CUPRINS

1. Ce sunt mucegaiurile ? ......................................................................................................... 3

1.1. Cele mai importante genuri ale micologiei alimentare .............................................. 4
1.2. Micotoxinele ............................................................................................................... 5
2. Metode de determinare a mucegaiurilor si a micotoxinelor ................................................. 6
2.1. Tehnici de identificare a mucegaiurilor ...................................................................... 6
2.2. Metode calitative ........................................................................................................ 9
2.3. Metode cantitative ..................................................................................................... 12
3. Bibliografie ......................................................................................................................... 15

1. Ce sunt mucegaiurile ?
Mucegaiurile sunt fungi filamentoi care cresc sub forma unei mese ncolcite i se
rspndesc rapid putnd acoperi o suprafa de mai muli centimetrii n numai 2-3 zile.
ntreaga structur sau numai o poriune din aceasta este denumita miceliu. Un miceliu este
format din ramuri sau filamente denumite hife. Cele mai importante se nmulesc prin
ascospori, zigospori sau conidii. Ascosporii unor genuri se remarc prin gradul lor ridicat de
rezisten la temperaturi ridicate. Un grup formeaz picnidii sau acervuli (celule mici n form
de flacon, iar corpii de fructificare sunt conidiofori). Artrosporii rezult din fragmentarea
hifelor din unele grupe.
Cele mai importante observaii din ultimii douzeci de ani referitoare la sistematica
fungilor transmisibili prin alimente sunt despre descoperirea nmulirii sexuate sau perfecte a
ctorva specii i genuri binecunoscute. n aceast privin starea de ascomicet este considerat
de micologi ca fiind starea reproductiv cea mai important a unor fungi, stare denumit
teleomorf. Numele de specie dat unei ciuperci teleomorfe are prioritate fa de cel ce
definete starea anamorf (denumire dat strii imperfecte sau conidiale). Termenul holomorf
arat c sunt cunoscute ambele stadii, dar este utilizat termenul teleomorf.
Evoluia tehnicilor de recoltare i transformare a produselor agricole, transportul
alimentelor pe distane lungi i prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungit constituie
condiii

care

dac

sunt

realizate

necorespunztor,

devin

favorabile

dezvoltrii

microorganismelor nedorite i n particular, a mucegaiurilor.

Micotoxinele sunt metabolii ai mucegaiurilor cu o structur chimic mai mult sau mai
puin cunoscut care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte
degradante att la om,ct i la animale. Aceste toxine pot fi coninute n sporii de mucegai
sau de cele mai multe ori eliminate n substratul de cretere (aliment).

1.1. Cele mai importante genuri ale micologiei alimentare

Alternaria sunt fungi responsabili de putregaiul fructelor cu smburi, al
merelor i smochinelor precum i de putregaiul negru al citricelor.
Alternariile sunt fungi de cmp care cresc pe gru, dar se pot izola i de pe
crnurile roii. Acestea produc micelii septate cu conidiofori i conidii
cafenii mari. Unele specii produc micotoxine, dar majoritatea efectelor produse asupra
2

sntii animale i umane nu sunt nc bine cunoscute. Nu toate specile de Alternariasunt

combtute i considerate patogene, chiar mai mult, unele promit a fi arme de lupt ecologice
contra unor plante duntoare.
Aspergillus produce lanuri de conidii. Cnd se dezvolt cleistoteci cu
ascospori stadiul perfect al celor gsii n alimente este Emericella,
Eurotiumsau Neosartorya. Eurotium(fostul grup A. glaucus) produce
chistoteci de culoare glbui deschis, toate speciile fiind xerofile.
Aspergilii apar pe un numr mare de alimente, fiind pigmentai n galbenverde pn la negru. Putregaiul negru al piersicilor, citricelor i smochinelor constituie una
din condiiile alterrii fructelor. Unele specii se gsesc i pe unca afumat la ar sau pe
slnin, iar altele produc alterarea uleiurilor de palmier, alune i porumb.

Botrytis au conidioforii lungi, subiri i adesea pigmentai. Miceliul este

septat, conidiile sunt prezente pe celulele apicale, de culoare cenuie sau
neagr i uneori se produc sclerote neregulate. Botrytis cinerea este ce mai
frecvent specie gsit n alimente. Aceti fungi sunt importani pentru c
produc mucegaiul gri al merelor, perelor, zmeurei, cpunilor, strugurilor, merelor, citricelor
ial unor fructe cu smburi.

Fusarium formeaz un miceliu nchis cu aspect vtos cu nuane de roz,

rou, purpuriu sau cafeniu. Macroconidiile sunt septate, avnd forma
fusiform pn la falciform (n form de secer). Produc putregaiul moale
al smochinelor. Ca fungi de cmp unele specii se dezvolta pe grunele de
orez sau gru. Unele specii produc tricotecene, fumonizine i zearalenone. Fusarium
venenatum este produs pe scar industrial pentru a fi utilizat ca aliment uman.
Penicillium au conidioforii i conidiile sunt singurele structuri de
reproducie prezente, genul fiind plasat n clasa Deuteromycota. Sunt plasate
ntre ascomicete atunci cand se formeaza cleistochecii cu ascospori, ca de
exemplu Talaromyces sau Eupenicillium.Dintre cele dou genuri teleomorfe,
genul Talaromyces este cel mai important n contaminarea alimentelor. T. Flavus este
teleomorfa lui P. Dangeardii i este implicat n alterarea concentratului de suc de fructe.
3

Produce spori termorezisteni cnd se formeaz conidii n Penicillium acestea cad din fialide.
Culorile tipice pe care le au n alimente sunt albastru sau albastru verzui. Unele specii produc
putregaiul albastru i verde al citricelor, strugurilor, perelor i fructelor cu smburi.

1.2. Micotoxinele
Termenul de micotoxin vine de la cuvntul grecesc mycos care inseamn
ciuperc i de la cuvntul latin toxicum care nseamn otrav. Ele desemneaz metabolii
secundari secretai de mucegaiurile care aparin n principal genurilor Aspergillus, Penicillium
i Fusarium, prezente n mod natural n aerul ambient, pe pmnt i pe culturi.
Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminani alimentari cei mai
semnificativi n ceea ce privete impactul asupra sntii publice, securitii alimentare i
asupra economiei a numeroaselor ri. Ele se gsesc pe o mare varietate de produse alimentare
nainte, n timpul i dup recolt.
Afecteaz numeroase produse agricole, anume cereale, fructele, nucile, boabele de
cafea, orezul i plantele oleaginoase, care sunt substraturi foarte sensibile la contaminarea cu
mucegaiuri i la producerea de micotoxine. Contaminarea produselor de ctre micotoxine se
realizeaz n cazul cnd ntrunesc condiiile de mediu pe cmp pentru apariia lor, precum i
procedee neadecvate de recoltare, de stocare i de transformare atunci cnd sunt cumulate.
Prin diversitatea efectelor lor toxice i a propietilor lor sinergice, micotoxinele prezint un
risc pentru consumatorul alimentelor contaminate.

2. Metode de determinare a mucegaiurilor si a micotoxinelor

Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridic aspecte importante legate de pierderea

inocuitii alimentului. Atenia deosebit acordat mucegaiurilor este datorat caracteristicilor
anumitor specii de fungi de a elabora i elibera n aliment metabolii secundari numii
micotoxine, care au o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut, dar i capacitatea
dovedit de a modifica structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metabolii ai anumitor
4

tipuri de mucegaiuri au astfel efecte nocive att asupra sntaii omului, ct i asupra
animalului care consum alimente contaminate cu acestea.
Micotoxinele prezint un real pericol att pentru animale ct i pentru om, i este
obligatoriu ca manipularea probelor s se fac cu grij i s se lucreze n condiii care s
mpiedice contaminarea materialelor i a atmosferei.
n plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substane sunt ele nsui toxice: este
exemplul lui Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei
tipuri de simptome la om: infecie, alergie i toxicoz. Infecia reprezint o invazie a
esuturilor vii n timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigen fungic.
Toxicozele sunt maladii rezultate n urma expunerii, n general prin ingerare, prin inhalare sau
prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie s se insiste asupra faptului
c atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa fie
maxim.
Personalul din laborator trebuie s fie familiarizat cu reglementrile privind
securitatea. Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat i trebuie s se
realizeze un set complet de analize la snge. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie s
cuprind trei puncte:
identificarea sursei periculoase i a efectelor posibile asupra sntaii n cazul
nefolosirii echipamentului adecvat;
punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor i microorganismelor;
nelegerea sensului responsabilitii pentru a permite aplicarea msurilor de
securitate;

2.1. Tehnici de identificare a mucegaiurilor

Pentru manipularea eantioanelor se recomand s se lucreze n cabine securizate

biologic. Pentru protecie, personalul trebuie s poarte n permanen sor, mnui i masc.

Manipularea produselor mucegite

Produsele mucegite nu trebuie s fie manipulate niciodat fr mnui i analizele se
vor face n aa fel nct s se evite pe ct posibil inhalarea particulelor toxice.
Analiza eantioanelor test
Securitatea manipulrii este foarte important n timpul acestei operaii. Este
primordial minimizarea contaminrii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf.
Contactul direct cu toxinele pure sau n soluie trebuie s fie evitat prin folosirea
echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeele de lucru ca i echipamentele folosite n
timpul extraciei trebuie s fie obligatoriu decontaminate dup utilizare.
Decontaminarea laboratorului
Sticlria de laborator i suprafeele care au intrat n contact cu toxinele sunt splate cu
NaClO 0,5%. Carcasele n care au fost inute animalele de laborator sunt incinerate.
Eantionarea
Studii au artat c peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datoreaz
eantionrii necorespunztoare; trebuie deci s ne asigurm c eantioanele prelevate pentru a
fi analizate sunt reprezentative.
Este important deci s se prezinte un plan de eantionare care s fac parte din
reglementrile privind controlul contaminrii cu micotoxine. n ultimii ani, o atenie deosebit
a fost acordat ameliorrii i asigurrii calitii analizelor fcute pentru identificarea
contaminanilor din produsele din alimentaia uman i animal. Pentru stabilirea normelor
comerciale, contaminanii trebuie s fie corect identificai si cantitile determinate s fie
sczute. Micotoxinele nu fac excepie de la aceste reguli i analiza lor prezint dificulti
particulare n ceea ce privete obinerea eantioanelor reprezentative iar analiza trebuie s
permit identificarea nivelurilor sczute de micotoxine (sub 500 ppm).
Eantionarea constitue o etap crucial n determinarea coninutului de micotoxine
dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxin nu este proporional cu
cantitatea de mucegaiuri prezent, sunt foarte rar distribuite uniform n eantion. Contrar
metodelor

analitice,

sistemele

de

eantionare
6

nu

pot

face

obiectul

ncercrilor

interlaboratoriale i n general, un plan de eantionare este propus pe baza unui studiu statistic
al repartiiei toxinelor msurate, apoi el este adoptat n mod oficial.
Determinarea numarului de mucegaiuri
Materiale necesare:
1. Cutii necesare pentru operatia de pregatire si omogenizare a probei
2. Cutii Petri, eprubete si pipete
3. Solutii diluate: solutie fiziologica peptonata 0.1 %; apa de robinet sterila; citrat de
sodiu 2%.
4. Solutii: acid tartric solutie 10%, acid lactic solutie 10%
5. Inhibitori
6. Medii de cultura (Czapek Dox, extract de drojdie, agar-malt, etc)
7.
Efectuarea dilutilor decimale: din alimentele lichide, omogenizate prin agitare se ia 1 ml si se
introduce intr-o eprubeta de 9 ml cu ser fiziologic peptonat. Se continua dilutiile decimale
succesive
Insamantarea: din fiecare dilutie se introduce cate 1 ml in doua cutii Petri. Se toarna cate 15
ml mediu topic si racit si se omogenizeaza.
Incubarea: cutiile Petri se tin la o temperatura de 22-24 grade timp de 5 zile pentru
mucegaiuri.
Numararea coloniilor: cu ochiul liber sau cu lupa. Se efectueaza de obicei in cutiile Petri in
care s-au dezvoltat intre 10 si 100 colonii.

Identificarea morfologica a coloniilor de mucegaiuri:

1. Examenul macroscopic: se efectueaza pe colonii de o saptamana in placa initiala. Se
urmareste aspectul general al coloniei, textura, ritmul de crestere si pigmentarea.
2. Examinarea la lupa binocular: prin observarea in detaliu a aparatului vegetativ.

3. Examinarea microscopica: se racleaza cu ansa o mica portiune de colonie, se pune o

picatura de Lugil si se examineaza cu obiectivele de 10x, 20x si 40x pentru a observa
spori sau alte structuri de diagnostic.
Tehnici de identificare a mucegaiurilor
Examenul microscopic direct este dificil, prin caracterul sau interpretabil. El poate
creea confuzii deoarece filamentele fungice pot fi uor confundate cu fibrele vegetale, iar
sporii pot fi confundai cu diferite artefacte. Fungii levuriformi sau filamentoi primari,
rspunzatori cu declanarea bolii, pot fi deseori mascai de specii care se dezvolt secundar,
aa cum ar fi Penicillium, Rhizopus sau Scopulariopsis.
Prin colorarea frotiurilor obinute din materiale patologice se ating doua obiective:
vizualizarea mai bun a elementelor fungice i conservabilitatea preparatelor. De asemenea,
se pot colora i fragmente de micei recoltate din coloniile ce au crescut pe mediile de cultur.
Frotiurile se realizeaza prin suspendarea miceilor n ap distilat, pe lama degresat, i uscate
la temperatura camerei.
1. Metoda de colorare rapida (dupa Schwartz si Lamkins).
2. Metoda Hotckiss McManus

2.2.

Metode calitative

n aceast seciune vom trata metodele care n general sunt folosite ca metode rapide
de detecie a micotoxinelor.
Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. Dup
cum tim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina
concentraia molar a soluiei. Pentru interpretarea corect a msurilor realizate, ne vom folosi
de dou legi care descriu absorbia luminii de materie:
Legea lui Lambert:

A = log

Legea lui Beer :

A=Cd

I0
I

Unde:

A = absorbana sau densitatea optic a soluiei;

I = intensitatea luminii emise
Io = intensitatea luminii transmise
C = concentraia substanei absorbante
= coeficeintul de extincie al substanei absorbante

n practic, n cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbanei este adus la

zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care conine soluia de analizat este apoi plasat n
spectrofotometru (fig. 2) i citirea poate ncepe. Fiecare micotoxin are o valoare a
absorbanei bine specificat.

Figura 2: Spectofotometru UV
Figure 2: UV Spectophotometer

1. Metode imunologice
Testele imunologice constituie astzi metodele rapide de detecie a aflatoxinelor i a
altor micotoxine n alimente. Anticorpii policloni i monocloni folosii sunt agenii de
legtur folosii. Se tie c micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa molecular
mic, anticorpii policloni sunt produi indirect prin rspunsul imunitar al animalelor la un
complex micotoxin-protein. Raportul molecular micotoxin-protein este foarte important
pentru intensitatea rspunsului imunitar. Poziia i tipul de legtur ntre toxin i protein
sunt de asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretai prin fusiunea celulelor n splina

oarecilor i legarea celulelor miceliene datorit polietilen glicolului. Imunogeneza este

administrat prin injectri repetate de cantiti mici de protein (40-300 g).
Recunoaterea imunologic este bazat pe complementarismul spaial al grupelor
specifice al antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie n testul
immunologic i trebuie s fie obligatoriu corect preparat i caracterizat. Caracteristicile utile
pentru selecionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea i
randamentul.
Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), i testele pe coloana de imunoafinitate. n
ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.

2. Metode de imunoafinitate

Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbie de anticorpi pe un suport

inert (tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticl). Micotoxinele sunt prelevate de
soluiile test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impuritile din cartu au fost splate,
micotoxinele sunt desorbite n metanol i transferate pe coloan n faza invers pentru a fi
separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru
prelevarea i concentrarea micotoxinelor prezint mai multe avantaje: creterea selectivitii,
posibilitatea prelevrii din volume mari i asocierea cu alte tehnici analitice.
Aceast tehnic prezint de asemena avantajul de a fi foarte rapid (10-15 minute) i
nu presupune necesitatea unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este
folosirea unei cantiti importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca n cazul anumitor
micotoxine ca aflatoxinele, o derivaie prealabil trebuie s fie realizat pentru a putea folosi
tehnica fluorimetric cu lumina UV.

10

2.3 Metode cantitative

1. Teste kit

Testele kit permit determinarea coninutului de micotoxine n laboratoare

nespecializate. Testele kit folosite funcioneaz dup dou metode: metoda cromatografiei n
strat subire i metoda imunologic. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela c un
singur test poate fi folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe
metodele imunologice au avantajul uurinei i rapiditii metodei.

2. Cromatografie n strat subire (TLC)

Cromatografia n strat subire este o metod folosit ncepnd cu anul 1990 pentru
analiza aflatoxinelor. Pentru cromatografia n strat subire limita de detecie pentru dozarea
aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De obicei, aceast
metod este urmat de un test ELISA n cazul n care furnizeaz un rspuns pozitiv. S-a artat
c cromatografia n strat subire poate fi aplicat n egal msur i n cazul analizei
tricotecenelor, n particular a desoxinivalenolului (DON) i al zearalenonei (ZON).

Principiul metodei
Extracia micotoxinelor n solveni organici i separarea lor prin cromatografie n strat
subire, identificarea micotoxinelor separate n lumina ultraviolet la lungimile de und de
254 nm i 366 nm fa de substana etalon i confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate
n spoturi prin reacii de derivatizare.

3. HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de

nalt performan)

11

HPLC realizeaz cuantificare de mare precizie. Este o metod de referin i poate

realiza cuantificarea compusului de analizat aflat n cantiti foarte mici (ng). n cazul metodei
HPLC dezvoltate limita de detecie poate ajunge pn la 0,02 ppm, n timp ce limita de
cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metod folosit pentru analiza numeroaselor
micotoxine ca: zearalenin, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina i alfatoxine. Dei este
o metod cu un pre ridicat, care necesit experiena i timp, aceast metod este foarte mult
folosit ca tehnica de confirmare n cazul determinrilor folosind cromatografia n strat
subire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportat la
cromatografia n strat subire: precizie.
Exist dou tipuri de cromatografie cu lichid de nalt performan (fig 3): cu faza
normal i cu faza invers (RP-HPLC). Dac prima a avut o perioad de glorie acum 20 de
ani, astzi cel mai des folosit este cea de a doua. Totui trebuie specificat faptul c n cazul
folosirii (RP-HPLC), fluorescena aflatoxinelor B1 i G1 scade.
Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare i unul de
detecie.
Modulul de separare controleaz urmtorii parametri cromatografici: programare
metoda, compoziie solvent, viteza de eluie, splarea garniturilor, injecia probei, semnalarea
a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfaa IEEE- 488, termostatare
coloan, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare const din dou sisteme- un
sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe i o valv de realizare a
gradientului) i un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a
cte 24 de flacoane i un injector automat)
Modul de deteie - este un detector performant UV/Vis, cu dou canale, destinat
aplicaiilor HPLC i opereaz n domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul cruia se fac
achiziiile de date, ct i prelucrarea lor, este MILLENIUM.
Proba de la care se pleac este reprezentat de cereale mcinate. Fiind o prob solid, trebuie
s se fac extracia prealabil a compusului de analizat, DON fiind solubil n solveni folosii
n mod curent pentru extracie.
Deoarece extractul este foarte complex este necesar realizarea unei separri prealabile, care
are rolul de a nltura eventualii interfereni, dar i de a proteja coloana cromatografic.

12

Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a dou tipuri de coloane, pe de o parte,
coloane de iminoafinitate DONprep, care leag micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana,
de anticorpul specific aflat n umplutura coloanei, iar pe de alt parte, coloane
multifuncionale, Mycosep 225 i coloana Multisep 216, care las s treac micotoxina
prin coloana, n timp ce compui de interferen sunt reinui n umplutura coloanei.
n selectarea metodei HPLC i a condiiilor iniiale se pornete de la proba de
analizat. n urma extraciei i a separrii se obine o prob care conine molecule cu mase
moleculare mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indic
abordarea unei cromatografii cu faza invers.
Alegerea coloanei de separare se face cunoscnd ca DON-ul are masa molecular
mai mic de 2000, este solubil n solveni apoi, nu este ionic i nici polar. Coloana de
separare aleas pentru analiz este Symetry C18, avnd lungimea de 25 cm i diametrul
interior de 0,46 cm. Faza staionar este octadecilsilanul, care prezint o retenie foarte bun
deoarece lungimea lanului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de
carbon). Dimensiunea porilor este de 100 , iar dimensiunea particulelor este de 5 m,
opiunea fiind justificat de masa molecular mic a compusului de analizat.

Figura 3: Sistem HPLC

Figure 3: HPLC System

13