Procedee microscopice de

investigare celulară prin

folosirea
anticorpilor
Dr. Cătălin Gabriel MANOLE

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Definiţia noţiunii de anticorp
• ANTICÓRP s. m. proteină
specifică elaborată de
organism ca răspuns la
pătrunderea unui antigen. (< fr.
anticorps) (DEX)
Epitop
N.B. Prin antigen înţelegem orice Paratop
proteină străină de organismul
care produce anticorpul.
§ O imunoglobulină, în forma
literei “Y”, produsă de
limfocitele B, folosită de
sistemul imun pentru
identificarea și neutralizarea
particulelor străine.

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Definiţia noţiunii de anticorp

§ Interacționează specific cu o
secvență de aminoacizi
(EPITOP) din structura unei Epitop
proteine (ANTIGEN) Paratop

§ Fiecare braț al anticorpului

conține un paratop, care este
specific pentru un singur
epitop.

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Structura generală
a anticorpilor

1. Regiunea Fab
2. Regiunea Fc
3. Lanț greu
4. Lanțurile ușoare
5. Paratop
6. Regiune balama

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Metode de utilizare a
anticorpilor în microscopie

• Imunomarcare pentru microscopia optică

– Imunohistochimia

– Imunofluorescența

• Imunomarcare pentru microscopia electronică

– Imuno-electrono-microscopia

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Imunomarcarea
• Reprezintă totalitatea tehnicilor care folosesc
anticorpi pentru localizarea antigenelor
corespunzătoare
– pe secțiuni tisulare
• Criosecțiuni
• Secțiuni la parafină
– pe celule în cultură
• Face posibilă vizualizarea distribuției și localizării
componentelor celulare în microscopie optică

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Principiul metodei
• Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un
anticorp (Ac)
• Ac sunt purificați din serul animalelor de laborator
• Ac vor fi cuplați cu un sistem de detecție
– ENZIMĂ căreia i se furnizează un SUBSTRAT care va fi
transformat într-un compus colorat (IMUNOHISTOCHIMIE)
• Vizualizare în microscopie optică, cu lumină directă
– MOLECULE FLUORESCENTE (IMUNOFLUORESCENȚĂ)
• Vizualizare în microscopie de fluorescență

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Metode de
imunomarcare pentru microscopie

• Metoda directă

• Metoda indirectă

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Metoda directă
- anticorp primar marcat -

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Metoda indirectă anticorp
primar nativ și anticorp
secundar marcat

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
IMUNOHISTOCHIMIA
{

http://www.ihcworld.com/products/images/GBI/polink-ds1.jpg
 Imunohistochimia
Enzimă Substrat Culoare
Proxidaza de hrean 3,3'-diaminobenzidină (DAB) Brun-negru
Horseradish peroxidase (HRP)

Combinație de clorură de tetrazoliu

Forfataza alcalină (nitro blue tetrazolium chloride NBT) Negru – violet

Alkaline phosphatase (AP) și 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfat
(BCIP)

http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm
BCIP/NBT

DAB+ kit
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Ce structuri celulare pot
fi marcate ?

• Structuri membranare

• Organite celulare

• Componente nucleare

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
Ac pentru ribozomi Ac pentru mitocondrii

http://www.abcam.com/
colon
mezoteliu ficat

Ac pentru Ac pentru
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
componente ale membranei plasmatice componente ale invelișului nuclear
 Evaluarea proliferării celulare

http://www.abcam.com/rad21-antibody-ab154769.html#description_images_5

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Evaluarea apoptozei

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 IMUNOFLUORESCENȚA

https://www.pnnl.gov/science/images/highlights/computing/cell_cluster.jpg

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Fluorescența
• O variantă de luminiscență
• O moleculă capabilă de fluorescenţă (fluorofor,
sau fluorocrom) excitată cu lumină de o anumită
lungime de undă, va emite o radiație
electomagnetică cu o lungime de undă superioară,
în spectrul vizibil
• Parametrii:
– Spectru de absorbție/excitație
– Spectru de emisie
– Intensitate
– Durată
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
Spectrul
electromagnetic
 Microtubuli

ADN

http://www.antibodies-online.com/antibody/93891/anti-alpha+Tubulin+TUBA1+N-Term+antibody/
Ribozomi

ADN

Filamente de actină
 ADN (cromozomi)
Microtubuli
(fus de diviziune)
Kinetocori

http://www.hhmi.org/sites/default/files/Biointeractive/IOTW/iow-expansionmicroscopy.jpg

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Imuno-electrono
microscopia

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Date generale
• Metoda a fost introdusă pentru prima oară în
1971 de către Faulk & Taylor
• Folosește anticorpi absorbiţi pe particule de aur
(5-30 nm)
• După caracteristicile anticorpului primar şi
structura celulară căreia se adresează
marcarea se poate realiza:
– pre-includere
– post-includere
• Metoda mai scumpă și mai laborioasă
℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 Scop
- Cea mai bună metodă pentru detectarea și
localizarea proteinelor în diferite
compartimente celulare datorită puterilor
de mărire și de rezoluție superioare

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
http://ajpendo.physiology.org/content/ajpendo/305/1/E41/F4.large.jpg

Receptor pentru FGF în celule lactotrope din hipofiză

℗2013 Disciplina de medicină celulară și moleculară - medicina dezvoltării umane, UMF „Carol Davila” Bucureșt
 În endoteliul
Evidenţieri aortic

pentru
caveolină 1
IMUNOHISTOCHIMIE
http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2800001_jkms-25-16-g005&req=4

În celule endoteliale din ficat

IMUNOELECTRONOMICROSCOPIE
http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/BerndCV/Lab/EpithelialInfoWe
b/Transcytosis.html http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968432811001417