitii staflococilor.
Hemolizinele sunt cei mai importani factori toxici care contri-
buie la alterarea celulelor.
n funcie de specia animal de la care provin globulele roii, de aspectul
zonei de hemoliz, de posibilitatea de a aciona la 40 C sau la 37C ct i
de termorezisten, au fost descrise patru tipuri de hemolizine distincte din
punct de vedere antigenic, notate cu alfa, beta, gamma i delta.
Dup studiile lui Lammer, tulpinile de staflococ patogene pentru om
produc hemolizine alfa i delta, iar cele patogene pentru animale, alfa, beta
i delta.
Hemolizina alfa ( toxina sau staflotoxina) este cea mai
agresiv, find prezent, de obicei, la tulpinile umane. Exercit o activitate
hemolitic intens asupra eritrocitelor de iepure i de oaie i o activitate
hemolitic slab asupra celor de om. Molecula purifcat de toxin alfa
prezint n formele monomere un coefcient de sedimentare 3S i are masa
molecular de 28.000 daltoni. Hemolizina alfa acioneaz la 37 C ne mai
avnd efect la 4C. Sub aciunea formolului i a cldurii (37C) poate f
transformat n anatoxin.
Pe lng activitatea hemolitic, alfa toxina manifest i o aciune
dermonecrotic (prin administrare intradermic la iepure), leucolitic
(asupra leucocitelor de om i de iepure), trombocitotoxic i letal (prin
administrare intravenoas la oarece i n doze mari la iepure).
Modul de aciune const n fxarea staflotoxinei pe hematii, ceea ce
determin eliminarea ionilor de K
+
i a hemoglobinei, urmate de liz.
Pe agar cu snge produce o zon ntins de hemoliz clar, cu margini
difuze.
Hemolizina beta este produs cel mai frecvent de ctre Stp.
aureus, find prezent ntr-o mai mare msur la tulpinile de origine animal.
Prezint o activitate hemolitic mai pronunat fa de hematiile de oaie i
bou, dar nu i asupra celor de iepure sau de om.
Betahemolizina este o sfngomielinaz care acioneaz asupra
sfngomielinelor din membrana eritrocitelor la 37C. Pe agar cu snge
produce o zon ntins de hemoliz difuz, dar cu marginile net delimitate.
Caracteristica cea mai important a acestei molecule toxice este producerea
hemolizei de tip cald-rece (Irina Codi), care se traduce prin producerea
de zone de hemoliz incomplet la 37C, care dup expunerea culturii cteva
ore la 4C, devine complet (similar celei produse de hemolizina ).
Hemolizina beta este mai puin toxic, avnd efect letal numai n
doze mari i un grad mai ridicat de termorezisten, comparativ cu celelalte
hemolizine staflococice.
56
Hemolizina gamma este activ fa de eritrocitele de iepure,
om i oaie, leucocite i limfoblaste i inactiv fa de hematiile de cal.
Este termolabil i prezint o activitate mai intens la temperaturi joase.
Gammahemolizina este alctuit din dou componente cu aciune sinergic
a cror mas molecular nsumat este de 45.000 daltoni.
Hemolizina delta este antigenic distinct de celelalte fraciuni,
elaborarea ei find condiionat de cultivarea bacteriei n atmosfer cu CO
2
.
Prezint o aciune hemolitic i leucolitic fa de celulele de om, iepure,
cobai, cal, oarece.
Enterotoxinele sunt secreii produse de unele tulpini de staflococi
coagulaz negativi. Din punct de vedere chimic, acestea sunt proteine
simple constituite dintr-un singur lan polipeptidic n care predomin lizina,
asparagina, acidul glutamic i tirozina. Masa lor molecular variaz ntre
28.000 i 35.000 daltoni.
Enterotoxigeneza poate avea loc ntre limite largi de temperatur
(-6,7 C i 45,5 C), find infuenat favorabil de condiia de aerobioz; nu
este inhibat de acidiferea mediului (find elaborat chiar la pH 4) i nici
de concentraiile crescute de NaCl. Sunt rezistente la aciunea enzimelor
digestive i la temperaturi pn la 117C. Rezist aproximativ o or la
100C, ceea ce face ca ele s nu fe distruse n cursul preparrii culinare
a alimentelor. Dac sunt incomplet inactivate, se reconstituie parial n
24 de ore la 25C. Distrugerea forei intestinale prin antibioticoterapie le
poteneaz efectul.
Prin imunodifuzie au fost identifcate ase variante antigenice notate
cu A, B, C, C
1
, D, E. n 1984, pe baza examinrii a 122 de tulpini, Mustafa
gsete urmtoarea frecven a tipurilor de enterotoxin: A = 36 tulpini, B =
30 tulpini, C = 16 tulpini, D = 20 tulpini i E = 1 tulpin.
Enterotoxinele reprezint una dintre cauzele cele mai frecvente ale
toxiinfeciilor alimentare sau a enterocolitelor pseudomembranoase, n urma
tratamentului cu antibiotice. n toxiinfeciile alimentare cel mai frecvent sunt
implicate enterotoxinele A i D, iar n enterocolite, enterotoxina B. Speciile
sensibile la aciunea enterotoxinelor staflococice sunt: omul, maimua i
pisica.
Se pare c acioneaz numai asupra centrilor nervoi, declannd
contracii peristaltice i antiperistaltice ale intestinului, responsabile de
producerea sindromului diareic i al vomei.
Evidenierea enterotoxinelor staflococice se poate realiza prin
testul Dolman, care const n administrarea fltratului de culturi pe cale
intraperitoneal la pisoi de 6-8 sptmni. Testul este pozitiv cnd se constat
creterea temperaturii cu aproximativ 1C, neutroflie i o gastroenterit
57
pasager al crei principal simptom este voma (uneori poate cpta un
caracter paroxistic).
Un nalt grad de specifcitate n identifcarea serologic a enterotoxi-
nelor se poate realiza prin teste ca: seroprotecia pe pisici; seroprecipitarea
n tub; imunodifuzia n gel de agar, ELISA, PCR.
Toxina epidermolitic i exfoliant. Are masa molecular de 24.000
daltoni i este antigenic. Prezint un tropism marcant pentru esutul
conjunctiv cutanat, acionnd prin distrugerea cementului intercelular cu
desprinderea straturilor superioare ale epidermului.
Produce, la om, sindromul pielii oprite, iar la porc epidermita
exsudativ.
Leucocidinele determin distrugerea leucocitelor avnd o aciune
exclusiv asupra neutroflelor i macrofagelor de om i de iepure.
Are o structur complex, find reprezentat de dou subuniti
distincte electroforetic, puternic antigenice, una termolabil i cealalt
termostabil. Activitatea biologic a acestor subuniti este inhibat de
anticorpii specifci.
Proteina A este un compus prezent n peretele celular cu masa
molecular de 43.000 daltoni.
Prezint o aciune antifagocitar, anticomplementar, determin liza
trombocitelor i induce starea de alergie.
Proteina A este antigenic, avnd utilizri multiple n imunologia
practic datorit situsurilor sale de cuplare cu regiunea F
c
(fragment
cristalizabil) a complementului.
Tabelul 2.9.
Caracteristici ale enterotoxinelor staflococice cunoscute pn n prezent
Enterotoxine
Doza
emetic
Greutate
molecular (Da)
Anul
izolrii
Locusul genei rspunztoare de
elaborarea toxinei
A 5 27,100 1960 cromozom
B 5 28,366 1959 SaPI
C
1
5 34,100 1967 -
C
2
5-10 34,000 1984 -
C
3
<10 26,900 1984 -
D 20 27,300 1979 plasmid
E 10-20 29,600 1971 cromozom
G - 27,043 1992 -
H <30 27,300 1995 -
I slab 34,928 1998 -
58
Enterotoxine
Doza
emetic
Greutate
molecular (Da)
Anul
izolrii
Locusul genei rspunztoare de
elaborarea toxinei
J - - 1998 -
K - 26,000 2001 SaPI
L - - 2001 -
SaPI = insula de patogenitate pentru Stp. aureus
2.1.10. Structura antigenic
Prin reacia de seroaglutinare i seroprecipitare s-au putut identifca
mai multe grupe antigenice.
Patogenitatea staflococilor este generat de aciunea complex a
numeroi factori enzimatici care acioneaz simultan i ntreptruns,
neputnd f vorba de o serie de aciuni separate i independente.
Unul dintre mecanismele cele mai importante ale reactivitii n
infecia staflococic l reprezint aprarea celular prin endocitoz,
realizat de ctre neutrofle i unele tulpini, de macrofage. Declanarea
acestor mecanisme de reacie se bazeaz pe recunoaterea determinanilor
antigenici de suprafa ai celulelor staflococice ajunse n esuturi unde sunt
recunoscute ca non-self. Au fost identifcai peste treizeci de determinani
antigenici. Staflococii prezint o heterogenitate i o variabilitate antigenic
foarte mare, find identifcate antigene celulare cu specifcitate de gen, de
specie, precum i mari variaii de la tulpin la tulpin.
Ca antigene cu specifcitate de gen, a fost pus n eviden o protein
prezent att la Stp. aureus ct i la Stp. epidermidis.
Dintre antigenele cu specifcitate de specie face parte polizaharidul A,
specifc speciei Stp. aureus, identifcat ca acid ribitol teichoic, compus din
N-acetil glucozamin i poliribitol fosfat ataat la stratul bazal al peretelui
celular.
Animalele care au suferit infecii staflococice repetate prezint o
alergie cutanat de tip imediat prin injectarea intradermic a polizaharidului
A. Acest polizaharid nu se gsete n peretele celular al staflococilor
nepatogeni.
Polizaharidul B este tot un derivat al acidului teichoic i anume acid
glicerol teichoic, find specifc speciei Stp. epidermidis.
Proteina A este un component major al peretelui celular la Stp. aureus
i se gsete la peste 90% din tulpinile de staflococ patogen.
Tulpinile patogene izolate de la om i animale formeaz, de obicei,
o capsul de natur polizaharidic, a crei prezen accentueaz virulena
tulpinii de staflococ. Capacitatea antifagocitar este mai pronunat, iar
59
vaccinurile preparate cu asemenea tulpini sunt mai imunogene.
2.1.11. Infecia natural
Staflococii produc numeroase i variate infecii purulente la om i
animale. Posed o putere infectant slab cu toate c se gsesc frecvent
pe suprafaa obiectelor i a tegumentului. Se pare c aceti germeni nu
acioneaz (chiar dac este vorba despre o tulpin cu virulen ridicat)
dect pe un fond debilitat. Dintre factorii locali care pot declana o infecie
staflococic, fac parte iritaiile permanente, hematoamele i esuturile
devitalizate, iar dintre factorii generali: diabetul, carenele vitaminice,
subnutriia, abuzul de alcool i medicamente (corticoizi, antihistaminice).
La om, Stp. epidermidis produce endocardite, foliculite superfciale sau
acnee pustuloas.
Stp. aureus produce infecii primare i infecii secundare. Infeciile
primare sunt reprezentate de infecii acute i toxiinfecii alimentare.
Cele mai frecvente sunt: staflocociile cutanate (foliculite superfciale
i profunde); sicozis (foliculita brbiei i a mustilor); acnee pustuloas
grav, hidrosadenit (infecia glandelor sudoripare axilare); furunculoza.
Toxiinfeciile alimentare sunt produse de tulpinile enterotoxigene din
alimente ca: produsele lactate, oule neferte, carnea. Condiiile de producere
a unei toxiinfecii alimentare sunt cantitatea de germeni din aliment (n jur
de 100.000 germeni/gram) i capacitatea enterotoxigen a acestora.
Infeciile secundare produse de Stp. aureus la om, sunt reprezentate n
principal de osteomielite, artrite, endocardite, meningite, abcese (hepatic,
cerebral, septicemii).
Infeciile staflococice la animale se ntlnesc destul de frecvent putnd
f primare i secundare.
La vaci, produc mamita staflococic, descris pentru prima dat
de Bang i Lucet (1889). Este ntlnit la vacile n lactaie i se caracterizeaz
prin infamaia glandei mamare, cu modifcri cantitative i calitative ale
laptelui i, uneori, gangrena parenchimului mamar. Agentul etiologic major
al acestei infecii este Stp. aureus, subsp. aureus. De asemenea, s-au mai
izolat i Stp. hyicus i Stp. intermedius.
Stp. aureus, subsp. aureus produce la taurine i alte infecii cum ar
f: dermatita staflococic a taurinelor (furunculoza staflococic), infecie
localizat la baza cozii, regiunea perineal i regiunea crupei. La vacile cu
mamit staflococic a fost descris o dermatit exsudativ cu localizare pe
mameloane sau pe pielea glandei mamare.
La ovine, Stp. aureus subsp. aureus produce mamita gangrenoas
60
a oilor i caprelor, numit popular rsfugul negru, care se ntlnete la
animalele n lactaie i se caracterizeaz prin febr, suprimarea secreiei
lactate i gangrenarea parenchimului mamar. Stp. aureus subsp. aureus
se poate izola ca germen epift de pe tegumentul animalelor sntoase i
tegumentul mamar. Tulpinile izolate de la femelele bolnave sunt catalaz
pozitive, find asemntoare morfologic, cultural i biochimic cu tulpinile
de staflococi izolate de la vacile cu mamit staflococic.
Alte infecii produse la oi i capre de Stp. aureus sunt:
piemia de cpue a mieilor (staflococia endemic a mieilor), -
produs de Stp. aureus subsp. aureus;
staflococia aposteomatoas a oilor i caprelor (boala Morel sau -
boala abceselor), produs de Stp. aureus subsp. anaerobius;
dermatitele staflococice ale caprelor, care sunt afeciuni cutanate -
produse, cu o singur excepie, de Stp. aureus subsp. aureus la oile i caprele
inute n condiii de igien i alimentaie defcitare. Cele mai cunoscute
sunt: dermatita facial, impetigo, staflococia cu Stp. xylosus i dermatita
acropodial.
La porc, Stp. hyicus subsp. hyicus produce epidermita exsudativ
a porcului, boal infectocontagioas, care se exprim clinic prin eritem
cutanat i exsudat grsos de culoare alb-glbuie pe suprafaa zonelor
cutanate afectate. Stp. hyicus subsp. hyicus se gsete pe piele i mucoase
(nazal, vaginal) la porcii sntoi, dar i la alte specii de animale. Este
coagulaz negativ i nu produce hemoliz fa de eritrocitele de oaie.
Produce fosfataz, hialuronidaz, nu fermenteaz manitolul i nu produce
acetoin. n cadrul speciei exist tulpini patogene i nepatogene, iar
tulpinile patogene produc dou toxine exfoliative termolabile, responsabile
de virulena acestor tulpini.
Stp. hyicus poate f izolat i de la alte specii de animale (vaci, cai,
mgari), cu leziuni cutanate, precum i de la vaci cu mamite subclinice.
Alte infecii staflococice produse la suine, cu semnifcaie patologic
mai redus, sunt: dermita ulcerativ i mamita scroafelor impubere produse
de Stp. aureus subsp. aureus.
Staflococia iepurilor este produs de Stp. aureus subsp. aureus,
find epift pe mucoase i piele la iepuri, ntlnit frecvent i n cresctorii,
mai ales pe pereii cutilor.
La cine, infeciile staflococice sunt produse n principal de Stp.
intermedius, care este inclus n fora bacterian rezident, urmat ca frecven
de Stp. aureus i Stp. hyicus. Mai frecvente i mai importante sunt dermatitele
staflococice (piodermatitele), dar i otitele externe, conjunctivitele, infeciile
genitale, urolitiaza, pododermatitele, discospondilitele etc.
61
La ceii, din rasele Ciobnesc spaniol i Labrador este descris
piodermita juvenil.
La nurc, Stp. aureus subsp. aureus produce piodermit
caracterizat prin focare purulente pe pielea regiunii cervicale, dorsale i
genitale.
La oarecii i obolanii de laborator au fost descrise dermatite
staflococice produse de Stp. aureus subsp. aureus.
Staflococia aviar este o boal infecioas care poate evolua
acut, septicemic sau ca infecie localizat la articulaii, burse seroase, piele
i organe interne. Infecia este produs de tulpini coagulaz pozitive de
Stp. aureus subsp. aureus. Au mai fost izolai de la psri: Stp. hyicus, Stp.
epidermidis, Stp. gallinarum.
2.1.12. Infecia experimental
Speciile sensibile la infecia staflococic n condiii de laborator sunt:
iepurele, obolanul i oarecele.
La iepure, inocularea se realizeaz pe cale intravenoas, provocnd
o infecie septicemic mortal, cu prezena germenilor n numr mare, mai
ales, n frotiurile efectuate din rinichi.
obolanii tineri, inoculai intravenos, fac deseori infecii mortale
caracterizate prin simptomatologie nervoas.
oarecii inoculai pe cale intrapleural mor n 1-3 zile, cu prezena
staflococilor, mai ales, n lichidul pleural i cel pericardic, fcat i splin.
Badijonarea mameloanelor, la oaie, cu culturi patogene de staflococi
nu duce la instalarea infeciei, dect dac exist o leziune (o poart de intrare)
la acest nivel sau dac germenii se introduc direct n canalul galactofor (Abe
S. i Kvai H., 1991).
2.1.13. Imunoproflaxie
Pentru proflaxia infeciilor staflococice se utilizeaz stocvaccinuri
sau autovaccinuri asociate cu antibioticoterapie i anatoxina staflococic
obinut prin inactivare cu formol 3 i cldur (T = 40 C).
La vaci, n proflaxia specifc a mamitelor staflococice, se folosesc
vaccinuri polivalente inactivate.
n mamita gangrenoas a oilor i caprelor se folosesc vaccinuri
inactivate care sunt de obicei culturi n bulion de Stp. aureus subsp. aureus
inactivate cu formol i cu hidroxid de aluminiu, ca adjuvant.
62
2.1.14. Sindromul gastroenteritelor staflococice
Simptomele intoxicaiei alimentare staflococice apar de obicei n
decurs de 4 ore de la ingestia unui aliment contaminat, dei s-a raportat un
interval de 1-6 ore.
Simptomele se manifest prin grea, vrsturi, colici abdominale
(care de obicei sunt extrem de severe), diaree, transpiraie, prostraie i
uneori o scdere a temperaturii corpului. Acestea dureaz n general 24-48
de ore, rata mortalitii find foarte redus sau nul.
Tratamentul obinuit const n repaus la pat i meninerea echilibrului
hidric. La ncetarea simptomelor bolnavul nu posed o imunitate
demonstrabil mpotriva crizelor recidivante dei animalele devin rezistente
la enterotoxine dup doze orale repetate. Deoarece simptomele pot f puse pe
seama ingestiei enterotoxinelor preformate, este de neles c coproculturile
ar putea f negative dei acest lucru se ntmpl destul de rar.
Dovada unei intoxicaii alimentare staflococice se stabilete prin
recuperarea staflococilor enterotoxigeni din resturile de mncare sau din
coproculturile bolnavilor.
Trebuie fcute ncercri de a extrage enterotoxinele din alimentele
suspecte, n special cnd numrul celulelor viabile recuperabile este redus.
Cantitatea minim de enterotoxine necesar pentru provocarea bolii la om
este de aproximativ 20 ng.
Aceast valoare deriv dintr-o epidemie de gastroenterit staflococic
provocat de laptele din ciocolat 2%. Din 12 cartoane cu lapte, SEA a fost
gsit n cantitate de 94 pn la 184 ng per carton, cu o medie de 144 ng.
Rata crizelor a fost asociat cu cantitatea de lapte consumat i cu vrsta. Cei
n vrst de 5-9 ani au fost mai sensibili dect cei de 10-12 ani. Constatri
mai vechi au artat o doz de 20-35 ng de SEB pur pentru aduli. Din 16
incidente de gastroenterite staflococice, au fost gsite niveluri SE mai mici
de 0,01-0,25 ng/g de aliment.
2.1.15. Incidena toxiinfeciilor alimentare produse de staflococi i
alimentele vehicul
Incidena staflococilor n alimentele crora nu l-i s-au aplicat
tratamente termice este foarte mare. De obicei, alimentele vehicul sunt
reprezentate de produsele incorect refrigerate dup preparare.
Evaluri recente situeaz numrul de cazuri de gastroenterite transmise
prin staflococi ntre 1 milion i 2 milioane pe an, n SUA.
Una dintre cele mai mari epidemii raportate vreodat, s-a produs n
63
iunie-iulie 2000, n districtul Kansai, n Japonia. Au fost 13.420 de victime,
iar alimentul vehicul principal a fost laptele smntnit i pudrat cu zahr
de la o singur surs. Agentul etiologic l-a reprezentat o tulpin de Stp.
aureus productoare de SE. Simptomele au aprut la 83,4% din victimele
intervievate, n decurs de 6 ore. Vrsturile au fost raportate n 73,3% din
cazuri, iar diareea la 75,9% din victime.
ntre anii 1981-1995, n Koreea, au fost nregistrate 64 de epidemii de
intoxicaii alimentare staflococice, cu 2490 de cazuri, reprezentnd 16,5%
din totalul epidemiilor alimentare din aceast perioad.
n Japonia 9,9% din toate cazurile de toxiinfecii alimentare i 15,9%
din epidemii au fost de origine staflococic. ntre anii 1980-1999, n Japonia
au fost raportate 2.525 de epidemii staflococice cu 59.964 de mbolnviri
i 3 decese.
Principalele alimente care au servit ca vehicul au fost orezul i
pstile de fasole. SEA, mpreun cu SEB au fost enterotoxinele cele mai
frecvente.
Problema care se pune este o problem de raportare, pentru c, frecvent,
epidemiile mici din gospodriile populaiei nu sunt raportate autoritilor de
sntate public. Un procent mare de cazuri, raportate, de toate tipurile sunt
reprezentate de evenimente, la care particip un numr mare de persoane.
O epidemie neobinuit, provocat de SEA i SED, a fost datorat de
consumul de ciuperci slbatice n oet. Alimentul a coninut 10 ng SEA i 1
ng SED per gram.
2.1.16. Prevenirea sindroamelor de intoxicaii staflococice i de alte
intoxicaii alimentare
Cnd n alimentele susceptibile se gsesc un numr redus de
staflococi, acestea vor rmne indemne de enterotoxine i de alte riscuri
de intoxicaii alimentare, dac sunt pstrate la/sub 4,4C sau la peste 60C,
pn la consum.
n anii 1961-1972, Brion a investigat peste 700 de epidemii de
toxiinfecii alimentare. Acesta a constatat c dintre cei 16 factori, care au
contribuit la producerea toxiinfeciilor alimentare, cel mai frecvent au fost
implicai, urmtorii cinci factori:
refrigerarea incorect; 1.
prepararea alimentelor cu mult naintea servirii lor planifcate; 2.
igiena personal incorect (nesatisfctoare); persoane infectate 3.
care manipuleaz alimentele;
fertul sau procesarea termic, insufciente; 4.
64
meninerea hranei n dispozitive de nclzire, la temperatura de 5.
cretere bacterian.
Cei cinci factori enumerai au contribuit la producerea a 68% din
epidemii.
Alimentele susceptibile nu trebuie inute la limita creterii staflococilor,
mai mult de 3-4 ore.
2.1.17. Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA)
Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA) a devenit o
problem de sntate pentru majoritatea statelor membre ale UE. Uzual
infeciile cu MRSA au fost acceptate ca find cu risc ridicat n cadrul
spitalelor, dar recent a fost detectat o nou tulpin de MRSA (ST398)
la animale de producie din UE. n special, porcii au fost identifcai ca
find o important surs de infecie pentru cresctorii de porci sau familiile
acestora, n caz de contact direct cu porcii.
MRSA este rezistent la majoritatea antibioticelor utilizate n mod
obinuit i constituie un pericol mai ales pentru pacienii cu o imunitate
sczut. n Regatul Unit, numrul de decese atribuite MRSA a fost estimat
la aproximativ 3000 pe an.
La nivelul statelor membre ale Uniunii europene MRSA nc
evolueaz n dinamici ce variaz de la endemii slabe pn la endemii
majore. Peste 50% din cele 31 state membre (n principal statele din sudul
Europei, Regatul Unit i Irlanda) raporteaz izolarea MRSA n peste 25%
din totalul izolatelor Staphylococcus aureus. n nordul Europei procentul
MRSA se menine n ultimii anii la sub 4%. Procente crescnde de izolate
MRSA sunt raportate n ultimii ani de Olanda, Finlanda, Republica Ceh,
Germania, Belgia, Ungaria, Regatul Unit al Marii Britanii i Irlandei de
Nord, Portugalia i Malta, n timp ce scderea incidenei este semnalat
n Frana i Slovenia. n Romnia situaia este extrem de grav, n ultimii
ani numrul izolatelor MRSA a crescut foarte mult, procentul acestora din
totalul izolatelor Staphylococcus aureus depete 50-60% (tabel 1).
65
Evoluia incidenei izolatelor MRSA n 2002 i 2006 n UE i EEA/EFTA
(Sistemul de Supraveghere a Rezistenei la antimicrobiene European, 2008)
,
*** European Centre for Disease Prevention and Control. Annual Epidemiological
Report on Communicable Diseases in Europe 2008. Report on The State of
Communicable Diseases in The EU and EEA/EFTA Countries
Friedrich AW, Witte W, de Lencastre H, Hryniewicz W, Scheres J, Westh H, et
al. A European laboratory network for sequence-based typing of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) as a communication platform between human and
veterinary medicine an update on SeqNet.org. Euro Surveill. 2008;13(19):pii=18862.
*** EARSS. Interactive database access. http://www.rivm.nl/earss/database/
2.1.18. Metode de izolare i identifcare a lui Stp. aureus din alimente
Metoda de numrare direct n plci Petri a lui Stp. aureus
Tehnica de lucru
Din produsul omogenizat i din fecare diluie se nsmneaz aseptic
1 ml de prob n trei plci Petri cu agar Bayrd-Parker (M21). Inoculul se
distribuie astfel: 0,4 ml n prima plac, 0,3 ml n cea de-a doua i 0,3 ml n
cea de-a treia.
Plcile se inverseaz i incubeaz 45-48 de ore la 35C.
Se selecioneaz plcile Petri care conin ntre 20 i 200 colonii
caracteristice.
Coloniile formate de staflococi sunt circulare, netede, convexe,
umede, cu diametrul de 2-3 mm, de culoare gri pn la negru, cu margini de
culoare deschis, aproape alb, nconjurat de o zon opac i frecvent de
o zon exterioar clar. Au o consisten untoas, pn la cleioas. Uneori
66
se pot observa tulpini nelipolitice, cu un aspect similar cu excepia faptului
c zonele nconjurtoare opace i clare sunt absente. Tulpinile izolate din
alimentele congelate sau uscate pstrate pe perioade mai lungi, prezint
frecvent o coloraie mai puin neagr dect cele tipice, care pot avea un
aspect rugos i o textur uscat.
Pentru stabilirea numrului prezumptiv de staflococi pe un gram
de produs se verifc 10 colonii, din plcile cu pn la 100 de colonii
caracteristice i 20 de colonii din plcile cu mai mult de 100 de colonii
caracteristice.
Verifcarea const n examenul microscopic i n reacia coagulazei.
Se nsmneaz coloniile coagulaz pozitive, pe un set de plci triple i se
multiplic cu factorul de diluie al probei. Aceast valoare se raporteaz la
numrul de staflococi aurii per gram din produsul testat.
Testul coagulazei. Se transfer coloniile suspecte de a f Stp. aureus n
tuburi cu bulion BHI (M26), 0,2-0,3 ml i se amestec bine. Se nsmneaz
pe mediul TSA (M77) (sau alt mediu de ntreinere adecvat), coninutul
unei anse de suspensie BHI. Se incubeaz tuburile cu bulion BHI i mediul
TSA nsmnat, 18-24 de ore la 35C. Se menin culturile la temperatura
camerei pentru folosirea unor teste auxiliare n cazul n care rezultatele sunt
ndoielnice. Se adaug la cultura de BHI 0,5 ml de plasm citratat de om sau
de iepure, (integral sau diluat 1/5), cu EDTA i amestec bine. Eprubetele
se incubeaz la 35C (ntr-o baie de ap sau ntr-o etuv), timp de 18-24 de
ore i se examineaz din or n or timp de 6 ore pentru coagulare. Testul
se consider pozitiv numai n cazul n care se formeaz un coagul ferm i
complet care rmne pe loc cnd tubul este inversat. Coagularea parial
(reaciile 2+ i 3+) trebuie testat n continuare. Concomitent cu culturile
suspecte se testeaz i culturile cunoscute ca pozitive i negative.
Formarea de coagul n eprubetele nsmnate cu coloniile de verifcare
i n cea cu tulpina de referin i lipsa de coagul n eprubeta martor negativ,
se consider reacie pozitiv.
Se efectueaz coloraia Gram a tuturor culturilor suspecte i se
examineaz microscopic.
Teste auxiliare
1. Testul catalazei
Catalaza este o hemoprotein care descompune peroxidul de hidrogen
n ap i oxigen. Bacteriile care o produc se protejeaz astfel de efectele
letale ale peroxidului de hidrogen aprut ca metabolit fnal n metabolismul
67
aerob al carbohidrailor.
Se poate realiza n mediul lichid sau pe mediu solid.
- testul n bulion nutritiv: se adaug la cultura de 18-24 de ore, n
bulion 1 ml soluie 3% H
2
O
2
.
- testul pe agar nutritiv: se ntinde 1 ml soluie H
2
O
2
3% peste cultura
de 18-24 de ore a organismului testat cu tubul nclinat n mod adecvat.
Rezultatul reaciei:
Se observ imediat i dup 5 minute apariia bulelor de gaz. Viteza
descompunerii H
2
O
2
crete o dat cu temperatura. Reaciile fals pozitive pot
f datorate oxigenului dizolvat n reactiv. Inconvenientul poate f evitat dac
se agit reactivul cu pipeta nainte de utilizare.
2. Utilizarea anaerob a glucozei
Se nsmneaz masiv fecare tub cu mediu de fermentaie a
carbohidrailor ce conine glucoz 0,5%. Ca indicator se folosete albastrul
de bromtimol. Se acoper suprafaa mediului cu un strat de 25 mm de ulei
de parafn. Se incubeaz 5 zile la 37C.
Rezultatul reaciei:
Testul este pozitiv dac indicatorul i modifc culoarea n galben i
negativ dac mediul rmne albastru.
3. Utilizarea anaerob a manitolului
Se repet procedura de mai sus folosind ca hidrat de carbon manitolul.
90% dintre tulpinile de Stp. aureus sunt pozitive la acest test. Concomitent
se folosesc martori pozitivi i negativi.
4. Sensibilitatea la lizostafn
Se transfer cu ansa de nsmnare o colonie izolat din placa cu agar
ntr-un ml de fosfat tampon salin i se omogenizeaz bine. Se adaug 25
nanograme/ml de lizostafn. Se incubeaz la 35C, maxim 2 ore, dac are
loc limpezirea mediului testul este considerat pozitiv. Majoritatea tulpinilor
de Stp. aureus sunt pozitive la acest test.
68
5. Producerea nucleazei termostabile
Reprezint o modalitate indirect de difereniere a multiplicrii speciei
Stp. aureus n prelevat, la un nivel de peste 10
6
germeni per gram de aliment.
Aceast reacie poate f considerat un test de confrmare n special pentru
reaciile de coagulaz 2+.
Tehnica de lucru:
Se prepar microlame pe care se toarn agar cu acid deoxiribonucleic
i albastru de toluidin, n grosime de aproximativ 3 mm. Dup solidifcarea
agarului se fac 10-12 godeuri (scobituri), cu diametrul de 2 mm, cu ajutorul
unui dispozitiv special, ndeprtnd prin aspiraie dopul de agar. Se adaug
pe lama astfel preparat aproximativ 0,01 ml de prob nclzit (15 minute
ntr-o baie marin ferbinte) din culturile n bulion folosite pentru testul
coagulazei. Lamele se incubeaz n camere umede 4 ore la 35C.
Rezultatul reaciei:
Reacia pozitiv este semnalat de dezvoltarea unui halou roz-deschis,
care se extinde la cel puin 1 mm de la periferia godeului.
Determinarea numrului cel mai probabil de germeni
Tehnica de lucru:
Se inoculeaz 3 tuburi cu bulion tripticaz soia, ce conine 10% clorur
de sodiu i 1% piruvat de sodiu, cu cantiti de 1 ml, de diluii zecimale din
fecare prob. Diluia maxim trebuie s fe negativ. Tuburile nsmnate
se incubeaz 48 de ore la 35C. Se transfer coninutul unei anse din fecare
tub ce prezint turbiditate pe mediul Bayrd-Parker, care trebuie s aib
suprafaa foarte bine uscat.
Plcile se incubeaz 48 de ore la 35C.
Din fecare plac se recolteaz una sau mai multe colonii suspecte, se
continu procedura pentru identifcare i confrmarea lui Stp. aureus, ca mai
sus.
Stabilirea numrului cel mai probabil de staflococi se face n
concordan cu tabelul Mac Crady, n funcie de numrul de eprubete i
diluii confrmate ce conin staflococi coagulaz pozitivi.
69
METODA DE NUMRARE DIRECT N PLCI PETRI
A STAFILOCOCILOR AURII
450 ml tampon fosfat Butterfield
50 g aliment; se amestec la 10.000-
12.000 rpmpt 2 min.
5. Selectarea plcilor ce conin ntre 20-200 de colonii.
6. Numrarea coloniilor din fiecare tip morfologic suspicionate de a fi Stp. aureus; se testeaz > de o
colonie din fiecare tip pentru coagulaz; se adaug un numr de colonii pe un set de 3 plci Petri ce
dau testul coagulazei pozitiv i se multiplic factorul de diluie; aceast valoare se exprim ca fiind
numrul de celule de Stp. aureus per gram
1. Omogenizare
2. Diluarea
omogenatului de prob
alimentar
3. Pipetarea
de 0,4; 0,3; 0,3 n plci
separate de agar Baird-
Parker
4. Incubarea
la 35C, 45-48 de ore
Diluii seriate
n 90 ml
tampon fosfat
1: 10
10 ml 10 ml 10 ml
1: 100 1: 1000
METODA DE NUMRARE DIRECT N PLCI PETRI
A STAFILOCOCILOR AURII
450 ml tampon fosfat Butterfield
50 g aliment; se amestec la 10.000-
12.000 rpmpt 2 min.
5. Selectarea plcilor ce conin ntre 20-200 de colonii.
6. Numrarea coloniilor din fiecare tip morfologic suspicionate de a fi Stp. aureus; se testeaz > de o
colonie din fiecare tip pentru coagulaz; se adaug un numr de colonii pe un set de 3 plci Petri ce
dau testul coagulazei pozitiv i se multiplic factorul de diluie; aceast valoare se exprim ca fiind
numrul de celule de Stp. aureus per gram
1. Omogenizare
2. Diluarea
omogenatului de prob
alimentar
3. Pipetarea
de 0,4; 0,3; 0,3 n plci
separate de agar Baird-
Parker
4. Incubarea
la 35C, 45-48 de ore
Diluii seriate
n 90 ml
tampon fosfat
1: 10
10 ml 10 ml 10 ml
1: 100 1: 1000
70
Teste biochimice de confrmare pentru Stp. aureus, Stp. epidermidis
i micrococi
Test
biochimic
Stp. aureus Stp. epidermidis Micrococi
Catalaz + + +
Coagulaz + - -
Termonucleaz + - -
Lizostafn + + -
Utilizarea
anaerob a:
glucozei
manitolului
+
+
+
-
-
-
71

Stip. aureus. Frotiu efectuat din cultur de pe
mediul solid. Coloraia Gram. Se observ gru-
parea staflo (grmezi cu aspect de ciorchine
de strugure) a cocilor (Pietzckel T.)

Agar Columbia. Stp. aureus. Mediu nu-
tritiv de baz mai complet dect agarul
nutritiv simplu, devine un excelent me-
diu selectiv cnd este adiionat i cu
substane inhibitorii; conine trei tipuri
de peptone, produse prin digestie i prin
infuzie, amidon clorur de sodiu i agar

Mediul MSA (Mannitol salt agar)
Staphylococcus aureus - fermentarea manitolu-
lui (ingalbenirea mediului);
Serratia marcescens - nu s-a dezvoltat datorita
continutului mare de sare al mediului

Mediul MSA (Mannitol salt agar)
Streptococcus agalactiae - nu s-a dezvol-
tat datorita continutului mare de sare al
mediului);
Staphylococcus epidermidis - s-a dezvol-
tat dar nu a fermentat manitolul
72
Bibliografe
Adcock PM, Pastor P, Medley F, Patterson JE, Murphy TV. Methicillin-resistant 1.
Staphylococcus aureus in two child care centers. J Infect Dis. 1998;178(2): 577-
580.
Bagger JP, Zindrou D, Taylor KM. Postoperative infection with methicillin-re- 2.
sistant Staphylococcus au-reus and socioeconomic background. Lancet. 2004;
363(9410):706-708.
Baggett HC, Hennessy TW, Rudolph K, et al. Community-onset methicillin-re- 3.
sistant Staphylococcus au-reus associated with antibiotic use and the cytotoxin
Panton-Valentine leukocidin during a furunculosis outbreak in rural Alaska. J In-
fect Dis. 2004;189(9):15651573.
Begier EM, Frenette K, Barrett NL, et al. A high-morbidity outbreak of methicillin- 4.
resistant Staphylococcus aureus among players on a college football team, facili-
tated by cosmetic body shaving and turf burns. Clin Infect Dis. 2004;39(10):1446-
1453.
Boyce JM. Methicillin-resistant 5. Staphylococcus au-reus in hospitals and long-term
care facilities: microbiology, epidemiology, and preventive measures. Infect Con-
trol Hosp Epidemiol. 1992;13(12):725-737.
Centers for Disease Control and Prevention. Active Bacterial Core Surveillance: 6.
methodologycase defnition and ascertainment. http://www.cdc.gov /ncidod/
dbmd/abcs/meth-case.htm. Accessibility verifed September 21, 2007.
7. Centers for Disease Control and Prevention. Four pediatric deaths from commu-
nity-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureusMinnesota and North
Dakota, 1997-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1999;48(32):707-710. http://
www.cdc.gov/mmwr /preview/mmwrhtml/mm4832a2.htm. Accessibility verifed
September 25, 2007.
Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant 8. Staphylococ-
cus aureus infections among competitive sports participantsColorado, Indiana,
Pennsylvania, and Los Angeles County, 2000-2003. MMWR Morb Mortal Wkly
Rep. 2003;52(33):793
Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant 9. Staphylococcus
aureus infections in correctional facilitiesGeorgia, California, and Texas, 2001-
2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2003; 52(41):992-996.
Centers for Disease Control and Prevention. Outbreaks of community-associated 10.
methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin infectionsLos Angeles County,
California, 2002-2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2003;52(5):88.
Centers for Disease Control and Prevention. Progress toward elimination of 11. Hae-
mophilus infuenzae type b invasive disease among infants and children, United
73
States, 19982000. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2002;51(11):234-237.
Cosgrove SE, Qi Y, Kaye KS, Harbarth S, Karchmer AW, Carmeli Y. The impact of 12.
methicillin resistance in Staphylococcus aureus bacteremia on patient outcomes:
mortality, length of stay, and hospital charges. Infect Control Hosp Epidemiol.
2005;26 (2):166-174.
Cosgrove SE, Sakoulas G, Perencevich EN, Schwaber MJ, Karchemer AW, Car- 13.
meli Y. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methi-
cillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect
Dis. 2003;36(1):53-59.
Engemann JJ, Carmeli Y, Cosgrove SE, et al. Adverse clinical and economic out- 14.
comes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus
aureus surgical site infection. Clin Infect Dis. 2003;36(5):592-598.
Francis JS, Doherty MC, Lopatin U, et al. Severe community-onset pneumonia in 15.
healthy adults caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the
Panton-Valentine leukocidin genes. Clin Infect Dis. 2005;40(1):100-107.
Fridkin SK, Hageman JC, Morrison M, et al. Methicillin-resistant 16. Staphylococcus
aureus disease in three communities. N Engl J Med. 2005;352(14):14361444.
Hidron AI, Kourbatova EV, Halvosa JS, et al. Risk factors for colonization with 17.
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in patients admitted to an
urban hospital: emergence of community-associated MRSA nasal carriage. Clin
Infect Dis. 2005;41(2):159-166.
Kaplan SL, Hulten KG, Gonzalez BE, et al. Three-year surveillance of com- 18.
munity-acquired Staphylococcus aureus infections in children. Clin Infect Dis.
2005;40(12):1785-1791.
Klevens RM, Edwards JR, Richards CL, et al. Estimating healthcare-associated in- 19.
fections and deaths in U.S. hospitals, 2002. Public Health Rep. 2007; 122(2):160-
166.
Klevens RM, Edwards JR, Tenover FC, McDonald LC, Horan T, Gaynes R. Chang- 20.
es in the epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in intensive
care units in U.S. hospitals, 1992-2003. Clin Infect Dis. 2006;42(3):389-391.
Klevens RM, Morrison MA, Fridkin SK, et al. Spread of community-associated 21.
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains in healthcare settings
Emerg Infect Dis. 2006;12(12):1991-1993.
Kuehnert MJ, Hill HA, Kupronis BA, Tokars JI, Solomon SL, Jernigan DB. Me- 22.
thicillin-resistant Staphylococcus aureus hospitalizations, United States. Emerg
Infect Dis. 2005;11(6):868-872.
Kyaw MH, Rose CE Jr, Fry AM, et al; Active Bacterial Core Surveillance Pro- 23.
gram of the Emerging INfections Program Network. The infuence of chronic ill-
nesses on the incidence of invasive pneumococcal disease in adults. J Infect Dis.
2005;192(3):377-386.
74
Laupland KB, Church DL, Mucenski M, Sutherland LR, Davies HD. Population- 24.
based study of the epidemiology of and the risk factors for invasive Staphylococ-
cus aureus infections. J Infect Dis. 2003;187 (9):1452-1459.
Lina G, Pie dmont Y, Godal-Gamot F, et al. Involvement of Panton-Valentine 25.
Leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneu-
monia. Clin Infect Dis. 1999;29 (5):1128-1132.
Ma XX, Ito T, Tiensasitorn C, et al. Novel type of staphylococcal cassette chromo- 26.
some mec identifed in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strains. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46(4):1147-1152.
McDougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, McAllister SK, Tenover 27.
FC. Pulsed-feld gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus
aureus isolates from the United States: establishing a national database. J Clin
Microbiol. 2003; 41(11):5113-5120.
McDougal LK, Wenming Z, Patel JB, Tenover FC. Characterization of two new 28.
community-associated oxacillin-resistant Staphylococcus aureus pulsed-feld
types consisting of U.S. isolates that carry SCCmecIV and the Panton-Valentine
leukocidin gene [abstract]. Presented at: American Society for Microbiology 104th
General Meeting; May 23-27, 2004; New Orleans, LA.
Mokdad AH, Ford ES, Bowman BA, et al. Prevalence of obesity, diabetes, and 29.
obesity-related health risk factors, 2001. JAMA. 2003;289(1):76-79.
Moran GJ, Krishnadasan A, Gorwitz RJ, et al. Methicillin-resistant 30. S. aureus
infections among patients in the emergency department. N Engl J Med. 2006;
355(7):666-674.
Morin CA, Hadler JL. Population-based incidence and characteristics of communi- 31.
ty-onset Staphylococcus aureus infections with bacteremia in 4 metropolitan Con-
necticut areas, 1998. J Infect Dis. 2001; 184(8):1029-1034.
Muto CA, Jernigan JA, Ostrowsky BE, et al; SHEA. SHEA guideline for prevent- 32.
ing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus au-
reus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003;24(5):362-386.
Naimi TS, LeDell KH, Como-Sabetti KM, et al. Comparison of community-and 33.
health care associated methicillin-resistant Staphylococcus au-reus infection.
JAMA. 2003;290(22):2976-2984.
Rosenstein NEPB, Stephens DS, Popovic T, Hughes JM. Meningococcal disease. 34.
N Engl J Med. 2001; 344(18):1378-1388.
Saravolatz LD, Markowitz N, Arking L, Pohlod D, Fisher E. Methicillin-resistant 35.
Staphylococcus aureus: epidemiologic observations during a community-acquired
outbreak. Ann Intern Med. 1982;96(1): 11-16.
Schramm GE, Johnson JA, Doherty JA, Micek ST, Kollef MH. Increasing inci- 36.
dence of sterile-site infections due to non-multidrug-resistant, oxacillin-resistant
Staphylococcus aureus among hospitalized patients. Infect Control Hosp Epide-
75
miol. 2007;28 (1):95-97.
Schuchat A, Robinson K, Wenger JD, et al. Bacterial meningitis in the United 37.
States in 1995. N Engl J Med. 1997;337(14):970-976.
Seybold U, Kourbatova EV, Johnson JG, et al. Emergence of community-associat- 38.
ed methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 genotype as a major cause
of health care-associated blood stream infections. Clin Infect Dis. 2006;42(5):647-
656.
Siegel JD, Jackson M, Chiarello L; Healthcare Infection Control Practices Ad- 39.
visory Committee. Management of multidrug-resistant organisms in health-care
settings, 2006. 2006. http://www.cdc.gov/ncidod /dhqp/index.html. Accessed June
29, 2007.
Simona Ivana, 40. 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 41. Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 42. Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n
micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-
5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 43. Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
Simona Ivana, 2007 44. Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
Simona Ivana, 2007 45. Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
Simona Ivana, 46. 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973-
736-090-8
Simona Ivana, 47. 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
Sunenshine RH, Liedtke LA, Fridkin SK, Strausbaugh LJ; Infectious Diseases So- 48.
ciety of America Emerging Infections Network. Management of inpatients colo-
nized or infected with antimicrobial-resistant bacteria in hospitals in the United
States. Infect Control Hosp Epidemiol. 2005;26(2):138-143.
Tenover FC, McDougal LK, Goering RV, et al. Characterization of a strain of com- 49.
munity-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus widely disseminat-
ed in the United States. J Clin Microbiol. 2006; 44(1):108-118.
Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing prevalence of multidrug- 50.
resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med. 2000;
343(26):1917-1924.
Whitney CG, Farley MM, Schaffner W, et al. Effectiveness of seven-valent pneu- 51.
mococcal conjugate vaccine against invasive pneumococcal disease: a matched
76
case-control study. Lancet. 2006;368(9546): 1495-1502.
Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. 52.
Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from
a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 2004;39(3):309-317.
Wootton SH, RNAold K, Hill HA, et al. Intervention to reduce the incidence of 53.
methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin infections in a correctional facil-
ity in Georgia. Infect Control Hosp Epidemiol. 2004;25(5):402-407.
Zetola N, Francis JS, Nuermberger EL, Bishai WR. Community-acquired meticil- 54.
lin-resistant Staphylococcus aureus: an emerging threat. Lancet Infect Dis. 2005;
5(5):275-286.
Zinderman CE, Conner B, Malakooti MA, LaMar JE, Armstrong A, Bohnker BK. 55.
Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus among military
recruits. Emerg Infect Dis. 2004;10(5):941-944.
77
CAPITOLUL 3
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE
BACTERII DIN GENUL BACILLUS
3.1. Bacillus anthracis
3.1.1. Taxonomie
Ordinul Bacillales cuprinde 10 familii (care au fost enumerate la
familia Staphylococcaceae) (dup J.P. Euzby, 2006)
Familia Bacillaceae cuprinde bacterii Gram pozitive, formatoare de
endospori. Sporii rezist ani de zile la adpost de lumin solar i usc-
ciune, find foarte rspndii n sol i n locuri cu praf i ntuneric, de unde
i denumirea lor de bacterii telurice.
Denumirea genului Bacillus a fost introdus n nomenclatura
bacteriilor de ctre Ferdinand Cohn, n 1876, prin schimbarea numelui
Vibrio subtilis, creat anterior de Ehrenberg, n Bacillus subtilis.
Sunt germeni aerobi sau facultativ anaerobi, oxidazo-pozitivi i,
majoritatea, catalazo-pozitivi.
Genul Bacillus cuprinde 189 de specii bacteriene (J.P. Euzeby, 2006),
majoritatea saprofte i nepatogene putnd f psihrofle, mezofle sau
termofle, alcalofle sau acidofle, halotolerante sau halofle.
Cresc bine pe medii simple de cultur. Majoritatea speciilor se gsesc
n mediul extern i colon, de unde ajung frecvent la nivelul mucoaselor,
find nepatogene sau ocazional patogene.
Bacillus anthracis este singura specie nalt patogen, epizootogen,
find transmis accidental omului.
78
Tabelul 3.1
Bacili
Gram
pozitivi
sporogeni
Tip respirator Familia Genul Specii Tipul
Aerobi Bacillaceae Bacillus
B. anthracis Sp. cu patog.ridic.
B. cereus
B. subtilis
Sp. ocazional patog.
A
n
a
e
r
o
b
i
C
l
o
s
t
r
i
d
i
a
c
e
a
e
C
l
o
s
t
r
i
d
i
u
m
C. tetani
C. botulinum
Sp toxigene
C. chauvoei
C. septicum
C. perfringens
C. novyi
Sp. toxig. i virul.
C. colinum
C. piliforme
C. sordellii
C. diffcile
C. villosum
C. baratii
Sp. ocaz. patogene
3.1.2. Istoric
Nume comun: bacilul antraxului, agentul crbunelui, bacteridia
crbunoas
Studiul crbunelui, nume dat de Hippocrat, a preocupat muli medici
din cele mai vechi timpuri, datorit ravagiilor pe care aceast boal le
fcea printre erbivorele domestice. Un cadavru de animal mort de infecie
crbunoas, odat deschis, contamineaz solul i vegetalele cu miliarde de
bacili care, la aer se transform n spori, viabili zeci de ani. Erau vestite
cmpiile blestemate, pe care orice turm sau ciread erau rapid decimate,
contaminnd, i mai intens, solul respectiv. Izolarea bacteriei s-a realizat
concomitent n trei ri diferite, de ctre Rayer i Davaine n Frana,
Pollender n Germania i Branell n Rusia, n perioada 1849-1850. Robert
Koch a studiat procesul de sporogenez, iar Pasteur a preparat primul vaccin
anticrbunos prin cultivare la 42-45C.
La 21 mai 1881 a avut loc celebra experien public de la Pouilly-
Le-Fort, cnd Pasteur i colaboratorii au vaccinat 24 de oi, o capr i 6 vaci,
animale care au supravieuit infeciei de prob cu bacteria virulent, n timp
ce acelai numr de martori nevaccinai au fcut infecia mortal.
n 1882, encovski prepar primul vaccin sporulat din lume, din
germeni atenuai prin cldur.
79
Un moment important l-au reprezentat cercetrile efectuate n ara
noastr de ctre profesorul Stamatin (1936) i n Africa de Sud de Sterne
(1937), care au obinut (pe medii cu snge i respectiv, n atmosfer de dioxid
de carbon) primele tulpini de B. anthracis acapsulogene, dar sporogene
i imunogene, din care au putut f preparate cele mai efciente vaccinuri
anticrbunoase cunoscute pn n prezent.
Datorit msurilor de proflaxie specifc i nespecifc, crbunele
apare rar la animale i foarte rar la om, mai ales la muncitori ca boal
profesional (prelucrarea pieilor, blnurilor, a lnii)
3.1.3. Morfologie
B. anthracis este un bacil mare (4-8/1,2), drept, cu capetele retezate,
imobil, Gram pozitiv. Se grupeaz, de obicei, sub form de streptobacili. n
frotiurile efectuate din culturi din medii lichide se ntlnesc flamente, iar n
cele efectuate de pe medii solide apar dispui n lanuri lungi, necapsulogeni
(formeaz capsul numai n medii cu ser, bicarbonatate, incubate n atmosfer
cu dioxid de carbon).
n frotiurile efectuate din produse patologice se grupeaz n lanuri
scurte (D. Buiuc) i sunt capsulai, nesporulai. Formeaz o capsul mare
care nconjoar continuu toi bacilii dintr-un lan (D. Buiuc) i se coloreaz
metacromatic n roz cu albastru de metilen policrom. Se mai poate evidenia
prin colorare negativ cu tu de China, coloraia Riss (corpul bacterian rou,
capsula roz), coloraia Giemsa (corpul bacterian violet-nchis, capsula roz).
Grosimea capsulei este n general de 0,2-1, iar n culturile vechi grosimea
acesteia descrete.
Dup Manicev, capsula are o structur trilamelar format din:
stratul extern, ce conine antigene capsulare peptidice;
stratul mijlociu, conine antigene proteice i polizaharidice;
stratul intern, cu antigene mucopolizaharidice.
Variantele acapsulogene provoac edeme mari locale, favoriznd
mobilizarea mijloacelor de aprare ale organismului.
Tulpinile avirulente sunt acapsulogene.
Bacilul antraxului este sporogen, sporulnd numai n contact cu
oxigenul atmosferic nu i n organism. Sporul are form oval, find situat
central i nu deformeaz celula vegetativ.
Sporularea este favorizat de adugarea n mediile de cultur a unor
substane, cum ar f cazeina, zeama de lmie sau de roii, acidul ascorbic
80
precum i prezena ionilor de sodiu, litiu, potasiu i respectiv, absena ionilor
de mangan. Este inhibat de D-alanin.
Bacilul antraxului se dezvolt bine pe medii simple de cultur. Este
facultativ anaerob, condiiile de aerobioz, find optime n limite largi de
temperatur (15-43C), temperatura optim find de 35C, iar pH-ul de 7,2-
7,4.
3.1.4.1. Aspecte culturale
n bulion, coloana de mediu este, de obicei, limpede, dar prezint un
depozit caracteristic cu aspect foconos (granular) mrimea lui find direct
proporional cu lungimea lanurilor de bacili. Dup agitare, depozitul se
desprinde de fundul eprubetei i se omogenizeaz n mediul de cultur cu
aspect caracteristic de fulgi de zpad (focoane de vat).
Pe suprafaa agarului B. anthracis formeaz colonii mari, de 3-6 mm
diametru, neuniforme, neregulate, opace, nepigmentate (albe-cenuii),
turtite, mate, rugoase (de tip R), cu aspect de sticl pisat, nehemolitice sau
slab hemolitice. Deseori, marginile coloniei sunt dantelate, cap de meduz
(D. Buiuc) prezentnd expansiuni vizibile macroscopic, numite cornioane;
examinate la microscop cu obiectiv mic sau cu lupa, apar nconjurate de
prelungiri laterale, ondulate, ca uviele de pr. La o mrire a grosismentului
se observ c aceste prelungiri sunt formate din lanuri de bacili.
La tulpinile recent izolate, dup 2-3 zile, n centrul coloniei primare se
dezvolt o proeminen central n form de buton, numit colonie fic
sau secundar. n culturile atenuate la 42,5C, pe lng coloniile obinuite
de tip R, pot aprea i colonii de tip S i chiar de tip M.
Coloniile formate de B. anthracis se caracterizeaz prin tenacitate,
deoarece dac ridicm uor marginea coloniei cu acul de nsmnare,
aceasta rmne erect, ca i albuul de ou, btut spum.
Tulpinile capsulate de B. anthracis, dac sunt cultivate pe agar nutritiv
cu ser sau 5-7% bicarbonat de sodiu, n borcane cu lumnare, formeaz
colonii mucoide, rotunde, convexe.
nsmnat n profunzimea mediilor semisolide cu un ac drept de
nsmnare, prin nepare, germenul formeaz o cultur mai dezvoltat
spre suprafaa mediului i mai srac n profunzime, find asemntoare cu
un brad rsturnat. Rezistena bacteriei n culturile bacteriene este foarte
lung (mai muli ani) datorit sporilor.
81
Pe cartof glicerinat, Bacillus anthracis, crete rapid i abundent,
formnd un strat alb-cenuiu, cu luciu mat, ce conine bastonae bogat
sporulate. Laptele este coagulat, iar cazeina se peptonizeaz. Acest mediu
dup incubare cteva zile la 37C, devine mai limpede i se coloreaz
glbui; cu timpul se separ n dou straturi, unul superior constituit din
grsimi, altul inferior din zer. Dup 6 luni, la 37C, mediul devine brun, iar
densitatea lui se reduce. Conine cantiti apreciabile de amoniac.
Pe serul coagulat, bacilii viruleni sunt capsulai dnd natere unor
colonii bombate, lucioase, iar cei neviruleni nu capsuleaz formnd colonii
plane i aspre.
n mediile sintetice, tiamina reprezint un factor de cretere esenial.
Pe mediul selectiv PLET (Polimixin, Lizozim, EDTA) bacilul antraxului
formeaz n 24 de ore nite colonii mici, n timp ce B. cereus nu se dezvolt pe
acest mediu, constituind un criteriu de difereniere ntre cei doi germeni.
Nu prezint interes pentru identifcare. Activitatea glucidolitic i
proteolitic sunt reduse. Fermenteaz glucoza, fructoza, zaharoza, maltoza.
Hidrolizeaz amidonul. Produce catalaz. Reacia indolului, ureazei i
hidrogenului sulfurat sunt negative. Activitatea hemolitic este slab sau
absent. Reduce albastrul de metilen i nitraii n nitrii. Reacia Voges
Proskauer este pozitiv.
B. anthracis este adesea inclus n grupul B. cereus, format din B.
cereus, B. anthracis, B. thuringiensis i B. mycoides. Bacilul antraxului se
difereniaz de B. cereus prin faptul c este imobil, nu produce hemoliz pe
agarul cu snge, este sensibil la penicilin i la fagul g. Poate f difereniat
prin tehnicile genetice actuale de ceilali membrii ai grupului B. cereus.
3.1.6. Proprieti antigenice
La B. anthracis au fost identifcate trei tipuri de antigene:
antigene capsulare, reprezentate de polipeptida din care este
format capsula;
antigene somatice de natur polizaharidic, care intervin sub
form de precipitinogen n reacia Ascoli-Valenti.
fraciunea a doua a toxinei de natur proteic corespunznd
antigenului lui Gladstone, responsabil de proprietile imunogene ale
vaccinurilor.
82
3.1.7. Ecologie
Bacilul antraxului se gsete n sol, sub form sporulat, find n
corelaie direct cu urmtorii factori de mediu: reacia alcalin sau neutr,
temperatura de 21-27C, umiditatea de 60% (Davies, 1960). De aceea,
incidena antraxului scade progresiv cu creterea latitudinii. La aceeai
latitudine, distribuia sporilor n sol este inegal, ceea ce determin caracterul
zonal al mbolnvirilor. Frecvena mai mare a cazurilor este n perioada
punatului. Insectele pot f vectori ai germenului, n zonele cu clim cald
i umed.
3.1.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu
Bacilul antraxului este patogen obligatoriu, existena sa depinznd de
faza de multiplicare ntr-un animal gazd. De aceea, dezvoltarea microciclic
n mediu, este extrem de rar.
Forma vegetativ este surprinztor de fragil, n timp ce sporul poate
supravieui decenii (timpul ntre infectarea gazdelor receptive poate f, de
asemenea, de ani sau decenii).
Formele vegetative sunt distruse n 30 de minute la 60C. Sporii mor
n 10 minute la ferbere, n 3 ore la 140C cldur uscat, n 60 de minute
n ap oxigenat 3%, n 15 minute n clorur de var 5%, formol 10%, sod
caustic 2-5%. Antibioticele cele mai active sunt penicilina, eritromicina,
teramicina, tetraciclinele, i cloramfenicolul. Fa de streptomicin,
majoritatea tulpinilor dau mutante rezistente. n prezena penicilinei, bacilii
se transform n forme sferoidale mari, care n lan dau aspectul unui irag
de perle (Perlschnurtest).
Din sol se izoleaz cu uurin bacteriofagi activi fa de Bacillus
anthracis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides (fagi CAM).
Bacillus anthracis acioneaz prin virulen i toxicitate. Virulena este
dat de capsul i de toxina produs n timpul fazei de cretere exponenial.
Capsula reprezint un important factor antifagocitar care asigur nmulirea
excesiv a bacteriei n organismul infectat, find compus din polimeri
ai acidului D-glutamic, dar poate conine i polizaharide. Sinteza ei este
mediat de poliamide i stimulat de albumina seric bovin.
Virulena este asigurat i prin intermediul unor enzime ca: lecitinaza,
proteaza i colagenaza.
83
Rezistena mai mare la infecie a unor specii cum sunt cinele, porcul
i obolanul, se datoreaz unei enzime, gamma-glutamilaz, capabil s
degradeze capsula.
Toxina este format din trei proteine sinergice, dar separabile, produse
n faza logaritmic a creterii i denumite antigen protector (AP), factor
letal (FL) i factor edematogen (FE).
Administrarea intravenoas simultan a AP i a FL este letal pentru
oareci i obolani, n timp ce infectarea intradermic concomitent de AP
i de FE induce edem localizat la cobai sau iepuri.
Pe baza acestor considerente unii autori sunt de prere c AP+FL
reprezint toxina letal, iar AP+FE toxina edematogen ns n mod natural
cele trei fraciuni sunt produse ntotdeauna simultan.
FE este o metaloproteaz calciu i zinc dependent ce are capacitatea
de a produce modifcri ale metabolismului apei i ionilor, aprnd astfel
edemul caracteristic n antrax. Rolul FE n infecie pare a f acela de prevenire
a fagocitozei bacteriilor (PCB Turnbull, 2005).
Cauza major a decesului se pare c ar f complexul FL+AP, care este
responsabil de producerea majoritii leziunilor tisulare.
Genele celor trei toxine (paf, leg, cya) sunt localizate ntr-o plasmid
de 119 Mda, find coordonate de cerinele de bicarbonat i temperatur.
Genele factorilor de virulen se af n dou plasmide mari. Genele
celor trei toxine, sunt localizate n plasmida pX 01, iar cele implicate n
sinteza capsulei, n plasmida pX 02.
Pierderea uneia dintre cele dou plasmide (care implic pierderea
capacitii de a produce toxine sau capsul) induce pierderea virulenei.
Tulpinile pX 01 i pX 02 stau la baza vaccinurilor contra antraxului.
Infecia natural se numete antrax, febris carbunculosa, charbon
bacteridien.
Antraxul este o infecie prin excelen septicemic, germenii
multiplicndu-se n snge, prin care sunt vehiculai n toate organele.
Evolueaz clinic cu febr, tulburri generale, circulatorii, respiratorii i
digestive. Morfopatologic se caracterizeaz prin edeme serohemoragice
n esutul conjunctiv subcutanat, hemoragii subseroase, aspectul asfxic al
sngelui, hipertrofa i ramolismentul pulpei splenice.
Este cunoscut i sub denumirea de dalac, bub neagr, crbune sau
pustul malign.
Poarta de intrare o constituie mucoasa bucofaringian lezat.
84
Contaminarea la erbivore (ovine, bovine) este masiv, sporii ajungnd n
organism odat cu furajele. Ptrunderea bacteriei n organism este favorizat
de frecvena soluiilor de continuitate datorate tipului de alimentaie ceea ce
explic incidena cea mai mare a bolii la erbivore. Numrul mare al sporilor
de contaminare precum i rezistena bacteriei capsulate la fagocitoz este
urmat de nmulirea considerabil a germenului. Concomitent Bacillus
anthracis elaboreaz i toxine producnd o infecie septicemic cu toxiemie,
cu evoluie hiperacut i letalitate peste 80%. Cadavrele deschise permit
sporularea bacililor n contact cu aerul i rspndirea germenului n sol. O
pune astfel contaminat genereaz crbune i peste 30 de ani.
n solurile alcaline bogate n humus a fost dovedit supravieuirea
sporilor pn la 60 de ani, ceea ce i-a fcut pe cresctorii de animale din
unele pri s le denumeasc cmpii blestemate. Germenul are un spectru
foarte larg de patogenitate, cuprinznd toate mamiferele i, foarte rar psrile
datorit temperaturii corporale nefavorabile dezvoltrii acestei bacterii.
n timp ce erbivorele se infecteaz, de regul, pe cale digestiv,
porcinele i carnivorele se mbolnvesc prin consumul de carne infectat.
La ovine, infecia se realizeaz uor i pe cale respiratorie, inhalnd sporii
coninui n praful de pe terenurile contaminate. Este posibil i infecia
transcutanat la nivelul unor leziuni accidentale sau prin intermediul
insectelor hematofage. La om, infecia se realizeaz pe cale digestiv,
respiratorie sau transcutanat.
Crbunele digestiv apare prin consum de carne contaminat
evolund cu gastroenterit acut, sindrom holeriform, evoluie mortal n
1-2 zile.
Crbunele pulmonar , consecutiv inhalrii de spori, apare la
blnari, pielari find descrise mici explozii epidemice; se justifc vaccina-
rea la anumite grupe de risc. Infecia evolueaz ca o bronhopneumonie
hiperacut, aproape totdeauna mortal.
Crbunele cutanat sau pustula malign apare dup ptrunde-
rea sporilor prin soluiile de continuitate ale tegumentelor find, de obicei,
o boal profesional ntlnit la agricultori, mcelari, tbcari. Pe fondul
unui edem ntins, nedureros apare o vezicul, pustul, care se nconjoar
de o coroan de alte vezicule; centrul se necrozeaz i se formeaz escara
neagr; ganglionii regionali sunt infamai. Aceasta este forma cea mai
benign a infeciei crbunoase, uor recunoscut clinic i tratabil. Se mai
numete i bub neagr, carbuncul.
Situaia epidemiologic. n 2006, 29 de state UE i EEA/EFTA au
furnizat date ECDC-ului (Liechtenstein nu a raportat) asupra cazuisticii
antraxului la om, cu un total de 16 cazuri raportate i ase confrmate.
85
Cele mai multe cazuri au fost raportate de Spania dar numai dou au fost
confrmate i patru state (Bulgaria, Grecia, Romnia i Regatul Unit) au
raportat fecare cte un caz.
Distribuia pe grupe de vrst i sex.
Nu au fost identifcate diferene ale incidenei funcie de
sex (raportul brbat: femeie a fost de 1 la 1), cu raportarea tuturor
acestor cazuri la aduli, n principal la grupul de vrst 45-64 ani.
Sezonalitatea.
Majoritatea cazurilor au fost raportate n timpul lunilor de var, n iulie
(2 cazuri), august (1 caz) i septembrie (1 caz), iar celelalte cazuri au fost
raportate n ianuarie (date sezoniere au fost furnizate numai de Bulgaria,
Grecia, Spania i Regatul Unit).
Animalele de laborator sensibile sunt oarecele, cobaiul i iepurele.
Psrile pot f infectate prin procedeul clasic, imaginat de Pasteur, prin
meninere n condiii de temperatur sczut. Cile de inoculare sunt multiple:
intradermic, subcutan, intramuscular, intraperitoneal, intravenoas.
Dac se inoculeaz intradermic un singur spor dintr-o tulpin virulent, se
poate reproduce infecia la oarece, care este specia cea mai sensibil.
3.1.12. Diagnosticul la om
n antraxul cutanat, poarta de intrare o constituie o leziune a pielii.
Dup 3-5 zile apare o mic vezicul, iar n urmtoarele 2-3 zile centrul
veziculei se ulcereaz i se transform ntr-o crust foarte aderent, uscat
i neagr nconjurat de un inel de vezicule, care reprezint escara specifc
antraxului. Consecutiv leziunilor apare i edemul.
Diagnosticul antraxului cutanat se realizeaz prin efectuarea de frotiuri
colorate MFadyean i/sau prin cultura bacteriologic a probelor pretratate
de lichid vezicular, obinute de sub marginile escarei.
3.1.12.1. Diagnosticul diferenial
Se realizeaz n cazul furunculozei, ectimei contagioase, ancrului
siflitic primar, erizipelului, pestei, morvei i ulcerului tropical.
n formele pulmonare i intestinale, boala se manifest printr-o faz
supraacut cu febr uoar, indispoziie i gastroenterit cu durata de la o
zi la cteva zile. n faza acut apar simptome severe de febr alternant cu
86
hipotermie prostraie, oc, colaps i moarte n cteva ore.
n faza acut se poate recurge la efectuarea de frotiuri din snge sau
fecale colorate MFadyean.
Dup moarte metodele de diagnostic sunt aceleai ca i n cazul
animalelor. O complicaie grav i rar o reprezint meningita, care este
ntlnit cu o frecven mai mare n Tamil Nadu, India.
Antraxul uman se poate mpri n: antrax industrial i non-industrial,
n funcie de modul de contaminare care se poate realiza, fe direct de la
animale, fe indirect prin manipularea i prelucrarea produselor animale
contaminate.
Antraxul non-industrial este aproape ntotdeauna cutanat i afecteaz
de obicei oamenii care lucreaz cu animale, cum ar f fermieri, veterinari,
muncitori din abatoare.
rile care nregistreaz o cretere a incidenei sunt Africa sub
saharian, sub continentul indian i indonezian, anumite provincii din China,
pri din Turcia i diferite ri din fosta URSS (P.C.B. Turnbull, 2005).
Majoritatea proceselor industriale distrug sporii, astfel nct produsele
fnite apar libere de spori. Totui produsele reziduale obinute din etapele
iniiale de prelucrare (apa utilizat la splare) transport sporii de antrax n
mediu, iar acetia pot infecta animalele.
Dei este una dintre cele mai vechi boli, nu se cunoate nc n totalitate
modul n care animalul contracteaz boala sau factorii care infueneaz
acest lucru.
Studiul antraxului experimental se realizeaz de obicei prin
determinarea dozei letale 50%, parenterale sau prin aerosoli.
n cazul unor studii n care infecia s-a realizat pe cale oral, n furaje,
s-a stabilit c pentru iniierea infeciei clinice sunt necesare doze extrem de
mari (mult mai mari dect cele ntlnite n zonele endemice sau sporadice).
Transmiterea antraxului de la animal la animal este extrem de rar i
se pare c este mediat de nepturile unor insecte.
La oameni transmiterea de la individ la individ este foarte rar. Totui,
Heyworth n 1987, n cursul unei misiuni medicale n Zimbabwe, ar f
contractat boala n timp ce pansa leziunea unui bolnav.
Infecia uman se produce cel mai frecvent prin contact cu animalele
bolnave, find o boal profesional.
n unele ri, n transmiterea bolii la om pot f implicate unele
insecte.
Omul pare s fe relativ rezistent la aceast infecie. n anumite zone
din Africa sunt nregistrate rate sczute de infecie, dei rata expunerii este
nalt.
87
ntr-un studiu efectuat la maimuele Rhesus s-a nregistrat o doz
letal 50% parenteral de 3000 de spori. Dozele letale 50% administrate
prin inhalare la maimue au variat de la 4130 la 760.000 de spori (PCB
Turnbull). Totui oamenii par s fe mult mai rezisteni dect maimuele,
datorit faptului c doza poate depinde de greutatea corporal i pentru c
omul are inclus n alimentaie i carnea.
Riscul de mbolnvire poate f redus, printr-o igien industrial
adecvat n ceea ce privesc hainele de protecie, vaccinarea, ct i instituirea
prompt a tratamentului.
88
Bacillus anthracis -
Coloraia Gram, se remarc
prezena a numeroi
endospori n celule i
endospori liberi nconjurai
de un contur violet.

Testul
mobilitii.
Bacillus
anthracis -
dreapta
89
Coloraia Gram, se remarc flamente foarte lungi caracteristice.
Colonii de B. anthracis pe agar cu snge; se observ n centrul imaginii fenomenul de
tenacitate, care se traduce prin aspectul erect similar cu albuul de ou btut
90
3.2. Bacillus cereus

3.2.1. Introducere
Bacillus cereus este o bacterie anaerob, sporagen, prezent n sol,
praf i ap. A fost asociat cu toxiinfeciile alimentare n Europa nc din
1906. Printre primii cercettori care au raportat cu precizie toxiinfeciile
alimentare provocate de Bacillus cereus a fost Plazikowski. Descoperirile
sale au fost confrmate de ali cercettori europeni la nceputul anilor 1950.
Prima epidemie documentat n SUA a fost n 1969 i prima din Marea
Britanie n 1971. n produsele alimentare proaspete i procesate se gsesc
un numr mic de germeni. n carnea crud, produsele de carne i aditivii
alimentari, Bacillus cereus a fost gsit n 6,6% din 534, 18,3% din 820 i
respectiv 39,1% din 609 probe, cu nivele cuprinse ntre 10
2
- 10
4
germeni/
gram. Nu se tie dac vreunele din aceste tulpini au fost enterotoxigene.
Tulpinile enterotoxigene au fost obinute dintr-o varietate de alimente.
Din 83 de tulpini 85% au fost pozitive n laptele crud pentru toxina
diareic.
Pe lng Bacillus cereus, tulpinile de B. mycoides din lapte produc
enterotoxina diareic n 9 zile la temperaturi cuprinse ntre 6C i 21C.
Alte specii productoare de enterotoxine sunt: P. circulans, B. lentus, B.
thuringieusis, B. pumilus, P. polymyxa, B. caratarum i B pasterurii. B.
thuringieusis a fost izolat din alimente i aparent produce toxina activ
Vero.
Aceast bacterie prezint o dezvoltare minim la temperaturi cuprinse
ntre 4-5C, i maxim la 48-50C. Creterea a fost demonstrat i la valori
ale pH-ului peste 4,9-9,3.
Sporii si prezint o rezisten tipic la cldur pentru alte mezofle.
3.2.2. Patogenitate
Aceast bacterie produce o varietate larg de toxine i enzime
extracelulare, care includ lecitinaza, proteaza, beta-lactamaza,
sfngomielinaza, cereolizina (toxina letal pentru oarece, hemolizina 1) i
hemolizina BL.
Cereolizina este o toxin tiol activat analog perfngolizinei O. Are
o greutate molecular de 55 KDa i n mod aparent nu joac nici un rol n
sindroamele de gastroenterit alimentar.
Sindromul diareic pare s fe produs de un complex tripartit compus
91
din componentele B L (HBL). Acest complex produce hemoliz, citoliz,
dermonecroz, permeabilitate vascular i activitate enterotoxic.
Constituie 50% din toxicitatea retinal a supernatantului din cultura
de B. cereus n endoftalmie.
Cu toate c prezena enterotoxinei nu a fost demonstrat se pare c
HBL este responsabil de sindromul diareic.
Folosind un kit comercial pentru detectarea componentei L
2
s-a artat
c aceasta este produs n timpul fazei logaritmice.
Sunt necesare aproape 10
7
celule/ml pentru a demonstra activitatea
toxic i un pH cuprins ntre 6-8,5.
A fost demonstrat posibilitatea unor tulpini de a produce toxina la
temperaturi ntre 6-21C.
Testul PCR bazat pe gena HBL A (care codifc componenta B)
s-a dovedit mai util i mai rapid dect kiturile folosite pentru detectarea
enterotoxinei diareice.
Cu toate c sindromul diareic este produs n general de B. cereus i
complexul HBL, cel puin alte 14 specii din genurile Bacillus i Paenibacillus
sunt capabile s produc aceast toxiinfecie.
Pe baza analizei genetice s-a sugerat c B.cereus, B. thuringieusis i
B. anthracis s fe o singur specie, dar ultimele dou specii se pare c nu
produc complex toxic B. cereus.
Oricum B. anthracis este inclus n grupul B. cereus care cuprinde B.
mycoides, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis i B. thuringiensis.
Factorul de virulen al lui B. cereus este reprezentat de un complex
exterotoxic numit HBL. Acesta manifest hemoliz, dermonecroz i
proprieti de permeabilitate vascular.
3.2.3. Sindromul diareic
Simptomele apar n 12-13 ore, dureaz 6-12 ore i constau n grea,
dureri abdominale asemntoare crampelor i scaune apoase.
Febra este n general absent. De notat este similitudinea dintre acest
sindrom i toxiinfeciile alimentare produse de Clostridium perfringens.
Alimentele incriminate sunt cerealele care conin porumb sau amidon
de porumb, carne de pui, vegetale, carne tocat, crnai, lapte, carne gtit,
mncruri pe baz de orez indoneziene, budinci, supe etc. Epidemiile
raportate ntre 1950 i 1978 au fost rezumate de Gilbert, iar numrul de
germeni a variat ntre 10
5
-10
8
per gram.
Hauge ntr-o investigaie n primele epidemii a descoperit c alimentul
incriminat era sosul de vanilie. Numrul de germeni a fost de la 2,5x10
7
la
92
1x10
8
per gram.
Serovarurile din epidemiile diareice includ tipurile 1, 6, 8, 9, 10, 12.
Serovarurile 1, 8, 12 au fost incriminate i n sindromul emetic.
3.2.4. Sindromul emetic
Aceast form de toxiinfecie alimentar cu B. cereus este mai acut
i mai sever dect sindromul diareic.
Perioada de incubaie dureaz de la 1 la 6 ore, frecvent find cuprins
ntre 2 i 5 ore. S-a consemnat similitudinea cu sindromul toxiifeciilor
alimentare staflococice.
Este asociat cu mncrurile pe baz de orez fert sau prjit. Pe lng
acestea au mai fost incriminate crema pasteurizat, spaghetele, piureul i
legumele.
Au fost raportate epidemii n Marea Britanie, Canada, Australia,
Olanda, Finlanda, Japonia i SUA. Prima epidemie din SUA a fost raportat
n 1975, alimentul responsabil find carnea de pui.
Numrul de organisme necesare pentru a cauza acest sindrom pare s
fe mai mare dect cel ce cauzeaz sindromul diareic, i anume de 2 x 10
9

per gram
Serovarurile de B. cereus asociate cu sindromul emetic includ: 1, 3, 4,
5, 8,12, 19.
Toxina emetic este o cereulid, un peptid ionoforic, insolubil n ap,
foarte apropiat de valinomicin. Are o greutate molecular de 1,2 KDa.
Induce formarea de vacuole n celulele HEp-2, chiar prin nclzirea pn la
121C, timp de 30 de minute.
Hrciogul (Suncus murinus) reprezint un animal de experien foarte
bun.
Prin nsmnarea a trei tulpini de B. cereus ntr-un mediu triptic de
soia, s-a remarcat c la sfritul fazei logaritmice a avut loc producia de
cereulid iar toxicitatea a avut loc independent fa de sporulare. Tulpinile
au produs ntre 80-166 g de cereulid/ml la 21C n 1-3 zile n timpul fazei
staionare cnd numrul a ajuns de la 2x10
8
la 6x10
8
ufc/ ml. Producia la
8C i peste 40C a fost minim.
Tulpinile emetice se dezvolt ntre 15-50C, cu un optim ntre 35C
i 40C. Sindromul emetic este asociat cu mncrurile de orez. Dezvoltarea
tulpinilor ce secret toxina emetic n orez nu infueneaz dezvoltarea
altor tulpini de B. cereus, cu toate c formeaz populaii mari, cu germinare
extins.
93
3.2.5. Determinarea numrului cel mai probabil de germeni (most
probable number, MPN)
Din fecare diluie a probei alimentare se nsmneaz cte 1 ml n
trei eprubete per diluie, cu bulion triptic de soia; se incubeaz tuburile
48 de ore la 30C i se verifc pentru o cretere dens, tipic pentru B.
cereus; din tuburile n care se dezvolt colonii suspecte se fac pasaje n
plci Petri prin etalare pe suprafaa mediilor de izolare MYP (manitol cu
emulsie de glbenu de ou i polimixin B) (M78) i agar cu snge (M15)
i se incubeaz 24-48 de ore la 30C; din coloniile care au produs lecitinaz
se efectueaz subculturi pe agar snge pentru confrmarea lui B. cereus; se
calculeaz MPN de B. cereus per gram din fecare prob pe baza numrului
de tuburi pentru fecare diluie n care s-a confrmat prezena germenului.
Confrmarea lui B. cereus
Se verifc pe mediul MYP prezena lecitinazei i lipsa fermentrii
manitei; coloniile de B. cereus apar mari, de culoare roz nchis, pe fond
violaceu, find nconjurate de o zon de precipitare a glbenuului.
n cazul prezenei betahemolizei, pe mediul cu agar snge apar colonii
mari nconjurate de un halou evident de hemoliz, care nu se intensifc
dup depozitare la rece (specifc pentru B. cereus).
Pentru confrmarea lui B. cereus se aleg din fecare plac cu agar MYP,
5-6 colonii lecitinaz pozitive, care se transfer pe pante cu agar nutritiv.
Se efectueaz frotiuri colorate Gram i se examineaz la microscop.
B. cereus va aprea ca un bacil Gram pozitiv, mare, cu capetele rotunjite
grupat n lanuri mai lungi sau mai scurte i cu endospori elipsoidali situai
central sau subterminal, care de obicei nu deformeaz celula vegetativ.
Se transfer o ans de cultur bacterian de pe fecare pant ntr-un tub
cu soluie steril cu tampon fosfat. Se amestec bine i se folosete cultura
n suspensie pentru inocularea urmtoarelor medii de confrmare:
1. Bulion cu glucoz i rou fenol.
Se inoculeaz o ans de cultur bacterian (aproximativ 2 mm) n trei
ml de bulion. Tuburile se incubeaz anaerob ntr-un sistem GasPack, 24 de
ore la 35C. Tuburile se agit riguros i se verifc pentru cretere dup cum
arat turbiditatea i modifcarea culorii mediului din rou n galben, ceea ce
arat c a avut loc eliberarea de acid din glucoz.
2. Bulion cu nitrat (M71).
Se realizeaz prin adugarea la cultura n bulion a 0,25 ml de reactiv.
Dac n aproximativ 10 minute va aprea o coloraie portocalie nseamn c
94
testul este pozitiv.
3. Mediul VP modifcat (M68).
Se inoculeaz o ans de cultur bacterian (aproximativ 3 mm) n 5
ml de mediu. Se incubeaz 48 de ore la 35C. Se testeaz pentru prezena
de acetil-metil-carbinol prin pipetarea a 1 ml de cultur ntr-o eprubet
Wassermann, la care se adaug 0,6 ml de soluie de alfa-naftol i 0,2 ml de
soluie de hidroxid de potasiu 40%. Se agit i se adaug cteva cristale de
creatin. Rezultatele se citesc dup pstrarea timp de o or la temperatura
camerei. Testul este pozitiv dac apare o culoare roz sau violet.
4. Agar cu tirozin.
Se nsmneaz mediul de cultur i se incubeaz 48 de ore la
35C. Dac se produce clarifcarea mediului nseamn c tirozina a fost
descompus.
5. Bulion cu lizozim.
Se inoculeaz mediul cu o ans de cultur bacterian. Se folosete
ca martor pozitiv, bulion nutritiv simplu nsmnat. Tuburile se incubeaz
24 de ore la 35C. Se nregistreaz creterea ca pozitiv sau negativ, iar
tuburile negative se incubeaz alte 24 de ore nainte de ndeprtare.
Se nregistreaz rezultatele obinute prin testele de confrmare
considerndu-se pozitive, cele care:
- sunt bacili Gram pozitivi, ce formeaz spori, care nu deformeaz
sporangiul;
- produc lecitinaz i nu fermenteaz manitolul pe agar MYP;
- cresc i produc acid din glucoz pe cale anaerob;
- reduc nitraii n nitrii;
- produc acetil-metil-carbinol;
- descompun tirozina;
- cresc n prezena lizozimului 0,001%.
Aceste caracteristici fundamentale sunt comune cu ale altor membrii
ai grupului B. cereus, incluznd tulpinile rizoide de B. cereus var. mycoides,
bacterii patogene ale insectelor cristalifere ca B. thuringiensis i cele
patogene pentru mamifere ca B. anthracis.
Teste pentru diferenierea membrilor grupului B. cereus
1. Testul mobilitii:
Se inoculeaz un mediu BC pentru testarea mobilitii prin nepare
cu un ac drept de nsmnare (3 mm suspensie de cultur de 24 de ore).
Se incubeaz 18-24 de ore la 30C. Dac creterea bacterian difuzeaz
n tot mediul de cultur, bacteriile sunt mobile, iar dac aceasta are loc
95
numai de-a lungul liniei de nsmnare nseamn c bacteriile sunt imobile.
Alternativ se nsmneaz circa 3 mm de suspensie bacterian pe suprafaa
unei pante de agar cu 0,2 ml de ap distilat steril. Se incubeaz 6-8
ore la 30C. Se testeaz mobilitatea prin examenul ntre lam i lamel.
Majoritatea tulpinilor de B. cereus i B. thuringiensis sunt mobile, avnd
fageli peritrichi. B. anthracis i aproape toate tulpinile de B. cereus var.
mycoides sunt imobile.
2. Creterea rizoid:
Se nsmneaz bacteria de cercetat n plci Petri cu agar nutritiv.
Se incubeaz 48-72 de ore la 30C. Se controleaz pentru creterea rizoid
care se caracterizeaz prin producerea de colonii cu structuri asemntoare
unor rdcini ce se pot extinde pe mai muli centimetri de la locul inoculrii.
B. cereus formeaz de obicei colonii rugoase n form de galaxie care nu
trebuiesc confundate cu cele rizoide tipice pentru B. cereus var. mycoides.
Majoritatea tulpinilor din aceast varietate sunt imobile.
3. Testul pentru activitatea hemolitic:
Se nsmneaz o suspensie de cultur bacterian de 24 de ore ntr-o
plac Petri cu agar snge de oaie i tripticaz soia. Plcile se incubeaz 24
de ore la 35C. Culturile de B. cereus sunt de obicei puternic hemolitice
i produc o zon de 2-4 mm de hemoliz complet (beta) n jurul coloniei
bacteriene. Majoritatea tulpinilor de B. thuringiensis i B. cereus var.
mycoides sunt tot betahemolitice. Tulpinile de B. anthracis sunt de obicei
nehemolitice dup o incubaie de 24 de ore.
4. Testul pentru cristalele de toxin proteic:
Se inoculeaz pe pante cu agar nutritiv o suspensie bacterian de 24
de ore. Se incubeaz la 30C, 24 de ore i se las la temperatura camerei 2-3
zile. Se fac frotiuri care se usuc la aer i se fxeaz prin fambare. Lamele se
plaseaz pe suportul biei de colorare i se acoper cu metanol. Se las 30
de secunde, se ndeprteaz metanolul i se usuc bine lama trecnd-o prin
facr. Se pune din nou lama pe suport i se acoper cu fuxin bazic 0,5%
sau fuxin ZN (Difco). Se nclzete lama uor la facr pn la apariia
vaporilor. Se ateapt 1-2 minute i se repet aceast etap. Se las 30 de
secunde, se ndeprteaz colorantul, iar lama se cltete bine cu ap de
robinet. Se usuc lama (fr tergere) i se examineaz la un microscop cu
imersie pentru prezena endosporilor i a cristalelor tetragonale ntunecate
(n form de diamant). Cristalele sunt de obicei, mai mici dect sporii.
Acestea sunt abundente ntr-o cultur veche de 3-4 zile de B. thuringiensis,
96
dar nu pot f detectate prin tehnici de colorare, dect dup liza sporangiului.
De aceea, dac nu se pot observa spori liberi, culturile se in la temperatura
camerei cteva zile n plus i se reexamineaz. De obicei, cristalele de toxin
proteic sunt produse de B. thuringiensis.
97

B. cereus. Coloraia
Gram. Metod indirect
de evideniere a sporului
care apare necolorat, oval
i deformeaz uor celula
vegetativ. Se remarc
prezena unei grupri n
lan.
B. cereus. Microscopie electronic. Bacili asemntori cu Bacillus anthracis dar cu
capetele mai rotunjite, mobili, fagelai peritrich.
98
B. cereus agar cu snge de oaie, hemoliz beta. Se remarc colonii mari, neuniforme,
opace de tip R (rough), lipsite de tenacitate, find nconjurate de o zon larg de beta
hemoliz. Se remarc aspectul caracteristic de picturi de cear.
B. cereus coloraia Leifson, se observ fageli dispui peritrich.
99
3.3. Bacillus subtilis
3.3.1. Taxonomie
B. subtilis cuprinde 2 subspecii, i anume: subtilis i spizizenii
(Nakamura i col. 1999).
3.3.2. Caractere generale
Formeaz colonii mari care cresc i invadeaz suprafaa mediilor
insufcient uscate. Rotunde sau neregulate, cu suprafaa lipsit de strlucire,
sunt opace, greu emulsionabile, pot f zbrcite i devin colorate n crem sau
brun.
Determin zone largi de hemoliz.
nsmnarea prin nepare n agar nutritiv glucozat 1% formeaz
o cretere groas, frecvent rugoas, brun. Creterea n profunzime este
limitat i poate f nconjurat de un disc submers de pigment roiatic.
3.3.3. Morfologie
Bacil mic cu diametrul sub 0,9 i lung de 1,3-3 , dispus izolat sau
n lanuri scurte; sporogen, spor elipsoid, dispus central; cilogen peritrih.
Fermenteaz glucoza, testul Voges-Proskauer pozitiv, reduce nitraii
n nitrii, hidrolizeaz amidonul i cazeina.
Bacillus subtilis este slab patogen, poate s produc toxiinfecii
alimentare la om n urma consumului de preparate pe baz de orez, fructe
uscate (schemele 3.1 i 3.2).
Schema 3.1
Criterii pentru diferenierea bacililor Gram pozitivi aerobi, sporogeni, spori ovali
sau sferici

GENUL
BACILLUS
Spori ovali sau sferici,
nu deformeaz celula
Spori ovali cu perete gros,
deformeaz celula
Spori sferici, deformeaz
celula
100
Schema 3.2
Criterii biochimice de identifcare a bacililor Gram pozitivi, sporogeni, aerobi
Fermentarea dextrozei
Acidifierea arabinozei
Negativ
Producerea de lecitinaz
Pozitiv Negativ
B. cereus
mobil
ureaz
hemolitic
nepatogen: oarece, cobai

B. anthracis
imobil, ureaz -
capsulat (in vivo)
nehemolitic
patogen: oarece, cobai
Pozitiv
B. subtilis
B. megaterium
mobil
capete rotunjite
nehemolitic
lipsit de patogenitate

101
Bibliografe
Ariel, N., Zvi, A., Grosfeld, H., Gat, O., Inbar, Y., Velan, B., Cohen, S., Shafferman, 1.
A. (2002). Search for Potential Vaccine Candidate Open Reading Frames in the
Bacillus anthracis Virulence Plasmid pXO1: In Silico and In Vitro Screening.
Infect. Immun. 70: 6817-6827
Ariel, N., Zvi, A., Makarova, K. S., Chitlaru, T., Elhanany, E., Velan, B., Cohen, S., 2.
Friedlander, A. M., Shafferman, A. (2003). Genome-Based Bioinformatic Selection
of Chromosomal Bacillus anthracis Putative Vaccine Candidates Coupled with
Proteomic Identifcation of Surface-Associated Antigens. Infect. Immun. 71: 4563-
4579
Barlass, P. J., Houston, C. W., Clements, M. O., Moir, A. (2002). Germination of 3.
Bacillus cereus spores in response to L-alanine and to inosine: the roles of gerL and
gerQ operons. Microbiology 148: 2089-2095
Barth, H., Aktories, K., Popoff, M. R., Stiles, B. G. (2004). Binary Bacterial Toxins: 4.
Biochemistry, Biology, and Applications of Common Clostridium and Bacillus
Proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 373-402
Bavykin, S. G., Lysov, Y. P., Zakhariev, V., Kelly, J. J., Jackman, J., Stahl, D. 5.
A., Cherni, A. (2004). Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB Gene Sequence
Analysis To Determine Phylogenetic Relationships of Bacillus cereus Group
Microorganisms. J. Clin. Microbiol. 42: 3711-3730
Bell, C. A., Uhl, J. R., Hadfeld, T. L., David, J. C., Meyer, R. F., Smith, T. F., 6.
Cockerill III, F. R. (2002). Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler
PCR. J. Clin. Microbiol. 40: 2897-2902
Berger, B. J., English, S., Chan, G., Knodel, M. H. (2003). Methionine Regeneration 7.
and Aminotransferases in Bacillus subtilis, Bacillus cereus, and Bacillus anthracis.
J. Bacteriol. 185: 2418-2431
Blackwood, K. S., Turenne, C. Y., Harmsen, D., Kabani, A. M. (2004). Reassessment 8.
of Sequence-Based Targets for Identifcation of Bacillus Species. J. Clin. Microbiol.
42: 1626-1630
Bode, E., Hurtle, W., Norwood, D. (2004). Real-Time PCR Assay for a Unique 9.
Chromosomal Sequence of Bacillus anthracis. J. Clin. Microbiol. 42: 5825-5831
Bouchek-Mechiche, K., Gardan, L., Andrivon, D., Normand, P. (2006). 10.
Streptomyces turgidiscabies and Streptomyces reticuliscabiei: one genomic
species, two pathogenic groups. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2771-2776
Bourgogne, A., Drysdale, M., Hilsenbeck, S. G., Peterson, S. N., Koehler, T. M. 11.
(2003). Global Effects of Virulence Gene Regulators in a Bacillus anthracis Strain
with Both Virulence Plasmids. Infect. Immun. 71: 2736-2743
Brillard, J., Lereclus, D. (2004). Comparison of cytotoxin cytK promoters from 12.
Bacillus cereus strain ATCC 14579 and from a B. cereus food-poisoning strain.
102
Microbiology 150: 2699-2705
Callegan, M. C., Cochran, D. C., Kane, S. T., Gilmore, M. S., Gominet, M., 13.
Lereclus, D. (2002). Contribution of Membrane-Damaging Toxins to Bacillus
Endophthalmitis Pathogenesis. Infect. Immun. 70: 5381-5389
Cardazzo, B., Negrisolo, E., Carraro, L., Alberghini, L., Patarnello, T., Giaccone, V. 14.
(2008). Multiple-Locus Sequence Typing and Analysis of Toxin Genes in Bacillus
cereus Food-Borne Isolates. Appl. Environ. Microbiol. 74: 850-860
Chada, V. G. R., Sanstad, E. A., Wang, R., Driks, A. (2003). Morphogenesis of 15.
Bacillus Spore Surfaces. J. Bacteriol. 185: 6255-6261
Chang, Y.-H., Shangkuan, Y.-H., Lin, H.-C., Liu, H.-W. (2003). PCR Assay of 16.
the groEL Gene for Detection and Differentiation of Bacillus cereus Group Cells.
Appl. Environ. Microbiol. 69: 4502-4510
Chen, Y., Succi, J., Tenover, F. C., Koehler, T. M. (2003). {beta}-Lactamase Genes 17.
of the Penicillin-Susceptible Bacillus anthracis Sterne Strain. J. Bacteriol. 185:
823-830
Cherif, A., Borin, S., Rizzi, A., Ouzari, H., Boudabous, A., Daffonchio, D. (2003). 18.
Bacillus anthracis Diverges from Related Clades of the Bacillus cereus Group in
16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Transcribed Spacers Containing tRNA Genes.
Daffonchio, D., Raddadi, N., Merabishvili, M., Cherif, A., Carmagnola, L., Brusetti, 19.
L., Rizzi, A., Chanishvili, N., Visca, P., Sharp, R., Borin, S. (2006). Strategy for
Identifcation of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains Closely Related
to Bacillus anthracis. Appl. Environ. Microbiol. 72: 1295-1301
DANCER, S.J., McNAIR, D., FINN, P., KOLSTO, A-B. (2002). Bacillus cereus 20.
cellulitis from contaminated heroin. J Med Microbiol 51: 278-281
Dauphin, L. A., Newton, B. R., Rasmussen, M. V., Meyer, R. F., Bowen, M. D. 21.
(2008). Gamma Irradiation Can Be Used To Inactivate Bacillus anthracis Spores
without Compromising the Sensitivity of Diagnostic Assays. Appl. Environ.
Microbiol. 74: 4427-4433
Davison, S., Couture-Tosi, E., Candela, T., Mock, M., Fouet, A. (2005). Identifcation 22.
of the Bacillus anthracis {gamma} Phage Receptor. J. Bacteriol. 187: 6742-6749
de Been, M., Francke, C., Moezelaar, R., Abee, T., Siezen, R. J. (2006). Comparative 23.
analysis of two-component signal transduction systems of Bacillus cereus, Bacillus
thuringiensis and Bacillus anthracis.. Microbiology 152: 3035-3048
de Vries, Y. P., Atmadja, R. D., Hornstra, L. M., de Vos, W. M., Abee, T. (2005). 24.
Infuence of Glutamate on Growth, Sporulation, and Spore Properties of Bacillus
cereus ATCC 14579 in Defned Medium. Appl. Environ. Microbiol. 71: 3248-
3254
de Vries, Y. P., Hornstra, L. M., de Vos, W. M., Abee, T. (2004). Growth and 25.
Sporulation of Bacillus cereus ATCC 14579 under Defned Conditions: Temporal
103
Expression of Genes for Key Sigma Factors. Appl. Environ. Microbiol. 70: 2514-
2519
DelVecchio, V. G., Connolly, J. P., Alefantis, T. G., Walz, A., Quan, M. A., Patra, 26.
G., Ashton, J. M., Whittington, J. T., Chafn, R. D., Liang, X., Grewal, P., Khan, A.
S., Mujer, C. V. (2006). Proteomic Profling and Identifcation of Immunodominant
Spore Antigens of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis.
Demidova, T. N., Hamblin, M. R. (2005). Photodynamic Inactivation of Bacillus 27.
Spores, Mediated by Phenothiazinium Dyes. Appl. Environ. Microbiol. 71: 6918-
6925
Easterday, W. R., Van Ert, M. N., Simonson, T. S., Wagner, D. M., Kenefc, L. J., 28.
Allender, C. J., Keim, P. (2005). Use of Single Nucleotide Polymorphisms in the
plcR Gene for Specifc Identifcation of Bacillus anthracis. J. Clin. Microbiol. 43:
1995-1997
Ehling-Schulz, M., Svensson, B., Guinebretiere, M.-H., Lindback, T., Andersson, 29.
M., Schulz, A., Fricker, M., Christiansson, A., Granum, P. E., Martlbauer, E.,
Nguyen-The, C., Salkinoja-Salonen, M., Scherer, S. (2005). Emetic toxin formation
of Bacillus cereus is restricted to a single evolutionary lineage of closely related
strains. Microbiology 151: 183-197
Elzi, M. V., Mallard, K., Droz, S., Bodmer, T. (2005). Polyphasic Approach for 30.
Identifying Bacillus spp.. J. Clin. Microbiol. 43: 1010-1010
Fedhila, S., Gohar, M., Slamti, L., Nel, P., Lereclus, D. (2003). The Bacillus 31.
thuringiensis PlcR-Regulated Gene inhA2 Is Necessary, but Not Suffcient, for
Virulence. J. Bacteriol. 185: 2820-2825
Fedhila, S., Msadek, T., Nel, P., Lereclus, D. (2002). Distinct clpP Genes Control 32.
Specifc Adaptive Responses in Bacillus thuringiensis. J. Bacteriol. 184: 5554-
5562
Ghelardi, E., Celandroni, F., Salvetti, S., Beecher, D. J., Gominet, M., Lereclus, 33.
D., Wong, A. C. L., Senesi, S. (2002). Requirement of fhA for Swarming
Differentiation, Flagellin Export, and Secretion of Virulence-Associated Proteins
in Bacillus thuringiensis. J. Bacteriol. 184: 6424-6433
Gomes-Solecki, M. J. C., Savitt, A. G., Rowehl, R., Glass, J. D., Bliska, J. B., 34.
Dattwyler, R. J. (2005). LcrV Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for
Detection of Yersinia pestis from Human Samples. CVI 12: 339-346
Grass, G., Schierhorn, A., Sorkau, E., Muller, H., Rucknagel, P., Nies, D. H., 35.
Fricke, B. (2004). Camelysin Is a Novel Surface Metalloproteinase from Bacillus
cereus. Infect. Immun. 72: 219-228
Han, C. S., Xie, G., Challacombe, J. F., Altherr, M. R., Bhotika, S. S., Bruce, D., 36.
Campbell, C. S., Campbell, M. L., Chen, J., Chertkov, O., Cleland, C., Dimitrijevic,
M., Doggett, N. A., Fawcett, J. J., Glavina, T., Goodwin, L. A., Hill, K. K., Hitchcock,
104
P., Jackson, P. J., Keim, P., Kewalramani, A. R., Longmire, J., Lucas, S., Malfatti,
S., McMurry, K., Meincke, L. J., Misra, M., Moseman, B. L., Mundt, M., Munk, A.
C., Okinaka, R. T., Parson-Quintana, B., Reilly, L. P., Richardson, P., Robinson, D.
L., Rubin, E., Saunders, E., Tapia, R., Tesmer, J. G., Thayer, N., Thompson, L. S.,
Tice, H., Ticknor, L. O., Wills, P. L., Brettin, T. S., Gilna, P. (2006). Pathogenomic
Sequence Analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Isolates Closely
Related to Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 188: 3382-3390
Hao, W., Golding, G. B. (2004). Patterns of Bacterial Gene Movement. 37. Mol Biol
Evol 21: 1294-1307
Hao, W., Golding, G. B. (2006). The fate of laterally transferred genes: Life in the 38.
fast lane to adaptation or death.. Genome Res 16: 636-643
Harvie, D. R., Vilchez, S., Steggles, J. R., Ellar, D. J. (2005). Bacillus cereus Fur 39.
regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology 151:
569-577
Hathout, Y., Setlow, B., Cabrera-Martinez, R.-M., Fenselau, C., Setlow, P. (2003). 40.
Small, Acid-Soluble Proteins as Biomarkers in Mass Spectrometry Analysis of
Bacillus Spores. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1100-1107
Helgason, E., Cer, R. Z., Jiang, L., Shores, K. A., Fouts, D. E., Tourasse, N. J., 41.
Angiuoli, S. V., Kolonay, J., Nelson, W. C., Kolsto, A.-B., Fraser, C. M., Read, T.
D. (2004). The genome sequence of Bacillus cereus ATCC 10987 reveals metabolic
adaptations and a large plasmid related to Bacillus anthracis pXO1. Nucleic Acids
Res 32: 977-988
Helgason, E., Tourasse, N. J., Meisal, R., Caugant, D. A., Kolsto, A.-B. (2004). 42.
Multilocus Sequence Typing Scheme for Bacteria of the Bacillus cereus Group.
Hill, K. K., Ticknor, L. O., Okinaka, R. T., Asay, M., Blair, H., Bliss, K. A., Laker, 43.
M., Pardington, P. E., Richardson, A. P., Tonks, M., Beecher, D. J., Kemp, J. D.,
Kolsto, A.-B., Wong, A. C. L., Keim, P., Jackson, P. J. (2004). Fluorescent Amplifed
Fragment Length Polymorphism Analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus,
and Bacillus thuringiensis Isolates. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1068-1080
Hoffmaster, A. R., Hill, K. K., Gee, J. E., Marston, C. K., De, B. K., Popovic, 44.
T., Sue, D., Wilkins, P. P., Avashia, S. B., Drumgoole, R., Helma, C. H., Ticknor,
L. O., Okinaka, R. T., Jackson, P. J. (2006). Characterization of Bacillus cereus
Isolates Associated with Fatal Pneumonias: Strains Are Closely Related to Bacillus
anthracis and Harbor B. anthracis Virulence Genes.. J. Clin. Microbiol. 44: 3352-
3360
Hoffmaster, A. R., Ravel, J., Rasko, D. A., Chapman, G. D., Chute, M. D., Marston, 45.
C. K., De, B. K., Sacchi, C. T., Fitzgerald, C., Mayer, L. W., Maiden, M. C. J.,
Priest, F. G., Barker, M., Jiang, L., Cer, R. Z., Rilstone, J., Peterson, S. N., Weyant,
R. S., Galloway, D. R., Read, T. D., Popovic, T., Fraser, C. M. (2004). Identifcation
105
of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling
inhalation anthrax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 8449-8454
Hornstra, L. M., de Vries, Y. P., Wells-Bennik, M. H. J., de Vos, W. M., Abee, 46.
T. (2006). Characterization of Germination Receptors of Bacillus cereus ATCC
14579. Appl. Environ. Microbiol. 72: 44-53
Hoton, F. M., Andrup, L., Swiecicka, I., Mahillon, J. (2005). The cereulide genetic 47.
determinants of emetic Bacillus cereus are plasmid-borne. Microbiology 151:
2121-2124
Hu, X., Van der Auwera, G., Timmery, S., Zhu, L., Mahillon, J. (2009). Distribution, 48.
Diversity, and Potential Mobility of Extrachromosomal Elements Related to the
Bacillus anthracis pXO1 and pXO2 Virulence Plasmids. Appl. Environ. Microbiol.
75: 3016-3028
Hurtle, W., Bode, E., Kaplan, R. S., Garrison, J., Kearney, B., Shoemaker, D., 49.
Henchal, E., Norwood, D. (2003). Use of Denaturing High-Performance Liquid
Chromatography To Identify Bacillus anthracis by Analysis of the 16S-23S rRNA
Interspacer Region and gyrA Gene. J. Clin. Microbiol. 41: 4758-4766
Hurtle, W., Bode, E., Kulesh, D. A., Kaplan, R. S., Garrison, J., Bridge, D., House, 50.
M., Frye, M. S., Loveless, B., Norwood, D. (2004). Detection of the Bacillus
anthracis gyrA Gene by Using a Minor Groove Binder Probe. J. Clin. Microbiol.
42: 179-185
Jensen, G. B., Larsen, P., Jacobsen, B. L., Madsen, B., Smidt, L., Andrup, L. (2002). 51.
Bacillus thuringiensis in Fecal Samples from Greenhouse Workers after Exposure
to B. thuringiensis-Based Pesticides. Appl. Environ. Microbiol. 68: 4900-4905
Jones, G. W., Nielsen-Leroux, C., Yang, Y., Yuan, Z., Dumas, V. F., Gomes 52.
Monnerat, R., Berry, C. (2007). A new Cry toxin with a unique two-component
dependency from Bacillus sphaericus. FASEB J. 21: 4112-4120
Kim, W., Kim, J.-Y., Cho, S.-L., Nam, S.-W., Shin, J.-W., Kim, Y.-S., Shin, H.-S. 53.
(2008). Glycosyltransferase - a specifc marker for the discrimination of Bacillus
anthracis from the Bacillus cereus group. J Med Microbiol 57: 279-286
Klee, S. R., Ozel, M., Appel, B., Boesch, C., Ellerbrok, H., Jacob, D., Holland, G., 54.
Leendertz, F. H., Pauli, G., Grunow, R., Nattermann, H. (2006). Characterization of
Bacillus anthracis-Like Bacteria Isolated from Wild Great Apes from Cote dIvoire
and Cameroon.. J. Bacteriol. 188: 5333-5344
Klevan, A., Tourasse, N. J., Stabell, F. B., Kolsto, A.-B., Okstad, O. A. (2007). 55.
Exploring the evolution of the Bacillus cereus group repeat element bcr1 by
comparative genome analysis of closely related strains. Microbiology 153: 3894-
3908
Ko, K. S., Kim, J.-M., Kim, J.-W., Jung, B. Y., Kim, W., Kim, I. J., Kook, Y.-H. 56.
(2003). Identifcation of Bacillus anthracis by rpoB Sequence Analysis and
Multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 41: 2908-2914
106
Ko, K. S., Kim, J.-W., Kim, J.-M., Kim, W., Chung, S.-i., Kim, I. J., Kook, Y.-H. 57.
(2004). Population Structure of the Bacillus cereus Group as Determined by
Sequence Analysis of Six Housekeeping Genes and the plcR Gene. Infect. Immun.
72: 5253-5261
Kristoffersen, S. M., Ravnum, S., Tourasse, N. J., Okstad, O. A., Kolsto, A.-B., 58.
Davies, W. (2007). Low Concentrations of Bile Salts Induce Stress Responses and
Reduce Motility in Bacillus cereus ATCC 14570. J. Bacteriol. 189: 5302-5313
Lee, S. J., Park, S.-Y., Lee, J.-J., Yum, D.-Y., Koo, B.-T., Lee, J.-K. (2002). Genes 59.
Encoding the N-Acyl Homoserine Lactone-Degrading Enzyme Are Widespread in
Many Subspecies of Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3919-
3924
Leoff, C., Choudhury, B., Saile, E., Quinn, C. P., Carlson, R. W., Kannenberg, 60.
E. L. (2008). Structural Elucidation of the Nonclassical Secondary Cell Wall
Polysaccharide from Bacillus cereus ATCC 10987: COMPARISON WITH THE
POLYSACCHARIDES FROM BACILLUS ANTHRACIS AND B. CEREUS
TYPE STRAIN ATCC 14579 REVEALS BOTH UNIQUE AND COMMON
STRUCTURAL FEATURES. J. Biol. Chem. 283: 29812-29821
Liang, L., He, X., Liu, G., Tan, H. (2008). The role of a purine-specifc nucleoside 61.
hydrolase in spore germination of Bacillus thuringiensis. Microbiology 154: 1333-
1340
Mukhopadhyay, S., Akmal, A., Stewart, A. C., Hsia, R.-c., Read, T. D. (2009). 62.
Identifcation of Bacillus anthracis Spore Component Antigens Conserved across
Diverse Bacillus cereus sensu lato Strains. Mol. Cell. Proteomics 8: 1174-1191
Oggioni, M. R., Meacci, F., Carattoli, A., Ciervo, A., Orru, G., Cassone, A., Pozzi, 63.
G. (2002). Protocol for Real-Time PCR Identifcation of Anthrax Spores from
Nasal Swabs after Broth Enrichment. J. Clin. Microbiol. 40: 3956-3963
Okstad, O. A., Tourasse, N. J., Stabell, F. B., Sundfaer, C. K., Egge-Jacobsen, W., 64.
Risoen, P. A., Read, T. D., Kolsto, A.-B. (2004). The bcr1 DNA Repeat Element Is
Specifc to the Bacillus cereus Group and Exhibits Mobile Element Characteristics.
J. Bacteriol. 186: 7714-7725
Pannucci, J., Okinaka, R. T., Sabin, R., Kuske, C. R. (2002). Bacillus anthracis 65.
pXO1 Plasmid Sequence Conservation among Closely Related Bacterial Species.
J. Bacteriol. 184: 134-141
Pomerantsev, A. P., Kalnin, K. V., Osorio, M., Leppla, S. H. (2003). 66.
Phosphatidylcholine-Specifc Phospholipase C and Sphingomyelinase Activities
in Bacteria of the Bacillus cereus Group. Infect. Immun. 71: 6591-6606
Priest, F. G., Barker, M., Baillie, L. W. J., Holmes, E. C., Maiden, M. C. J. (2004). 67.
Population Structure and Evolution of the Bacillus cereus Group. J. Bacteriol. 186:
7959-7970
Radnedge, L., Agron, P. G., Hill, K. K., Jackson, P. J., Ticknor, L. O., Keim, P., 68.
107
Andersen, G. L. (2003). Genome Differences That Distinguish Bacillus anthracis
from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 69:
2755-2764
Rasko, D. A., Rosovitz, M. J., Okstad, O. A., Fouts, D. E., Jiang, L., Cer, R. Z., 69.
Kolsto, A.-B., Gill, S. R., Ravel, J. (2007). Complete Sequence Analysis of Novel
Plasmids from Emetic and Periodontal Bacillus cereus Isolates Reveals a Common
Evolutionary History among the B. cereus-Group Plasmids, Including Bacillus
anthracis pXO1. J. Bacteriol. 189: 52-64
Reissbrodt, R., Rassbach, A., Burghardt, B., Rienacker, I., Mietke, H., Schleif, J., 70.
Tschape, H., Lyte, M., Williams, P. H. (2004). Assessment of a New Selective
Chromogenic Bacillus cereus Group Plating Medium and Use of Enterobacterial
Autoinducer of Growth for Cultural Identifcation of Bacillus Species. J. Clin.
Microbiol. 42: 3795-3798
Reyes-Ramirez, A., Ibarra, J. E. (2005). Fingerprinting of Bacillus thuringiensis 71.
Type Strains and Isolates by Using Bacillus cereus Group-Specifc Repetitive
Extragenic Palindromic Sequence-Based PCR Analysis. Appl. Environ. Microbiol.
71: 1346-1355
Rice, E. W., Adcock, N. J., Sivaganesan, M., Rose, L. J. (2005). Inactivation of 72.
Spores of Bacillus anthracis Sterne, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis
subsp. israelensis by Chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 71: 5587-5589
Rowan, N. J., Caldow, G., Gemmell, C. G., Hunter, I. S. (2003). Production of 73.
Diarrheal Enterotoxins and Other Potential Virulence Factors by Veterinary Isolates
of Bacillus Species Associated with Nongastrointestinal Infections. Appl. Environ.
Microbiol. 69: 2372-2376
Ryu, C., Lee, K., Hawng, H.-J., Yoo, C.-K., Seong, W.-K., Oh, H.-B. (2005). 74.
Molecular Characterization of Korean Bacillus anthracis Isolates by Amplifed
Fragment Length Polymorphism Analysis and Multilocus Variable-Number
Tandem Repeat Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 71: 4664-4671
Salvetti, S., Ghelardi, E., Celandroni, F., Ceragioli, M., Giannessi, F., Senesi, 75.
S. (2007). FlhF, a signal recognition particle-like GTPase, is involved in the
regulation of fagellar arrangement, motility behaviour and protein secretion in
Bacillus cereus. Microbiology 153: 2541-2552
Satterfeld, B. C., Kulesh, D. A., Norwood, D. A., Wasieloski, L. P. Jr, Caplan, M. 76.
R., West, J. A.A. (2007). Tentacle ProbesTM: Differentiation of Diffcult Single-
Nucleotide Polymorphisms and Deletions by Presence or Absence of a Signal in
Real-Time PCR. Clin. Chem. 53: 2042-2050
Schuch, R., Fischetti, V. A. (2006). Detailed Genomic Analysis of the W{beta} 77.
and {gamma} Phages Infecting Bacillus anthracis: Implications for Evolution of
Environmental Fitness and Antibiotic Resistance.. J. Bacteriol. 188: 3037-3051
Schumacher, W. C., Storozuk, C. A., Dutta, P. K., Phipps, A. J. (2008). Identifcation 78.
108
and Characterization of Bacillus anthracis Spores by Multiparameter Flow
Cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 74: 5220-5223
Sela-Abramovich, S., Chitlaru, T., Gat, O., Grosfeld, H., Cohen, O., Shafferman, A. 79.
(2009). Novel and Unique Diagnostic Biomarkers for Bacillus anthracis Infection.
Shi, X., Rao, N. N., Kornberg, A. (2004). Inorganic polyphosphate in Bacillus 80.
cereus: Motility, bioflm formation, and sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101: 17061-17065
Slamti, L., Lereclus, D. (2005). Specifcity and Polymorphism of the PlcR-PapR 81.
Quorum-Sensing System in the Bacillus cereus Group. J. Bacteriol. 187: 1182-
1187
Slamti, L., Perchat, S., Gominet, M., Vilas-Boas, G., Fouet, A., Mock, M., Sanchis, 82.
V., Chaufaux, J., Gohar, M., Lereclus, D. (2004). Distinct Mutations in PlcR
Explain Why Some Strains of the Bacillus cereus Group Are Nonhemolytic. J.
Bacteriol. 186: 3531-3538
Sorokin, A., Candelon, B., Guilloux, K., Galleron, N., Wackerow-Kouzova, N., 83.
Ehrlich, S. D., Bourguet, D., Sanchis, V. (2006). Multiple-Locus Sequence Typing
Analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Reveals Separate Clustering
and a Distinct Population Structure of Psychrotrophic Strains. Appl. Environ.
Microbiol. 72: 1569-1578
Susanna, K. A., den Hengst, C. D., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. (2006). Expression 84.
of Transcription Activator ComK of Bacillus subtilis in the Heterologous Host
Lactococcus lactis Leads to a Genome-Wide Repression Pattern: a Case Study of
Horizontal Gene Transfer. Appl. Environ. Microbiol. 72: 404-411
Ticknor, L. O., Kolsto, A.-B., Hill, K. K., Keim, P., Laker, M. T., Tonks, M., 85.
Jackson, P. J. (2001). Fluorescent Amplifed Fragment Length Polymorphism
Analysis of Norwegian Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Soil Isolates.
Tinsley, E., Khan, S. A. (2006). A Novel FtsZ-Like Protein Is Involved in 86.
Replication of the Anthrax Toxin-Encoding pXO1 Plasmid in Bacillus anthracis..
J. Bacteriol. 188: 2829-2835
Tinsley, E., Naqvi, A., Bourgogne, A., Koehler, T. M., Khan, S. A. (2004). Isolation 87.
of a Minireplicon of the Virulence Plasmid pXO2 of Bacillus anthracis and
Characterization of the Plasmid-Encoded RepS Replication Protein. J. Bacteriol.
186: 2717-2723
Tourasse, N. J., Kolsto, A.-B. (2008). SuperCAT: a supertree database for combined 88.
and integrative multilocus sequence typing analysis of the Bacillus cereus group
of bacteria (including B. cereus, B. anthracis and B. thuringiensis). Nucleic Acids
Res 36: D461-D468
Tourasse, N. J., Stabell, F. B., Reiter, L., Kolsto, A.-B. (2005). Unusual Group II 89.
109
Introns in Bacteria of the Bacillus cereus Group. J. Bacteriol. 187: 5437-5451
Valjevac, S., Hilaire, V., Lisanti, O., Ramisse, F., Hernandez, E., Cavallo, J.-D., 90.
Pourcel, C., Vergnaud, G. (2005). Comparison of Minisatellite Polymorphisms
in the Bacillus cereus Complex: a Simple Assay for Large-Scale Screening and
Identifcation of Strains Most Closely Related to Bacillus anthracis. Appl. Environ.
Microbiol. 71: 6613-6623
van Schaik, W., Tempelaars, M. H., Wouters, J. A., de Vos, W. M., Abee, T. (2004). 91.
The Alternative Sigma Factor {sigma}B of Bacillus cereus: Response to Stress and
Role in Heat Adaptation. J. Bacteriol. 186: 316-325
Verheust, C., Jensen, G., Mahillon, J. (2003). pGIL01, a linear tectiviral plasmid 92.
prophage originating from Bacillus thuringiensis serovar israelensis. Microbiology
149: 2083-2092
Vilas-Boas, G., Sanchis, V., Lereclus, D., Lemos, M. V. F., Bourguet, D. (2002). 93.
Genetic Differentiation between Sympatric Populations of Bacillus cereus and
Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1414-1424
Xu, D., Cote, J.-C. (2003). Phylogenetic relationships between Bacillus species 94.
and related genera inferred from comparison of 3 end 16S rDNA and 5 end 16S-
23S ITS nucleotide sequences. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 695-704
Yoong, P., Schuch, R., Nelson, D., Fischetti, V. A. (2006). PlyPH, a Bacteriolytic 95.
Enzyme with a Broad pH Range of Activity and Lytic Action against Bacillus
anthracis.. J. Bacteriol. 188: 2711-2714
Zahner, V., Cabral, D. A., Regua-Mangia, A. H., Rabinovitch, L., Moreau, G., 96.
McIntosh, D. (2005). Distribution of Genes Encoding Putative Virulence Factors
and Fragment Length Polymorphisms in the vrrA Gene among Brazilian Isolates
of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 71: 8107-
8114
Zasada, A. A., Gierczynski, R., Raddadi, N., Daffonchio, D., Jagielski, M. (2006). 97.
Some Bacillus thuringiensis Strains Share rpoB Nucleotide Polymorphisms Also
Present in Bacillus anthracis. J. Clin. Microbiol. 44: 1606-1607
Zhang, R., Zhang, C.-T. (2003). Identifcation of genomic islands in the genome of 98.
Bacillus cereus by comparative analysis with Bacillus anthracis. Physiol. Genomics
16: 19-23
Zhong, W., Shou, Y., Yoshida, T. M., Marrone, B. L. (2007). Differentiation of 99.
Bacillus anthracis, B. cereus, and B. thuringiensis by Using Pulsed-Field Gel
Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 73: 3446-3449
110
CAPITOLUL 4
TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE
BACTERIILE DIN GENUL CLOSTRIDIUM
4.1. Clostridium botulinum
4.1.1. Taxonomie
Genul Clostridium (gr. closter = fus) face parte din familia
Clostridiaceae, Ordinul Clostridiales, Clasa Clostridia.
Cuprinde peste 180 de specii, Gram pozitive, n general mobile, cu
fageli dispui peritrih; dimensiuni de 0,2-2/1,5-3,5 . Produce endospori
ovali sau sferici care, uzual, deformeaz celula i sunt termorezisteni. Sunt
catalaz i oxidaz negativi. Unele specii atac zaharurile fermentativ, altele
sunt azaharolitice. Sunt strict anaerobi i rar aerotolerani. Se dezvolt n
limite largi de temperatur (15-69C) i pH (4-10).
Sunt prezeni n intestinul vertebratelor i nevertebratelor, unde
particip la digestia (descompunerea) materiilor organice de origine animal
i vegetal. Odat cu materiile fecale ajung n mediul ambiant contaminnd
solul, apele i plantele, unde supravieuiesc mult datorit sporilor.
Genul Clostridium cuprinde specii patogene i nepatogene. n funcie
de patogenitatea lor, pot f mprite n:
specii predominant sau exclusiv toxigene;
specii toxigene i virulente (germenii gangrenei gazoase);
specii accidental patogene;
specii nepatogene;
111
Tabelul 4.1
Clasifcarea speciilor din genul Clostridium
Specia bacterian Specia animal receptiv Infecia natural
Specii predominant sau exclusiv toxigene Clostridioze neurotoxice
C. tetani Om, mamifere Tetanos
C. botulinum Om, mamifere, psri Botulism (tipurile A-F)
Specii toxigene i virulente
C. chauvoei Rumegtoare, suine Crbune emfzematos
C. septicum
Rumegtoare, mai rar suine Edem malign
Ovine Bradsot
Gin, pui Dermatita gangrenoas
C. novyi: tip A
Ovine Edemul capului la berbeci
Rumegtoare Gangren gazoas
C. novyi: tip B Ovine, mai rar bovine Hepatita necrozant
C. novyi: tip C Bubaline, mai rar taurine Osteomielit
C. perfringens: tip A
Om, animale Gangren gazoas
Om Toxiinfecii alimentare
C. perfringens: tip A-E Mamifere, psri Enterotoxiemii
C. piliforme Roztoare, carnivore Boala lui Tyzzer
Specii ocazional patogene
C. sordellii Rumegtoare mici, suine Enterotoxiemie
C. spiroforme
Iepure, mai rar suine, mnji Enterotoxiemie
Iepure Enterit mucoid
Mnji, suine Enterocolit
C. diffcile
Om, hamster, iepure, cobai
Enterocolit indus de
antibiotice
Mnji. suine, cine
Enterocolit neindus de
antibiotice
4.1.2. Istoric
Pasteur, n anul 1861, pune prima dat n eviden, n cursul cercetrilor
asupra fermentaiei acide a untului, o bacterie anaerob pe care o denumete
Vibrio butyricum, ulterior Clostridium butyricum. Pasteur arat c aceast
bacterie nu numai c triete fr aer, dar aerul o omoar....
112
Fesser, n 1865, observ pentru prima dat clostridiile n leziunile
gangrenoase la bovine, iar Chaveau, n 1873, face legtura etiologic ntre
prezena clostridiilor n edemul gazos i substratul morfopatologic. n
1877, Pasteur i Joubert cultiv prima bacterie anaerob patogen pe care
a denumit-o Vibrio septique, ulterior Clostridium septicum. Aceti cerce-
ttori au pus bazele bolilor infecioase produse de bacteriile anaerobe la om
i animale.
Clostridium botulinum a fost izolat pentru prima dat de ctre Van
Ermengem (1896) ntr-un jambon alterat care a provocat 23 de mbolnviri,
denumindu-l Bacillus botulinum (lat. botulus = crnat).
Kempner (1897) face primele ncercri de preparare a serului
antibotulinic.
Landmann (1904) izoleaz la Darmstadt, pentru prima dat Clostridium
botulinum din alimente de origine vegetal (salat din fasole conservat).
ncepnd cu 1910 s-au izolat noi tulpini de Clostridium botulinum, n
afar de cea a lui Ermengem, care a fost considerat de tip A. Toate celelalte
tipuri de toxine (B, C, D, E, F, G) determin sindroame identice, dar nu pot
f neutralizate dect de antitoxina omoloag.
Tipul B, izolat pentru prima dat de ctre Leuch (1910), a fost evideniat
pe tot globul n sol, precum i n intestinul de porc (botulus).
Tipul C, subtipul C alfa (din larvele de musc Lucillia caesari),
identifcat de ctre Bergston (1922), a fost izolat mai ales la psri, animale
mici, obolan, pisic.
Tipul C, subtipul C beta (Seddon, 1922), izolat din os de taurin.
Tipul D (Theiller i Robinson, 1927), a fost izolat att din sol, ap,
vegetale, ct i de la bovine i ecvine.
Tipul E, descris pentru prima dat de Gunninson i col. (1935), a fost
izolat exclusiv de la peti.
Tipul F (Mller i Scheibel, 1960) a fost izolat dintr-un pate de fcat,
care a produs intoxicaie la om.
Tipul G (Gimnez i Ciccarelli, 1970), a fost izolat numai din sol.
4.1.3. Morfologie
Clostridium botulinum este un bacil mare (0,5-2,4/1,7-22,2), drept sau
uor curbat, ciliat peritrih (R. M. Mnzat), necapsulogen, Gram pozitiv.
Este sporogen, cu sporul oval, situat subterminal, ce deformeaz celula
vegetativ, dndu-i aspect de sticl de lamp de petrol.
113
Tabel 4.2.
Caractere microscopice i culturale ale speciilor din genul Clostridium
(dup Macovei Alexandra, 1999)
Specia Sporul
a
Corpul bacterian
Zona de
hemoliz
agar-snge
C. baratii
R-O
S-T
umfat,
0,5-1,9/1,6-10,2
m
unic
rotunde/neregulate, turti-
te, uor convexe, translucid
opace
C. bifermentans OC/S
neumfat,
0,6-1,9/1,6-11 m
unic mici, rotunde, transparente
C. botulinum OC/S
umfat,
0,6-1,4/3,0-20,2
m
unic mari, fmbriate, transparente
C. butyricum OC
neumfat,
0,5-1,7/2,4-7,6 m
-
rotunde/neregulate, uor con-
vexe, albe-cenuii.
C. cadaveris OT
umfat,
0,3-1,3/1,4-9,4 m
-
b
rotunde, convexe, translucid-
opace
C. clostridiiforme OC/S
c
umfat,
0,3-0,9/1,4-9,0 m
-
rotunde, convexe, albe-ce-
nuii
C. diffcile OS
umfat,
0,5-1,9/3,0-16,9
m
-
rotunde/rizoide, turtite, cenu-
ii-transparente.
C. histolyticum OS
umfat,
0,5-0,9/1,3-9,2 m
unic
rotunde/neregulate, uor con-
vexe, transparente
C. inocuum OT/S
umfat,
0,4-1,6/1,6-9,4 m
unic
rotunde, convexe, transpa-
rente
C. novyi OC/S
umfat,
0,6-1,4/1,6-17 m
unic
rotunde/neregulate, turtite
invazive
C. paraputrifcum OT
umfat,
0,5-1,4/1,9-17 m
-
rotunde, uor convexe/plate;
translucide-semiopace
C. perfringens Osc
umfat,
0,6-2,4/1,3-19 m
dubl
rotunde, convexe, cenuii-
glbui, transparente; colonii
cu morfologii diferite (turtite,
margini lobate, flamentoase,
etc.) pot aprea n aceeai
cultur
C. ramosum R/OT
umfat,
0,5-0,9/2-12,8 m
-
rotunde, convexe, incolore,
transparente
C. septicum OS
umfat,
0,6-1,9/1,9-35 m
unic
neregulate, invazive, trans-
parente
C. sordelii OC/S
puin umfat,
0,5-1,7/1,6-20,6
m
unic
rotunde/neregulate, turtite,
cenuii, transparente-opace
C. sporogenes OS
umfat,
0,3-1,4/1,3-16 m
unic
fmbriate cap de meduz,
opace
C. subterminale OS
umfat,
0,5-1,9/1,6-11 m
unic
rotunde cu margini lobate,
bombate/uor convexe, ce-
nuii-translucide
114
Specia Sporul
a
Corpul bacterian
Zona de
hemoliz
agar-snge
C. tertium OT
umfat,
0,5-1,4/1,5-10,2
m
unic
rotunde, uor convexe, albe-
cenuii
C. tetani RT
umfat,
0,5-1,7/2,1-18,1
m
unic
rizoide, turtite, cenuii-trans-
parente
a
Simboluri pentru spori: O = oval, R = rotund, C = central, S = subterminal, T = terminal;
b
Hemoliza variabil;
c
Sporuleaz difcil in vivo i in vitro.
Este un germen strict anaerob, cu temperatura optim de dezvoltare n
funcie de grupa metabolic. Astfel, tulpinile din grupa I se dezvolt optim
la 30-40 C, a II-a la 25-37 C, i a III-a la 30-37 C.
Temperaturile minime de cretere sunt la grupa a II-a i I de 3,3 C i
respectiv, 10 C, iar temperaturile maxime de 45-50 C, pH-ul optim este de
7-7,6, suportnd variaii de la 5 la 9.
Creterea este stimulat de adaosul de glucide fermentescibile,
find inhibat de clorura de sodiu 5-10%, fumul lichid, unii polifosfai i
condimente, bila 20% sau pH 8,5.
Dezvoltarea majoritii tulpinilor de Clostridium botulinum este
inhibat de tulpinile de Clostridium perfringens i Clostridium sporogenes,
izolate din sol, precum i de lactobacili, streptococi etc., care scad pH-ul i
produc unele substane antimicrobiene (nisina, bacitracina).
n mediile lichide produce turbiditate abundent, cu depozit
omogenizabil i cu miros rnced caracteristic.
Pe geloz cu snge, formeaz colonii mari (3-8mm), de culoare
cenuie, semitransparente, cu centrul opac i cu hemoliz n jur.
Dup aspectul hemolizei s-au difereniat cinci tipuri de colonii.
Cultivat n profunzimea mediilor solide formeaz colonii pufoase (puf
de ppdie, ciucure), translucide, ciuruite, datorit bulelor foarte fne de
gaz, cu arborizaii fne (observate la lup), asemntoare cu o grenad n
explozie. Pe mediul Nagler sau Willis-Hobbs, produce opalescen i strat
perlat.
115
Proprietile fermentative ale glucidelor difer n funcie de tipul
tulpinilor.
Tabelul 4.3
Criterii biochimice de difereniere a speciilor din genul Clostridium
(dup Quinn i col., 1994)
Clostridium spp.
Leciti-
naz
Li-
paz
Hidroliza
gelatinei
Digestia
cazeinei
Indol
Glu-
coz
Lac-
toz
Su-
croz
Mal-
toz
C. tetani - - + - V - - - -
C. botulinum I - + + + - + - - +
C. botulinum II - + + - - + - - +
C. botulinum III V + + - V + - - V
C. botulinum IV - - + + - - -
C. chauvoei - - + - - + + + +
C. septicum - - + + - + + - +
C. novyi A + + + - - + + - +
C. novyi B + - + + V + - - +
C. novyi C - - + - + + - - -
C. haemolyticum + - + + + + - - -
C. sordellii + - + + + + - - +
C. colinum - - - - - - - + +
C. perfringens + - + + - + + + +
C. diffcile - - + - - + - - -
Legend: + = reacie pozitiv; - = reacie negativ; V = variabil; = netestat
Toate tulpinile lichefaz gelatina, produc lipaz, hidrogen sulfurat,
reduc azotaii i prezint intense proprieti proteolitice.
Reduce albastrul de metilen, dar este neindoligen. Reaciile cu rou
metil i Voges-Proskauer sunt negative. Produce o hemoliz mai activ fa
de hematiile de oaie.
116
Bacilul botulinic posed antigene celulare O i H (fr importan
practic), exoenzime proteolitice, lecitinaz, hemolizin, dar invazivitatea
lui n organism este cel mai adesea nul. Infecia se produce foarte rar prin
plaga contaminat.
Prin reacii de seroaglutinare i seroneutralizare s-au identifcat apte
biotipuri toxigene notate cu literele mari ale alfabetului de la A la G.
Pe baza caracterelor metabolice au fost mprite n patru grupe:
grupa I 5 , care include tipul A i tulpinile proteolitice ale tipurilor
B i F;
grupa a II-a 5 , cu tipul F i tulpinile glucidolitice ale tipurilor B
i F;
grupa a III-a 5 , cu tipurile C i D;
grupa a IV-a 5 , cu tipul G.
Cele apte tipuri de Clostridium botulinum produc toxine distincte
antigenic, dei evoluia clinic este identic.
n cadrul tipului C, se disting dou subtipuri diferite antigenic, C alfa
(patogen pentru psri) i C beta (patogen pentru mamifere).
Tulpinile C alfa produc o cantitate nsemnat de toxin C
1
i cantiti
mici de C
2
i D, pe cnd tulpinile C beta produc cantiti mari de toxin C
2
i
D i cantiti mici de C
1
, iar tulpinile de tip D, cantiti nsemnate de toxin
D i C
2
i cantiti mici de C
1
. Tulpinile de tip E, F, G produc numai un tip
de toxin.
Toxina C
2
este o toxin cu efect letal, ce acioneaz i asupra
permeabilitii vasculare ns fr efect paralitic.
Se poate identifca n culturi dup tripsinizare, iar la efectuarea testului
ansei ligaturate se comport ca o enterotoxin, n cazul reaciei pozitive.
La tulpinile de tip C i D a mai fost identifcat exoenzima C
3
cu
proprieti deocamdat puin cunoscute.
ntre tipul A i D exist nrudiri antigenice, serul specifc tipului D find
capabil s neutralizeze toxina de tip A. Celelalte tipuri sunt net distincte,
neexistnd nici o relaie antigenic ntre ele.
4.1.7. Ecologie
C. botulinum este o bacterie care se gsete n sol sub form de spori,
de unde poate contamina apa, alimentele i furajele. De asemenea, se gsete
i n intestinul mamiferelor. Bacteria poate f purtat la nivelul intestinului
de unele specii de psri de balt i peti marini. Este izolat mai frecvent n
117
solurile din S.U.A. dect n cele din Europa.
Dintre tipurile de C. botulinum identifcate n probele examinate,
cea mai mare rspndire a avut-o tipul E n mediul acvatic din zonele reci;
tipurile A i B au fost mai frecvente n solurile i preparatele din pete i
carne din America de Nord, Europa de Nord, Brazilia. Tipurile F i G s-au
identifcat foarte rar.
Tipurile A, B, E, F sunt saprofte n sol pe cnd C i D sunt parazite
obligatorii n tubul digestiv al mamiferelor i psrilor.
Sursele de infecie n afar de ap i alimente (respectiv furaje) mai pot
f reprezentate de larvele unor diptere (gen. Lucilla, Calliphora, Chrysomia)
ce sunt ingerate de ctre psri. Bovinele i ovinele din Australia, Africa,
Texas (S.U.A.) datorit carenei primare de fosfor i protein inger oasele
sau larvele infectate (alotriofagie) cu C. botulinum i toxin.
Furajele incriminate n apariia botulismului sunt cele alterate sau
corespunztoare organoleptic, dar contaminate (n special cele murate).
Sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice. C. botulinum prezint o
sensibilitate destul de mare la aciunea antibioticelor i chimioterapicelor.
Tulpinile din grupa a II-a i a III-a sunt sensibile la penicilin, cloramfenicol,
tetraciclin, eritromicin, rifampicin, cefalotin, cefaloxitin, clindamicin,
metronidazol, find rezistente la pentamicin i acid nalidixic.
Tulpinile din grupa I sunt sensibile la penicilin, cloramfenicol,
tetraciclin, metronidazol i rifampicin.
4.1.8. Patogenitate
Unicul factor de patogenitate la Clostridium botulinum este toxina.
Toxigeneza are loc n condiiile multiplicrii bacteriei, avnd la
dispoziie substratul nutritiv, n lipsa oxigenului i la temperatur optim
de 25-30C.
Toxina botulinic este o neurotoxin, find considerat cea mai
puternic otrav din natur. A fost purifcat sub form cristalizat ca o
pulbere alb, de natur proteic, electroforetic omogen. Toxina brut este
format din complexe proteice cu greutatea moleculei ce difer n funcie
de tip (150.000-900.000 Da), sub diferite mrimi moleculare (7S, 12S, 16S,
19S). Este compus dintr-o fraciune toxic (neurotoxin) i mai multe
fracii netoxice care includ i o hemaglutinin.
Fraciile netoxice protejeaz fracia toxic de aciunea distructiv a
enzimelor de la nivelul tubului digestiv. La rumegtoare, o parte din toxine
sunt inactivate de microfora ruminal. Cantitatea de toxin eliberat variaz
de la tip la tip, de la tulpin la tulpin i n raport cu mediul folosit. La om
118
cel mai toxigen este tipul A, toxina avnd o capacitate mare de fxare pe
esuturi.
Toxina botulinic, mpreun cu tetanospasmina sunt considerate cele
mai puternice toxine din natur: s-a stabilit c un miligram conine 1.200.000
DLM/kg corp cobai, find capabil s omoare 1.200 de tone sau 2 milioane
de oareci; 198,422 g toxin ar f sufciente pentru a distruge viaa pe toat
suprafaa globului.
Toxina se absoarbe pe cale digestiv, odat cu furajele sau cu apa
contaminate ca i proteinele din ingest[, avnd un neurotropism exclusiv.
Ea blocheaz transmiterea infuxului nervos n fbrele nervoase colinergice,
prin inhibarea eliberrii de acetilcolin la nivelul plcilor neuromusculare
ale nervilor motori, rezultnd paralizia de tip fasc, activitate similar cu
a curarei, fr a f identic. Toxina botulinic inhib activitatea toxinei
tetanice.
Sub aciunea formolului i a cldurii, se transform n anatoxin care
este un vaccin ideal fr ns s aib aplicaii practice datorit caracterului
accidental al acestei intoxicaii.
Formele vegetative nu au o rezisten deosebit la factorii de mediu.
Dezvoltarea lor este inhibat de aciditate (3-4), nitrit de sodiu 1%,
clorur de sodiu, fum, condimente.
Sporii prezint cea mai mare rezisten la aciunea cldurii dintre
germenii anaerobi patogeni: 6 ore la 100 C, 2 ore la 105C i 20 de minute
la 120C. Termorezistena sporilor crete dac n mediile de cultur se
gsesc cantiti mari de zahr, ioni de calciu, magneziu, fer etc., precum
i albu de ou i lipide. Sporii tineri sunt mai rezisteni, iar pH-ul sub 5 i
peste 9 i sensibilizeaz. Formolul 10% la 20C i distruge ntr-o or. Razele
gamma asociate cu razele ultraviolete prezint un efect sporicid foarte
intens, asigurnd cea mai efcient metod de sterilizare a conservelor i
semiconservelor.
Toxina botulinic este sensibil la aciunea cldurii, find inactivat la
80C n 5-60 minute n funcie de tulpin.
Este inactivat de lumina direct n cteva zile, n schimb ntunericul
i temperatura de 4C o conserv mai multe luni.
Din conserve alimentare este distrus prin ferbere n 20 de minute, iar
din carne, pete, furaje dup 2 ore.
Soluia Lgol, permanganatul de potasiu 0,1% i alcoolul o inactiveaz
rapid, acesta din urm, administrat per os, dup ingerarea de toxin previne
119
intoxicaia.
n scopul inactivrii toxinei, apa potabil trebuie tratat cu 10 ppm
clor rezidual, timp de o or. Filtrarea i purifcarea apei ndeprteaz o mare
parte de toxin.
4.1.10. Intoxicaia botulinic
Este o infecie rar care se produce la om i animale, consecutiv
consumului de alimente, respectiv furaje care conin toxin.
Acestea sunt reprezentate cel mai adesea de conserve, mezeluri nchise
n membrane, furaje nsilozate. Se spune c boala a fost inventat odat
cu metodele de conservare.
n toate tipurile de botulism, perioada de incubaie, evoluia bolii i
letalitatea sunt n raport direct cu cantitatea i tipul de toxin ingerat. Ingestia
de doze mortale determin simptome n 12-36 ore; letalitatea n infecia
netratat atinge 60-80%. Botulismul la animale are un caracter sporadic
sau zonal, cel mai frecvent find afectate solipedele, apoi rumegtoarele,
urmate de suine i carnasiere. Dintre animalele de blan cea mai sensibil
este nurca, iar dintre psri, raa (mai ales raa slbatic, cotat drept animal
santinel pentru o zon cu mai multe specii).
n funcie de specia afectat i tipul de toxin, apar predominant
modifcri funcionale ale diferitelor grupe musculare cum sunt: tulburri de
vedere, disfagie, dizartrie, uscciunea gurii i vlului palatin la om, paralizia
limbii i faringelui la bovine, a aripilor, picioarelor i gtului la psri, ale
membrelor posterioare la nurc, iar la cabaline, pareze i paralizii ale ntregii
musculaturi. Procesele mintale sunt pstrate, iar febra lipsete. Moartea
survine prin paralizia muchilor respiratori, pneumonie, bronhopneumonii
secundare prin implicarea muchiului respirator.
La cabaline, psri i om, prin ingerarea sporilor, acetia germineaz
la nivelul tubului digestiv i elibereaz toxina determinnd botulismul la
mnji, pui broiler i nou-nscui. La copiii sugari, botulismul poate aprea
prin consum de miere contaminat cu spori.
4.1.11. Situaia epidemiologic a botulismului
n anul 2006 au fost raportate n total 157 cazuri (din care s-au confrmat
109) de ctre 26 state membre ale UE, Islanda i Norvegha (Finlanda
i Liechtenstein nu au raportat). n anul 2005 a fost raportat un numr
aproximativ egal: 152 cazuri raportate de 22 state. Numai 4 state au raportat
10 sau mai multe cazuri: Polonia (22), Romnia (14), Italia (12) i Regatul
120
Unit (10). Bulgaria a raportat cel mai mare procent de notifcare (0,10 la
100.000), n timp ce rata medie a notifcrii a fost de 0,024 la 100000.
Distribuia pe grupe de vrst i sex. Date privind distribuia pe
grupe de vrst i sex au fost furnizate de 26 state. Din 104 cazuri la care s-a
cunoscut vrsta, 39 cazuri au fost n grupul de vrst 25-44 ani, 25 cazuri n
grupul de vrst 45-64 ani i 24 cazuri n grupul de vrst 15-24 ani. Rata
cea mai ridicat a notifcrii (0,04 cazuri la 100.000) a fost la grupul de
vrst 15-24 ani.
Date referitoare la sexul pacienilor au fost la 98 de cazuri. A fost
raportat un numr mai mare de cazuri la brbai (63) dect la femei (35), cu
un raport pe sexe de 1,8 brbai la o femeie.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de botulism uman n EU i EEA/EFTA
n 2006 (n=104 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor,
2008)
Sezonalitatea. 14 state membre ale UE, Islanda i Norvegia au furnizat
i notifcri lunare n anul 2006. Analiza celor 85 de cazuri de botulismul nu
a prezentat vreo variaie sezonier, n plus numrul cazurilor este prea mic
pentru a putea evalua un asemenea parametru.
Distribuia sezonier a cazurilor de botulism uman n EU i EEA/EFTA n 2006
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
121
4.1.12. Situaia botulismului n Romnia, ntre anii 2003 i 2009,
prezentat de INCDMI Cantacuzino, Bucureti
Prezena toxinei botulinice se determin n ser sau aliment prin testul
letalitii pe oarece, iar determinarea tipului de toxina prin seroprotecie cu
ajutorul anticorpilor specifci.
2003
27 probe
15 probe de ser 7 pozitive: - 2 tip B - 5 ser insufucient pentru
determinarea tipului de toxina
12 probe alimentare, 1 pozitiva, tip B
Nr.
crt.
Proba Rezultat
1 Ser pacient Absenta toxina botulinica
2 Ser pacient Abs. toxina botulinica
5 Ser pacient Prezenta ser insufcient pentru determinarea
tipului
tipului
10 Ser pacient Prezenta tip B
11 Ser pacient (a consumat
conserv preparat n cas)
Prezenta tip B
tipului
14 Aliment Conserva caz
pct. 11
Abs. toxina botulinica
122
pct. 11
pct. 11
pct. 11
tipului
19 Aliment Zacusca Abs. toxina botulinica
20 Aliment Peste Abs. toxina botulinica
21 Aliment Peste Abs. toxina botulinica
22 Aliment Carne n untur Prezenta tip B
23 Aliment Parmezan ras Abs. toxina botulinica
tipului
2004
18 probe
17 probe de ser 8 pozitive: - 2 tip B, - 6 ser insufucient
pentru determinarea tipului de toxina
1 proba alimentara, negativa
Nr. Crt. Proba Rezultat
1. Ser pacient Abs. toxina botulinica
4. Ser pacient Prezenta tip B
6. Ser pacient Prezenta ser insufcient pentru determinarea tipului
123
13. Aliment Crnai Abs. toxina botulinica
2005
25 probe
20 ser 12 pozitive: - 5 tip B, - 7 ser insufucient pentru determinarea
tipului de toxina
1 proba alimentara, negativa

1. Ser pacient Prezenta ser insufcient pentru det. tipului
124
21. Proba alimentara Abs. toxina botulinica
2006
26 probe
26 ser 9 pozitive: - 7 tip B, - 2 ser insufucient pentru determinarea
tipului de toxina
125
2007
110 probe
61 ser - 35 pozitive: - 1 tipE,
- 24 tip B,
- 11 - ser insufucient pentru determinarea tipului de
toxina
49 probe alimentare, 2 pozitive, tip B
Nr.
Crt.
Proba Rezultat
4. Aliment Carne afumat
cazul de la pct. 3
Prezenta tip B
126
16. Ser pacient Prezenta tip E
17. Aliment Conserva ton Abs. toxina botulinica
30. Aliment Macrou Abs. toxina botulinica
31. Aliment Carne porc in
untura
Prezenta tip B
32. Aliment Pulpa pasare Abs. toxina botulinica
33. Aliment Inghetata Abs. toxina botulinica
34. Aliment Sorici Abs. toxina botulinica
127
50. Aliment Salam de porc Abs. toxina botulinica
51. Aliment Pate de fcat Abs. toxina botulinica
52. Aliment Parizer Abs. toxina botulinica
53. Aliment Salam de porc Abs. toxina botulinica
55. Aliment Parizer Abs. toxina botulinica
128
129

2008
Pn la data de 21. 07.2008:
38 probe:
32 probe ser 19 pozitive: 15 tip B, 4 ser insufcient pentru
determinarea tipului de toxina
6 probe alimentare - 1 pozitiva, tip B, 2 in lucru
Nr.
Crt.
Proba Rezultat
130
17. Aliment Carne in untura
(preparat in casa)
Prezenta tip B
18. Aliment Pasta de tomate Abs. toxina botulinica
19. Aliment Cap de porc si
organe (preparat in casa)
20. Aliment Zarzavat (preparat
in casa)
131
37. Aliment Conserva
SARDINELLA IN ULEI,
SKL CAN PROD, Thailanda
SARDINELLA IN ULEI,
SARDINELLA IN ULEI,
2009

Pn la data de 11. 02.2009:

9 probe ser - 4 pozitive - prezent tip B
- 3 in lucru
12 probe aliment - in lucru
132
7. Ser pacient In lucru
10. Aliment hamsii prajite In lucru
11. Aliment sunca de porc In lucru
12. Aliment zarzavat cu rosii preparat in casa In lucru
13. Aliment branza topita In lucru
14. Aliment carne de porc In lucru
15. Aliment crnai In lucru
16. Aliment mazare verde, conserva In lucru
17. Aliment mazare verde, conserva In lucru
18 Aliment sunca porc In lucru
19. Aliment coasta porc afumata In lucru
20. Aliment sunca porc In lucru
21. Aliment hamsii sarate In lucru
4.1.13. Metode de izolare i identifcare a speciei
Clostridium botulinum din alimente
Materiale i aparatur.
1. Frigider.
2. Prosoape uscate, curate.
3. Arztor Bunsen.
4. Deschiztor de cutii de conserve steril bacteriologic.
5. Mojar cu pistil steril.
6. Forceps steril.
133
7. Pipete sterile cu dop de vat.
8. Dispozitiv mecanic de pipetare.
9. Tuburi de cultur sterile.
10. Jaruri anaerobe (Gas Pak).
11. Anse de nsmnare.
12. Incubator.
13. Vase sterile de rezerv pentru probe.
14. Stative.
15. Lame microscopice.
16. Microscop cu contrast de faz sau n cmp luminos.
17. Plci Petri sterile de 15 x 100 ml.
18. Tuburi de centrifug.
19. Centrifug de nalt vitez.
20. Seringi sterile de 1 sau 3 mililitri pentru injectarea oarecilor.
21. oareci (15-20 g).
22. Cleti pentru oareci, etc.
Medii i reactivi.
1. Bulion cu fcat sau bulion cu carne (M4).
2. TPGY (bulion cu extract de drojdie, glucoz, pepton, tripticaz)
sau TPGYT (cu tripsin) (M86).
3. Agar cu glbenu de ou i fcat de viel sau agar pentru anaerobi cu
glbenu de ou (M87).
4. Soluie alcoolic de iod (4% iod i 70% etanol).
5. Fosfat de gel tamponat steril (pH 6,2)
6. Soluie salin fziologic steril.
7. Soluie de hidroxid de sodiu.
8. Acid clorhidric.
9. Etanol absolut.
10. Soluie de tripsin (preparat de Difco) 1:250.
11. Reactivi pentru coloraia Gram.
Prepararea probelor.
Manipularea preliminar. Se refrigereaz probele pn la testare, cu
excepia conservelor nedeschise, care nu se refrigereaz dect dac se umf
foarte tare i prezint pericolul de a crpa. n laborator containerul se cur
i se marcheaz cu un cod de identifcare.
Alimentele lichide i solide. Se transfer aseptic alimentele cu puin
lichid sau fr ntr-un mojar steril. Se adaug o cantitate egal de soluie
de gel fosfat tampon i se frmieaz bine cu un pistil steril. Alternativ,
134
se inoculeaz buci mici din produs direct n mediul de mbogire cu un
forceps steril. Alimentele lichide se inoculeaz direct n mediul de cultur
cu ajutorul unor pipete sterile. Se prepar i o prob de rezerv. Dup
cultivare se transfer aseptic poria de rezerv ntr-un vas steril pentru
testele ulterioare.
4.1.14. Detectarea lui C. botulinum viabil
mbogirea. Se ndeprteaz oxigenul dizolvat din mediul de
mbogire prin autoclavare 10-15 minute i se rcete rapid fr agitare
nainte de inoculare.
Se inoculeaz dou tuburi de mediu cu carne fart cu 1-2 grame de
aliment solid sau 1-2 mililitri de aliment lichid la 15 mililitri de bulion de
mbogire. Se incubeaz la 35C.
Se inoculeaz dou tuburi de bulion TPGY ca mai sus. Se incubeaz
la 26C. Se folosete TPGYT, ca o alternativ numai atunci cnd
microorganismul implicat este foarte suspect de a f o tulpin neproteolitic
a tipurilor B, E sau F.
Introducerea inoculului n bulion se realizeaz foarte uor. Dup 5 zile
de incubare se examineaz culturile pentru turbiditate, producia de gaz i
digestia particulelor de carne, precum i mirosul. Examinarea culturilor se
poate realiza direct prin montare umed cu contrast de faz de mare putere
sau prin efectuarea unui frotiu colorat Gram n cmp luminos. Se studiaz
morfologia microorganismelor i se noteaz existena unor celule clostridiale
tipice, apariia i extinderea relativ a sporulrii i localizarea sporilor
n celulele vegetative. n acest moment se testeaz fecare cultur pentru
prezena toxinei. De obicei, o perioad de incubaie de 7 zile reprezint
creterea activ n care are loc producerea unei concentraii maxime de
toxin botulinic. Dac dup 7 zile nu se remarc nici un fel de cretere
bacterian n mediul de cultur aceasta se mai incubeaz nc 10 zile pentru
detectarea unei germinri, eventual ntrziat a sporilor. Pentru izolarea
germenilor n culturi pure se pstreaz la frigider o cultur de mbogire n
apogeul sporulrii.
Izolarea culturilor pure. C. botulinum se izoleaz mai rapid din fora
mixt a unei culturi bacteriene dintr-un mediu de mbogire sau dintr-un
specimen original.
Tratamentul prealabil al probelor prin etalare. Se adaug un volum
egal de alcool absolut sterilizat prin fltrare la 1-2 mililitri de cultur ntr-
un tub steril prevzut cu capac cu urub. Se amestec bine i se incubeaz
o or la temperatura camerei. Pentru izolare se iau 1-2 mililitri din poria
135
reinut; se adaug un volum egal de alcool absolut sterilizat prin fltrare,
ntr-un tub steril cu capac nurubat. Se amestec bine i se incubeaz o or
la temperatura camerei. Alternativ, se nclzesc 1-2 mililitri de prob pentru
distrugerea celulelor vegetative (80C, 10-15 minute). Nu se folosete
tratamentul termic pentru tipurile non-proteolitice de C. botulinum.
Etalarea n plci Petri a culturilor tratate. Se nsmneaz cultura
bacterian tratat termic ntr-un mediu de agar cu glbenu de ou i fcat
de viel sau ntr-un mediu de agar anaerob cu glbenu de ou n vederea
obinerii de colonii izolate. Se incubeaz plcile nsmnate la 35C, 48 de
ore n condiii anaerobe.
Selecionarea coloniilor tipice de C. botulinum. Se selecioneaz
aproximativ 10 colonii tipice care pot f proeminente sau plate, netede
sau rugoase, de obicei cu o margine neregulat i care prezint o oarecare
rspndire. Dac sunt examinate n lumin oblic produc iridiscen pe un
mediu cu glbenu de ou. Aceast zon lucioas este deseori denumit zon
perlat i de obicei se extinde dincolo de conturul coloniei. n afar de zona
perlat coloniile de C. botulinum ce aparin tipurilor C, D, E sunt de obicei
nconjurate de o zon lat de 2-4 milimetri de precipitat galben. Coloniile
produse de tipurile A i B prezint n general o zon mai mic de precipitare.
Tipul E de C. botulinum se inoculeaz n bulion TPGY. Celelalte tipuri de
toxine se inoculeaz n bulion cu fcat mrunit sau n bulion cu carne fart.
Se incubeaz 5 zile. Se testeaz pentru producerea de toxine.
Izolarea n cultur pur. Se rensmneaz o cultur toxic n duplicat
pe un mediu de agar cu glbenu de ou. Se incubeaz anaerob prima plac
la 35C, iar a doua aerob tot la 35C. Dac coloniile tipice apar numai n
placa anaerob, se consider cultur pur. O transferare n serie prin etape
suplimentare de mbogire poate crete numrul bacteriilor n msur
sufcient pentru a permite izolarea acestora. Cultura pur n stare sporulat
se pstreaz prin congelare pe perle de sticl sau prin lioflizare.
Detectarea toxinei botulinice
Prepararea probei alimentare. Se recolteaz o poriune de prob
pentru detectarea bacteriilor viabile de C. botulinum i o alt poriune pentru
testarea toxicitii. Restul probei se pstreaz la frigider. Se centrifugheaz
probele ce conin particule solide n suspensie sub refrigerare i se utilizeaz
supernatantul pentru determinarea toxinei. Se extrag alimentele solide cu un
volum egal de gel fosfat, tamponat la pH 6,2. Se utilizeaz ct mai puin
tampon pentru a evita diluarea toxinei dup detectare.
136
Determinarea toxicitii n probele alimentare sau n culturi
Tratarea cu tripsin. Toxinele non-proteolitice necesit o activare cu
tripsin pentru a putea f detectate. Deoarece mediul TPGY conine deja
tripsin nu mai necesit alt tratament n acest sens pentru c ar putea avea
loc degradarea unei toxine complet activat prezent n cultur. Se ajusteaz
pH-ul supernatantului la un pH de 6,2 cu NaOH 1N sau cu HCl. Se adaug
0,2 mililitri de soluie apoas saturat de tripsin la 1,8 mililitri din fecare
supernatant ce urmeaz s fe testat pentru toxicitate (pentru prepararea
soluiilor de tripsin se plaseaz un gram de tripsin Difco 1/250 ntr-un tub
steril de cultur i se adaug 10 mililitri de ap distilat dup care se agit i
se nclzete n scopul dezvoltrii). Preparatul tratat cu tripsin se incubeaz
la 35-37C timp de o or cu agitare uoar.
Testarea toxicitii. Se efectueaz teste paralele cu materiale tratate cu
tripsin i cu duplicate netratate. Se fac diluii seriate la 1/2, 1/10 i 1/100
dintr-o cantitate netratat de prob lichid sau solid, n gel fosfat tamponat.
Se execut apoi aceleai diluii din fecare prob lichid sau cultur tratat
cu tripsin. Se injecteaz intraperitoneal fecare din perechile separate de
oareci cu 0,5 mililitri de lichid nediluat i netratat i cu 0,5 mililitri din
fecare diluie din proba netratat folosind o sering de 1,0 mililitri sau
3,0 mililitri. Se repet procedura cu probe duplicate tratate cu tripsin. Se
nclzesc 1,5 mililitri de lichid supernatant netratat sau de cultur netratat
timp de 10 minute la 100C. Proba nclzit se rcete i fecare oarece
dintr-o pereche se injecteaz cu 0,5 mililitri de lichid nediluat.
Este de ateptat ca oarecii s nu moar deoarece dac toxina botulinic
este prezent, va f inactivat prin nclzire.
Toi oarecii se urmresc periodic 48 de ore. Se nregistreaz
simptomele i decesele. Semnele tipice de botulism ncep de obicei, n
primele 24 de ore, cu horipilaie, respiraie grea, slbiciunea membrelor i,
n fnal paralizie, urmat de dispnee i moarte prin insufcien respiratorie.
Sfritul letal al oarecilor nu constituie o dovad sufcient c materialul
injectat conine toxin botulinic. Uneori moartea poate f provocat chiar
de substanele chimice prezente n lichidul injectat sau de un traumatism.
137
4.2. Clostridium perfringens
4.2.1. Introducere
n funcie de capacitatea lor de a produce anumite exotoxine au fost
recunoscute 6 tipuri: A, B, C, D, E, F.
Tulpinile care produc toxiinfecii alimentare aparin tipului A,
find, n general rezistente la cldur i produc numai urme de toxin alfa.
Unele tulpini ale tipului C produc enterotoxine putnd cauza toxiinfecii
alimentare.
Tulpinile clasice productoare de toxiinfecii alimentare difer de tipul
C prin faptul c nu produc toxin beta. Aceasta a fost recuperat din enteritele
necrotice. Tulpinile tipului A pot f termolabile sau termorezistente.
Tabelul 4.4.
Tipuri i toxine de Clostridium welchii
Clostridium welchii
Toxine

Tipul A - termosensibil +++ - - - - ++ - ++ - +/- +
Tipul A - termorezistent /tr - - - - - - +/- - +++/- -
Tipul C - termorezistent + + + - - - - - - - +
B.C. Hobbs, 1962, Bacterial Food Poisoning, Royal Society of Health
Cele termorezistente produc toxina teta, care este perfngolizina O
(PLO), o hemolizin tiol activat similar listeriolizinei O (LLO) produs
de Lis. monocytogenes.
Ca i LLO, PLO are o greutate molecular de 60 KDa, i a fost
secveniat i clonat.
Dei, Clostridium perfringens a fost asociat cu gastroenteritele nc din
1895, prima demonstraie clar a faptului c este agentul etiologic al unor
toxiinfecii alimentare a fost fcut de Mc Clung care a cercetat epidemii
n care au fost implicate ginile. Primul raport detaliat al caracteristicilor
sindromului toxiinfeciilor alimentare a fost cel al lui Hobbs n Marea
Britanie. Cu toate c britanicii erau contieni c acesta reprezint cauza
toxiinfeciilor alimentare prin anii 1940-1950 au fost nregistrate puine
incidente nainte de 1960.
C. perfringens este un anaerob teluric, saproft, cu rspndire universal:
sol, ap, aer, alimente de origine vegetal sau animal, nesterilizate. De
138
asemenea, se gsete pe tegumentele i mucoasele externe i interne, find
un comensal al acestora. A fost izolat de la om, din organele interne, n care
se gsete n stare latent.
4.2.2. Istoric
Germenul a fost izolat pentru prima dat de Achalme (1891),
numindu-l Bacillus aerogenes capsulatus, apoi de Welch i Nuttall (1892)
de la om cu gangren gazoas. Froenkel (1893) l denumete Bacillus
phlegmonis emphysematosae. Klein (1895) i schimb numele n Bacillus
enteritidis sporogenes, Veillon i Zuber (1898) propun denumirea de
Bacillus perfringens, Migula (1900), Bacillus welchii, n cinstea cercet-
torului american Welch, iar Holland (1920), l ncadreaz n genul
Clostridium.
Tabelul 4.5
Agenii clasici ai gangrenei gazoase i speciile Clostridium mai rar ntlnite n
procesele gangrenoase
Agenii clasici ai
gangrenei gazoase
Specii mai rar prezente n procese gangrenoase
C. histolyticum
C. perfringens
C. novyi A, B
C. septicum
C. sporogenes
C. diffcile
C. sphenoides
C. cRNAis
C. innocuum
C. indolis
C. beijerinckii
C. paraperfringens
C. fallax
C. subterminale
C. tertium
C. cochlearium
C. putrifcum
C. perenne (imobil)
C. novyi tip C
C. ramosum
C. cadaveris
C. pseudotetanicum
Evid n inf. gangre-
noase la animale:
C. chauvoei
C. limosum
4.2.3. Morfologie
C. perfringens este un bacil scurt i gros, de 0,6-2,4/1,3-19,0, cu ca-
petele retezate, dispus n perechi sau lanuri scurte, formeaz, uneori, fla-
mente (mai ales cei din tipul C). Este Gram pozitiv n culturi tinere, iar
n cele vechi sau cu pH acid, devine Gram negativ. n organismul animal
majoritatea tulpinilor posed capsul, n care predomin polizaharidele.
Capsula se coloreaz prin metodele de evideniere a cililor. Prin meto-
dele Giemsa i Gram, capsula apare ca un halou subire, necolorat, n jurul
bacilului. Este necilogen. Este sporogen, ns sporul nu se evideniaz
prin metodele obinuite de evideniere. Acesta este oval, cu dimensiuni de
0,4-0,6, situat central sau subterminal, deformnd celula vegetativ sub
139
form de sticl de lamp de petrol (sau brcu).
Rezistena la factorii de mediu
C. perfringens se dezvolt uor pe mediile pentru anaerobi. Toate
tipurile tulbur intens i uniform mediile lichide, deja dup cteva ore
dac se nsmneaz abundent. Ulterior, mediile se clarifc i cultura
sedimenteaz. Dup dezvoltarea germenilor n bulion cu fcat, fragmentele
de fcat iau o culoare roiatic, iar n mediile cu glucide fermentescibile se
dezvolt o cantitate abundent de gaz cu miros rnced.
Pe suprafaa mediilor solide formeaz colonii rotunde, convexe cu
diametrul de 2-5 milimetri, cenuii-glbui, transparente cu morfologii
diferite: lucioase cu margini regulate (S), rugoase cu margini festonate (R)
i unele asemntoare cu primele, dar de consisten mucoas (M). Coloniile
S i M conin bacili mai scuri i mai groi, iar coloniile R flamentoase. n
coloniile M germenii capsuleaz.
n geloza Veillon formeaz colonii lenticular-discoidale, opace, unele
cu form de tricorn, perpendiculare una pe alta i o producie abundent de
gaz care dilacereaz mediul, efect ce a inspirat i numele speciei.
C. perfringens este unul dintre anaerobii cei mai tolerani fa de
oxigenul liber, dezvoltndu-se n suprafa la o presiune de 40 mm Hg, cu
pH optim 7,0. Temperatura optim este de 45C, pentru tipurile A, D, E, iar
tipurile B i C cresc la fel de bine la 37C i 45C, cu limite de 18-47C,
avnd o uoar termoflie, proprietate ce st la baza unor metode de izolare.
S-au identifcat i tulpini care, cresc bine i la 6C un numr limitat de
pasaje i care nu sunt cu adevrat psihrofle.
Tulpinile de Clostridium perfringens izolate din muchiul de cal s-au
dezvoltat fr mrirea perioadei de lag, la un Eh (potenial redox) de -45
sau mai puin. Valorile de Eh pozitive au avut drept efect mrirea perioadei
de lag.
Cu toate c se cultiv uor pe medii obinuite, pentru sporulare necesit
medii speciale (Duncan i Strong) sau folosirea unor tehnici speciale (sacii
de dializ).
Clostridium perfringens este mezofl. Temperatura optim se situeaz
ntre 37C i 45C. Temperatura minim este de 20C i cea maxim de
50C.
Dezvoltarea optim n mediu cu tioglicolat pentru 6 tulpini a fost ntre
30 i 40C. Temperatura optim pentru sporulare n mediul Ellner a fost ntre
37-40C. Creterea la 45C n condiii optime duce la scurtarea timpului de
140
generaie la 7 minute. n ceea ce privete pH-ul majoritatea tulpinilor cresc
ntre 5-8,5.
Cea mai joas valoare a a
w
pentru cretere i germinare se situeaz
ntre 0,97 i 0,95 n medii cu sucroz sau cu NaCl, sau 0,93 n medii cu
glicerol folosind o baz fuid de tioglicolat.
Cu toate c tipul A a crescut la un pH de 5,5, nu a sporulat i nu a
produs nici o toxin.
Clostridium perfringens nu este la fel de strict la condiiile de
anaerobioz ca i celelalte clostridii. Dezvoltarea sa a avut loc iniial la un
Eh de +320mV. Pentru dezvoltare, pe lng biotin, pantotenat, tiridoxal
adenin are nevoie de cel puin 13 aminoacizi.
Este un germen heterofermentativ i descompune un numr mare de
carbohidrai. Dezvoltarea sa este inhibat de NaCl 15%.
Endosporii tulpinilor ce produc toxiinfecii alimentare difer prin
rezistena lor la temperaturi nalte. Unii au o rezisten tipic, alii sunt
mezofli, iar civa sunt extrem de rezisteni.
Au fost raportate valori AD
100C
de 0,31 pentru Clostridium perfringens
(ATCC 3624) i o valoare de 17,6 pentru tulpina NCTC 8238.
Pentru 8 tulpini care au determinat reacii la iepure, valoarea D
100C
a
variat de la 0,70 la 38,37.
Diferenele de sensibilitate la cldur n cadrul tulpinilor de Clostridium
perfringens sunt asociate cu posesia genei cpe. Valorile D
100C
pentru 13
izolate din carne, psri i pete, cnd gena cpe este de origine cromozomal
sunt cuprinse ntre 43 i 170, n timp ce o tulpin nonepidemic care
poart gena cpe pe plasmide a avut valoarea 3. Aceti autori au observat
c tulpinile epidemice posed n mod tipic valori de peste 40, n timp ce
tulpinile nonepidemice mai puin de 2.
Distrugerea celulelor vegetative de Clostridium perfringens prin
cldur la temperaturi mai joase, perioade mai lungi de timp (LTLT) a fost
studiat la cteva grupe. Pentru tulpina ATCC 13124 din carne de viel
mrunit i autoclavat, D
56,8C
a fost de 48,3 minute similar cu D
56,8C
sau
D
47,9C
pentru fosfolipaza C. Folosind tulpina NCTC 8798 valorile D pentru
celule au fost mai mari o dat cu creterea temperaturilor n carnea de vit
autoclavat.
Pentru celulele crescute la 37C, D
59C
a fost de 3,1 minute; celulele
crescute la 45C au avut D
59C
de 7,2 minute; celulele crescute la 49C au
avut D
59C
de 10,6 minute.
Un alt factor important n rezistena la cldur l reprezint mediul
chimic. Alderton i Snell au artat c rezistena sporilor la cldur este
n mare parte o proprietate inductibil, reversibil chimic ntre o stare
141
senzitiv i una rezistent. Folosind aceast ipotez s-a artat c sporii devin
mai rezisteni la cldur dac sunt tratai cu soluii de acetat de calciu (de
exemplu, 0,1 sau 0,5M la pH 8,5 pentru 140 de ore la 50C). Prin aceast
metod rezistena sporilor la cldur poate f crescut de la 5 la 10 ori. Pe
de alt parte rezistena la cldur poate f sczut prin meninerea sporilor
n 0,1 N HCl la 25C pentru 16 ore sau prin meninerea endosporilor n
mncruri cu pH acid.
Supravieuirea la congelare n piureul de pasre a fost studiat de
Strong i Canada care au descoperit c doar 4% din celule au supravieuit
la -17,7C, 180 de zile. Sporii uscai au avut o rat de supravieuire de 40%
dup 90 de zile i de 11% dup 180 de zile.
Tipizarea cu bacteriocin a fost realizat la tipul A. A fost realizat pe
90 de tulpini neimplicate n epidemiile alimentare cu un set de 8 bacteriocine
i 85,6% reprezentate de tipurile de bacteriocin de la 1 la 6.
Oxigenul este nociv pentru formele vegetative. Expunerea plcilor
Petri cu medii solide la contactul cu aerul, dup scoaterea din anaerostat,
la temperatura camerei sau la 40C, 10-18 ore, determin moartea
unor tulpini, ne mai find posibil transplantarea lor. C. perfringens este
sensibil la penicilin, cloramfenicol, eritromicin, tetraciclin, ampicilin,
clindamicin, metronidazol i rezistent la streptomicin, kanamicin,
negamicin, polimixine (B, E).
Sporii sunt distrui la 100C n 2-3 minute, cu excepia tipului F ai
crui spori rezist la aceast temperatur pn la 2 ore.
n culturile de diferite tipuri apar bacteriofagi specifci pentru C.
perfringens, clasifcai n cinci grupe fagice. Bacteriofagii viruleni s-au
gsit n apele de canal i n rurile poluate. Unele tulpini de tip A, B, C sunt
lizogene, pe cnd cele de tip D i E nu sunt. Tulpinile cu colonii S i R sunt
sensibile la bacteriofagi, iar cele mucoase sunt rezistente.
Majoritatea tipurilor sunt hemolitice, cu excepia tipului A izolat din
focare de toxiinfecii alimentare cu activitate lecitinazic intens.
n laptele turnesolat formeaz coagul caracteristic, alveolar, buretos,
cu lichid limpede, glbui, cu turnesolul redus mai accentuat n partea
inferioar a tubului. n bulion cu snge hemolizeaz eritrocitele, iar mediul
ia o culoare brun, cu miros butiric. n mediile cu creier se dezvolt, dar nu
le nnegrete, ci le imprim o culoare roie.
Pe mediul Zeissler cu snge de iepure, oaie, bou sau om, majoritatea
coloniilor sunt nconjurate de o zon larg de hemoliz, format din dou
142
subzone: una clar sub colonie i n imediata ei vecintate (hemoliz teta) i
una mai puin clar, brun, murdar, netransparent, la periferie (hemoliz
alfa), care se intensifc la 4C. Unele tulpini de tip B i C produc pe mediul
Zeissler cu snge de oaie sau bou hemoliz delta, ntre hemoliza teta i
alfa.
Este puternic sulftoreductor, nnegrind rapid mediile de cultur cu
sulft de sodiu i un compus feric (mediile Wilson-Blair, Kondratieva).
Fermenteaz cu producere de acizi i gaze majoritatea glucidelor.
Hidrolizeaz amidonul, lichefaz gelatina, nu produce indol. Testul CAMP
este pozitiv, folosind ca tulpin indicator Streptococcus agalactiae, al
crui factor defuzibil intensifc hemoliza parial dat de toxina alfa i
C. perfringens. Pe mediul cu lecitovitelin (emulsie de glbenu de ou) d
reacia Nagler pozitiv, iar pe mediul Willis-Hobbs, vireaz culoarea.
Tulpinile de C. perfringens posed antigene somatice comune speciei,
precum i unele cu specifcitate de tip, n cadrul crora s-au identifcat mai
multe subtipuri.
Astfel, tulpinile de tip A care produc toxiinfecii alimentare au fost
difereniate n 19 tipuri aglutinante.
4.2.7. Patogenitate
C. perfringens i manifest patogenitatea prin virulen i
toxigenez.
Exotoxina este o protein cu structur complex. Pn n prezent
s-au studiat 14 factori numii toxine sau antigene, majore i minore. Dintre
acestea, patru sunt toxine letale majore (alfa, beta, epsilon, iota) pe care se
bazeaz ncadrarea tulpinilor de C. perfringens n tipurile toxigene A, B, C,
D, E. Alte 10 sunt toxine minore, care pot avea sau nu rol n patogenitate
(gamma, delta, eta, teta, kapa, lambda, miu, niu, i neuraminidaze) precum
i enterotoxina responsabil de toxiinfeciile alimentare.
Toxina alfa (lecitinaza) a fost descris nc din 1908 de ctre
Mecinicov. n 1939, Nagler a constatat c fltratul unei tulpini toxigene de
C. perfringens tulbur serul uman, fenomen numit reacia Nagler, iar Mc
Farlane i Knight, n 1941, au dovedit pentru prima dat natura enzimatic
a toxinelor bacteriene, toxina alfa a C. perfringens find o hemolizin
lecitinazic sau mai precis o fosfolipaz C. Tot ei constat c toxina
alfa tulbur i soluia limpede de lecitovitelin. Aparena opalescenei
143
lecitovitelinei i a serului uman, ct i opaciferea din mediile solide sunt
inhibate de serul antialfa. Acest test (TLV) se folosete att n scop de
diagnostic, ct i pentru titrarea serului antiperfringens.
Toxina alfa este singura toxin pur, o lecitinaz. Ea reprezint
factorul major responsabil de aciunea mionecrotic n gangrena gazoas
(V. Secaiu) a lui C. perfringens. Toxina activ este o metaloprotein cu
zinc, find activat de ionii de calciu i inhibat de fosfai, citrai etc.
Toxina alfa are efect letal, necrotic i hemolitic, crete permeabilitatea
vascular i afecteaz activitatea cordului, determinnd hipotensiune,
bradicardie i ca o consecin, ocul, adesea fatal, ntlnit n gangrena
gazoas.
Toxina beta este toxina principal a tulpinilor B i C, termolabil,
nehemolitic. Are aciune letal i necrozant local, produce necroz
n intestin sau n tegument, iar general, la inocularea intravenoas, prin
eliberarea de catecolamine endogene, crete permeabilitatea vascular i
tensiunea arterial. Recent, s-a identifcat, pe baza determinrilor genetice
toxina beta 2, responsabil de tulburrile digestive n enterite la suine.
Toxina epsilon constituie toxina principal a tipului D i toxina
secundar a tipului B. Apare n mediile de cultur sub form de protoxin
devenind activ prin nvechire sub aciunea toxinelor kapa i lambda sau
sub aciunea enzimelor proteolitice, cum este tripsina. Toxina produce
creterea permeabilitii vasculare n mai multe organe, ntre care n rinichi,
unde produce congestie i hiperemie. n creier determin edem i necroza
esutului nervos. Produce efect citotoxic pentru macrofagele peritoneale, la
cobai i iepure.
Toxina iota reprezint toxina principal a tipului E, cu efect letal
dermonecrotic i creterea permeabilitii capilare. Este elaborat sub form
de protoxin, find activat de enzimele proteolitice. Este compus din dou
fracii imunologic i biochimic distincte: iota a i iota b.
Enterotoxina este o protein cu mas molecular de 35 Kdal,
inactivat de unele enzime proteolitice, dar nu de tripsin, chemotripsin
i papain. n anumite condiii, tripsina i intensifc activitatea necrozant
asupra pielii de cobai i activitatea hemaglutinant fa de eritrocitele de
iepure. Este termolabil.
Enterotoxina este un component al sporului i provine din citoplasma
formei vegetative. Se acumuleaz n cantitate mare, intracelular, sub form
de corpi incluzionali iar prin liza celulei este eliberat n intestin.
Enterotoxina acioneaz asupra enterocitelor, alternd permeabilitatea
mucoasei intestinale. Are o aciune parasimpaticomimetic. n intestin,
pe lng creterea permeabilitii vasculare, stimuleaz i activitatea
144
glandular. Produce o hipersecreie exocrin a pancreasului. Asupra pielii
are efect eritematogen, fenomen folosit ca test n determinrile cantitative
ale enterotoxinei, considerat de o mie de ori mai sensibil dect testul ansei
ligaturate.
Cantiti mici de enterotoxin i de alte toxine de C. perfringens se
absorb n tubul digestiv i trec n circulaia sanguin inducnd formarea de
antitoxine.
Numai unele dintre toxinele minore prezint importan pentru
tipizarea tulpinilor: delta, lambda, miu i niu.
Toxiinfeciile alimentare sunt produse de enterotoxin. Fiind o protein
spor specifc producia acesteia are loc odat cu sporularea. Toate cazurile
de toxiinfecii alimentare cunoscute se datorez tulpinilor de tip A.
Enterita necrotic o boal raportat n Noua Guinee este produs de
toxina beta a tipului C. Aceasta a fost asociat cu o rat a mortalitii de 35-
40% n timp ce toxiinfeciile alimentare datorate tulpinilor tipului A au fost
fatale numai la persoanele btrne sau debile.
Enterotoxina tulpinilor din tipul A a fost demonstrat de ctre Duncan
i Strong. Enterotoxina purifcat are o greutate molecular de 35.000 daltoni
i un punct izoelectric de 4,3. Este sensibil la cldur (este distrus la 60C
n 10 minute) i pronaz, dar rezistent la tripsin, chimotripsin i papain.
ntr-un studiu s-a artat c formele L ale lui Clostridium perfringens produc
la fel de multe enterotoxine ca i formele clasice.
Enterotoxina este sintetizat n ultimele stadii ale sporulrii. Maximul
de toxin se produce chiar nainte de liza sporangiului, iar endotoxina
este eliberat odat cu endosporii. Condiiile care determin sporularea
favorizeaz i producia de enterotoxin, iar acest lucru a fost demonstrat
cu rafnoz, cafein i teobromin. n ultimii doi compui cantitatea de
enterotoxin poate ajunge de pn la 450 g/ml. S-a artat c aceasta este
similar cu proteinele structurale ale endosporilor asociate covalent cu
nveliul acestuia. Celulele sporuleaz liber n tractul intestinal precum i
ntr-o varietate mare de alimente.
O singur gen cpe este responsabil pentru producerea de enterotoxin.
La tulpinile de tip A este de origine cromozonal, n timp ce la tulpinile,
care nu produc toxiinfecii alimentare este de origine plasmidic.
ntr-un mediu de sporulare, enterotoxina a aprut la 3 ore de la
inocularea celulelor vegetative. Trei tulpini de Clostridium perfringens au
produs n mediul DS (Duncan-Strong) ntre 1 i 100 g/ml de enterotoxin,
dup 24-36 de ore. S-a sugerat c enterotoxina preformat poate exista n
unele alimente i contribuie foarte rar la declanarea simptomelor.
Enterotoxina lui Clostridium perfringens (CPE) nu este un superantigen,
145
cum sunt enterotoxinele staflococice. Proteina CPE conine 319 aminoacizi
i se leag de claudin i/sau un receptor membranal eucariotic de 50
KDa, care duce la formarea unui complex CPE de 90 KDa n membranele
celulei gazd. Un complex mai mare de 160 KDa se formeaz prin adiia
la proteinele membranei celulare ale celulei gazd, care n fnal duce la
inducerea schimbrilor de permeabilitate n membranele celulare i moartea
celulelor gazd.
Specia receptiv este cobaiul inoculat pe cale intramuscular, la care
se produce o gangren gazoas la locul de inoculare, asemntoare cu cele
reproduse cu C. chauvoei i C. septicum. Mioliza este prezent la tipurile A,
C, D, E i lipsete la tulpinile de tip B.
Alte specii receptive sunt oarecele i obolanul.
Toxinele diferitelor tipuri produc diverse modifcri la animalele de
experien. Astfel, la oareci i cobai inoculai subcutanat produc: edem,
gangren gazoas i distrofa organelor interne. La obolan calea cea mai
sever este cea intraperitoneal. La oarece i iepure, toxina se inoculeaz
cel mai frecvent intravenos pentru toxinotipia tulpinilor.
Germen epift al tubului digestiv, condiionat patogen, provoac infecii
la mamifere i unele psri. Pe primul loc se situeaz ovinele, urmate de
caprine, taurine i suine.
Receptivitatea este condiionat de factori intrinseci (specie, vrst,
ras, stare de ntreinere) i extrinseci (alimentaie, frig, cldur excesiv,
stres). Principalele infecii ntlnite la animale i om, clasifcate dup
biotipuri sunt (V. Secaiu):
tipul A produce gangren la om i cabaline, toxiinfecii
alimentare la om;
tipul B produce dizenteria anaerob a mieilor i enterotoxiemii
la oile adulte;
tipul C enterotoxiemii la oi, iar unele subtipuri enterotoxiemii
la viei, miei, purcei, pui;
tipul D enterotoxiemii la miei i oi adulte, boala rinichiului
moale la capre i bovine;
tipul E cu grad de patogenitate mai redus, izolndu-se uneori
din enterite de la ovine i taurine;
146
tipul F enterit necrotic la om.
4.2.10. Prevenire i combatere
Sindromul gastroenteritei produse de Clostridium perfringens poate f
prevenit prin luarea unor msuri adecvate, care duc la ndeprtarea cauzelor
principale ale toxiinfeciilor alimentare de toate tipurile. Deoarece acest
sindrom apare de obicei n cantinele instituionale, trebuiesc luate precauii
speciale.
Bryan a construit un grafc cu timpul i temperatura, n care s-a
produs mbolnvirea studenilor i profesorilor, ntr-o cantin de coal prin
consumul de carne de curcan cu enterotoxin. S-a ajuns la concluzia c
sosul i carnea au fost responsabile pentru boal, ci nu garnitura.
Pentru a preveni reapariia unor astfel de episoade, aceti cercettori
au sugerat 9 pai pentru prepararea curcanului i a garniturii.
Fig. 4.1. Relaia dintre timp i temperatur n timpul preparrii crnii de curcan n
cantina unei coli dup Bryan et al.
Gtirea curcanului se face pn cnd temperatura intern n piept 1.
ajunge la cel puin 73,8C sau mai mult.
Splarea meticuloas i sanitizarea tuturor vaselor i a echipamentelor 2.
n care s-a pregtit curcanul crud.
Splarea minilor i folosirea mnuilor de plastic de unic folosin 3.
la dezosare, mrunire i alte prelucrri.
Separarea crnii de sos nainte de rcire. 4.
147
Rcirea s se fac ct mai rapid dup prelucrare. 5.
Folosirea tvilor mai puin adnci pentru pstrarea la frigider. 6.
Se aduce zeama n care a fert curcanul la temperatura de ferbere 7.
nainte de a face sosul sau garnitura.
Garnitura se ferbe pn ajunge la 73,8C sau mai mult. 8.
nainte de servire se nclzesc bucile de curcan n sos pn la 9.
73,8C.
4.2.11. Metode de izolare i identifcare a lui C. perfringens din
alimente
Transportul probelor la laborator
Probele se transport i se examineaz rapid, fr congelare,
inndu-se la 10C, pn la examinare. Dac analiza nu se poate realiza
n decurs de 8 ore, iar proba trebuie transportat la laborator, aceasta se
trateaz cu soluie salin, glicerinat, tamponat.
Se folosete o tehnic aseptic pentru prepararea probei n vederea
pstrrii sau a transportului. O poriune de 25 de grame de prob se transfer
ntr-un sac de plastic. Se adaug 25 de mililitri de soluie salin glicerinat,
tamponat i se elimin aerul din sac. Probele lichide, cum ar f: sosurile
sau sucurile de carne, trebuiesc amestecate bine cu un volum egal de soluie
fziologic glicerinat, tamponat, de concentraie dubl.
Probele tratate cu glicerin se pstreaz de la -20C la -32C ntr-
un congelator sau cu ghea uscat, astfel nct congelarea s se produc
ct mai rapid. Pentru analiza n laborator, probele se decongeleaz i se
transfer mpreun cu soluia fziologic salin glicerinat, ntr-un blender
steril. Se adaug 200 mililitri de pepton diluat i se ncepe examinarea.
Aparatur i materiale
blender de nalt vitez i vase de sticl sau metal de 1 litru cu V
capac;
jar anaerob, BBL, Gas Pak sau Oxoid; V
incubator 35C; V
numrtor de colonii, Quebec sau echivalent; V
pipete serologice de 1 mililitru cu gradaii de 0,1 mililitri i pipete V
de 10 mililitri cu gradaii de 1 mililitru;
plci Petri sterile, 15 x 100 milimetri; V
ans de platin, 3 milimetri. V
148
Medii i reactivi
TSC (triptoz-sulft-cicloserin) (M85); V
bulion cu fcat (M34); V
bulion cu tioglicolat, cu sau fr resazurin; V
bulion cu lapte i fer; V
bulion cu lactoz i gelatin; V
bulion de sporulare; V
mediul pentru mobilitate cu nitrat; V
reageni pentru detectarea nitriilor; V
soluia cu sare glicerinat; V
reactivi pentru coloraia Gram; V
soluie de albastru de bromtimol 0,04%. V
Izolare i identifcare
Identifcarea acestei specii se bazeaz pe urmtoarele caracteristici
principale:
morfologia specifc i proprietile tinctoriale: bacil relativ scurt
i cu capetele tiate drept, Gram pozitiv;
lipsa mobilitii (marea majoritate a clostridiilor sunt mobile);
fermentarea tumultoas i acidiferea glucozei, lactozei i
zaharozei;
posibilitatea de a se multiplica la 45-47C;
producerea de hidrogen sulfurat;
capacitatea de a liza hematiile de oaie i de a produce lecitinaz.
Procedee de cultivare
Se execut frotiuri colorate Gram din proba alimentar. Se examineaz
pentru bacili Gram pozitivi mari.
Tehnica determinrii prezenei i a numrului de bacterii de C.
perfringens direct de pe mediile solide:
1. n plci Petri:
Se amestec ntr-un blender steril 25 de grame de prob alimentar cu
225 de mililitri de diluant cu pepton i se amestec 1-2 minute la 10.000-
12.000 rpm.
149
Se prepar diluii seriate de la 10-1 la 10-6 prin transferul a 10 mililitri
din diluia anterioar n 90 de mililitri de diluant cu pepton. Se toarn 6-7
mililitri de agar TSC (triptoz-sulft-cicloserin), fr glbenu de ou, n
fecare dintre cele 12 cutii Petri de 15 x 100 milimetri. Cnd agarul s-a
solidifcat se transfer aseptic 1 mililitru din fecare diluie de omogenat
n duplicat n centrul fecrei plci Petri. Se adaug 15 mililitri de agar
TSC fr glbenu de ou i se amestec prin rotaie uoar. Dup ce agarul
s-a solidifcat, plcile se plaseaz vertical ntr-un jar anaerob. Se stabilesc
condiiile de anaerobioz i se plaseaz jarul la 35C, 20-24 de ore. Dup
incubare, se examineaz plcile pentru formarea de colonii negre.
Se selecteaz plcile care prezint ntre 20 i 200 de colonii negre.
Se utilizeaz un numrtor de colonii Quebec i se calculeaz numrul de
clostridii per gram de aliment. Se pstreaz placa Petri pentru testele de
identifcare.
2. n eprubete:
Se prepar bulionul cu fcat prin nclzire 10 minute, n ap clocotit
sau cu vapori continui i se rcete rapid fr agitare. Se toarn n fecare
eprubet inoculat agar TSC. Se omogenizeaz bine inoculul prin rotirea
uoar a eprubetelor n palme pentru a se evita formarea bulelor de aer. Se
introduc ntr-un vas cu ap rece. Se toarn apoi agar cu tioglicolat n fecare
eprubet ntr-un strat de aproximativ 2 centimetri.
Se introduc din nou eprubetele ntr-un vas cu ap rece pentru
solidifcarea rapid a mediului de cultur. Se incubeaz 18-24 de ore, la
35C. Se numr coloniile caracteristice, n eprubetele n care s-au dezvoltat
ntre 5 i 20.
Teste de confrmare prezumptiv
Prezena unor bacili Gram pozitivi, scuri, cu capete tiate drept, n
frotiurile efectuate Gram, precum i dezvoltarea unor colonii lenticulare n
geloza Veillon (M5), cu zone de hemoliz n agarul Zeisler i Willis-Hobbs
se consider prezen de C. perfringens.
Testul prezumptiv n lapte cu fer: se inoculeaz un mediu modifcat
de lapte-fer, cu 1 mililitru de cultur de tioglicolat lichid, cu cretere intens
i se incubeaz la 46C, n baie marin. Dup 2 ore, se verifc din or n
or pentru fermentare puternic. Aceast reacie se caracterizeaz printr-o
coagulare rapid a laptelui, urmat de transformarea cheagului ntr-o mas
spongioas, care de obicei se ridic la suprafa.
Culturile care prezint o fermentare puternic n decurs de 5 ore sunt
150
considerate pozitive. Ocazional, o tulpin poate necesita chiar i 6 ore
sau mai mult pentru producerea fermentrii, dar acesta este considerat un
rezultat ndoielnic ce trebuie controlat prin alte teste de confrmare.
Teste de confrmare defnitiv
Se inoculeaz cultura bacterian din mediul cu tioglicolat lichid sau
o poriune de colonie de pe agarul TSC, n mediile cu lactoz, gelatin i
mediul de mobilitate cu nitrat tamponate. Se perforeaz lactoza (gelatina) n
mod repetat cu un ac drept pentru a ne asigura c inocularea este corect i
se cltete ansa ntr-un pahar cu ap cald, nainte de fambare pentru a evita
spargerea. Se incubeaz mediile inoculate 24 de ore la 15C.
Se examineaz cultura de pe mediul lactoz-gelatin, pentru producerea
de gaz i pentru modifcarea culorii din rou n glbui, ceea ce arat producia
de acid. Tuburile se rcesc o or la 5C i se controleaz pentru licheferea
gelatinei. Dac mediul nu se gelatinizeaz, se mai incubeaz 24 de ore, la
35C i se controleaz din nou.
Se inoculeaz bulionul de sporulare cu 1 mililitru de cultur de
mediu tioglicolat lichid i se incubeaz 24 de ore la 35C. Se efectueaz un
frotiu colorat Gram, i se examineaz microscopic pentru spori. Culturile
sporulate se pstreaz la 4C, dac se dorete efectuarea n continuare a
testrii izolatelor.
C. perfringens nu este mobil. Se examineaz tuburile cu mediul de
mobilitate cu nitrat, n lumin transmis pentru tipul de cretere de-a lungul
liniei de nsmnare. Microorganismele imobile cresc numai n i de-a
lungul acestei linii, iar cele mobile produc o cretere difuz n mediu.
Reducerea nitrailor n nitrii: Se adaug 0,5 mililitri de reactiv A i
0,2 mililitri de reactiv B, la o cultur dintr-un mediu de mobilitate cu nitrat
tamponat. Culoarea violet dezvoltat n decurs de 5 minute arat prezena
nitriilor. Dac nu apare nici o culoare se adaug cteva granule de pulbere
de zinc i se las n repaus cteva minute. Un test negativ (neapariia culorii
violet) dup adugarea prafului de zinc, arat c nitraii au fost redui complet.
Un test pozitiv (apariia culorii violet) indic faptul c microorganismul este
incapabil s reduc nitraii.
Rezultatele se nregistreaz n tabele.
C. perfringens este identifcat prezumptiv, ca bacil Gram pozitiv, ce
produce colonii negre n agar TSC, reduce nitraii n nitrii, fermenteaz
lactoza, cu eliberare de acid i gaz i lichefaz gelatina dup 48 de ore.
Este de ateptat ca unele tulpini s produc reacie pozitiv n mediul de
sporulare. Microorganismele suspecte, care nu ndeplinesc ns criteriile
151
menionate se vor testa n continuare.
Se execut subculturi din izolatele care sunt non-motile, reduc nitratul,
fermenteaz lactoza, cu producere de acid i gaz i lichefaz gelatina n 48
de ore, ntr-un mediu lichid cu tioglicolat.
Se incubeaz 24 de ore la 35C i se efectueaz un frotiu colorat Gram
i se controleaz pentru puritate i pentru morfologia celular tipic.
De cele mai multe ori bacteriile din alimente se gsesc n stare latent.
Activarea lor se face mai greu n medii solide, motiv pentru care produsul
de cercetat se inoculeaz mai nti n medii lichide, n care se realizeaz nu
numai revigorarea germenilor, dar i nmulirea acestora.
Din produsul omogenizat i din fecare diluie se inoculeaz cte un
mililitru n cte o eprubet cu bulion cu fcat sau bulion cu tioglicolat, cu sau
fr resazurin sau cu bulion-glucoz-amidon-cistin.
Dac se urmrete prezena lui C. perfringens ntr-o cantitate mai
mare de produs (10, 100 grame) se vor folosii volume mai mari de mediu.
n general, proporia ntre inocul i mediu trebuie s fe de 1/5-1/10.
Mediile inoculate se incubeaz la 45C, 24 de ore i se observ din or
n or, ncepnd cu a cincia or de incubare. n momentul apariiei primelor
bule de gaze se fac treceri prin striere pe mediile Zeisller sau Willis-Hobbs
turnat i solidifcat n plci Petri. Acestea se incubeaz la 45C, 24-48 de
ore. Se citete rezultatul prin observarea coloniilor specifce pentru C.
perfringens.
Pe mediul Zeisller, C. perfringens formeaz colonii mari, netede,
lucioase, uor bombate, opace, uneori pigmentate n verde, nconjurate de o
zon de hemoliz beta i de o zon mai mare de hemoliz incomplet.
Pe agarul Willis-Hobbs formeaz colonii roii (fermentarea lactozei)
nconjurate de un halou opac (activitatea lecitinazic).
152
Fig. 4.2. Agar cu snge nsmnat cu
Clostridium perfringens. Colonii de
dimensiuni diferite (mici i medii) de culoare
gri sau gri-galben i translucide.
Fig. 4.3. Agar cu snge nsmnat cu Clostridium perfringens examinat sub fascicul de
lumin. Colonii nconjurate de cte un inel dublu de hemoliz.
Fig. 4.4. Clostridium botulinum Fig. 4.5. Clostridium perfringens
153
Anellis.A., and D. Berkowitz. 1977. Comparative dose-survival curves of 1.
representative Clostridium botulinum type F spores with type A and B spores.
Angulo, F.J., J. Getz, J.P. Taylor. K.A. Hendricks, E.L. Hathaway, S.S. Barth, H.M. 2.
Solomon, A.E. Larson, E.A. Johnson, L.N. Nickey, and A A. Reis. 1998. A large
outbreak of botulism: The hazardous baked potato./ Infect. Dis. 178:172-177.
Anniballi, F.L. Fenicia, G. Franciosa, and P. Aureli. 2002. Infuence of pH and 3.
temperature on the growth of and toxin production by neurotoxigenic strains of
Clostridium butyricum type E. J. Food Protet. 65:1267-1270.
Austin, J.W., and K.C. Dodds. 2001. 4. Clostridium botulinum. In Foodborne Disease
Handbook, Vol. 1, 2nd ed., ed. Y.H. Heu, M.D. Pierson, and J.R. Gorham, 107-
138. New York: Marcel Dekker.
Baker, D.A., and C. Genigeorgis. 1990. Predicting the safe storage of fresh fsh 5.
under modifed atmospheres with respect to Clostridium botulinum toxigenesis by
modeling length of the lag phase of growth. J. Food Protect. 53:131-140.
Beecher, D.J., J.L. Schoeni, and A.C.L. Wong. 1995. Enterotoxic activity of 6.
hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun. 63:4423-428.
Beecher, D.J., J.S. Pulido, N.P. BRNAey, and A.C.L. Wong. 1995. Extracellular 7.
virulence factors in Bacillus cereus en dophthalmitis: Methods and implication of
involvement of hemolysin BL. Infect. Immun. 63:632-639.
Bradshaw, J.G., G.N. Stelma, V.I. Jones, J.T. Peeler, J.G. Wimsatt, J.J. Corwin, and 8.
R.M. Twedt. 1982. Thermal inactivation of Clostridium perfringens enterotoxin in
buffer and in chicken gravy. J. Food Sci. 47:914-916.
Barnes. E., and M. Ingram. 1956. The effect of redox potential on the growth of 9.
Clostridium welchii strains isolated from horse muscle. J. Appl. Bacteriol. 19:117-
128
Bryan. F.L.. T.W. McKinely. and B. Mixon. 1971. Use of time-temperature 10.
evaluations in detecting the responsible vehicle and contributing factors of
foodborne disease outbreaks. J. Milk Food Technol. 34:576-582.
Byrne, M.P., T.J. Smith, V.A. Montgomery, and L.A. Smith. 1998. Purifcation, 11.
potency, and effcacy of the botulinum neurotoxin type A binding domain from
Pichia pastoris as a recombinant vaccine candidate. Infect. Immun. 66:4817-
4822.
Christiansen, L.N., J. Deffner, E.M. Foster, and H. Sugiyama. 1968. Survival and 12.
outgrowth of Clostridium botulinum type E spores in smoked fsh. Appl. Microbiol.
16:133-137.
Ciccarelli, A.S., D.N. Whaley, L.M. McCroskey.D.F. Gimenez, V.R. Dowell, 13.
Jr., and C.L. Hatheway. 1977. Cultural and physiological characteristics of
Clostridium botulinum type G and the susceptibility of certain animals to its toxin.
Craig, J., and K. Pilcher. 1966. 14. Clostridium botulinum type F: Isolation from
154
salmon from the Columbia River. Science. 153:311-312.
Creti, R., L. Fenicia, and P. Aureli. 1990. Occurrence of 15. Clostridium botulinum in
the soil of the vicinity of Rome. Curr. Microbiol. 20:317-321.
Crisley, F.D., J.T. Peeler, R. Angelotti, and H.E. Hall. 1968. Thermal resistance of 16.
spores of fve strains of Clostridium botulinum type E in ground whitefsh chubs.
J. Food Sci. 33:411-416.
Damgaard, PH., H.D. Larsen. B.M. Hansen, J. Bresciani, and K. Jorgensen. 1996. 17.
Enterotoxin-producing strains of Bacillus thuringiensis isolated from food. Lett.
Appl. Microbiol. 23:146-150.
Dodds, K.L. 1989. Combined effect of water activity and pH on inhibition of toxin 18.
production by Clostridium botulinum in cooked, vacuum-packed potatoes. Appl.
Duncan, C.L. 1973. Time of enterotoxin formation and release during sporulation 19.
of Clostridium perfringens type A. J. Bacteriol. 113:932-936.
Duncan, C.L. 1976. 20. Clostridium perfringens. In Food Microbiology: Public
Health and Spoilage Aspects, ed. M.P. deFigueiredo and D.F. Splittstoesser, 170-
197. Westport. CT: AVI.
Duncan, C.L., and D.H. Strong. 1968. Improved medium for sporulation of 21.
Clostridium perfringens. Appl. Microbiol. 16:82-89.
Duncan, C.L., and D.H. Strong. 1969. Ileal loop fuid accumulation and production 22.
of diarrhea in rabbits by cell live products of Clostridium perfringens. J. Bacteriol.
100:86-94.
Eklund, M., and F. Poysky. 1965. 23. Clostridium botulinum type E from marine
sediments. Science 149-306.
Fantasia. L.D.. and A.P. Duran. 1969. Incidence 24. of Clostridium botulinum type E
in commercially and laboratory dressed white fsh chubs. Food Technol. 23:793-
794.
Focgeding. P.M.. and F.F. Busta. 1980. 25. Clostridium perfringens cells and
phospholipase C activity at constant and linearly rising temperatures. J Food Sci.
45:018-924.
Genigeorgis. C.. 0. Sakaguchi, and H. Riemann. 1973. Assay methods for 26.
Clostridium perfringens type A enterotoxin. Appl. Microbiol. 26:111-115.
Gilbert. R.J. 1979. 27. Bacillus cereus gastroenteritis. In Food-borne infections and
intoxications, ed. H. Riemann and F.L. Bryan. 495-518. New York: Academic
Press.
Gilligan. PH.. L. Brown, and R.E. Berman. 1983. Differentiation of 28. Clostridium
diffcile toxin from Clostridium botulinum toxin by the mouse lethality test. Appl.
Gimenez, J.A., M.A. Gimenez, and B.R. DasGupta. 1992. Characterization of the 29.
neurotoxin isolated from a Clostridium baratii strain implicated in infant botulism.
Infect. Immun. 60:518-522.
Gimenez. D.F.. and A.S.Ciccarelli. 1970. 30. Anothcrlypcof Clostridium botulinum.
Zentral.Bakteriol. Orig. A 215:221-224.
Girardin. H.. C. Albagnac, C. Dargaignaratz. C. Nguyen-The, and F. Carlin. 31.
2002. Antimicrobial activity of foodborne Paembacillus and Bacillus spp. against
155
Clostridium botulinum. J. Food Protect. 65:806-813.
Goepfert. J.M.. and H.U. Kim. 1975. Behavior of selected foodborne pathogens in 32.
raw ground beef. J. Milk Food Technol. 38:449-452.
Goepfert. J.M.. W.M. Spira. and H.U. Kim. 1972. 33. Bacillus cereus: Food poisoning
organism. A review. J. Milk Food Technol. 35:213-227.
Goldner, S.B., M. Solbert, S. Jones, and L.S. Post. 1986. Enterotoxin synthesis 34.
by nonsporulating cultures of Clostridium botulinum. Appl. Environ. Microbiol.
52:407-412.
Granum. P.E., W. Telle, 0. Olsvik, and A. Stavn. 1984. Enterotoxin formation by 35.
Clostridium perfringens during sporu-lation and vegetative growth. Int. J. Food
Microbiol. 1:4349.
Griffths. M.W. 1990. Toxin production by psychrotrophic 36. Bacillus spp. present in
milk. J. Food Protect. 53:790-792.
Haggblom. MM., C. Apetroaie, M.A. Andersson. and M.S. Salkinoja-Salonen. 37.
2002. Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of Bacillus cereus,
produced under various conditions. Appl. Environ. Microbiol. 68:2479-2483.
Hall, J.D., L.M. McCroskey, B.J. Pincomb. and C.L. Hatheway. 1985. Isolation of 38.
an organism resembling Clostridium barati which produces type F botulinal toxin
from an infant with botulism. J. Clin. Microbiol. 21:654-655.
Hauge. S. 1955. Food poisoning caused by aerobic spore-forming bacilli. 39. J. Appl.
Bacterid. 18:591-595.
Hauschild. A.H.. and H. Hilsheimer. 1971. Purifcation and characteristics of the 40.
enterotoxin of Clostridium perfringens type A. Can. J. Microbiol 17:1425-1433.
Helgasoon. E.O.. A. tfkstad, D.A. Caugant, H.A. Johansen, A. Fouet, M. Mock, 1. 41.
Hegna.and A.-B. Kolsto. 2000. Bacillus anthracis, Bin illtu cereus, and Bacillus
thuringiensisOne species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ.
Microbiol. 66:2627-2630.
Hielm, S., J. Bjorkroth, E. Hyytia, and H. Korkeala. 1998. Prevalence of 42.
Clostridium botulinum in Finnish trout farms: Pulsed-feld gel electrophoresis
typing reveals extensive genetic diversity among type E isolates. Appl. Environ.
Microbiol. 64:4161-4167.
Hobbs, B.. M. Smith, C. Oakley, G. Warrack. and J. Cruickshank. 1953. 43. Clostridium
welchii food poisoning. J. Hyg. 51:75-101.
Huhtanen. C.N.. J. Naghski, C.S. Custer, and R.W. Russell. 1976. Growth and 44.
toxin production by Clostridium botulinum in moldy tomato juice. Appl. Environ.
Huss. H.H. 1980. Distribution of 45. Clostridium botulinum. Appl. Environ. Microbiol.
39:764-769.
I 1(1 Sperber, W.H. 1983. Infuence of water activity on foodborne bacteriaA 46.
review. J Food Protect. 46:142-150.
Ikawa, J. Y., and C. Genigeorgis. 1987. Probability of growth and toxin production 47.
by nonproteolytic Clostridium botulinum in rocktish fllets Stored under modifed
atmospheres. Int. J. Food Microbiol. 4:167-181.
Ikawa. J.Y. 1991. 48. Clostridium botulinum growth and toxigenesis in shelf-stable
noodles. J. Food Sci. 56:264-265.
156
Imai. H.. K. Oshita. H. Hashimoto, and D. Fukushima. 1990. Factors inhibiting 49.
the growth and toxin formation of Clostridium botulinum types A and B in tsuyu
(Japanese noodle soup). J. Food Protect. 53:1025-1032.
Johnson. K.M.. C.L. Nelson, and F.F. Busta. 1983. Infuence of temperature on 50.
germination and growth of spores of emetic and diarrheal strains of Bacillus
eRNAs in a broth medium and in rice. J. Food Sci. 48:286-287.
Kang. C.K.. M. Woodburn, A. Pagenkopf. and R. Cheney. 1969. Growth, 51.
sporulation. and germination of Clostridium perfringens in media of controlled
water activity. Appl. Microbiol. 118:798-805
Simona Ivana, 52. 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 53. 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti;
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3.
736-090-8
736-090-8
ISBN: 978-973-736-089-2
ISBN: 978-973-736-089-2
Solomon, H.M., D.A. Kautter. and R.K. Lynt. 1982. Effect of low temperatures 68.
on growth of nonproteolytic Clostridium botulimtm types B and F and proteolytic
157
type G in crabmeat and broth. J. Food Protect. 45:516-518.
Solomon, R.M., R.K. Lynt, Jr.. D.A. Kautter, and T. Lilly. Jr. 1971. Antigenic 69.
relationships among the proteolytic and nonproteolytic strains of Clostridium
botulimtm. Appl. Microbiol. 21:295-299.
Sonnabend, O., W. Sonnabend. R. Heinzle, T. Sigrist, R. Dirnhofer. and U. Krech. 70.
1981. Isolation of Clostridium botulinuni type G and identifcation of type G
botulinal toxin in humans: Report of fve sudden unexpected deaths. J. Infect. Dis
143:22-27.
St. Louis, M.E., S.H.S. Peck, D. Bowering, G.B. Morgan, J. Blatherwick, S. 71.
Banarjee, G.D.M. Kettyla, W.A. Black. M.E Milling, A.H.W. Hauschild. R.V.
Tauxe. and P.A. Blake. 1988. Botulism from chopped garlic: Delayed recognition
of a major outbreak. Ann. Intern. Med. 108:363-368.
Stark, R.L., and C.L. Duncan. 1971. Biological characteristics 72. of Clostridium
perfringens type A enterotoxin. Infect Immun. 4:89-96.
Strong, D.H., J.C. Canada, and B. Griffths. 1963. Incidence 73. of Clostridium
perfringens in American foods. Appl. Micro biol. 11:42-44
Strong. D.H., and J.C. Canada. 1964. Survival 74. of Clostridium perfringens in frozen
chicken gravy. J. FoodSci. 29:479-482.
Strong. D.H.. C.L. Duncan, and G. Perna. 1971. 75. Clostridium perfringens type A food
poisoning. II. Response of the rabbit ileum as an indication of enteropathogenicity
of strains of Clostridium perfringens in human beings. Infect. Immun. 3:171-178.
Suen, J.C, C.L. Hatheway, A.G. Steigerwalt, and D.J. Brenner. 1988. 76. Clostridium
argentinense sp. nov.: a genetically homogeneous group composed of all strains
of Clostridium botulimtm toxin type G and some nontoxigenic strains previously
identifed as Closridium subterminale or Clostridium hastiforme. Int. J. Syst.
Sugii, S., I. Ohishi, and G. Sakaguchi. 1977. Correlation between oral toxicity 77.
and in vitro stability of Clostridium botulimtm types A and B toxins of different
molecular sizes. Infect. Immun. 16:910-914.
Sugiyama, H., and D.C. Mills. 1978. Intraintestinal toxin in infant mice challenged 78.
intragastrically with Clostridium botulimtm spores. Infect. Immun. 21:59-63.
Sugiyama, H., and K.H. Yang. 1975. Growth potential of 79. Clostridium botulimtm
in fresh mushrooms packaged in semiper meable plastic flm. Appl. Microbiol.
30:964-969.
Tompkin, R.B. 1980. Botulism from meat and poultry productsA historical 80.
perspective. Food Technol. 34(5):229-236, 257.
Trakulchang, S.P., and A. A. Kraft. 1977. Survival of 81. Clostridium perfringens in
refrigerated and frozen meat and poultry items. J. Food Sci. 42:518-521.
Tsang, N., L.S. Post, and M. Solberg. 1985. Growth and toxin production by 82.
Clostridium botulimtm in model acidifed systems. J. FoodSci. 50:961-965.
Weiss. K.F.. and D.H. Strong. 1967. Some properties of heat-resistant and heat- 83.
sensitive strains ofClostridium perfringens. I. Heat resistance and toxigenicity../.
Wen, Q., and B.A. McClane. 2004. Detection of enterotoxigenic 84. Clostridium
perfringens type A isolates in American retail foods. Appl. Environ. Microbiol.
70:2685-2691.
Wentz, M., H. Scott, and J. Vennes. 1967. 85. Clostridium Botulinum type F: Seasonal
158
inhibition by Bacillus licheniformis. Science 155:89-90.
Whelan, S.M., M.J. Elmore, N.J. Dodsworth, J.K. Brehm, T. Atkinson, and N.P. 86.
Minton. 1992. Molecular cloning of the (lostridium botulimtm structural gene
encoding the type B neurotoxin and determination of its entire nucleotide sequence.
Williams-Walls. N.J, 1968. 87. Clostridium botulimtm type F: Isolation from crabs.
Science 162:375-376.
Zhou, Y, H. Sugiyama, and E.A. Johnson. 1993. Transfer of neurotoxigenicity from 88.
Clostridium butyruum to a nontox igenic Clostridium botulimtm type E-like strain.
Zhou, Y, H. Sugiyama, H. Nakano, and E.A. Johnson. 1995. The genes for the 89.
Clostridium botulinuni type G toxin complex are on a plasmid. Infect. Immun.
63:2087-2091.
159
CAPITOLUL 5
IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN
GENUL LISTERIA N PRODUCEREA
TOXIINFECIILOR ALIMENTARE
5.1. Listeria monocytogenes
5.1.1. Caractere generale
Listeriile sunt bacterii Gram pozitive nesporogene i neacidorezistente.
n trecut erau clasifcate n genul Listerella. Numele generic a fost schimbat
n 1940 n Listeria. n multe privine sunt similare cu genul Brochothrix.
Ambele genuri sunt pozitive la testul catalazei i au tendina s se asocieze
n natur cu bacteriile din genul Lactobacillus. Toate cele 3 genuri produc
acid lactic din glucoz i alte zaharuri fermentescibile,dar spre deosebire de
Listeria i Brochotrix, lactabacilii nu produc catalaz.
O perioad de timp listeriile au fost considerate nrudite cu
bacteriile corineforme i din acest motiv au fost clasifcate n familia
Corynebacteriaceae, ns acum este clar c sunt mai apropiate de bacteriile
din genurile Bacillus, Lactobacillus i Streptococcus. Din punct de vedere
al RNA-ului ribozomal 16S, Listeria se apropie de Brochothrix, iar aceste
genuri mpreun cu Staphylococcus i Kurthia ocup poziia dintre grupul
Bacillus i Lactobacillus/Streptococcus n cadrul ncrengturii Clostridium-
Lactobacillus-Bacillus.
Transferurile genetice au loc ntre Listeria, Bacillus, Staflococcus,
iar reaciile imunologice ncruciate apar ntre Listeria, Streptococcus,
Staphylococcus i Lactobacillus. Cu toate c Erysipelothrix intr n cadrul
micoplasmelor are n comun cu Listeria i Brochothrix 338 de baze purinice
i pirimidinice.
Listeria spp. conine acizi teichoici i lipoteichonici, precum i bacilii,
staflococ, streptococii i lactobacilii, ns spre deosebire de acestia coloniile
160
produse de listerii produc o irizaie albastr verzuie n lumina oblic.
n prezent genul Listeria cuprinde 7 specii. Fostul Listeria murray a
fost combinat cu Listeria grayi. Se poate observa din c cele 2 specii ocup
o poziie deprtat de celelalte 5. Listeria ivanovii conine 2 subspecii:
ivanovii si londoniensis. Prima se difereniaz de cea de-a doua prin
abilitatea sa de a fermenta riboza i incapacitatea de a fermenta N-acetil
beta D manozamina.
Folosind reacia de polimerizare n lan (PCR) bazat pe tehnicile
de identifcare a DNA-ului, s-a dovedit c Listeria innocua i Listeria
welshimeri sunt nrudite, iar Listeria grayi este omogen i se nrudete n
mod clar cu celelalte 5 specii. Acizii teichoici tip Poly (ribitolfosfat), sunt
principalii polimeri din peretele celular la Listeria spp. Acidul lipoteichoic
de la Listeria grayi se separ tot mai mult de celelalte specii prin faptul c
prezint acid lipoteichoic modifcat.
Se pare c acizii teichoici sunt recunoscui de bacteriofagi ca liganzi
ai peretelui celular.
Testul CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) este considerat de
muli cercettori drept test defnitiv pentru Listeria monocytogenes.
Un izolat care este CAMP pozitiv cu Stapylococcus aureus sau Rco.
equi trebuie considerat ca izolat prezumtiv de Lis. monocytogenes, dar nu
neaprat virulent.
Stimularea hemolizei n prezena lui Staphylococcus aureus se pare c
se datoreaz unei fosfolipaze C, fosfofatidilinozitol specifc sau fosfatidil-
colin-specifc de la Lis. monocytogenes i a unei sfngomielinizare de la
Staphylococcus aureus.
5.1.2. Istoric
Listeria monocytogenes a fost identifcat pentru prima dat datorit
unui focar infecios spontan la iepurii i cobaii de laborator, de Murray
i colab. si n 1924, la Cambridge (Anglia). Numele de monocytogenes
atribuit speciei s-a datorat leucocitozei marcate cu mononucleare prezent
la aceste animale. n Africa de Sud, n 1927, Pirie a izolat aceeai bacterie
de la gerbili infectai i a denumit-o Listerella, dup chirurgul i pionierul
antisepsiei, lordul Lister. Din motive taxonomice, denumirea generic a fost
schimbat n 1940 n Listeria. n Noua Zeeland, Gill este creditat cu prima
izolare a Lis. monocytogenes de la un animal domestic infectat, el descriind
i o encefalit ovin cu micri n menaj.
n 1929, n Danemarca, Nyfeldt a izolat Lis. monocytogenes de la om,
din hemoculturile unor persoane cu o infecie asemntoare mononucleozei
161
(o form rar de manifestare a bolii), iar Burn, n 1936, n Statele Unite
al Americii, a stabilit listerioza ca find o cauz de infecie n perioada
perinatal i, de asemenea, de meningit la aduli. nainte de 1926 au existat
descrieri ale unor boli care probabil au fost listerioza; ntr-adevr, un izolat
difteroid din lichidul cefalorahidian al unui soldat, n 1919, la Paris, a fost
ulterior identifcat ca find Lis. monocytogenes.
n cursul anilor 1980, creterea numrului de cazuri de listerioza
uman i animal n mai multe ri (inclusiv Marea Britanie), mpreun
cu o serie de toxiinfecii alimentare in America de Nord i Europa (tabelul
5.1) au dus la rennoirea interesului profesional fa de boal i la alarmarea
publicului.
Tabelul 5.1
Episoade de listerioza uman cu transmitere alimentar
ar An Numr de cazuri Aliment implicat
SUA 1976 20 ? Salat crud
Noua Zeeland 1980 22 ? Scoici sau pete crud
Canada 1981 41 Salat de varz crud
SUA 1983 49 ? Lapte
SUA 1985 142 Brnz proaspt
Elveia 1983-7 122 Brnz proaspt
UK 1987-9 >350 Pateu
SUA 1989 2 ? Crevei
Australia 1990 9 Pateu
Australia 1981 4 Midii afumate
Noua Zeeland 1992 4 Midii afumate
Frana 1992 279 Limb de porc n aspic
Frana 1993 39 Toctur de porc conservat
Frana 1995 33 Brnz topit
? Indic asocierea epidemiologic fr izolarea tulpinii implicate din
alimentul specifcat.
5.1.3. Taxonomie
Familia Listeriaceae
Cuprinde dou genuri, i anume: Listeria i Brachothrix (J.P. Euzby,
2006).
162
Tabelul 5.2
Grupa bacililor Gram pozitivi,
nesporogeni, aerobi sau facultativ
anaerobi
Genul Specia
Listeria Lis. monocytogenes
Erysipelothrix
Ers. rhusiopathiae
Ers. tonsillarum
Ers. inopinata
Corynebacterium
Cor. pseudotuberculosis
Cor. bovis
Cor. diphteriae
Arcanobacterium Abc. pyogenes
Actinomyces
Act. bovis
Act. israelii
Actinobaculum Abl. suis
Genul Listeria cuprinde apte specii: Lis. denitrifcans (Jonesia
denitrifcans), Lis. grayi (Lis. murrayi), Lis. innocua, Lis. ivanovii, cu subsp.
ivanovii i londoniensis, Lis. monocytogenes, Lis. seeligeri, Lis. welshimeri
(dup Bergeys Manual of systematic Bacteriology, 2nd Edition, 2004).
Speciile de listerii au fost defnite pe baza studiilor de hibridare, de
electroforez enzimatic multilocular i de secveniere a RNA
r
16S.
ntre tulpinile de Lis. monocytogenes electroforeza enzimatic
multilocular i secvenierea genelor specifce contureaz dou sublinii
genetice, care se suprapun serovarurilor 1/2b, 3b i 4b i, respectiv, 1/2a,
1/2c, 3a i 3c.
Majoritatea speciilor sunt comensale sau saprofte, n afar de Lis.
monocytogenes care este patogen att pentru animale ct i pentru om.
5.1.4. Morfologie
Bacterie polimorf, predominant bacilar (bacili scuri, drepi sau
ncurbai), dar i cu forme cocobacilare, cocoide sau flamentoase (la
variantele R) cu dimensiuni de 0,5/0,5-2.
Este necapsulogen, nesporogen, imobil. n culturile incubate la
temperaturi sub 35C sunt mobili, avnd 4-5 fageli dispui peritrich, iar
prin cultivare la 37-46C devin imobili sau monofagelai.
n prelevatele patologice, listeriile apar fe extracelular, fe fagocitate,
ceea ce constituie o prob cert n diagnosticul listeriozei.
n frotiurile efectuate direct din lichidul cefalorahidian se pot observa
cocobacili, Gram pozitivi, izolai n perechi sau n lanuri scurte.
n culturile tinere, incubate la 35-37C, domin formele scurte,
cocobacilare, iar n culturile vechi formele polimorfe, aprnd deseori i
163
forme flamentoase lungi de 6-20 asemntoare lactobacililor.
Sunt Gram pozitivi, dar pot deveni Gram negativi n culturile vechi,
sau printr-o decolorare prelungit de 3-5 minute, putnd f considerai Gram
labili.
n culturile efectuate din produse patologice cu for mixt, Lis.
monocytogenes se aseamn foarte mult din punct de vedere morfologic i
cultural cu bacilul rujetului. Coninutul n G+C al DNA-ului este de 36-42
mol%.
Dimensiunea cromozomului Lis. monocytogenes a fost estimat la
aproximativ 3150 kb, find stabilit harta fzic i genetic (prin utilizarea
electroforezei n gel), pe care au fost localizate mai multe gene. Genele
implicate n patogeenz sunt aproape toate grupate pe un singur locus.
La Lis. monocytogenes au fost introdui i exprimai transpozonii Tn
1545, Tn916 i Tn917 (i derivaii lor), care s-au dovedit instrumente extrem
de utile pentru nelegerea virulenei acestei bacterii. Un transpozon foarte
asemntor cu Tn917 (denumit Tn5422) a fost recunoscut n plasmidele
recoltate de la Lis. monocytogenes, care codifc de asemenea rezistena la
cadmiu. La unele tulpini de Lis. monocytogenes i la alte specii de Listeria
a fost detectat DNA-ul plasmidic, care a fost asociat cu rezistena la cadmiu.
Genele plasmidice ale rezistenei la cadmiu prezint un grad nalt de
similaritate cu rezistena la cadmiu a Staphylococcus aureus. Dei rareori, a
fost observat rezistena, codifcat de plasmide, numai fa de tetraciclin,
ca i multirezistena la cloramfenicol, eritromicin, streptomicin i
tetraciclin. S-a demonstrat transferul plasmidelor listerice native, nu numai
ntre speciile de Listeria, ci i ctre alte specii bacteriene, incluznd Bacillus
subtilis, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae i Staphylococcus
aureus.
Fagii lizogeni sunt frecvent purtai de Listeria i sunt n general similari
morfologic, cu capete izometrice i cozi lungi, necontractile, corespunznd
familiilor Myoviridae sau Styloviridae. Genomul fagic este reprezentat de
un DNA dublu catenar linear de 35-42 kb. Proprietile litice ale seturilor de
fagi au fost utilizate pentru subtiparea Lis. monocytogenes.
Ca i utilizarea mutagenezei cu transpozoni, experimentele de
complementare a plasmidelor, mpreun cu studiul comportamentului Lis.
monocytogenes n culturi de esuturi de mamifere i n modele pe oareci
infectai experimental, au dus la o mai bun nelegere a genelor implicate
n virulena acestui microorganism. De asemenea, n analiza acestor bacterii
au fost aplicate, cu mult succes, tehnici de generare a mutaiilor punctiforme
prin schimb alelic, de introducere de material genetic prin electroporoz
i de exprimare a genelor Lis. monocytogenes la Lis. innocua i Bacillus
164
subtilis.
Listeriile sunt bacterii facultativ anaerobe i se cultiv bine pe medii
uzuale ntre 0 i 45C, optim la 20-37C. Uneori necesit suplimentarea
mediilor cu snge, lichid de ascit sau glucoz.
Izolarea listeriilor din materialele patologice, se realizeaz deseori
difcil, necesitnd medii selective sau de mbogire cum ar f: agarul cu
tripafavin, acid nalidixic i ser; agar cu acridin i acid nalidixic. Uneori,
pentru izolare este necesar mbogirea la rece, care se realizeaz
prin pstrarea produsului patologic n bulion triptaz, la 4C, timp de 4
sptmni, cu subcultivare din 4 n 4 zile pe geloz snge i incubare la
37C n atmosfer cu 10% dioxid de carbon.
n bulion peptonat produce un aspect uniform, iar n bulion glucozat
un aspect foconos. Dup o incubare prelungit formeaz un depozit dens
i aderent caracteristic, care se ridic n mediu, dup agitare, sub form de
tirbuon.
Pe agarul glucozat sau triptozat formeaz colonii de mrimi diferite,
de form rotund, de tip S, uor bombate, transparente, cu aspect caracteris-
tic de picturi de rou. Centrul lor poate avea un aspect cristalin sticlos.
Prezint o consisten apoas, iar dac sunt examinate n lumin oblic, la
45 de grade, apar cu irizaii bleu-verzui.
Coloniile variantelor L sunt mai mari, turtite, cu centrul opac i cu
marginile neregulate, friabile, greu emulsionabile.
Pe agar cu 5% snge de berbec, iepure, cal, bou sau om, coloniile de
Lis. monocytogenes apar nconjurate de o zon ngust de beta hemoliz
difuz.
Culturile de pe medii solide degaj un miros caracteristic de lapte
acidulat.
n mediile semisolide (agar 3), dup nsmnarea bacteriei prin
neparea mediului n profunzime i incubarea la 37C, aceasta crete sub
forma unei umbrele la 3-5 milimetri de suprafaa agarului, dovedind astfel
o mobilitate marcant.
Cerinele nutriionale ale listeriei sunt tipice bacteriilor Gram pozitive.
Ele se dezvolt bine pe medii cum ar f infuzia de cord-creier, soia cu
tripticaz i cu triptoz. Au nevoie pentru cretere de cel puin 4 vitamine
B: biotina, ribofavina, tiamina i acidul tioctic (acid alfa lipoic; factor
de cretere pentru unele bacterii i protozoare) i de aminoacizi: cisteina,
glutamina, izoleucina, leucina, valina.
165
Glucoza favorizeaz creterea tuturor speciilor prin producerea de
acid lactic. Toate speciile folosesc glucoz pe calea Embden-Meyerhof ca i
majoritatea enterococilor.
Listeria este capabil s hidrolizeze esculina i s creasc n prezent
de bil10 sau 40% i 10% NaCl,0,025% acetat i 0,04% telurit de potasiu;
nu crete n prezena azidurii de sodiu 0,02%.
Listeriile posed o hidroliaz pentru srurile biliare find astfel capabil
s colonizeze vezica biliar. Se dezvolt pe agarul Mac Conkey. Cu toate c
ferul este important pentru creterea n vivo Lis. monocytogenes nu posed
componeni de legare a ferului. i face rost de acesta prin mobilizarea
reductiv a ferului liber care se leag de receptorii de suprafa.
Produce catalaz, nu produce oxidaz, hidrogen sulfurat i nici
indol.
Pe agar snge produce beta-hemoliz, ceea ce o difereniaz de Lis.
innocua.
Testul CAMP poate evidenia clar caracterele hemolitice, prin
nsmnarea lui Staphylococcus aureus sau Rhodococcus equi sub form de
striuri ntr-o singur direcie pe placa cu agar snge, iar tulpinile de Listeria
perpendicular fa de acestea, fr a le atinge. Hemoliza va deveni mai
exacerbat n apropierea striului de Stp. aureus pentru Lis. monocytogenes,
iar n apropierea striului de Rco. equi, hemoliza va f mai accentuat pentru
Lis. ivanovii. Testul CAMP clasic poate f modifcat, prin utilizarea unui
disc impregnat cu beta lizin staflococic.
Lis. monocytogenes produce, de regul, acid din L-ramnoz i alfa-
metil-D-monozid.
Efectul pH-ului:
Cu toate c listeriile cresc cel mai bine la un pH ntre 6 i 8,exist
unele specii/tipuri care supravieuiesc la un pH cuprins ntre 4,1 si 9,6 la
temperaturi de 1-45C.
n general minimul de pH necesar pentru dezvoltarea unei bacterii
depinde de temperatura de incubaie, compoziia nutritiv a substratului,
activitatea apei i de prezena i cantitatea de NaCl i alte sruri i
inhibitori.
Creterea lui Lis. monocytogenes n mediile de cultur a fost obser-
vat la un pH de 4,4 n mai puin de 7 zile la 30C; la pH=4,5 n triptoz la
19C i la un pH 4,66 n 60 de zile la 30C. n primul studiu creterea la pH
166
4,5 a aprut la 20C n 14 zile i la pH 5,23 la 4C. Dezvoltarea la pH 4,5
a fost crescut de restricia de oxigen. n cel de al treilea studiu creterea a
fost observat la un pH de 4,66 n 60 de zile la 30C. Bacteria s-a dezvoltat
pan la temperatura de 10C la un pH 4,83. La 5C i un pH de 5,13 nu s-a
nregistrat nici o cretere.
ntr-un alt studiu, 4 tulpini de Lis. monocytogenes au crescut la un
pH de 4,5 dup 30 de zile ntr-un mediu de cultur incubat la 30C nefind
observat nici o cretere la pH 4 sau mai mic. Valorile de pH de 3,8-4 s-a
dovedit a f mai distructive dect cele de 4,2-5 n serum de portocale la
30C, 5 zile.
Efectul temperaturii:
Temperatura minim necesar pentru creterea a 78 de tipuri de Lis.
monocytogenes pe agar triptic de soia a fost de 1,1 0,3C cu o marja de
0,5-3C. Dou tulpini au crescut la 0,5C i 8 au crescut la sub 0,8C n 10
zile la un incubator cu gradient continuu de temperatur.
ntr-un alt studiu pe 22 de tulpini temperatura minim de cretere a
fost de 1,7-3C. Faptul c tulpinile de Listeria monocytogenes au avut o
temperatur minim de cretere cu 0,6C mai mic dect celelalte specii, au
sugerat cercettorilor c hemoliza poate favoriza creterea i supravieuirea
lui Listeria monocytogenes n mediile reci. Serovarurile 1/2a,1/2b si 4b au
crescut mai lent la 3C dect cele cu antigenele 01.Temperatura maxim de
cretere a listeriilor este de 45C.
Rezistena listeriilor n mediile naturale este remarcabil, supravieuind
mai mult de 2 ani n siloz sau n sol. Dei sunt bacterii nesporogene,
supravieuiesc timp de 201-295 zile n sol, 346-750 de zile n apele
stttoare, 977 de zile n fecale. La temperatura de 65C rezist 10 minute.
n mediile de cultur optime, listeriile au putut f reizolate dup 21 de ani.
Larga rspndire a genului, ca i capacitatea sa de a supravieui pe suprafee
uscate i umede favorizeaz contaminarea dup procesarea alimentelor, prin
contactul cu produsele crude sau cu mediul din fabric.
Antibioticele cele mai active fa de listerii sunt ampicilina, tetracicli-
nele, find rezistente la streptomicin i polimixina B.
Factorii de mediu:
Listeriile sunt foarte rspndite n natur putnd f i gsite n vegetaia
n descompunere, n sol, fecale animale, deeuri i ap. n general este de
167
ateptat s se gseasc mpreun cu speciile din genul Brochothrix (bacterie
de acid lactic) i unele specii de bacterii corineforme.
ntr-un studiu efectuat n Scoia pe probe de fecale de pescru, ciori
i silozuri, numrul cel mai mare de listerii a fost gsit la pescruii hrnii
cu deeuri de canalizare, iar numrul cel mai mic a fost gsit n fecalele de
ciori.
Cel mai frecvent ntlnite sunt speciile Listeria monocytogenes i
Listeria innocua, iar cel mai rar Listeria seeligeri. Primele dou bacterii
au fost gsite n proporie de 44% n silozurile mucegite i de 22% n
silozurile formate din baloi mari.
Microorganismul a fost gsit n silozul cu pH mai mare sau mai mic
de 4,5.
Listeria monocytogenes a fost izolat din 8,4 pan la 44% din probele
luate din lanurile de cereale, puni, nmol, fecale animale, locurile de
hrnire a faunei slbatice i din sursele apropiate.
Lis. monocytogenes supravieuiete n sol peste 295 de zile. Din
apele de coast ale Californiei, 62% din 37 de probe de ap dulce sau ap
puin srat i 17,4% din 46 de probe de sediment au fost pozitive pentru
Lis. monocytogenes, dar nu a fost izolat nici o tulpin din 35 de probe de
stridii.
Listeriile se pot asocia cu anumite produse din lapte precum si cu alte
bacterii productoare de acid lactic.
Produse lactate:
Protocolul de pasteurizare, temperatur sczut, timp ndelungat
(LTLT=low temperature, long-time) (62,8C pentru 30 de minute) este i
mai distructiv.
Folosind tulpina Scott A (serovarul 4b din epidemia din Massachusetts)
valorile D au variat de la 0,9 la 2,0 secunde cu valorile Z de 6,0-6,5C.
Tulpina F5069 pare a f puin mai rezistent la temperatur dect
Scott A,cu toate c Scott A a fost mai rezistent din alte 3 tulpini evaluate,
neincluznd F5069.
Produsele nonlactate:
Pentru oule i produsele din carne,valorile D sunt n general mai mari
dect pentru lapte, fapt de altfel nesurprinztor, considernd efectul proteinelor
i lipidelor asupra rezistenei termale asupra microorganismelor,
Pentru o tulpin de Lis. monocytogenes izolat din carnea de pui
valorile D la 70C au fost de 6,6-8,4 secunde; cam aceleai valori s-au
ntlnit i la carnea de vit.
168
ntr-un studiu asupra crnii de crab albastru tulpina Scott A la niveluri
de 10
7
,a avut o valoare D de 2,68 minute i o valoare Z de 8,4 C, indicnd
astfel c protocolul de pasteurizare de 30 de min la 85C este adecvat pentru
declararea produsului ca find bun pentru consum.
Dintre speciile de Listeria, Lis. monocytogenes este patogen pentru
om. Cu toate c i Listeria ivanovii poate reproduce infecia experimental la
oarece este necesar un numar mult mai mare de germeni pentru a reproduce
infecia (pn la 10
6
celule nu au reprodus infecia la oarece). Listeria
innocua, Listeria welshimeri i Listeria seeligeri sunt nepatogene,cu toate
c ultima produce o hemolizin numit listeriolizina O. Listeriolizina O
(LLO) reprezint cel mai important factor de virulen find asociat cu Lis.
monocytogenes.
Listeria monocytogenes este larg rspndit n mediu i a fost izolat
din numeroase sedii, incluznd solul, apa, canalizarea i materiile vegetale
n descompunere (n special, nutreul nsilozat insufcient fermentat):
viabilitatea sa este remarcabil, supravieuind mai mult de 2 ani n sol sau
siloz. Se gsete n excreiile animalelor aparent sntoase (i, de asemenea,
ale oamenilor), dei starea de purttor intestinal este tranzitorie. Chiar cnd
este prezent n concentraii ridicate n alimente, nu produce n general
alterarea sau contaminarea acestora. Larga rspndire a Lis. monocytogenes
i capacitatea sa de a supravieui pe suprafee uscate i umede favorizeaz
contaminarea dup procesarea alimentelor, prin contactul cu produsele
crude sau cu mediul din fabric.
Multe tipuri de alimente crude, prelucrate, gtite i pregtite pentru
consum conin Lis. monocytogenes, dei la niveluri sczute (10 germeni/g).
Proprietile microorganismului favorizeaz transmiterea listeriozei pe cale
alimentar. Listeria monocytogenes crete ntr-o gam larg de alimente
cu umiditate relativ ridicat (A > 0,95) i la temperaturi foarte variabile
(0-45C). Creterea se produce i la temperaturi de refrigerare, dei este
relativ lent, cu un timp de dublare maxim de aproximativ 1 - 2 zile la 4C.
Multiplicarea n alimente este ntructva limitat la intervalul de pH de 5
- 9, i Lis. monocytogenes nu este sufcient de rezistent la cldur pentru
a supravieui pasteurizrii laptelui. Tolerana neobinuit a bacteriei fa
de clorura de sodiu i nitritul de sodiu, ca i capacitatea de a se multiplica,
dei lent, n alimentele refrigerate, fac din Lis. monocytogenes o problem
special a contaminrii post-procesare a alimentelor refrigerate.
169
5.1.8. Structura antigenic
Pe baza antigenelor somatice (I-XIV) si a celor fagelare (AE),
Sealinger i Danker au stabilit o schem de clasifcare antigenic mprind
genul n 17 serotipuri (serovaruri).
Lis. monocytogenes conine 13 serovaruri din care cteva sunt comune
cu Listeria innocua i Listeria seeligeri. Lis. innocua este reprezentat de 2
serovaruri find nepatogen.
Heterogenicitatea sporit a antigenelor din inveliul extern al listeriilor
poate f corelat cu numrul mare de specii gazd. Cel mai frecvent sunt
izolate tipurile si 4. Inainte de 1960 n Europa i Africa predomina tipul
1, iar n America de Nord tipul 4, dar acest tipar pare s se f schimbat.
Astfel s-a demonstrat c serotipurile de listeria nu sunt legate de procesul
patologic al gazdei sau de originea geografc, iar acest lucru este confrmat
de bacteriile izolate din hran cu toate c serovarurile 1/2a i 4b prezint
unele diferene geografce. n SUA i Canada serovarul 4b reprezint 65-
80% din toate tulpinile.
Epidemia din SUA din 1998-1999 s-a datorat consumului de cremwurti
ce conineau o tulpin nou de serovar 4b. ntre 1 ianuarie i 30 iunie 1996,
60% din 2232 de izolate din cazuri umane n Anglia, au fost 4b i 11, 17 i
4% find cauzate de 11/2a, 1/ab i 1/2c. n general tulpinile 4b se asociaz cu
epidemiile, in timp ce tulpinile 1/2 se asociaz cu produsele alimentare.
Serovarul 1/2a a fost cel mai frecvent raportat n Europa de Est, Africa
de Vest, Germania central, Finlanda i Suedia, pe cnd serovarurile 1/2a i
4b au fost raportate n Frana i Olanda n proporii egale.
Se datoreaz virulenei precum i producerii unei toxine cu efect
letal pentru animalele de laborator i aciune citopatogen asupra culturilor
celulare.
Listeriile au un caracter neinvaziv, putndu-se multiplica n enterocite
(H. Rducnescu), de unde trec n snge, iar bacteriemia primar este urmat
de localizri secundare (meninge, endocard, uterul gestant, glanda mamar,
etc.).
O modifcare caracteristic o reprezint mononucleoza, determinat
de o monoglicerid din membrana citoplasmatic a bacteriei.
Apariia infeciei este favorizat de vrsta tnr, starea de gestaie (la
ovine), furajarea necorespunztoare, factorii zooigenici etc.
170
Listeriolizina O i ivanolizina O:
n general tulpinile patogene/virulente de Lis. monocytogenes produc
beta hemolizin pe agarul cu snge i acid din ramnoz, dar nu din xiloz.
Tulpinile a cror hemoliz poate f amplifcat cu exosubstana
prepurifcat sau direct prin folosirea culturii sunt potenial patogene.
Toate tulpinile virulente de Lis. monocytogenes produc o substan
specifc care este responsabil de beta hemoliz asupra eritrocitelor i de
distrugere a celulelor fagocitare care le nglobeaz i anume listeriolizina O
(LLO).
Substana respectiv i perfngolizina O (PFO) sunt omoloage cu
streptolizina O (SLO) i pneumolizina (PLO).
Listeriolizina O (LLO) are o greutate moleculara de 60000Da, find
constituit din 504 aminoacizi. Este produs n faza de cretere exponenial
(cu niveluri maxime dup 8-10 ore).
LLO este sintetizat la 37C n medii cu glucoz 0,2%. Sorbitolul n
proporie de 2% inhib sinteza LLO la 35C n condiii aerobe sau anaerobe
de incubare.
LLO a fost detectat la toate tulpinile de Lis. monocytogenes chiar i
la unele tulpini nehemolitice. Nu a fost identifcat la Lis. welshimeri i Lis.
grayi.
Gena care codifc producerea ei este denumit hly i este de origine
cromozomal.
Lis. ivanovii i Lis. seeligeri produc exotoxine tiol dependente care
sunt similare, dar nu identice cu LLO. Lis. ivanovii produce cantiti mari
de astfel de exotoxine.
Ivanolizina O(ILO) este o citolizin tiol activat produs de Lis.
ivanovi. Antiserul obinut de la Lis. ivanovi produce reacii ncruciate
cu cel de la Lis. monocytogenes i SLO. Mutantele defciente n ILO s-au
dovedit a f avirulente pentru oarece i embrionii de gin.
LLO purifcat prezint n comun cu SLO si PLO urmtoarele
proprietai: 1) sunt activate de compuii SH cum ar f cisteina; 2) sunt
inhibate de cantiti mici de colesterol i prezint situsuri antigenice comune
evideniate prin reacii cross-imunologice.
Spre deosebire de SLO si PLO, LLO este activat la un pH de 5,5 dar
nu la un pH 7,0 ceea ce sugereaz posibilitatea activitaii sale n fagolizozomi
(fagozomii macrofagelor).
DL50 pentru oarece este de aproximativ 0,8g i induce un
rspuns infamator cnd este injectat intradermic. Se pare ca LLO i alte
toxine poreforming (formatoare de pori) au evoluat de la o singur gen
171
progenitoare.
Cnd infecia cu Lis. monocytogenes se produce pe cale oral, n mod
aparent colonizeaz tractul intestinal prin mecanisme neelucidate pn n
prezent. De la acest nivel invadeaz esuturile, inclusiv placenta la femeile
gravide i intr n torentul sangvin de unde ajunge la alte celule susceptibile.
Ca patogen intracelular trebuie s patrund i s se replice n aceste celule.
Invazia fagocitelor se produce n dou faze prin ptrunderea listeriilor direct
n fagozomi i apoi de la acetia n citoplasma fagocitului.
Intrarea Lis. monocytogenes n celulele gazd care nu au fost fagocitate
este facilitat de ctre proteinele de suprafa ale bacteriei, denumite n 1A
i 1B. Prima are o greutate molecular de 88 KDa, iar cea de-a doua de
65KDa.
Proteina 1A (internalina are ca receptor de suprafata F-cadherina),
invadeaz culturile celulare, epiteliale, iar proteina n 1B invadeaz culturile
de hepatocite de oarece. Alte proteine intalnite la listerii sunt: 1) p60, o
proteina de 60 kDa codifcat de gena iap. Este secretat de toate speciile
de listeria find implicate n producerea listeriilor n celulele gazd; 2) Act A
(90kDa) care este necesar pentru polimerizarea actinei i permite micarea
intracitoplasmatic a listeriilor n celulele gazd; 3) Ami (90kDa) este o
bacterie lizin care se af pe suprafaa lui Lis. monocytogenes.
Dintr-un studiu de 150 de probe de hran, Ami a fost prezent in 149,
n timp ce 283 din 300 de probe umane au coninut aceast protein. Toate
proteinele pozitive au prezentat LLO, n 1B i Act A.
Lis. monocytogenes supravieuiete n interiorul macrofagelor trecnd
prin membranele fagolizozomale n citoplasm (citosol) proces facilitat n
parte de LLO.
O dat ajuns n citosol proteina de suprafa Act A (faciliteaz formarea
cozilor de actin) care propulseaz microorganismul ctre membrana
citoplasmatic. La nivelul membranei formeaz vacuole membranare
duble. Cu ajutorul LLO i a celor 2 fosfolipaze bacteriene, fosfolipaza C
fosfotidilinozitol-specifc (codifcat de plcA) i fosfolipaza C (broad-rouge
phospholipase) (codifcat de plcB) bacteriile sunt eliberate, iar procesul
se repet cu intrarea acestora n celulele gazd adiacente. Ultimul proces
apare dupa forarea membranei n afar i formarea unui flopodiu care
este absorbit de o celul adiacent, dup care procesul se repet. Astfel
rspndirea lui Lis. monocytogenes de la o celul la alta are loc far ca
bacteria s prseasc componentele interioare ale celulei.
O parte interesant, dar incomplet studiat a celulei de Lis.
monocytogenes este acidul lipoteichoic (LTA) al membranei celulare care
se aseamn cu lipopolizaharidul (LPS) din membrana extern a bacteriilor
172
Gram negative.
Datorit acestui factor de producere a monocitozei (monocytosis-
producing-activity, MPA) s-a dat i numele speciei: monocytogenes.
Acidul lipoteichoic (LTA-lipoteichoic acid) reprezint 6% din
greutatea uscat a celulei i este asociat cu membrana plasmatic. Are o
greutate molecular de 1000 Da, nu conine aminoacizi sau carbohidrai i
stimuleaz numai celulele mononucleare. Prezint toxicitate mic pentru
esuturi i este inactiv serologic dar omoar macrofagele in vitro. S-a
demonstrat c are urmtoarele proprieti comune cu LPS: este pirogenic
i letal pentru iepure; produce o reacie Schwartzman local; conine acizi
grai hidroxi acilai; produce o reacie pozitiv cu reactivul LAL (Limulus
ameobocyte lysatereagent); conine KDO (2-keto-3 deoxyoctonic acid);
conine heptoz. Reactivul LAL n cantitate de 1mg produce reacie pozitiv,
n timp ce LPS poate f activat ntr-o cantitate de picograme.
Lis. ivanovii este patogen pentru oi la care produce avort, find un
producator prolifc de hemoliz pe eritrocitele de oaie. Posed o hemolizin
like-LLO (ILO), sfngomielinaz i lecitinaz. Sfngomielinaza are o
greutate molecular de 27000Da. n timp ce hemolizina like-LLO este
responsabil pentru producerea beta hemolizei pe eritrocitele de oaie, alfa
hemoliza produs de Rco. equi se pare c este cauzat de dou enzime.
5.1.10. Izolarea i identifcarea
nainte de jumtatea anilor 1980, mbogirea la rece, bazat pe
capacitatea Listeriei de a depi prin cretere la temperaturi sczute germenii
competitivi, a fost utilizat n principal pentru izolarea selectiv. Totui,
datorit lipsei de specifcitate a acestei metode i a faptului c este lent
(unii cercettori au incubat bulion pn la 6 luni), procedurile au fost mult
mbuntite. Au fost dezvoltate medii care utilizeaz diveri ageni selectivi,
incluznd acrifavin, clorur de litiu, colistin, acid nalidixic, cicloheximid
i polimixin. Aceste metode au lrgit capacitatea laboratoarelor de
microbiologie (n special, a celor implicate n controlul alimentelor) de a
izola selectiv Listeria.
Pentru detectarea listeriilor n alimente sunt din ce n ce mai mult
utilizate hibridizarea acizilor nucleici i testele imunoenzimatice.
5.1.11. Listerioza uman
Listerioza este o infecie oportunist care afecteaz cel mai frecvent
persoanele cu afeciuni intercurente severe, btrnii, femeile gravide,
173
fetuii i nou-nscuii. Cu toate acestea, pacienii n afara acestor factori
de risc pot f de asemenea infectai. Indivizii cu cel mai mare risc de a
contracta listerioza sunt btrnii, cei imunocompromii prin afeciuni
limfoproliferative (leucemii i limfoame), persoanele cu alte neoplazii
sau care primesc tratament imunosupresiv (corticosteroizi, ciclosporin,
azatioprin, iradiere). Alte condiii predispozante includ sindromul
imunodefcitar dobndit (SIDA), alcoolismul, fcatul alcoolic, diabetul i
purttorii de proteze cardiace valvulare sau proteze articulare.
Femeile gravide au un risc crescut de a contracta listerioza, posibil
datorit scderii fziologice a imunitii, dar vor prezenta invariabil o form
relativ uoar a bolii. Infecia matern poate disemina la ft, ducnd fe
la moarte intrauterin, fe la naterea unui copil sever afectat n primele
zile dup natere (infecie neonatal cu debut precoce). De asemenea, nou-
nscuii pot dezvolta septicemie cu debut tardiv, tipic la 10-12 zile dup
natere.
Listerioza afecteaz cel mai frecvent coninutul uterului gravid,
sistemul nervos central i circulaia. La persoanele negravide, listerioza
se prezint cel mai frecvent ca meningit (cu sau fr septicemie) sau ca
septicemie fr afectarea sistemului nervos central. Ultima form a bolii
este n general limitat la indivizii imunocompromii i are rareori focare
de infecie identifcabile. Meningoencefalita i encefalita listeric apar mai
rar. La femeia gravid, listerioza este de cele mai multe ori recunoscut sub
forma unuia sau mai multor episoade pseudogripale autolimitate, n cursul
sau n a doua jumtate a celui de-al doilea trimestru, dei infecia poate
aprea pe toat durata sarcinii. Listerioza matern se prezint, de obicei, cu
febr i alte simptome nespecifce, dei unele persoane pot f asimptomatice.
Meningita listerian matern i infeciile recurente la aceeai femeie n
cursul unor sarcini diferite sunt foarte rare.
5.1.12. Epidemiologie
Larga rspndire a Lis. monocytogenes asigur numeroase ci de
transmitere a bolii att la animale, ct i la oameni. Dei actualmente s-a
acordat un mare interes transmiterii pe cale oral, acesta nu este singurul
mod de transmitere.
Vrful incidenei listeriozei umane are loc cel mai adesea la sfritul
verii i nceputul toamnei, din motive nc nenelese. Listerioza animal
apare cel mai des primvara, probabil nu numai din cauza fziologiei i
condiiei animalelor, ci i datorit furajrii defcitare.
Incidena raportat a listeriozei umane variaz n funcie de ar, de
174
la mai puin de 1 la peste 7 cazuri la un milion de locuitori. Dei aceste
cifre pot refecta n parte diferene ale sistemelor de surpaveghere, ele
reprezint probabil diferene reale ale incidenei. Exist diferene similare
ale incidenei listeriozei animale ntre diferite regiuni: de exemplu, n Marea
Britanie, listerioza ovinelor reprezint o problem deosebit n Scoia i
nordul Angliei. Aceste diferene pot f datorate parial capacitii de a furaja
corespunztor animalele.
n 2006 au fost raportate 1628 cazuri n 27 de state, Malta i Islanda
nu au raportat cazuri (Portugalia, Romania i Liechtenstein nu au raportat).
Danemarca (1,0 la 100.000), urmat de Finlanda (0,88 la 100.000) i
Luxemburg (0,85 la 100.000) au avut cea mai mare rat a notifcrilor. Rata
medie a notifcrilor a fost de 0,35 la 100.000 locuitori.
Distribuia pe grupe de vrst i sex
Din 1612 cazuri raportate la care au fost disponibile informaiile legate
de vrst, 55,8% au avut peste 65 ani i aceast grup de vrst a avut cea
mai mare rat a notifcrilor de 1,2 la 100.000 locuitori. Cazurile de listerioz
la copii sub 4 ani au reprezentat 7%, constiduind a doua rat a incidenei pe
grupe de vrst, cu 0,47 la 100.000. Cazuistica a fost relativ egal distribuit
la cele 1617 cazuri la care sexul a fost raportat (0,3 la 100.000 la femei i
0,4 la 100.000 la brbai).
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de listerioz uman n EU i EEA/EFTA n 2006
(n=1612 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
Sezonalitatea
Cazurile de listerioz au fost mai rar raportate n primul trimestru
al anului 2008 dect n restul anului. Cu toate acestea nu se poate discuta
despre o evoluie sezonier a acestei boli.
175
Distribuia sezonier a cazurilor de listerioz uman n EU i EEA/EFTA n 2006
Analiza ratei notifcrilor listeriozei n statele Uniunii Europene n
perioada 2003-2006 scoate n eviden o cretere semnifcativ a cazuisticii.
Totui, aceste date trebuie analizate cu pruden ntruct interpretarea
defniiei de caz i sistemele de supraveghere specifc difer n cadrul
Uniunii Europene de la un stat la altul. Majoritatea statelor raporteaz
c majoritatea cazurilor au origine domestic (59,7%) sau necunoscut
(36,6%). n 2006, Republica Ceh raporteaz un focar grav n care au fost
implicate 78 de cazuri cu 13 mori. Sursa acestui focar a fost brnza.
5.1.13. Transmiterea prin alimente
n prezent este general acceptat faptul c alimentele contaminate
reprezint principala cale de transmitere a acestei toxiinfecii. Dei diferite
din punct de vedere al constituenilor i al proceselor de preparare, alimentele
asociate cu transmiterea au urmtoarele aspecte comune: capacitatea de a
susine multiplicarea Lis. monocytogenes (coninut relativ mare n ap i pH
aproape neutru); contaminare relativ mare (> 10
5
/g) cu tulpina implicat;
procesare cu perioad de pstrare relativ extins; consum fr preparare
suplimentar.
Datorit faptului c tabletele de lucern sunt produse uscate, Lis.
monocytogenes nu este capabil s se dezvolte. Cu toate acestea, unul din
ingrediente (lucerna) avea proprieti similare celor descrise mai sus, n sensul
c nainte de uscare i ncapsulare era depozitat n condiii de umiditate, n
care apreau deteriorarea i posibil creterea Lis. monocytogenes.
176
Perioada de incubaie a infeciei transmise alimentar variaz larg
ntre indivizi, de la 1 la 90 zile, cu o medie de aproximativ 30 zile pentru
infecia intrauterin. Nu se tie dac aceste diferene dup ingestia oral sunt
dependente de doz sau de tulpin, sau dac refect diferene necunoscute
n susceptibilitatea gazdelor. Pe baza datelor de la un numr foarte mic
de cazuri, n alimentele consumate de pacieni nainte de infecie au fost
gsite nivele nalte de Lis. monocytogenes (10
3
->10
7
), sugernd c doza
infectant a fost mare. Totui, este necesar mult precauie, ntruct doza
infectant variaz probabil foarte mult de la individ la individ. n plus,
alimentele suspecte sunt, n general, disponibile pentru examinare numai
perioade scurte de timp i de aceea este mai probabil s fe examinate cele
de la pacieni cu perioad de incubaie scurt. Aceste observaii, mpreun
cu capacitatea Lis. monocytogenes de a se multiplica n alimente (chiar n
condiii ideale de depozitare) dovedesc c exist difculti considerabile n
stabilirea unui nivel sigur de Lis. monocytogenes n alimente, n scopul
elaborrii unor reglementri.
Dup cum s-a afrmat deja, Lis. monocytogenes este larg rspndit
n mediu, inclusiv n alimente, dei n general este prezent n numr mic.
Acest aspect, mpreun cu proprietile i tipurile de alimente asociate
infeciei susin probabilitatea unei doze infectante mari n cazul infeciei
alimentare.
Au fost descrise episoade de listerioza uman implicnd peste 100
indivizi. Unele din acestea au continuat pe perioade lungi de timp, ntre
6 luni i 5 ani, ceea ce se explic probabil prin colonizarea pe termen
lung a unui singur loc din mediul de prelucrare al alimentului, precum i
prin perioada de incubaie lung a unor pacieni. Facilitile din mediul
de prelucrare a alimentelor contaminate cu Lis. monocytogenes au inclus
echipamentul de prelucrare din lemn, rafturile metalice i din lemn, curelele
de transmisie poroase i canalele de scurgere din pardoseal. S-a demonstrat
c Listeria monocytogenes supravieuiete bine ntr-o varietate de medii n
care se prelucreaz alimente, n special n cele umede i cu materii organice
i c din aceste locuri se produce contaminarea n timpul prelucrrii.
Tabelul 5.3.
Cazuri sporadice de listerioza uman transmis pe cale alimentar
ar An Aliment implicat
SUA 1985 Crnciori de curcan
Anglia 1986 Brnz topit
177
ar An Aliment implicat
Anglia 1988 Brnz topit
Anglia 1988 Pui prjit
Canada 1989 Tablete cu lucerna
SUA 1989 Salam
Finlanda 1989 Ciuperci srate
Italia 1989 Salam
Italia 1989 Pete
Danemarca 1989 Icre de cod afumate
Canada 1989 Brnz topit
Belgia 1989 Frica proaspt i ngheat
Italia 1994 Msline murate
O comparaie ntre numrul de alimente ce conin Lis. monocytogenes
i numrul cazurilor de listerioza a indicat c majoritatea alimentelor
contaminate (chiar cele asociate cu izbucniri epidemice) au o rat de atac
foarte mic. Unele tulpini de Lis. monocytogenes pot avea o patogenitate
mai mare, dar bazele acesteia sunt puin nelese.
Date find proprietile i distribuia Lis. monocytogenes, cazurile
legate de o surs comun de infecie pot avea o distribuie foarte larg, att
temporal, ct i geografc. Unele episoade de listerioza de origine alimentar
au fost recunoscute n situaii foarte neobinuite i este posibil ca, n pofda
sistemelor de supraveghere naionale i internaionale, sursa comun s
rmn necunoscut.
5.1.14. Transmiterea listeriozei la animale
Avortul i septicemia animalelor nou-nscute sunt n mod clar rezultatul
infeciei intrauterine dobndite de la mam i exist un paralelism ntre
acestea, avortul i infecia neonatal cu debut precoce la om. Septicemia
mieilor (nsoit de meningit la unele animale) n primele cteva sptmni
de via a fost atribuit infeciei ombilicale dobndite n cursul naterii,
posibil din solul sau alimentele contaminate: aceasta corespunde infeciei
neonatale cu debut tardiv la om.
Irita i keratoconjunctivita apar de obicei n timpul iernii, la oile i
bovinele hrnite cu siloz. Ele se pot produce prin introducerea direct n ochi
a hranei contaminate i au fost asociate cu distribuia furajului n jgheaburi
sau iesle situate la nivelul ochilor.
178
Ca i n infecia uman, se presupune c majoritatea cazurilor de
listerioz animal sunt dobndite pe cale oral. La oi i bovine exist o
asociere strns ntre alimentaia cu siloz i toate manifestrile listeriozei,
dei unele cazuri apar i cnd nu se folosete acest furaj. Cu toate acestea,
mecanismul exact prin care alimentaia cu siloz duce sau predispune la
listerioz este neclar. n condiii normale, este imposibil producerea
acestui siloz lipsit de Listeria: germenul a fost izolat din siloz cu un pH
mai mic de 4, dei n numr foarte mic. Cnd se produce siloz de proast
calitate, fr a se realiza condiiile de pH sczut i anaerobioz, Listeria
prolifereaz i se gsete n numr mare. Calitatea slab este adesea datorat
calitii proaste a plantelor sau contaminrii cu sol i fecale. Tehnologia
actual de producere a silozului folosind prelate de polietilen a dus la o
cretere corespunztoare a listeriozei ovine n Marea Britanie. Dei aceast
metod este mai economic dect cele utilizate tradiional, plantele sunt mai
predispuse la alterare i la creterea listeriilor: un numr mare de germeni se
gsesc n locurile unde s-au produs deteriorri ale prelatei sau la marginea
acesteia. Incidena maxim a listeriozei animale n cursul primverii poate
refecta o scdere a calitii furajelor utilizate pentru hran. Observaia c
listerioza este adesea asociat cu slaba calitate a furajelor, n care se gsesc
cantiti mari de Lis. monocytogenes, sugereaz c doza infectant este
mare.
S-a sugerat c silozul ar putea avea un efect imunosupresor, dar
mecanismul nu a fost nc elucidat.
Att la oameni, ct i la animale, majoritatea infeciilor sunt probabil
rezultatul ingestiei unor alimente sau furaje n care s-a produs proliferarea
excesiv a Lis. monocytogenes.
Este neclar ce proporie din toate tulpinile de Lis. monocytogenes i
Lis. ivanovii prezente n mediu produc boala i de ce Lis. ivanovii este att
de rar patogen pentru om. Dei au fost identifcate unele culturi nepatogene
de Lis. monocytogenes, infecia experimental a animalelor (dei n modele
mai degrab nenaturale) nu a indicat o variaie foarte mare a virulenei.
Cu toate acestea, distribuia tipurilor de Lis. monocytogenes printre
tulpinile izolate din mediu i cele care produc boala este variabil. Att la
oameni, ct i la animale, proporia tipurilor de Lis. monocytogenes difer
semnifcativ n funcie de sindroamele produse. In plus, majoritatea tulpinilor
responsabile de episoadele aparent necorelate de listerioz uman transmis
pe cale alimentar au fost neateptat de asemntoare. Semnifcaia acestor
trei observaii nu este clar; totui, ele pot refecta adaptri ale tulpinilor
(sau speciilor) la diferite nie ecologice care afecteaz virulena.
n afar de infecia uman dobndit ca rezultat direct al ngrijirii
179
animalelor infectate sau prin hrana direct contaminat de la un animal
infectat (cum ar putea f cazul laptelui de la un animal cu mastit listeric),
conexiunile dintre listerioz uman i animal, dac exist, sunt neclare.
Analiza tulpinilor ce produc listerioz uman i animal sporadic indic
o larg varietate de tipuri n ambele grupuri, care n general nu par s fe
nrudite. Vrfurile sezoniere ale listeriozei umane i animale nu coincid,
sugernd, de asemenea, c ntre aceste dou grupuri nu exist relaii cauzale.
Acest fapt nu ar trebui poate s fe neateptat n cazul unui grup de patogeni
marginali, care nu sunt probabil bine adaptai i care sunt distribuii larg n
mediu, cu multe tipuri diferite.
Listeria monocytogenes i Lis. ivanovii sunt membrii unui grup de
bacterii adaptate la medii saprofte din sol i ap i au adaptri suplimentare
pentru supravieuirea n mediul intracelular al eucariotelor. Modul de
evoluie a acestor factori suplimentari este neclar. Acetia ar f putut evolua
pentru a permite supravieuirea la mamifere sau la un grup foarte diferit de
eucariote, cum ar f protozoarele.
La Centrul Naional de Referin pentru Zoonoze din INCDMI
Cantacuzino - Bucureti au fost trimise, n perioada 2002-2006, pentru
confrmare/identifcare, 30 tulpini ca suspiciuni Listeria spp. izolate din
produse alimentare de origine animal.
n studiul nostru s-au utilizat:
- agar cu 5% snge (defbrinat) de berbec;
- trus coloraie Gram (violet de genian, Lgol, amestec alcool-
aceton, fuxin 1/10 preparat extemporaneu);
- geloz moale 3 repartizat n tuburi 16/160 mm;
- geloz 2% mediu nclinat, repartizat n tuburi 16/160mm;
- medii lichide zaharate 1%, cu indicator albastru de bromtimol,
coninnd glucoz, lactoz, maltoz, zaharoz, salicin, adonit, trehaloz,
D-manit, D-manoz, L-ramnoz, D-xiloz;
- tulpini test CAMP: Staphylococcus aureus i Rhodococcus equi,
- seruri hiperimune de iepure adsorbite Lis. monocytogenes la si 4b.
S-au efectuat urmtoarele teste recomandate pe plan internaional:
1. nsmnarea tulpinilor pe mediul agar 5% snge (defbrinat) de
berbec, pentru obinerea de colonii izolate; dup termostatare peste noapte
la 35-37C s-a examinat aspectul morfocultural al coloniilor.
2. nsmnarea agarului 2% mediu nclinat i incubarea 48 ore la
35-37C, pentru examinarea culturii n lumin oblic i observarea apariiei
irizaiei bleu-verzuie.
3. Efectuarea de frotiuri din cultur pur, colorate dup metoda
180
Gram i examinate microscopic cu obiectiv 90 imersie.
4. Efectuarea testului mobilitii, prin neparea n dublu a mediului
geloz moale 3, incubare 24 ore la 35-37C i, n paralel, la temperatura
camerei, cu examinarea modului de cretere a culturii.
5. Efectuarea testului CAMP cu striu de Staphylococcus aureus i
Rhodococcus equi, pentru a urmri apariia beta-hemolizei.
6. Insmnarea n medii lichide zaharate 1% - cu indicator albastru
de bromtimol - pentru a urmri fermentarea carbohidrailor, prin producerea
de acid dup incubare 24 ore la 35-37C
7. Serotiparea tulpinilor de Lis. monocytogenes prin reacia de
aglutinare cu seruri de iepure adsorbite 1a i 4b.
Tabelul 5.4
Tulpini de Listeria spp. Izolate din produse alimentare (nr./%)
Produs Produse din carne Produse lactate Total tulpini
An NR. % NR. % NR. %
2002 7 23,33 2 6,66 9 30,0
2003 - - - - - -
2004 1 3,33 - - 1 3,33
2005 11 36,66 - - 11 36,66
2006 7 23,33 2 6,66 9 30,0
Total tulpini 26 86,66 4 13,33 30 100
Tabelul 5.5
Apartenena la speciile listeria conform investigaiilor efectuate
(Nr. rezultate pozitive/%)
Specie
Lis. monocytogenes
Lis. innocua L. gray
Lis.
welshimeri serovar 1a serovar 4b
Test Nr. % Nr. % Nr. % Nr. % Nr. %
Beta-hemoliza 7 23,33 - - - - - - - -
Testul
CAMP
S. aureus 7 23,33 - 3,33 - - - - - -
R. equi - - - - - - - - - -
Mobilitatea 7 23,33 - 3,33 - - - - - -
Testul oxidazei - - - - - - - - - -
Testul catalazei 7 23,33 - 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66
181
Tabelul 5.6
Apartenena la speciile listeria conform investigaiilor efectuate
(Nr. Rezultate pozitive / %)
Lactoz - - - - 2 6,66 - - - -
Zaharoz - - - - 2 6,66 - - -
Maltoz 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66
Trehaloz 2 6,66 1 3,33 2 6,66 - - - -
Salicin 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66
D-Manit - - - - - - 1 3,33 - -
D-Manoz 7 23,33 1 3,33 19 63,33 - - 2 6,66
L-Ramnoz 7 23,33 1 3,33 1 3,33 - - 1 3,33
D-Xiloz - - - - 2 6,66 - - - -
Identifcare serologic
L.m. 1a 7 23.33 - - - - - - - -
L.m. 4b - 1 3,33 - - - - - -
Total tulpini 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66
Tabelul 5.7
Specii listeria izolate din produse alimentare (nr./%)
Specie
L.monocytogenes
L.innocua L.gray L.welshimeri
serovar la serovar 4b
Produs Nr. % Nr. % Nr. % Nr. % Nr. %
Carne tocat 1 3,33 - 8 26,66 - -
Past mici 1 3,33 - - - -
Crnati 3 10,0 - 3 10,0 - -
esut
muscular
cal - - 1 3,33 - -
porc - - 3 10,0 - -
bovina
i i
i i
Slnin lucru - - 1 3,33 - -
Costi afumat 1 3,33 - - - -
Spat porc - - 1 3,33 - -
Carcas pasre - 1 3,33 - - -
Cacaval - - 1 3,33 - -
Lapte praf - - - - 2 6,66
Lapte crud - - 1 3,33 - -
Total tulpini
7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66
182
n urma studiului efectuat n INCDMI Cantacuzino i Facultatea de
Medicin Veterinar, Bucureti s-au desprins urmtoarele concluzii:
Confrmarea bacteriologic a genului 1. Listeria s-a obinut la toate
cele 30 tulpini investigate.
Testele preliminare, cu caracter diferenial n cadrul genului, 2.
au relevat caracteristicile morfoculturale, microscopice i biochimice
(producerea de acid din D-manoz i L-ramnoz, fr a ataca D-manita i
D-xiloza ) ale Lis. monocytogenes la 8 tulpini.
Serotiparea, prin reacia de aglutinare cu seruri de iepure adsorbite, 3.
a permis evidenierea a 7 tulpini Lis. monocytogenes serovar 1a i o tulpin
Lis. monocytogenes serovar 4b, 19 tulpini au fost evideniate ca find Lis.
innocua, 1 tulpin a fost identifcat ca Lis. grayi, iar 2 tuplini ca Lis.
welshimeri.
Lis. monocytogenes 4. , specia tip a genului Listeria, condiionat-
patogen pentru om i animale, a fost ntlnit n produse de carne n curs
de preparare sau netratate termic. De asemenea, 17 din cele 19 tulpini
identifcate ca Lis. innocua i o tulpin Lis. grayi, nepatogene, au fost
evideniate n preparatele de carne.
n produse lactate (cacaval, lapte praf, lapte crud) au fost 5.
evideniate dou tulpini Lis. innocua i o tulpin Lis. welshimeri, probabil
contaminate n timpul procesrii sau pstrrii.
Listeriile pot proveni de la animale purttoare de germeni sau pot 6.
coloniza diversele suprafee inerte, ori pot forma bioflme pe suprafaa
alimentelor n curs de procesare.
Lis. monocytogenes 7. la, serotip frecvent ntlnit n Romnia, unde
boala are caracter sporadic, a fost relevat in produse de carne de provenien
indigen.
Lis. monocytogenes 8. 4b, serotip rspndit n rile Europei
occidentale i America de Nord, unde boala poate evolua sub aspect
epidemic, a fost prezent n produse de origine animal, import Italia.
Lis. innocua 9. este considerat specie nepatogen pentru om i
animale, ca i Lis. grayi i Lis. welshimeri.
Speciile de 10. Listeria ntlnite n produse lactate provenite din lapte
pasteurizat sunt considerate ca germeni de contaminare din mediul extern.
11. Lis. monocytogenes are cel mai important potenial patogen pentru
om i animale.
183
5.1.15. Toxiinfeciile alimentare produse de Listeria monocytogenes
Pentru prima data Listeria monocytogenes fost descris n 1911 de
ctre Hiilphers, dup care n 1923 Murray et. al. a facut o descoperire mai
amnunit a acestei bacterii.
Primul caz uman de listerioz a fost raportat n 1929, boala avnd o
evoluie sporadic. Lis. monocytogenes este agentul etiologic cel mai des
ntlnit i a fost izolat n Anglia i ara Galilor n 98% din cazurile umane
i 85% din cele animale. Lis. ivanovii a produs infecia n 3 cazuri umane,
iar Lis. seeligeri numai ntr-unul.
ntre 1986-1988 numrul de cazuri de listerioz uman a sczut n
Anglia i ara Galilor. Rata de mortalitate la 558 de cazuri umane n Marea
Britanie a fost de 46%.
n perioada 1983-1987 au fost raportate 775 de cazuri n ara Galilor
cu 219 (28%) mori, find neabortigen.
Numrul de cazuri de listerioz la 1 milion de oameni n 1992 a fost
n Australia 2, Canada 2-4, Danemarca 4-5, Marea Britanie 2-3 i n S.U.A
de 4. Numrul estimativ total de cazuri, n SUA, n 1993 a fost de 1092 cu
248 de cazuri. Nu toate au fost de origine strict alimentar.
n Belgia i Olanda 10% din vacile snatoase testate au fost purttoare
de listerii, iar n probele de fecale umane recoltate din diferite centre de
prelucrarea hranei au fost pozitive 5%.
n Marea Britanie, ntr-o perioad de 18 luni, din 5000 de probe de
fecale analizate, 32 au ieit pozitive.
Infecia ncruciat cu Lis. monocytogenes a fost observat n infeciile
congenitale ale noilor nscui, pn la cei aparent sntoi. Listeria a fost
izolat de la oameni sntoi n proporie de 1% pn la aproape de 15%.
n cazul fast-food-urilor, carnea i produsele din carne de pasre
reprezint principalele surs de infecie.
Mijloacele de aprare ale organismului:
Rezistena organismului la patogenii intracelulari (virusuri, parazii,
Listeria monocytogenes) este mediat de celulele T (limfocite care se
formeaz n mduva osoas i a cror maturare are loc n timus).
Spre deosebire de celulele B prin care se realizeaz imunitatea umoral,
celulele T activate acioneaz direct asupra non-selfului.
Atunci cnd un patogen ptrunde n interiorul celulei gazd acesta nu
mai poate f distrus de ctre anticorpii circulani, ns prezena patogenului
184
este semnalat de schimbrile structurale de la nivelul celulei parazitate.
Celulele T sunt implicate n distrugerea celulei gazd care nu mai este
recunoscut ca self.
Macrofagele leag i prezint Lis. monocytogenes celulelor T, n
aa fel nct s fe recunoscute ca non-self. Atunci cnd celulele T atac
bacteriile, ele se mresc n dimensiuni i formeaz clone specifce antigenelor
respective. Celulele T pentru a f activate secret interleukina-1 (IL-1), iar
apoi se multiplic i se difereniaz pentru a forma diverse substraturi. Cele
mai importante subseturi de celule T sunt cele helper sau CD4(L3T4
+
)
si cele killer CD8(Lyt2
+
). Celulele TCD
4
reacioneaz cu antigenul dup
producerea de linfokine (citokine): IL-1, IL-2, IL-6 sau gamma interferon
i altele.
Gamma interferonul (a crui producie este asistat de factorul de
necroz al tumorilor induce producerea de receptori IL-2 pe monocite.
De asemenea IL-2 mrete activarea celulelor Killer care pot liza
macrofagele infectate.
IL-2 administrat la oarece ntr-o cantitate mai mic de 0,6 micrograme/
oarece, mrete rezistena acestora la Lis. monocytogenes.
Gamma interferonul activeaz macrofagele i celulele killer. Acestea
din urm lizeaz macrofagele infectate. Att CD4 ct i CD8 sunt stimulate
de Lis. monocytogenes activnd macrofagele (prin producia lor de gamma
interferon) i contribuind la rezistena la listerioz. Se pare c infecia indus
experimental la oarece este asemntoare cu cea de la om.
O dat cu nglobarea bacteriei de ctre macrofage acestea secret la
locul infeciei un factor de cretere a monocitopoezei (factor-increasing-
monocytopoiesis) (FIM). Acesta este transportat n mduva osoas unde
stimuleaz producerea de alte macrofage. Numai listeriile viabile pot induce
rspunsul celulelor T i imunitatea contra listeriozei. LLO reprezint factorul
de virulen la Lis. monocytogenes care stimuleaz reacia celulelor T i
este o proteina termosensibil. Subsetul celulelor (CD
8
) pare a f principalul
component responsabil de imunitatea anti-listeria, stimulnd producerea
de citokine de ctre macrofage; imunitatea pasiv poate f dobndit prin
transferul subsetului de celule CD
8
.
Aciunea Lis. monocytogenes relev rolul multifuncional al
limfokinelor n imunitatea celulelor T i importana critic aparent a
factorului primar de virulen LLO al acestei bacterii. Ceea ce face ca
gazdele imunocompromise s fe mult mai susceptibile la acest tip de
infecie este efectul agenilor imunosupresori asupra sistemului de celule T.
Pe baza rolului jucat de limfokine n aprarea organismului au fost sugerate
unele terapii posibile, dar efectele acestora la om sunt nc neclare.
185
Rezistena bacteriei n alimente:
Datorit faptului c Lis. monocytogenes rezist la temperaturi cuprinse
ntre 1-45C i la un pH ntre 4,1-9,6 este de ateptat ca aceasta s reziste n
alimente o lung perioad de timp, iar acest lucru a fost confrmat.
Tulpinile Scott A i V7 inoculate n cacaval n cantitate de 10
4
-10
5
/g
au supravieuit 28 de zile la 3C.
Cnd aceste dou tulpini au fost inoculate n brnza Camembert
mpreun cu alte dou tulpini creterea a avut loc n 18 zile de la maturare
cu niveluri de 10
4
-10
5
iar dup 65 de zile de 10
6
-10
7
/g.
Lis. monocytogenes a supravieuit n pachetele cu cacaval cu acid
ascorbic 0,3%, 130 de zile.
Limitele legale ale numrului de listerii din alimente:
Unele ri au stabilite limite legale ale numrului de listerii din alimente
(n special cele de tip fast-food), n timp ce altele nu.
Guvernul S.U.A. duce cea mai strict politic n ceea ce privete
numrul de germeni din alimente acetia find desemnai cu termenul de
adulterani. Acest lucru se traduce prin faptul c orice aliment fast-food
care conine acest germen n probele de 50 grame poate f reinut sau retras
de pe piaa.
Tolerana 0 n general nseamn absena microorganismului n probele
de 25 grame.
Comisia Europeana (EC) a dat o directiv pentru produsele i
subprodusele din lapte prin care specifc tolerana 0 pentru brnzeturile
fne i absena bacteriei n probe de 1g pentru celelalte produse.
Comisia Internaional de Microbiologie Specifc Alimentelor
(ICMSF) a stabilit c dac acest microorganism nu depete 100 germeni/
gram n momentul consumului, alimentul poate f consumat de ctre indivizii
sntoi.
n anii 1994-1998 n S.U.A. Lis. monocytogenes a fost responsabil
de 61% din cele 1328 retrageri de alimente, urmat de salmonele cu 11%.
Oricum nu este corect s presupunem c toate alimentele confscate ar
f provocat boala dac ar f fost vndute. Nu toate tulpinile produc listerioze
la oameni, iar carnea i produsele de carne de pasre nu sunt folosite n
acelai mod de ctre consumatori.
5.1.16. Proflaxie i combatere
Productorii de alimente i de echipament pentru procesarea acestora
trebuie s cunoasc proprietile listeriei. Fabrica i echipamentul trebuie
186
proiectate astfel nct s faciliteze curenia i igienizarea, pentru a reduce
posibilitatea contaminrii i colonizrii cu Lis. monocytogenes. Productorii,
transportatorii i comercianii alimentelor perisabile trebuie s utilizeze
un bun echipament de refrigerare, mpreun cu o mpachetare adecvat i
informaii pentru consumator, de tipul termenului de garanie i al condiiilor
optime de pstrare. Pentru sigurana i calitatea produsului fnal, este
recomandabil aplicarea unui program de tipul HACCP sau a unei scheme
de control i evaluare similare. n ultimul deceniu, industria alimentar din
Europa i America de Nord a fost activ n investigarea prezenei listeriei
n alimente i mediul, n implementarea analizelor de risc i n stabilirea
unor coduri de procedur existnd dovezi care atest ameliorarea calitii
microbiologice a unor alimente n aceast perioad.
Deoarece Listeria monocytogenes este un patogen potenial, iar
detectarea altor specii de Listeria poate indica o contaminare a mediului (n
special, n cazul acelor alimente care au trecut printr-un proces bactericid),
idealul ar f excluderea tuturor germenilor din alimente, aciune care ar trebui
ntreprins viguros. Realizarea acestui obiectiv este probabil impracticabil
pentru toate alimentele i este n mod clar de neatins n cazul alimentelor
crude sau a celor care nu au fost supuse unui proces listericid. Reacia
autoritilor naionale fa de prezena Listeriei n alimentele vndute cu
amnuntul a variat de la excluderea total a anumitor alimente (politic
aplicat n Statele Unite ale Americii i n unele ri din Comunitatea
European), pn la tolerana unei anumite contaminri.
Listeria monocytogenes se poate multiplica (dei lent) la temperaturile
de refrigerare, de aici rezultnd nu numai importana excluderii sale din
alimente, ci i a inhibrii multiplicrii i supravieuirii sale. Aceast problem
poate f abordat prin mbuntirea reglementrilor privind temperatura i
durata de pstrare. n prezent este posibil evaluarea nivelului de Listeria
din alimente, ceea ce furnizeaz informaii suplimentare valoroase asupra
calitii microbiologice a acestora, prin faptul c un nivel mai nalt
refect probabil nclcri ale normelor de igien, durat i temperatur de
depozitare.
Pentru evitarea listeriozei i a altor toxiinfecii alimentare, publicul
larg trebuie educat n ce privete utilizarea alimentelor de bun calitate i
a msurilor de igien personal, din momentul cumprrii hranei pn la
consum. Aceasta include evitarea contaminrii ncruciate ntre alimentele
crude i cele gtite, utilizarea unor frigidere corespunztoare i nedepirea
duratei de pstrare normale a alimentelor. ntruct Listeria este larg
rspndit n mediu, evitarea total i eliminarea complet a germenului
din toate alimentele este imposibil i este probabil c toi indivizii vor
187
f la un moment dat expui infeciei cu Listeria. Cu toate acestea, femeile
gravide i persoanele imunocompromise prezint un risc mai mare de a
contracta listerioza. n multe ri (incluznd Marea Britanie, Statele Unite
ale Americii, Frana, Noua Zeeland i unele regiuni din Australia) indivizii
expui riscului sunt sftuii s-i ia msuri speciale de precauie. Alimentele
preparate sau semipreparate, cum ar f brnzeturile cu past moale i pateul,
s-au dovedit a f n mod special periculoase. n Anglia i ara Galilor a
fost emis recomandarea general ca indivizii vulnerabili s nu le consume.
O alt recomandare general a fost emis n Statele Unite pentru evitarea
unor tipuri de brnz (telemea i brnza de tip mexican), a alimentelor tip
delicates i pentru renclzirea preparatelor din carne. n lumina recentelor
pusee epidemice din Australia, ar putea f, de asemenea, prudent evitarea
unor alimente gtite precum i a semipreparatelor din pete i molute.
Indivizii susceptibili trebuie s evite consumarea crnii i alimentelor
de origine marin crude sau inadecvat preparate, s spele fructele i legumele
care vor f consumate crude i s renclzeasc atent toate alimentele
semipreparate nainte de consum, n special pe cele nalt procesate
anterior.
O afeciune pseudogripal inexplicabil la femeile gravide sau la cei
imunocompromii trebuie investigat prin hemoculturi. n plus, persoanele
care ngrijesc animalele infectate trebuie s cunoasc posibilitatea listeriozei
oculare sau cutanate i s solicite asisten medical n cazul dezvoltrii
unor leziuni suspecte. De asemenea, poate f prudent avertizarea femeilor
gravide i a celor imunocompromii s evite asistarea la ftarea mieilor,
s nu mulg oile care au ftat recent, s nu intre n contact cu placentele i
mieii nou-nscui. Acestea reprezint n mod clar ci poteniale de infecie,
dei, cu excepia leziunilor oculare i cutanate, nu s-au observat asociaii
semnifcative ntre cazurile de listerioza i mediul rural.
Pentru prevenirea infeciei ncruciate n perioada neonatal trebuie
ntreprinse msuri stricte de control al infeciei in momentul naterii. Aceste
msuri necesit ngrijirea separat a pacienilor, utilizarea echipamentului
sterilizat termic sau a celui de unic folosin, tergerea cu alcool a
suprafeelor, purtarea mnuilor i a orurilor, care vor f schimbate nainte
de splarea minilor i asistarea altor pacieni.
Deoarece listerioza uman este o afeciune rar, schemele de
supraveghere i investigare epidemiologic a cazurilor sunt eseniale
pentru identifcarea grupurilor de pacieni cu aceeai surs i cale de
infecie. Utilizarea studiilor tip caz-control pentru investigarea puseelor de
listerioza a avut rezultate contradictorii, iar episoadele cu surs comun pot
f recunoscute numai prin recoltarea produselor patologice de la pacienii
188
infectai i identifcarea tulpinilor comune. ntruct Lis. monocytogenes este
larg rspndit n mediu (inclusiv n alimente), este important utilizarea
schemelor de tipaj discriminatoriu n compararea izolatelor. Metodele
de determinare a subtipurilor aplicate la Lis. monocytogenes au inclus
serotipajul, tipajul cu bacteriocin, analiza plasmidelor, tipajul fagic, analiza
fragmentelor de restricie DNA (incluznd electroforeza n gel), amplifcarea
aleatorie a DNA-ului polimorf i electroforeza enzimatic multilocular.
Metodele tradiionale de analiz au utilizat serotipajul i tipajul fagic, dei
combinarea acestora cu metodele moleculare sau cu electroforeza enzimatic
multilocular ofer un grad mult mai nalt de discriminare. Pentru a utiliza
aceste metode este necesar o investiie considerabil de timp, personal
i echipament, acestea find practicabile numai n laboratoarele centrelor
naionale de referin cu un interes special pentru Listeria.
Dup cum s-a discutat anterior, pentru prevenirea listeriozei animale
trebuie acordat atenie hranei acestora, n special furajelor. Pentru uz animal
au fost elaborate vaccinuri vii atenuate, afrmndu-se c acestea ofer o
oarecare protecie, dei studiile n teren sunt echivoce. Totui, o dat cu
revoluia aprut n nelegerea patogenezei acestei infecii i a interaciunilor
agentului etiologic cu imunitatea celular a gazdei, mpreun cu capacitatea
de manipulare genetic, pare probabil c Listeria va reprezenta n viitor un
domeniu activ de investigaie.
5.1.17. Metoda i schema de lucru utilizat pentru izolarea i
identifcarea lui Lis. monocytogenes
Se obine omologatul alimentar din amestecarea a 25 grame de aliment
cu 225 mililitri de ap peptonat i se amestec bine ntr-un blender steril.
Incubarea se realizeaz la 20C, timp de 1-2 ore.
Prembogirea. Se amestec 25 grame de prob cu 225 mililitri
bulion Demi-Fraser (M82). Incubarea se realizeaz la 30C, timp de 24 de
ore.
mbogirea selectiv. Cte 1 mililitru din cultura obinut prin
resuscitare i prembogire se nsmneaz n 100 mililitri bulion Demi-
Fraser. Incubarea se realizeaz la 30C, timp de 24 de ore.
Trecerea pe mediul selectiv de izolare. 0,1 mililitri din cultura ca
atare sau din amestecul 0,5 mililitri cultur + 4,5 mililitri KOH se striaz pe
suprafaa agarului Palcom (M83). Incubarea se realizeaz la 35C, timp de
24-48 de ore.
Izolarea coloniilor caracteristice. Se selecteaz 5 colonii tipice i se
paseaz n plci Petri cu agar nutritiv (sau agar TSYEA). Se incubeaz la
189
35-37C, timp de 18-24 de ore.
Identifcarea i confrmarea lui Lis. monocytogenes
1. Coloraia Gram: listeriile apar ca bacili Gram pozitivi sau
cocobacili.
2. Testul mobilitii: se transplanteaz de pe mediile agarizate,
selective, 5 colonii caracteristice ntr-o eprubet cu bulion creier i cord de
bovin i 3 colonii ntr-o eprubet cu agar nutritiv moale i se incubeaz la
25C, 24 de ore. Se execut, din cultura n bulion, examenul ntre lam i
lamel. Lis. monocytogenes prezint o mobilitate intens i caracteristic i
execut micri de rostogolire ce alterneaz cu scurte perioade de repaus. Pe
agarul moale, mobilitatea bacteriei este exprimat prin dezvoltarea culturii
sub form de umbrel.
3. Testul catalazei: Catalaza este o enzim hemoporfrinic, ce
catalizeaz reacia de descompunere a apei oxigenate. Reacia se evideniaz,
atunci cnd se pune n contact o ans de cultur cu o pictur de ap
oxigenat. Apariia bulelor de gaz se interpreteaz ca reacie pozitiv, find
specifc pentru listerii.
4. Fermentarea carbohidrailor: Se folosete ap peptonat cu rou-
fenol. Listeria monocytogenes fermenteaz glucoza i ramnoza, cu producere
de acid, fr producere de gaz, dar nu fermenteaz xiloza i manitolul.
Teste de confrmare:
a) Testul hemolizei. Prin acest test se pot diferenia dou specii strns
nrudite i anume Lis. monocytogenes i Lis. innocua. Speciile hemolitice
de listerii sunt: Lis. monocytogenes, Lis. ivanovii, Lis. seeligeri.
Se procedeaz astfel: suprafaa agarului cu snge de oaie se striaz
cu cultura bacterian de testat. Se incubeaz 24 de ore la 35-37C. Lis.
monocytogenes formeaz colonii mici cu un halou mic, clar, n jur, specifc
hemolizei beta. Lis. ivanovii are o activitate hemolitic puternic formnd
n jurul coloniilor zone clare, ntinse, iar Lis. seeligeri produce o hemoliz
slab.
b) Testul CAMP. Poate evidenia clar caracterele hemolitice i se
realizeaz prin nsmnarea lui Stp. aureus i Rco. equi sub form de
striuri, ntr-o singur direcie pe placa cu agar snge, iar tulpinile de Listeria
perpendicular, fa de traiectoria acestora, fr a le atinge. Hemoliza
tulpinilor de Lis. monocytogenes este mai exacerbat n apropierea striului
de Stp. aureus, iar pentru Lis. ivanovii, numai n apropierea striului de Rco.
equi.
190
Testarea patogenitii: se realizeaz pe baza urmtoarelor teste:
testul lui Anton;
pe oareci imunocompromii, infectai intraperitoneal cu tulpini
virulente de Lis. monocytogenes;
prin inocularea pe membrana corioalantoidian a oului embrionat.
Testul lui Anton: se realizeaz pe cobai, prin instilare n sacul
conjunctival a ctorva picturi dintr-o cultur proaspt de 24 de ore. n
cazul reaciei pozitive apar simptome de cheratoconjunctivit purulent,
care se vindec spontan n cteva zile.
191
Lis. monocytogenes frotiu din cultur. Se
remarc polimorfsm, forme predominant
bacilare, dar i forme cocobacilare, cocoide.
Lis. monocytogenes microscopie electronic;
Bacili scuri, drepi sau ncurbai
Lis. monocytogenes microscopie
electronic, coloraie negativ
Lis. monocytogenes hemocultur.
Listeriile apar fe extracelular, fe
fagocitate, ceea ce constituie o prob cert
n diagnosticul listeriozei
Lis. monocytogenes testul CAMP
Lis. monocytogenes testul mobilitii.
n mediile semisolide, dup nsmnarea
listeriei prin neparea mediului n
profunzime i incubarea la 37C, aceasta
crete sub forma unei umbrele.
192
Microscopie electronic a unui macrofag dup 8 ore de la infecia cu Lis. monocytogenes.
Bacteria a trecut de bariera lizozomilor i se divide n citoplasm. Cromatina nucleului
macrofagului apare condensat i citoplasma se af ntr-un stadiu progresiv de liz
Mediul OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria
Agar) coloniile de Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes beta hemoliz
Nucleu
Listeria n citoplasm
193
Fenlon, D.R., T. Stewart, and W. Donachie. 1995. The incidence, numbers 1.
and types of Listeria monocytogenes isolated from farm bulk tank milks. Lett.
Appl. Microbiol. 20:57-60,
Focgeding, P.M., and N.W. Stanley. 1990. 2. Listeria monocytogenes P5069
thermal death times in liquid whole egg, y. Food Protect. 33:6-8.
Galsworthy, S.B., and D. Fewster. 1988. Comparison of responsiveness to the 3.
monocytosis-producing activity of Listeria monocytogenes in mice genetically
susceptible or resistant to listeriosis. Infection 16(Suppl. 2):118-122.
Geoffroy, C, J.-L. Gaillard, J.E. Alouf, and P. Berche. 1989. Production of 4.
thiol-dependent haemolysins by Listeria monocytogenes. J. Gen. Microbiol.
135:481487.
Geoffroy, C, J.-L. Gaillard, J.E. Alouf. and P. Berche. 1987. Purifcation, 5.
characterization, and toxicity of the sulfhydryl-activatcd hemolysin
listeriolysin O from Listeria monocytogenes. Infect. Ininiun. 55:1641-1646.
George, S.M., B.M. Lung, and T.F. Brocklehurst. 1988. The effect of pH and 6.
temperature on initiation of growth of Listeria monocytogenes. Lett. Appl.
Gilbert, R.J. 1992. Provisional microbiological guidelines for some ready-to- 7.
eat foods sampled at point of sale: Notes for PHLS Food Examiners. Public
Health Serv. Lab. Q. 9:98-99.
Gilbert, R.J., and P.N. Pini. 1988. Listeriosis and foodborne transmission. 8.
Lancet 1:472-473.
Gitter, M., R. Bradley, and PH. Blampied. 1980. 9. Listeria monocytogenes
infection in bovine mastitis. Vet. Rec. 107:390-393.
Glass, K.A., and M.P Doyle. 1990. Fate of 10. Listeria monocytogenes in
processed meat products during refrigerated storage. Appl. Environ. Microbiol.
55:1565-1569.
Golnazarian, C.A., C.W. Donnelly, S.J. Pintauro, and D.B. Howard. 11.
1989. Comparison of infectious dose of Listeria monocytogenes F5817 as
determined for normal versus compromised C57B1/6J mice. J. Food Protect.
52:696-701.
Grau, F.H., and P.B. Vanderline. 1990. Growth of 12. Listeria monocytogenes on
vacuum-packaged beef. J. Food Protect. 53:739-741.
Green, S.S. 1990. 13. Listeria monocytogenes in meat and poultry products.
Interim Rept. to Natl Adv. Comm. Microbiol. Spec. Foods. FSIS/USDA,
Nov. 27.
194
Groves. R.D., and H.J. Welshimer. 1977. Separation of pathogenic from 14.
apathogenic Listeria monocytogenes by three in vitro reactions. J. Clin.
Haak-Frendscho, M., K.M. Young, and C.J. Czuprynski. 1989. Treatment 15.
of mice with human recombinant interleukin-2 augments resistance to the
facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. Infect. Immitn.
57:3014-3021.
Harrison, M.A., and Y.-W. Huang. 1990. Thermal death times for 16. Listeria
monocytogenes (Scott A) in crabmeat. J. Food Protect. 53:878-880.
Heisick, J.E., D.E. Wagner, M.L. Nierman, and J.T Peeler. 1989. 17. Listeria spp.
found on fresh market produce. Appl. Environ. Microbiol. 55:1925-1927.
Hird, D.W. 1987. Review of evidence for zoonotic listeriosis. /. 18. Food Protect.
50:429-433.
Hogen, C.J., E.R. Singleton, K.S. Kreuzer, E.M. Sloan, and J.N. Sofos.. 1998. 19.
Isolation of catalasc-negative Listeria monocytogenes from foods. Dairy Food
Environ. Sanit. 18:424-426.
Hof, H., and P. Hefner. 1988. Pathogenicity of 20. Listeria monocytogenes in
comparison to other Listeria species. Infection l6(Suppl. 2): 141-144.
Igarashi, K.-I., M. Mitsuyama, K. Muramori, H. Tsukada, and K. Nomoto. 21.
1990. Interleukin-1 -induced promotion of T-cell differentiation in mice
immunized with killed Listeria monocytogenes. Infect. Ininiim. 58:3973-3979.
Jacquet, C, E. Gouin, D. Jcannel, P. Cossart, and J. Rocourt. 2002. Expression 22.
of ActA, Ami, InlB. and listeriolysin O in Listeria monocytogenes of human
and food origin. Appl. Environ. Mirobiol. 68:616-622.
Jay, J.M. 1996. Prevalence 23. of Listeria spp. in meat and poultry products. Food
Control 7:209-214.
Johnson. J.L., M.P. Doyle, and R.G. Cassens. 1990. 24. Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. in meat and meat products. A review. J. Food Protect.
53:81-91.
Johnson, J.L., M.P. Doyle, and R.G. Cassens. 1988. Survival of 25. Listeria
monocytogenes in ground beef. Int. J. Food Microbiol. 6:243-247.
Jones, D. 1988. The place of 26. Listeria among Gram-positive bacteria. Infection
16(Suppl. 2):85-88.
Junttila, J., J. Hirn, P. Hill, and E. Nurmi. 1989. Effect of different levels 27.
of nitrite and nitrate on the survival of Listeria monocytogenes during the
manufacture of fermented sausage.,/ Food Protect. 52:158-161.
Junttila. JR.. S.I. Nicmcla, and J. Him. 1988. Minimum growth temperatures 28.
of Listeria monocytogene* and nonhaemolytic listeria. J. Appl. Bacterial.
195
65:321-327.
Kampelmacher, E.H., and L.M. Van Nooble Jansen. 1969. Isolation of 29. Listeria
monocytogenes from faeces of clinically healthy humans and animals. Zentral.
Bakt. Inf. Abt. Orig. 211:353-359.
Kathariou. S. 2002. 30. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food
safety perspective. J. Food Protect. 65:1811-1829.
Kaufmann, S.H.E. 1988. 31. Listeria monocytogenes specifc T-cell lines and
clones. Infection 16(Suppl. 2): 128-136.
Kaufmann. SHE.. E. Hug. U. Vath. and I. Muller. 1985. Effective protection 32.
against Listeria monocytogenes and delayed-type hypersensitivity to listerial
antigens depend on cooperation between specifc L3T4+ and Lyt2+ T cells.
Infect. Immun. 48:263-266.
Kouassi. Y.. and L.A. Shelef. 1995. Listeriolysin O secretion by 33. Listeria
monocytogenes in broth containing salts of organic acids../. Food Protect.
58:1314-1319.
Kreft. J.. D. Funke. A. Haas. F. Lottspeich. and W. Goebel. 1989. Production, 34.
purifcation and characterization of hemolysins from Listeria ivanovii and
Listeria monocytogenes Sv4b. FEMS Microbiol. Lett. 57:197-202.
Kurtz. R.S., K.M. Young, and C.J. Czuprynski. 1989. Separate and combined 35.
effects of recombinant interleukin-1 a and gamma interferon on antibacterial
resistance. Infect. Immun. 57:553-558.
Kwantes. W., and M. Isaac. 1971. Listeriosis. 36. Br. Med. J. 4:296-297.
Leasor, S.B., and P.M. Foegeding. 1989. 37. Listeria species in commercially
broken raw liquid whole egg. J. Food Protect. 52:777-780.
Lammerding, A.M., and J.M. Farber. 1994. The status 38. of Listeria monocytogenes
in the Canadian food industry. Dairy FoodEmiron.Sanit. 14:146-150.
Lingnau, A., E. Domann, M. Hudel, M. bock, T. Nichterlein. J. Wehland. and 39.
T. Chakraborty. 1995. Expression of the Listeria monocytogenes EGD in IA
and iw7B genes, whose products mediate bacterial entry into tissue culture
cell lines, by PrfA-dependent and -independent mechanisms. Infect. Immun.
63:3896-3903.
Linton, R.H., M.D. Pierson, and J.R. Bishop. 1990. Increase in heat resistance 40.
of Listeria monocytogenes Scott A by sublethal heat shock. J. Food Protect.
53:924-927.
Liu. Z.. and C. Cheers. 1993. The cellular source of interleukin-6 during 41.
Listeria infection. Infect. Immun. 61:2626-2631.
Loessner. M.J., and M. Busse. 1990. Bacteriophage typing of 42. Listeria species.
Lovett, J., I.V. Wesley, M.J. Vandermaaten, J.G. Bradshaw, D.W. Francis, R.G. 43.
196
Crawford, C.W. Donnelly, and J.W. Messer. 1990. High-temperature short-time
pasteurization inactivates Listeria monocytogenes. J. Food Protect. 53:734-
738.
Lovett, J. 1988. Isolation and identifcation of 44. Listeria monocytogenes in dairy
products. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71.658-660.
Lovett. J., D.W. Francis, and J.M. Hunt. 1987. 45. Listeria monocytogenes in raw
milk: Detection, incidence, and pathogenicity. J. Food Protect. 50:188-192.
Ludwig, W., K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt. 1984. 16S rRNA analysis 46.
of Listeria monocytogenes and Brochothrix thermosphacta. FEMS Microbiol.
Lett. 25:199-204.
Lund. B.M., M.R. Knox, and MB. Cole. 1989. Destruction of 47. Listeria
monocytogenes during microwave cooking. Lancet 1:218.
Mackeness, G.B. 1971. Resistance to intracellular infection. 48. J. Infect. Dis.
123:439-445.
Mackey, B.M., C. Pritchet, A. Norris, and G.C. Mead. 1990. Heat resistance of 49.
Listeria: Strain differences and effects of meat type and curing salts. Lett. Appl.
Mackey, B.M., and N. Bratchell. 1989. The heat resistance 50. of Listeria
monocytogenes. Lett. Appl. Microbiol. 9:89-94.
Malinverni. R., J. Bille, CI. Perret, F. Regli, F. Tanner, and M.P Glauser. 1985. 51.
Listeriose epidemique. Observation de 25 cas en 15 mois au Centre hospitalier
universitaire vaudois. Schweiz. Med. Wschr. 115:2-10.
McKellar, R.C. 1994. Use of the CAMP test for identifcation of 52. Listeria
monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 60:4219^225.
McLauchlin, J. 1997. The pathogenicity of 53. Listeria monocytogenes: A public
health perspective. Rev. Med. Microbiol. 8:1-14.
McLauchlin. J. 1987. 54. Listeria monocytogenes, recent advances in the taxonomy
and epidemiology of listeriosis in humans. J Appl. Bacteriol. 63:1-11.
McLauchlin, J., A. Audurier, and A.G. Taylor. 1986. Aspects of the epidemiology 55.
of human Listeria monocytogene. infections in Britain 1967-1984. The use of
serotyping and phage typing. J. Med. Microbiol. 22:367-377.
Mengaud, J., M.F. Vincente, J. Chenevert. J.M. Pereira, C. Gcoffroy. B. 56.
Giequel-Sanzey, F. Baquero, J.-C. Perez-Diaz and P. Cossart. 1988. Expression
in Escherii hia coli and sequence analysis of the listeriolysin () determinant of
Listen,, monocytogenes. Infect. Immun. 56:766-772.
Mitsuyama, M., K.-I. Igarashi, I. Kawamura, T. Ohmori, and K. Nomoto. 1990. 57.
Difference in the induction of macrophage interleukin-1 production between
viable and killed cells of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 58:1254-
197
1260.
Moors, M.A., B. Levitt, P. Youngman, and D.A. Portnoy. 1999. Expression 58.
of listeriolysin O and ActA by intracellular and extracellular Listeria
monocytogenes. Infect. Immun. 67:131-139.
Murray, E.G.D., R.A. Webb, and M.B.R. Swann. 1926. A disease of rabbits 59.
characterized by large mononuclear leuco-cytosis caused by a hitherto
undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacterial.
29:407-439.
Nakane, A., A. Numata, M. Asano, M. Kohanawa, Y. Chen, and T. Minagawa. 60.
1990. Evidence that endogenous gamma interferon is produced early in Listeria
monocytogenes infection. Infect. Immun. 58:2386-2388.
Nicolas, J.-A., and N. Vidaud. 1987. Contribution a letude des 61. Listeria presented
dans les denrdes dorigine animale destinces a la consommation humaine. Rec.
Med. Vet. 163(3):283-285.
Notermans, S., J. Dufrenne, P. Teunis, and T. Chackraborty. 1998. Studies on 62.
the risk assessment of Listeria monocytogenes. J. Food Protect. 61:244248.
Parish, M.E., and D.P. Higgins. 1989. Survival 63. of Listeria monocytogenes in
low pH model broth systems. J. Food Protect. 52:144-147.
Petran, R.L., and E.A. Zottola. 1989. A study of factors affecting growth and 64.
recovery of Listeria monocytogenes Scott A. J. Food Sci. 54:458-460.
Piccinin, D.M., and L.A. Shelef. 1995. Survival of 65. Listeria monocytogenes in
cottage cheese. 7. Food Protect. 58:128-131.
Pine, L., G.B. Malcolm, and B.D. Plikaytis. 1990. 66. Listeria monocytogenes
intragastric and intraperitoneal approximate 50% lethal doses for mice are
comparable, but death occurs earlier by intragastric feeding. Infect. Immun.
58:2940-2945.
Pini, P.N., and R.J. Gilbert. 1988. The occurrence in the U.K. of 67. Listeria species
in raw chickens and soft cheeses Int. J. Food Microbiol. 6:317-326.
Rocourt, J., P. Boerlin, F. Grimont, C. Jaquet, and J.-C. Piffarctti. 1992. 68.
Assignment of Listeria grayi and Listeria murrayi to a single species, Listeria
grayi, with a revised description of Listeria grayi. Int. J. System. Bacteriol.
42:171-174.
Ruhland, G.J., and F. Fiedler. 1987. Occurrence and biochemistry of lipoteichoic 69.
acids in the genus Listeria. System. Appl. Microbiol. 9:40-46.
Ryser, E.T., and E.H. Marth. 1988. Survival of 70. Listeria monocytogenes in cold-
pack cheese food during refrigerated storage. J. Food Protect. 51:615-621.
Ryser, E.T., and E.H. Marth. 1987. Fate of 71. Listeria monocytogenes during the
manufacture and ripening of Camembert cheese. J. Food Protect. 50:372-378.
198
Ryser, E.T., E.H. Marth, and M.P. Doyle. 1985. Survival of 72. Listeria
monocytogenes during manufacture and storage of cottage cheese. J. Food
Protect. 48:746-750.
Schmidt. U., H.P.R. Seeliger, E. Glenn, B. Langer, and L. Leistner. 1988. 73.
Listerienfunde in rohen Fleischcrzeugmsscn Fleischwirtsch. 68:1313-1316.
Seeliger, H.P.R., and K Holme. 1979. Serotyping of 74. Listeria monocytogenes
ami related species. Meth. Microbiol. 13:31^19.
Shelef, L.A. 1989. Survival of 75. Listeria monocytogenes in ground beef or liver
during storage at 4 and 25 C. J. Food Protect. 52:379-383.
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 76.
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 77.
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere 78.
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-
86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor 79.
Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor 80.
Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor 81.
Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978- 82.
973-736-090-8
Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi, 83.
ISBN: 978-973-736-089-2
Singh, S.P., B.L. Moore, and l.H. Siddique. 1981. Purifcation and further 84.
characterization of phenol extract from Listeria monocytogenes. Am. J. Vet.
Res. 42:1266-1268.
Sizmur, K., and C.W. Walker. 1988. 85. Listeria in prepackaged salads. Lancet
1:1167.
Skalka, B., J. Smola, and K. Elischerova. 1982. Routine test for in vitro 86.
differentiation of pathogenic and apathogenic Listeria monocytogenes strains.
J. Clin. Microbiol. 15:503-507.
Skovgaard, N., and C.-A. Morgen. 1988. Detection of 87. Listeria spp. in faeces from
animals, in feeds, and in raw foods of animal origin. Inl. .1. Food Microbiol.
Vit M, Olejnik R, Dlh J, Karpskov R, Cstkov J, Prkazsk V, Prkazsk 88.
M, Benes C, Petrs P. Outbreak of listeriosis in the Czech Republic, late 2006:
preliminary report. Euro Surveill. 2007 Feb 8;12(2):E070208.1.
199
European Food Safety Authority (EFSA). The Community summary report 89.
on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents, antimicrobial resistance
and foodborne outbreaks in the European Union in 2006. The EFSA Journal.
2007(130). Available from: http://www.efsa.europa.eu/EFSA/DocumentSet/
Zoon_report_2006_en,0.pdf.
Denny J, McLauchlin J. Human 90. Listeria monocytogenes infections in Europe:
an opportunity for improved European surveillance. Euro Surveill. 2008;13
(13).
200
CAPITOLUL 6
Implicaiile bacteriilor din genul Mycobacterium n
producerea toxiinfeciilor alimentare
6.1. Mycobacterium avium subspecia paratuberculosis
(Myb. paratuberculosis)
Sinonime: Myb. johnei, Francis, 1943, Bacillus paratuberculosis
(Bergey i col.).
Nume comune: Bacilul paratuberculozei, Bacilul lui Johne.
6.1.1. Istoric
Germenul a fost izolat pentru prima dat de ctre Twort i Ingram n
1912 dup ce boala fusese descris cu mult timp n urm de ctre Johne i
Frothingham (1895).
6.1.2. Morfologie
Myb. avium subsp. paratuberculosis este un bacil scurt i relativ gros,
asemntor cu Myb. bovis, de 1-2 microni lungime, imobil, necapsulogen,
nesporogen, Gram pozitiv i acidorezistent.
Bacilul lui Johne este o bacterie pretenioas din punct de vedere al
condiiilor de cultivare. Se cultiv greu pe medii speciale (Lwenstein,
Petragnani), necesitnd adugarea unor extracte de micobacterii sau chiar
de micobacterii inactivate. De regul, se adaug suspensii de Myb. phlei.
Izolarea germenului este difcil i se realizeaz printr-o tehnic
asemntoare cu cea folosit la tuberculoz. Incubarea culturilor se
realizeaz la temperatura de 37C i dureaz 1-2 luni.
Pe suprafaa mediilor solide formeaz dup minimum 4-6 sptmni
201
nite colonii de culoare alb, mici, rotunde, bombate, cu o margine fn,
uor neregulat. Uneori, culturile vechi apar pigmentate n galben sau
portocaliu.
n mediile lichide formeaz la suprafa o membran groas i
ncreit.
Nu se examineaz practic pentru identifcarea acestei specii.
S-a observat c ntre infecia tuberculoas i cea paratuberculoas,
exist o relaie de protecie ncruciat, datorit nrudirii antigenice a agenilor
etiologici. Extractele obinute din bacilii paratuberculozei reprezint un
produs revelator, utilizabil n practic, numit paratuberculin sau johnin.
Taurinele tuberculoase dau reacii pozitive la johnin.
6.1.6. Ecologie
Bacilul lui Johne este obligatoriu parazit, find prezent n intestinul
animalelor bolnave.
A fost remarcat o relaie ntre prevalena paratuberculozei ntr-o zon
geografc i aciditatea sau coninutul n fer din sol. Myb. paratuberculosis
este un germen foarte rezistent fa de agenii nocivi fzici i chimici, iar n
mediul ambiant (puni, furaje, sol) poate supravieui de la un an la altul.
6.1.7. Patogenitate
Speciile natural receptive sunt taurinele, ovinele, caprinele adulte, dar
i rumegtoarele slbatice (cerbul, cprioara, mufonul, yakul, zebra, lama,
antilopa, cmila). Foarte rar se pot infecta i solipedele sau porcii.
Infecia natural poart denumirea de paratuberculoz sau enterit
hipertrofant i se caracterizeaz prin ngroarea mucoasei intestinului
gros, care apare ncreit, amintind de aspectul circumvoluiunilor cerebrale,
consecutiv proceselor hiperplazice.
202
Fotiu colorat Ziehl-Neelsen din amprent de intestin subire n paratuberculoz, infecie
natural. Se observ abundena bacililor Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis n
frotiurile din material patologic.
Fotiu colorat Ziehl-Neelsen din cultur de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis;
colonii crescute n mediu Middlebrook cu mycobactin.
203
Bull, T. J., Hermon-Taylor, J., Pavlik, I., El-Zaatari, F., Tizard, M. (2000). 1.
Characterization of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
development of multiplex PCR typing. Microbiology 146: 2185-2197
Bull, T. J., Hermon-Taylor, J., Pavlik, I., El-Zaatari, F., Tizard, M. (2000). 2.
Characterization of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
development of multiplex PCR typing. Microbiology 146: 2185-2197
Castellanos, E., Aranaz, A., Gould, K. A., Linedale, R., Stevenson, K., Alvarez, 3.
J., Dominguez, L., de Juan, L., Hinds, J., Bull, T. J. (2009). Discovery of Stable and
Variable Differences in the Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Type I, II, and
III Genomes by Pan-Genome Microarray Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75: 676-
686
Collins, D. M., De Zoete, M., Cavaignac, S. M. (2002). Mycobacterium avium 4.
subsp. paratuberculosis Strains from Cattle and Sheep Can Be Distinguished by a PCR Test
Based on a Novel DNA Sequence Difference. J. Clin. Microbiol. 40: 4760-4762
de Juan, L., Alvarez, J., Romero, B., Bezos, J., Castellanos, E., Aranaz, A., Mateos, 5.
A., Dominguez, L. (2006). Comparison of Four Different Culture Media for Isolation and
Growth of Type II and Type I/III Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains
Isolated from Cattle and Goats. Appl. Environ. Microbiol. 72: 5927-5932
Dupont, C., Thompson, K., Heuer, C., Gicquel, B., Murray, A. (2005). 6.
Identifcation and characterization of an immunogenic 22 kDa exported protein of
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. J Med Microbiol 54: 1083-1092
Enosawa, M., Kageyama, S., Sawai, K., Watanabe, K., Notomi, T., Onoe, S., 7.
Mori, Y., Yokomizo, Y. (2003). Use of Loop-Mediated Isothermal Amplifcation of the IS900
Sequence for Rapid Detection of Cultured Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.
J. Clin. Microbiol. 41: 4359-4365
Fang, Y., Wu, W.-H., Pepper, J. L., Larsen, J. L., Marras, S. A. E., Nelson, 8.
Eric. A., Epperson, W. B., Christopher-Hennings, J. (2002). Comparison of Real-Time,
Quantitative PCR with Molecular Beacons to Nested PCR and Culture Methods for
Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Bovine Fecal Samples. J.
Clin. Microbiol. 40: 287-291
Griffths, T. A., Rioux, K., De Buck, J. (2008). Sequence Polymorphisms in 9.
a Surface PPE Protein Distinguish Types I, II, and III of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 46: 1207-1212
Harris, N. B., Barletta, R. G. (2001). Mycobacterium avium subsp. 10.
paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512
Harris, N. B., Barletta, R. G. (2001). Mycobacterium avium subsp. 11.
paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512
Hermon-Taylor, J., Barnes, N., Clarke, C., Finlayson, C. (1998). Grand Round: 12.
Mycobacterium paratuberculosis cervical lymphadenitis, followed fve years later by
terminal ileitis similar to Crohns disease. BMJ 316: 449-453
Hughes, V., Bannantine, J. P., Denham, S., Smith, S., Garcia-Sanchez, A., Sales, 13.
J., Paustian, M. L., Mclean, K., Stevenson, K. (2008). Immunogenicity of Proteome-
Determined Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-Specifc Proteins in Sheep
with Paratuberculosis. CVI 15: 1824-1833
204
Kurade, N. P., Tripathi, B. N., Rajukumar, K., Parihar, N. S. (2004). Sequential 14.
Development of Histologic Lesions and Their Relationship with Bacterial Isolation, Fecal
Shedding, and Immune Responses during Progressive Stages of Experimental Infection of
Lambs with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Vet Pathol 41: 378-387
Marsh, I. B., Bannantine, J. P., Paustian, M. L., Tizard, M. L., Kapur, V., 15.
Whittington, R. J. (2006). Genomic Comparison of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis Sheep and Cattle Strains by Microarray Hybridization. J. Bacteriol. 188:
2290-2293
Mobius, P., Luyven, G., Hotzel, H., Kohler, H. (2008). High Genetic Diversity 16.
among Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from German Cattle Herds
Shown by Combination of IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis
and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem-Repeat Typing.
Mobius, P., Luyven, G., Hotzel, H., Kohler, H. (2008). High Genetic Diversity 17.
among Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from German Cattle Herds
Shown by Combination of IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis
and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem-Repeat Typing.
Motiwala, A. S., Amonsin, A., Strother, M., Manning, E. J. B., Kapur, V., 18.
Sreevatsan, S. (2004). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis Isolates Recovered from Wild Animal Species. J. Clin. Microbiol. 42:
1703-1712
Motiwala, A. S., Strother, M., Amonsin, A., Byrum, B., Naser, S. A., Stabel, J. R., 19.
Shulaw, W. P., Bannantine, J. P., Kapur, V., Sreevatsan, S. (2003). Molecular Epidemiology
of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: Evidence for Limited Strain Diversity,
Strain Sharing, and Identifcation of Unique Targets for Diagnosis. J. Clin. Microbiol. 41:
2015-2026
Motiwala, A. S., Strother, M., Amonsin, A., Byrum, B., Naser, S. A., Stabel, J. R., 20.
Shulaw, W. P., Bannantine, J. P., Kapur, V., Sreevatsan, S. (2003). Molecular Epidemiology
of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: Evidence for Limited Strain Diversity,
Strain Sharing, and Identifcation of Unique Targets for Diagnosis. J. Clin. Microbiol. 41:
2015-2026
Overduin, P., Schouls, L., Roholl, P., van der Zanden, A., Mahmmod, N., 21.
Herrewegh, A., van Soolingen, D. (2004). Use of Multilocus Variable-Number Tandem-
Repeat Analysis for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin.
Microbiol. 42: 5022-5028
Paustian, M. L., Kapur, V., Bannantine, J. P. (2005). Comparative Genomic 22.
Hybridizations Reveal Genetic Regions within the Mycobacterium avium Complex That
Are Divergent from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Isolates. J. Bacteriol.
187: 2406-2415
Pearce, L. E., Truong, H. T., Crawford, R. A., Yates, G. F., Cavaignac, S., de 23.
Lisle, G. W. (2001). Effect of Turbulent-Flow Pasteurization on Survival of Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis Added to Raw Milk. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3964-
3969
Pickup, R. W., Rhodes, G., Bull, T. J., Arnott, S., Sidi-Boumedine, K., Hurley, 24.
M., Hermon-Taylor, J. (2006). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Lake
Catchments, in River Water Abstracted for Domestic Use, and in Effuent from Domestic
205
Sewage Treatment Works: Diverse Opportunities for Environmental Cycling and Human
Exposure.. Appl. Environ. Microbiol. 72: 4067-4077
Rodrguez, J. G., Fissanoti, J. C., Del Portillo, P., Patarroyo, M. E., Romano, M. 25.
I., Cataldi, A. (1999). Amplifcation of a 500-Base-Pair Fragment from Cultured Isolates
of Mycobacterium bovis. J. Clin. Microbiol. 37: 2330-2332
Salgado, M., Herthnek, D., Bolske, G., Leiva, S., Kruze, J. (2009). First isolation 26.
of mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis from wild guanacos (lama guanicoe) on
tierra del fuego island. J Wildl Dis 45: 295-301
Semret, M., Turenne, C. Y., de Haas, P., Collins, D. M., Behr, M. A. (2006). 27.
Differentiating Host-Associated Variants of Mycobacterium avium by PCR for Detection
of Large Sequence Polymorphisms.. J. Clin. Microbiol. 44: 881-887
Stevenson, K., Hughes, V. M., de Juan, L., Inglis, N. F., Wright, F., Sharp, J. 28.
M. (2002). Molecular Characterization of Pigmented and Nonpigmented Isolates of
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 40: 1798-1804
Stevenson, K., Hughes, V. M., de Juan, L., Inglis, N. F., Wright, F., Sharp, J. 29.
M. (2002). Molecular Characterization of Pigmented and Nonpigmented Isolates of
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 40: 1798-1804
Thibault, V. C., Grayon, M., Boschiroli, M. L., Hubbans, C., Overduin, P., 30.
Stevenson, K., Gutierrez, M. C., Supply, P., Biet, F. (2007). New Variable-Number Tandem-
Repeat Markers for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium
Strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism
Typing. J. Clin. Microbiol. 45: 2404-2410
Turenne, C. Y., Collins, D. M., Alexander, D. C., Behr, M. A. (2008). 31.
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium subsp. avium Are
Independently Evolved Pathogenic Clones of a Much Broader Group of M. avium
Organisms. J. Bacteriol. 190: 2479-2487
Turenne, C. Y., Semret, M., Cousins, D. V., Collins, D. M., Behr, M. A. (2006). 32.
Sequencing of hsp65 Distinguishes among Subsets of the Mycobacterium avium Complex.
Turenne, C. Y., Wallace, R. Jr., Behr, M. A. (2007). Mycobacterium avium in the 33.
Postgenomic Era. Clin. Microbiol. Rev. 20: 205-229
Turenne, C. Y., Wallace, R. Jr., Behr, M. A. (2007). Mycobacterium avium in the 34.
Postgenomic Era. Clin. Microbiol. Rev. 20: 205-229
Whittington, R. J., Hope, A. F., Marshall, D. J., Taragel, C. A., Marsh, I. 35.
(2000). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: IS900
Restriction Fragment Length Polymorphism and IS1311 Polymorphism Analyses of
Isolates from Animals and a Human in Australia. J. Clin. Microbiol. 38: 3240-3248
Whittington, R. J., Hope, A. F., Marshall, D. J., Taragel, C. A., Marsh, I. 36.
(2000). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: IS900
Restriction Fragment Length Polymorphism and IS1311 Polymorphism Analyses of
Isolates from Animals and a Human in Australia. J. Clin. Microbiol. 38: 3240-3248
Whittington, R. J., Marsh, I., McAllister, S., Turner, M. J., Marshall, D. J., 37.
Fraser, C. A. (1999). Evaluation of Modifed BACTEC 12B Radiometric Medium and
Solid Media for Culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from Sheep. J.
Whittington, R. J., Marsh, I., McAllister, S., Turner, M. J., Marshall, D. J., 38.
Fraser, C. A. (1999). Evaluation of Modifed BACTEC 12B Radiometric Medium and
206
Solid Media for Culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from Sheep. J.
Whittington, R. J., Marshall, D. J., Nicholls, P. J., Marsh, I. B., Reddacliff, L. A. 39.
(2004). Survival and Dormancy of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in the
Environment. Appl. Environ. Microbiol. 70: 2989-3004
207
CAPITOLUL 7
Implicaiile bacteriilor din familia Enterobacteriaceae n
producerea toxiinfeciilor alimentare
Tabelul 7.1
G
r
u
p
a

b
a
c
i
l
i
l
o
r

G
r
a
m

n
e
g
a
t
i
v
i

f
a
c
u
l
t
a
t
i
v

a
n
a
e
r
o
b
i
Familia Genuri Specii
E
n
t
e
r
o
b
a
c
t
e
r
i
a
c
e
a
e
Escherichia
E. coli, E. adecarboxylata, E. albertii, E. fergusonii,
E. hermannii, E. vulneris, E. blattae
Klebsiella
K. pneumoniae ( subsp. pneumoniae i rhinoscle-
romatis), K. granulomatis, K. mobilis, K. ornithino-
lytica, K. oxytoca, K. ozaenae, K. planticola, K. rhino-
scleromatis, K. singaporensis (Li i col. 2004), K.
terrigena, K. trevisanii, K. variicola (Rosenblueth i
col.. 2004)
Proteus
P. vulgaris, P. hauseri, P. inconstans, P. mirabilis,
P. morganii, P. myxofaciens, P. penneri, P. rettgeri
(Prov. rettgeri)
Providencia
Prov. rettgeri, Prov. stuartii, Prov. alcalifaciens, Prov.
friedericiana, Prov. heimbachae, Prov. rustigianii
Morganella M. morganii (subsp. morganii i sibonii)
Serratia
S. marcescens (subsp. marcescens i sakuensis), S.
entomophila, S. fcaria, S. fonticola, S. grimesii, S.
liquefaciens sakuensis (Ajithkumar i col. 2003), S.
marinorubra, S. odorifera, S. plymuthica, S. protea-
maculans, S. proteamaculans (subsp. proteamaculans
i quinovora), S. quini-vorans, S. rubidaea, S.
ureilytica (Bhadra i col. 2005)
Yersinia
Y. pseudotuberculosis (subsp. pseudotuberculosis
i pestis), Y. enterocolitica (subsp. enterocolitica
i palearctica), Y. aldovae, Y. aleksiciae (Sprague
i Neubauer 2005), Y. bercovieri, Y. frederiksenii,Y.
intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y.
philomiragia, Y. rohdei, Y. ruckeri
Salmonella
S. enterica (subsp. arizonae, bongori, diarizonae,
enterica, houtenae, indica i salamae), S. bongori,
S. choleraesuis ( subp. arizonae, bongori, cholerae-
suis, diarizonae, houtenae, indica i salamae), S.
enteritidis, S. typhi, S. typhimurium S. arizonae, S.
paratyphi, S. subterranea (Shelobolina, 2005),
208
Familia Enterobacteriaceae (44 de genuri) reunete bacili Gram
negativi, nesporogeni, mobili, prin fageli peritrichi sau imobili.
Nepretenioi nutritiv, cresc pe medii cu pepton n prezena bilei
(tabelele 7.2., 7.3. a, b).
Fermenteaz glucoza, sunt oxidaz negativi, produc catalaz i reduc
nitraii n nitrii (tabelul 7.4).
Tabelul 7.2
Caractere de cultivare ale enterobacteriaceelor pe medii nutritive simple
(incubate 24 de ore la 35-37C)
(dup Negru M., 1999)
Mediul
Aspecte comune ale culturii
Aspecte particulare
Forma S Forma R
Bulion simplu
(bulion glucozat,
Mediul I)
tulbure, uniform,
fr depozit
limpede ori tulbure n
grade diferite, cu inel
ori vl i cu depozit
Agar nutritiv
colonii de 2-3 mm,
rotunde, bombate,
umede, cu suprafaa
neted i marginile
regulate
colonii de 2-3 mm,
rotunde, plate, cu
suprafaa rugoas i
marginile regulate
colonii mucoide V de 4-5
mm, rotunde, bombate, cu
margini regulate, tendin
la confuare, aspect mucos
(frecvente la Klebsiella i
Escherichia;
colonii pigmentate V
a
;
cretere invaziv: V
n jurul coloniei se
dezvolt zone de migrare
concentrice (caracteristic
pentru genul Proteus)
Agar-snge
ca pe agarul
nutritiv; unele
tulpini dezvolt
hemoliz
similare formei S depind de tipul hematiilor
* Pigment rou (Serratia spp.), galben (Enterobacter spp., Xenorhabdus spp.),
brun (Xenorhabdus spp.)
209
Tabelul 7.3 a.
Medii folosite n diagnosticul enterobacteriaceelor
(dup Carp-Crare M., 1997)
Mediul
Substana
inhibant
Substana
hidrocar-
bonat
Indicator
Aspectul coloniilor
Pozitiv Negativ
Mac Conkey
(MC)
sruri biliare
integrale i
cristal violet
lactoz
rou
neutru
roii, cu halou
opalescent
necolorate
Leifson
(ADCL)
sruri biliare
(dezoxicolat
de Na)
lactoz
rou
neutru
roii
necolorat (la bact.
cu H
2
S pozitiv,
centrul negru)
Salmonella
Shigella (SS)
sruri biliare
integrale
lactoz
rou
neutru
roii, cu
centrul opac
necolorate semi-
transparente
Istati Meitert
(M)
bil uscat lactoz
albastru
bromtimol
galbene opace verzui sau albastre
Geloz verde
briliant sau
Christensen
(V.B.)
verde
briliant
lactoz rou fenol
galbene-
verzui
roii
Wilson Blair
(W.B)
verde
briliant
glucoz
sulft de
bismut
majoritatea enterobacteriaceelor
se dezvolt greu, exceptnd
Salmonella
Levin (EMB) - lactoz
eozin
albastru
metilen
negre, cu luciu
metalic
necolorate sau roz
Drigalski
(dup Le
Minor)
- lactoz bromtimol galbene albastre
Endo - lactoz
fuxin,
hiposulft
de Na
roii incolore
Geloza
lactozat
i albastru
bromtimol
- lactoz
albastru
bromtimol
galbene albastre
Gassner - lactoz
Meta-
cromgelb
i Wasser-
blau
albastre galbene
210
Tabelul 7.3 b.
Aspectul coloniilor la principalele genuri de enterobacteriacee
Mediul Salmonella Shigella Escherichia Proteus
Wilson Blair
colonii umede,
negre pentru
S. typhimurium;
colonii plate,
verzui pentru
S. suipestifer i
S. typhimurium
nu se dezvolt
(afar de
S. fexneri i
S. sonnei, care
dau colonii
brune)
nu crete sau
d colonii rare,
mici, gri
colonii verzi,
neinvadante
Leifson colonii incolore colonii incolore colonii roii
colonii cu
centrul negru
Christensen
Lester i
Jurgens
colonii netede,
roii sau roz
strlucitoare
colonii netede
roii, strlucitore
colonii groase,
galbene-verzui
strlucitoare
colonii izolate,
mucoase,
galbene sau roz
SS
colonii incolore,
cu centrul negru
pentru salmonelele
ce dau H
2
S
colonii incolore
rare colonii roz
sau rou aprins
colonii rare
neinvadante
Istrati Meitert
colonii verzi,
albstrui
colonii verzi sau
verzui-albstrui
colonii galbene
opace
colonii izolate,
central opace,
devenind negre
Geloza verde
briliant
(Christensen)
colonii roii nu crete colonii verzui
uneori colonii
rare roii,
neinvadante
Mac Conkey colonii incolore colonii incolore
colonii roii
cu inele
periferice de bil
precipitat
invadeaz
Levin
(E.M.B.)
colonii incolore colonii incolore
colonii negre sau
cu centrul negru,
cu refex metalic
invadeaz
Geloz
lactozat
turnesolat
(Drigalski)
colonii albastre colonii albastre colonii roii invadeaz
Endo colonii incolore colonii incolore colonii roii invadeaz
211
Tabelul 7.4
Familia Enterobacteriaceae: identifcarea preliminar
a
(dup Negu M., 1999)
Genul
Mediul T.S.I. Mediul M.I.L.F.
Urea-
z
Citrat
(Sim-
mons)
Glucoza
(coloana)
H
2
S
Lactoza/
Zaharoza
Mobi-
litate
Indol
Lizin-
decar-
boxilaz
Fenil-ala-
nindeza-
minaz
Acid Gaz
Escherichia + +
b
- +
c
+
b
+
d
+ - - -
Shigella + - - - - V - - - -
Salmonella + +
c
+
f
- +
g
- +
f
- - +
h
Citrobacter + + V + + V - - D +
Klebsiella + +
i
- +
i
- V +
i
- V +i
Enterobacter + + - + + - V - V +
Hafnia + + - - +22C - + - - -
Serratia + V - V + - +
j
- - +
Proteus + + +
k
- + V - + + V
Providencia + V - - + + - + V V
Morganella + + - - + + - + + -
Yersinia + - - V
+22-
30C
V - - + -
a
Simboluri: + = majoritatea tulpinilor pozitive; - = majoritatea tulpinilor negative; V =
variaii n funcie de specie.
b
Cu excepia E. coli inactiv.
c
Escherichia fergusonii i majoritatea tulpinilor de E. vulneris i E. coli inactiv nu formeaz
lactoz/zaharoz.
d
Exceptnd E. vulneris.
e
Exceptnd serovarurile typhi i tallinarum de S. enterica.
f
Exceptnd serovarul paratyphi A de S. enterica.
g
Exceptnd serovarurile gallinarum i pulorum de S. enterica.
h
Exceptnd serovarurile tiphy, paratiphy A., gallinarum i pullorum de S. enterica.
i
Exceptnd K. rhinoscleromatis.
j
Exceptnd Serratia plymuthica.
k
Tulpinile de P. myxofaciens nu produc H
2
S, iar cele de P. penneri produc doar n proporie
de 30%.
212
n funcie de mobilitate i proprieti metabolice sunt redate deosebirile ntre principalele
genuri, n schemele 7.1 i 7.2 (dup Rpuntean Gh., 2001).
Schema 7.1
Mobilitate
Mobili
Citrat
Lactoz Lactoz
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
C
i
t
r
o
b
a
c
t
e
r

E
n
t
e
r
o
b
a
c
t
e
r

C
i
t
r
o
b
a
c
t
e
r

E
n
t
e
r
o
b
a
c
t
e
r

U
r
e
a
z

-

U
r
e
a
z

+

Citrobacter Proteus
Imobili
Citrat
+
-
Ureaz - Ureaz +
Shigella Klebsiella

Schema 7.2
Lactoz
Lactozo +
Indol
Citrat Uree
+
-
+
-
+
-
Lactozo -
Glucoz
+
-
Mobilitate
Pseudomonas
alcaligenes
Shigella
Proteus
C
i
t
r
o
b
a
c
t
e
r

E
s
c
h
e
r
i
c
h
i
a

K
l
e
b
s
i
e
l
l
a

E
n
t
e
r
o
b
a
c
t
e
r

Salmonella
+
-
Uree
H
2
S
+
-

213
CAPITOLUL 8
Implicaiile bacteriilor din genul Salmonella n producerea
toxiinfeciilor alimentare
8.1. Caractere generale
Toxiinfeciile alimentare produse de salmonele, din punct de vedere al
frecvenei i al implicaiilor igienico-sanitare ocup primul loc n majoritatea
rilor. Acestea apar mai frecvent n anotimpurile calde (mai-octombrie),
cnd exist mai muli purttori umani i animali, temperatura find factor
favorabil pentru dezvoltarea i multiplicarea germenilor.
Exist peste 2700 de serotipuri Salmonella, grupele majore find
reprezentate de:
- grupul I S. enterica subsp. enterica;
- grupul II S. enterica subsp. salamae;
- grupul III S. enterica subsp. arizonae;
- grupul III b S. enterica subsp. diarizonae;
- grupul IV S. enterica subsp. houtenae;
- grupul V S. enterica subsp. indica.
Grupul V a cptat statutul de specie, ca S. bongori. Aceste schimbri
au avut loc pe baza hibridizrilor DNA-RNA i a electroforezei enzimatice
multiloculare. Serovarurile se pot scrie cu liter mare. De exemplu: S.
enterica serovar Typhimurium poate f notat S. typhimurium. Din punct de
vedere epidemiologic, salmonelele pot f plasate ntr-una din urmtoarele
trei grupe:
1. Serotipuri monopatogene pentru om: S. Typhi, S. Paratyphi A, S.
Paratyphi C, care sunt agenii febrei tifoide i paratifoide.
2. Serovaruri adaptate gazdei (patogeni umani ce pot f contactai din
alimente). S. Gallinarum (carnea de pasre), S. Dublin (carnea de vit),
S. Abortus-equi (cal), S. Abortus-ovis (oaie), S. Choleraesuis (carnea de
porc).
3. Serovaruri inadaptate (fr gazd preferenial); patogeni
pentru oameni i animale i includ majoritatea serovarurilor care produc
214
toxiinfeciile alimentare.
Principalele rezervoare pentru infecia uman sunt psrile, bovinele,
ovinele i porcinele.
La oameni, prezena i severitatea simptomelor depind de doza
infectant. Tipic, apare o diaree apoas, cu durat de cteva zile, ce duce
la deshidratare, cu dureri abdominale i febr joas. Septicemia i formarea
abceselor sunt rare.
La animale este frecvent infecia subclinic, multe dintre acestea find
purttori intermiteni sau persisteni. Bovinele, pot prezenta febr, diaree,
avorturi. La viei apar epizootii de diaree, cu o mortalitate nalt.
La porcine, febra i diareea sunt mai puin frecvente dect la bovine.
Ovinele, caprinele i psrile infectate nu prezint de obicei nici un
semn de infecie.
Proflaxia i combaterea toxiinfeciilor alimentare includ msuri de
educare a celor care manipuleaz alimentele pentru meninerea igienei
corespunztoare n buctrii, prepararea adecvat a crnii, refrigerarea
alimentelor preparate i prevenirea contaminrii ncruciate, pasteurizarea
laptelui, msuri de igien personal i reducerea contaminrii carcaselor de
psri n abatoare. Iradierea crnii i a altor alimente nainte de achiziionare
va reduce contaminarea.
Salmoneloza uman se poate manifesta sub dou forme clinice. Cea
mai sever este febra enteric, produs de S. typhi sau S. paratyphi A, B sau
C.
Cu puine excepii, n cazul febrei paratifoide B transmiterea este
interuman, fr implicarea animalelor. Toate celelalte salmonele aparin
n primul rnd animalelor i unele pot f transmise la om, producnd
salmoneloza non-tifoidic.
8.2. Istoric
n 1880, Eberth i Koch, au evideniat n foliculii limfatici necrotici
la decedaii de febr tifoid, un bacil incriminat n etiologia bolii, pe care
ulterior Gartner reuete s-l cultive.
Salmon i Smith, n 1885, izoleaz Bacillus choleraesuis de la
porcii cu pest, iar Gartner descrie n 1888 n Germania prima toxiinfecie
alimentar, cu 58 de mbolnviri n urma consumului de carne de vit tiat
de necesitate i atribuie acestui microorganism numele de B. enteritidis.
n anul 1900, Ligniers, separ pasteurelele de grupul de bacterii
descris de Salmon i constituie un nou gen, n cadrul bacteriilor intestinale
Gram negative, pe care l intituleaz Salmonella.
215
n 1899, n Belgia, are loc o izbucnire determinat de un bacil anterior
izolat i descris de Leffer la oarecii dintr-o cresctorie de laborator i pe
care l denumete Bacillus aertrycke.
n Romnia prima salmoneloz (o toxiinfecie alimentar determinat
de friptur din carne de miel) a fost descris de Babe, n 1905.
Pornind de la studiile privind structura antigenic, ale lui Andrews, n
1921-1924, White propune prima schem de identifcare antigenic, extins
ulterior de Kauffmann, cunoscut azi ca schema Kauffmann-White.
Craigie i Yen, utiliznd o serie de bacteriofagi specifci alctuiesc
n 1939 prima schem de tipizare la Salmonella typhi, utilizarea ei find i
astzi de necontestat n investigarea epidemiologic a febrei tifoide.
Studiile de conversie antigenic sub aciunea bacteriofagilor temperai
efectuate de Le Minor i Popoff au modifcat radical taxonomia genului,
introducnd un sistem raional de clasifcare.
8.3. Taxonomie
Termenul de Salmonella a fost adoptat n onoarea unui medic
veterinar american, Daniel E. Salmon, care a participat la studiile iniiale.
Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae. Popoff i
Le Minor propun clasifcarea genului Salmonella n dou specii: S. enterica
i S. bongori.
Tabelul 8.1
Numrul actual al serotipurilor de Salmonella
Specia Subspecia Numr de serotipuri
enterica
Enterica 1435
Salomae 485
Arizonae 94
Diarizonae 321
Houtenae 69
Indica 11
bongori - 20
S. enterica cuprindea ase subspecii (pe criterii exoenzimatice):
enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae i indica.
Clasifcarea actual (J. P. Euzby, 2006) a genului Salmonella, cuprinde
nou specii, care sunt prezentate n tabelul 8.1.
n cadrul speciilor i subspeciilor au fost descrise serotipuri desemnate
216
taxonomic prin nomenclatura din schema Kauffmann-White.
Pentru simplifcare, n practic se folosete terminologia de gen
Salmonella, urmat de denumirea de serotip.
Pentru a deosebi termenii care desemneaz specia sau subspecia de
cei care defnesc serotipul, s-a fcut propunerea, ca acesta din urm s fe
scris cu iniial majuscul (de exemplu: Salmonella anatum).
La unele serotipuri se ntlnesc subdiviziuni bazate pe criteriul
sensibilitii la bacteriofagi (fago sau lizotipuri), la bacteriocine
(bacteriocinotipuri) i la antibiotice.
n tabelul 8.2, redm serotipurile de salmonele implicate n patologia
veterinar.
Toate serotipurile menionate n tabel, cu excepia lui S. arizonae fac
parte din specia enterica.
Tabelul 8.2
Serotipuri de salmonele patogene pentru animale i om (dup Negu M.)
Gazda
Serotipuri de
Salmonella
Infecia produs
Om
S. typhi febra tifoid
S. paratyphi febra paratifoid
S. schottmuelleri febra paratifoid
S. enteritidis toxiinfecii alimentare
S. typhimurium toxiinfecii alimentare
Bovine
S. dublin
excretori subclinici, purttori, enterit, septicemie,
meningit la viei, avort, osteomielit, artrite, cangren
uscat a extremitilor la viel, enterite, septicemie
S. typhimurium
S. bovimorbifcans
Porcine
S. choleraesuis i
S. choleraesuis
biotip Kunzerdorf
izbucniri clinice severe, similare cu cele din pesta porcin;
complicaii secundare n pesta porcin
S. typhisuis
Enterit cronic la porcii tineri; mai puin virulent dect S.
choleraesuis; enterit sau septicemie
Ovine
S. abortus ovis avort la oaie
S. montevideo
S. dublin
S. typhimurium
enterite sau septicemii
S. anatum
217
Gazda
Serotipuri de
Salmonella
Infecia produs
Cabali-
ne
S. abortus equi avort la iap
S. typhimurium
enterite sau septicemie, mai ales la mnji dar i la adulii
supui stresului
Gini
i alte
psri
S. pullorum boala puloric puloroz
S. gallinarum tifoza aviar la adulte
S. enteritidis infecii severe la gin i curcan (enterite i septicemie)
S. typhimurium
paratifoza ginilor; poate produce septicemie la puii de
porumbel i artrite ale aripilor
8.4. Morfologie
Salmonella (cu excepia lui S. pullorum-gallinarum) este o
enterobacterie mobil, respectiv un bacil sau cocobacil Gram negativ,
cu dimensiuni de 0,6/2-4 microni. Este necapsulogen i nesporogen.
Serotipurile de S. enterica subsp. enterica prezint fmbrii manozosenzitive,
cu rol de adezine la celulele epiteliale intestinale. Salmonelele din serotipul
pullorum-gallinarum au fmbrii neadezive de tip 2 i din aceast cauz sunt
apatogene pentru om.
S. enterica subsp. arizonae i diarizonae posed fmbrii
hemaglutinante.
Coninutul n guanin i citozin al DNA este de 50 moli % (prin
analiz biochimic, Hill, 1966).
Majoritatea tulpinilor genului sunt sensibile la fagul 01 al lui Felix i
Callow (1943). Acest fag este nalt specializat pentru Salmonella, liznd
99,5% din tulpinile testate (din acest gen) i numai 0,3% din tulpinile ce
aparin altor membrii ai familiei (Thall i Kalligs, 1955).
8.5. Condiii de cultivare i caractere culturale
Salmonelele se dezvolt n limite largi de temperatur (2-54C) i pH
(ntre 4 i 9,5 cu un optim de 6,5-7,5).
Se dezvolt pe mediile de cultur uzuale n 18-24 de ore, la tempera-
tura de 37C. n mediile lichide, variantele S tulbur uniform mediul n
timp ce variantele R, sedimenteaz pe fundul eprubetei, mediul aprnd
limpede.
218
Pe agarul nclinat se remarc disocierea coloniilor n variantele S, R i
M de 2-4 milimetri n diametru.
Variantele S sunt rotunde, lucioase, cu margini regulate, uor
emulsionabile.
Variantele R apar mai rar i sunt rugoase, cu margini neregulate, iar
cele de tip M sunt mai mari, cu centrul ombilicat i marginile cu aspect
mucoid. Unele tulpini formeaz colonii pitice.
Pentru izolare i identifcare se folosesc medii de cultur speciale,
difereniale sau selective.
n laboratoarele veterinare s-au preconizat scheme restrnse prin
care s se poat diferenia, n prima faz, bacteriile intestinale lactoz-
pozitive de cele lactoz-negative. n acest sens se folosete un sistem
constituit din mediile TSI (Triple Sugar Iron) i MILF (mobilitate, indol,
lizin, fenilalanin), care permite diferenierea principalelor grupri de
enterobacterii.
Schema 8.1
Circuitul salmonelelor
(dup Verde N., 2001)

ANIMALE PENTRU
CONSUM
ANIMALE
IMPORT
FURAJE*
VECTORI
MEDIU
AP
SOL
ABATOR
ALIMENT
OM
PROCE SARE
219
Tabelul 8.3
Dezvoltarea enterobacteriaceelor lactoz negative i lactoz pozitive pe mediile
selective (adaptat dup Duca E., 1977)
Categoria
selectiv
(incubare
35-37C)
Mediul
A
b
r
e
v
.Dezvoltarea enterobacteriaceelor
- colonii -
Observaii
Lactoz pozitive Lactoz negative
Slab selective
(24 ore)
agar lactoz Mac
Conkey
M
C
2-3 mm, roii, fr
halou opalescent;
uneori mucoide
1-2 mm, semi-transparente,
necolorate
Y. cholerae colonii
incolore, translucide
ori roz
eozin albastru de
metilen (Levin)
E
M
B
1-2 mm, roii, cu
sau fr centru
nchis E. coli
(picturi de fuxin)
necolorate
Moderat
selective (24-
48 ore, citire
interm. la 24
ore)
agar dezoxi-colat
citrat lactoz
(Leifson)
A
D
C
L
1-2 mm, roii;
rareori mucoide
necolorate (H
2
S pozitiv,
central negru)
S. typhi colonii
necolorate;
Yersinia nu se dezvolt
Hektoen en-teric
King i Metzger
H
E
1-2 mm, roii
(mediul vireaz n
rou)
1-2 mm, albastre (H
2
S
pozitiv, cu centrul negru)
xiloz-lizin
dezoxicolat
(Taylor)
X
L
D2-3 mm, galbene,
opace
1-2 mm, roii, semitranspa-
rente (H
2
S pozitiv, centrul
negru)
agar bil albastru
de bromtimol
(Istrate-Meitert
I
M1-2 mm, galbene
1-2 mm albastre-verzui (H
2
S
pozitiv, centrul negru)
Moderat
selective (24-
48 ore, citire
interm. la 24
ore)
agar sruri biliare
i pro-pilenglicol
(Rambach)
R
.
A
.
1-3 mm, verzui-
albastre, albastre-
violet
opalescente, incolore
Salmonella spp.
colonii roii
agar Salmonella
Shigella (Difco)
S
.
S
.
1-2 mm, roz
in-colore (H
2
S po-zitiv
centrul negru)
Yersinia colonii
0,5 mm incolore,
translucide
SMID (bio
Mrieux)
S
M
I
D
1-2 mm, roii sau
glbui
1-2 mm verzi-albstrui (H
2
S
pozitiv centrul negru)
220
Categoria
selectiv
(incubare
35-37C)
Mediul
A
b
r
e
v
.Dezvoltarea enterobacteriaceelor
- colonii -
Observaii
Lactoz pozitive Lactoz negative
nalt selective
(48 ore)
agar-sulfur de
bismut (Wilson-
Blair)
W
B
inhibiie
1-2 mm, negre, roii, halou
negru metalic
Shigella i Yersinia nu
se dezvolt
agar verde briliant
A
V
B
inhibiie 1-2 mm roii, halou rou
Shigella i Yersinia nu
se dezvolt
Pe mediile de mbogire, selenit acid de sodiu i bulion tetrationat
Mller-Kauffmann se dezvolt prompt (n 24 de ore i chiar mai rapid la
temperatura de 40 grade Celsius).
Pot vira mediul cu selenit n crmiziu, dup 24-48 de ore i pot
decolora mediul Kauffmann-Mller. Pe mediile selective, toate salmonelele
formeaz culturi lactoz-negative. Acestea pot f ierarhizate astfel:
slab selective : agar-lactoz-sruri biliare (MacConkey); eozin
albastru de metilen (Levin);
moderat selective : agar-dezoxicolat-citrat lactoz (Leifson);
agar-bil-albastru de bromtimol (Istrate Meitert); agar sruri biliare i
propilenglicol (Rambach);
nalt selective : agar-sulfur de bismut (Willson-Blair), agar verde
briliant.
8.6. Proprieti biochimice
Toate salmonelele fermenteaz glucoza cu producie de gaz,
metabolizeaz citratul de amoniu, ca unic surs de carbon, reduc nitraii n
nitrii, nu produc indol i nici ureaz. Reaciile hidrogenului sulfurat, lizin
i ornitindecarboxilazei sunt pozitive, nu fermenteaz zaharoza, inozitolul
i salicina.
Pe baza proprietilor biochimice i a altor nsuiri, Kauffmann (1960)
a mprit genul Salmonella n patru subgenuri, crora Le Minor (1984) le-a
mai adugat un gen suplimentar.
Caracterele biochimice ale speciilor i subspeciilor de Salmonella sunt
redate n tabelele 8.4 i 8.5.
221
Tabelul 8.4
Caractere difereniale ale speciilor i subspeciilor de Salmonella
(dup Negu, 1999)
Testul
Salmonella enterica subspeciile:
Salmonella
bongori
enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica
-galactozidaza - - + + - d +
Gelatinaza - + + + + + -
Galacturonat - + - + + + +
Crete n mediu
cu KCN
- - - - + - +
Malonat - + + + - - -
Mucat + + + d - + +
d-tartrat + - - - - - -
-glutamil
transferaza
+ + - + + + +
-glucuronidaz d d - + - d -
Dulcitol + + - - - d +
Salicin - - - - + - -
Sorbitol + + + + + - +
Lactoz - - -75% +75% - + d
Liza prin fag O
1
+ + - + - + d
Habitat
a
n
i
m
a
l
e

c
u

s
n
g
e

c
a
l
d
animale cu
snge rece
Tabelul 8.5
Salmonella enterica subsp. enterica: diferenierea biochimic a serovarurilor
(dup Negu, 1999)
Testul
Serovarurile Celelalte
serovaruri typhi paratyphi A choleraesuis gallinarum pullorm
Gaz din glucoz - + + - + +
Citrat (Simmnons) - - d + - +
H
2
S (48h) - - - - +
Lizindecarboxi-
laz
+ - + + + +
Ornitindecarboxi-
laz
- + + - + +
Mobilitate + + + - - +
222
8.7. Proprieti antigenice
Salmonelele posed trei categorii principale de antigene:
antigene somatice O 5 ;
antigene fagelare H 5 ;
antigene de suprafa Vi 5 .
Acestea sunt amplasate n celula bacterian, astfel: la suprafa se
gsete antigenul Vi, iar limitrof acestuia, spre interior, antigenul O, iar
antigenul H intr n structura fagelilor.
Antigenele somatice O sunt termostabile, alcoolorezistente, find
reprezentate de complexul lipopoliglucidic din membrana extern a peretelui
celular. Aglutinarea O are un aspect granular find inhibat de formol
n concentraie de 0,5%. Antigenele O se noteaz cu cifre arabe. Dup
semnifcaia lor diagnostic, se mpart n antigene majore cu specifcitate de
serogrup i antigene minore, comune mai multor grupe.
Datorit acestei specifciti, salmonelele au fost ncadrate n 46 de
grupe notate n schema Kauffmann-White, iniial cu litere mari ale alfabetului
latin, iar dup epuizarea acestuia, cu numrul de ordine al factorului specifc.
n mod excepional, pot aprea modifcri n mecanismele de biosintez ale
salmonelelor care sunt urmate de pierderea specifcitii O. Acest fenomen
se explic prin apariia culturilor S-R (de tranziie) sau R sau sub aciunea
bacteriofagilor convertizori. Efectele acestor modifcri se pot traduce prin
schimbarea serotipului n cadrul aceleiai serogrupe sau chiar ntr-o alt
grup. De exemplu, degradarea prin conversie fagic indus de fagul E
15

a antigenelor somatice 3,10 i 3,15, determin schimbarea serotipului i a
numelui acestuia, iar S. anatum consecutiv modifcrilor din echipamentul
enzimatic devine S. newington.
Antigenele fagelare H sunt reprezentate de fageline (proteinele
structurale ale fagelilor). Sunt termolabile, puternic antigenice i au o
greutate molecular de 40 Kdal. Aglutinarea H are un aspect foconos i
nu este inhibat de formol.
S. pullorum i S. gallinarum nu posed antigene H deoarece sunt
imobile.
Un numr restrns de salmonele (S. typhi, S. enteritidis) sintetizeaz un
singur antigen H i se numesc monofazice. Marea majoritate ns produc
dou categorii de antigene notate cu H
1
i H
2
find considerate difazice.
Acest fenomen a fost descris n 1929, de ctre Andrewes i poart numele de
variaie de faz. Antigenele de faza nti (H
1
) considerate specifce au fost
notate cu litere mici ale alfabetului latin i defnesc serotipul. Antigenele de
faza a doua (H
2
) sunt nespecifce i noteaz cu cifre arabe.
223
Antigenele de suprafa Vi au fost descrise pentru prima dat la S.
typhi, izolat de la bolnavii cu febr tifoid. Ulterior au fost identifcate la
S. paratyphi i excepional la S. dublin.
Edwards, n 1972 remarc antigenul Vi la S. paratyhi C, izolat de la
porc. Antigenul Vi este situat n celul, exterior antigenului O pe care l
mascheaz mpiedicnd astfel aglutinarea cu seruri anti O. El constituie
substratul pentru fxarea bacteriofagilor Vi utilizai n lizotipie care au o
importan mare n epidemiologie.
Salmonelele care posed antigenul Vi sunt rezistente la fagocitoz
i prezint o virulen mai mare.
S-a mai descris la salmonele i un antigen de nveli M, iniial la
tulpinile mucoide de S. paratyphi B, iar apoi i la alte serotipuri.
Formula antigenic const n notarea tuturor antigenelor care intr n
structura unui serotip dat. Notarea se face ncepnd cu antigenele somatice,
urmat de antigenele fagelare de faza nti i antigenele fagelare de faza
a doua. De exemplu, S. typhimurium are antigenele somatice 1, 4, 5, 12,
antigenul de faza nti i i de faza a doua 1, 2. Formula ei antigenic este
1,4,5,12:i:1,2.
La salmonelele care posed antigene Vi, acesta se noteaz dup ultimul
antigen somatic. De exemplu, S. typhi are formula antigenic 9,12,Vi:d.
Antigenele inconstante sunt puse ntre paranteze mari, iar cele
insufcient dezvoltate (slab aglutinabile) ntre paranteze mici. De exemplu,
la S. derby, cu formula antigenic 1,4,[5],12:f,g:(1,2), prezena antigenului
somatic 1 se datoreaz lizogeniei, iar antigenul 5 somatic i 1,2 fagelare
sunt inconstant prezente.
Grupele serologice sunt constituite pe baza structurii antigenice
somatice. Grupele mai vechi au fost notate cu literele mari ale alfabetului
de la A la Z, iar cele mai recente cu numere arabe.
Cu literele C, D, E i G sunt notate mai multe grupe. n acest caz,
dup liter urmeaz un numr de ordine. De exemplu, litera C este utilizat
pentru notarea a patru grupe: C
1
, C
2
, C
3,
C
4
.
Toate salmonelele dintr-o grup sunt caracterizate printr-unul sau
mai multe antigene majore comune, considerate antigene de grup. De
exemplu, pentru grupa A, antigenul de grup este antigenul 2; pentru grupa
B, antigenul 4; pentru grupa C
1
antigenul 6 i 7, pentru C
2
6 i 8, pentru C
3

8 etc.
La ultimele grupe notate cu numere, numrul grupei corespunde cu al
antigenului de grup.
Structura antigenic i serovarurile de salmonele mai frecvent
circulante sunt redate n tabelul 8.6.
224
Tabelul 8.6
Structura antigenic a serovarurilor de Salmonella mai frecvent circulante
a
(dup Negu, 1999)
Serovarul
Structura antigenic
O
H
1 2
Paratyphi A
Grup A
1, 2, 12
a -
Paratyphi B
Grup B
1,4/5/12
b 1,2
Java 1,4/5/12 b /1,2/
Abony 1,4/5/12 b c, n, x
Schleissheim 4, 12, 27 b, z12 -
Saintpaul 4/5/,12 c, h 1,2
Reading 1,4/5/,12 c, h 1,5
Kaapstad 4,12 c, h 1, 7
Chester 5/5/,12 c, h e, n, x
Derby 1,4/5/,12 f, g /1,2/
Agona 1,4,12 f, g, s -
Essen 4,12 g, m -
California 4,5,12 m, t -
Typhimurium 1,4/5/12 i 1,2
Bredeney 1,4,12,27 l, v 1,7
Kimuenza 1,4,12,27 l,v e, n, x
Heidelberg /1/,4,5,/12/ r 1,2
Haifa 1,4,/5/,12 z
10
1,2
Ohio
Grup C1
6,7
b l, w
Paratyphi C 6,7/Vi/ c 1,5
Choleraesuis 6,7 c 1,5
Choleraesuis var.
kunzendorf
6,7 /c/ 1,5
Typhisuis 6,7 c 1,5
Isangi 6,7 d 1,5
Livingstone 6,7 d 1, w
Lomita 6,7 c, h 1,5
Braenderup 6,7 c, h e, n, z
15
Montevideo 6,7 g, m, s /1,2,7/
Weltevreden 3,10 r z
6
Amager 3,10 y 1,2
Orion 3,10 y 1,5
Newington
Grup E2
3,15
c, h 1,6
225
Serovarul
Structura antigenic
O
H
1 2
Tucbinger 3,15 y 1,2
Senftenberg
Grup E4
1,3,9
g/s/t
Taksony 1,3,19 i z
6
Aberdeen
Grup F
11
i 1,2
Rubislaw 11 R c, n, x
Poona
Grup G1
1,13,22
z 1,6/z59
Durham
Grup G2
13,23
b c, n, z
15
Grumpensis 13,12 d 1,7
Worthington 1,13,23 z 1,w
Cubana 1,13,23 z29 -
Gaminara
Grup I
16
d 1,7
Minnesota
Grup L
21
b c, n, x
Adelaide
Grup O
35
f, g -
Johannesburg
Grup R
41
b c, n, x
Waycross
Grup S
41
z
4
, z
23
-
Houten IV 43 z
4
, z
23
z
4
, z
23
Oranienburg 6,7 m, t -
Thompson 6,7 k 1,2
Concord 6,7 l, v 1,2
Irumu 6,7 l, v 1,5
Colorado 6,7 l, w 1,5
Virchow 6,7 r 1,2
Infantis 6,7,/14/ r 1,5
Tennessee 6,7 z
29
-
Lille 6,7 z
38
-
Menchen
Grup C2
6,8
d 1,2
Manhattan 6,8 d 1,2
Newport 6,8 c, h 1,2
Kottbus 6,8 c, h 1,5
Chincol 6,8 g, m, s c, n, x
Bonariensis 6,8 i c, n, x
Blockley 6,8 k 1,5
226
Serovarul
Structura antigenic
O
H
1 2
Litchfeld 6,8 l, v 1,2
Manchester 6,8 l, v 1,7
Bovismorbifcans 6,8 r 1,5
Hadar 6,8 z
10
c, n, x
Glostrup 6,8 z
10
c, n, z
15
Wippra 6,8 z
10
z
6
Emek
Grup C3
/8/,20
g, m, s -
Kentucky /8/,20 i z
6
Eimsbuettel
Grup C4
6,/7/,/4/
d l, w
Jerusalen 6,/7/,/4/ z
10
l, w
Typhi
Grup D1
9,12,/Vi
d -
Enteridis 1,9,12 g, m -
Dublin 1,9,12 g, p -
Javiana 1,9,12 l, z
28
1,5
Wangata 9,12 z
4
z
23
/1,7/
Pullorum 1,9,12
1
,12
2
- -
Gallinarum 1,9,12
1
,12
1
- -
Butantan
Grup E1
3,10
b 1,5
Muenster 3,10 c, h 1,5
Anatum 3,10 c, h 1,6
Meleagridis 3,10 c, h l, w
Westhampton 3,10 g, s, t -
Sinstorf 3,10 l, v 1,5
London 3,10 l, v 1,6
Give 3,10 l, v 1,7
a
Simboluri:/ /, poate f absent.
8.8. Nomenclatura salmonelelor
n funcie de etapa n care au fost izolate i omologate, salmonelele se
noteaz dup:
numele speciei receptive, afeciunea provocat sau o combinaie
ntre acestea; de exemplu: S. typhi, S. choleraesuis, S. enteritidis, S.
typhimurium, S. gallinarum etc.;
numele localitii de unde au fost izolate: S. nitra, S. helsinki, S.
montevideo, S. dublin, S. panama etc.;
227
formula antigenic.
Schema Kauffmann-White este un catalog iniiat de Kauffmann care
conine un inventar al tuturor serotipurilor de Salmonella, aezate pe grupe
serologice. n dreptul fecrui serotip este notat formula antigenic.
8.9. Ecologie
Salmonelele se gsesc n tubul digestiv al omului, mamiferelor,
psrilor i animalelor cu snge rece. Cele dou surse majore, omul i
animalele sunt responsabile de poluarea solului, apelor reziduale, apelor
de suprafa n care pot supravieui luni i chiar ani (n sol). O suit de
factori, printre care intensifcarea comerului i a cltoriilor la mari
distane, migraiile populaionale, industrializarea alimentaiei i a creterii
animalelor de consum (porci, psri), n mari colectiviti consumatoare
de hran cu adaosuri proteice, deseori contaminate (finuri furajere de
carne, oase, snge) au contribuit la rspndirea serovarurilor i la creterea
morbiditii prin salmoneloze. Factorii sezonieri i clima cald favorizeaz,
n condiii precare de igien, nivelul morbiditii. Cu puine excepii
serovarul Typhi i Paratyphi, pentru om; ser. Abortus ovis, pentru ovine;
ser. Typhisuis, pentru porci i ser. Gallinarum/Pullorum pentru psri toate
celelalte serovaruri nu au specifcitate de gazd.
Numeroi vectori (insecte, roztoare, psri, carnasiere, apele reziduale
din ferme, abatoare etc.) constituie verigi importante n declanarea unor
enzootii de salmoneloz. S-a demonstrat c musca domestic, nu numai c
vehiculeaz pasiv salmonelele, dar le i transmite trasovarian, iar albinele
fac o salmoneloz chimic. Gndacul de buctrie, furnica, ixodidele,
argasidele, pot vehicula i ele infecia salmonelic. Nu exist ecosistem
n natur n care salmonelele s nu fe prezente. obolanii s-au dovedit a f
unul dintre rezervoarele principale, pentru animalele domestice i om. Cinii
sunt vectori pentru numeroase serotipuri. De la acetia s-au identifcat: S.
typhimurium, S. choleraesuis, S. enteritidis, S. anatum.
Malnutriia, avitaminozele, dismineralozele i micotoxicozele
contribuie i ele prin debilitarea organismului. n afara transmiterii pe
orizontal se nregistreaz i infecii cu transmitere vertical, transplacentar,
n special la oaie i iap, la care infecia se exprim prin avort.
Transmiterea vertical este, de asemenea, o caracteristic a salmonelozei
psrilor, dat de serotipuri imobile (ser. Gallinarum/Pullorum).
228
8.10. Patogenitate
Salmonelele au grade diferite de patogenitate care variaz n funcie
de serotip. n tabelul Kauffmann-White, fgureaz i numeroase serotipuri,
al cror rol patogen este necunoscut, unele dintre acestea find izolate o
singur dat. Salmonelele au capacitatea de a se multiplica n organism,
att extracelular ct i intracelular. Imunitatea fa de salmonele este
mediat celular i dependent de imunoglobulinele netransferabile pe cale
placentar.
Orice infecie cu salmonele induce o imunitate specifc de serotip.
ntr-un organism imunizat antisalmonelic (vaccinuri vii, vaccinuri atenuate),
macrofagele nu mai permit nmulirea intracelular a germenilor, iar fa de
cei afai extracelular sunt active imunoglobulinele i complementul.
Salmonelele i datoreaz patogenitatea, att virulenei, ct i
toxicitii. Acestea posed mai muli factori de virulen, care faciliteaz
invazia celulelor non-fagocitare, supravieuirea n mediul intracelular i
replicarea n interiorul celulei gazd.
Dup ingestia microorganismului, urmtoarea etap a procesului
patogen este reprezentat de penetrarea epiteliului intestinal. O dat
penetrate, aceste celule, bacteriile sunt incluse n vacuole intracitoplasmatice
delimitate de o membran.
Salmonelele virulente supravieuiesc i se multiplic n aceste vacuole
i n fnal lizeaz celulele gazd i disemineaz n organism.
Supravieuirea salmonelelor n interiorul incluziilor implic blocarea
fuziunii ntre fagozomi i lizozomi. Totodat, prin depolarizarea barierelor
epiteliale, salmonelele afecteaz integritatea jonciunilor intercelulare,
fenomen ce se traduce prin favorizarea leziunilor citotoxice (semnifcative)
ale celulelor epiteliale.
Salmonelele nu au nevoie de mobilitate sau de fmbrii (ca speciile
Yersinia spp., Escherichia coli), pentru a adera i invada celulele eucariote
(E. J. Threlfall).
Pentru invazie este necesar sinteza proteic de novo, care este
reglat de concentraia sczut n oxigen, de faza de cretere sau de suprafaa
celulelor epiteliale.
Virulena reprezint mecanismul major de agresiune i const n
capacitatea de a se ataa, a se multiplica i a invada peretele intestinal.
Ataarea salmonelelor la enterocit se realizeaz prin intermediul fmbriilor
(fe manoz sensibile tip 1, fe manoz rezistente tip 3) a adezinelor de
suprafa i hemaglutininelor sau prin peptidele induse de enterocit. Zona de
ataare o reprezint receptorii glicoproteici ai celulei intestinale, localizai
229
pe microvili sau glicocalix. Ataarea la celulele M care cptuesc plcile
Payer urmeaz aceleai mecanisme.
Supravieuirea i multiplicarea salmonelelor n celula gazd, este
un alt element important al virulenei. Finalitatea acestui proces const
n rspndirea bacteriilor n lamina proprie i declanarea mecanismului
infamaiei, cu eliberarea de mediatori celulari cu aciune vasodilatatoare.
n acest sens se remarc prostaglandinele care, prin mecanisme chimico-
enzimatice blocheaz retroresorbia sodiului, determinnd acumularea de
lichide n intestin. Clinic, infamaia i acumularea de lichid intraluminal,
determin accentuarea peristaltismului, apariia crampelor i a diareei.
Plasmidele de virulen cu specifcitate de serotip (PSS) stimuleaz
bacteria purttoare la o multiplicare rapid, depind posibilitile de aprare
ale gazdei.
Unele serotipuri de salmonele posed plasmide cu greutate molecular
relativ mare, care pot f privite ca find, specifce de serotip. Serotipurile
cu astfel de plasmide sunt reprezentate de: S. enteritidis, S. typhimurium,
S. dublin, S. cholerae suis, S. pullorum i S. gallinarum. Rolul acestor
plasmide n patogeneza bolii la oameni i alte specii de animale este neclar.
Se pare c sunt necesare pentru declanarea bacterian: pentru supravieuirea
intracelular a salmonelelor n fagocite. De asemenea, s-a sugerat c pot
crete supravieuirea microorganismelor n infecia extraintestinal la
oameni (T. J. Humphrey).
Sideroforii (care au capacitatea de a bloca ferul), intervin prin
intermediul enterochelinei n sporirea gradului de virulen. De asemenea,
antigenul Vi are rol n virulen, inhibnd opsonizarea bacteriei de ctre
componenta complementului C
36
, opunndu-se fagocitrii acesteia de ctre
macrofag.
Salmonelele i manifest toxicitatea prin elaborarea de exo i
endotoxine.
Exotoxinele sunt reprezentate de o enterotoxin care este o protein
cu o greutate molecular ntre 90 i 110 Kdal. Analizele electroforetice au
demonstrat o similitudine ntre enterotoxina salmonelic i enterotoxina LT
de la Vibrio cholerae, att n ceea ce privete confguraia ct i modul de
aciune.
Citotoxina din membrana citoplasmatic este o protein termolabil,
cu greutatea molecular de 56-78 Kdal. Aciunea ei se manifest prin
inhibarea sintezei proteice a celulelor gazd, determinnd liza acestora.
Endotoxinele i exercit activitatea prin activarea complementului
230
avnd ca efect citoliza, eliberarea de mediatori vasoparalitici TNF (tumor
necrosis factor), factorul de coagulare intravascular i prin efectul pirogen.
Endotoxinele induc manifestri digestive, vasculare, renale i
corticosuprarenale.
8.11. Sensibilitatea fa de factorii de mediu
Salmonelele prezint o rezisten destul de mare la aciunea factorilor
fzici, chimici i biologici. La 60C sunt distrui n 12-20 minute, iar la
100C n 5-8 minute. Pe puni salmonelele rezist pn la 200 de zile, n
blegar 6-11 luni, n fecalele de roztoare 148 de zile, iar n cele de psri
200 de zile, n solurile bogate n humus 8-9 luni. n alimente pot rezista pn
la 180 de zile, n lapte 2-3 luni, n pulberea de ou 4 ani. n apele reziduale
i n cadavrele n putrefacie rezist 2-3 luni (R. M. Mnzat).
Antisepticele i dezinfectantele obinuite sunt active fa de salmonele
n concentraii uzuale. Sunt sensibile fa de antibiotice (cloramfenicol,
tetracicline, neomicin, gentamicin, amoxicilin, colimicin, cefalosporine)
i chimioterapice (nitrofuran, sulfametazin, fuorochinolon).
Utilizarea antibioticelor i chimioterapicelor creeaz cu uurin
tulpini rezistente fa de acestea. Explicaia fenomenului const n existena
factorului plasmidic R care se transfer cu uurin de la o bacterie la alta
prin gene extracromozomale, fenomen cunoscut sub numele de R-infecie
(R. M. Mnzat).
8.12. Infecia experimental
Animalul de elecie este oarecele infectat intraperitoneal, iar cu unele
tulpini cu un grad ridicat de patogenitate i pe cale oral.
Infecia evolueaz cronic de la cteva zile la cteva sptmni. La
examenul necropsic oarecii prezint focare necrotice caracteristice n fcat
i splenomegalie.
Infeciile experimentale la om i animale. Poart denumirea de
salmonele sau paratifoze. Pot f primare sau secundare.
Infeciile salmonelice se caracterizeaz prin stri febrile, simptome i
leziuni gastroenterice, splenice i hepatice. O afnitate deosebit o au pentru
cile i vezica biliar, unde se gsesc n cantitate mare i unde rmn de
regul, localizate la purttori.
Se practic pentru speciile cu spectru larg de patogenitate i anume,
oarecele, prin inoculare intraperitoneal, cu formare de focare necrotice n
231
fcat i splenomegalie.
Pentru salmonelele imobile se folosesc n infecia experimental puii
de gin.

8.13. Serotipuri de salmonele patogene
A. Taurine
S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis, S. rostok, S. saint-paul i rar
S. bovismorbifcans, produc salmoneloza primar la taurine.
Serotipul S. dublin este cel mai adaptat la taurine, devenind purttoare
de lung durat sau chiar ntreaga via.
Recent s-a descris infecia salmonelic la taurine cu S. typhimurium
fag DT104, care este implicat n declanarea unor toxiinfecii alimentare
la om, cu evoluie destul de grav, datorit rezistenei deosebite a acestei
tulpini la antibiotice i chimioterapice (R. M. Mnzat).
S-au mai izolat de la taurine i S. infantis, S. oranienburg, S. aberden,
S. minesota, S. havana, S. gyve, S. newport i altele, care ns nu prezint
implicaii clinice.
Incidena infeciei salmonelice la taurine este mai ridicat n
Transilvania. Categoria cea mai afectat sunt vieii iar infecia se realizeaz
pe cale digestiv, pulmonar i excepional ombilical.
Sensibilitatea noului nscut se datoreaz lipsei unui sistem de aprare
specifc, organismul acestuia find incapabil de a elabora imunoglobuline.
Rezistena la infecia salmonelic depinde de imunizarea mamei i de
ingesta corect a colostrului de ctre viel, n primele ore de via.
Proflaxia specifc se realizeaz prin administrarea de vaccinuri
inactivate sau vaccinuri vii din tulpini atenuate.
n ara noastr se folosesc dou variante de vaccinuri inactivate:
vaccin acetonat contra salmonelozei i colibacilozei taurinelor;
vaccin acetonat tribacterian, contra salmonelozei, colibacilozei i
pasteurelozei.
B. Ovine
S. abortusovis este cea mai important i produce avortul salmonelic
al oilor, precum i mbolnviri perinatale la miei.
Au mai fost descrise avorturi enzootice la oaie, produse de S.
typhimurium n Australia.
Mecanismul producerii avortului, se explic prin capacitatea de
multiplicare i invadarea uterului gestant i implicit, a producerii de endo
i exotoxine.
232
C. Cabaline
Se ntlnesc serotipurile: typhimurium, enteritidis, derby, bovis,
mortifcans, choleraesuis, newport, anatum, dublin i altele care produc
salmoneloza franc a cabalinelor. Infecia are o evoluie sporadic, rar
enzootic i afecteaz de obicei animalele tinere, de 6-18 luni.
S. abortusequi, produce avortul salmonelic al iepelor i a fost izolat
n 1893 de Smith i Kilborne din secreia vaginal a iepelor care au avortat
(R. M. Mnzat).
D. Suine
Serotipul cu cea mai mare implicaie n patologie este S. choleraesuis,
cu dou varieti:
monofazic sau Kunzendorf;
bifazic sau american.
Din acestea au derivat prin mutaii selective S. typhisuis i S. paratyphi
C (tabelul 8.7).
Tabelul 8.7
Serotipuri patogene pentru porc (adaptat dup Edwards i Ewing)
Specia
Antigen Antigen H
Vi O Specifce Nespecifce
Grupa C
1. S. paratyphi C
VI VI, VII C 1, 4, 5
2. S. choleraesuis
v. american
- VI, VII C 1, 3, 4, 5
3. S. choleraesuis
v. kunsendorf
- VI, VII - 1, 3, 4, 5
4. S. typhisuis - VI, VII C 1, 3, 4, 5
5. S. typhisuis
v. voldagsen
- VI, VII - 1, 3, 4, 5
S. choleraesuis, cu cele dou variante afecteaz n special tineretul
i acioneaz la nivel enteropulmonar, n timp ce S. typhisuis poate afecta
i adulii. S. paratyphi C are o afnitate deosebit fa de celula hepatic i
produce icter, find totodat i serotipul cel mai patogen pentru om.
Vaccinarea antisalmonelic se realizeaz cu vaccinuri vii, constituite
mai ales din mutante R, nepatogene i imunogene, capabile s stimuleze
att imunitatea celular, ct i pe cea umoral.
E. Psri
Infeciile salmonelice se pot ncadra n dou grupe. Prima grup
include infecii cu S. gallinarum i S. pullorum care afecteaz n special
233
ginile i curcile, determinnd tifoza i respectiv puloroza aviar tratate ca
o singur entitate tifopuloroza. A doua grup include serotipuri mobile de
salmonele din specia enterica, ncadrate sub denumirea de paratifoze.
Pn acum dou decenii, S. gallinarum i S. pullorum au fost
considerate eronat ca dou specii distincte de salmonele imobile. Cercetrile
efectuate de Le Minor i Popoff, n 1988, precum i lucrrile lui Christensen
n 1992 privind caracterizarea lui S. enterica serovar gallinarum, biovar
gallinarum i pullorum, prin analiza proflului plasmidic i biochimic, aduc
unele date suplimentare, dar ncadrarea taxonomic propus de acetia nu a
fost validat ofcial.
S-a demonstrat prin electroforeza enzimatic multilocular i estimarea
genotipului c ambele biovarieti sunt monofletice, strmoul lor comun
find imobil. Sunt asemntoare i din punct de vedere antigenic i posed
antigenele O
1
, O
9
i O
12
cu specifcaia c biovarul pullorum prezint o
variaie a antigenului O
12
avnd n plus factorii 12
2
i 12
3
(R. M. Mnzat).
Biochimic, ambele varieti fermenteaz arabinoza, dextroza, galacto-
za, manitolul, ramnoza i xiloza, cu producere de acid (fr producie de
gaz). Nu fermenteaz lactoza, sucroza i salicina.
Diferena major ntre cele dou biovarieti este aceea c biovar
pullorum produce rapid decarboxilarea ornitinei, n timp ce biovar
gallinarum, nu.
Biovar pullorum conine o toxin termostabil la care sunt susceptibile
roztoarele, nu i puii, iar biovar gallinarum o toxin letal pentru iepuri i
endotoxin.
Tifopuloroza afecteaz gina, curca, bibilica, fazanul, punul i
papagalul. Receptivitatea maxim o prezint puii de gin, n primele
sptmni de via.
Infecia se transmite vertical prin ou (cea mai important cale de
transmitere), sau orizontal, pe cale conjunctival i digestiv. Datorit acestui
fapt se impune o sever supraveghere serologic a efectivelor de psri prin
diferite variante ale reaciei de aglutinare: hemaglutinare rapid (RHAR),
seroaglutinare rapid, seroaglutinare n tuburi (RSAL) i microaglutinare.
Ultimul test se execut n plci de microtitrare find mai uor de executat i
mai economic.
Alte teste serologice utilizate sunt testul COOMBS, testul de
imunodifuzie i ELISA.
n ara noastr se realizeaz RHAR i RSAL, antigenul find realizat
din tulpini selecionate de Salmonella biovar pullorum cu o structur
antigenic complet (tulpini standard, bogate n fraciunea antigenic O
12

delipidate) (R. M. Mnzat).
234
n cazul depistrii de focare, msura cea mai indicat const n
excluderea oulor provenite din fermele contaminate i asanarea focarelor
respectndu-se cu strictee principiul totul plin, totul gol, dezinfecia i
repausul sanitar.
n cazul contaminrii puternice a unui teritoriu, care face imposibil
eradicarea, se poate aplica n scop imunoproflactic vaccinarea. Un vaccin viu
care a dat rezultate acceptabile se prepar din tulpina atenuat 9R. Aceasta
este constituit dintr-o suspensie de germeni vii din biotipul gallinarum,
cultivat n mediul lichid i lioflizat, find marcat prin aglutinabilitatea
ei cu soluie fziologic clorurosodic sau cu soluie de acrifavin i
neaglutinabilitatea ei cu serul anti O polivalent sau cu serurile de grup.
Vaccinarea se face la ginile din efectivele de reproducie, iar la nevoie pot
f vaccinai i puii de 4-5 zile.
Serotipurile de salmonele mobile incriminate n infeciile paratifce
sunt numeroase. n ara noastr, n ordinea incidenei se remarc: S.
enteritidis (50,8%), S. typhimurium (30,4%), S. gallinarum (5,8%), S.
heidelberg (2,4%), S. agona (2,1%), S. derby (2,9%), S. haifa (2,4%), S.
newport (2,4%) (R. M. Mnzat).
La palmipede (dup Perianu) s-au izolat urmtoarele serotipuri:
anatum, enteritidis, typhimurium, choleraesuis, iar la porumbel typhimurium,
un tip antigenic deosebit de cel clasic, deoarece i lipsesc factorii 1 i 5 din
antigenul somatic.
8.14. Salmoneloza non-tifoidic la om
S. typhi i S. paratyphi produc la om febra enteric, care reprezint
forma cea mai sever de boal. Transmiterea se face de la om la om fr
implicarea animalelor.
Infeciile umane sunt determinate, n majoritatea cazurilor de
ctre S. enterica subsp. enterica cu 3 serotipuri: typhi, typhimurium i
choleraesuis.
Se cunosc trei tipuri de tablouri clinice ale acestor infecii:
serotipul typhi produce febra tifoid;
serotipul typhimurium produce enterocolita acut;
serotipul choleraesuis produce tipul septicemic caracterizat
prin bacteriemie i leziuni focale;
Salmonelele care se transmit de la animale la om produc salmoneloza
non-tifoidic, care este o infecie zoonotic extrem de rspndit pe
mapamond.
Salmoneloza uman, rmne o problem major, att din punct
235
de vedere al morbiditii ct i din punct de vedere economic. Numrul
cazurilor de salmoneloz non-tifoidic a crescut vizibil n ultimii 10 ani.
Acestea sunt asociate n mare parte cu S. enteritidis, tipul fagic (TF) 4 care
predomin n Europa Occidental, TF 1, n Europa de Est i TF 8 n SUA
(T. J. Humphrey).
Pn n prezent au fost identifcate peste 2700 de serotipuri, ns foarte
puine dintre acestea sunt implicate n salmoneloza uman.
Salmonelele pot prezenta antigene comune cu alte enterobacterii, ceea
ce poate crea difculti n diagnostic.
Cele mai utilizate tehnici (dup E. J. Threlfall) pentru subclasifcarea
n cadrul serotipului sunt:
tipizarea cu bacteriofagi (lizotipizarea);
biotipizarea;
tipizarea prin antibiogram (tipizarea R);
analiza coninutului de lipopolizaharide (LPS) sau proteine
membranare externe (PME) pentru investigaii specifce;
caracterizarea DNA-ului plasmidic.
Lizotipizarea. Pe baza schemelor de tipizare fagic au fost identifcate
peste 30 tipuri fagice de S. enteritidis i peste 200 de tipuri de S. typhimurium.
Pn n prezent s-au realizat astfel de scheme pentru: S. typhi, S. paratyphi
A i B, S. enteritidis, S. typhimurium, S. virchow i S. hadar.
Biotipizarea a fost utilizat pentru subclasifcarea mai multor serotipuri
de Salmonella. Aceast metod se bazeaz pe urmtoarele teste:
mobilitate;
prezena fmbriilor hemaglutinante;
fermentarea diferitelor substraturi.
Tipizarea prin antibiogram (R tipizarea sau rezistotipia). Reprezint
pentru unele serotipuri i tipuri fagice (S. typhimurium) un marker
epidemiologic util.
Analiza coninutului de LPS. S-a dovedit util pentru investigarea
interaciunilor ntre anumite tipuri fagice. De exemplu, pierderea ireversi-
bil a capacitii de a sintetiza LPS s-a dovedit responsabil pentru con-
versia S. enteritidis tipul 4, n S. enteritidis tipul 7 (T. J. Humphrey).
Caracterizarea DNA-ului plasmidic. Se poate realiza prin urmtoarele
metode:
tipizarea proflului plasmidelor;
amprentarea plasmidic;
identifcarea genelor virulenei mediate de plasmide.
Aceste metode sunt aplicabile numai tulpinilor purttoare de plasmide.
Pentru diferenierea salmonelelor care nu posed plasmide au fost utilizate
236
urmtoarele metode:
ribotipizarea;
tipizarea secvenelor cromozomiale clonate aleator;
tipizarea secvenei de inserie 200;
electroforeza n gel n cmp pulsatil.
Infecia salmonelic se realizeaz prin ingestia microorganismelor
din ap, alimente crude, insufcient preparate, contaminate ulterior sau
prin transmiterea interuman pe cale fecal-oral. Aceasta din urm se
poate realiza prin contact direct cu excreiile infectate sau indirect, prin
manipularea obiectelor contaminate cu excreii.
Exist mai multe tipuri de epidemii produse de ctre salmonele la
om:
tipul surs punctiform , n care majoritatea cazurilor primare
apar ntr-o perioad de 12-72 de ore de la consumul alimentului contaminat.
Acest tip de epidemii apar n cazul n care mai multe grupuri de populaie
(spitale, coli, azile, recepii) sunt deservite de acelai furnizor.
tipul surs comun continu sau larg rspndit , n care
alimentul (medicamentul) contaminat este distribuit pe scar larg. Aceste
epidemii au fost rspndite n Marea Britanie, prin consumul de salam i
psti de fasole i n multe alte ri prin consumul de ou i carne de pui,
insufcient preparate.
epidemiile cu transmitere interuman , se ntlnesc cel mai
frecvent n instituiile n care exist difculti n meninerea igienei, cum ar
f spitalele psihogeriatrice.
epidemii care ntrunesc caracteristicile tuturor celor trei tipuri
descrise mai sus, ntlnite mai ales n spitale i extrem de greu de eradicat.
Sursele principale de salmonele implicate n infectarea produselor de
origine animal sunt reprezentate de:
efectivul matc infectat;
alimentele contaminate;
mediul.
Prezena salmonelelor n furaje, duce la infectarea animalelor i a
produselor acestora. n acest sens, se recomand ca prelucrarea termic a
furajelor s fe sufcient pentru distrugerea salmonelelor.
Utilizarea excreiilor animale pe terenurile fermelor, prezint de
asemenea riscuri pentru sntatea animalelor i a oamenilor. O mare varietate
de salmonele au fost izolate din cursurile de ap i de la animalele slbatice
din jurul fermelor. Se consider c, n special, pescruii au importan
n diseminarea salmonelelor. oarecii sunt implicai n transmiterea lui S.
enteritidis la ginile outoare (J. G. Cruickshank).
237
Contaminarea crnii cu salmonele este dependent de gradul portajului
la animalul viu i de igiena procesului de sacrifcare.
Contaminarea carcaselor se poate produce aproape n orice stadiu
al procesului de sacrifcare, cel mai probabil n momentul ndeprtrii
intestinelor i a pielii.
Contaminarea cu salmonele a carcaselor de psri reprezint rezultatul
contaminrii ncruciate, ce se poate produce n cursul transportului sau pe
linia de sacrifcare. Cel mai important mijloc de contaminare, l reprezint
oprirea, care este inefcient pentru distrugerea sau ndeprtarea microorga-
nismelor ataate de pielea puilor (T. J. Humphrey).
n cazul oulor, salmonelele pot f izolate fe de pe coaja oului, fe din
coninutul acestuia.
Principalul vehicul n salmoneloza uman asociat consumului de
lapte este laptele nepasteurizat. Toate salmonelele descoperite pn n
prezent sunt sensibile la cldur, find uor distruse prin pasteurizare. Totui,
n 1956, laptele pasteurizat a fost incriminat ntr-o epidemie de Salmonella.
S-a descoperit ns c dopurile sticlelor erau contaminate cu fecale de
oarece (E. J. Threlfall).
Salmonelele pot supravieui n anumite brnzeturi. n Canada au fost
infectate 1500 de persoane care au consumat brnz Cheddar, n Marea
Britanie, prin consumul de brnz topit, s-a produs o epidemie cu S. dublin,
iar n Frana (1993), prin brnza de capr, s-au contaminat cu S. java peste
273 de persoane (E. J. Threlfall).
Persoanele care manipuleaz alimente i au diaree constituie un risc
semnifcativ n rspndirea infeciei salmonelice i trebuiesc excluse de la
lucru o perioad ce se prelungete cu 48 de ore dup vindecare.
Produsele crude contaminate cu Salmonella (carnea) contamineaz i
mediul unei buctrii.
Salmonelele se pot dezvolta i pe carnea crud, pstrat la temperaturi
mai mari dect cea de refrigerare. Astfel Luby i col. 1993, au raportat o
epidemie cu S. agona i S. hadar prin consum de curcan preparat inut n
buctria unui restaurant, cltit cu ap i apoi renclzit i servit.
Uniunea European a adoptat o legislaie pentru monitorizarea regulat
a efectivelor reproductoare de psri. Cele la care se confrm prezena lui
S. enteritidis sau S. typhimurium vor f sacrifcate.
n Marea Britanie, pentru prevenirea recontaminrii furajelor
este posibil ncorporarea unor compui antimicrobieni cum ar f acizii
organici.
Pentru tratamentul salmonelozelor la animale se utilizeaz antibioticele
care reuesc s salveze viaa animalului, ns de cele mai multe ori acestea
238
rmn purttoare.
La bovine, n marea majoritate a cazurilor, infecia clinic este produs
de S. dublin i S. typhimurium, vaccinurile comerciale mpotriva acestor
serotipuri avnd o larg utilizare.
La psri, S. enteritidis poate produce manifestri clinice. Un vaccin
recent, care utilizeaz o tulpin de S. enteritidis cultivat n condiii de
depleie de fer, a redus ratele mortalitii, i contaminrii coninutului
oulor la psri infectate experimental.
Diseminarea infeciei de ctre psrile slbatice (pescrui) reprezint
un mijloc important de contaminare a mediului.
ansele de a produce animale libere de salmonele cresc prin asigurarea
unei biosecuriti corespunztoare, prin programe efciente de combatere a
roztoarelor, igien i dezinfecie.
Unul dintre cele mai efciente tratamente ale produsului fnit l
constituie iradierea. Dempster (1985) a demonstrat c aceasta distruge
salmonelele din carcasele de pui.
n ceea ce privete carnea roie, s-a dovedit c pulverizarea cu
ap ferbinte (80C) sau acid lactic pot f utilizate cu bune rezultate n
decontaminarea carcaselor.
Pe lng msurile de igien aplicate n ferme, reducerea timpului
de transport i limitarea timpului de ateptare naintea sacrifcrii, reduc
substanial riscul contaminrii cu Salmonella.
Trebuiesc instituite programe educaionale care s accentueze
importana splrii minilor, a depozitrii i refrigerrii adecvate a
alimentelor, a igienei buctriilor i a prevenirii contaminrii ncruciate.
Combaterea epidemiilor se bazeaz pe urmtoarele aspecte:
spitalizarea i tratamentul pacienilor; V
identifcarea i supravegherea contacilor i a altor persoane V
expuse aceleai surse;
blocarea transmiterilor ulterioare; V
depistarea i eliminarea cauzei epidemiei. V
Infecia cu Salmonella are cel mai frecvent ca rezultat o afeciune de
tip gastroenterit, cu diaree i, uneori, un numr de alte simptome.
ntr-o epidemie din Canada asociat cu brnza Cheddar, doza infectant
de S. typhimurium la aduli anterior sntoi a fost calculat ca find mai
mic de 10 celule.
Rata medie a atacului n epidemiile de salmoneloz n care vehiculul
era carnea de pasre a fost estimat la 20%.
239
Simptom Procent de cazuri*
Diaree 87
Durere abdominal 84
Stare febril 75
Grea 65
Mialgii 64
Vrsturi 24
Cefalee 21
Scaune sangvinolente 6
* Date dintr-o epidemie cu S. enteritidis cu transmitere prin ou.
Cercetri mai recente, care au analizat 47 de epidemii din Statele
Unite, cu diferii vectori i produse de S. enteritidis, S. thompson sau S.
typhimurium au calculat o rat medie a atacului de 56%, cu limite ntre
3-100% din persoanele expuse.
Perioada de incubaie este de obicei n limita a 12-72 ore, dar ocazional
se poate prelungi pn la o sptmn.
Persoanele foarte tinere, vrstnicii, cei cu imunosupresie i cu boli
cronice subiacente sunt mai susceptibile la infecie i au o predispoziie
particular pentru dezvoltarea complicaiilor.
Pentru majoritatea serotipurilor, incluznd S. enteritidis i S.
typhimurium, cele mai frecvente la om, numai o mic proporie din pacieni
(1-2%), n special cei cu susceptibilitate nalt i cei infectai cu tulpini
invazive, pot dezvolta bacteriemie cu febr i alte manifestri de septicemie
cu germeni Gram negativi.
Pentru anumite serotipuri mai puin frecvente, cum ar f S. dublin
i S. choleraesuis i, de asemenea, pentru anumite tulpini de S. virchow,
incidena infeciilor extraintestinale este mai mare.
Complicaiile infeciei diseminate pot include abcese metastatice n
diferite organe, cum ar f: oasele, n special vertebrele, peretele aortic i
rinichii.
Se consider c infeciile asimptomatice sunt frecvente, dei proporia
pacienilor fr manifestri clinice este necunoscut. n investigarea
epidemiilor nu este neobinuit ca pn la 50% din contacii cazurilor s
excrete microorganismul, rmnnd totui asimptomatici.
Evoluia clinic a majoritii infeciilor cu Salmonella este spre
remisiunea complet a tuturor simptomelor.
240
Aproximativ jumtate din pacienii cu infecii necomplicate vor
continua s excrete microorganismul n fecale, timp de 5 sptmni dup
vindecare, 17%, 9 sptmni i mai puin de 1% dup un an.
Aceast stare prelungit de purttor este mic printre infeciile
alimentare find cauza investigaiilor multiple i a excluderii victimelor de
la diferite activiti ce implic manipularea alimentelor.
Forma septicemic a bolii va necesita tratament antibiotic. Dei,
majoritatea tulpinilor sunt sensibile la o mare varietate de antibiotice,
ciprofoxacinul, o chinolon reprezint actualmente tratamentul de elecie,
dac exist indicaii dat find c este efcient att n combaterea bolii, ct i
n reducerea duratei portajului consecutiv.
Studii recente din Marea Britanie au demonstrat c, ncepnd cu 1990,
incidena rezistenei multiple a S. typhimurium i incidena rezistenei la
ciprofoxacin a S. hador i S. virchow a crescut.
8.15. Epidemiologie
Raportrile naionale continu s semnaleze Salmonella ca cel mai
important agent etiologic al toxiinfeciilor alimentare.
Salmoneloza uman continu s fe o problem internaional major,
att ca morbiditate ct i din punct de vedere economic.
n multe ri numrul de cazuri raportate de salmoneloz non-tifoidic
a crescut substanial n decursul ultimilor 10 ani. Acestea sunt asociate
n mare parte cu S. enteritidis, tipul fagic (TF)4, predominnd n Europa
occidental, (TF)1 Europa de Est i (TF)8 i 13 n Statele Unite.
n 2006 statele membre ale Uniunii Europene alturi de Islanda i
Norvegia (cu excepia Liechtensteinului care nu a raportat) au avut 171.791
alerte de toxiinfecii salmonelice din care 168.639 au fost confrmate,
aceasta a fcut ca rata medie a notifcrilor s fe 34 la 100.000 locuitori.
(tabelul 8.8).
Tabelul 8.8.
Numrul i rata notifcrilor cazurilor de salmoneloz uman n UE i EEA/EFTA,
n 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Austria C 4787 4787 57,9
Belgia C 3630 3630 34,5
Bulgaria A 1056 1056 13,7
Cipru C 99 99 12,9
241
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Republica Ceh C 25102 24186 235,9
Danemarca C 1662 1662 30,6
Estonia C 453 453 33,7
Finlanda C 2576 2576 49,0
Frana C 6008 6008 9,5
Germania C 52575 52575 63,8
Grecia C 985 890 8,0
Ungaria C 9752 9389 93,2
Irlanda C 422 420 10,0
Italia C 6272 6272 10,7
Latvia C 866 781 34,0
Lituania A 3557 3467 101,9
Luxembourg C 308 308 65,7
Malta C 63 63 15,6
Olanda C 1667 1667 10,2
Polonia A 13362 12502 32,8
Portugalia C 415 387 3,7
Romnia A 645 645 3,0
Slovacia C 8784 8191 152,0
Slovenia C 1519 1399 69,8
Spania C 5117 5117 11,7
Suedia C 4056 4056 44,8
Marea Britanie C 14124 14124 23,4
Total UE 169862 166710 33,8
Islanda C 116 116 38,7
Liechtenstein N - - -
Norvegia C 1813 1813 39,1
Total 171791 168639 33,9
Sursa: raportri naionale
A = raportare de date agregate; C = raportare de cazuri; N = nici o
raportare; N = nespecifcat.
n nou din statele care raporteaz date la ECDC (Austria, Republica
Ceh, Finlanda, Germania, Ungaria, Lituania, Luxemburg, Slovacia i
Slovenia) rata notifcrilor este mult peste media european. Numai patru
state au raportat puin peste 10 cazuri la 100.000 de locuitori (Frana,
Grecia, Portugalia i Romnia). n 28 de statele analizate numrul cazurilor
de salmoneloz uman s-a redus cu 8% ntre 2005 i 2006. Douzeci i
dou de state au furnizat informaii referitoare la posibila origine a infeciei
242
(domestic sau de import) i proporia total a cazurilor importate a fost de
10,5% din totalul cazurilor informate. Proporia cazurilor raportate ca infecii
transfrontaliere (de import) a fost de peste 70% n patru state (Finlanda,
Islanda, Norvegia i Suedia), 25% n Regatul Unit i sub 15% n celelalte
state. Malta, Portugalia i Spania susin c toate cazurile de salmoneloza cu
care s-au confruntat, n aceeai perioad luat n studiu, cel mai probabil au
avut origine domestic.
8.15.1. Distribuia cazurilor de salmoneloz uman
pe grupe de vrst i sex
n toate statele ce raporteaz date la ECDC rata notifcrilor a fost
foarte mare la grupa de vrst 0-4 ani, cu o valoare medie de 180,5 cazuri la
100.000 locuitori. Valori peste aceast medie au fost semnalate n 9 ri, cu
un maxim de 1.636,5 cazuri la 100.000 locuitori n republica Ceh. Aceast
rat tinde s scad pe msur ce vrsta crete spre 25 ani. Rata rmne sub
25 cazuri la 100.000 locuitori n restul grupelor de vrst (25-44 ani, 45-64
ani i 65 de ani i peste).
Figura 8.1.
Distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de salmoneloz uman n EU i
EEA/EFTA n 2006 (n=142325 cazuri)
Nu au fost observate diferene, n funcie de sex, ale ratei medii (35,1
brbai i 35,4 femei - cazuri la 100.000 locuitori) la cele 146.526 cazuri la
care aceste informaii au fost disponibile.
243
Sezonalitatea.
Luna cu cele mai multe cazuri de salmoneloz uman raportate a fost
septembrie. Cnd s-au analizat sezonier cazurile de salmoneloz, fr a se
lua n calcul Germania, luna cu cele mai multe cazuri a fost august. Totui,
este evident c un numr semnifcativ mai mare de salmoneloz uman este
semnalat spre fnalul verii.
Figura 8.2.
Distribuia sezonier a cazurilor de listerioz uman n EU i EEA/EFTA n
2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
8.15.2. Supravegherea salmonelozelor
Din datele supravegherii salmonelozelor umane n Europa a reieit
c cele mai comune serovaruri salmonelice sunt S. Enteritidis i S.
Typhimurium, acestea find izolate n 75% din cazurile raportate n 2006
i n 82% din cazurile raportate n 2006. O serie de rapoarte au scos n
eviden o variabilitate sezonier, serovarul S. Enteritidis find mult mai
frecvent semnalat n perioada de var/toamn.
Tabelul 8.9
Primele 5 serovaruri Salmonella raportate n 2006
Serovar Nr. cazuri %
Enteritidis 90362 62,5
Typhimurium 18685 12,9
Infantis 1246 0,9
Virchow 1056 0,7
Newport 730 0,5
Hadar 713 0,5
Sursa: TESSy.
244
Salmonelozele continu s aib n statele europene o rat extrem de
ridicat a notifcrilor (34 cazuri la 100.000 locuitori). Diferenele ntre ri
sunt n unele cazuri semnifcative i demonstreaz nc odat difcultatea
comparrii datelor. Salmonella spp. continu s fe cauza a numeroase
focare la nivel multinaional, naional i subnaional. Unele state europene
au mai multe cazuri de salmoneloz importate dect domestice. Alte state
pot ntmpina difculti n colectarea sistematic a datelor pentru a stabilii
dac sunt sau nu de import.
8.16. Rezervoare i ci de infecie
Sursele primare majore de infecie rmn n continuare animalele, ele
contribuind decisiv la contaminarea alimentelor.
Caracteristic pentru toxiinfeciile alimentare produse de Salmonella
este faptul c, n orice epidemie, cazurile primare apar prin consumul
alimentelor contaminate, iar cazurile ulterioare i secundare se pot produce
prin contactul cu cazurile primare.
Epidemiile transmise prin alimente tind s fe de tipul surs
punctiform, majoritatea cazurilor primare aprnd ntr-o perioad de 12-
72 de ore de la consumul alimentului contaminat.
Mai puin frecvente sunt epidemiile de tipul surs comun continu
sau larg rspndit, n care un aliment sau medicament contaminat este
distribuit pe scar larg i cazurile sunt corelate prin prezena aceleai
salmonele, dar nu n spaiu i timp. Recent, n epidemiile de acest tip,
vehiculul a fost reprezentat de salamuri i pstile de fasole n Marea
Britanie i de ou i carnea de pui insufcient preparate n alte ri.
Epidemiile cu transmitere interuman sunt ntlnite cel mai adesea
n instituiile n care pot exista difculti n meninerea igienei, cum ar f
spitalele psihogeriatrice.
Transmiterea salmonelelor se realizeaz fe prin ingestia acestora din
ap sau alimente crude, insufcient preparate sau contaminate ulterior, fe
prin transmiterea interuman pe cale fecal-oral: prin contactul direct cu
excreiile infectate sau indirect, prin manipularea obiectelor, ca aternuturile,
jucriile i mbrcmintea contaminate cu excreii.
Cele trei surse principale de salmonele implicate n infectarea
produselor de origine animal sunt:
efectivul matc infectat o ;
alimentele contaminate o ;
mediul o .
245
Importana fecrei ci de infecie este dependent parial de serotipul
de Salmonella i animalul implicat.
n cazul anumitor salmonele, de obicei, cele cu adaptare total sau
parial la gazd, transmiterea vertical de la efectivul matc infectat find
principala cale de infectare. Exemplele n acest sens sunt reprezentate de S.
dublin la bovine i S. enteritidis PT4 la pui, mai ales n producia de pui de
carne.
Prezena salmonelelor n furaje are adesea ca rezultat infectarea/
colonizarea animalelor i a produselor acestora. Acest fapt pare s aib
o importan deosebit n cazul psrilor. Prelucrarea tehnic folosit n
producia furajelor trebuie s fe sufcient pentru a distruge salmonelele.
Utilizarea excreiilor animale pe terenurile fermelor prezint riscuri
poteniale pentru sntatea animalelor domestice i a oamenilor. Salmonelele
sunt capabile de supravieuire prelungit n materiile fecale, ml sau pe
puni.
De asemenea, pot exista difculti n igienizarea i dezinfectarea
cldirilor fermelor, salmonelele find izolate din 8% din eantioanele
recoltate din unitile de cretere a vieilor, dup curenie i dezinfectare.
De asemenea, n multe studii, o varietate de salmonele a fost izolat din
cursurile de ap i de la animalele slbatice din jurul fermelor. Se consider
c n special pescruii au o importan n diseminarea salmonelelor.
oarecii pot avea importan n diseminarea S. enteritidis la ginile
outoare, iar infecia experimental a oarecilor slbatici cu o tulpin de S.
enteritidis PT4, a dus la excreia bacteriei timp de 6 luni.
8.17. Contaminarea alimentelor
Contaminarea crnii
Carnea crud (tranat sau procesat) trebuie privit ca potenial
contaminat Salmonella spp.
Crnaii, carnea tocat i organele procurate din comer cu amnuntul,
pot avea rate nalte de contaminare.
Salmonelele pot contamina carnea carcaselor pe o varietate de ci, dar
contaminarea fecal este cea mai important.
Extinderea contaminrii este dependent de gradul portajului de
animalul viu i de igiena procesului de sacrifcare.
Prevalena animalelor pozitive pentru Salmonella va crete, ca rezultat
al aglomerrii n piee, iar stresul transportului animalelor poate duce la
recrudescena infeciilor latente. De asemenea, salmonelele se pot rspndi
246
rapid n timpul transportului sau n abator, nainte de sacrifcare. Grau
i Smith (1974) au demonstrat c prevalena carcaselor de miei pozitive
pentru Salmonella era corelat cu timpul de ateptare al animalelor nainte
de sacrifcare.
La animalele cu carnea roie, contaminarea este mai probabil n
momentul ndeprtrii intestinelor i a pielii.
La psri contaminarea carcaselor o depete adesea pe cea a psrilor
vii.
Acesta este rezultatul contaminrii ncruciate, care se poate produce
n cursul transportului i n multe puncte pe linia de sacrifcare, dar oprirea
nainte de jumulirea mecanic are o importan particular.
Un studiu controlat din Marea Britanie, a demonstrat c infecia cu
PT4 era asociat cu consumul de pui fript, pregtit pentru distribuia la
domiciliul clientului. Fie bacteria era prezent n esuturi, fe ca rezultat
al bolii invazive, fe n urma ptrunderii apei contaminate din bazinul de
oprire.
Contaminarea oulor
Se crede c infecia ginilor outoare cu S. enteritidis i implicit
contaminarea oulor au avut importan n creterea incidenei salmonelozei
umane, observat n multe ri la mijlocul i sfritul anilor 1980.
Salmonelele pot f izolate din coaja sau coninutul oului. Prezena lor
pe coaj, este de obicei rezultatul portajului fecal, dei, mai ales n cazul
lui S. enteritidis, infecia tractului genital inferior, poate f de asemenea
important.
Anchetele din SUA i Marea Britanie, au demonstrat c prevalena
oulor cu coninut pozitiv la vnzarea ctre publicul larg este redus (<
0,1%).
Cu toate acestea, dat find numrul mare de ou consumate, chiar
aceste rate de contaminare, aparent sczute, pot f semnifcative.
Contaminarea laptelui i produselor lactate
Animalele productoare de lapte, inclusiv bovinele, pot f infectate cu
salmonele.
Gibs i colaboratorii (1989) au descoperit c S. typhimurium DT49 a
persistat ntr-un efectiv de vaci de lapte timp de 3 ani.
Principalul vehicul n salmoneloza uman, asociat cu consumul de
lapte este laptele nepasteurizat, find raportate numeroase epidemii.
247
Toate salmonelele examinate pn n prezent sunt sufcient de sensibile
la cldur pentru a f distruse prin pasteurizare. De obicei, epidemiile apar
ca rezultat al recontaminrii produsului tratat termic cu lapte crud.
Salmonelele pot supravieui n anumite brnzeturi, aceste produse
find implicate n mai multe epidemii.
n Canada, 1500 de persoane au fost infectate dup ce au consumat
brnz Cheddar contaminat.
Recent, n Marea Britanie, o epidemie de infecie cu S. dublin a fost
asociat cu brnza topit din lapte de vac, nepasteurizat. Similar, n Frana,
n 1993, o epidemie S. enterica, serotipul paratyphi B, cu peste 273 de cazuri
identifcate a fost produs de brnza de capr contaminat (E. J. Threlfall,
2005).
Contaminarea n timpul manipulrii alimentelor
Persoanele care manipuleaz alimente i excret salmonele sunt
adesea acuzate de a f sursa epidemiei. Salmonelele sunt rapid ndeprtate
prin splarea minilor.
Persoanele care manipuleaz alimente i prezint diaree, constituie
un risc semnifcativ i trebuie excluse de la lucru, timp de 48 de ore, dup
vindecare.
S-a dovedit c produsele crude contaminate cu Salmonella, n principal
carnea, contamineaz extensiv mediul din buctrii.
Multe epidemii de salmoneloz au fost determinate de o practic ne-
corespunztoare n buctrii i, Roberts (1986), a estimat c n aproximativ
14% din cazuri, contaminarea ncruciat a avut o contribuie semnifcati-
v.
De asemenea, salmonelele sunt capabile de cretere pe o varietate de
alimente preparate sau crude, iar depozitarea la temperaturi mai mari dect
cele de refrigerare s-au dovedit a f un factor important n multe epidemii.
De exemplu, Luby i colaboratorii (1993) au raportat o epidemie extins,
n care consumatorii au fost infectai cu S. agona sau S. hadar, deoarece
curcanul preparat fusese pstrat nerefrigerat n buctria unui mic restaurant
timp de mai multe ore, cltit cu ap pentru ndeprtarea mirosului neplcut
i incomplet nclzit nainte de a f servit.
8.18. Msuri de prevenire i combatere a salmonelozelor
Pentru reducerea sau eliminarea riscului de toxiinfecii alimentare
cu Salmonella este posibil intervenia n mai multe puncte ale lanului
248
alimentar. Fezabilitatea interveniei i efciena sa economic pot depinde
de serotipul de Salmonella implicat i de gradul su de diseminare. Astfel,
n Marea Britanie, infecia cu S. typhimurium DT 124, n urma contaminrii
salamului a fost prevenit prin retragerea temporar de pe pia a produsului
i ameliorarea igienei produciei.
Salmoneloza transmis prin lapte, poate f prevenit prin simpla
pasteurizare corespunztoare a laptelui i produselor lactate.
Cnd infecia este larg rspndit, cum a fost cazul pandemiei
multinaionale produs de S. enteritidis, combaterea se realizeaz mai
difcil, n special dac vehiculele infeciei sunt alimente, cum ar f oule sau
puii, care sunt consumate n cantiti mari.
Ca o consecin a problemelor economice, se exploreaz strategii
alternative. Excluderea competitiv, n care culturi de microorganisme
intestinale, de la gini mature neinfectate sunt administrate puilor n vrst
de o zi, a limitat infecia cu Salmonella find utilizat din ce n ce mai
mult.
Pentru prevenirea contaminrii furajelor animalelor, se poate recurge
la ncorporarea unor compui antimicrobieni, cum ar f acizii organici.
Humphrey i Lanning (1988) au artat c acest tratament aplicat
furajului pentru psri de reproducie reduce transmiterea vertical a
salmonelelor. De asemenea, s-a dovedit c tratamentul acid al hranei
limiteaz diseminarea orizontal a S. enteritidis PT4 la unele efective de
psri de carne.
Programele de combatere a roztoarelor trebuie privite, de asemenea,
ca o important msur de proflaxie, mai ales n industria avicol.
Bovinele reprezint principala specie domestic la care salmoneloza
produce frecvent manifestri clinice, majoritatea find cauzate de infecia cu
S. dublin i S. typhimurium. Salmoneloza clinic este foarte rar la porcine.
La psri, spre deosebire de alte serotipuri de Salmonella, S. enteritidis
poate determina manifestri clinice, n special la rasele de carne.
n cadrul programelor de combatere, n cazul animalelor fr manifestri
clinice, este necesar identifcarea celor pozitive pentru Salmonella.
Tehnicile de examinare trebuie s fe sensibile i ct mai rapide. O abordare
efcient const n efectuarea unui screening ambiental sau serologic, cu
confrmarea rezultatelor pozitive pentru examinarea mai atent a psrilor.
Pandemia internaional actual de infecie cu S. enteritidis a dus la
monitorizarea pe scar larg a efectivelor de psri. Msurarea nivelului
anticorpilor vitelini mpotriva S. enteritidis, este efcace n detectarea
efectivelor reproductoare sau outoare pozitive i reprezint o tehnic
ieftin i neinvaziv, demn de utilizare pe scar larg.
249
Diseminarea infeciei de ctre psrile slbatice (n special pescrui)
de pe lng gropile de gunoi reprezint de asemenea un mijloc semnifcativ
de contaminare a mediului.
Unul dintre cele mai efciente tratamente ale produsului fnit este
iradierea. Dempster (1985) a demonstrat c acest procedeu poate distruge
salmonelele din carcasele de pui.
n ceea ce privete carnea roie, s-a dovedit c pulverizarea cu ap
ferbinte (80C) sau acid lactic poate f utilizat pentru decontaminarea
carcaselor.
Prevalena animalelor pozitive pentru Salmonella, care ajung la
abatoare, poate f diminuat prin reducerea timpului de transport i limitarea
timpului de ateptare naintea sacrifcrii.
Alte msuri, cum ar f ligaturarea anusului, pentru a mpiedica
contaminarea carcaselor cu fecale, vor reduce de asemenea riscul la infeciile
salmonelice.
Marea majoritate a salmonelelor nu se poate dezvolta pe alimentele
pstrate la temperaturi sub 7C i cresc lent la temperaturi sub 10C. Astfel,
refrigerarea va prelungi durata de pstrare a alimentelor i va mpiedica
multiplicarea salmonelelor.
Recent, n Europa, s-a discutat mult despre refrigerarea oulor, ca
mijloc de limitare a riscului de infecie cu S. enteritidis.
Succesul combaterii salmonelozei necesit intervenii la toate punctele
lanului alimentar. Pentru limitarea riscului, consumatorii i furnizorii pot
face multe privind igiena buctriilor i prepararea adecvat a alimentelor
cu risc.
n perioada 2008-2009 n Facultatea de Medicin Veterinar, Bucureti
i INCDMI Cantacuzino s-a efectuat un studiu pe 184 de probe, reprezentate
de carne i derivate, lapte i derivate, ou i produse din ou.
Tulpinile izolate au fost testate biochimic i serologic pentru
confrmarea n cadrul Institutului de Diagnostic i Sntate Animal, n
direcia determinrii bacteriilor din genul Salmonella la produsele alimentare
de origine animal i testelor de sanitaie.
Analizele efectuate pe sortimente de produse i rezultatele lor sunt
cuprinse n tabelul de mai jos:
Anul
Sortiment
2008 2009
Probe
analizate
Probe
pozitive
Probe
analizate
Probe
pozitive
Afumturi 10 2 8 3
Brnz 8 3 4 2
Carne de pasre 10 2 5 3
Carne de porc 9 4 4 3
250
Anul
Sortiment
2008 2009
Probe
analizate
Probe
pozitive
Probe
analizate
Probe
pozitive
Carne de vit 7 0 10 2
Hamburger 8 2 11 2
ngheat 5 1 5 1
Lapte i derivate 6 2 5 0
Lapte praf 6 2 9 0
Ou 10 4 10 2
Produse de patiserie 8 0 8 1
Salate cu compoziie proteic 7 2 11 3
Total 94 24 90 22
Prelucrnd probele i rezultatele analizelor din tabelul de mai sus,
rezult urmtorul procentaj:
Felul probelor analizate
Numrul
total de
probe
Dintre care
Negative % Pozitive %
Afumturi 18 13 72,22 5 27,77
Brnz 12 7 58,33 5 41,66
Carne de pasre i derivate 15 10 66,66 5 33,33
Carne de porc i derivate 13 6 46,15 7 53,84
Carne de vit i derivate 17 15 88,23 2 11,76
Hamburger 19 15 78,94 4 21,05
ngheat 10 8 80,00 2 20,00
Lapte i derivate 11 9 81,81 2 18,18
Lapte praf 15 13 86,66 2 13,33
Ou i produse din ou 20 14 70,00 6 30,00
Produse de patiserie 16 15 93,75 1 6,25
Salate cu compoziie proteic 18 7 38,88 5 27,77
Incidena tulpinilor de Salmonella n cele 184 de probe de produse de
origine animal prelucrate dup metoda IDSA, este prezentat n urmtorul
tabel:
Locul dup frecven Serovar Numrul de tulpini tipizate Procent
1 S. Enteritidis 27 58,69
2 S. Typhimurium 11 23,91
3 S. Thompson 3 6,52
4 S. Anatum 2 4,34
5 S. Agona 1 2,17
251
6 S. Dublin 1 2,17
7 S. London 1 2,17
Total - 46 -
Ansamblul investigaiilor ntreprinse permit formularea urmtoarelor
concluzii:
n urma examenelor bacteriologice pentru izolarea germenilor din 1.
genul Salmonella din produse alimentare de origine animal s-a observat c
procentul probelor pozitive nu depete 53,84% (n cazul crnii de porc).
n cazul probelor efectuate din afumturi, procentul probelor 2.
pozitive a fost de 27,77%; din brnz 41,66%, din carne de pasre i derivate
33,33%; din carne de porc i derivate 53,84%; din carne de vit i derivate
11,76%; hamburger 21,05%; ngheat 20%; lapte i derivate 18,18%; lapte
praf 13,33%, ou i produse din ou 30,00%; produse de patiserie 6,25%;
salate cu compoziie proteic 27,77%
Serovarurile de salmonele izolate n cadrul Institutului de Igien 3.
i Sntate Public Veterinar, Bucureti, au fost n ordinea incidenei
urmtoarele: S. Enteritidis 58,69%, S. Typhimurium 23,91%; S. Thompson
6,25%, S. Anatum 4,34%; S. Agona 2,17%; S. Dublin 2,17%; S. London
2,17%.
Cea mai nalt rat de contaminare cu salmonele are loc n abatoare, 4.
n cadrul diferitelor operaiuni, ncepnd de la sacrifcare i pn la tranare
i ambalare.
n cadrul unor toxiinfecii alimentare, factorul uman a avut o 5.
importan sufcient de mare n producerea acestora.
n cadrul produselor de patiserie, tratate bine termic incidena 6.
contaminrii acestora cu salmonele a fost sczut. Incidena n cazul
produselor de patiserie a fost mai mic (6,25%) dect n cazul celorlalte
produse. Acest procent se datoreaz contaminrii ulterioare a produselor de
la purttorii umani sau fabricarea produselor n condiii neigenice.
Dintre toate mediile solide de izolare selectiv folosite, agarul cu 7.
rou fenol i verde briliant s-a dovedit a f cel mai efcient.
Acest mediu prezint avantajul c detectarea coloniilor dup aspectul
lor nu se bazeaz pe elaborarea hidrogenului sulfurat, ceea ce permite
detectarea i a serotipurilor de salmonele H
2
S negative.
Nu au fost izolate bacterii din genul 8. Salmonella, n cazul
produselor alimentare de origine animal, tratate termic, provenite din
uniti mari de producie, unde sunt implementate reguli stricte de igien.
Defcienele igienice de prelucrare a crnii crude de pasre, 9.
252
pornind de la abator, au creat posibiliti de contaminare a carcaselor
obinute n urma sacrifcrii psrilor.
Modul de furajare, densitatea mare din fermele de psri, aternutul,
ventilaia, adpostul, au reprezentat factori ce au generat mbolnvirea
psrilor.
8.19. Diagnosticul de laborator al toxiinfeciilor alimentare
produse de salmonele
Toxiinfeciile alimentare fac parte din grupul mare al bolilor
transmise prin alimente. n acest cadru se individualizeaz urmtoarele
particulariti:
Afecteaz dou sau mai multe persoane, care au servit cel puin o
mas n comun cu circa 72 de ore, naintea debutului bolii.
Alimentul declanator poate f suspectat dup calculul ratei de atac
epidemiologic prin alimentele consumate n perioada posibil de incubaie.
Debuteaz acut pe fondul unei snti depline.
Se manifest prin cteva sindroame clinice defnite: digestive sau
nervoase (survenite dup un debut digestiv).
Evolueaz acut n cteva ore sau zile spre vindecare sau, ocazional,
moarte.
Nu genereaz cazuri secundare de boal.
Cheia diagnosticului etiologic o constituie perioada de incubaie i
simptomatologia care debuteaz brusc i cu caracter epidemic.
Recoltarea probelor
Reprezint o aciune complex, care impune examinarea a numeroase
prelevate:
probe de la bolnavi (fecale, vom, ser sangvin), eventual de la
cadavre (coninut intestinal, snge);
probe de la martori (membrii ai colectivitii, care au servit masa n
comun, dar nu s-au mbolnvit);
probe de alimente, eventual i semipreparate sau ingrediente;
probe de la personalul implicat n manipularea alimentelor;
probe de mediu (aerul i suprafeele de prelucrare a alimentelor,
recipiente din buctrii, laboratoare culinare, de patiserie etc.).
253
Metoda de lucru
Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se
face conform metodelor stabilite de standarde, din care menionm pe cea
descris n ISO 6579/1995.
1. Prembogire neselectiv: se cntresc 25 grame de produs
alimentar n 225 ml ap peptonat tamponat;
2. Se incubeaz la 35C, 24 de ore;
3. mbogire selectiv: a) se transfer 0,1 ml cultur obinut n faza
de prembogire ntr-o eprubet care conine 10 ml de bulion tetrationat
(M72);
b) se transfer 1 ml cultur din mediul de prembogire selectiv
ntr-o eprubet cu 10 ml de bulion selenit cistin (SC).
Numai n cazul amestecului de probe incubate care conin molute, se
transfer 0,1 ml la 10 ml de mediu Rappaport-Vassiliadis (RV) (M59) i un
alt mililitru la 10 ml de bulion TT.
4. Se incubeaz bulioanele la 35C, 24 de ore.
5. Izolarea pe medii selective agarizate:
a) Se striaz cu ajutorul unei anse pe suprafaa unei plci Petri mari
(140 mm), care conine primul mediu selectiv de izolare n trei plci cu agar
BS (agar cu sulft de bismut HE (agar Hekten enteric) (M43) i XLD (agar
cu xiloz-lizin-dezoxicolat) (M69). Plcile cu sulft de bismut se prepar cu
o zi nainte i se pstreaz pn la nsmnare la ntuneric i la temperatura
camerei. Se repet nsmnarea cu 3 ml de bulion din cultura obinut n
mediul Rappaport-Vasiliadis pe agar cu rou fenol i verde briliant Edel i
Kampelmaker, pentru probele de molute.
b) Se procedeaz la fel i cu cel de-al doilea mediu de izolare selectiv
SC (bulion selenit cistin) n vederea obinerii de colonii izolate.
Mediul BS este nalt selectiv, iar HE i XLD sunt moderat selective.
6. Se incubeaz plcile la 35C, 24-48 ore.
7. Se examineaz plcile pentru prezena unor colonii suspecte de a
face parte din genul Salmonella.
a) Agar Hekten enteric (HE) (M43) coloniile tipice sunt albastre
verzui sau bleu, cu sau fr centru negru; multe culturi de Salmonella
pot produce colonii cu centre mari, negre, lucioase sau pot s apar sub
forma unor colonii aproape complet negre; n mod atipic, cteva specii de
Salmonella produc colonii galbene, cu sau fr centre negre.
b) Agar cu sulft de bismut (BS) (M23) coloniile tipice de Salmonella
pot f maro, gri sau negre; uneori prezint luciu metalic; mediul din jurul
coloniilor este, de obicei, la nceput cafeniu, dar poate deveni negru, o dat
254
cu prelungirea incubaiei, producnd aa numitul efect de halou. Unele
tulpini pot produce colonii verzi, mediul nconjurtor find slab negricios.
c) Agar cu xiloz-lizin-dezoxicolat (XLD) (M69) coloniile tipice
sunt roz, cu sau fr centre negre; multe culturi de Salmonella pot avea
centre mari, negre, lucioase sau colonii aproape complet negre; atipic,
cteva specii de Salmonella pot produce colonii galbene, cu sau fr centre
negre.
8. Confrmare:
Selectarea coloniilor: se recolteaz din fecare plac cu mediu selectiv
de izolare 5 colonii caracteristice i se nsmneaz pe agar TSI (M73) i
agar LI (lizin fer) (M74); se incubeaz mediile la 35C, 24 de ore, n cazul
agarului TSI i 48 de ore la 35C (LI agar).
Agar TSI:
Se nsmneaz suprafaa nclinat a agarului prin striere i poriunea
dreapt (baza) prin nepare; se incubeaz; se interpreteaz:
a) Masa mediului (poriunea dreapt):
galben = denot fermentarea glucozei (G+);
roie = nu are loc fermentarea glucozei (G-);
neagr = la limita ntre poriunea dreapt i cea nclinat (formare
de hidrogen sulfurat);
bule sau fsuri = formare de gaz din glucoz
b) Suprafaa nclinat (panta):
galben = fermenteaz lactoza i zaharoza;
roie = lactoz i zaharoz negative;
Culturile tipice de Salmonella fermenteaz glucoza i nu fermenteaz
lactoza i zaharoza:
panta (poriunea nclinat) de culoare roie (alcalin);
baza (poriunea dreapt) galben (acid);
cu formare de bule de gaz (spargerea mediului);
formare de hidrogen sulfurat nnegrire (90% din cazuri).
n agarul LI, Salmonella produce o reacie alcalin, coloraie purpurie
(violet) n poriunea dreapt a mediului. Se consider reacie negativ
(acid) numai culoarea galben distinct n poriunea dreapt a mediului.
Majoritatea salmonelelor produc H
2
S n agar LI.
Alte teste biochimice:
1. Testul ureazei: Se inoculeaz cteva colonii prezumptiv pozitive de
pe fecare pant de agar n tuburi cu bulion cu uree (M75). Se incubeaz 24
de ore la 35C.
Reacie pozitiv: n urma nsmnrii unei bacterii care hidrolizeaz
255
ureea mediul iniial galben se coloreaz n rou, datorit virrii roului fenol
n prezena amoniacului, metabolit rezultat din descompunerea ureei.
2. Mediul cu cianur de potasiu (KCN) (M58): Dac are loc creterea
bacteriilor (indicat prin turbiditate) reacia este pozitiv. Majoritatea
speciilor de Salmonella sunt negative la acest test.
3. Bulion cu malonat: Se inoculeaz 3 mililitri de cultur bacterian
de 24 de ore prezumptiv pozitiv n bulion malonat (M76). Se incubeaz 48
de ore la 35C, dar se examineaz i dup 24 de ore. Dac testul este pozitiv
mediul devine albastru, iar dac este negativ culoarea bulionului va rmne
nemodifcat.
4. Testul indolului reacie negativ-inel galben.
5. Reacia Voges-Proskauer (M68) reacia pozitiv este indicat de
apariia unei culori roz, pn la rou n toat coloana mediului. Salmonelele
dau reacii negative la acest test.
6. Testul roului metil majoritatea salmonelelor dau test pozitiv,
indicat de culoarea roie, difuz a mediului.
Se consider ca nefind Salmonella culturile care dau rezultate pozitive
la KCN i VP i rezultate negative la testul roului metil.
7. Agar cu citrat Simmons (M64): Test pozitiv: prezena creterii este
nsoit de modifcarea culorii mediului din verde n albastru; majoritatea
culturilor de Salmonella sunt citrat-pozitive.
Confrmarea serologic:
Punerea n eviden a antigenelor O, H i Vi ale salmonelelor se face
prin reacia de aglutinare pe lam cu serul corespunztor al coloniilor pure,
dup eliminarea surselor autoaglutinabile.
Eliminarea surselor autoaglutinabile:
Se aplic pe o lam de sticl bine splat soluie salin n care se
disperseaz o parte din coloana ce urmeaz a f testat obinnd o suspensie
omogen i tulbure. Se oscileaz lama n plan orizontal 30-60 secunde; se
examineaz pe un fond ntunecat; dac bacteriile aglutineaz (se adun
n grmezi) nseamn c sursa este autoaglutinabil i nu se mai supune
ncercrilor ulterioare.
Punerea n eviden a antigenelor O:
Se folosete o colonie pur neautoaglutinabil i se procedeaz ca mai
sus, numai c soluia salin se nlocuiete cu o pictur de antiser O.
Test pozitiv: aglutinare n amestecul testat; absena aglutinrii n
martorul salin.
Reacia negativ nu exclude prezena unei specii a acestui gen,
deoarece Ag O poate f mascat de Ag Vi de la suprafaa bacteriei (antigen
256
de nveli), n aceast situaie find necesar aglutinarea rapid cu ser anti
Vi. Aceast reacie se efectueaz n prezena unor martori constituii din
suspensiile de antigen, la care se adaug ser fziologic, ser normal i ser
cunoscut pozitiv.
Aglutinarea cu seruri de grup O se folosete pentru stabilirea grupei
serologice din care face parte tulpina supus analizei.
Sistemele microtest
Micrometodele (microtestele) reduc volumul substratului enzimatic i
permit deseori o citire rapid ntre 4 i 6 ore pn la 18 ore de incubare.
Dup izolarea pe medii selective coloniile suspecte se pot identifca
biochimic prin intermediul sistemelor microtest, folosind scheme, tabele
sau sisteme codifcate de ncadrare.
Sistemele microtest sunt cunoscute sub diverse denumiri comerciale.
Pentru identifcarea salmonelelor din alimente se va folosi oricare din cele 4
sisteme biochimice comerciale (API 20E, Enterotub II, Enterobacteriaceae
II, MICRO-ID).
Pentru confrmare se recurge apoi la testul serologic somatic (O) i
testul fagelar (H) sau testul fagelar Spicer-Edwards.
Se confrm a f Salmonella acea cultur clasifcat cu kit-urile
biochimice comerciale ca prezumptiv, cnd aceasta este pozitiv la testul
somatic (O) i testul fagelar (H).
257
IZOLAREA I IDENTIFICAREA
GENULUI SALMONELLA
1. Omologat
alimentar
2. Prembogire
Incubare la 35C,
24 de ore
3. mbogire
selectiv. Incubare
la 35C, 24 de ore
4. nsmnare n
plci Petri.
Incubare la 35C,
24-48 de ore
5. nsmnare pe
mediul TSI i LI.
Incubare la 35C,
24 de ore (agar TSI)
sau 48 de ore (agar
LI).
5. Confirmare biochimic i serologic
25 g aliment
225 ml mediu de prembogire
10 ml
bulion selenit cistin
Agar TSI
10 ml
bulion tetrationat
Pant alcalin
(roie)
Baz acid
(galben)
Baz alcalin
(purpurie)
Agar LI Cu sau fr nnegrire
(producia de H
2
S)
IZOLAREA I IDENTIFICAREA
GENULUI SALMONELLA
1. Omologat
alimentar
2. Prembogire
Incubare la 35C,
24 de ore
3. mbogire
selectiv. Incubare
la 35C, 24 de ore
4. nsmnare n
plci Petri.
Incubare la 35C,
24-48 de ore
5. nsmnare pe
mediul TSI i LI.
Incubare la 35C,
24 de ore (agar TSI)
sau 48 de ore (agar
LI).
5. Confirmare biochimic i serologic
25 g aliment
225 ml mediu de prembogire
10 ml
bulion selenit cistin
Agar TSI
10 ml
bulion tetrationat
Pant alcalin
(roie)
Baz acid
(galben)
Baz alcalin
(purpurie)
Agar LI Cu sau fr nnegrire
(producia de H
2
S)
258
Salmonella sp., imagine electrono-microscopic, salmonele izolate dintr-o
epidemie determinat de consumul de tomate
Salmonella typhimurium, scanare electrono-microscopic (3200x).
259
Salmonella typhimurium, n circulaia sanguin
Salmonella enterica serovar Typhimurium. Agar Luria (LA).
260
Salmonella typhi, Agar SS (Salmonella-Shigella). Se remarc coloniile de
salmonele transparente , cu centrul negru
Salmonella spp. Bulion SF (Selenit-F)
261
Mediul cromogen de diagnostic diferenial (Oxoid Salmonella Rapid
Culture Method, OSCM II). Se remarc coloniile de Salmonella colorate
n violet deschis.
S. typhi. Coloraia Gram.
262
S. typhi. Coloraia fagelar Leifson.
S. typhi. Coloraia fagelar Cassares-Gill
263
Salmonella sp. Cultur de 24 de ore pe agar XLD;
zonele de culoare neagr indic prezena H
2
S, n condiii alcaline
Salmonella choleraesuis subsp. arizonae. Cultivat pe agar snge
264
Salmonella typhimurium. Cultur pe agar Hektoen enteric (HE).
Formeaz colonii albastre-verzui.
Salmonella sp. Agar Salmonella-Shigella (SS)
265
S. enterica subsp. enterica mediu cromogen coloniile de Salmonella
sp. apar colorate in viiniu pe fondul galben-transparent al mediului de
cultur (nu pot identifcate pe acest mediu S. indiana si S. choleraesuis)
Salmonella sp. pe agar DC (cu citrat-deoxicolat)
266
1. Brzoi D., 1985, Infuena diferitelor valori de pH asupra dezvoltrii i
supravieuirii unor tulpini de Staphilococcus aureus, Comunicare la Sesiunea de Comunicri
tiinifce, FMV, Bucureti.
2. Brzoi D., Lidia Tulu, 1984, Efciena unor metode de lucru pentru decelarea
S. aureus din laptele praf, Rev. cret. anim., Bucureti 11, 42.
3. Brzoi D., 1985, Microbiologia produselor alimentare de origine animal., Ed.
Ceres, Bucureti, 84-93.
4. Brzoi D., Meica S., Negu M., 1999, Toxiinfeciile alimentare, Ed. Diacon
Coresi, Bucureti.
5. Brzoi D., 1993, Asigurarea calitii microbiologice a produselor alimentare
prin aplicarea unui sistem de msuri preventive, Caiet de informare i documentare tehnic,
LCCAF, Bucureti, 2, 16.
6. Brzoi D., 1990, Unele metode folosite pentru decelarea enterotoxinei
staflococice, Caiet de informare i documentare tehnic, LCCAF, Bucureti 1, 60.
7. Collinson S. K. i col., 1998, Thin, aggresive fmbriae mediate binding of
Salmonella enteritidis to fbronectin, J. Bacteriol.
8. DAoust I. Y., 1994, Salmonella and International food Trade, Int. J. Food
Microbiol.
9. De Rycke J. i col., 1990, Evidence for two types of citotoxic necrotizing factor
of Escherichia coli., J. Clin. Microbiol.
10. De Rycke J. i col., 1991, Les colibacilles producteurs de cytotoxines:
importance en, mdicine vtrinaire et en sant publique, Ann. Rech. Vt.
11. Donnenberg M. S., J. B. Keper, 1992, Enterotoxigenic Escherichia coli, Infect.
Immun.
12. Dorn C. R., E. J. Angrick, 1991, Serotype O
157
:H
7
Escherichia coli from bovine
and meat source, J. Clin. Microbiol.
13. Dorn C. R., 1995, may 5, Escherichia coli O
157
:H
7
(Review), JAVMA.
14. Farmer J. J., 1995, Enterobacteriaceae Introduction and identifcation, Manual
of clinical microbiology, Ed. VI by Muray R., ed. ASM Press Washington D.C.
15. Garcia Dee Portieeo F. Finlayb, 1994, Invasion and intracellular proliferation
of Salmonella within nonphagocytic cells, Microbioloaa SEM.
16. Garbutt J., 1997, Essentials of food microbiology RNAOLD, Londra.
17. Guard-Petter i col., 2002, Molecular pathobiology and epidemiology of egg
contaminating Salmonella enterica serovar Enteritidis In: Current topics in Food Safety in
Animal Agriculture (Eds.), ASM Press, Washington DC.
18. Hennessyw W. T., 1996 A national outbreak of Salmonella enteritidis infection
from ice-cream, New Engl. J. Med.
19. Liebana E. i col., 2002 Investigation of the genetic diversity among isolates
of Salmonella enterica serovar dublin from animals and humans from England, ara
Galilor and Ireland Journal of Applied Microbiology.
20. Old D.C. Threefale E.J., 2005, Salmonella in Topley and Wilsons Microbiology
and Microbial Infections, Systematic Bacteriology, RNAold, London.
267
21. Rankin i col., 2002 Molecular characterization of cephalosporin-resistant
Salmonella enterica serotype Newport isolates from animals in Pennsylvania, Journal of
clinical microbiology.
22. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti;
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
23. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale,
Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
24. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6;
ISBN (13) 978-973-86571-5-1
25. Simona Ivana, 2007 Manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
26. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
27. Simona Ivana, 2007 Microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed.
tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
28. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
29. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-
973-736-090-8
30. The Merk Veterinary Manual, 2007, Seventh ed.
31. Adinarayanan, N., V.D. Foltz, and F. McKinley. 1965. Incidence of Salmonellae
in prepared and packaged foods. J. Infect. Dis. 115:19-26.
32. Audisio, M.C., G. Oliver, and M.C. Apella. 2000. Protective effect of
Enterococcus faecium J96, a potential probiotic strain, on chicks infected with Salmonella
Pullorum. J. Food Protect. 63:1333-1337.
33. BRNAhart, H.M., D.W. Dreesen, R. Bastien, and O.C. Pancorbo. 1991.
Prevalence of Salmonella Enteritidis and other serovars in ovaries of layer hens at time of
slaughter. J. Food Protect. 54:488^191.
34. Bean, N.H., and P.M. Griffn. 1990. Foodborne disease outbreaks in the United
States, 1973-1987: Pathogens, vehicles, and trends. J. Food Protect. 53:804-817.
35. Beloian, A., and G.C. Schlosser. 1963. Adequacy of cooking procedures for the
destruction of salmonellae. Am. J Public Health 53:782-791.
36. Bradshaw, J.G., D.B. Shah, E. Forney, and J.M. Madden. 1990. Growth of
Salmonella Enteritidis in yolk of shell eggs from normal and seropositive hens. J. Food
Protect. 53:1033-1036.
37. Brooks, J. 1962. Alpha amylase in whole eggs and its sensitivity to
pasteurization temperatures. /. Hyg. 60:145-151.
38. Bryan. F.L. 1977. Diseases transmitted by foods contaminated by wastewater.
/. Food Protect. 40:45-56.
39. Centers for Disease Control and Prevention. 2003. Multistate outbreak of
Salmonella serotype Typhimurium infections associated with drinking unpasteurized
milkIllinois, Indiana, Ohio, and Tennessee, 2002-2003. Morb. Mort. Wkly. Rep. 52:613-
615.
40. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Multistate outbreaks of
Salmonella serotype Poona infections associated with eating cantaloupe from Mexico
268
United States and Canada, 2000-2002. Morb. Mort. Wkly. Rep. 51:1044-1047.
41. Centers for Disease Control and Prevention. 2000a. Outbreak of Salmonella
serotype Enteritidis infection associated with eating raw or undercooked shell eggs
United States, 1996-1998. Morb. Mort. Wkly. Rep. 49:73-79.
42. Centers for Disease Control and Prevention. 2000b. Outbreak of Salmonella
serotiype intentions associated with eating a nationally distributed dipCalifornia, Oregon,
and Washington, January 2000. Morb. Mori. Wtiy. Rep. 49:60-61.
43. Centers for Disease Control and Prevention. 1999. Outbreak ol Salmonella
serotype Muenehen infections associated with unpasteurized orange juiceUnited States
and Canada, June 1999. Morb. Mori. \\ kty. Rep. 48:582-585.
44. Centers for Disease Control. 1985. ShigellosisUnited States, 1984. Morb.
Mori. Wkly. Rep. 34:600.
45. Chung. K.C.. and J.M. Goepfen. 1970. Growth of Salmonella at low pH. J.
Food Sci. 35:326-328.
46. Chung. Y.H.. S.Y. Kim. and Y.H. Chang. 2003. Prevalence and actibiotic
susceptibility of Salmonella isolated from foods in Korea for 1993 to 2001. J. Food
Protect. 66:1154-1157.
47. Crockett, C.S., C.N. Hass, A. Fazil. 1996. Prevalence of shigellosis in the
U.S.: Consistency with dose-response information. Int. J. Food Microbiol. 30:87-99.
48. DAoust, J.Y., and H. Pivnick. 1976. Small infectious doses of Salmonella.
Lancet 1:866.
49. Dargatz, D.A., P.J. Fedorka-Cray, S.R. Ladely, and K.E. Ferris. 2000. Survey
of Salmonella serotypes shed in feces of beef cows and their antimicrobial susceptibility
patterns. J. Food Protect. 63:1648-1653.
50. Fedorka-Cray, P.J., D.A. Dargatz, L.A. Thomas, and J.T. Gray. 1998. Survey
of Salmonella serotypes in feedlot cattle. J. Food Protect. 61:525-530.
51. Goepfert, J.M., and R.A. Biggie. 1968. Heat resistance of Salmonella
typhimurium and Salmonella Senftenberg 775W in milk chocolate. Appl. Microbiol.
16:1939-1940.
52. Graber, G. 1991. Control of Salmonella in animal feeds. Division of Animal
Feeds. Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration. Report to the
National Advisory Commission on Microbiological Criteria for Foods.
53. Hennessy, T.W., C.W. Hedberg, L. Slutsker. 1996. A national outbreak of
Salmonella Enteritidis infections from ice cream. N. Engl. J. Med. 334:1281-1286.
54. Hinton. M.. E.J. Threlfall. and B. Rowe. 1990. The invasive potential of
Salmonella Enteritidis phage types for young chickens. Lett. Appl. Microbiol. 10:237-
239.
55. Hobbs, B.C. 1961. Public health signifcance of Salmonella carriers in
livestock and birds. J. Appl. Bacteriol. 24:340-352.
56. Horwitz, M.A., R.A. Pollard, M.H. Merson, and S.M. Martin. 1977. A large
outbreak of foodbome salmonellosis on the Navajo Indian Reservation, epidemiology and
secondary transmission. Am. J. Public Health 67:1071-1076.
57. Impey, C.S., and G.C. Mead. 1989. Fate of salmonellas in the alimentary tract
of chicks pre-treated with a mature caecal microfora to increase colonization resistance.
J. Appl. Bacteriol. 66:469^475.
58. Jones, F.T.. R.C. Axtell. D.V. Rives, S.E. Schneideler, F.R. Tarver, Jr., R.L.
269
Walker, and M.J. Wineland. 1991. A survey of Salmonella contamination in modem
broiler production. J. Food Protect. 54:502-507.
59. Juven, B.J., N.A. Cox, J.S. Bailey, J.E. Thomson, O.W. Charles, and J.V.
Shutze. 1984. Survival of Salmonella in dry food and feed. J. Food Protect. 47:445^*48.
60. Kampelmacher. E.H. 1963. The role of salmonellae in foodbornc diseases. In
Microbiological Quality of Foods, ed. L.W. Slanctz et al., 84-101. New York: Academic
Press.
61. Keller, L.H., C.E. Benson, K. Krotec, and R.J. Eckroade. 1995. Salmonella
Enteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of
chickens. Infect. Immun. 63:2443-2449.
62. Lee, W.-C, M.-J. Lee, J.-S. Kim, and S.-Y Park. 2001. Foodborne illness
outbreaks in Korea and Japan studied restrospec-tively. J. Food Protect. 64:899-902.
63. Le Minor. L., and M.Y Popoff. 1987. Designation of Salmonella enterica
sp. nov., nom. rev., as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. System.
Bacteriol. 37:465^168.
64. Lerche, M. 1961. Zur Lebenfahigkeit von Salmonella bakterien in
Mayonnaise und Fleischsalat. Wein. Tierarztl. Mschr. 6:348-361.
65. Ley, F.J., B.M. Freeman, and B.C. Hobbs. 1963. The use of gamma radiation
for the elimination of salmonellae from various foods. J. Hyg. 61:515-529.
66. Lillard, H.S. 1986. Role of fmbriae and fagella in the attachment of
Salmonella typhimurium to poultry skin. J. Food Sci. 51:54-56.65.
67. Martin, W.J., and W.H. Ewing. 1969, Prevalence of serotypes of Salmonella.
Appl. Microbiol. 17:111-117.
68. Matches. JR. and J Liston. 1968. Low temperature growth of Salmonella. J.
Food Sci. 33:641-645.
270

Microbiologia Alimentelor Voli

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Microbiologia Alimentelor Voli

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

1

S-ar putea să vă placă și