Metode Uzuale in Screenenigul Si Diagnosticul

CRISTINA RUSU
Metode uzuale în screeningul

şi diagnosticul bolilor
genetice: tehnici folosite
în genetica medicală
Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F. Iaşi

2007
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României
Metode uzuale în screeningul şi diagnosticul bolilor genetice: tehnici

folosite în genetica medicală /
coord.: Cristina Rusu – Iaşi: Editura Gr. T. Popa, 2007
Bibliogr.
Index
ISBN 978-973-7682-31-4
I. Rusu, Cristina (coord.)
575
Referenţi ştiinţifici:
Prof. dr. Mircea Covic – U.M.F. Iaşi
Prof. dr. Victor Ioan Pop – U.M.F. Cluj
Prof. dr. Emilia Severin – U.M.F. Bucureşti
Coordonator: Rusu Cristina
La acest volum au colaborat:

• Dr. Bica Vasilica • Dr. Iliev Gheorghe
• Dr. Creţ Victoria • Biol. Ivanov Iuliu
• Şef lucr. Dr. Csep Katalin • Conf. Dr. Puiu Maria
• Conf. Dr. Gavrilovici Cristina • Dr. Sireteanu Adriana
• Biol. Grămescu Mihaela • Asist. Dr. Skrypnyk Cristina
Editura „Gr.T.Popa”
Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi
Str. Universităţii nr. 16
Toate drepturile asupra acestei lucrări aparţin autorului şi Editurii „Gr.T.Popa” Iaşi.
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiată sau transmisă prin nici un mijloc, electronic
sau mecanic, inclusiv fotocopiere, fără permisiunea scrisă din partea autorului sau a editurii.
Tiparul executat la Tipografia Universităţii de Medicină şi Farmacie "Gr. T. Popa" Iaşi, str.
Universităţii nr. 16, cod. 700115, Tel. 0232 267798 int. 231,
Fax 0232 211820
Cuprins
CUPRINS
1 TEHNICI DE SCREENING PRENATAL ............................... 3

1.1 Screeningul serului matern................................................3
1.2 Screeningul ecografic.....................................................13
2 TEHNICI DE SCREENING NEONATAL............................. 25
2.1 Screeningul neonatal pentru fenilcetonurie..................27
2.2 Screeningul neonatal pentru hipotiroidism congenital..35
2.3 Screeningul neonatal pentru galactozemie...................39
2.4 Screeningul neonatal al bolilor metabolice prin
spectrometrie de masă ..................................................................43
3 TEHNICI DE SCREENING POSTNATAL .............................. 49
3.1 Testul anti - FMRP........................................................49
3.2 Screeningul bolilor lizozomale ...................................55
4 TEHNICI DE DIAGNOSTIC PRENATAL ........................... 63
4.1 Diagnosticul ecografic ...................................................63
4.2 Amniocenteza..................................................................71
4.3 Puncţia de vilozităţi corionice......................................81
4.4 Identificarea de celule fetale şi ADN fetal liber în
circulaţia maternă .........................................................................87
5 TEHNICI CITOGENETICE DE DIAGNOSTIC
POSTNATAL............................................................................................ 97
5.1 Cromatina sexuală..........................................................97
5.2 Cariotipul ......................................................................105
5.3 Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) ................113
5.4 Hibridizarea genomică comparativă (CGH) .............123
5.5 Stabilirea de linii celulare...........................................129
i
Tehnici folosite în genetică
6 TEHNICI MOLECULARE DE DIAGNOSTIC POSTNATAL

135
6.1 Extracţia şi cuantificarea de ADN...........................135
6.2 Reacţia PCR ................................................................141
6.3 Metoda Southern blotting..........................................155
6.4 Tipizarea ADN– obţinerea amprentelor ADN ............161
6.5 MLPA şi MAPH .........................................................167
6.6 Hibridizarea genomică comparativă cu microcipuri
ADN (array CGH) ...................................................................177
6.7 Analiza mutaţiilor ADN folosind sonde
oligonucleotidice specifice unei alele (ASO) ............................185
6.8 Testul de trunchiere a proteinelor (PTT)...................191
6.9 Polimorfismul conformaţional al monocatenelor (SSCP)
197
6.10 Electroforeza în gel cu gradient denaturant (DGGE)....203
6.11 Analiza heteroduplexurilor (HDA) .............................209
6.12 Polimorfismul mononucleotidic (SNP)......................215
6.13 Secvenţializarea ADN.................................................225
7 TEHNICI COMPUTERIZATE DE DIAGNOSTIC.............. 233
7.1 Programe de diagnostic .............................................233
8 ASPECTE ETICE ALE TESTĂRII GENETICE................ 239
9 GLOSAR........................................................................................ 249
10 INDEX ALFABETIC.................................................................... 259
ii
Prefaţă
Genetica Medicală este un domeniu foarte dinamic – din

punct de vedere clinic în fiecare zi se descoperă implicarea de
factori genetici în afecţiuni considerate anterior „clasice”, dar apar şi
noi sindroame plurimalformative. În ceea ce priveşte investigaţiile de
laborator, acestea caută să evidenţieze defecte genetice din ce în ce
mai mici, prin metode din ce în ce mai accesibile, care să permită fie
testarea în acelaşi timp a mai multor indivizi (teste screening), fie
testarea concomitentă la acelaşi pacient a mai multor gene sau
regiuni cromozomiale (teste de diagnostic).
În acest context, ne-am propus realizarea unui material

sintetic, dar suficient de detaliat pentru a permite aprofundarea
principiilor diferitelor tehnici folosite pentru screeningul şi
diagnosticul bolilor genetice. Descrierea fiecărei metode include:
definiţie, indicaţii, principii, interpretarea rezultatelor, variante ale
metodei, avantaje şi dezavantaje, adrese utile şi bibliografie.
Materialul este completat cu numeroase ilustraţii care să faciliteze
înţelegerea.
Volumul se adresează în principal medicilor geneticieni în

curs de pregătire şi medicilor negeneticieni, care trebuie să ştie când
să trimită pacienţii pentru investigaţii genetice, care teste sunt cele
mai indicate şi cum să interpreteze rezultatele primite. Materialul ar
putea fi util şi pentru medicii geneticieni cu experienţă, multe dintre
tehnicile prezentate fiind tehnici de ultimă oră, accesibile şi care pot
furniza rezultate deosebite atât pentru diagnostic, cât şi pentru
managementul pacientului şi familiei.
În speranţa că am reuşit să venim în întâmpinarea cerinţelor

dumneavoastră, vă dorim o lectură placută.
Autorii
iii
iv
Partea I
Tehnici
de
screening
A. Prenatal
1. Triplu test
2. Ecografia fetală
B. Neonatal
1. Fenilcetonuria
2. Hipotiroidia congenitală
3. Galactozemia
4. Boli metabolice (spectrometria de masă)
C. Postnatal
1. Testul antiFMRP
2. Screeningul bolilor lizozomale
1
2
Tehnici de screening prenatal
1 TEHNICI DE SCREENING PRENATAL
1.1 Screeningul serului matern

Dr. Puiu Maria
Definiţie
Screeningul serului matern este o analiză efectuată în timpul
sarcinii (de obicei în trimestrul II) din sângele gravidei, în scopul
detectării unor anomalii fetale. Cea mai frecvent folosită variantă
este triplul test, numit şi triplu screening, test Kettering sau test Bart.
Testul constă în determinarea nivelurilor serice ale alfa-
fetoproteinei (AFP), estriolului neconjugat (uE3) şi ale
gonadotrofinei corionice (hCG).
Interpretarea ţine cont de diferiţi factori (vârsta gestaţională,
etnie, greutatea şi vârsta mamei, sarcină unică/ gemelară etc) şi
apreciază care este şansa ca fătul să prezinte o anomalie.
Acest test nu stabileşte un diagnostic, ci reprezintă doar un
semnal de alarmă şi sugerează necesitatea utilizării unor alte teste
diagnostice.
Indicaţii
Metoda se foloseşte ca test screening la gravidele cu risc de
a da naştere unor copii cu:
• Defecte de tub neural (anencefalie, spina bifida),
• Sindrom Down (trisomie 21),
• Sindrom Edwards (trisomie 18),
• Sindrom Turner (monosomie X),
• Triploidie (făt cu 69 cromozomi),
• Trisomie 16 în mozaic,
• Sindrom Smith- Lemli- Opitz,
3
• Deficit de steroid sulfatază (care produce ihtioză congenitală),

• Deces fetal.
Suspiciunea trebuie confirmată ulterior prin ecografie, dozări
biochimice în lichidul amniotic şi investigaţii citogenetice din
vilozităţile coriale sau lichidul amniotic.
Screeningul serului matern se recomandă:
• În cazul familiilor cu istoric pozitiv pentru defecte de tub neural
(anencefalie sau spina bifida) sau Sindrom Down (trisomie 21);
• Gravidelor cu vârsta de peste 35 de ani;
• În cazul utilizării unor medicamente dăunătoare în primele luni
de sarcină;
• Gravidelor cu diabet zaharat tratat cu insulină;
• Celor care au prezentat o viroză în primele săptămâni de
sarcină;
• Gravidelor expuse la nivele crescute de radiaţii.
Principii
Testul necesită sânge venos (5 ml). Triplul test se efectuează
între săptămânile 15-20 de gestaţie, cu un interval optim la 16-18
săptămâni.
Pentru ca testul să fie concludent, el bazându-se pe corelaţia
dintre vârsta sarcinii şi determinarea cantitativă a markerilor serici,
este important ca el să fie precedat de o ecografie care va stabili
corect vârsta gestaţională, prin biometrie fetală.
Alfa fetoproteina (AFP)

Este o proteină produsă de ficatul fetal, echivalentul fetal al
albuminei şi principala proteină din sânge în primele stadii ale
dezvoltării fetale. Atinge un nivel maxim în sângele fetal în
săptămânile 10-13 de sarcină şi se menţine crescută până la 32
săptămâni. Spre sfârşitul perioadei fetale este înlocuită treptat cu
albumina. AFP în lichidul amniotic, apoi în sângele matern, unde
4
concentraţia creşte aproximativ constant şi atinge un maxim în

trimestrul III de sarcină.
Studiile au arătat că există mai multe cauze pentru valori
crescute sau scăzute ale AFP în sângele matern.
Cauze de AFP crescută:
• Defecte de tub neural (spina bifida, anencefalia);
• Defecte congenitale ale tegumentului;
• Defecte ale peretelui abdominal;
• Teratom sacrococcigian;
• Malformaţii gastro-intestinale;
• Anomalii reno-urinare (obstrucţie, rinichi polichistic, agenezie
renală);
• Osteogeneza imperfecta;
• Distrofie fetală;
• Deces fetal;
• Oligohidramnios;
• Sarcina multiplă;
• Greutate mică a gravidei.
Cauze de AFP scăzută:

• Vârsta gestaţională mai mică decât cea calculată;
• Trisomii cromozomiale (ex Sindrom Down);
• Sindrom Turner cu higroma chistică;
• Mola hidatiformă;
• Greutate mare a gravidei.
AFP singură sau în triplul test poate determina 80-90% din
defectele de tub neural.
5
Gonadotrofina corionică umană (hCG)

hCG este un hormon (glicoproteină constituită din 2 subunităţi
α şi β) produs de sinciţiotrofoblastul placentei, începând cu
momentul nidării în peretele uterin. Valoarea sa creşte rapid în
primele 8 săptămâni de gestaţie, apoi scade aproximativ constant
până în săptămâna 20, rămânând apoi constant.
Nivelul crescut de hCG (în special subunitatea β) pare să fie
cel mai sensibil marker pentru trisomia 21, iar nivelul scăzut hCG
poate să fie asociat cu trisomia 18.
Estriolul neconjugat (uE3)

uE3 este un estrogen produs de placentă, din precursori
furnizaţi de către ficatul fetal. Nivel scăzut poate apărea în trisomiile
21 şi 18.
Interpretarea rezultatelor
Prelucrarea computerizată a valorilor biochimice raportate la o
serie de factori stabileşte magnitudinea riscului.
Concentraţiile markerilor biochimici utilizaţi pentru calcularea
riscului nu sunt constante de-a lungul sarcinii. De aceea, ele trebuie
“normalizate” la săptămâna de sarcină corespunzătoare.
Nivelul fiecărui marker seric pentru o anumită gravidă este
măsurat şi raportat ca multiplu de mediană (Multiple of Median =
MoM) pentru sarcinile normale de aceeaşi vârstă gestaţională.
Mediana reprezintă valoarea mijlocie a rezultatelor
determinărilor fiecărui marker efectuate într-o anumită săptămână de
vârstă gestaţională.
Multiplu al medianei (MoM) se obţine prin împărţirea valorii
obţinute la o gravidă cu o anumită vârstă gestaţională la valoarea
mediană stabilită pentru vârsta gestaţională respectivă. Intervalul
acceptat pentru risc este de 0,4 – 2,5 x MoM.
Programele specializate (ex Prisca) corectează valorile MoM
în funcţie de vârsta gravidei, greutatea ei, grupul etnic, statusul de
fumător /nefumător, multiplicitatea sarcinii, eventualele afecţiuni
(diabet zaharat insulino dependent), istoricul familial de trisomii sau
6
defecte de tub neural. Aceste programe pot calcula şi riscul pentru

anomaliile urmărite.
Testul are valoare orientativă (Tabel 1.1.1). Majoritatea
gravidelor la care se obţine un rezultat pozitiv pentru trisomie 21
(Sindrom Down), trisomie 18 (Sindrom Edwards) sau defecte de tub
neural pot avea un copil normal. De aceea, în situaţia unui rezultat
pozitiv se impun testări diagnostice suplimentare (amniocenteza).
Tabel 1.1.1: Interpretarea triplului test

SCREENING: AFP Estriol hCG
Sindrom Down ↓ ↓ ↑
Trisomie 13 N ? ↓
Trisomie 18 ↓ ↓ ↓
Defect de tub neural deschis ↑ N N
Dismatur, prematur, nou născut mort ↑ ? ?
Sarcină multiplă ↑ ↑ ↑
În cazul Sindromului Down, rata de detecţie a triplului test

este 75%, iar rata cazurilor fals pozitive este 8,5%.
În plus, atunci când există suspiciunea de Sindrom Down,
înainte de efectuarea amniocentezei este indicată efectuarea unei
ecografii detaliate care să caute „semne de alarmă”: chisturi de
plexuri coroide, edem nucal (translucenţă nucală), focare
intracardiace hiperecogene, uşoară pielectazie, intestin hiperecogenic
şi scurtarea femurului. Prezenţa acestor anomalii impune efectuarea
amniocentezei.
În cazul defectelor de tub neural, dacă valoarea AFP în serul
matern depăşeşte 2,5 MoM se impune efectuarea de teste diagnostice
– ecografia (caută reducerea DBP, semnul „lămâii” şi semnul
„bananei”- vezi capitolul de ecografie) şi amniocenteza (cu dozarea
AFP în lichidul amniotic). Dacă AFP în lichidul amniotic are valori
peste 3,5 MoM, se confirmă diagnosticul de defect de tub neural.
7
Dacă are valori de >/- 2 MoM se dozează acetilcolinesteraza în

lichidul amniotic.
Variante ale metodei

a) Screening prenatal de prim trimestru:
• Se efectuează în intervalul 10 săptămâni – 13 săptămâni 6 zile
de vârstă gestaţională;
• Markeri utilizaţi: PAPP-A (pregnancy associated plasma protein
– A), β-hCG liber, alături de translucenţa nucală (>3 mm în
săptămâna 12 de sarcină) măsurată ecografic şi absenţa oaselor
nazale (ecografic).
• Metoda este fiabilă şi permite depistarea a 91% din cazurile de
trisomie 21 (cu o rată a testelor fals pozitive de 5%), putând
ridica suspiciuni şi pentru alte patologii fetale (Tabel 1.1.2).
Tabel 1.1.2: Markeri în MoM (multiplu al medianei) şi rata de detecţie în

diferite aneuploidii (Spencer et al. 2000).
Aneuploidia TN ß hCG PAPP-A Rata
detecţiei
Trisomia 21 2.67 MoM 2.15 MoM 0.51 MoM 91%
45, X 4.76 MoM 1.11 MoM 0.49 MoM >90%
MoM (multiplu al medianei), TN (translucenţa nucală), PAPP-A
(pregnancy-associated plasma protein A).
b) Dublu test:
• Se realizează în săptămânile 13 – 22 de vârstă gestaţională;
• Se testează AFP şi fracţiunea liberă a βhCG;
• Testul are o rată de depistare cazurilor cu Sindrom Down de
80%, cu o rată a testelor fals pozitive de 2,8%;
8
c) Triplu test:
• Se realizează la 15 – 20 săptămâni de gestaţie;
• Testul constă în măsurarea AFP, estriolului neconjugat şi a
gonadotrofinei corionice în serul matern;
• Rata de depistare a cazurilor de Sindrom Down este 75%, cu o
rată a cazurilor fals pozitive de 8,5%;
d) Triplu test plus:

• Triplu test combinat cu fosfataza alcalină rezistentă la uree a
neutrofilelor;
• Depistează 70-80% din cazurile de Sindrom Down;
e) Cvadruplu test:
• Se aplică la 15 – 20 săptămâni de vârstă gestaţională;
• Măsoară nivelele de AFP, hCG sau βhCG, estriol, inhibină A;
• Inhibina A are un nivel de 1,8 MoM în sarcinile cu Sindrom
Down;
• Acest test creşte sensibilitatea pentru trisomiile 13, 18 şi 21;
identifică 79% din fetuşii cu Sindrom Down.
f) Test integrat:
• Screening seric în trimestrul I şi II, asociat cu evaluare
ecografică; depistează 90% din cazurile cu Down; poate depista
şi feţi cu Trisomie 18 sau Sindrom Smith- Lemli- Opitz;
• La 12 săptămâni: ecografie fetală care caută edemul nucal şi
stabileşte cu precizie vârsta gestaţională; în serul femeii gravide
se dozează PAPP A;
• La 16 săptămâni de gestaţie se măsoară în serul mamei: AFP,
βHCG fracţiunea liberă, estriolul neconjugat şi inhibina A.
9
Avantaje şi dezavantaje
Importanţa determinării riscului malformativ prin triplul test
constă în reducerea numărului de persoane care se încadrează în
grupele de risc şi care ar trebui să facă puncţie amniotică şi
cariotipare (investigaţie exactă, dar invazivă, cu un anumit grad de
risc şi mult mai costisitoare).
Cele mai importante avantaje sunt:
• economice (triplu test este o metodă relativ ieftină, comparativ
cu alte tehnici de screening şi diagnostic antenatal);
• legate de timp (rezultatul este posibil în 1-2 săptămâni);
• metoda este neinvazivă, lipsită de riscuri pentru mamă şi făt.
Dezavantajele metodei constau în sensibilitatea scăzută şi
valoarea orientativă şi nu diagnostică.
Există şi situaţia în care prin efectuarea testului, persoane
aparent fără nici un risc pot fi incluse în grupul de risc. De aceea, în
ultimul timp se preferă folosirea testului integrat, care creşte
probabilitatea de depistare a cazurilor, evitând astfel expunerea unor
persoane cu risc scăzut la stresul unor valori de cele mai multe ori
fals pozitive.
Adrese utile
• http://library.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/PRENATAL/PREN
ATAL.html
• http://www.babycenter.com/refcap/1487.html
• http://www.americanpregnancy.org/prenataltesting/afpplus.html
• http://www.wolfson.qmul.ac.uk/epm/screening/integrated.shtml
Bibliografie
• Berkowitz R.L., Cuckle H.S., Wapner R, D'Alton, M. - Aneuploidy
Screening-What Test Should I Use?, Obstetrics & Gynecology
2006;107:715-718.
• Berkowitz R. L., Roberts J., Minkoff H. - Challenging the strategy of
maternal age-based prenatal genetic counseling, JAMA,
March 22, 2006; 295(12): 1446 - 1448.
10
• Covic Mircea, Dragoş Ştefănescu, Ionel Sandovici – Genetică

medicală – Editura Polirom, 2004, p521-525.
• Shur N., Marion R., Gross S. J. A Surprising Postnatal Diagnosis,
Obstet. Gynecol., July 1, 2006; 108(1): 189 - 195.
• Simpson, J. L. - Choosing the Best Prenatal Screening Protocol.
NEJM , 2005, 353: 2068-2070 .
• Spencer K, Heath V, Flack N, Ong C, Nicolaides KH, First trimester
maternal serum AFP and total hCG in aneuploidies other than
trisomy 21. Prenat Diagn, 2000, 20:635–639
11
12
1.2 Screeningul ecografic

Dr. Iliev Gheorghe
Definiţie
Ecografia sau morfologia fetală este o tehnică de investigare
neinvazivă (atât pentru făt, cât şi pentru mamă), folosită pentru
examinarea morfologiei fetale şi a anexelor acestuia. Metoda permite
depistarea anomaliilor morfologice la făt cu expresie imagistică
(ecografică) la momentul examinării.
Indicaţii
Ecografia fetală trebuie practicată de rutină la toate gravidele,
ca metodă de screening, deoarece s-a constatat că 90% dintre
anomaliile fetale apar la cuplurile fără risc malformativ.
Deşi considerată inofensivă pentru făt, nu se recomandă
folosirea abuzivă a ecografiei, deoarece ultrasunetele pot avea şi
efecte biologice asupra ţesuturilor (efectul termic, efectul de
cavitaţie). Astfel, la fiecare examen ecografic se va respecta
principiul ALARA (As Low As Reasonably Achievable – A face un
diagnostic cât mai bun cu o putere (de emisie) cât mai mică).
Din aceste considerente, într-o sarcină clinic şi biologic
normală se vor face doar 3 ecografii, fiecare examen având obiective
distincte:
• Morfologia fetală din primul trimestru (11-13 săptămâni de
amenoree – s.a.):
o confirmarea şi localizarea sarcinii,
o morfologie fetală: calota craniană, emisferele cerebrale,
spaţiu pelucid, talamusul, plexurile coroide, profil facial,
orbite, cordul (cu 4 camere), stomacul, rinichii şi vezica
urinară, cele 4 membre, fiecare cu 3 segmente şi 5 structuri
la extremităţi;
o precizarea vârstei gestaţionale;
o localizarea placentei;
13
o identificarea semnelor ecografice pentru anomalii

cromozomiale (pliu nucal, agenezie os nazal, regurgitaţie
tricuspidiană);
La această vârstă de sarcină se identifică şi se măsoară pliul
nucal, un marker ecografic specific vârstei gestaţionale, asociat
cu risc crescut fie pentru anomalii cromozomiale, fie pentru
malformaţii cardiace sau pentru alte anomalii fetale. De
asemenea, la această vârstă gestaţională mai pot fi depistate
malformaţiile cu expresie ecografică precoce;
• Morfologia fetală de al II-lea trimestru (21-23 s.a.):
o morfologie fetală ecografică completă,
o biometrie fetală,
o localizarea placentei,
o volumul lichidului amniotic.
În trimestrul doi de sarcină se identifică semnele ecografice
minore sau nespecifice (soft marker) care sunt simple
particularităţi morfologice, întâlnite destul de frecvent, şi care nu
sunt însoţite în mod obişnuit de nici un handicap particular, cu
excepţia cazurilor când sunt asociate cu patologia cromozomială
(şi identificate în cadrul sonografiei genetice);
• Morfologia fetală din trimestrul III (32-34 s.a.):
o morfologie fetală (în special, reevaluarea structurilor
cerebrale şi a morfologiei renale),
o evaluarea ritmului de creştere fetală (biometrie fetală,
greutate fetală estimativă),
o volumul de lichid amniotic,
o localizarea placentară,
o poziţia fetală.
La 32-34 s.a. pot fi diagnosticate malformaţiile fetale cu expresie
ecografică tardivă. De regulă, la cea de a treia morfologie fetală
sunt identificate sarcinile cu retard de creştere intrauterină.
14
Aceste cazuri necesită şi folosirea ecografiei Doppler pentru

ariile vasculare materne (arterele uterine) şi fetale (artera
ombilicală, artera cerebrală medie, iar în cazurile cu hipoxie
fetală instalată – ductul venos, istmul aortic, vena ombilicală).
Screeningul ecografic pentru patologie cromozomială în primul

trimestru de sarcină
Prima morfologie fetală (11-13 s.a.) poate fi practicată pe cale
endovaginală sau abdominală sau se folosesc ambele metode. De
obicei se foloseşte calea endovaginală, deoarece cu sonda
endovaginală de înaltă frecvenţă se obţin imagini cu o rezoluţie mult
mai bună şi la o vârsta de sarcină mai mică decât cu sonda
abdominală.
Screeningul ecografic pentru patologia cromozomială din
cadrul primei morfologii fetale se bazează pe identificarea şi
măsurarea pliului (edemului) nucal. Metoda a fost dezvoltată de
şcoala europeană de ecografie (K. Nicolaides şi colaboratorii, 1996).
Pliul nucal reprezintă un edem subtegumentar de la nivelul cefei
reprezentat ecografic printr-o imagine hipoecogenă la acest nivel. În
mod normal, este prezent în toate sarcinile începând cu 10 s.a., are o
grosime care variază (creşte) în funcţie de vârsta gestaţională sau,
mai bine-zis, de lungimea cranio - caudală a fătului (LCC), şi dispare
după 14 s.a. (Fig.1.2.1 - 1.2.2). S-a demonstrat că un pliu nucal mult
prea gros are o semnificaţie patologică, sarcina respectivă fiind cu
risc crescut fie pentru patologie cromozomială, fie pentru
malformaţii congenitale de cord sau alte anomalii fetale.
Măsurarea pliului nucal se face pe cale endovaginală sau
transabdominală (Fig. 1.1.1 - 1.1.2). Tehnica de măsurare a acestuia,
stabilită de FMF (Fetal Medicine Foundation, London), este
standardizată şi răspunde la 5 criterii precise:
• Incidenţa secţiunii fetale trebuie să fie strict sagitală.
Examinarea se face în incidenţa pentru măsurarea LCC a
fătului;
• Imaginea fătului trebuie să ocupe 75% din dimensiunile
monitorului;
15
• Se face plasarea corectă a calliper-ului (unul la nivelul interfeţei

edem nucal/piele şi altul la nivelul interfeţei edem nucal/spate);
• Se face diferenţierea dintre amnion şi edem nucal;
• LCC trebuie să fie cuprinsă între 45 – 84 mm. Sunt dimensiunile
observate la 11 - 13 s.a. + 6 zile şi sunt singurele dimensiuni
admise în calcularea riscului pentru patologia cromozomială.
Fig. 1.2.1: Sarcină 11s.a.+5zile. Ecografie transabdominală.

A). LCC=53,8mm; B). Pliu nucal normal (0,9mm)
16
Fig.1.2.2: Sarcina 11s.a.+6zile. Ecografie transvaginală.

A). LCC=49,6mm; B). Pliu nucal normal (0,9mm)
Este nevoie de un antrenament suficient de mare pentru ca

măsurătorile să devină reproductibile. Controlul calităţii se poate
face folosind scorul Herman (1998). Pentru acest scop se utilizează
criterii ecografice majore şi criterii ecografice minore, reprezentate
în tabelul 1.2.1. Punctajul realizat se clasifică după cum urmează:
• 8 - 9 – rezultat excelent,
• 4 - 7 – rezultat acceptabil,
17
• 1 - 3 – rezultat intermediar,
• 0 - 1 – rezultat inacceptabil.
În practica curentă, un operator trebuie să fie în măsură să
realizeze un scor acceptabil.
Tabel 1.2.1: Scorul Herman (1998)

Criterii ecografice Scor
majore 0 2
Planul secţiunii Oblic Sagital
Plasare calliper Plasat prost Plasat bine
Plan cutanat vizibil la nivelul Occiput Occiput + spate
Criterii ecografice Scor
minore 0 1
Dimensiune imagine Insuficientă >75% al monitorului
Amnion Nu se vizualizează Vizibil
Poziţia capului Flectat / deflectat Intermediară
Screeningul ecografic pentru patologie cromozomială în

trimestrul doi de sarcină
Şcoala de ecografie din SUA (D. Nyberg şi colaboratorii,
1996) au întrodus termenul de „sonografie genetică”. Examenul
ecografic se practică în trimestrul doi de sarcină (15 - 23 s.a.) şi se
bazează pe identificarea semnelor ecografice nespecifice asociate
frecvent cu Trisomia 21. În urma studiilor au fost identificate 6 astfel
de semne ecografice:
• tegumente nucale îngroşate (≥5mm),
• intestin hiperecogen (grad 2 şi 3),
• humerus scurt,
• femur scurt,
• pielectazie (≥3mm),
• calcificări intracardiace.
18
Principii
Ecografia este o metodă imagistică medicală bazată pe
folosirea ultrasunetelor emise de către o sondă. Această utilizare se
bazează în special pe două proprietăţi ale ultrasunetelor, propagarea
foarte bine direcţionată şi calitatea de a se reflecta de la interfaţa cu
medii care au o impedanţă acustică diferită. Ultrasunetele reflectate
sunt transformate la nivelul sondei în semnale electrice, care, în urma
prelucrării de către ecograf, sunt vizibile pe monitor ca imagini.
Există trei metode de interpretare a valorilor grosimii pliului
nucal, fiecare având o semnificaţie distinctă:
• Grosimea pliului nucal cu pragul limită de 3 mm: Are
avantajul de a fi o metodă foarte simplă, dar are şi marele
incovenient de a ignora evoluţia grosimii pliului nucal în funcţie
de vârsta gestaţională şi nu poate fi integrată cu alte metode de
screening prenatal (vârstă maternă, serologie maternă);
• Grosimea pliului nucal cu pragul limită în funcţie de
percentila 95 a acestuia: Prezintă avantajul că respectă evoluţia
grosimii pliului nucal în funcţie de vârsta gestaţională, dar are şi
handicapul imposibilităţii integrării cu alte metode de screening
(vârstă maternă, markeri serologici materni, sonograma genetică
din trimestrul al doilea de sarcină);
• În funcţie de Multipla de Mediană (MoM) a pliului nucal:
MoM-ul reprezintă raportul dintre valoarea măsurată a pliului
nucal şi valoarea calculată a acestuia. Metoda, promovată de
FMF (Fetal Medicine Foundation, London), se bazează pe
determinarea factorului de probabilitate pentru patologie
cromozomială (likehood ratio – LR) în funcţie de multipla de
MoM a pliului nucal pentru o valoare dată a LCC şi oferă
posibilitatea de a calcula riscul pentru aneuploidie (Tab. 1.2.2 -
1.2.3).
19
Calcularea factorului de probabilitate pentru patologia

cromozomială în funcţie de MoM a pliului nucal
Mo +0.0 +0.1 +0.2 +0.3 +0.4
M
0.5 0.43 0.23 0.17 0.16 0.18
1.0 0.22 0.29 0.40 0.58 0.85
1.5 1.3 2.0 3.1 4.8 7.5
2.0 12 19 30 47 73
2.5 120 180 280 440 680
Tabel 1.2.2: Factor de probabilitate pentru patologia cromo-
zomială în funcţie de MoM a pliului nucal (După Cuckle, 1999).
Folosirea Tab. 1.2.2:
Prima situaţie: În caz că grosimea pliului nucal este exprimată în
MoM în raport cu LCC. Pentru un pliu nucal de 1,8 MoM (1,5 + 0,3
MoM) factorul de risc corespunde unei valori de 4,8.
A doua situaţie: Dacă pliul nucal şi LCC sunt exprimate în „mm” se
foloseşte Tab. 1.2.3 pentru a calcula MoM a pliului nucal.
LCP +0 +1 +2 +3 +4
(mm) mm mm mm mm mm
35 - - - 1.09 1.12
40 1.14 1.16 1.18 1.20 1.22
45 1.24 1.26 1.28 1.31 1.33
50 1.35 1.37 1.39 1.41 1.44
55 1.46 1.48 1.50 1.52 1.54
60 1.56 1.58 1.60 1.62 1.64
65 1.66 1.68 1.70 1.72 1.74
70 1.76 1.78 1.79 1.81 1.83
75 1.85 1.86 1.88 1.90 1.91
80 1.93 1.94 1.96 1.97 1.98
Tabel 1.2.3: Pliului nucal calculat pentru o valoare dată a LCP
(După Cuckle, 1999).
Folosirea Tab. 1.2.3: Dacă pliul nucal şi LCC sunt exprimate în mm,
pentru LCC egală cu 66 mm (65 + 1) valoarea calculată a pliului
nucal din tabel este 1,68 mm. Dacă valoarea măsurată a pliului nucal
este 2,0 mm, atunci MoM pentru pliul nucal = 2,0 / 1,68 = 1,2 MoM.
În Tab. 1.2.2 pentru 1,2 MoM factorul de probabilitate = 0,40.
20
Riscul post- ecografie pentru patologia cromozomială (Trisomia 21,

Trisomia 18, Trisomia 13) se calculează înmulţind riscul bazal pentru
un tip de trisomie (în funcţie de vârsta maternă şi vârsta gestaţională)
cu factorul de probabilitate pentru MoM a pliului nucal:
Risc post-ecografie = Risc bazal × Factor de probabilitate MoM pliu nucal
Această modalitate de interpretare a valorilor grosimii pliului nucal

poate fi integrată cu celelalte proceduri de screening prenatal (dublu
test, triplu test, sonografia genetică din trimestrul doi de sarcină).
Interpretarea rezultatelor „sonografiei genetice” se face în

felul următor:
Pentru fiecare semn ecografic a fost calculat factorul de
probabilitate (likehood ratio – LR):
• tegumente nucale îngroşate (≥5mm) – 11,0;
• intestin hiperecogen (grad 2 şi 3) – 5,5;
• humerus scurt – 2,5;
• femur scurt – 2,2;
• calcificări intracardiace – 2,0;
• pielectazie (≥3mm) – 1,5.
Pentru ecografia fetală normală LR=0,36. Înmulţind riscul
bazal pentru Trisomia 21 (în funcţie de vârsta maternă şi vârsta
gestaţională) cu factorul de probabilitate obţinut se poate calcula
riscul individual pentru Trisomia 21. În funcţie de rezultatul obţinut,
se ia hotărârea dacă sunt indicate alte metode de investigaţii (puncţia
amniotică, cariotipul fetal).

Ca metodă de screening ecografic din primul trimestru de
sarcină se foloseşte doar ecografia bidimensională (2D).
Ecografia tridimensională (3D) nu are aplicabilitate ca metodă
de screening.
21
Avantaje si dezavantaje
Deşi nu este cea mai ieftină metodă de screening (preţul
ecografului cu caracteristici tehnice bune şi costul pregătirii unui
ecografist bun sunt relativ ridicate), ecografia fetală este larg folosită
datorită faptului că este o metodă de examinare neinvazivă şi sigură
(nu s-au demonstrat efectele nocive asupra subiecţilor examinaţi),
care a devenit foarte accesibilă pentru gravide datorită faptului că
dotarea cu un ecograf a devenit o regulă pentru spitale şi foarte multe
cabinete medicale private. Metoda este avantajoasă doar dacă se face
un examen ecografic calitativ. Calitatea unei ecografii fetale poate fi
influenţată de următorii factori: performanţele tehnice ale
ecografului, competenţa şi experienţa ecografistului şi factori ţinând
de gravidă (vârsta sarcinii, calitatea peretelui abdominal al gravidei,
poziţia fetală, volumul de lichid amniotic).
Ca orice metodă de examinare imagistică, ecografia are
dezavantaje care ţin în primul rând de limitele metodei. Ecografia
fetală nu permite identificarea malformaţiilor minore care nu au o
expresie imagistică fie în general, fie la momentul examinării
gravidei. Condiţiile de examinare fetală neadecvate legate de
calitatea peretelui abdominal sau cel uterin al gravidei (obezitate,
perete abdominal cicatricial, uter polifibromatos), poziţia fetală sau
mobilitatea excesivă a acestuia, cantitatea de lichid amniotic (oligo/
polihidramnios) pot reprezenta, la fel, mari dezavantaje ale metodei
de examinare.
Adrese utile
• www.fetalmedicine.com
Bibliografie
• Cucke H. - Calcuating correct Down’s syndrome. Br J Obstet
Gynecol 1999, 106: 371-372;
• Herman A, Maymon R, Dreayen E et al. - Nuchal translucency
audit: a novel image scoring method. Ultrasound Obstet Gynecol
1998, 12: 398-403;
22
• Hutchon DJR, Khattab A. - How to use Bayes theorem to estimate

sequential conditional riscks. Odds or risk; that is the question!
www.thefetus.net/page.php?id=1115;
• Nicolaides KH. The 11 – 13 weeks scan. Fetal Medicine Foundation,
London 2004;
• Nyberg DA; Souter VL, El-Bastawissi A et al. - Isolated sonografic
markers for detection of fetal Down syndrome in the second
trimester of pregnancy. J Ultrasound Med 2001; 20: 1053-1063;
• Snijders RJM, Sebire NJ, Cuckle H, Nicolaides KH - Maternal age
and gestational age-specific risks for chromosomal defects. Fetal
Diag Ther 1995;10:356–67;
• Snijders RJM, Sundberg K, Holzgreve W et al. - Maternal age and
gestational age specific risk for trisomy 21. Ultrasound Obstet
Gynecol 1999, 13 (3): 167-170.
23
24
Tehnici de screening neonatal
2 TEHNICI DE SCREENING NEONATAL

În general, programele de screening neonatal trebuie să
îndeplinească următoarele condiţii (criterii Wilson):
• Afecţiunea pentru care se face testul să fie bine definită clinic şi
biochimic;
• Incidenţa în populaţia testată să fie crescută;
• Boala să se asocieze cu morbiditate şi mortalitate crescută;
• Să fie disponibil un tratament eficient;
• Să existe o perioadă de timp până la instalarea semnelor de
boală, perioadă în care intervenţia îmbunătăţeşte evoluţia;
• Testul screening să fie etic, sigur, simplu şi robust;
• Screningul să fie eficient din punct de vedere al costului.
În majoritatea serviciilor de neonatologie nou- născuţii sunt
supuşi la 2 tipuri de screening:
• Screening clinic: pentru malformaţii cardiace (prin ascultaţia
cordului), testicul necoborât şi surditate (prin examen clinic) şi
pentru luxaţie congenitală de şold (prin manevra Ortolani);
• Screening paraclinic: de obicei recoltarea de sânge pe o hârtie
specială de filtru (card Guthrie) în ziua 3-5 de viaţă, sânge din care
se fac teste pentru diferite boli ce produc handicap sever.
Odată cu evoluţia cunoştinţelor din domeniu şi în special
datorită dezvoltării explozive a tehnologiei, numărul afecţiunilor ce
pot fi testate prin screening neonatal a crescut considerabil. Un
exemplu l-ar putea reprezenta tehnica spectrometriei de masă, a cărei
aplicare în programele de screening neonatal duce la diagnosticul a
numeroase boli metabolice.
Afecţiunile pentru care se poate face screening neonatal sunt
în număr de 29 şi se încadrează în următoarele categorii:
• Anomalii ale metabolismului aminoacizilor;
25
• Anomalii ale metabolismului acizilor organici;

• Anomalii ale oxidării acizilor graşi;
• Hemoglobinopatii;
• Alte afecţiuni.
În unele ţări programele de screening neonatal includ şi teste
pentru depistarea fibrozei chistice şi a Sindromului X fragil,
afecţiunile respective fiind frecvente, beneficiind de măsuri
terapeutice specifice, iar fără terapie evoluţia pacientului făcându-se
cu handicap moderat/ sever în majoritatea cazurilor.
În cele ce urmează, totuşi, ne vom limita la principiile
tehnicilor ce intră în programele de screening neonatal din
majoritatea ţărilor din lume.
26
2.1 Screeningul neonatal pentru fenilcetonurie

Dr. Bica Vasilica
Definiţie
Fenilcetonuria (PKU) este o boală metabolică transmisă
autozomal recesiv, care constă în imposibilitatea de a converti fenil-
alanina în tirozină, datorită deficienţei enzimei fenilalanin-
hidroxilază (PAH, sub 5% din valorile normale). Deficitul enzimatic
duce la acumularea fenilalaninei (toxic pentru celulele nervoase) şi
lipsa tirozinei (manifestată prin deficit de pigmentare). În timp
organismul dezvoltă alte căi metabolice, cu transformarea excesului
de fenilalanină în acid piruvic.
Screeningul neonatal pentru fenilcetonurie constă în
evaluarea nivelului sanguin de fenilalanină la toţi nou născuţii.
Depistarea precoce a copiilor afectaţi şi aplicarea măsurilor
de terapie (dietă săracă în fenilalanină) duce la recuperare completă.
Indicaţii
Acesta este un test screening, care se face la toţi nou-
născuţii în ziua a treia de viaţă pentru depistarea PKU. La cazurile
depistate se aplică investigaţii biochimice suplimentare pentru
confirmarea suspiciunii de diagnostic, se fac teste de ADN şi ulterior
se instituie dieta săracă în fenilalanină timp de 3 ani.
Principii
Metoda clasică aplicată pentru screeningul neonatal al PKU
este testul Guthrie. Etapele de lucru sunt următoarele:
• Recoltarea se face în ziua 3–5 de viaţă, când nivelul sangvin de
fenilalanină a ajuns deja la mai mult de 240 µM; trebuie
parcurse următoarele subetape:
o Prelevarea câtorva picături de sânge din călcâi pe o hârtie de
filtru specială, cu obţinerea unui spot de sânge (vezi Fig.
2.1.1); se recoltează 4 spoturi pentru fiecare pacient (pe
acelaşi card);
27
o Uscarea spoturilor;
o Ambalarea probei;
o Transportul la laboratorul central;
o Înregistrarea probelor;
o Decuparea eşantioanelor (sub formă de discuri) de lucru din
spoturile de sânge prin perforarea hârtiei de filtru;
În unele laboratoare se recoltează şi spoturi de urină pentru
analiza metaboliţilor urinari.
Fig 2.1.1: Recoltarea sângelui pentru testul Guthrie
• Analiza propriu-zisă a probelor - Testul Guthrie este un test de

dozare semicantitativă, care are la bază o reacţie de inhibiţie
bacteriană:
o Eşantioanele din picăturile de sânge uscat sunt plasate pe o
placă Petri cu gel de agar (care stimulează dezvoltarea
germenilor) şi incubate cu o linie de Bacillus subtilis (forma
sporulată) şi beta 2 thienil-alanină, inhibitor al creşterii
Bacilului subtilis (vezi Fig. 2.1.2);
o Pe aceeaşi placă se pun şi discuri cu cantităţi standard de
fenilalanină (pentru control);
28
o După perioada de incubare de 16 de ore se citesc plăcile cu

gel. Se analizează inelul din jurul discului.
Picătură sânge
Decupare discuri cu
sânge din hârtia de filtru
Sânge aplicat pe hârtie de filtru
Discuri aşezate pe gel agar

împreună cu B. subtilis şi un
competitor al fenilalaninei
Lipsa creşterii bacteriene
Creştere bacteriană
datorită excesului de
fenilalanină din disc
Fig. 2.1.2: Etapele efectuării testului Guthrie pentru screeningul PKU
Concentraţia normală de fenilalanină în sângele nou
născutului este mai mică de 120 µM (2 mg/dl).
Fenilalanina stimulează creşterea bacteriană. În acelaşi timp,
fenilalanina are efect antagonist faţă de beta 2 thienil-alanină.
29
La un copil normal, beta 2 thienil-alanina inhibă creşterea

bacteriană deoarece nu există suficientă fenilalanină care să anihileze
acţiunea beta 2 thienil-alaninei.
La un copil cu PKU, cantitatea crescută de fenilalanină
blochează acţiunea inhibitorie a beta 2 thienil-alaninei, astfel încât
germenii rămân liberi să se dezvolte sub acţiunea factorilor nutritivi
din gelul agar. Consecinţa va fi o colonie sub formă de halou albicios
în jurul rondelei. Zona de creştere este proporţională cu cantitatea de
fenilalanină din eşantion (o cantitate de fenilalanină uşor peste
normal este suficientă pentru a anihila acţiunea inhibitorie a beta 2
thienil-alaninei; cantităţi suplimentare de fenilalanină vor avea efect
stimulator asupra dezvoltării bacteriene).
La copiii la care testul Guthrie depistează cantităţi crescute
de fenilalanină se fac teste biochimice suplimentare pentru
confirmarea diagnosticului.
Algoritmul de interpretare este următorul:
• O singură valoare de 120-360 µM sau raport crescut fenil-
alanină/ tirozină → repetarea testului screening;
• O singură valoare peste 360 µM → măsurarea nivelului sangvin
de fenilalanină şi tirozină:
o dacă nivelul fenilalaninei rămâne crescut (mai mare de 360
µM) şi nivelul de tirozină este normal → hiper-
fenilalaninemie;
o dacă nivelul de tirozină este crescut → se vor evalua cauzele
de hipertirozinemie;
o dacă nivelul de fenilalanină scade la normal şi nivelul de
tirozină este normal → se va lua în calcul o hiper-
fenilalaninemie maternă;
• Hiperfenilalaninemie persistentă (mai mare de 360 µM) şi nivel
normal de tirozină → repetarea nivelului de plasmatic de
fenilalanină, măsurarea metaboliţilor pterinei în urină şi
măsurarea nivelului de biopterin- reductază în sânge.
30
Pacienţii cu PKU clasică prezintă un nivel sangvin crescut

de fenilalanină (mai mare de 1- 1,2 mmol/l), în condiţiile unui aport
normal de proteine.
Majoritatea nou născuţilor cu nivel crescut de fenilalanină în
sânge depistaţi prin screening prezintă o formă uşoară sau tranzitorie
de hiperfenilalaninemie.
Valoarea limită =120 - 240µM (2 - 4mg%) ca indicator al
unui test Guthrie « pozitiv ».
Rezultate fals pozitive se pot înregistra la: hiper- fenil-
alaninemie tranzitorie, prematuri, alimentaţie parenterală sau
contaminarea hârtiei de filtru.
Rezultate fals negative apar în: recoltaea prea devreme după
naştere sau prezenţa de antibiotice în proba de sânge.
Alternative ale metodei

• Spectrometria de masă în tandem - tehnică recent adoptată,
permite screening-ul simultan pentru majoritatea bolilor de
metabolism care implică aminoacizii.
Sunt necesare două spectro-fotometre (unul care determină
masa de molecule ionizate şi al doilea, care identifică
moleculele pe seama profilelor lor).
Datele sunt analizate într-un program computerizat şi
rezultatele sunt furnizate sub forma unor vârfuri pentru fiecare
metabolit;
În cazul PKU spectrometria de masă în tandem prezintă
avantajul că se determină în cadrul aceluiaşi test şi fenilalanina
şi tirozina (cu calcularea raportului fenilalanină/ tirozină),
diagnosticul fiind stabilit foarte precis printr-un singur test;
• Analiza calitativă urinară (testul cu perclorură ferică = reacţia
Főlling) - în prezenţa sărurilor ferice acidul fenil- piruvic
(metabolit urinar al fenilalaninei) dă în câteva secunde o
coloraţie verde. Metoda este simplă, rapidă şi puţin costisitoare,
dar nu este totalmente specifică. Adăugarea a 3 - 5 picături
perclorură ferică FeCl3 soluţie 10% la 1 ml de urină produce
coloraţia verde a urinii, care atinge intensitatea maximă în 3 - 4
minute şi dispare în 20 - 40 minute. La nou născuţi se pune pe
31
scutecele umede o picătură de FeCl3 sau o bandeletă de hârtie

de filtru impregnată cu reactiv.
Principalele avantaje ale metodelor de screening pentru
PKU sunt:
• Se adresează unui număr mare de nou născuţi, crescând
şansele de depistare a cazurilor;
• Se efectuează curând după naştere, permiţând iniţierea precoce
a tratamentului dietetic;
• Relativ ieftine;
• Rapide - identifică potentialii suspecţi în timp util;
• Neinvazive;
• Necesită pentru analiză o cantitate foarte mică de sânge;
• Noile tehnologii reduc rezultatele fals pozitive şi oferă analiza
mai multor metaboliţi;
• Raportul cost - beneficiu este foarte favorabil.
Dezavantajele screeningului pentru PKU constau în :

• Oferă şi rezultate fals pozitive;
• Nu stabilesc un diagnostic specific;
• Rezultatele fals pozitive produc anxietate familiei.
Adrese utile
• http://www.patient.co.uk/showdoc/40024834/
• http://www.isns-neoscreening.org/FactSheets/Guidelies.htm
Bibliografie
• Aicardi Jean – Diseases of the nervous system in childhood, 1998,
Mac Keith Press, p.245, 264-266, 804-805;
32
• Covic M., Ştefănescu D., Sandovici I. – Genetică medicală, Ed

Polirom 2004, p358-361, 525-526;
• Emery’s Elements of Medical Genetics, Churchill Livingstone, 2002,
p.313-318;
• Rimoin D., Connor M., Pieritz R., Korf B. - Principles and Practice
of Medical Genetics, fourth edition, Churchill Livingstone, 2002,
vol.I, p.826-836, vol.II , p.2405-2414;
• Victor Maurice, Ropper Allan – Adams and Victor’s Principles of
Neurology, seventh edition, 2001, International Edition, p.1008 –
1009.
33
34
2.2 Screeningul neonatal pentru hipotiroidism

congenital
Dr. Bica Vasilica
Definiţie
Hipotiroidismul congenital (HC) este cea mai frecventă
boală identificată prin screening neonatal, incidenţa fiind de 1:4.000
naşteri.
De obicei hipotiroidismul congenital apare sporadic. Cauza
este reprezentată de absenţa sau hipoplazia glandei tiroide. De
asemenea, pot exista disfuncţionalităţi ale reglării glandei tiroide la
nivel hipofizar sau hipotalamic.
Hormonii tiroidieni sunt necesari pentru un metabolism
normal, creştere şi dezvoltarea creierului. Lipsa lor va afecta toate
aceste domenii.
Atât frecvenţa crescută a afecţiunii, cât şi severitatea
afectării clinice în lipsa tratamentului justifică aplicarea
screeningului neonatal.
Indicaţii
născuţii în ziua a treia de viaţă pentru depistarea HC. La cazurile
depistate se instituie cât mai precoce tratamentul de substituţie
hormonală tiroidiană.
Principii
Screeningul neonatal pentru HC constă în dozarea TSH şi T4.
Recoltarea se face în ziua 3-5 de viaţă (sau cel puţin la 24
ore după prima masă proteică) pe card Guthrie - acelaşi card (hârtie
de filtru specială) pe care se recoltează şi sânge pentru PKU (vezi
capitolul 2.1).
Unele programe încep cu dozarea TSH, iar dacă acesta este
crescut, se face şi dozarea T4.
35
Alte programe de screening fac ambele dozări de la început.

Dozarea nivelului seric al TSH se face prin reacţie
fluorimetrică.
Măsurarea concentraţiei sangvine de tiroxină (T4) constă
în incubarea discului de hârtie de filtru cu sânge uscat cu T4 marcat şi
anticorpi anti - T4 şi un inhibitor al TBG (Thyroxin Binding
Globulin). O concentraţie sangvină scăzută duce la creşterea legării
T4 marcat la anticorpii anti - T4 şi scăderea cantităţii de T4 marcat
liber. După separarea fracţiunilor legate şi nelegate, măsurarea
activităţii în fiecare fracţiune permite estimarea concentraţiei de T4
sangvin. Prelucrarea datelor este automată şi analiza este
computerizată.
În cazul rezultatelor anormale se mai face o dată testul după
1 - 2 săptămâni.
Nivele scăzute de T4 la nou- născut se pot întâlni în
următoarele situaţii :
• Hipotiroidism primar ;
• Hipotiroidism secundar ;
• Nivel scăzut de TBG (congenital sau câştigat) ;
• Medicamente administrate la mamă (iod, litiu, PTU) ;
• Prematuritate ;
• Afectare severă sau stress neonatal ;
• Sarcină gemelară (când se asociază cu prematuritate sau boală
severă);
• Hipotiroidism tranzitoriu idiopatic;
• Tiroidită maternă cu trecere transplacentară a anticorpilor anti-
tiroidieni.
Interpretarea rezultatelor este următoarea:
36
• T4 ↓ + TSH ↑ → hipotiroidism primar; se evaluează ecografic

glanda tiroidă, se fac dozări din sânge şi se începe tratamentul
cu levotiroxină;
• T4 ↓ + TSH normal → TBG scăzut sau cauză tranzitorie de
hipofuncţie tiroidiană neonatală; rareori necesită tratament; se
fac totuşi şi dozări din sânge;
• T4 normal + TSH ↑ → displazie a glandei tiroide; pot dezvolta
hipotiroidism ulterior.
La nou născuţii prematuri sau sever afectaţi primul test se
face la vârsta de 7 zile sau după ce alimentaţia proteică a fost tolerată
24 ore. Se mai face un al doilea test la vârsta de o lună/ greutate
2000g/ la externare. Dacă la vârsta de 3 luni copilul încă mai este în
spital, se recomandă un al treilea test. De multe ori la astfel de copii
T4 este scăzut, iar TSH este normal sau uşor crescut (până la
stabilizare şi creştere constantă în greutate). Dacă T4 este scăzut, iar
TSH este mult crescut, se fac investigaţii suplimentare şi se începe
tratamentul de substituţie.
Avantajele şi dezavantajele sunt aceleaşi ca la toate testele
screening (vezi Capitolul 2.1).
Adrese utile
• http://www.dshs.state.tx.us/newborn/c_thyro.shtm
Bibliografie
Mac Keith Press, p.245, 264-266, 804-805;
Polirom 2004, p358-361, 525-526;
p.313-318;
37
vol.I, p.826-836, vol.II , p.2405-2414;
1009.
38
2.3 Screeningul neonatal pentru galactozemie

Dr. Bica Vasilica
Definiţie
Galactozemia este o boală a metabolismului galactozei, cu
transmitere autozomal recesivă, cauzată de deficitul enzimei GALT
(galactozil-1 fosfat uridil transferază), o enzimă care este prezentă în
mod normal în toate ţesuturile.
Incidenţa galactozemiei clasice este 1: 60.000 naşteri.
Nou născuţii cu galactozemie pot apărea normali la naştere,
dar în câteva zile până la două săptămâni după naştere (după iniţierea
alimentaţiei lactate) simptomele galactozemiei netratate devin foarte
severe.
Simptomatologia precoce a bolii constă în tulburări de
alimentaţie, reflex de supt slab, icter, hepatomegalie, la care se mai
pot adăuga cataractă, hipoglicemie, tulburări de coagulare, imunitate
scăzută, deces prin sepsis (datorat în special bacteriei Escherichia
coli). Pe termen îndelungat, afecţiunea determină retard mintal şi de
creştere, ciroză hepatică macronodulară şi insuficienţă ovariană la
femei.
Indicaţii
născuţii în ziua a treia de viaţă pentru depistarea celor cu
galactozemie clasică datorată deficitului enzimei GALT.
Principii
Se recoltează sânge pe cardul Guthrie în ziua 3 - 5 de viaţă şi
apoi se fac teste specifice pentru galactozemie dintr-un disc.
Reacţia fluorimetrică determină nivelul crescut de galactoză
în sângele nou născuţilor, fiind urmată de reacţia Beutler prin care se
determină activitatea enzimatică GALT.
39
Identificarea bolnavilor permite instituirea precoce a

tratamentului dietetic, care constă în eliminarea aportului de
galactoză.
Testele pot furniza rezultate fals pozitive sau fals negative.
Nou născuţii care încă nu au primit lactoză (lapte) sau cei
care primesc lapte pe bază de soia pot să nu aibă galactoză crescută,
de aceea este important să se facă şi testul Beutler.
Copiii care au primit transfuzie înainte de recoltarea testului
pot avea test Beutler fals negativ datorită activităţii GALT din
eritrocitele transfuzate. De aceea, tipul de alimentaţie şi statusul
transfuzional trebuie menţionate pe formularul ce însoţeşte cardul
Guthrie.
Copiii cu test screening pozitiv (lipsa activităţii GALT sau
galactoză mult crescută) necesită urmărire, iar alimentaţia se schimbă
pe formulă de lapte pe bază de soia.
Dacă rezultatele sunt numai uşor modificate, se repetă testul
pe card Guthrie. Cardurile trebuie analizate repede, deoarece enzima
GALT poate fi distrusă de căldură.
O alternativă ar putea fi varianta fluorimetrică a tehnicii.
Avantajele şi dezavantajele sunt aceleaşi ca la toate testele
screening (vezi Capitolul 2.1).
Adrese utile
• http://www.idph.state.il.us/HealthWellness/fs/galactosemia.htm
• http://www.kidshealth.org/parent/system/medical/newborn_screening_
tests.html
• http://www.savebabies.org/diseasedescriptions/galactosemia.ph
• http://www.marchofdimes.com/professionals/14332_15455.asp
40
Bibliografie
Mac Keith Press, p.245, 264-266, 804-805;
Polirom 2004, p358-361, 525-526;
p.313-318;
vol.I, p.826-836, vol.II , p.2405-2414;
1009;
• Yamaguchi A., Fukushi M., Mizushima Y. et al. – Microassay for
Screening Newborns for Galactosemia with use of a Fluorimetric
Microplate Reader – Clin Chem 35/9, 1962-1964 (1989).
41
42
2.4 Screeningul neonatal al bolilor metabolice

prin spectrometrie de masă
Dr. Rusu Cristina

Definiţie
Bolile metabolice reprezintă o categorie foarte polimorfă de
afecţiuni genetice caracterizate prin deficitul unei enzime specifice.
Consecinţele principale constau în acumularea substratului enzimei
respective şi lipsa produsului final. Marea majoritate a acestor boli
determină afectarea progresivă a individului, cu handicap fizic şi
intelectual şi în final deces precoce.
Până relativ de curând, diagnosticul fiecărei boli metabolice
se stabilea individual, prin tehnici laborioase şi costisitoare.
Introducerea tehnicii de spectrometrie de masă (MS) a făcut
posibilă evaluarea mai multor metaboliţi în acelaşi timp, permiţând
screeningul mai multor boli metabolice într-un singur test simplu şi
puţin costisitor.
Indicaţii
Tehnica MS este indicată în următoarele categorii de boli
metabolice:
• Boli cu afectarea aminoacizilor, de exemplu fenilcetonuria,
tirozinemia, homocistinuria sau boala urinilor cu miros de sirop
de arţar;
• Boli cu afectarea oxidării acizilor graşi, de exemplu anomaliile
în metabolismul carnitinei;
• Boli cu afectarea acizilor organici, de exemplu acidemia
malonică, deficitul multiplu de carboxilaze sau acidemia
propionică;
• Boli cu afectarea ciclului ureei, de exemplu deficitul de ornitin-
transcarbamilază sau citrulinemia;
• În viitor tehnica MS se va extinde probabil pentru afecţiuni ce
interesează homocisteina, acizii biliari, hormonii steroizi, acizii
43
graşi cu lanţ foarte lung, carbohidraţii complecşi şi hormonii

tiroidieni.
Principii
Tehnica MS este o metodă electronică de identificare a
componentelor dintr-un produs de analizat prin separarea lor în
funcţie de masa moleculară, dar şi aprecierea cantităţii în care se
găseşte fiecare component în parte.
Există variante multiple ale tehnicii MS, cea mai utilizată la
momentul actual fiind spectrometria de masă în tandem (MS/MS).
Un spectrometru de masă în tandem este format din 2
spectrometre de masă care comunică printr-o cameră specială.
În vederea realizării screeningului neonatal se recoltează
câteva picături de sânge (obţinut prin puncţia călcâiului nou
născutului în ziua a treia de viaţă) pe o hârtie de filtru specială (card
Guthrie). Se transportă cardurile la laborator, unde se decupează
rondelele impregnate cu sânge şi se diluează serul din hârtia de filtru.
După ce a fost pregătită, proba este injectată în primul spectrometru
de masă. Aici proba este ionizată (prin bombardament rapid al
atomilor sau electrospray) pentru a produce ioni moleculari (ioni
parentali), tipurile de molecule prezente fiind determinate în funcţie
de raportul masă/ încărcătură (m/z).
Apoi proba este trimisă în camera intermediară (de coliziune
celulară). Ionii parentali trec separat în camera de reacţie în funcţie
de raportul m/z. Aici proba de ioni moleculari este descompusă în
fragmente numite analiţi. După ce a fost descompusă, proba este
transferată în al doilea spectrometru de masă.
În al doilea instrument analiţii selectaţi sunt sortaţi şi
cântăriţi în funcţie de raportul lor m/z.
Rezultatul este furnizat sub forma unui grafic cu mai multe
vârfuri (câte unul pentru fiecare analit). Vârful fiecărui analit este
comparat cu un standard intern pentru a furniza un rezultat calitativ,
dar şi unul cantitativ. Liniile verticale de pe histogramă identifică
masa, în timp ce liniile orizontale reprezintă cantitatea.
44
Datele furnizate de computer pot fi analizate în două feluri:

• În funcţie de ionii parentali – se obţine un grafic cu toţi ionii
parentali care prin fragmentare produc un anumit ion fiu;
• În funcţie de pierderile neutre - se obţine un grafic cu toţi ionii
parentali care prin fragmentare pierd un anumit fragment neutru
comun.
În acest fel MS/MS permite măsurarea foarte rapidă, cu
acurateţe, folosind standarde interne corespunzătoare, a multor tipuri
diferite de metaboliţi cu o pregătire minimă a probelor şi fără
separare cromatografică în prealabil. Rezultatul este furnizat în
câteva minute, metoda putându-se preta pentru realizarea de teste în
masă (screening neonatal).

• Spectrometria de masă prin cromatografie în lichid (LC/MS) –
Principalele caracteristici sunt:
o Necesită extracţie pentru pregătirea probei;
o Separarea cromatografică permite o separare cu rezoluţie
medie;
o Sensibilitate: milimolar- nanomolar;
o Viteza lentă (5 – 90 min);
o Avantaje semnificative: ionizare uşoară, spectru larg de
mase moleculare identificate;
o Dezavantaje majore: viteza scăzută a analizei.
Varianta cu ionizare prin electrospray (ESI) este una dintre
cele mai folosite metode la momentul actual. Comparativ cu
alte metode de ionizare are capacitatea de a analiza atât
compuşi cu masă moleculară mare, dar şi compuşi cu masă
moleculară mică, capacitatea de evaluare cantitativă este
excelentă, sensibilitatea este crescută, pregătirea probelor
este simplă, se pretează la automatizare şi ionizarea este
uşoară.
45
• Analiza fluxului de injecţie (FIA) – cu următoarele

caracteristici:
o Necesită extracţie pentru pregătirea probei;
o Nu se face separare cromatografică;
o Sensibilitate: milimolar- micromolar;
o Viteza rapidă (1 – 5 min);
o Avantaje semnificative: date într-un singur spectru; rapidă;
o Dezavantaje majore: inhibiţie semnalelor când există multe
componente.
• Spectrometria de masă prin cromatografie în gaz (GC/MS) –
A fost metoda de elecţie pentru analiza moleculelor mici şi încă
se foloseşte pentru detecţia multor boli metabolice. Principalele
caracteristici sunt:
o Necesită extracţie şi modificare chimică pentru pregătirea
probei;
o Separarea cromatografică permite o separare cu rezoluţie
mare;
o Sensibilitate: milimolar- nanomolar;
o Viteza lentă (30 min);
o Avantaje semnificative: rezoluţie înaltă; există standarde
disponibile;
o Dezavantaje majore: preparare dificilă a probei; viteza
scăzută a analizei; ionizarea greoaie; număr limitat de
molecule ce pot fi analizate; necesită componenţi volatili;
• NMR – Principalele caracteristici sunt:
o Nu necesită pregătirea probei;
o Nu se face separare cromatografică;
o Sensibilitate: milimolar- micromolar;
o Viteza rapidă (1 - 5 min);
46
o Avantaje semnificative: nu necesită prepararea probei;

o Dezavantaje majore: sensibilitate scăzută; unele clase
chimice nu sunt detectate.
Principalele avantaje ale spectrometriei de masă în tandem
constau în:
• Preparare automatizată a probei;
• Injectarea automată a probei;
• Ionizarea prin tehnica microspray, care creşte semnificativ
randamentul analizei;
• Impactul crescut al metodei – sunt analizate mai multe boli
printr-un singur test (cost eficienţă); se pot testa mai multe
categorii de boli în acelaşi timp;
• În cazul aminoacidopatiilor se pot analiza 500 probe/ aparat/ zi,
metoda pretându-se pentru screening neonatal; rata rezultatelor
fals negative este minimă;
• Considerate global, afecţiunile ce pot fi testate prin MS/MS sunt
frecvente (1/4.000 nou născuţi), ceea ce justifică aplicarea
metodei pentru screening neonatal. În plus, în cazul afecţiunilor
respective pot fi aplicate diferite strategii terapeutice: restricţie
dietetică, metode farmacologice (medicamente, vitamine,
cofactori), administrarea de dializă sau glucoză şi terapie de
substituţie enzimatică.
În cazul celorlalte variante avantajele şi dezavantajele sunt
prezentate mai sus.
Bibliografie
• American College of Medical Genetics/ American Society of Human
Genetics Test and Technology Transfer Committee Working Group –
Tandem mass spectrometry in newborn screening, ACMG/ASHG
statement July/August 2000, vol 2, no 4, p 267-269;
47
• Banta-Wright Sandra, Steiner Robert – Tandem Mass Spectrometry

in Newborn Screening, A Primer for Neonatal and Perinatal
Nurses, J Perinat Neonat Nurs, 2004, vol 18, no 1, p 41-58;
• Bartlett Kim, Eaton Simon, Pourfarzam Morteza – New developments
in neonatal screening, Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 1997; 77,
151-154;
• Pandor A, Eastham J, Beverley C et al. – Clinical effectiveness and
cost-effectiveness of neonatal screening for inborn errors of
metabolism using tandem mass spectrometry: a systematic review,
Health Technology Assessment 2004, vol 8, no 12;
• Want Elizabeth, Cravatt Benjamin, Siuzdak Gary – The Expanding
Role of Mass Spectrometry in Metabolite Profiling and
Characterization, Chem Bio Chem 2005, 6, 1941-1951;
• Wilcken Bridget, Wiley Veronica, Hammond Judith, Carpenter Kevin
– Screening Newborns for Inborn Errors of Metabolism by
Tandem Mass Spectrometry, N Engl J Med 2003; 348: 2304-12;
• Yokoyama Yukio, Takahashi Tomoko, Sato Hisakuni – Rapid
Screening for Inborn Errors of Metabolism Using Liquid
Ionization Mass Spectrometry with Dried Blood Spots on
Screening Cards, Analytical Sciences 2001, vol 17 supplement, p
1535-1542.
48
Tehnici de screening postnatal
3 TEHNICI DE SCREENING POSTNATAL
3.1 Testul anti - FMRP

Dr. Rusu Cristina
Definiţie
Testul anti-FMRP reprezintă un test imunologic ce utilizează
anticorpi monoclonali împotriva proteinei FMRP (specifice
Sindromului X fragil) pentru a depista prezenţa/ absenţa FMRP din
celule.
Gena implicată în Sindromul X fragil se numeşte FMR1 şi
produce o proteină numită FMRP. În porţiunea iniţială a genei FMR1
se găseşte o repetiţie trinucleotidică (CGG)n. În funcţie de numărul
de repetiţii se disting 3 situaţii mari (vezi Tabel 3.1.1).
Tabel 3.1.1: Tipuri de mutaţii ale genei FMR1

Număr Termen Clinic Cantinate
repetiţii FMRP
3-54 Normal Normal clinic Normală
55-200 Premutaţie Unele semne clinice Redusă
>200 Mutaţie Tablou clinic caracteristic Absentă
completă Sindromului X fragil
Indicaţii
Metoda se foloseşte ca test screening la pacienţii suspectaţi
de a avea Sindrom X fragil. Diagnosticul trebuie confirmat ulterior
prin teste moleculare (PCR şi Southern blot).
Principii
Etapele principale ale testului anti-FMRP sunt următoarele:
• Fixare (cu paraformaldehidă) pentru ca structurile celulare să îşi
păstreze acelaşi aspect ca în stare vie;
49
• Permeabilizare (cu metanol) – tratament care creează pori în

membrana celulară şi astfel permite intrarea anticorpilor în
celulă, pentru a identifica proteina ţintă;
• Clătiri (cu PBS şi PBS+) care îndepărtează excesul de metanol,
împiedicând reacţia lui cu reactivii ulteriori;
• Incubare cu anticorpul primar – anticorpul monoclonal
pătrunde în celulă, caută proteina FMRP în citoplasmă şi se
fixează pe ea;
• Clătire (cu PBS+) pentru a îndepărta anticorpii nelegaţi;
• Incubare cu anticorpul secundar – anticorpii secundari sunt
molecule specifice care caută anticorpul primar şi se leagă de el;
mai multe molecule de anticorp secundar se leagă de fiecare
moleculă de anticorp primar, amplificând astfel reacţia (Fig.
3.1.1)
Colorant
FMRP Anticorp Anticorp

primar secundar
Fig. 3.1.1: Principiul imunohistochimic al testului anti-FMRP
• Clătiri (cu PBS+, PBS şi Tris) pentru a îndepărta anticorpii

secundari nelegaţi;
50
• Incubare cu colorant – se fixează pe anticorpii secundari şi
evidenţiază prezenţa lor în celulă;
• Montarea unei lamele şi examinare la microscop.
La persoanele normale proteina FMRP este prezentă în
celule şi este pusă în evidenţă cu particulele de colorant.
La pacienţii cu Sindrom X fragil (indivizi cu mutaţie
completă) proteina FMRP lipseşte. La astfel de persoane citoplasma
celulelor (limfocite sau rădăcina firului de păr) nu apare colorată
specific. Uneori pacienţii cu Sindrom X fragil sunt mozaicuri (unele
celule sunt normale, altele prezintă premutaţie, iar altele mutaţie
completă). În această situaţie proteina FMRP este absentă numai în
unele celule, nu în toate.
La indivizii cu premutaţie cantitatea de FMRP este scăzută,
dar variaţia de culoare este greu de apreciat. Din acest motiv testul
antiFMRP nu este indicat în astfel de situaţii.
Aspectele de mai sus se întâlnesc la bărbaţi. La femei de
multe ori un cromozom X prezintă mutaţie completă, iar celălalt este
normal, ceea ce face ca unele dintre celule să fie colorate, iar altele
nu. Testul este numai orientativ pentru femei. Confirmarea prin teste
moleculare (PCR şi Southern blot) este obligatorie.

Până în prezent au fost descrise 3 variante ale metodei – pe
amniocite (prenatal), pe frotiu de sânge periferic (Fig. 3.1.2) şi pe
rădăcina firului de păr (Fig. 3.1.3) (postnatal).
Aplicarea metodei pentru diagnostic prenatal este posibilă,
dar nu este indicată, deoarece testul antiFMRP nu este un test de
certitudine. Datorită faptului că în majoritatea serviciilor PCR şi
Southern blot sunt disponibile, se preferă aplicarea directă a acestor
metode pentru un diagnostic precis.
Varianta pe frotiu de sânge este din ce în ce mai puţin
folosită deoarece cantitatea de reactivi este relativ mare (trebuie
acoperită toată lama), iar numărul de celule de pe o lamă este relativ
mic (coloraţia specifică apare numai în limfocite). Metoda de
obţinere a unui concentrat leucocitar modifică nivelul de FMRP, de
51
aceea testul antiFMRP nu poate fi aplicat pe spoturi de concentrat

leucocitar (suprafaţă mai mică şi număr crescut de celule).
În prezent se preferă tehnica pe rădăcina firului de păr.
Recoltarea este mult mai puţin agresivă, cantitatea de reactivi este
mai mică, iar rezultatele par să aibă şi valoare prognostică (firul de
păr şi creierul au aceeaşi origine embriologică)
Fig. 3.1.2: Frotiu de sânge: stânga – anormal (lipsa coloraţiei maro în

citoplasma limfocitului); dreapta - normal (proteina FMRP colorată în maro
în citoplasma limfocitului)
Fig. 3.1.3: Fir de păr: stânga – anormal (lipsa coloraţiei roz a rădăcinii
firului de păr); dreapta - normal (proteina FMRP colorată în roz)
52
Avantajele şi dezavantajele testului antiFMRP faţă de testele
folosite în mod convenţional când există suspiciunea de Sindrom X
fragil sunt prezentate în Tabelul 3.1.2.
Două avantaje majore sunt cel economic (testul antiFMRP
este o metodă ieftină) şi cel legat de timp (se poate da un rezultat
într-o zi).
Tabel 3.1.2: Comparaţie Southern blot – PCR- test antiFMRP în Sindromul

X fragil (modificat după Hagerman, 2002)
Caracteristică a testului PCR Southern Anti
blot FMRP
Determină exact numărul de repetiţii +++ - -
CGG
Rapidă şi foloseşte cantităţi mici de +++ + +
ADN
Detectează metilarea - +++ -
Detectează premutaţiile ++ + -
Detectează mutaţiile complete + ++ +
Detectează mozaicismul + ++ +
Distinge femeile normale de cele ++ + +
purtătoare
Distinge femeile homozigote de cele ++ + +
purtătoare
Distinge femeile homozigote de cele cu +/- ++ +
mutaţie completă
Distinge bărbaţii cu premutaţie de cei cu ++ + +
mutaţie completă
Detectează deleţiile - +/- -
Adrese utile
• http://www2.eur.nl/fgg/ch1/fragx/index.html
Bibliografie
• Hagerman R.J., Hagerman P.J. – Fragile X Syndrome – Diagnosis,
Treatment and Research. The Johns Hopkins University Press, 2002;
• Murray J., Cuckle H., Taylor G., Hewison J.: Screening for fragile X
syndrome. Health Technology Assessment 1997; Vol 1: No.4;
53
• Sherman S., Pletcher B., Driscoll D.: Fragile X syndrome:

Diagnostic and carrier testing. Genetics in Medicine, vol 7, no 8,
584-587, 2005;
• Willemsen R., Anar B., De Diego Otero Y. et al - Noninvasive Test
for Fragile X Syndrome, Using Hair Root Analysis, Am J Hum
Genet, vol 65 (1999), p 98–103;
• Willemsen R., Smits A., Mohkamsing S. et al - Rapid antibody test
for diagnosing fragile X syndrome: a validation of the technique,
Hum Genet, Vol 99, Nr 3 /1997, p 308-311;
• Willemsen R., Mohkamsing S., De Vries B. et al - Rapid antibody
test for fragile X syndrome, Lancet, 1995, vol. 345, no 8958, pp.
1147-1148;
• Willemsen, R.; Smits, A.; Severijnen, L.-A. et al. : Predictive testing
for cognitive functioning in female carriers of the fragile X
syndrome using hair root analysis. J. Med. Genet. 40: 377-379,
2003.
54
3.2 Screeningul bolilor lizozomale

Dr. Victoria Creţ
Definiţie
Bolile lizozomale – boli genetice de metabolism - reprezintă
un grup de peste 40 de boli diferite, heterogene din punct de vedere
clinic şi biochimic, fiecare boală fiind caracterizată prin deficitul
unei enzime lizozomale specifice.
Frecvenţa bolilor lizozomale este apreciată la 1:5.000 –
1:10.000, iar modul de transmitere al acestor boli este autosomal
recesiv, cu două excepţii: boala Hunter şi boala Fabry, a căror
transmitere este recesivă legată de cromozomul X.
Diagnosticul clinic este adesea dificil datorită lipsei de
specificitate a manifestărilor clinice.
Examinarea histopatologică este limitată de imposibilitatea
de a deosebi diferitele tipuri de material lipidic stocat.
Indicaţii
Indicaţiile pentru dozarea enzimelor lizozomale sunt:
• copii şi adulţi cu trăsături grosiere ale feţei, cu sau fără
organomegalie sau manifestări neurologice;
• copii şi adulţi cu organomegalie inexplicabilă;
• întârziere în dezvoltare şi/ sau regresia achiziţiilor dobândite de
la naştere până la vârsta de 10 ani;
• convulsii asociate altor manifestări sugestive.
În plus, examinarea poate fi solicitată pentru testarea
purtătorilor în cazuri bine precizate, astfel:
• testarea părinţilor unui copil diagnosticat cu boală lizozomală,

deoarece:
o ajută la stabilirea riscului familiei de a avea alţi descendenţi
afectaţi: în cazul în care părinţii sunt confirmaţi purtători,
riscul pentru un alt copil afectat este 25% şi sunt indicate
55
teste de diagnostic prenatal; în cazul în care un părinte este

normal, se apreciază că apariţia copilului afectat se datorează
unui accident, iar riscul de recurenţă este mult mai mic;
o aduce informaţii utile laboratorului privitor la nivelul
enzimei la purtătorii care ulterior vor dori diagnostic prenatal
sau pentru alţi membri ai familiei care solicită testul;
• testarea unor persoane care au avut o rudă decedată cu o boală

lizozomală confirmată sau doar suspectată pe criterii clinice
sugestive.
Bolile lizozomale care pot fi testate prin dozarea enzimelor

lizozomale sunt prezentate mai jos, cu precizarea enzimei
deficitare (în paranteză) şi a disponibilităţilor de diagnotic
prenatal (cu asterix):
1) Sfingolipidoze:
• boala Gaucher* (beta-glucozidaza şi chitotriozidaza);
• boala Fabry* (alfa-galactozidaza);
• boala Niemann - Pick tip A şi B* (sfingomielinaza);
• boala Tay - Sachs* (beta - hexozaminidaza);
• boala Sandhoff* (beta - hexozaminidaza);
• GM1 gangliozidoza* (beta - galactozidaza);
• leucodistrofia metacromatică* (arylsulfataza A);
• boala Krabbe* (galactocerebrozidaza);
• boala Farber* (ceramidaza)
2) Mucopolizaharidoze (testarea glicozaminoglicanilor):
• boala Hurler şi Hurler - Scheie (MPS I)*: alfa - iduronidaza;
• boala Hunter (MPS II)*: iduronat sulfataza;
• boala Sanfilippo tip A (MPS III A)*: heparan - sulfamidaza;
• boala Sanfilippo tip B (MPS III B)*:
afla - N - acetilglucozaminidaza;
• boala Sanfilippo tip C (MPS III C)*:
glucozamin - Ncetiltransferaza;
• boala Morquio tip A (MPS IV A)*:
56
N - acetilgalactozamin 6 - sulfataza;
• boala Morquio tip B (MPS IV B)*: beta - galactozidaza;
• boala Maroteaux - Lamy (MPS VI)*: arylsulfataza B;
• boala Sly (MPS VII)*: beta - glucuronidaza;
• deficitul multiplu de sulfataze: arylsulfataza A şi alte sulfataze.
3) Mucolipidoze:
• afla - manozidoza* (afla - manozidaza);
• beta - manozidoza* (beta - manozidaza);
• fucozidoza* (afla fucozidaza);
• sialidoza (alfa - N - acetylneuraminidaza);
• galactosialidoza (alfa - N - acetylneuraminidazidaza
şi beta - galactozidaza);
• boala Shindler (alfa - N - acetylgalactozaminidaza);
• aspartylglycozaminuria (aspartylglycozaminidaza).
4) Glicogenoze:
• boala Pompe (glicogenoza tip II): alfa - glucozidaza.
5) Defecte ale procesării enzimelor lizozomale:
• I - cell - disease* şi polidistrofia pseudo-Hurler*:
(arylsulfataza A; beta - hexozaminidaza; alte enzime).
6) Defecte de transport ale enzimelor lizozomale:
• Cistinoza* (încorporarea S - cistinei);
• Sialuria (acidul N - acetylneuraminic).
7) Alte boli lizozomale:
• boala Wolman*;
• boala de stocaj a esterilor de colesterol;
• boala Niemann-Pick tp C*.
Principii
Pentru screeningul bolilor lizozomale se poate apela, într-o
primă etapă, la determinarea produşilor metabolici urinari (în
mucopolizaharidoze şi glicoproteinoze), a căror valoare crescută
57
demonstrează defectul biochimic şi probabilitatea deficitului

enzimatic. Astfel:
a). Screeningul tuturor mucopolizaharidozelor se poate face prin:

• metoda calitativă: precipitarea glicozaminoglicanilor (GAGs)
urinari cu un detergent cationic, cetylpyridinium chloride
(CPC); electroforeza bidimensională pe acetat de celuloză şi
vizualizarea componentelor separate cu Alcian Blue;
• metoda cantitativă: determinarea glicozaminoglicanilor (GAGs)
din urină printr-o reacţie cu dimethylmethylene blue (care nu
necesită precipitare prealabilă), în analizorul centrifugal Cobas
Bio. Limitele acestor metode constau în riscul unor rezultate fals
pozitive sau fals negative. Fiind metode orientative, diagnosticul
pozitiv se poate stabili doar printr-o metodă de dozare a
enzimelor lizozomale.
b). Screeningul glicoproteinozelor:

• metoda calitativă: cromatografia în strat subţire a produşilor din
urină, utilizând orcinol şi resorcinol. Orice rezultat pozitiv
trebuie urmat de analiza cantitativă;
• metoda cantitativă: dozarea enzimatică. Trebuie menţionat că
metoda este un supliment util al screeningului enzimatic din
leucocite şi nu o alternativă.
Diagnosticul enzimatic oferă şansa unui diagnostic definitiv,
prin precizarea deficitului enzimei specifice fiecărei boli în parte, cu
menţiunea că nu toate bolile lizozomale beneficiază de acest tip de
diagnostic.
Măsurarea activităţii enzimatice se poate face în:
• leucocite;
• plasmă;
• ser;
• culturi de celule: din piele (fibroblaşti), amniocite, vilozităţi
corionice;
58
• picătură de sânge uscată pe hîrtie de filtru (pentru screening

neonatal), metodă nou introdusă, ieftină şi care pare a fi foarte
utilă ca metodă screening (testare în masă).
Prelevarea probei:
• 5–10 ml sânge recoltat pe EDTA sau heparină (în funcţie de
laborator), pentru dozarea enzimelor din leucocite / plasmă (este
preferat pentru screeningul iniţial); se trimit la temperatura
camerei, în ziua recoltării;
• cultură de celule:
o fibroblaşti obţinuţi prin biopsie cutanată, la nivelul
antebraţului;
o amniocite: 10 - 15 ml lichid amniotic recoltat prin
amniocenteză în săptămânile 14 - 17 de sarcină;
o celulele corionului vilozitar (obţinut prin biopsie în
săptămâna 10 - 12 de sarcină);
• picătură de sânge pe hârtie de filtru, cu un diamteru de 3 - 5 mm
(screening neonatal).
Metodele utilizate sunt fluorimetrice, spectrofotometrice şi
imunohistochimice.
Pentru măsurarea activităţii enzimelor în ţesuturile
menţionate se utilizează substrat sintetic reprezentat de 4 - methyl -
umbelliferyl, derivaţi de para - nitrocathecol şi para - nitrofenol.
Se impune stabilirea condiţiilor exprimentale prin variaţia
parametrilor de lucru: temperatura, timpul de incubare, concentraţia
substratului şi compoziţia mediului de reacţie.
Rezultatele se exprimă cuantificat, în funcţie de laborator şi
tipul probei: în nmol/ h/ mg proteină ori µKat/ h/ mg proteină (în
ţesuturi) şi nmol/ h/ ml sau µKat/ h/ ml (în plasmă, ser).
Amploarea scăderii nivelului enzimei deficitare variază
semnificativ în funcţie de enzima/ boala implicată: dacă pentru boala
Gaucher o scădere cu aproximativ 30% a nivelului beta -
glucocerebrozidazei confirmă diagnosticul, pentru boala Niemann -
59
Pick, sfingomielinaza trebuie să scadă la valori de sub 1% pentru a

putea afirma diagnosticul.
Bibliografie
• Civallero G., Michelin K., de Mari J. et al. – Twelve different
enzyme assays on dried-blood filter paper samples for detection of
patients with selected inherited lysosomal storage disorders. Clin
Chim Acta. 2006 Oct; 372 (1-2):98-102;
• Clements Peter – Mass Spectrometry as a Platform for the
Diagnosis of Lysosomal Disorders. Clinical Chemistry. 2004; 50:
1723-1724
• Covic Mircea, Stefănescu Dragoş, Sandovici Ionel – Genetica
Medicală - Bolile lizozomale, p 361-363. Editura Polirom, 2004;
• Fuller Maria, Melanie Lovejoy, John J. Hopwood and Peter J. Meikle -
Immunoquantification of Β-Glucosidase Diagnosis and Prediction
of Severity in Gaucher Disease. Clinical Chemistry. 2005; 51:2200-
2202;
• Grigorescu-Sido Paula, Cristina Drugan, Gheroghe Jebeleanu, Simona
Bucerzan, Victoria Creţ, Camelia Sos - Metode Enzimatice şi
moleculare în diagnosticul de laborator al bolilor lizozomale.
Revista Română de Pediatrie; vol XLIX, Nr 3, 2000 : 297-303 ;
• Mayes JS, Scheerer JB, Sifers RN, Donaldson ML - Differential
assay for lysosomal alpha-galactosidases in human tissues and its
application to Fabry's disease. Clin Chim Acta. 1981 May
5;112(2):247-51;
• Millington S. David – Newborn Screening for Lysosomal Storage
Disorders. Clinical Chemistry. 2005; 51: 808-809;
• Rimoin L. David, Connor J. Michael, Pyeritz E. Reed – Emery and
Rimoin’s Principles and Practice of Medical Genetics -
Gangliosidosis and Related Storage Disorders, p 2105-2129, 3rd
Edition, Churchill Livingstone 1997;
• Yijun Li., C. Ronald Scott, Nestor A. Chamoles et al. – Direct
Multiplex Assay of Lysosomal Enzymes in Dried Blood Spots for
Newborn Screening. Clinical Chemistry. 2004; 50: 1785-1796.
60
Tehnici de diagnostic
Partea II
Tehnici de diagnostic
A. Prenatal
1. Ecografia fetală
2. Amniocenteza
3. Puncţia de vilozităţi corionice
4. Izolarea de celule/ ADN fetal din circulaţia maternă
B. Postnatal
Tehnici citogenetice
1. Cromatina sexuală
2. Cariotipul
3. Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)
4. Hibridizarea genomică comparativă (CGH)
5. Stabilirea de linii celulare
Tehnici moleculare
1. Extracţia de ADN
2. Reacţia PCR
3. Metoda Southern blotting
4. Amprentele de ADN
5. MLPA şi MAPH
6. Array CGH
7. Tehnica ASO
8. Testul de trunchiere a proteinelor (PTT)
9. Polimorfismul conformaţional al monocatenelor (SSCP)
10. Electroforeza în gel cu gradient denaturant (DGGE)
11. Analiza heteroduplexurilor (HDA)
12. Polimorfismul mononucleotidic (SNPs)
13. Secvenţierea ADN
Tehnici computerizate
1. Programe de diagnostic
61
62
Tehnici de diagnostic prenatal
4 TEHNICI DE DIAGNOSTIC PRENATAL
4.1 Diagnosticul ecografic

Dr. Iliev Gheorghe
Definiţie
Ecografia sau morfologia fetală este o tehnică de investigare
neinvazivă, folosită pentru examinarea morfologiei fetale şi a
anexelor acestuia. Metoda permite doar diagnosticul malformaţiilor
fetale cu expresie imagistică (ecografică) la momentul examinării.
Indicaţii
Ecografia fetală morfologică trebuie practică sistematic,
rolul iniţial al acesteia fiind cel de screening ecografic. Se recomandă
trei examene ecografice sistematice, la 11 - 13 s.a., 21 - 23 s.a. şi 32 -
34 s.a., fiecare examen având obiective bine definite. În cazul în care
la screening-ul ecografic se identifică o malformaţie fetală, ecografia
fetală se transformă dintr-o metodă de screening în una de diagnostic
prenatal.
Rata diagnosticului prenatal al malformaţiilor congenitale
depinde de mai mulţi factori, şi în primul rând de vârsta gestaţională
la care se fac examenele ecografice obligatorii:
• Prima morfologie fetală (11 - 13 s.a.) - Pot fi diagnosticate
malformaţiile cu expresie ecografică precoce:
o Anomalii cerebrale: anencefalie/ acranie, holoprozencefalia
alobară şi semilobară,
o Anomalii cardiace: malformaţiile congenitale de cord cu
modificarea arhitecturii celor patru camere (ventricul unic,
hipoplazie marcată de ventricul/ cord stâng),
o Anomalii ale peretelui abdominal: omfalocel, gastrischizis,
o Anomalii ale membrelor: sirenomielie, focomelie (fig.4.1.1 -
4.1.2);
63
• A doua morfologie fetală (21 - 23 s.a.) - identifică majoritatea

malformaţiilor fetale severe cu expresie ecografică la momentul
examinării (fig.4.1.3 - 4.1.5);
• A treia morfologie fetală (32 - 34 s.a.) - diagnostichează
malformaţiile fetale cu expresie ecografică tardivă:
o malformaţii cerebrale: ventriculomegalie, hidrocefalie,
disgenezie corp calos, chist cerebral, hemoragie cerebrală,
chist arahnoidian, macrocefalie, microcefalie,
o malformaţii congenitale de cord evolutive: hipoplazie
ventriculară stângă, hipoplazie ventriculară dreaptă,
coarctaţie de aortă, stenoză pulmonară, tetralogie Fallot,
o atrezie duodenală,
o displazii renale.
Fig. 4.1.1: Ecografie endovaginală. Sarcină 11 s.a. + 6zile.

Holoprozencefalie semilobară.
64
Fig. 4.1.2: Ecografie endovaginală. Sarcină 12 s.a. Omfalocel.
Fig. 4.1.3: Ecografie transabdominală. Sarcină 24 s.a.

Malformaţie congenitală de cord. Canal atrio-ventricular.
65
Unele malformaţii fetale sunt asociate frecvent cu anomalii

cromozomiale:
• Malformaţii cranio-cerebrale: La nivelul sistemului nervos
central, cele mai frecvente malformaţii asociate cu anomaliile
cromozomiale sunt microcefalia şi holoprozencefalia. Frecvenţa
aneuploidiilor din holoprozencefalie variază între 36,7% şi 50%
dintre cazuri, cea mai frecventă anomalie cromozomială fiind
Trisomia 13.
Fig. 4.1.4: Ecografie transabdominală. Sarcină 21 s.a.+5zile.

Hidrocefalie bilaterală.
• Malformaţii congenitale de cord (MCC): Frecvenţa

aneuploidiilor din MCC variază între 29,3% şi 33% din cazuri.
Cele mai frecvente aberaţii cormozomiale întâlnite la feţii cu
MCC sunt Trisomia 21 (28,3% din cazuri), Trisomia 18
(17,4%), monosomia X (10,9%) şi alte anomalii cromozomiale
(Trisomia 13, triploidia etc.) (28,3% din cazuri).
• Hernia diafragmatică: Se asociază cu anomaliile cromozomiale
în 13,9 – 34% dintre cazuri, cel mai frecvent cu Trisomia 18.
66
• Obstrucţii gastro-intestinale: Din totalitatea obstrucţiilor gastro

- intestinale sunt asociate cu anomaliile cromozomiale 9,2 –
24% din cazuri. Atrezia duodenală este cea mai frecventă şi se
asociază cu anomaliile cromozomiale în 38% din cazuri.
Fig. 4.1.5: Ecografie transabdominală. Sarcină 25 s.a. + 2zile.

Atrezie duodenală.
• Malformaţii ale membrelor: Anomaliile cromozomiale sunt

regăsite în 5,9% dintre cazurile cu picior strâmb izolat şi în
22,2% dintre cazurile cu picior strâmb asociat cu alte anomalii,
cea mai frecventă fiind Trisomia 18. Mâna încleştată este o altă
malformaţie a membrelor asociată frecvent cu aneuploidii. Ea
este regăsită în 53% dintre cazurile cu Trisomia 18.
Incidenţa malformaţiilor fetale variază în funcţie de tipul

aneuploidiei. Astfel, malformaţiile fetale sunt diagnosticate în 20%
din cazurile cu Trisomia 21, 80% din cazurile cu Trisomia 18 şi 90%
din cazurile cu Trisomia 13.
67
Asocierea unor malformaţii fetale poate orienta diagnosticul

către un anumit tip de anomalie cromozomială:
• Pentru Trisomia 21 sunt caracteristice malformaţiile congenitale
de cord (cel mai frecvent canal atrio- ventricular), hidropsul
fetal şi/sau hygroma chistică, rareori atrezia duodenală.
• În cazurile cu Trisomia 13 cele mai frecvente malformaţii sunt
malformaţiile SNC, în special holoprozencefalia, după care
urmează anomaliile faciale (ciclopia, hipotelorismul,
despicătura labială/ palatină), displazia renală, MCC,
polidactilia, picior strâmb.
• În schimb, pentru Trisomia 18 este caracteristică o diversitate
foarte largă de anomalii.
Principii
Principiile utilizării ecografiei fetale ca metodă de diagnostic
prenatal sunt identice cu cele din cadrul screening-ului ecografic
prenatal.
Orice suspiciune de malformaţie fetală impune trimiterea
gravidei către un centru de diagnostic prenatal de grad superior, unde
se va preciza diagnosticul prenatal şi se va stabili conduita
obstetricală, apelând în funcţie de caracterul malformaţiei la
consultaţia unui specialist de profil. În cazul malformaţiilor
congenitale asociate de regulă cu patologia cromozomială, în funcţie
de vârsta gestaţională, se va lua în discuţie eventualitatea puncţiei
amniotice (cariotip fetal/ test FISH). Conduita obstetricală va fi
stabilită de comisia de etică alcătuită din ecografist, obstetrician,
neonatolog, genetician şi medicul specialist de profil.

Ca şi un cazul screeningului ecografic, în ecografia fetală de
diagnostic rolul principal revine ecografiei tradiţionale bidimen-
sionale. Important este ca să se folosească un protocol standartizat
pentru morfologie fetală în funcţie de vârsta gestaţională, iar
68
ecografistul să aibă o experienţă bună. În funcţie de tipul patologiei

fetale ecografia bidimensională poate fi completată cu un examen
Doppler (diagnostic diferenţial între retardul de creştere intrauterină
de natură vasculară şi nonvasculară).
Ecografia tridimensională (3D) are doar un rol secundar ca
metodă de diagnostic prenatal deoarece nu înlocuieşte morfologia
fetală bidimensională. Poate fi folosită doar în completarea
morfologiei fetale bidimensionale şi are o arie de aplicabilitate
restrânsă.
Ecografia 4D sau ecografia tridimensională în timp real nu
are aplicabilitate practică în diagnosticul prenatal.
Avantajele şi dezavantajele ecografiei fetale ca metodă de
screening prenatal sunt valabile şi pentru ecografia fetală ca metodă
de diagnostic prenatal. Este important ca şi în cadrul ecografiei fetale
de diagnostic examenul morfologic să se facă conform protocoalelor
de morfologie fetală standardizate, echipamentul ecografic să fie de
bună calitate, iar ecografistul să aibă o pregătire şi o experienţă bună.
De asemene, este esenţial ca medicul de familie să informeze corect
gravida şi să o dirijeze în timp util pentru efectuarea screeningului
prenatal ecografic (11 – 13 s.a., 21 – 23 s.a., 32 – 34 s.a.) şi/ sau
serologic (dublu test, triplu test).
Diagnosticul prenatal al unei patologii fetale oferă
posibilitatea ca echipa de specialişti (obstetrician, ecografist, neo-
natolog, genetician şi medic specialist de profil) să stabilească
conduita obstetricală şi neonatală, de comun acord cu părinţii. Dacă
se decide ca sarcina să-şi urmeze cursul, gravida este dirijată să nască
într-un centru prenatal unde nou- născutului i se poate acorda
asistenţa de specialitate în funcţie de diagnostic.
Adrese utile
• www.fetalmedicine.com
69
Bibliografie
• Blaas HG, Eriksson AG, Salvesen KA et al. - Brain and faces in
holoprosencephaly: pre- and postnatal description of 30 cases.
Ultrasound Obstet Gynecol 2002 Jan; 19 (1): 24-38;
• Bronsteen R, Lee W, Vettraino IM et al. - Second- trimester
sonography and trisomy 18. J Ultrasound Med 2004 Feb; 23 (2):
233-240;
• Chaoui R, Korner H, Bommer C et al. - Prenatal diagnosis of heart
defects and associated chromosomal aberrations. Ultraschall Med
1999 Oct; 20 (5): 177-184;
• Evrard PH, Belpaire MC, Boog G et al. - Diagnostic anténatal des
affections di SNC: rézultats préliminaires d’une série multi-
centrique européenne de 350 cas. J Fr Echogr 1984: 2: 123-125;
• Garne E, Haeusler M, Barisic R et al. - Euroscan study group.
Congenital diaphragmatic hernia: evaluation of prenatal diagnosis
in 20 European regions. Ultrasound Obstet Gynecol 2002 Apr; 19
(4): 329-333;
• Haeusler MC, Berghold A, Stoll C et al. - Euroscan study group.
Prenatal ultrasonographic detection of gastrointestinal
obstruction: results from 18 European congenital anomaly
registries. Prenat Diagn 2002 Joule; 22 (7): 616-623;
• Mcgahan JP, Nyberg DA, Mack LA. - Sonography of facial features
of alobar and semilobar holoprosencephaly. Am J Roentgenol 1990
Jan, 154 (1): 143-148;
• Nyberg DA. - Second Trimester Genetic Sonogram- How does it fit
in? www.comtecmed.com/cogi/cogi5/abstracts/Nyberg.doc;
• Pagnotta G, Maffulli N, Aureli S et al. - Antenatal sonographic
diagnosis of clubfoot: a six-year experience. J Foot Ankle Surg 1996
Jan-Feb; 35 (1): 67-71.
70
4.2 Amniocenteza
Dr. Puiu Maria
Definiţie
Amniocenteza este o procedură chirurgicală utilizată în cadrul
diagnosticului prenatal, care constă în aspirarea unui eşantion de
lichid amniotic, în care se găsesc celule fetale, prin intermediul unui
ac foarte fin, introdus în cavitatea amniotică, traversând peretele
abdominal, sub anestezie locală şi sub ghidaj ecografic.
Cu ajutorul amniocentezei medicii pot stabili starea de
sănătate şi de maturitate a fătului şi pot diagnostica eventualele
anomalii fetale.
Amniocenteza poate fi practicată din momentul în care
lichidul amniotic care înconjură fătul este în cantitate suficientă şi
eşantionul de care este nevoie poate fi extras în siguranţă. Vârsta de
sarcină la care se practică puncţia amniotică este de regulă 15 - 18
săptămâni de amenoree. Unele clinici şi laboratoare de citogenetică
recomandă intervenţia chiar la vârste mai precoce (12-14 săptămâni
de amenoree).
Ea face parte, împreună cu biopsia de trofoblast sau biopsia de
vilozităţi coriale (coriocenteza) şi puncţia cordonului ombilical fetal
(cordocenteza) din metodele invazive de diagnostic prenatal (vezi
Fig. 4.2.1).
Indicaţii
Amniocenteza permite efectuarea de teste pentru următoarele
tipuri de afecţiuni:
• Anomalii cromozomice – prin efectuarea cariotipului din
celulele fetale;
• Boli ereditare monogenice – prin dozări biochimice sau teste
moleculare ce utilizează ADN-ul extras din celulele fetale;
• Infecţii fetale (Toxoplasmoză, Citomegalovirus) – prin
efectuarea de teste imunologice pe proba de lichid amniotic;
71
• Defecte de tub neural – prin dozarea acetilcolinesterazei şi a

AFP în lichidul amniotic (împreună cu ecografia fetală).
Fig. 4.2.1 : Ilustrarea diverselor căi posibile de acces spre embrion, pentru
necesităţi diagnostice : 1- Embrion ; 2- Cavitate amniotică ; 3- Cavitate
corială ; 4- Cavitate uterină ; 5- Vilozităţi coriale ; A- Amniocenteză ; B.
Puncţie de vilozităţi coriale (PCV) traversând peretele abdominal ; C.
Puncţie a cordonului ombilical (V. ombilicală) ; D. Puncţie de vilozităţi
coriale (PCV) pe cale vaginală
Amniocenteza este indicată sistematic în următoarele situaţii:

• când gravida se apropie sau depăşeşte vârsta de 40 de ani (în
unele ţări investigaţia este propusă gravidelor peste 35 de ani, în
altele celor peste 38 de ani), întrucât riscul de trisomie 21 este
considerat crescut. Riscul de a avea un copil cu anomalie
cromozomială, în special trisomie 21 (Sindrom Down) este
prezent la femeile de orice vârstă, dar după vârsta de 35 de ani
72
riscul creşte semnificativ şi relativ rapid. O mamă de 35 de ani

are un risc de 1/240 de a avea un copil cu trisomie 21; la 40 ani,
acest risc este de 1/70.
Amniocenteza depistează în egală măsură şi anomaliile altor
perechi de cromozomi, riscul fiind de asemenea corelat cu
vârsta gravidei (vezi Tabel 4.2.1).
Tabel 4.2.1: Corelaţia vârstă maternă - risc de anomalii cromozomiale

Vârsta Trisomie Trisomie Trisomie
maternă 21 18 13
15 - 19 1:1.600 1:17.000 1:33.000
20 - 24 1:1.400 1:14.000 1:25.000
25 - 29 1:1.100 1:11.000 1:20.000
30 - 34 1:700 1:7.100 1:14.000
35 - 39 1:240 1:2.400 1:4.800
40 - 44 1:70 1:700 1:1.600
45 - 49 1:20 1:650 1:1.500
• când unul din părinţi prezintă o anomalie cromozomică

Unii părinţi sunt purtători ai unei remanieri cromozomice
(anomalie cromozomică echilibrată), fără consecinţe pentru ei,
dar care pot conduce la o anomalie cromozomială dezechilibrată
la copiii lor, cu apariţia de manifestări clinice specifice. În
general este vorba de o situaţie cunoscută de familie, depistată
în urma naşterii unui copil cu anomalie cromozomială şi cariotip
anormal sau cu ocazia investigaţiilor efectuate pentru precizarea
etiologiei unor avorturi spontane repetate sau a sterilităţii
cuplului;
73
• când ecografia antenatală screening evidenţiază la făt o

malformaţie sugestivă pentru o anomalie cromozomială. Feţii
purtători ai unei anomalii cromozomiale prezintă frecvent
malformaţii ce pot fi depistate ecografic. Astfel, screeningul
ecografic antenatal urmăreşte aspecte morfologice sugestive
pentru anomaliile cromozomiale, cum ar fi translucenţa nucală
fetală, măsurată în săptămâna 12 de sarcină (dacă este mai mare
de 3 mm sugerează diagnosticul de Sindrom Down);
• dozarea unor substanţe în sângele matern, care pot sugera o
eventuală anomalie cromozomială la făt (triplu test anormal).
În 5 - 8 % din cazuri testele indică o creştere a riscului şi
justifică investigaţii suplimentare, printre care şi amniocenteza ;
• Amniocenteza tardivă, efectuată în cursul celui de-al treilea
trimestru de sarcină permite urmărirea evoluţiei unei sarcini cu
risc crescut (incompatibilitate Rh etc.) sau dacă se suspectează
o malformaţie digestivă sau neurologică sau pentru identificarea
unei eventuale suferinţe fetale care necesită o intervenţie:
o nivelul celulelor liniei eozinofile denotă gradul de maturitate
a tegumentelor;
o nivelul creatininei relevă gradul de maturitate a rinichilor;
o raporturile lecitină/ sfingomielină sau acid palmitic/ acid
stearic relevă gradul de maturitate a plămânilor.
Principii
Principiul diagnosticului prenatal constă în prelevarea
celulelor fetale şi efectuarea investigaţiilor în scopul decelării
eventualelor boli genetice, cum ar fi trisomia 21.
Amniocenteza este precedată de o examinare ecografică atentă
pentru a stabili numărul de fetuşi, conformaţia şi viabilitatea fetală,
vârsta gestaţională, poziţia placentei, volumul aproximativ al
lichidului amniotic şi locul puncţiei (în funcţie de placentă şi de
fetus). Sub ghidaj ecografic (Fig. 4.2.2) se introduce transabdominal
un ac de puncţie rahidiană până în cavitatea amniotică. Primii
mililitri de lichid amniotic se îndepărtează (pot fi contaminaţi cu
74
celule materne) şi apoi se aspiră într-o seringă aproximativ 15 - 20

ml de lichid amniotic (câţiva mililitri în cazul amniocentezei
precoce). După amniocenteză se observă ecografic bătăile cordului
fetal şi starea gravidei. Această intervenţie durează câteva secunde şi
uneori se renunţă chiar şi la anestezia locală. După prelevare
viitoarea mamă se poate reîntoarce acasă, fiind sfătuită să evite
pentru câteva ore efortul şi să se odihnească.
Principalele complicaţii ale amniocentezei sunt: riscul de
inducere a avortului (1%), scurgerile mici de lichid amniotic,
infecţiile şi lezarea fătului. În plus, amniocenteza precoce poate
determina risc de detresă respiratorie a nou născutului sau deformări
ortopedice benigne.
Fig. 4.2.2 : Ecografia permite reperarea fătului şi prelevarea de lichid

amniotic în siguranţă. Imagine - poziţia acului de puncţie, ghidat ecografic
Amniocenteza permite realizarea unui cariotip, pornind de la
celulele prezente în lichidul amniotic şi verificarea cromozomilor
copilului care se va naşte.
75
Dacă rezultatele sunt normale ele liniştesc şi încurajează

gravida, excluzând un anumit număr de probleme. În acelaşi timp,
nu toate malformaţiile şi anomaliile sunt legate de modificări vizibile
ale cromozomilor. Şi în ultimă instanţă, dacă este descoperită o
anomalie cromozomială, de exemplu trisomia 21, decizia unei
eventuale întreruperi a sarcinii aparţine doar părinţilor. Din acest
motiv, se recomandă ca amniocenteza să fie precedată de o şedinţa
de sfat genetic şi să fie practicată doar gravidelor care intenţionează
să înrerupă sarcina dacă suspiciunea care a recomandat
amniocenteza se confirmă şi fătul este afectat.

Principalele investigaţii efectuate din lichidul amniotic sunt:
• Analiza cromozomilor utilizând cultura de lungă durată:
Celulele fetale conţinute în lichidul amniotic sunt cultivate şi
păstrate în incubator timp de 7-10 zile. Cariotipul poate fi
efectuat când celulele s-au multiplicat suficient. Se analizează
cel puţin 16 - 20 de celule obţinute din culturi diferite ale
aceluiaşi produs. Este nevoie în medie de 10 - 14 zile pentru a
obţine un rezultat definitiv. În cazuri foarte rare poate fi
necesară o nouă prelevare (confirmarea unui rezultat, eşec de
cultură). Această metodă permite în egală măsură evidenţierea
anomaliilor cromozomiale de număr, dar şi a unor anomalii
cromozomice structurale, suspectate sau nu;
• Metoda de analiză directă, prin FISH (Fluorescent In Situ
Hybridisation): Această investigaţie, chiar dacă este parţială
(foloseşte doar sonde pentru cromozomii 13, 18, 21, X şi Y) şi
preliminară, permite obţinerea de rezultate rapide (depistează
70% dintre anomaliile cromozomiale în mai puţin de 48 de ore)
şi precise. Se obţin informaţii privind anomaliile cromozomice
grosiere cum sunt trisomiile 21, 18, 13 sau trisomiile
cromozomilor sexuali (XXY, XXX sau XYY), respectiv
monosomia X (sindromul Turner). Principalul dezavantaj constă
în faptul că nu se depistează anomaliile structurale (se folosesc
celule în interfază, deci se apreciază numai numărul de
cromozomi marcaţi prin numărarea punctelor fluorescente, nu se
76
vizualizează cromozomii pentru a le aprecia morfologia). Un alt

dezavantaj ar fi preţul crescut al testului;
• Evaluarea aneuploidiilor (anomalii de număr ale cromozomilor
13, 18, 21, X şi Y) prin tehnica MLPA - se extrage ADN din
celulele fetale şi se practică tehnica MLPA (vezi Cap. 6.5).
Principalele avantaje constau în preţul scăzut al testului şi
obţinerea unui rezultat în 24 ore. Dezavantajul major constă în
faptul că nu sunt evaluaţi toţi cromozomii şi nu se evidenţiază
anomaliile cromozomiale de structură ;
• Dozarea alfa-fetoproteinei : Creşterea alfa-fetoproteinei,
prezentă normal în cantitate mică în lichidul amniotic atrage
atenţia asupra unei posibile malformaţii fetale la nivelul
sistemului nervos sau a peretelui abdominal. Dozarea alfa-
fetoproteinei în lichidul amniotic prelevat prin amniocenteză se
efectuează sistematic, chiar în absenţa unui risc particular.
Atunci când există suspiciunea de defect de tub neural se
practică suplimentar şi dozarea acetilcolinesterazei în lichidul
amniotic ;
• Teste moleculare specifice : În cazul în care într-o familie
există o boală monogenică pentru care sunt disponibile teste
moleculare de diagnostic, la o sarcină cu risc se poate practica
amniocenteza, se extrage ADN din celulele fetale şi se fac
testele moleculare.
Concluziile studiilor cromozomice sunt de o fiabilitate aproape
absolută dacă numărul şi calitatea celulelor amniotice obţinute sunt
suficiente.
Un test ca amniocenteza, prin consecinţele pe care le implică,
nu poate fi impus. Avantajele şi inconvenientele testului trebuie să
fie discutate în prealabil, cu ambii parteneri, în prezenţa medicului
ginecolog care urmăreşte gravida sau care a recomandat consultul
genetic. Decizia amniocentezei aparţine gravidei, dar obligatoriu în
urma consultării geneticianului, care va pune la dispoziţie cuplului
toate informaţiile necesare unei bune înţelegeri a testului şi va
77
acorda sfatul genetic adecvat. Cu această ocazie gravida va semna

consimţământul de a se supune acestei intervenţii, informată fiind
asupra interesului medical al investigaţiei, asupra limitelor sale, a
complicaţiilor şi riscurilor intervenţiei.
Complicaţiile posibile ale amniocentezei sunt extrem de rare,
riscul fiind uşor crescut în cazul amniocentezei precoce.
Limitele testului constau în faptul că prin efectuarea unei
amniocenteze obişnuite se depistează numai anomaliile cromozo-
miale, nu şi cele ale genelor. Nu există la ora actuală nici un depistaj
de rutină al bolilor genice (cum ar fi mucoviscidoza sau miopatiile).
Dacă acest tip de boală este prezent într-o familie, diagnosticul este
adesea posibil utilizând lichidul amniotic, dar la nivel molecular (pe
ADN). În aceste condiţii este important să se recurgă la consultul
genetic, care va permite să se stabilească cea mai adecvată metodă
de diagnostic prenatal, în funcţie de boala şi mutaţia genică
suspectată.
Alte dezavantaje ale amniocentezei constau în costul ridicat,
eficienţa scăzută, perioada lungă până la obţinerea rezultatelor,
folosirea numai de celule vii care se divid, precum şi necesitatea de
personal înalt calificat.
Adrese utile:
• http://www.gfmer.ch/Guidelines/Depistage_prenatal_fr/Depistage_pre
natal_mt.htm
• http://www.chu-rouen.fr/ssf/diag/echographieprenatale.html
ATAL.html
• http://familydoctor.org/online/famdocen/home/women/pregnancy/fetal
/144.html#ArticleParsysMiddleColumn0003
Bibliografie
• Caughey A., Hopkins L., Norton M., Chorionic Villus Sampling
Compared With Amniocentesis and the Difference in the Rate of
Pregnancy Loss, Obstet. Gynecol., Sep 2006; 108: 612 – 616;
78
• Chiang H-H, Y-M (Yu) Chao, and Y-S Yuh, Informed choice of
pregnant women in prenatal screening tests for Down’s syndrome,
J. Med. Ethics, May 2006; 32: 273 – 277;
• Cleary-Goldman J., Morgan M., Malone F. et al., Screening for Down
Syndrome: Practice Patterns and Knowledge of Obstetricians and
Gynecologists, Obstet. Gynecol., Jan 2006; 107: 11 – 17;
medicală, p 533. Editura Polirom, 2004;
• Neilson J., Zarko Alfirevic, Optimising prenatal diagnosis of
Down's syndrome, BMJ, Feb 2006; 332: 433 – 434;
• Sweeney E., Genetic disorders and the fetus: diagnosis, prevention,
and treatment, 5th edition, Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed., Jul
2005; 90: 351;
• Vaisbuch E., Zvi Appelman, Chorionic Villus Sampling Compared

With Amniocentesis and the Difference in the Rate of Pregnancy
Loss, Obstet. Gynecol., Jan 2007; 109: 205.
79
80
4.3 Puncţia de vilozităţi corionice

Dr. Puiu Maria
Definiţie
Puncţia vilozităţilor corionice (PCV) sau coriocenteza este o
metodă invazivă de diagnostic prenatal, care este utilizată la debutul
sarcinii (perioada embrionară). Cel mai adesea este vorba de
prelevarea transvaginală, prin intermediul unui ac de biopsie, urmată
de examinarea în preparat direct sau în cultură de scurtă durată.
Coriocenteza permite realizarea unui cariotip, pornind de la
celulele vilozităţilor corionice (care vor forma placenta) şi analizarea
cromozomilor copilului care se va naşte. Această analiză mai este
recomandată pentru identificarea unei boli existente în familie,
determinate de o mutaţie genică, pentru care este posibil diagnosticul
prenatal.
Indicaţii
Puncţia vilozităţilor corionice (PCV) permite obţinerea
următoarelor informaţii:
• Diagnosticul aberaţiilor cromozomiale;
• Determinarea prenatală a sexului;
• Diagnosticul tulburărilor ereditare de metabolism;
• Diagnosticul bolilor ereditare monogenice (exemplu fibroza
chistică sau mucoviscidoza);
• Determinări imunogenetice (haplotipurile HLA).
Indicaţiile obişnuite ale puncţiei vilozităţilor corionice sunt
asemănătoare cu cele ale amniocentezei:
• Vârsta maternă avansată (peste 35 de ani): riscul de a avea un
copil cu o anomalie cromozomială, în special trisomia 21, care
este cea mai frecventă, creşte cu vârsta mamei;
81
• Când există o anomalie cromozomială la unul din părinţi:

Unul din părinţi poate fi purtător al unei anomalii cromozomiale
echilibrate, fără consecinţe clinice pentru el, dar care poate
conduce la apariţia unor copii cu anomalii cromozomiale
dezechilibrate şi cariotip anormal, la avorturi spontane repetate
sau sterilitate;
• Când se depistează antenatal o anomalie ecografică: Feţii cu
anomalii cromozomice prezintă mai frecvent, dar nu obligatoriu,
malformaţii vizibile ecografic. Dacă aceste malformaţii sunt
detectate în primul trimestru de sarcină, pentru confirmare şi
precizarea diagnosticului, se recomandă puncţia vilozităţilor
corionice;
• Atunci când în familie există o boală ereditară pentru care
depistarea prenatală este posibilă: La ora actuală nu există un
depistaj sistematic de rutină al bolilor ereditare date de o
anomalie situată la nivelul unei gene (boli monogenice ca
mucoviscidoza sau miopatiile). Dacă o boală a fost
diagnosticată în prealabil în familie, puncţia vilozităţilor
corionice poate fi utilizată cu scopul de a stabili diagnosticul
prenatal al acestei boli. Este vorba de situaţii particulare,
specifice fiecărei familii, care trebuie discutate cu genitorii, cu
ocazia consultaţiilor genetice prealabile.
Principii
Coriocenteza se bazează pe principiul că celulele corionice au
aceiaşi origine cu celulele fătului, deci aceleaşi caracteristici
genetice. Prelevarea lor este efectuată în săptămânile 10 - 12 de
sarcină, deci este un examen foarte precoce comparativ cu
amniocenteza (săptămâna 15 - 18 de sarcină).
Calea de abord este transcervicală (cu un catater flexibil) sau
transabdominală (cu un ac de puncţie rahidiană) sub ghidaj
ecografic, în funcţie de localizarea placentei.
Proba conţine atât celule fetale, cât şi celule din decidua
maternă, care trebuie îndepărtate cu grijă înainte de analiză.
82
Celulele trofoblastice pot fi utilizate pentru identificarea de

anomalii cromozomiale fie prin analiză directă, fie după o cultură de
scurtă durată (rezultatele fiind disponibile în 4 - 7 zile).
După o zi de cultură şi o alta pentru pregătirea tehnică sunt
examinate 15 - 20 de celule corionice aflate în diviziune.
O amniocenteză poate fi indicată dacă calitatea preparatului
este nesatisfăcătoare sau dacă rezultatul investigaţiei cromozomiale
trebuie confirmat.
În unele cazuri celulele corionice sunt utilizate pentru
investigaţii moleculare (atunci când într-o familie există o boală
monogenică şi mutaţia este cunoscută).
Principalele complicaţii ale biopsiei de vilozităţi corionice
sunt: sângerări (40%), avort (1 - 2%), producerea unor malformaţii
ale membrelor (anomalii transverse) şi feţei când este practicată
înaintea săptămânii a 10-a de sarcină.
Concluziile investigaţiilor cromozomice nu sunt posibile
dacă numărul şi calitatea celulelor obţinute nu sunt satisfăcătoare. Se
cunosc rare cazuri în care în produsul prelevat se găsesc celule
provenind de la mamă, ceea ce duce la interpretări eronate. Şi în
cazul diagnosticului molecular este verificată sistematic originea
fetală a produsului analizat.
Literatura de specialitate citează cazuri de mozaicism feto-
placentar în care există o neconcordanţă între formula cromozomică
a fătului şi cea din placentă.
La fel ca şi în cazul amniocentezei, preparatul direct din
celulele corionice permite obţinerea unui rezultat în 24 de ore,
privind aberaţiile cromozomiale grosiere cum sunt trisomiile 21, 18,
13 sau trisomiile cromozomilor sexuali (sindrom Klinefelter, triplu
X sau XYY), respectiv monosomia X (sindrom Turner). Dacă
preparatul direct eşuează, se poate recurge la analiza celulelor cu
ajutorul metodei de fluorescenţă (FISH).
Culturile de celule corionice permit evidenţierea unor
anomalii cromozomiale structurale, precum şi confirmarea
anomaliilor surpinse în preparatul celular direct.
83
Dacă rezultatele investigaţiilor efectuate pe celulele

corionice sunt normale, gravida va fi liniştită că o parte din
suspiciuni au fost eliminate. Ea va fi informată că nu toate
malformaţiile şi anomaliile sunt cauzate de modificări vizibile ale
cromozomilor, iar dacă suspiciunea evoluţiei anormale a fătului
persistă, se vor căuta alte investigaţii care să stabilescă diagnosticul
şi să precizeze starea de sănătate a acestuia.
Pe de altă parte, dacă a fost descoperită o anomalie
cromozomială, de exemplu trisomia 21 (sindromul Down), decizia
eventualei întreruperi a sarcinii aparţine integral părinţilor, după ce
aceştia au primit toate informaţiile legate de evoluţia, complicaţiile
şi prognosticul acestei boli.

Pentru analiza celulelor obţinute prin puncţia de vilozităţi
corionice pot fi utilizate diferite metode:
• analiza cromozomică – fie prin examen direct, fie după cultură
de scurtă durată; sunt depistate anomalii cromozomice numerice
şi structurale;
• FISH – se folosesc sonde specifice cromozomilor 13, 18, 21, X
şi Y şi se identifică anomaliile cromozomiale de număr ale
acestora; costul este ridicat, nu se pot identifica toţi cromozomii
şi nici anomaliile structurale;
• Teste biochimice – se pot aplica tehnici de imunohistochimie pe
fragmentul obţinut prin puncţia de vilozităţi corionice în vederea
aprecierii statusului fătului (afectat sau nu de o boală
metabolică); tehnica se aplică atunci când în familie este stabilit
un diagnostic precis de boală metabolică;
• Teste moleculare – atunci când în familie este prezentă o boală
monogenică pentru care sunt disponibile teste moleculare şi
mutaţia este cunoscută.
După prelevarea celulelor corionice, ca urmare a inserţiei
cateterului poate avea loc o sângerare care în 99% din cazuri se
84
opreşte rapid şi spontan. Durerile abdominale provocate de

contracţiile uterine cedează la scurt timp după terminarea puncţiei.
Riscul de avort spontan este de 1 - 2%, iar perioada în care poate
surveni este săptămâna de după intervenţie.
În 1 - 2% din cazuri, anomaliile cromozomice decelate prin
coriocenteză nu sunt reflectarea cromozomilor fătului (anomaliile
sunt localizate la nivelul placentei şi un sunt prezente la făt,
mozaicism feto- placentar). Aceste rezultate vor fi explicate
părinţilor în cadrul unui consult genetic, în care se va recomanda o
verificare a cariotipului fătului prin amniocenteză.
Biopsia de trofoblast poate răspunde aceloraşi indicaţii ca şi
amniocenteza, în special în suspiciunile de anomalii cromozomiale,
oferă aceleaşi informaţii, dar rezultatele sunt obţinute mai rapid.
Dacă trebuie luată o decizie în privinţa întreruperii sarcinii, ea va fi
mai uşor acceptată şi psihologic mai blândă pentru gravidă decât
dacă aceeaşi decizie ar trebui să aştepte pînă în trimestrul doi de
sarcină.
Fiind un test invaziv, care implică şi unele riscuri, chiar dacă
minore, coriocenteza nu poate fi impusă. Avantajele, inconveni-
entele şi limitele sale trebuie clar explicate partenerilor de către
echipa de specialişti care asigură urmărirea sarcinii, efectuează
puncţia şi acordă consult şi sfat genetic. Alegerea testului,
coriocenteză sau amniocenteză, va ţine cont de sugestiile
specialiştilor, dar rămâne o decizie pe care cuplul o ia în cunoştinţă
de cauză.
Geneticianul este cel care acordă cuplului toate informaţiile de
care are nevoie pentru o bună înţelegere a testelor propuse şi se
asigură că ei au decis în cunoştinţă de cauză. Consimţământul scris
este obligatoriu şi va fi semnat de către gravidă şi medicul genetician
care a consiliat-o.
În ceea ce priveşte recomandările specialiştilor privind locul
amniocentezei şi coriocentezei în diagnosticul prenatal părerile sunt
împărţite. Unii acuză amniocenteza că este prea tardivă: data ideală
pentru practicarea amniocetezei este de 15 - 16 săptămâni.Tehnica
fiind mai veche este şi mai bine pusă la punct şi rezultatele ei mai
exacte. În schimb, nu poate fi practicată la orice vârstă a sarcinii,
amniocenteza prea precoce expunând la un risc ceva mai mare
85
pentru eşecul tehnic sau de cultură. Practicată la 12 - 13 săptămâni,

ea devine un concurent serios pentru puncţia de vilozităţi corionice,
care are, teoretic, un risc ceva mai mare de avort spontan.
Adrese utile
• http://www.rcog.org.uk/resources/Public/pdf/aminiocentesis_chorionic
jan2005.pdf
• http://www.gfmer.ch/Guidelines/Depistage_prenatal_fr/Depistage_pre
natal_mt.htm
• http://www.chu-rouen.fr/ssf/diag/echographieprenatale.html
ATAL.html
• http://familydoctor.org/online/famdocen/home/women/pregnancy/fetal
/144.html#ArticleParsysMiddleColumn0003
Bibliografie
• Caughey A., Hopkins L., Norton M., Chorionic Villus Sampling
Compared With Amniocentesis and the Difference in the Rate of
Pregnancy Loss, Obstet. Gynecol., Jan 2007; 109; 205-206;
• Chi C., Kadir R., Management of women with inherited bleeding
disorders in pregnancy, Obstet Gynaecol (Lond), Jan 2007; 9: 27 –
33;
• Chiang H-H, Chao Y-M, Yuh Y-S, Informed choice of pregnant
women in prenatal screening tests for Down’s syndrome, J. Med.
Ethics, May 2006; 32: 273 – 277;
medicală, p 533 - 534. Editura Polirom, 2004;
• Neilson J., Alfirevic Z., Optimising prenatal diagnosis of Down's
syndrome, BMJ, Feb 2006; 332: 433 – 434;
• Vaisbuch E., Appelman Z., Chorionic Villus Sampling Compared
With Amniocentesis and the Difference in the Rate of Pregnancy
Loss, Obstet. Gynecol., Jan 2007; 109: 205.
86
4.4 Identificarea de celule fetale şi ADN fetal

liber în circulaţia maternă
Dr. Rusu Cristina
Definiţie
În domeniul diagnosticului prenatal tendinţa actuală este de a
utiliza tehnici neinvazive (care să nu aibă efecte negative asupra
fătului) şi care să fie cât mai performante.
Izolarea de celule fetale din circulaţia maternă este o tehnică
neinvazivă, dar laborioasă (trebuie izolate câteva celule fetale dintr-o
multitudine de celule materne). Metoda constă în separarea
eritrocitelor nucleate fetale de celulele sanguine materne, urmată de
aplicarea tehnicii FISH interfazic pe celulele fetale. Dezavantajul
major constă în persistenţa prelungită a celulelor fetale în circulaţia
maternă, după aplicarea metodei putând fi izolate celule de la o
sarcină anterioară.
Izolarea de ADN fetal liber din circulaţia maternă este de
asemenea o tehnică neinvazivă, mai avantajoasă decât prima
deoarece cantitatea de ADN fetal liber pare să fie mai mare decât cea
corespunzătoare celulelor fetale existente în circulaţie femeii
însărcinate. Metoda este mai puţin laborioasă şi constă în
amplificarea prin Real time PCR a ADNului fetal folosind de obicei
amorse specifice genei SRY (pentru identificarea sexului) sau genei
pentru antigenul D ce determină grupul sanguin Rh (în cazul
femeilor Rh– cu anticorpi antiRh, deci cu risc de a avea un copil cu
boala hemolitică a noului născut). Tehnica are avantajul că ADNul
fetal nu persistă în circulaţia maternă, deci ADNul fetal izolat şi
analizat provine cu siguranţă de la sarcina actuală. Aplicaţiile acestei
metode sunt relativ limitate deocamdată, dar se extind rapid.
Recent a fost introdusă o nouă metodă – izolarea ARNm
fetal din plasma maternă, pentru analiză fiind folosită tehnologia
microarray.
Ambele tehnici sunt metode moderne de diagnostic prenatal,
care încă nu sunt aplicate pe scară largă, aflându-se încă în stadiul de
cercetare. Ameliorarea condiţiilor tehnice şi scăderea preţului testării
87
vor duce cu siguranţă la aplicarea lor în practică, ele reprezentând

unele dintre puţinele metode neinvazive de diagnostic prenatal.
IZOLAREA DE CELULE FETALE DIN CIRCULAŢIA

MATERNĂ
Indicaţii
Izolarea de celule fetale din circulaţia maternă este o tehnică
indicată a fi folosită în următoarele situaţii majore:
• Atunci când testele de screening (ecografia şi screeningul
serului matern) ridică suspiciunea unei anomalii cromozomiale
(cel mai frecvent Sindromul Down). Dacă şi în urma aplicării
acestei metode persistă suspiciunea de trisomie 21 la făt, este
indicată aplicarea de tehnici invazive de diagnostic de tipul
amniocentezei sau biopsiei de vilozităţi corionice;
• Stabilirea sexului fetal în boli legate de cromozomul X care se
manifestă numai la băieţi;
• La femeile Rh- care au anticorpi antiRh care ar putea avea un
copil afectat de boala hemolitică a noului născut. Pe celulele
fetale izolate se aplică tehnica PCR cu amorse pentru gena ce
codifică antigenul Rh;
• Mai rar pentru boli monogenice precum sicklemia sau
talasemia.
Eritroblastele fetale ar putea fi cultivate şi utilizate în
vederea realizării unui cariotip (pentru diagnosticarea anomaliilor
cromozomiale structurale), dar metodologia exactă încă nu a fost
pusă la punct.
Principii
Momentul optim de aplicare a acestei metode de diagnostic
prenatal pare să fie la 15 săptămâni de gestaţie. Numărul de celule
fetale din circulaţia maternă scade în trimestrul III de sarcină.
88
Este necesară recoltarea a 8- 20 ml sânge de la femeia

gravidă.
Datorită prezenţei de celule fetale în circulaţia maternă,
femeia însărcinată reprezintă o formă de microhimerism. Factorii
care pot influenţa microhimerismul sunt: histocompatibilitatea,
anomaliile fetale sau placentare şi istoricul reproductiv (avorturi
spontane şi întreruperi de sarcină). Microhimerismul se asociază cu
unele boli materne autoimune, cum ar fi scleroza sistemică. Mai
mult, în ţesuturile materne afectate pare să se diferenţieze o populaţie
nouă de celule fetale (pregnancy- associated progenitor cells, PAPC).
De-a lungul timpului au fost luate în discuţie diferite tipuri
de celule fetale care să fie utilizate pentru testare:
• Eritroblastele par să fie cele mai avantajoase deoarece ele sunt
abundente în sângele fetal precoce şi extrem de rare în sângele
adultului normal;
• Celulele trofoblastice care intră în circulaţia maternă sunt
filtrate de plămânii materni şi deci nu pot fi folosite pentru
diagnostic prenatal; în schimb, alţi autori au reuşit să izoleze
celule epiteliale (trofoblastice) la 11- 12 săptămâni de gestaţie
printr-o metodă de sortare în funcţie de mărime;
• Leucocitele fetale sunt prezente în sângele matern, dar într-un
număr foarte scăzut şi au perioada de înjumătăţire foarte lungă,
ceea ce poate duce la contaminare cu celule de la sarcinile
anterioare.
Aproximativ 1/ 1.000- 10.000.000 din celulele nucleate din
circulaţia maternă sunt fetale. Pentru a putea aplica teste genetice de
diagnostic este necesară îmbunătăţirea concentraţiei de celule fetale
la 1/ 10- 100. Cele mai folosite tehnici sunt Sortarea celulară
magnetică (MACS) sau Sortarea celulelor activate fluorescent
(FACS) după ataşarea de anticorpi marcaţi magnetic sau fluorescent
pe markeri de suprafaţă specifici celulelor fetale. Anticorpul folosit
în mod obişnuit este anti-CD71. Sortarea celulară magnetică este mai
ieftină, mai rapidă şi necesită mai puţină experienţă decât FACS.
Pentru separarea celulelor mai poate fi folosită şi Citometria de flux.
89
Tehnica MACS presupune parcurgerea următoarelor etape:

• Separarea iniţială a celulelor prin centrifugare în gradient triplu
de densitate. Proba de sânge matern se pune într-un tub care
conţine 3 reactivi (pe bază de glucide) cu densităţi diferite.
Amestecul se centrifughează. Stratul din mijloc va conţine
eritroblastele şi granulocitele neutrofile. Se aspiră într-un tub
separat stratul mijlociu, cu mare atenţie pentru a nu produce
amestecul celulelor din straturi diferite;
• Celulele sunt apoi incubate cu anticorpul CD71 marcat magnetic
(fixat pe o bilă metalică). Complexul celulă- anticorp- bilă este
separat prin plasarea pe un magnet.
Proba rezultată în urma separării nu poate fi folosită pentru
analize citogenetice tradiţionale deoarece este încă puternic
contaminată cu celule materne. De aceea se preferă aplicarea
tehnicii de FISH interfazic folosind sonde specifice pentru
cromozomii 21, 18, 13, X şi Y. În cazul testării pentru evaluarea
sexului fetal se recomandă folosirea a 2 markeri de pe cromozomul
Y în combinaţie cu o sondă specifică pentru cromozomul X pentru
siguranţa detectării materialului fetal.
Cel care face examinarea urmăreşte numărul de puncte
fluorescente în fiecare nucleu – în mod normal trebuie să fie câte 2
puncte pentru fiecare sondă (vezi FISH interfazic).
Pentru interpretarea cazurilor de suspiciune de Sindrom
Down a fost stabilit un anumit prag – dacă mai mult de 3% din nuclei
au 3 semnale, atunci rata de depistare a cazurilor de trisomie 21 este
97%, cu o rată a cazurilor fals- pozitive de 13%. Valori similare au
fost obţinute pentru trisomiile 18 şi 13.
În afară de variantele menţionate mai sus, în literatură mai
sunt citate următoarele variante:
90
• Separarea iniţială a celulelor fetale prin centrifugare în gradient

de densitate (ca mai sus) urmată de depleţie CD45/CD14 şi
selecţia celulelor CD71 pozitive din celulele CD45/CD14
negative;
• Selecţia CD71 direct din sângele integral – pare să fie cu 4
ordine de mărime mai eficientă decât metoda clasică;
• Micromanipularea celulelor fetale, care sunt supuse amplificării
PCR fluorescente a 3 markeri STR (short tandem repeats) ai
cromozomului 21 (în cazul suspiciunii de Sindrom Down) sau
markeri STR pentru cromozomul Y (2) şi X (1) (în cazul
necesităţii stabilirii sexului fetal).
Izolarea celulelor fetale din circulaţia maternă prezintă
avantajul de a fi o metodă neinvazivă de diagnostic prenatal.
Principalele dezavantaje se referă la faptul că tehnica este
laborioasă şi costisitoare.
IZOLAREA DE ADN FETAL LIBER DIN

CIRCULAŢIA MATERNĂ
Indicaţii
Izolarea de ADN fetal din circulaţia maternă presupune
efectuarea de Real time PCR folosind amorse specifice (atât pentru
depistarea, cât şi pentru evaluarea cantităţii de ADN fetal).
Indicaţiile majore sunt aceleaşi ca şi la izolarea de celule
fetale din circulaţia maternă. Deci:
• Identificarea sexului fetal – se folosesc amorse specifice
cromozomului Y (pentru depistarea băieţilor) şi polimorfisme
ale cromozomului X moştenite de la tată (pentru depistarea
fetelor);
• Depistarea aneuploidiilor – se folosesc markeri STR (short
tandem repeat) de pe cromozomii 21, 18, 13;
91
• Evaluarea grupului Rh la femei Rh- care au risc de a avea un

copil cu boala hemolitică a noului născut; se folosesc amorse
specifice genei D;
• Diagnosticul prenatal al bolilor autosomal recesive (fibroză
chistică, hiperplazia congenitală de suprarenală) – se caută
markeri corespunzători alelei normale de la tată;
• Diagnosticul prenatal al bolilor autosomal dominante
(distrofie miotonică, acondroplazie, boală Huntington) – se
caută markeri corespunzători alelei anormale de la tată.
Principii
Momentul optim de aplicare a acestei metode de diagnostic
prenatal pare să fie la 8 săptămâni de gestaţie, deşi ADNul fetal se
poate depista în circulaţia maternă încă de la 5 săptămâni.
Posibilitatea unui diagnostic prenatal atât de precoce reprezintă un
avantaj major al tehnicii.
Este necesară recoltarea a 0,5- 1 ml sânge de la femeia
gravidă. ADNul fetal este stabil în proba de sânge în primele 24 ore
după recoltare.
ADNul fetal nu persistă mult timp în circulaţia maternă, ceea
ce furnizează siguranţa că ADNul izolat şi testat provine de la
sarcina actuală.
Concentraţia absolută în plasma şi serul matern este aceeaşi,
dar cantitatea relativă de ADN fetal este mai scăzută în ser decât în
plasmă. Deci, plasma este preferată faţă de ser pentru testare. În plus,
plasma poate fi obţinută imediat după recoltarea sângelui prin
centrifugare.
Metoda constă în efectuarea Real time PCR pe proba de
plasmă maternă folosind amorse specifice pentru celulele fetale (vezi
capitol PCR).
O problemă majoră este diferenţierea ADNului fetal din
plasma maternă de ADNul matern. Pentru rezolvare se caută markeri
epigenetici în plasma maternă bazaţi pe metilarea diferenţiată a
anumitor gene. Pentru locusul IGF H19 alela fetală moştenită de la
mamă este nemetilată şi poate fi diferenţiată (prin conversie cu
92
bisulfit şi PCR specific metilării) de alela moştenită de la tată, care

este metilată. Ulterior alelele fetale metilate diferenţiat pot fi
detectate prin secvenţiere directă şi măsurarea extensiei amorsei.
Amplificarea amorselor specifice certifică prezenţa situaţiei
respective la făt. De exemplu, în cazul unei boli recesive legate de X
(care afectează numai băieţii), dacă folosim amorse specifice
cromozomului Y (SRY, DYS14, DYZ3 sau DAZ) şi se produce
amplificarea, înseamnă că fătul este de sex masculin.
Studii din literatură au remarcat situaţii concrete în care se
produce modificarea cantităţii de ADN fetal din circulaţia maternă:
• În preeclampsie – s-a observat că iniţial creşte în circulaţia
maternă cantitatea de ADN liber fetal, apoi şi cea de ADN liber
matern şi abia după câteva săptămâni apar simptomele clinice;
tehnica ar putea fi folosită pentru monitorizarea sarcinilor;
• Similar, în avortul spontan atât ADNul liber fetal, cât şi ADNul
total în circulaţia maternă sunt crescute de 4 – 5 ori faţă de
sarcinile normale; folosind o valoare limită de 1,6 MoM pentru
ADNul total se poate prezice avortul spontan în 98,2% din
cazuri, cu o rată a cazurilor fals pozitive de 4,7%, iar dacă se
foloseşte limita de 1,8 MoM pentru ADNul fetal se depistează
97% din cazuri, cu 44,3% cazuri fals pozitive;
• În sarcina cu făt cu aneuploidie cantitatea de ADN liber fetal
din circulaţia maternă pare să fie crescută de aproape 2 ori faţă
de sarcinile normale;
• Cantitatea de ADN fetal din circulaţia maternă pare să varieze
invers proporţional cu greutatea maternă.
Tehnica de extracţie a ADN şi optimizarea ciclurilor PCR
sunt 2 factori majori ce pot influenţa succesul metodei.

În literatură mai sunt citate următoarele variante:
93
• Spectrometria de masă MALDI-TOF pentru analiza cantitativă

specifică a ADN şi ARNm fetal;
• PCR digital pentru detecţia moleculară a aneuploidiilor fetale.
Izolarea ADNului fetal din circulaţia maternă prezintă
avantajul de a fi o metodă neinvazivă de diagnostic prenatal. În plus,
tehnica poate fi aplicată foarte precoce, este simplă şi robustă şi
necesită o cantitate mică de sânge matern.
Principalul dezavantaj se referă la costul aparaturii.
Adrese utile
• http://www.fetalmedicine.com/11-14scanbook
Bibliografie
• Angert Robert, LeShane Erik, Lo Dennis et al. – Fetal Cell- free
Plasma DNA Concentrations in Maternal Blood are Stable 24
Hours after Collection: Analysis of First and Third- Trimester
Samples, Clinical Chemistry 49, 195-198, 2003;
• Babochkina Tatiana, Mergenthaler Susanne, Maier Dinges Tatyana et
al. – Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal
using a combination of two different Y chromosome- specific FISH
probes and a single X chromosome- specific probe, Archives of
Gynecology and Obstetrics vol 273, nr 3, 2005;
• Benachi Alexandra, Steffann Julie, Gautier Evelyne et al. – Fetal
DNA in metarnal serum: does it persist after pregnancy? Human
Genetics vol 113, no 1, July 2003, p 76-79;
• Bischoff Farideh, Sinacori Mina, Dang Dianne et al. – Cell- free fetal
DNA and intact fetal cells in maternal blood circulation:
implications for first and second trimester noninvasive prenatal
diagnosis, Human Reproduction Update vol 8, no 6, pp 493-500,
2002;
• Christensen Britta, Philip John, Kolvraa Steen et al. – Fetal Cells in
Maternal Blood: A Comparison of Methods for Cell Isolation and
Identification, Fetal Diagnosis and Therapy 2005; 20: 106-112;
94
• Chunming Ding, Yuk Ming Dennis – MALDI-TOF Mass

Spectrometry for Quantitative, Specific and Sensitive Analysis of
DNA and RNA, Ann NY Acad Sci 1075: 282-287 (2006);
• Farina Antonio, LeShane Erik, Lambert Messerlian Geralyn et al. –
Evaluation of Cell-free Fetal DNA as a Second Trimester
Maternal Serum Marker of Down Syndrome Pregnancy, Clinical
Chemistry 49: 2, 239-242 (2003);
• Hahn Sinuhe, Zhong Xiao Yan, Burk Martin et al. – Multiplex and
Real- Time Quantitative PCR on Fetal DNA in Maternal Plasma:
A comparison with Fetal Cells Isolated from Maternal Blood, Ann
NY Acad Sci 906: 148-152 (2000);
• Hahn Sinuhe, Holzgreve Wolfgang – Fetal cells and cell- free fetal
DNA in maternal blood: new insights into preeclampsia, Human
Reproduction Update, vol 8, no 6, pp 501-508, 2002;
• Khosrotehrani Kiarash, Bianchi Diana – Multi- lineage potential of
fetal cells in maternal tissue: a legacy in reverse, Journal of Cell
Science 118, 1559-1563 (2005);
• Lo Dennis – Fetal DNA in Maternal Plasma, Ann NY Acad Sci 906:
141-147 (2000);
• Lo Dennis, Leung Tse, Tein Mark et al. – Quantitative
Abnormalities of Fetal DNA in Maternal Serum in Preeclampsia,
Clinical Chemistry 45: 2, 184-188 (1999);
• Lo Dennis, Lun Fiona, Chan Allen et al. – Digital PCR for the
molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy, PNAS vol
104, no 32, pp 13116-13121, August 7, 2007;
• Rijnders Robbert, Christiaens Godelive, Bossers Bernadette et al. –
Clinical Applications of Cell- Free Fetal DNA From Maternal
Plasma, American College of Obstetricians and Gynecologists vol
103, no 1, January 2004;
• Rodriguez de Alba M., Palomino P., Gonzalez- Gonzalez C. Et al. –
Prenatal diagnosis on fetal cells from maternal blood: practical
comparative evaluation of the first and second trimesters, Prenat
Diagn 2001 Mar; 21 (3): 165-70;
• Saha Biswajit – The diagnostic potential of maternal plasma in
detecting fetal diseases by DNA test, Indian J Hum Genet 2004 vol
10, issue 2, pp 41-45;
95
• Samura Osamu, Sohda Satoshi, Johnson Kirby et a. – Diagnosis of

Trisomy 21 in Fetal Nucleated Erythrocytes from Maternal Blood
by Use of Short Tandem Repeat Sequences, Clinical Chemistry 47:
9, 1622-1626 (2001);
• Satiroglu Tufan Lale, Tufan Cevik, Kareli Babur et al. – Analysis of
Cell- Free Fetal DNA from Maternal Plasma and Serum Using a
Conventional Multiplex PCR: Factors Influencing Success, Turk J
Med Sci 35 (2005) 85-92;
• Stanghellini I., Bertorelli R., Capone L. Et al. – Quantitation of fetal
DNA in maternal serum during the first trimester of pregnancy by
the use of a DAZ repetitive probe, Molecular Human Reproduction
vol 12, no 9, pp 587-591, 2006;
• Vona Giovanna, Beroud Cristophe, Benachi Alexandra et al. –
Enrichment, Immunomorphological and Genetic Characterization
of Fetal Cells Circulating in Maternal Blood, Am J of Pathology
2002; 160: 51-58;
• Wachtel S., Shulman L., Sammons D. – Fetal cells in maternal
blood, Clinical Genetics, vol 59, issue 2, page 74-79, February 2001;
• Wataganara Tuangsit, Peter Inga, Messerlian Geralyn et al. – Inverse
Correlation Between Maternal Weight and Second Trimester
Circulating Cell- Free Fetal DNA Levels, American College of
Obstetricians and Gynecologists vol 104, no 3, September 2004;
• Yin Aihua, Ng Ehy, Zhang Xiangzhong et al. – Correlation of
maternal plasma total cell- free DNA levels with short term
outcoma of first- trimester vaginal bleeding, Hum Reprod Advance
Access published online on April 7, 2007.
96
Tehnici de diagnostic postnatal
5 TEHNICI CITOGENETICE DE
DIAGNOSTIC POSTNATAL
5.1 Cromatina sexuală
Biol. Grămescu Mihaela
TESTUL CROMATINEI X
Definiţie
Testul cromatinei X (testul Barr) presupune evidenţierea
cromozomului X inactiv, care formează un corpuscul de hetero-
cromatină (corpuscul Barr) vizibil la microscopul optic pe faţa
internă a membranei nucleare a celulelor interfazice.
Indicaţii
Testul cromatinei X este utilizat:
• la nou născuţii cu stare intersexuală pentru stabilirea rapidă a
sexului genetic (XX sau XY), care va permite declararea corectă
a sexului civil, diagnosticarea tipului de stare intersexuală
(premisă obligatorie pentru tratamentul chirurgical) şi educarea
corespunzătoare a copilului;
• în cazul anomaliilor de dezvoltare a caracterelor sexuale
secundare la pubertate pentru diagnosticarea unor anomalii de
număr sau de structură a cromozomului X (Sindroamele
47,XXY; 48,XXXY; 45,X; 47,XXX; 46,X,i(Xq), etc).
Testul cromatinei X a mai fost utilizat pentru depistarea

prenatală a sexului genetic al unui embrion în cazul în care mama
este purtătoarea unei gene mutante recesive gonosomale (pe care o
poate transmite la 50% din băieţi) şi în medicina legală pentru a
stabili provenienţa feminină sau masculină a unor pete de sânge,
fragmente de ţesut, etc. În cazul acestor situaţii, testul cromatinei
97
sexuale a fost înlocuit cu metode moderne de diagnostic molecular

prenatal (inclusiv identificarea genei mutante), respectiv cu metode
de realizare a “amprentei ADN”.
Principii
Etapele tehnicii cromatinei X sunt:
• recoltarea celulelor şi realizarea frotiurilor: analiza cromatinei
X se face de preferinţă în celulele mucoasei bucale sau în
polimorfonuclearele neutrofile, dar şi în celulele amniotice, în
celulele bulbului pilos, celule tumorale, etc. Celulele epiteliului
bucal sunt raclate cu ajutorul unei lame rodate de pe obraji sau
buza inferioară şi apoi etalate pe lame de sticlă;
• fixarea frotiurilor cu amestec de alcool etilic 96º/ eter etilic
(1:1);
• hidratarea are ca scop îndepărtarea fixatorului şi recuperarea
apei pierdute în timpul fixării. Se realizează prin trecerea
frotiurilor prin două băi succesive de alcool de 70º şi respectiv
50º şi două de apă distilată;
• hidroliza acidă urmăreşte îndepărtarea bacteriilor existente pe
lamă şi se realizează prin incubarea lamelor într-o baie de HCl
5N;
• colorarea lamelor se realizează cu carbol - fucsină, după
îndepărtarea acidului clorhidric prin spălare cu apă distilată.
După colorare se spală lamele cu alcool (care decolorează
citoplasma) şi apoi cu apă de robinet;
• examinarea frotiurilor la microscopul optic cu obiectivul de
imersie şi filtru verde.
Corpusculii Barr au o morfologie bine definită: au în medie 1
micron (µm), sunt coloraţi în roşu carmin intens, localizaţi pe faţa
internă a membranei nucleare, au formă ovalară (vezi Fig. 5.1.1) sau
plan convexă (mai rar triunghiulară, sferică sau în halteră).
Se analizează 300 de celule favorabile (ce corespund unor
criterii bine stabilite), se evaluează mărimea şi numărul corpusculilor
98
Barr şi în final se calculează procentul de celule cromatin pozitive.
Pe buletinul de analiză se va menţiona dacă testul Barr este pozitiv
sau negativ şi se va preciza procentul doar în cazul frecvenţelor mai
mici de 10%.
În practică, la o persoană normală de sex feminin, frecvenţa
celulelor cromatin pozitive este cuprinsă în medie între 20 - 35%,
chiar dacă teoretic toţi nucleii au corpusculi Barr. Această diferenţă
este dată de calitatea improprie a unor celule de pe lama cu frotiu (se
analizează doar celulele favorabile), dar probabil şi unor factori
celulari care produc decondensarea cromozomului X, fără a afecta
inactivarea lui (stări patologice, vârstă, diferite tratamente).
Fig. 5.1.1: Aspectul cromatinei X în celule de mucoasă bucală
99
Numărul de corpusculi Barr (CB) se calculează după
formula:
Număr CB = numărul de cromozomi X – 1
Aplicând formula de mai sus, în condiţii normale, persoanele de
sex feminin au un singur corpuscul Barr (test Barr pozitiv), iar la
persoanele de sex masculin lipsesc corpusculii (test Barr negativ).
Pornind de la numărul de corpusculi Barr se poate calcula
numărul de cromozomi X din fiecare celulă: numărul cromozomilor
X este mai mare cu 1 decât cel al corpusculilor Barr (vezi Tabel
5.1.1). Datorită acestor particularităţi testul cromatinei X este folosit
pentru stabilirea sexului genetic.
În anumite stări patologice, atât la femei, cât şi la bărbaţi,
testul Barr poate evidenţia, fie o modificare a numărului de
corpusculi Barr, fie a mărimii acestora (vezi Fig. 5.1.2):
Tabel 5.1.1: Interpretarea Testului Barr

Număr Sex masculin Sex feminin
corpusculi Cariotip Diagnostic Cariotip Diagnostic
Barr
0 46,XY Normal 45,X Turner
1 47,XXY Klinefelter 46,XX Normal
2 48,XXXY Klinefelter 47,XXX Triplu X
3 49,XXXXY Klinefelter 48,XXXX Poli X
1 < 1µm 46,XiXp Turner
1 > 1µm 46,XiXq Turner
1, % ↓ 45,X/46,XX Turner
mozaic
• fără corpuscul Barr: 45,X (sindrom Turner), 46,XY (sindrom

Morris – femei XY);
• un corpuscul Barr: 47,XXY (sindrom Klinefelter);
• doi corpusculi Barr: 47,XXX (sindrom triplu X), 48,XXXY
(sindrom Klinefelter);
100
• corpuscul Barr mai mare de 1µm: 46,X,i(Xq) (izocromozom X
de braţ lung);
• corpuscul Barr mai mic de 1µm (0,7 - 0,8µm): în cazul
deleţiilor la nivelul braţului scurt sau lung al cromozomului X
sau a izocromozomului X de braţ scurt;
• test Barr pozitiv, dar cu valori reduse în cazul monosomiei X în
mozaic.
(a) (b) (c)
Fig. 5.1.2: Variante ale cromatinei X în celule de mucoasă bucală: (a) 0

corpusculi (test Barr negativ); (b) 2 corpusculi; (c) 1 corpuscul mare
Avantajele utilizării acestui test sunt determinate de:
rapiditatea efectuării lui, costurile reduse şi dotarea tehnică
minimală.
Dintre dezavantajele acestuia amintim:
• dificultatea de identificare a mozaicurilor cromozomiale, a
anomaliilor de structură a gonosomilor;
• imposibilitatea identificării anomaliilor autosomilor;
• permite punerea unui diagnostic orientativ, pentru obţinerea
unor rezultate exacte şi a unor diagnostice precise fiind necesară
efectuarea cariotipului (studiul cromozomilor);
• este un test subiectiv, interpretarea lui ţinând de experienţa
examinatorului.
101
TESTUL CROMATINEI Y
Definiţie
Testul cromatinei Y presupune evidenţierea, prin colorare cu
diferiţi fluorocromi (ex. Quinacrina), a capătului terminal al
cromozomului Y, vizibil la microscopul cu fluorescenţă sub forma
corpusculului F.
Indicaţii
Ca şi testul cromatinei X, şi testul cromatinei Y este util
pentru determinarea sexului genetic în stările intersexuale la nou
născut, dar şi pentru diagnosticarea anomaliilor numerice
gonosomale. Comparativ cu testul cromatinei X, acesta se foloseşte
mai rar, deoarece presupune existenţa unui microscop cu
fluorescenţă şi diagnosticul cert este stabilit numai după efectuarea
cariotipului. În prezent, în laboratoarele modern utilate se foloseşte
metoda FISH interfazic cu sonde pentru cromozomii X şi Y, şi care
pune un diagnostic de certitudine.
Principii
Pentru evidenţierea corpusculului F trebuie parcurse
următoarele etape:
• recoltarea celulelor de pe mucoasa bucală şi efectuarea
frotiurilor pe lame de sticlă. Se pot efectua frotiuri şi din alte
tipuri de celule aflate în interfază: celule din cordonul ombilical,
din firul de păr, etc.
• fixarea preparatelor în etanol;
• colorarea lamelor cu frotiu în soluţie de quinacrină, la întuneric;
• spălarea lamelor pentru oprirea colorării şi îndepărtarea
excesului de colorant cu soluţie tampon McIlvaine;
• acoperirea lamelor cu lamele de sticlă şi citirea lor la
microscopul cu fluorescenţă (cu filtru pentru quinacrină).
102
Cromatina F apare sub forma unui corpuscul fluorescent de
aproximativ 0,25µm, strălucitor, situat în interiorul nucleului sau
ataşat de membrana acestuia şi corespunde celor 2/3 distale din
braţul lung al cromozomului Y.
Trebuie menţionat că mărimea corpusculului F variază în
funcţie de mărimea segmentului de heterocromatină: de la foarte mic,
până la de trei ori mai mari decât media.
Numărul de corpusculi F este egal cu numărul de cromozomi
Y existenţi în nucleu, deci o persoană normală de sex masculin va
avea în nucleu un singur corpuscul F, iar o persoană normală de sex
feminin, având doi cromozomi X, va avea testul negativ (nu are
cromozom Y, deci nici corpuscul F).
Frecvenţa celulelor cromatin Y pozitive depinde de tehnica
aplicată şi de ţesutul studiat şi este situată între 35-100%.
În cazul celulelor aflate în interfază, se pot descrie
următoarele situaţii:
• celule cu un singur corpuscul F: celulă masculină normală sau
celule 46,XY la o persoană cu sex civil feminin (sindrom
Morris, femei XY, insensibilitate la androgeni);
• celule cu doi corpusculi F: sindrom 47,XYY.
Analizarea cromatinei Y marcată fluorescent poate da

rezultate:
• fals negative, atunci când cantitatea de heterocromatină de pe
cromozomul Y este foarte mică, sau
• fals pozitive deoarece regiunile pericentromerice ale
cromozomilor acrocentrici apar la microscop sub forma unor
spoturi fluorescente, putând fi astfel confundate cu corpusculul
F.
Din aceasta cauză este obligatorie efectuarea cariotipului,
care va confirma sau nu suspiciunea de diagnostic stabilită prin
utilizarea testului cromatinei Y.
103
Bibliografie
• Barch M., The Act Cytogenetics. Laboratory Manual, second
edidion Raven Press, New York, 1991;
• Covic M., D Ştefănescu, I. Sandovici, Genetica Medicală, p 33-35,
308, Ed. Polirom, 2004;
• Gorduza E. V., C. Rusu, M. C. Buhuşi, Genetica Umană. Manual de
lucrări practice, Ed. Kolos Group, 2003;
• Moore KL, Barr ML. Smears from the oral mucosa in the detection
of chromosomal sex. Lancet.1955; II:57 – 58;
• Popescu P., H. Hayes, B. Dutrillaux, Tehniques de cytogenetique
animale, INRA Paris, 1998;
• Verma R. S., A. Babu, Human Chromosomes. Manual of Basic
Tehniques, Pergamon Press, New York, Oxford, Berlin,1989;
• Wegner R. D., Diagnostic cytogenetics, Springer Verlag Berlin
Heidelberg, New York, 1999.
104
5.2 Cariotipul
Dr. Puiu Maria
Definiţie
Cariotipul este aranjamentul standard al cromozomilor unei
celule realizat cu scopul de a detecta anomaliile cromozomiale
numerice sau structurale, omogene sau în mozaic, ale autozomilor
sau ale gonozomilor.
Acest examen se poate realiza folosind diferite tipuri de
celule: limfocite sangvine, celule tumorale (sau din măduva osoasă
hematogenă), fibroblaşti din piele, celule germinale, celule amniotice
sau trofoblast, în funcţie de indicaţie.
Metoda presupune obţinerea de celule în diviziune (cultură
de celule sau recoltare din ţesuturi ce se divid activ), celulele
respective fiind apoi prelucrate în mai multe etape succesive
(blocarea diviziunii în metafază, hipotonizare, fixare, etalare pe lamă
şi colorare). Ulterior cromozomii sunt fotografiaţi şi dispuşi în
perechi de cromozomi omologi după criterii standard, acest
aranjament purtând numele de cariotip.
Indicaţii
Stabilirea indicaţiei de cariotip presupune un examen clinic
atent, care permite adesea suspectarea anomaliei, întrucât pierderea
sau câştigarea unui segment cromozomic determină un tablou clinic
adesea stereotip, cu o dismorfie caracteristică.
În general, anomaliile autozomilor au consecinţe mai grave
decât anomaliile gonosomilor. Anomaliile omogene sunt mai grave
decât mozaicurile, iar anomaliile totale sunt mai grave decât cele
parţiale.
Majoritatea anomaliilor cromozomice asociază cel puţin
două dintre următoarele caracteristici:
• Înălţime anormală, de obicei hipostatură (talie sub -2,5 deviaţii
standard);
• Întârziere a dezvoltării sau retard mintal de grade variabile, de
obicei moderat/ sever (QI<50);
105
• Sterilitate sau infertilitate (incapacitatea de a avea descendenţi/

avorturi spontane/ nou născuţi morţi);
• Anomalii congenitale multiple (3/>);
• Anomalii ale dermatoglifelor.
Pricipalele INDICAŢII ale cariotipului sunt :

• Retard mintal cu/ fără tulburări de comportament;
• Ambiguitate sexuală la naştere – se face întâi test Barr, apoi
cariotip;
• Dezvoltare anormală a caracterelor sexuale secundare la
pubertate - se face întâi test Barr, apoi cariotip;
• Cupluri sterile – cupluri fără descendenţi după cel puţin 2 ani
fără mijloace contraceptive; se face cariotip la ambii membri ai
cuplului;
• Avorturi – cele de cauză genetică sunt precoce (primele 2 luni
de sarcină), spontane şi repetate (cel puţin 2); se face cariotip la
părinţi şi din produsul de avort (dacă este posibil);
• Nou născuţi morţi - se face cariotip la părinţi şi la făt (dacă este
posibil);
• Copii plurimalformaţi – 3/ mai multe anomalii congenitale;
• Unul dintre părinţi purtător de anomalie cromozomică
echilibrată;
• Cancer şi leucemii – cariotipul are valoare prognostică;
• Expunere profesională sau accidentală la mutagene –
cariotipul ajută la depistarea anomaliilor care în general
predispun la apariţia cancerului;
• Diagnostic prenatal – verificarea cromozomilor fătului fie
datorită vârstei materne avansate (mai mult de 35-38 ani), fie
datorită prezenţei unei anomalii cromozomice echilibrate în
familie.
106
Principalele CONTRAINDICAŢII ale cariotipului sunt:
• Boli monogenice – dominante/ recesive, autosomale/ legate de
X, cum ar fi hipercolesterolemia familială, fibroza chistică sau
hemofilia; defectul este prea mic pentru a fi depistat;
• Boli multifactoriale – de exemplu cardiopatia ischemică,
hipertensiunea arterială sau diabetul zaharat; sunt determinate
de mai multe defecte mici plus acţiunea nefavorabilă a
mediului;
• Anomalii congenitale izolate (unice) – sunt determinate de
mediu;
• Boli mitocondriale – defectul este în ADN-ul mitocondrial, nu
în cel din nucleu care se condensează sub formă de cromozomi.
Principiile metodei
La specia umană cromozomii sunt vizibili numai în timpul
diviziunii celulare (metafază sau prometafază). Tehnicile
convenţionale de cariotip vizează obţinerea unui maxim de celule
blocate în acest stadiu. Rezoluţia citogeneticii clasice este cea a
microscopiei fotonice şi nu poate depăşi 5100 pb.
Tehnica de cariotipare cuprinde o serie de etape succesive:
• Prelevarea celulelor de la pacient – cel mai frecvent sânge
(limfocite) obţinut prin puncţie venoasă; se mai pot recolta
fibroblaste din piele sau celule ale măduvei osoase hematogene,
cele din urmă putând fi utilizate direct, fără cultură de celule în
prealabil;
• Cultivarea celulelor in vitro, împreună cu un stimulator al
diviziunii (fitohemaglutinina – PHA), 24 - 48 de ore la 36ºC;
• Blocarea diviziunii în metafază prin adăugarea de colchicină
(Fig. 5.2.1);
• Hipotonizare – apa din soluţie intră în celule şi produce
dispersarea cromozomilor;
• Fixarea cromozomilor – pentru a avea acelaşi aspect ca în stare
vie;
107
• Etalarea celulelor din suspensia fixată, pe o lamă de sticlă, în

vederea observării la microscop;
• Marcajul în benzi: preparatul este în final colorat. Cea mai
clasică şi utilizată colorare este coloraţia Giemsa, care
antrenează, după aplicarea unui tratament specific apariţia de
benzi alternante, întunecate şi clare, pe toată suprafaţa
cromozomilor : “marcaj G”.
Fig. 5.2.1: Cromozomi în metafază
Topografia benzilor este caracteristică fiecărui cromozom şi

permite identificarea lor. Cei doi cromozomi ai aceleiaşi perechi au
aceeşi topografie a benzilor.
Benzile G se obţin prin denaturare enzimatică (tripsină) şi
permit vizualizarea a 300- 500 benzi pe lot haploid de cromozomi.
Benzile colorate sunt formate din heterocromatină, iar cele clare din
eucromatină.
108
• Analiza metafazelor la microscop, cu alegerea celor cu
cromozomi lungi, dispersaţi şi nesuprapuşi;
• Fotografierea câmpului microscopic în care este prinsă o
metafază;
• Decuparea cromozomilor din fotografie;
• Aranjarea cromozomilor (pe o hârtie specială cu numere) în
perechi de omologi după criteriile standard, în scopul
identificării anomaliilor numerice sau structurale (Fig. 5.2.2).
Fig. 5.2.2: Cariotip masculin, normal, 46, XY
Cele mai multe laboratoare folosesc astăzi metode moderne

de cariotipare şi programe computerizate care facilitează investigarea
şi cresc substanţial sensibilitatea rezultatelor.

Principalele metode ce mai pot fi folosite pentru analiza
globală a structurii cromozomilor sunt:
• Alte tipuri de marcaj în benzi:
109
o Q ← Quinacrină; benzile au aceaşi distribuţie ca în marcajul

G, dar preparatul trebuie examinat la microscopul cu
fluorescenţă;
o R ← Reverse (invers); benzile au distribuţie inversă faţă de
marcajul G şi Q („negativ”); benzile colorate sunt formate
din eucromatină, iar cele clare din heterocromatină; se obţin
prin denaturare termică;
o C ← Centromer; tehnica evidenţiază heterocromatina consti-
tutivă de la nivelul centromerului;
o T ← Telomer;
o NOR ← Organizatori nucleolari (sateliţi); metoda foloseşte
impregnaţia argentică.
• Tehnicile de înaltă rezoluţie sunt mai dificil de realizat şi
interpretat decât cariotipul standard, dar permit punerea în
evidenţă a anomaliilor de talie mult mai redusă. Studiul
celulelor în prometafază prin sincronizare culturilor şi
adăugarea de bromo- dezoxiuridină (BrdU) face posibilă
modificarea proprietăţilor tinctoriale ale benzilor cromozomice,
permiţând ameliorarea rezoluţiei cariotipului şi observarea a 550
- 850 benzi pe lot haploid de cromozomi (prometafază şi
respectiv profază).
• Tehnicile pentru evidenţierea situsurilor fragile au fost folosite
în trecut pentru diagnosticul Sindromului X fragil, dar după
introducerea tehnicilor moleculare tehnica a fost folosită din ce
în ce mai rar. Pentru evidenţierea situsurilor fragile fie se
foloseşte un mediu de cultură special (fără ser de viţel), fie se
adaugă la mediul de cultură Metotrexat;
• Cariotipul realizat din fibroblaste din piele: de obicei se
realizează în anomalii pigmentare cutanate în lungul liniilor
Blaschko, atunci când se bănuieşte existenţa unui mozaic
diploid/ triploid. Se recoltează o biopsie cutanată, ulterior
fragmentul fiind tritrurat pentru a separa celulele. Cultura este
de durată mai lungă şi necesită schimbarea periodică a mediului
de cultură.
110
Toate anomaliile cromozomiale sunt identificate şi înscrise
în formula cromozomică, cu ajutorul unor simboluri şi abrevieri,
stabilite prin consens internaţional (ISCN : International System for
human Cytogenetic Nomenclature) permiţând definirea precisă a
constituţiei cromozomiale a unui individ.
Formula cromozomică este modalitatea de exprimare a
rezultatului unui cariotip şi ea va include următoarele date:
• Cariotip normal: numărul total de cromozomi din celulă,
enumerarea cromozomilor sexuali (XX pentru sexul feminin şi
XY pentru sexul masculin); exemplu: 46,XY;
• Anomalii de număr ale autosomilor: numărul total de
cromozomi din celulă, enumerarea cromozomilor sexuali, +/- şi
numărul cromozomului implicat; exemplu: 47,XX,+21;
• Anomalii de număr ale gonosomilor: numărul total de
cromozomi din celulă, enumerarea tuturor cromozomilor
sexuali; exemplu: 47,XXY;
• Anomalii de structură: numărul total de cromozomi din celulă,
enumerarea cromozomilor sexuali, simbolul internaţional pentru
anomalia de structură şi numărul cromozomului implicat;
simbolurile pentru cele mai frecvente anomalii de structură sunt:
o t: translocaţie reciprocă echilibrată (schimb de fragmente
între 2 cromozomi);
o rob: translocaţie robertsoniană (2 cromozomi acrocentrici
uniţi la nivelul centromerului);
o ins: inserţie (un fragment dintr-un cromozom este inserat în
mijlocul unui alt cromozom);
o inv: inversie (un fragment dintr-un cromozom este aşezat
invers);
o del: deleţie (lipsa unui fragment dintr-un cromozom);
o dup: duplicaţie (un fragment cromozomic este prezent de 2
ori pe acelaşi cromozom);
111
o r: cromozom inelar (capetele unui cromozom se pierd, iar

capetele fragmentului rămas se unesc şi formează o structură
inelară);
o i: isocromozomi (cromozomi formaţi din 2 braţe identice);
o dic: cromozomi dicentrici (cromozomi ce au 2 centromere);
o fra: situs fragil.
Metoda are avantajul de a nu fi extrem de invazivă (puncţie
venoasă, puncţie sternală), nu foarte costisitoare, în raport cu alte
metode de investigare genetică. Fiind mai ales o metodă generală,
care identifică orice anomalie cromozomială, suficient de amplă,
pentru situaţiile în care rezultatul nu este edificator se va propune şi
realiza o metodă de investigare mai aprofundată.
Cariotipul standard permite decelarea remanierilor
cromozomiale, constituţionale sau câştigate care afectează cel puţin o
bandă cromozomială, adică în jur de 10 3 - 104 kb.
Adrese utile
• http://www.kumc.edu/gec/prof/cytogene.html
• http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman.
Bibliografie
• American College of Medical Genetics, Standards and Guidelines for
Clinical Genetics Laboratories, 2006 Edition.
• Covic M., D Ştefănescu, I. Sandovici, Genetica Medicală, p 41-46,
308, Ed. Polirom, 2004;
• Robert M. Silver, Fetal Death, Obstet. Gynecol., Jan 2007; 109: 153 -
167.
112
5.3 Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)

Dr. Skrypnyk Cristina
Definiţie
Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este o tehnică de
citogenetică moleculară care permite localizarea unei secvenţe
specifice de ADN într-un cromozom.
Indicaţii
• identificarea microdeleţiilor şi microduplicaţiilor cromozomi-
ale, suspectate clinic sau citogenetic;
• identificarea şi descrierea translocaţiilor criptice şi a
remanierilor complexe;
• identificarea rearanjamentelor subtelomerice la pacienţii cu
retard mintal idiopatic (FISH subtelomeric);
• detecţia sexului genetic sau a unor aneuploidii în nucleii
interfazici (FISH interfazic);
• determinarea originii cromozomilor marker;
• evaluarea unui mozaicism;
• identificarea rearanjamentelor cromozomiale complexe din
hemopatiile maligne şi tumorile neoplazice solide.
Principii
Principiul de bază al tehnicii FISH constă în hibridizarea prin
complementaritate, a unei sonde de ADN monocatenar, marcată
fluorescent, cu o anumită regiune a unui cromozom; prin microscopie în
fluorescenţă se identifică apoi dacă proba fluorescentă s-a legat de
segmentul specific ţintă din cromozom (vezi Fig. 5.3.1).
113
Fig. 5.3.1: Tehnica FISH (modificat după Strachan şi Read,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books)
Metodă
• obţinerea sondei de ADN prin izolarea de ADN pur şi marcarea
sa fluorescentă prin incorporarea unui fluorocrom; marcarea
ADN se poate face prin procedee enzimatice sau prin reacţia
PCR; sondele pot fi de tip secvenţe de ADN uman repetate în
tandem sau de tip secvenţe unice; principalele tipuri de sonde
FISH folosite în practică sunt:
o sonde specifice unui anumit locus dintr-un anumit
cromozom (BAC = bacterial artificial chromosome, YAC =
yeast artificial chromosome, cosmide);
o sonde centromerice (alfoide): sunt utilizate pentru
identificarea centromerului unui anumit cromozom,
114
identificarea cromozomilor marker, a anomaliilor
cromozomiale numerice în nucleii interfazici;
o sonde telomerice: au specificitate pentru regiunile telomerice
şi subtelomerice şi sunt utilizate pentru identificarea
anomaliilor structurale telomerice (asociate cu retardul
mintal);
o sonde pentru un cromozom specific (whole-chromosome-
painting probes) sau un braţ cromozomial specific
(chromosome-arm-painting probes);
o sonde de ADN complementar (ADNc) folosite pentru
localizarea genelor pe cromozom;
o sonde de ARN (complementare ARNm) folosite în studiul
preparatelor histologice.
Ţintele sunt multiple:

o ADN din cromozomii metafazici;
o ADN din nucleii interfazici ai celulelor fetale – se folosesc
sonde pentru cromozomii 21, 18, 13, X şi Y;
o Molecule de ADN „alungite” în prealabil prin procedee
fizice şi chimice – variantă folosită pentru FISH pe fibre
cromatidiene;
o Întregul cromozom – variantă folosită pentru „chromo-some
painting” sau cariotiparea spectrală (SKY);
o Întregul genom – variantă folosită în hibridizarea genomică
comparativă (CGH);
o ARNm din preparate histologice.
• obţinerea preparatelor de cromozomi metafazici, tratarea lor
enzimatică (pentru creşterea accesibilităţii sondei de ADN şi
reducerea cantităţii de citoplasmă);
• adăugarea sondei de ADN marcate cu fluorocromi, urmat de
denaturarea termică a preparatului cromozomial;
115
• hibridizarea sondei de ADN cu ADN ţintă de pe preparatul

cromozomial prin incubare la 37ºC, timp de 16 - 48 de ore
(timpul de incubare variază în funcţie de tipul de sondă
folosită);
• spălarea post-hibridizare a preparatului cromozomic cu
formamidă şi soluţie salină SSC (sodium chloride, sodium
citrate) pentru îndepărtarea excesului de sondă;
• vizualizarea sondei de ADN prin examinare la microscopul cu
fluorescenţă şi prelucrare digitală a imaginilor obţinute.
• absenţa semnalului fluorescent indică deleţia zonei
cromozomiale studiate;
• prezenţa a două semnale fluorescente distincte pe locusul studiat
indică o duplicaţie;
• identificarea semnalelor de hibridizare pe cromozomi diferiţi
permite identificarea translocaţiilor;
• utilizând ADN ţintă din cromozomii metafazici, nivelul de
rezoluţie al testului FISH este de 1-3Mb.

• FISH interfazic: proba de ADN este aplicată pe un preparat
care conţine celule în interfază (nuclei intacţi); procesul de
hibridizare este similar celui pentru preparatele metafazice;
semnalele de hibridizare apar sub formă de puncte fluorescente
în interiorul nucleilor; hibridizarea sondelor de ADN specifice
unor cromozomi (21, 18, 13, X şi Y) cu nuclei interfazici
permite diagnosticul prenatal rapid (fără cultură) al celor mai
frecvente anomalii de număr ale cromozomilor respectivi, fără
să fie nevoie de efectuarea cariotipului (figura 5.3.2 B); nivelul
de rezoluţie este de 100 kb;
• FISH pe fibre cromatidiene (ECF FISH): proba de ADN este
aplicată pe un preparat care conţine molecule de ADN în
116
prealabil "alungite" prin procedee fizice sau chimice; deşi
procedeul e simplu, el este extrem de minuţios şi delicat, putând
fi aplicat doar în laboratoare specializate; rezoluţie sub 5 kb;
Fig. 5.3.2: Exemple de rezultate FISH

A. (sus) FISH metafazic, deleţie 7q11.3 ( Sindrom Williams); Sonda LSI
ELN (1x semnal oranj), sonda de control (2x semnal verde);
B. (jos) FISH interfazic, diagnostic prenatal, trisomie 21; două semnale
verzi ( cromozomii 13), trei semnale roşii ( cromozomii 21).
• Whole-Chromosome Painting (colorarea unui cromozom
întreg): hibridizarea unei sonde specifice anume aleasă cu un
cromozom întreg; tipic se utilizează două culori astfel încât un
117
set normal de cromozomi metafazici are fiecare pereche de

cromozomi diferit colorată;
• M FISH (FISH multiplex, multicolor FISH): se utilizează
mai multe seturi de probe care conţin cantităţi diferite din
markerii fluorescenţi (galben, roşu, verde), fiecare cromozom
având o culoare specifică; pentru analiză se utilizează un soft
special cantitativ; diferenţele de culoare din structura unui
cromozom indică anomalii de structură, de tipul translocaţiilor
sau inserţiiilor; metoda permite identificarea markerilor
cromozomiali şi a originii acestora; tehnica nu este aplicabilă
pentru nuclei interfazici, iar hibridizarea poate dura 2 -3 zile;
• M FISH centromeric (CM FISH): permite identificarea
anomaliilor cromozomiale care implică regiunea centromerului;
semnalul de hibridizare este foarte puternic, nu sunt necesare
cantităţi mari de sonde de ADN şi timpul de hibridizare este
scurt (0,5 ore); nu se pot diferenţia centromerii cromozomilor 13
şi 21 şi nu se pot identifica markerii cromozomiali care nu
conţin secvenţe de tip microsateliţi;
• M FISH centromeric interfazic (iCM FISH): permite
identificarea aneuploidiilor în nuclei interfazici şi nu necesită
culturi celulare;
• Cariotip cu modificarea culorii (Color changing karyotyping,
CCK): tehnica permite identificarea tuturor cromozomilor
folosind numai 3 fluorocromi; se lucrează în 2 etape succesive:
iniţial se face hibridizare cu nucleotide marcate fluorescent şi se
înregistrează imaginea; ulterior se face o nouă hibridizare cu
anticorpi marcaţi care detectează haptenele, înregistrându-se din
nou imaginea; a doua fluorescenţă este mult mai intensă,
colorând-o pe prima; prin compararea celor 2 imagini se poate
identifica fiecare cromozom în parte; se poate folosi orice
microscop cu fluorescenţă şi numai 3 filtre; captarea imaginii se
poate face cu un aparat foto digital obişnuit, iar analiza imaginii
se poate face cu programe obişnuite (Adobe Photoshop) pe orice
calculator;
118
Fig. 5.3.3: Tehnica SKY

• SKY FISH: hibridizarea simultană a celor 24 de probe
specifice pentru fiecare cromozom, spectrul coloristic specific
fiecărui cromozom obţinându-se prin marcarea fiecăruia cu câte
un singur fluorocrom sau cu combinaţii specifice de multipli
fluorocromi; după incubare 24 - 72 de ore la 37ºC şi spălarea
posthibridizare a preparatelor, analiza microscopică se face cu
un sistem de imagine spectrală care utilizează un set de filtre
119
optic speciale, un interferometru şi o cameră digitală; prin

prelucrare computerizată se obţine o colorare specială a fiecărui
cromozom (Fig. 5.3.3).
• Tehnica FISH permite identificarea rearanjamentelor
cromozomiale complexe, precum şi descrierea originii şi
dimensiunilor fragmentelor cromozomiale implicate;
• În cazul variantei FISH în interfază este evitată etapa de cultură
celulară, ceea ce scurtează perioada până la stabilirea
diagnosticului; metoda este mai puţin sensibilă la contaminarea
cu celule materne (comparativ cu alte tehnici);
• FISH este o metodă performantă, dar complexă, laborioasă,

scumpă, care necesită celule intacte şi expertiză tehnică;
• FISH nu se substituie celorlalte metode de analiză
cromozomială şi are indicaţii foarte precise; FISH interfazic este
indicat a fi folosit ca test screening atunci când există semne de
alarmă, ulterior făcându-se evaluare citogenetică completă.
Adrese utile
• http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/CCKprinciple.html
• http://medgen.unige.ch/cytogenetics/fish.html
• http://www.-ermm.cbcu.com.ac-uk
• http://www.pasteur.fr/recherche/unites/biophyadn/e-fish.html
• http://www.qbiogene.com/products/fish/US-CAN_fish_probes.shtml
• http://www.vysis.com/MicrodeletionFISHProbes_26.asp
Bibliografie
• Covic M., D Ştefănescu, I. Sandovici, Genetica Medicală, p 42, 45, 80,
92, Ed. Polirom, 2004;
• Dudarewicz L., Holzgreve W., Jez A. et al. – Molecular methods for
rapid detection of aneuploidy, J Appl Genet 46 (2), 2005, pp 207-
215;
120
• Haddad BR, Schrock E, Meck J et al (1998). Identification of de
novo chromosomal markers and derivatives by spectral
karyotyping. Hum Genet 103:619-25;
• Heller A, Nietzel A, Rocchi M et al (2000) Centromere specific
mult-color FISH (cenM-FISH) - a new and rapid method for the
identification of marker chromosomes. Eur J Hum Genet 8 (Suppl
1):87;
• Henegariu O, Heerema NA, Bray-Ward P, Ward DC (1999). Colour-
changing karyotyping: an alternative to M-FISH/SKY [letter]. Nat
Genet 23:263-4;
• Huang B, Ning Y, Lamb AN et al (1998). Identification of an
unusual marker chromosome by spectral karyotyping. Am J Med
Genet 80:368-72;
• Huegel A, Coyle L, McNeil R, Smith A (1995). Evaluation of
interphase fluorescence in situ hybridization on direct
hematological bone marrow smears. Pathology 27:86-90;
• Lee C, Wevrick R, Fisher RB, Ferguson-Smith MA, Lin CC (1997).
Human centromeric DNAs. Hum Genet 100:291-304;
• Nietzel A, Starke H, Heller A et al (1999) Characterization of small
marker chromosomes by centromere specific 24-color FISH.
Cytogenet Cell Genet 85:40;
• Pergament E (2000). The application of fluorescence in-situ
hybridization to prenatal diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol
12:73-6;
• Schrock E, du Manoir S, Veldman T et al (1996). Multicolor spectral
karyotyping of human chromosomes [see comments]. Science
273:494-7;
• Speicher MR, Gwyn Ballard S, Ward DC (1996). Karyotyping
human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat
Genet 12:368-75;
• Uhrig S, Schuffenhauer S, Fauth C et al (1999). Multiplex-FISH for
pre- and postnatal diagnostic applications. Am J Hum Genet
65:448-62;
• Zhao L, Khan Z, Hayes KJ, Glassman AB (1998). Interphase
fluorescence in situ hybridization analysis: a study using
centromeric probes Ann Clin Lab Sci 28:51-6.
121
122
5.4 Hibridizarea genomică comparativă (CGH)

Dr. Sireteanu Adriana
Definiţie
Hibridizarea genomică comparativă (CGH) reprezintă o nouă
tehnică de citogenetică moleculară care permite scanarea întregului
genom pentru depistarea excesului/ lipsei de material genetic (ADN)
din cromozomi printr-o singură hibridizare, compensând astfel
dificultăţile întâlnite în citogenetica standard şi în tehnica FISH.
Indicaţii
• Identificarea duplicaţiilor sau deleţiilor în genele implicate în
cancer. CGH este folosită pentru detectarea anomaliilor
genetice din diferite boli maligne, în prezent fiind deja depistate
cu ajutorul ei câteva noi regiuni cromozomice care sunt frecvent
modificate în tumori;
• Identificarea pierderii heterozigozităţii în cancer;
• Identificarea duplicaţiilor sau deleţiilor în retardul creşterii şi
dezvoltării (retard mintal);
• Studii genomice comparative privind efectele numărului de

copii ale anumitor regiuni;
• Identificarea bacteriilor pe baza genelor ARN ribozomal.
Principii
CGH necesită marcarea unor cantităţi egale de ADN test (de
la pacient) şi ADN de control (normal) prin încorporarea unor
nucleotide modificate ce conţin molecule “reporter”: biotina şi
respectiv digoxigenina (DIG). Probele de ADN sunt amestecate
pentru a permite competiţia între ele şi hibridizate cu cromozomi
metafazici umani normali. Pentru a preveni legarea probelor de ADN
de regiuni de ADN repetitiv care apar în întregul genom (cu o
frecvenţă crescută la nivelul centromerelor, telomerelor şi unor
123
regiuni cromozomice specifice), aceste regiuni sunt blocate cu ADN

Cot-1 nemarcat (ADN placentar îmbogăţit pentru secvenţe ADN
repetitiv). Blocarea suboptimală cu ADN Cot-1 poate duce la un
raport CGH redus.
Moleculele “reporter” sunt recunoscute de liganzi specifici
(streptavidina pentru biotină şi anticorpi specifici pentru
digoxigenină) conjugaţi cu fluorocromi (fluorescein izotiocianat -
FITC, verde şi respectiv tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC,
roşu) pentru a permite vizualizarea semnalului de hibridizare.
Raportul semnalului verde sau roşu pe cromozomii metafazici
hibridizaţi indică localizarea unei duplicaţii (exces de verde) sau
deleţii (exces de roşu) din ADN test; regiunile cromozomice egal
reprezentate în ADN-ul test şi cel de referinţă vor fi colorate în
galben (vezi Fig. 5.4.1).
Raportul dintre semnalele fluorescente roşu şi verde este
măsurat de-a lungul axului longitudinal al fiecărui cromozom,
folosind o aplicaţie software CGH.
Un raport peste 1 indică supra-reprezentarea ADN-ului test
faţă de ADN de control (duplicaţie).
Un raport mai mic ca 1 indică sub-reprezentarea ADN-ului
test faţă de ADN de control (deleţie).
Astfel, diferenţele dintre semnalele de fluorescenţă
furnizează informaţii asupra câştigului sau pierderii de material
cromozomic comparativ cu o probă de ADN normal.
124
Izolarea ADN genomic de la pacient Izolarea ADN genomic normal
Marcaj cu biotină Marcaj cu digoxigenină
Co-hibridizarea catenelor de ADN marcate

cu cromozomi metafazici normali
Cromozomi metafazici normali
Streptavidină-FITC Anti-DIG-TRITC
Analiza computerizată a raportului

FITC/TRITC
Raportul ADN test/ADN normal
Limita de pierdere 0.85
Bara de exces
Limita de exces 1.15
Bara de pierdere
Numărul de cromozomi analizaţi

Numărul cromozomului
Fig. 5.4.1: Etapele tehnicii de hibridizare genomică comparativă (CGH)
CGH este o tehnică destul de laborioasă şi consumatoare de
timp, dar prezintă câteva avantaje clare comparativ cu alte tehnici
citogenetice.
Analiza citogenetică clasică (cariotipul) a tumorilor oferă o
privire de ansamblu asupra tuturor anomaliilor numerice şi
structurale majore prezente în tumoră. Pentru aceasta este necesară
125
(şi nu totdeauna posibilă) obţinerea de ţesut tumoral proaspăt pentru

a produce metafazele necesare pentru analiza citogenetică şi în acest
material diviziunile celulare trebuie să fie prezente. În plus, cultura
de ţesut poate fi selectivă pentru o anumită subpopulaţie, fiind neclar
faptul dacă aceste celule reprezintă tumora originală. Pentru a realiza
analiza CGH nu sunt necesare ţesuturi proaspete sau vii, ci este
suficientă o cantitate mică de ADN genomic care poate fi obţinut din
ţesuturi proaspete, îngheţate sau chiar fixate cu formol şi incluse în
parafină. Ţesuturile incluse in parafină sunt în general fixate, iar
acest proces duce frecvent la fragmentarea lanţurilor de ADN (în
funcţie de pH-ul fixatorului folosit), deci la o calitate slabă şi o
greutate moleculară mică (mai puţin de 200 pb) a ADN. Isola şi
colaboratorii au descris un protocol de izolare al ADN îmbunătăţit,
care permite extracţia de ADN cu greutate moleculară mare,
suficientă pentru a realiza o analiză CGH corectă. Analiza CGH se
poate realiza pe ADN izolat dintr-o cantitate mică de celule, ţesuturi
sau celule „singulare” obţinute prin micro-disecţie din ţesuturi sau
frotiuri de celule (cytospots). Aceste probe ADN pot fi amplificate
eficient folosind degenerative oligonucleotide priming PCR (DOP-
PCR), pentru a obţine suficient ADN pentru realizarea tehnicii
CGH.
CGH are o rezoluţie superioară faţă de cariotipul standard,
care permite doar detecţia unor amplificări sau deleţii grosiere ale
cromozomilor. Totuşi, CGH standard este încă limitat la o rezoluţie
de 3.000-10.000 Kb.
CGH are capacitatea de scanare a întregului genom cu mai
mare rapiditate şi mai puţin efort comparativ cu alte metode folosite
pentru decelarea anomaliilor de dozaj ale unei singure ţinte
(Southern blot, PCR, FISH).
Tehnica CGH prezintă de asemenea şi dezavantaje:
În primul rând, CGH nu permite detecţia anomaliilor
cromozomice structurale fără modificarea numărului de copii ADN
(cum ar fi translocaţiile cromozomice echilibrate, inserţiile şi
inversiile). Alte tehnici citogenetice precum cariotipul standard, M-
FISH (FISH multicolor) şi SKY (cariotiparea spectrală) permit
detecţia acestor anomalii cromozomice structurale.
126
CGH foloseşte fluorescenţa pentru a detecta pierderile sau
excesul de ADN; limita de detecţie depinde de mărimea alterărilor.
Deoarece ADN-ul ţintă din interiorul cromozomului este foarte
condensat şi răsucit, rezoluţia pentru depistarea modificărilor nu este
mai mică de 10 Mb pentru pierderi (teoretic, deleţiile de 1-5 Mb ar
trebui să fie detectabile, dar date experimentale au arătat o rezoluţie
maximă de 10-12 Mb). Pentru anomaliile în exces, dimensiunea
minimă detectabilă este de peste 2 Mb. Această rezoluţie, deşi poate
reprezenta un punct de plecare pentru studii de clonare poziţională,
cuprinde totuşi prea multe gene pentru a permite localizarea cu
precizie a unei anumite secvenţe.
Sensibilitatea CGH poate fi modificată prin contaminarea
ADN-ului de testat cu ADN provenit de la celule normale în proba
de ADN (de exemplu de la tehnicianul care efectuează testul).
Efectul acestei contaminări va deplasa raportul CGH spre 1. Dacă
procentul de ADN normal este mare, anomaliile cromozomice vor fi
nedetectabile. Pentru detectarea monosomiilor şi trisomiilor cel puţin
50% din proba de ADN trebuie să reprezinte ADN anormal, în timp
ce pentru anomaliile mai mici este necesar un procent de 75%. O
cale de a preveni această problemă este microdisecţia celulelor
tumorale din ţesuturi cu ajutorul laserului.
Un alt dezavantaj îl reprezintă faptul că analiza imaginilor
obţinute prin CGH este doar parţial automată, fiind nevoie de
citogeneticieni experimentaţi care să identifice fiecare cromozom
pentru a determina regiunile cu dezechilibre.
Bibliografie
• CGHView http://www.spectral-imaging.com/CGHView.asp;
• COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH)
PROTOCOL http://users.ugent.be/~fspelema/neubla/protocol/cgh.htm;
• Tapio Visakorpi Comparative Genomic Hybridization (CGH)
http://cgap-
mf.nih.gov/Protocols/DNARNAProteomicAnalysis/DNA/CGH.html;
• Boonstra, Ronald Application of Comparative Genomic Hybridization
to identify genetic regions of relevance to tumor development or
127
progression 2003;
http://dissertations.ub.rug.nl/faculties/medicine/2003/r.boonstra/;
• Covic M., Ştefănescu D., Sandovici I., Genetică Medicală, Editura
Polirom 2004, pg.47.
128
5.5 Stabilirea de linii celulare

Biol. Ivanov Iuliu
Definiţie
Liniile celulare (clone) sunt familii distincte de celule
crescute în cultură, stabilizate, care proliferează indefinit. Fiecare
dintre linii are anumite trăsături caracteristice motiv pentru care sunt
utilizate în biologia celulară, genetică, imunologie, etc.
Indicaţii
Principala indicaţie a iniţierii de linii celulare la om se referă
la:
• Linii celulare limfoblastice umane în situaţia în care o afecţiune
genetică afectează mai multe persoane din familie şi fie probele
de ADN de la anumite persoane ar putea să nu mai fie
disponibile (prin deces sau mutarea persoanelor respective în
altă regiune) sau atunci când se doreşte efectuarea de teste
funcţionale (structura genei respective este normală, dar ea nu
funcţionează corespunzător).
Principii
În genetică liniile celulare cele mai utilizate sunt cele
limfoblastice.
Cele trei coordonate care trebuie urmărite în rezolvarea
problematicii liniilor celulare sunt:
• îngheţarea sângelui pentru ca apoi să reuşim să facem o cultură
de celule;
• menţinerea culturilor de limfoblaste;
• stocarea liniilor celulare pentru a asigura o mare viabilitate.
1. Îngheţarea sângelui
Probele de sânge pot fi stocate ca rezervă în cazul în care
liniile celulare limfoblastice (LCL) sunt necesare la o dată ulterioară.
129
Pentru a fi îngheţat sângele sunt necesari următorii timpi:

• Se plasează 1-4 fiole direct într-un congelator cu -135°C timp
de 15 min, sau o oră într-o cameră frigorifică. S-a înregistrat o
viabilitate mai mare a celulelor îngheţate treptat în camera
frigorifică;
• Procedura începe prin pipetarea a 1 ml sânge în criotuburi
(1,25ml);
• Se adaugă în fiecare tub 100µl dimetil sulfoxid (DMSO)
(aproximativ 10% din cantitatea de sânge);
• Se îngheaţă imediat până la -90°C în camera frigorifică;
• Se transferă în frigiderul de depozitare pe perioadă îndelungată
la -135°C sau în containere cu azot lichid. Asemenea probe
îngheţate pot fi viabile pentru cel puţin 5 luni (G.Ghenevix-
Trench, et al).
2. Menţinerea culturilor de limfoblaste

Când sunt necesare LCL trebuie parcurse următoarele etape:
• Celulele sunt dezgheţate rapid la 37°C în baie de apă; se
poziţionează criotuburile într-un stativ şi se agită stativul pentru
a grăbi dezgheţarea celulelor (de obicei 1-2 minute sunt de
ajuns);
• Cu o pipetă se transferă proba într-un tub de centrifugă conic
(de 15ml) în care s-au pus în prealabil 10 ml de mediu de
spălare;
• Se centrifughează celulele pentru 10 min la 1200 rpm (rotaţii/
min, într-o centrifugă fără frânare) la temperatura camerei;
• Se aspiră supernatantul până aproape de sediment şi se adaugă
10 ml mediu de spălare; se centrifughează iarăşi 10 min la
1200 rpm (temperatura camerei, fără frânare). Se repetă
procedura în total de patru ori până când contaminarea cu celule
roşii este minimă. Dacă totuşi contaminarea cu eritrocite nu este
eliminată, atunci în câteva zile în cultură va diminua substanţial
numărul lor.
130
O altă metodă de separare a leucocitelor este cu Ficol. În
timpul centrifugării, eritrocitele şi granulocitele se depun pe fundul
tubului, iar limfocitele şi alte mononucleate rămân la interfaţa Ficol -
plasmă. Contaminarea cu eritrocite este neglijabilă. Marea majoritate
a trombocitelor sunt eliminate prin centrifugare la viteză joasă în
timpul spălărilor.
După separarea leucocitelor trebuie practicate următoarele
etape (vezi Fig. 5.5.1):
• Se aspiră supernatantul şi se resuspendă sedimentul în 300µl
supernatant filtrat de la o cultură de B95-8 infectată cu virus
Epstein Barr;
• Se transferă suspensia într-un flacon de cultură T-25ml
(flacon de cultură pentru ţesuturi) şi se incubează 2 ore la 37°C
cu 5% CO2;
• Se adaugă 800µl RPMI-1640 cu 20% SFV (ser fetal de viţel) şi
2X CSA (ciclosporină A);
• Se realizează diluţii succesive;
• Se pun toate vasele în incubator la 37°C cu 5% CO2;
• Se împrospătează mediul de două ori pe săptămână înlocuind
jumătate din mediul vechi cu unul nou până când apar coloniile
transformate (mediul nou trebuie să conţină 1X CSA).
Celulele trebuie subcultivate şi menţinute ulterior în mediu

de creştere fără CSA.
Sunt necesare 3-4 săptămâni pentru a creşte o linie celulară
din sânge îngheţat, sau pentru a creşte o linie celulară în vase plate
pentru ţesuturi (T-25ml) până la 1x108 celule/ml.
Menţinerea culturilor de limfoblaste este relativ simplă dacă
sunt luate în consideraţie cele două caracteristici esenţiale: ciclul
celular şi concentraţia celulară.
131
Sânge integral
B95-8, contaminat cu EBV Diluţie 1:1 cu RPMI 1640
Se pune pe suprafaţa Ficolului
Supernatant
(RPMI 1640
Sânge cu
+SFV)
RPMI
celule
Ficol
La 5 zile după ultima re-

centrifugare
împrospătare a mediului se ia
supernatantul şi se centrifughează
Se ia super-
natantul şi se Mediu şi ser
filtrează Leucocite din sânge
Ficol
Hematii
Se izolează inelul de celule

Se prepară albe şi se spală cu RPMI
mediul de
transformare
Fig. 5.5.2: Iniţierea unei linii celulare limfoblastoide
Ciclul celular
Fiecare cultură de limfoblaste este unică şi trebuie să fie
tratată ca atare. De exemplu, unele culturi cresc foarte repede, pe
când altele au nevoie de un timp dublu. Culturile care necesită ca
mediul să fie înlocuit (reîmprospătat) zilnic, se divid rapid şi
formează multe aglomerări. Culturile care cresc mai lent vor schimba
132
culoarea mediului la fiecare 3-4 zile şi necesită utilizarea CSA şi mai
puţin mediu la fiecare reîmprospătare (adăugare).
Culturile de limfoblaste cresc în aglomerări şi de aceea este
bine să fie agitate pentru ca aglomerările să fie dispersate.
Celulele de obicei sunt sedimentate pe fundul vasului
(recipientului), dar nu sunt lipite dacă în primul stadiu de
transformare cultura e săracă în nutrienţi.
O cultură care creşte bine virează mediul spre acid, în 12-24
ore după ce a fost împrospătat. Culoarea este un indicator foarte bun
atât al cresterii, cât şi al concentraţiei celulare (galben = creşte bine,
portocaliu/ roz = nu creşte bine).
Concentraţia celulară
Concentraţia celulară în suspensie este foarte importantă. Un
număr prea mare de celule, peste necesar, înseamnă o scădere a
viabilităţii (celulele moarte se colorează în albastru cu Trypan
albastru). Un număr prea mic de celule înseamnă o multiplicare
redusă.
Concentraţia minimă pentru o linie celulară este de 1,5-2x105
celule viabile/ ml. Concentraţia maximă de celule la care cultura
trebuie să fie împărţită în subculturi este de 2x1010.
Culturile cresc mai bine în vase T-25ml şi sunt menţinute cu
RPMI-1640 (suplimentat cu 1% L-Glutamină 200mM) plus 15%
SFV (inactivat prin caldură) plus antibiotic ca gentamicina sau
penicilina/ streptomicina.
Condiţiile de incubare sunt 37°C cu 5%CO2
Culturile trebuie hrănite (reîmprospătate) la fiecare 3-4zile.
Dacă o cultură celulară nu este hrănită destul de frecvent, celulele
depăşesc faza logaritmică de dezvoltare, astfel încât creşterea optimă
a liniei celulare nu este niciodată atinsă.
3. Stocarea liniilor celulare pentru a asigura o mare viabilitate

O cultură în faza logaritmică a creşterii trebuie să producă
destule celule pentru a îngheţa 10 fiole (1ml/ fiolă). Fiecare fiolă
trebuie să aibă un număr de 4-9 x 106 celule viabile. Prea multe sau
prea puţine celule scad recuperarea viabilităţii.
Celulele se îngheaţă în RPMI-1640 (15% SFV,10% DMSO).
133
Cultura este îngheţată încet utilizând o cameră de îngheţare

care trebuie să fie dotată cu un sistem performant de injectare a
azotului lichid, astfel încât temperatura să scadă cu 1°C/min, de la
+4°C până la -45°C, iar apoi câte 10°C/min până la -90°C. Apoi
fiolele îngheţate trebuie să fie stocate într-un sistem de
crioconservare la -135°C.
Probele trebuie să fie îngheţate într-un interval de 1/2-3ore
pentru ca expunerea la DMSO să fie cât mai mică deoarece acesta
este toxic pentru celule.
Tehnica prezintă multiple avantaje prin faptul că pune la
dispoziţie un număr practic infinit de celule pentru realizarea unui lot
cât mai mare de teste şi de asemeni poate menţine pe o perioadă de
timp foarte mare celule viabile.
Dezavantajele constau în tehnica laborioasă care necesită un
timp lung de prelucrare şi mai ales aparaturi ultraperformante.
Adrese utile
• http://ccr.coriell.org
• http://hg.wustl.edu/hdk_lab_manual/index.html
Bibliografie:
• Chenevix-Trench, G., et al, Method: Maintaining Lymphoblastoid
Cell Lines, Am. J. Hum. Genet. 46:635-636, 1990;
• Gazdar AF, Carney DN, Russell EK et al. In vitro growth of cutaneous
T-cell lymphomas. Cancer Treat Rep. 1979 Apr;63(4):587–590;
• Morgan DA, Ruscetti FW, Gallo R. Selective in vitro growth of T
lymphocytes from normal human bone marrows. Science. 1976 Sep
10;193(4257):1007–1008;
• Ram V., Arvind B., Human Chromosomes Manual of Basic
Tehnique, 214-219, Pergamon Press,1989;
• Rolf-Dieter Wegner, Establishnent of Permanent Lymphoblastoid
Cell Lines, Diagnostic Cytogenetics, 121-132, Springer, 1999;
• Ruscetti FW, Morgan DA, Gallo RC. Functional and morphologic
characterization of human T cells continuously grown in vitro. J
Immunol. 1977 Jul;119(1):131–138.
134
6 TEHNICI MOLECULARE DE
DIAGNOSTIC POSTNATAL
6.1 Extracţia şi cuantificarea de ADN

Dr. Csép Katalin
Definiţie
Extracţia de ADN constituie procedura prin care se izolează
din celulă molecula purtătoare de informaţie ereditară, prin etape
care permit eliminarea componentelor celulare de altă natură, şi
eliberarea lanţului polinucleotidic de proteinele nucleare (histone) cu
care formează cromatina. Extracţia de ADN constituie prima etapă a
analizelor moleculare realizate în scop de cercetare sau diagnostic.
Se poate realiza din diferite tipuri de ţesut şi din orice tip de
celulă nucleată de origine vegetală, animală sau umană, respectiv din
microorganisme. Se poate izola atât ADN-ul nuclear, cât şi cel
extranuclear existent în mitocondrii la om şi animale şi în cloroplaşti
la plante. La om, în scop de diagnostic, cel mai frecvent se realizează
extracţia ADN-ului genomic din celulele sanguine (leucocite-
limfocite), respectiv din celulele epiteliale din mucoasa bucală. În
cele ce urmează ne vom referi în principal la extracţia de ADN
genomic din sânge uman, prin metode accesibile, care nu necesită
reactivi toxici, şi cuu rezultate corespunzătoare din punct de vedere
cantitativ şi calitativ în scop de diagnostic.
Indicaţii
ADN-ul extras poate fi folosit ulterior în scopuri variate:
• cercetarea structurii ADN-ului, a interacţiunilor cu diverse
proteine, a filogenezei, etc.;
• biotehnologie şi inginerie genetică pentru obţinerea unor
medicamente şi terapie genică;
• stabilirea diagnosticului în boli genetice sau infecţioase, sau
aprecierea predispoziţiei genetice la boli prin analiza SNP, sau
135
aprecierea prognosticului şi răspunsului terapeutic în diferite

neoplazii;
• identificarea persoanelor în criminalistică şi a victimelor de
război sau catastrofe naturale şi studiul înrudirii pentru
expertizarea paternităţii etc.
Astfel, după izolarea ADN-ului pot urma diferite tehnici
moleculare, cum ar fi amplificarea/ clonarea (de ex. PCR), digestia
cu enzime de restricţie (de ex. RFLP), hibridizarea (de ex. Southern
blotting) sau secvenţierea.
Cuantificarea ADN-ului este indicată în următoarele situaţii:
• tehnici de analiză moleculară care necesită o anumită
concentraţie de ADN (de exemplu MLPA) sau un ADN pur;
• medicamente produse prin inginerie genetică în care produsul
final trebuie să conţină o cantitate foarte scăzută de ADN de la
celula gazdă pentru a nu fi antigenic;
• infecţii, în care se caută prezenţa ADN-ului bacterian, iar
cuantificarea apreciază intensitatea infecţiei;
• cancer – cuantificarea ADN-ului tumoral circulant apreciază
eficienţa terapiei.
Principii
Deşi numărul tehnicilor de extracţie de ADN este foarte
mare, iar metoda, condiţiile de lucru şi reactivii folosiţi pot varia,
principiul este identic, şi în marea majoritate a cazurilor necesită
parcurgerea următoarelor etape fundamentale:
• ruperea membranei celulare respectiv nucleare cu eliberarea
cromatinei şi îndepărtarea diferitelor componente celulare
(lipide, proteine, hidraţi de carbon) prin:
o centrifugare, pentru separarea componentelor celulare
de ADN;
o adăugare de detergent pentru dizolvarea lipidelor (ADN în
supernatant!)
136
• eliberarea moleculelor de ADN din cromatină/ cromozomi prin
îndepărtarea proteinelor nucleare prin:
o digestie proteică cu proteinază K;
o precipitare cu acetat de sodiu sau amoniu sau
o extracţie cu fenol şi cloroform;
• precipitarea ADN-ului la rece cu alcool (vezi Fig. 6.1.1):
o isopropanol (mai eficient) sau
o etanol (ADN în sediment!)
• spălarea ADN-ului sedimentat cu etanol 70-80% pentru
îndepărtarea sărurilor rămase;
• suspendarea ADN-ului într-o soluţie (buffer alcalin - TRIS-
EDTA, pH 8.0 sau apă), variabil în funcţie de prelucrarea
imediată sau păstrarea până la prelucrare în congelator la -20°C.
Fig. 6.1.1: ADN precipitat în alcool
Cantitatea mare şi calitatea (puritatea) corespunzătoare a
ADN-ului obţinut asigură succesul prelucrărilor ulterioare.
În general, după adăugare de alcool, ADN-ul apare sub
forma unui precipitat vizibil cu ochiul liber (Fig. 6.1.1). Prezenţa
ADN-ului poate fi detectată şi cu ajutorul unui indicator
137
(difenilamină), deci o reacţie specifică care confirmă prezenţa

dezoxiribozei printr-o coloraţie albastră.
Cu ajutorul acestei reacţii poate fi determinată şi cantitatea
ADN-ului prin măsurarea spectrofotometrică a absorbţiei la 600 nm
şi citirea rezultatului de pe o curbă standard. Cuantificarea poate fi
realizată şi după o digestie cu enzime de restricţie şi electroforeză în
gel de agaroză cu conţinut de bromură de etidiu, comparând
intensităţile cu un marker cu concentraţie cunoscută. Cel mai
frecvent însă se determină concentraţia soluţiei de ADN spectro-
fotometric, realizând o diluţie de 1:200 şi citind densitatea optică la
260 nm:
Concentraţia = A260 x 50 x 200 µg/ml
De regulă, se verifică spectroforometric şi puritatea ADN-
ului, schimbând lungimea de undă la 280 nm, citind valoarea
densităţii optice şi calculând raportul:
Puritate = A260/A280
Deoarece ADN absoarbe lumina ultravioletă la 260 nm, iar
proteinele la 280 nm, rezultatul va fi interpretat după cum urmează:
• 1,8 – ADN pur;
• 1,6 – contaminare cu proteine (impune precipitare adiţională);
• 2,0 – contaminare cu ARN (impune un tratament adiţional cu
ARN-ază).

Metodele folosite pentru extracţia de ADN sunt foarte
variate. De-a lungul anilor au fost dezvoltate o serie de proceduri tot
mai simple, rapide şi eficiente, care însă se bazează pe aceeaşi
principii. De la metodele laborioase, care durau câteva zile şi utilizau
substanţe toxice (fenol, cloroform), printr-o gamă largă de kituri
comercializate, în prezent sunt disponibile metode care necesită o
singură incubare a probei recoltate într-un singur tub la temperatura
camerei pentru câteva minute şi proceduri complet automatizate.
Pentru obţinerea unui rezultat bun se va alege metoda optimă
pentru extracţia de ADN, care depinde de:
138
• tipul materialului biologic folosit:
o origine umană, animală, vegetală, bacteriană, virală,
o sânge, salivă, materii fecale, urină, fibroblaşti din culturi
celulare, celule amniotice şi vilozităţi coriale, diferite tipuri
de ţesut obţinute prin biopsii (inclusiv cele incluse în
parafină),
o vechimea probei,
o cantitatea probei biologice, etc.
• tipul de ADN căutat:
o nuclear,
o extranuclear-mitocondrial,
o plasmidic,
• tehnica de prelucrare ulterioară (digestie cu enzime de
restricţie, PCR, secvenţiere, blotting, etc.).
Există tehnici (precipitare, cromatografie, microfiltrare/
ultrafiltrare etc.) prin care se poate extrage ADN-ul din gelul de
agaroză sau acrilamidă după electroforeză (izolarea unei benzi prin
tăierea gelului) sau amestecuri de reactivi după diferite reacţii (de ex.
PCR).
În cazul laboratoarelor mari care extrag zeci de probe de
ADN zilnic sau al laboratoarelor ce trebuie să extragă probe de ADN
pentru identificarea de persoane în situaţii de dezastre (sute sau mii
de victime) se folosesc metodele automatizate. Acestea folosesc bile
magnetice la care aderă ADN-ul, tehnica implicând spălări succesive
prin care sunt îndepărtate celelalte structuri celulare.
Metoda clasică de extracţie cu fenol foloseşte substanţe
toxice şi este laborioasă.
Există numeroase kituri comercializate de diferite firme
(Eppendorf, Eppicentre, Invitrogen, Qiagen, Sigma, etc.) cu
randament (mini, midi, maxi-prep) şi puritate variabilă a ADN-ului
139
obţinut, care permit extracţia de ADN într-un timp variabil, de regulă

sub o oră, prin câteva manipulări succesive, fără utilizarea unor
substanţe toxice şi la un preţ accesibil.
Automatizarea procedurii este benefică şi rentabilă în cazul
prelucrării unui număr crescut de probe.
Alegerea metodei optime şi o prelucrare atentă pot preveni
problemele cele mai frecvente, cum sunt:
• prezenţa contaminanţilor care pot inhiba prelucrarea ulterioară
(de ex. grupările hem inhibă reacţia de PCR),
• randament scăzut cel mai frecvent prin omogenizare sau liză
incompletă sau suspensie finală insuficientă,
• degradarea ADN-ului folosind probe vechi sau omogenizare la
o viteză prea mare,
• contaminare ARN prin spălarea insuficientă a sedimentului.
Adrese utile
• http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/
• http://biocompare.com
• http://www.bio-rad.com/
• http://www.horizonpress.com/gateway/protocols-jump-station.html
• http://www.orpegen.com/share/FE037_Dnamain.pdf
• http://dnagenotek.com/pdf_files/FluorescentQuantificationProtocol_N
ov2904.pdf
• http://www.norgenbiotek.com/tech%20downloads/MWM%20App%2
0Notes/DNA%20Quantification%20by%20Gel%20Densitometry%20
with%20Norgen%20DNA%20Ladders.pdf
• http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/RESEARCH/Protoc
ols/DNA%20quantification/DNA%20quantification.pdf
140
6.2 Reacţia PCR

Dr. Skrypnyk Cristina, Dr. Rusu Cristina
Definiţie
PCR - reacţia de polimerizare în lanţ - este o tehnică de
biochimie şi biologie moleculară catalizată enzimatic, în care
cantităţi mici specifice de ADN sunt amplificate exponenţial
într-un aparat numit termociclor prin schimbarea periodică a
temperaturii. Se poate amplifica o genă, un fragment de genă
sau de ADN necodant. Metodele clasice de PCR amplifică
fragmente de până la 10kb de ADN, pe când unele metode pot
copia fragmente de până la 40 kb în lungime.
Indicaţii
Impactul tehnologiei PCR a fost extrem de important în
multe domenii ale analizei genomului uman, în special în
cartografiere şi analiza expresiei genice. În ultimii ani tehnologia
PCR a condus la progrese fantastice ale analizei mutaţionale umane:
• Diagnosticul bolilor monogenice;
• Identificarea persoanelor prin amprente ADN (paternitate,
criminalistică);
• Diagnosticul patologiei infecţioase;
• Cancer;
• Diagnosticul bolilor mitocondriale;
• Studii imunologice în transplante de organe;
• Diagnostic prenatal al anomaliilor cromozomice;
• Clonarea genelor în vederea aplicării tehnologiei ADN
recombinant sau a terapiei genice;
• Computere ADN – tehnologie recent introdusă şi foarte
promiţătoare bazată pe principiile ADN de stocare a informaţiei.
141
Principiu
Principiul de bază al tehnologiei PCR este amplificarea ADN
utilizând ADN polimeraza. Tehnica necesită următoarele
componente:
• Matriţă ADN cae conţine fragmentul ce trebuie amplificat;
• Amorse (primeri) – secvenţe de ADN (20 - 25 perechi de baze)
complementar capetelor 5’ şi 3’ ale fragmentului amplificat;
• ADN- polimeraza – enzimă ce realizează copierea fragmentului
de ADN; de obicei este Taq polimeraza;
• Deoxinucleotide trifosfat (dNTP) – componentele din care
ADN polimeraza construieşte copia ADN;
• Soluţie tampon – furnizează un mediu optim din punct de
vedere chimic pentru o bună acţiune a ADN polimerazei;
• Cationi divalenţi (Mg sau Mn);
• Cationi monovalenţi (K).
Secvenţa care trebuie amplificată poate fi într-un procent
foarte mic în amestecul complex de reacţie. Amplificarea ADN este
posibilă pe baza activităţii enzimatice a ADN polimerazei şi este
realizată prin cicluri repetate ale reacţiei PCR, fiecare ciclu având
trei etape caracterizate de temperaturi diferite:
• denaturarea ADN la 94-96 ºC;
• fixarea amorselor (primerilor) la capetele ADN de amplificat,
la 50- 64 ºC;
• extensia amorselor sub acţiunea ADN polimerazei, la 70-74 ºC.
Tehnica foloseşte tuburi mici de reacţie (0,2-0,5 ml) care se

introduc în termociclor – maşină care încălzeşte/ răceşte brusc
tuburile la temperaturile prestabilite şi pe durate foarte precise. De
obicei se practică 20-35 cicluri de amplificare.
Metoda
Etapele reacţiei PCR (Fig. 6.2.1) sunt:
142
• denaturarea termică (separarea) a catenelor de ADN prin
încălzirea ADN la 94- 96ºC, 20- 30 secunde;
Fig. 6.2.1: Ciclu de reacţie PCR: (1) Denaturare la 94-96°C. (2) Alinierea
amorselor (P) la 50- 64°C. (3) Elongare la 72°C (P=Polimeraza). (4) Ciclul
1 este complet; cele 2 catene de ADN folosesc drept matriţă pentru
următorul ciclu.
• fixarea amorselor/ primerilor (anealing) – la capetele

fragmentului de amplificat se fixează amorsele/ primerii (sens şi
antisens); fixarea are loc la o temperatură care se calculează în
funcţie de structura amorselor, intervalul optim fiind 50- 64 ºC;
etapa durează 20- 40 secunde; după formarea de legături stabile
143
între ADN şi amorsă se poate fixa ADN polimeraza la capete şi

începe sinteza copiei;
• extensia - polimerizarea propriu zisă, în care, cu ajutorul
bazelor nucleotidice (dNTP) puse în mediul de reacţie, ADN
polimeraza (Taq pol I) construieşte prin complementaritate copii
identice ale fragmentului de analizat; temperatura depinde de
enzima folosită, intervalul optim fiind 70- 74ºC; durata depinde
de lungimea fragmentului amplificat; la sfârşitul reacţiei se
obţine un număr foarte mare de fragmente (ampliconi) identice
cu cel iniţial prin reproducerea sa exponenţială (262.144 de
copii după 20 de cicluri şi 1.073.741.824 de copii după 32 de
cicluri);
• pentru a verifica dacă s-a copiat corect fragmentul respectiv
produşii de amplificare sunt supuşi electroforezei în gel de
agaroză alături de un marker molecular cu greutate moleculară
deja cunoscută, şi sunt vizualizaţi cu ajutorul unei lămpi UV
(Fig. 6.2.2). Imaginea genei este o bandă care se opreşte în
dreptul greutăţii sale moleculare.
Fig. 6.2.2. Verificarea produşilor de reacţie PCR prin electroforeză în gel de

agaroză, comparativ cu markeri moleculari prestabiliţi. Linia 1: fragment
PCR de 1.850 pb. Liniile 2 şi 4: fragmente PCR de 800 pb. Linia 3: nu sunt
produşi PCR. Linia 5: linii multiple determinate de legarea amorselor în
locuri nespecifice.
144
Protocol standard pentru 50 µl amestec de reacţie PCR
• Se scot reactivii din congelator de la – 20 ºC şi se pun într-un
vas de lucru pe gheaţă, în hotă, pe masa de lucru;
• După dezgheţarea completă se agită uşor 1-2 secunde pe
agitator şi 1-2 secunde în microcentrifugă, după care se
replasează pe gheaţă (centrifugarea este importantă pentru
reducerea contaminării);
• Se prepară amestecul de reacţie adăugând rând pe rând reactivii
într-un tub de PCR de 1,5 ml; se agită uşor pe agitator, se
centrifughează în microcentrifugă şi se pune pe gheaţă în vasul
de lucru (volumul de amestec variază de la reacţie la reacţie în
funcţie de secvenţa specifică ADN de amplificat şi de amorse;
se adaugă apă distilată pentru uniformizarea volumului final);
• Se separă amestecul de reacţie în microtuburi PCR sterile care
se închid până când se vor adăuga restul de reactivi); tuburile se
pot acum păstra la temperatura camerei;
• Se adaugă apă distilată adiţional dacă este necesar;
• Se adaugă ADN de amplificat, ţinând tuburile oblic, pentru a
reduce la minim posibilitatea ca aerosolii să contamineze
amestectul;
• Se adaugă amorsele specifice;
• Se amestecă prin agitare;
• Se acoperă amestectul cu cel puţin 40µl de ulei mineral pentru a
preveni evaporarea;
• Introducerea tuburilor de reacţie în maşina PCR şi începerea
reacţiei ciclice.
Protocol de start la temperatură înaltă

• Se decongelează reactivii;
• Se prepară amestecul de reacţie fără a se adăuga Taq pol I;
volumul de reacţie se reduce la 5 µl pentru fiecare reacţie;
145
• Se procedează similar cu etapele 4-9 din protocolul standard;

• Se plasează microtuburile în maşina de PCR la 80ºC timp de 8-
10 minute;
• Se diluează Taq pol I în 1x tampon pentru a obţine 1,25 U/5µl;
• Se adaugă 5µl din Taq pol I diluată în fiecare microtub de
reacţie PCR (se indică adăugarea Taq pol I fără a scoate
microtuburile din maşina PCR; dacă nu există experienţa
necesară microtuburile se pot scoate, se adaugă repede enzima şi
se reintroduc imediat în maşina PCR);
• Se porneşte reacţia pentru 20-40 de cicluri.
După ultimul ciclu de reacţie PCR se indică incubarea în

continuare la 72ºC pentru 5-10 minute pentru a permite extensia
completă a capetelor 3’-OH. Microtuburile se scot apoi din maşina
PCR şi se introduc într-un suport diferit de cel utilizat pentru
pregătirea amestecului de reacţie, de preferat într-o altă cameră. Până
la analizarea reacţiei microtuburile se pot păstra la 4 ºC.

• Nested PCR – variantă de PCR care foloseşte 2 amplificări
succesive pentru a reduce amplificarea nespecifică; iniţial se
amplifică un fragment mai mare de ADN folosind un set de
amorse; se face electroforeza pentru verificaea corectitudinii şi
apoi se face o a doua amplificare (fragment mai mic din
interiorul primului fragment) folosind un set diferit de amorse;
• Inverse PCR – variantă de PCR folosită când se cunoaşte numai
o secvenţă din interiorul fragmentului de amplificat (nu
capetele);
• RT-PCR (reverse transcription PCR) este o metodă folosită
pentru analiza funcţională a genelor, metodă ce identifică ARN
din celule/ ţesuturi; reacţia PCR este precedată de o reacţie cu
transcriptază inversă care sintetizează ADN complementar din
ARN; pentru identificaea capetelor genelor se poate folosi o
146
variantă de RT-PCR numită RACE PCR (Rapid Amplification
of cDNA Ends);
• Assembly PCR – metodă artificială de sinteză a unor produşi
genici lungi prin realizarea unor oligonucleotide lungi care au
secvenţe scurte de suprapunere la capete; secvenţele de
suprapunere sunt diferite pentru a putea aranja oligonucleotidele
în ordine;
• Asymmetric PCR – tehnică folosită pentru a amplifica
preferenţial o catenă de ADN (folosită în secvenţiere şi
hibridizări); se folosesc amorse în exces pentru catena de ADN
ce trebuie amplificată şi amorse limitante care blochează
copierea celeilalte catene; după adăugarea amorselor limitante
viteza de reacţie scade, motiv pentru care sunt necesare
amplificări ulterioare;
• LATE PCR (Linear After The Exponential PCR) - variantă de
Asymmetric PCR care foloseşte amorsă limitantă ce
funcţionează la temperaturi mai mari decât amorsele în exces;
• Quantitative PCR (Q-PCR) este o metodă folosită pentru a
măsura cantitatea de produs PCR. Este metoda de elecţie pentru
a măsura cantitatea de ADN, ADNc sau ARN. Q-PCR se
foloseşte pentru a aprecia dacă o secvenţă de ADN este prezentă
într-o probă de analizat, precum şi numărul de copii din probă.
Rezultatele cele mai bune se obţin cu Quantitative real-time
PCR (QRT-PCR), tehnică în care se folosesc fluorocromi pentru
a măsura cantitatea de produs amplificat în timp real;
• Touchdown PCR - este varianta PCR care reduce legarea
nespecifică a amorselor prin scăderea treptată a temperaturii de
legare în cursul ciclurilor reacţiei PCR; temperatura iniţială de
legare este cu câteva grade mai mare decât temperatura medie
de legare a amorselor, iar spre finalul reacţiei, temperatura scade
cu câteva grade sub temperatura medie de legare. Temperaturile
mari cresc specificitatea de legare a amorselor, iar temperaturile
mai mici permit o amplificare mai eficientă a produşilor
specifici formaţi în primele etape de reacţie;
147
• Hot-start PCR – este o tehnică prin care se reduce amplificarea

nespecifică în timpul etapelor iniţiale ale reacţiei PCR; fie se
face încălzirea rapidă a componenţilor de reacţie la temperatura
de denaturare (95ºC) înainte de a adăuga polimeraza, fie se
folosesc sisteme speciale care inhibă activitatea polimerazei la
temperatura camerei (prin legarea de anticorpi sau prin
realizarea de legături covalente cu inhibitori care disociază doar
în etapa de încălzire rapidă la temperaturi înalte);
• Colony PCR – coloniile de E. coli pot fi scanate pentru a vedea
dacă vectorii au fost bine construiţi. Din coloniile selectate se ia
cu o scobitoare sterilă un fragment de agaroză şi se introduce în
amestecul de reacţie sau apă sterilă. Se adaugă amorsele şi
amestec de reacţie şi se începe reacţia PCR la 95ºC şi cu durată
mai mare (polimerază standard) sau cu durată mai scurtă a
denaturării la 100ºC (ADN polimerază himerică);
• Multiplex-PCR este o reacţie care utilizează mai multe seturi
diferite de amorse într-o singură reacţie PCR pentru a produce
ampliconi de mărimi diferite, specifici pentru secvenţe diferite
de ADN. Deoaece se fac mai multe teste într-o singură reacţie,
metoda economiseşte timp şi reactivi. Temperatura de legare a
fiecărui set de amorse trebuie optimizată pentru ca acestea să
acţioneze corect într-o singură reacţie, iar lungimea ampli-
conilor trebuie să fie suficient de diferită pentru a forma benzi
distincte care să fie vizualizate apoi prin electroforeză în gel de
agaroză;
• Methylation Specific PCR (MSP) este o metodă folosită pentru
a detecta metilarea insulelor CpG din ADN genomic. ADN este
iniţial tratat cu bisulfit de sodiu care va converti citozina
nemetilată în uracil, acesta fiind recunoscut de amorsele PCR ca
timină. Au loc apoi două reacţii PCR ale ADN-ului modificat,
folosind seturi identice de amorse; un set de amorse recunoaşte
ADN-ul cu citozină şi amplifică ADN-ul metilat, iar celălalt set
de amorse recunoaşte ADN-ul cu uracil sau timină şi amplifică
ADN-ul nemetilat;
• TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR);
148
• Meta-PCR: permite optimizarea amplificării şi secvenţierea

directă a genelor complexe;
• Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
permite amplificarea simultană a mai multor secvenţe diferite
folosind o singură pereche de amorse, evitând limitările de
rezoluţie ale PCR multiplex.
Aplicaţii ale tehnicilor PCR
• Amprentele ADN (Genetic fingerprinting) - tehnică de medicină

legală folosită la identificarea persoanelor prin compararea unor
probe de ADN; adesea este vorba de cantităţi foarte mici de
ADN, obţinute din sânge, salivă, păr, spermă sau alte materiale
organice; după tăierea ADN-ului de studiu în fragmente mici
acestea sunt amplificate prin tehnica PCR, separate prin
electroforeză în gel de agaroză şi vizualizate prin colorare cu
bromură de etidiu. Modelul de dispunere a acestora se numeste
amprentă de ADN şi există şanse de 1/1.000.000 ca acest model
să fie identic cu al altei persoane;
• Teste de paternitate: amprentele ADN sunt unice (cu excepţia
gemenilor monozigoţi), iar pentru a stabili legăturile de rudenie
sunt necesare probe ale mai multor membri din familie şi
compararea acestora;
• Identificarea unor boli genetice: fiecare genă candidat pentru o
boală genetică poate fi amplificată prin metoda PCR, folosind
amorse specifice, şi apoi secvenţializată pentru detectarea
mutaţiei;
• Identificarea bolilor virale: amplificând ADN-ul viral se poate
face analiza imediat după infectare (cu câteva zile/ luni înainte
de apariţia simptomatolgiei). Această posibilitate de diagnostic
precoce oferă un avans considerabil pentru terapie;
• Clonarea genelor: clonarea unei gene (a nu se confunda cu
clonarea unui organism) reprezintă procesul prin care se
izolează o genă dintr-un organism şi se inseră apoi în alt
149
organism. PCR este utilizată pentru a amplifica gena care se

inseră apoi în interiorul unui vector (vector = segment de ADN
care transportă o genă într-un organism gazdă). Vectorii cu
molecule circulare de ADN se numesc plasmide (Fig. 6.2.3).
ADN-ul se transferă în interiorul altui organism, unde gena şi
produsul ei pot fi studiate mai bine.
Fig. 6.2.3: Clonarea unei gene folosind un plasmid: (1) ADN cromozomial
al organismului A; (2) Reacţia PCR; (3) Copii multiple ale genei; (4)
Inserţia genei în interiorul plasmidului; (5) Plasmid cu gena din organismul
A; (6) Inserţia plasmidului în organismul B; (7) Multiplicarea şi expresia
genei din organismul A în organismul B.
• Mutageneză: este o metodă prin care se modifică secvenţa de

nucleotide dintr-un ADN, cu scopul de a studia funcţia unei
anumite secvenţe nucleotidice din cadrul genei, de a aprecia
rolul secvenţelor regulatoare intergenice sau pentru a studia
evoluţia in vitro a unei proteine. Mutaţiile se pot introduce prin
două metode care utilizează reacţia PCR:
o Mutageneza orientată pe situs - permite introducerea unei
mutaţii într-un anume loc din catena de ADN. Mutaţia dorită
este incorporată în amorsele utilizate în reacţia PCR;
o Mutageneza întâmplătoare este caracterizată prin faptul că
localizarea şi tipul mutaţiei nu pot fi controlate, se bazează pe
folosirea de polimeraze predispuse la erori sau adăugarea de
ioni (Mn) şi se utilizează pentru analiza relaţiei dintre
structura şi funcţia unei proteine. Prin alterarea întâmplătoare
a secvenţei de ADN se poate compara proteina finală cu cea
originală şi se pot stabili funcţiile fiecărei părţi proteice;
150
• Analiza ADN-ului ancestral: reacţia PCR poate fi aplicată pe

material biologic foarte vechi, făcând posibile diferite teste, ca
analiza mumiilor egiptene, aprecierea migraţiei popoarelor sau
identificarea de persoane;
• Genotiparea mutaţiilor specifice: Utilizând PCR specific unei
alele se poate determina dacă un individ are o mutaţie sau un
polimorfism. O amorsă este obişnuită şi se leagă la distanţă de
mutaţie, în timp ce cealaltă amorsă se leagă exact la nivelul
mutaţiei/ polimorfismului. Capătul 3’ al amorsei specifice alelei
este modificat, el legându-se doar dacă este potrivit cu una
dintre alele. Dacă polimorfismul afectează un singur nucleotid T
sau C, se vor utiliza două reacţii, una cu o amorsă care se
termină în T şi alta cu o amorsă care se termina în C. Amorsa
comună va fi aceaşi. După reacţia PCR, produsii de reacţie vor
fi supuşi electroforezei în gel de agaroză, iar distribuţia benzilor
de migrare în câmp eletroforetic va defini dacă individul este
homozigot T, C sau heterozigot T/C. Această metodologie
permite amplificarea unor haplotipuri specifice (când alele cu
două sau mai multe SNP apar împreună pe acelaşi cromozom -
dezechilibru de înlănţuire), detectarea cromozomilor recombi-
nanţi sau studiul recombinării meiotice;
• Compararea expresiei genice: reacţia PCR poate fi utilizată
pentru a aprecia modificările expresiei unei gene. Prin
transcripţie inversă ARNm poate fi transformat în ADN
complementar (ADNc). Moleculele de ADNc sunt supuse
electroforezei. Benzile foarte intense corespund unor gene foarte
active (există mult ADNc datorită unei cantităţi crescute de
ARNm), pe când benzile palide corespund unor gene mai puţin
active.
Principalele avantaje ale tehnicii PCR constau în:
• Metodă rapidă – se poate face analiza completă a unei probe în
24-48 ore;
• Interpretare cantitativă mai puţin subiectivă decât FISH;
151
• Tehnica este mai putin laborioasă decât FISH.

Metoda PCR prezintă însă şi dezavantaje:
• Necesită un grad mai mare de automatizare comparativ cu
tehnica FISH;
• Aplicarea pentru diagnosticele de aneuploidie este mai
limitată;
• Costuri mai mari decât FISH.
Adrese utile
• http://en.wikipedia.org/wiki/RT-PCR
• www.wzw.tum.de/gene-quantification/real-time.html
• http://www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Standard_PCR/
• http://www.horizonpress.com/gateway/pcr-protocols.html
• http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/Guide.html
Bibliografie
• Adinolfi M., Sherlock J. Prenatal detection of chromosome
disorders by QF-PCR, Lancet 2001 ,358 (9287)1030-1;
• Adler M., Wacker R. & Niemeyer C.M. (2003) A real-time immuno-
PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins.
Biochem Biophys Res Commun, 308, 240-250;
• Aerts J.L., Gonzales M.I. & Topalian S.L. (2004) Selection of
appropriate control genes to assess expression of tumor antigens
using real-time RT-PCR. Biotechniques, 36, 84-86, 88, 90-81;
• Alizadeh M., Bernard M., Danic B. et al. (2002) Quantitative
assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow
transplantation by real-time quantitative polymerase chain
reaction. Blood, 99, 4618-4625;
• Alonso A., Martin P., Albarran C. et al. (2004) Real-time PCR
designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number
in forensic and ancient DNA studies. Forensic Sci Int, 139, 141-149;
152
• Barletta J.M., Edelman D.C. & Constantine, N.T. (2004) Lowering
the detection limits of HIV-1 viral load using real-time immuno-
PCR for HIV-1 p24 antigen. Am J Clin Pathol, 122, 20-27;
• Barrois M., Bieche I., Mazoyer S. et al (2004) Real-time PCR-based
gene dosage assay for detecting BRCA1 rearrangements in breast-
ovarian cancer families. Clin Genet, 65, 131-136;
• Belgrader P., Benett W., Hadley D. et al. (1999) PCR detection of
bacteria in seven minutes. Science, 284, 449-450;
• Bryant P.A., Li H.Y., Zaia A. et al. (2004) Prospective study of a
real-time PCR that is highly sensitive, specific, and clinically
useful for diagnosis of meningococcal disease in children. J Clin
Microbiol, 42, 2919-2925;
• Bustin S.A. (2000) Absolute quantification of mRNA using real-
time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol
Endocrinol, 25, 169-193;
• Cilloni D., Gottardi E., De Micheli D. et al. (2002) Quantitative
assessment of WT1 expression by real time quantitative PCR may
be a useful tool for monitoring minimal residual disease in acute
leukemia patients. Leukemia, 16, 2115-2121;
• Cleary T.J., Roudel G., Casillas O. & Miller, N. (2003) Rapid and
specific detection of Mycobacterium tuberculosis by using the
Smart Cycler instrument and a specific fluorogenic probe. J Clin
Microbiol, 41, 4783-4786;
• Costa C., Pissard S, Girondon E. A one-step real-time PCR assay for
rapid prenatal diagnosis sickle cell disease and detection of
maternal contamination, Mol Diagn, 2003,7(1),45-8;
• Cottrell S.E., Distler J., Goodman N.S. et al. (2004) A real-time PCR
assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.
Nucleic Acids Res, 32, e10;
• Covault J., Abreu C., Kranzler H. & Oncken, C. (2003) Quantitative
real-time PCR for gene dosage determinations in microdeletion
genotypes. Biotechniques, 35, 594-596, 598;
• Ginzinger D.G., Godfrey T.E., Nigro J. et al. (2000) Measurement of
DNA copy number at microsatellite loci using quantitative PCR
analysis. Cancer Res, 60, 5405-5409;
153
• Grangeot-Keros L. Molecular diagnosis of viral materno-fetal

infections, Ann.Pharm Fr, 2003 61(4),259-64;
• Grimshaw GM, Scezepura A., Hulten M. ,MacDonald F. Evaluation
of molecular tests for prenatal diagnosis of chromosome
abnormalities, Health Technol Assess 2003(1-146);
• He L., Chinnery P.F., Durham S.E. et al. (2002) Detection and
quantification of mitochondrial DNA deletions in individual cells
by real-time PCR. Nucleic Acids Res, 30, e68;
• Hulten M A, Dhanjal S., Pertl B. Rapid and simple prenatal
diagnosis of common chromosome disorders: advantages and
disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR,
Reproduction,2003,126(3),279-297;
• Hwa H.L., Ko T.M., Yen M.L. & Chiang Y.L. (2004) Fetal gender
determination using real-time quantitative polymerase chain
reaction analysis of maternal plasma. J Formos Med Assoc, 103,
364-368;
• Kearns A.M., Draper B., Wipat W. et al. (2001a) LightCycler-based
quantitative PCR for detection of cytomegalovirus in blood, urine,
and respiratory samples. J Clin Microbiol, 39, 2364-2365;
• Kearns A.M., Graham C., Burdess D. et al. (2002a) Rapid real-time
PCR for determination of penicillin susceptibility in pneumococcal
meningitis, including culture-negative cases. J Clin Microbiol, 40,
682-684;
• Mackay I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory.
Clin Microbiol Infect, 10, 190-212;
• Mocellin S., Rossi C.R., Pilati P. et al. (2003) Quantitative real-time
PCR: a powerful ally in cancer research. Trends Mol Med, 9, 189-
195;
• Sabek O., Dorak M.T., Kotb M. et al. (2002) Quantitative detection
of T-cell activation markers by real-time PCR in renal transplant
rejection and correlation with histopathologic evaluation.
Transplantation, 74, 701-707;
• Zimmermann B., Holzgreve W., Wenzel F. & Hahn S. (2002) Novel
real-time quantitative PCR test for trisomy 21. Clin Chem, 48, 362-
363.
154
6.3 Metoda Southern blotting

Dr. Csép Katalin
Definiţie
Edward M. Southern a dezvoltat în anii ’70 o metodă prin
care moleculele de ADN sunt transferate din gelul fragil de agaroză
pe o membrană solidă (blotting = amprentă), având ca scop
evidenţierea unei secvenţe de ADN dintr-un amestec complex (de ex.
a unei gene din genom).
Indicaţii
Metoda permite evidenţierea prezenţei sau absenţei unor
secvenţe de ADN în proba biologică investigată. În scop de
diagnostic la om, prin Southern blot se pot identifica:
• mutaţii extinse (deleţii, inserţii) de peste 50-100 pb;
• mutaţii punctiforme (substituţii, deleţii, inserţii) care anulează
situsuri de restricţie sau crează situsuri de restricţie noi,
atât prenatal, cât şi postnatal, chiar în stadiile presimptomatice şi în
starea de heterozigot, deci la purtătorii sănătoşi ai mutaţiei.
Principii
După recoltarea probei biologice şi izolare, ADN-ul genomic
existent în soluţie este supus următoarelor etape de prelucrare:
• fragmentarea ADN-ului cu o enzimă de restricţie sau un
amestec de enzime; Enzimele de restricţie sunt endonucleaze
bacteriene care recunosc specific secvenţe scurte de nucleotide
(4 – 8 pb) denumite situsuri de restricţie, iar la nivelul acestora
secţionează catenele de ADN determinând apariţia fragmentelor
de restricţie. În funcţie de genomul studiat şi enzima de
restricţie folosită rezultă un număr variabil de fragmente de
restricţie de diferite lungimi dependent de densitatea situsurilor
specifice de restricţie;
• separarea fragmentelor de lungimi diferite prin electroforeză
155
Electroforeza în mod obişnuit se realizează în gel de agaroză

având o concentraţie de aproximativ 2 - 3%.
Datorită grupărilor fosfat, moleculele de ADN sunt încărcate
electronegativ şi deci se deplasează către anod.
Viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea
fragmentelor: după un anumit interval de timp, cele mai scurte
fragmente ajung cel mai departe, iar fragmentele cu greutate
moleculară mare se vor afla cel mai aproape de punctul start de
încărcare.
Separarea este limitată însă de dimensiunea porilor din reţeaua
tridimensională a gelului de agaroză. Se pot analiza numai
fragmente de ADN cu lungime de sub 50 kb. În cazul studierii
unor secvenţe mai lungi, se utilizează electroforeza în câmp
pulsatil, prin care fragmentele sunt supuse influenţei alternative a
două câmpuri electrice perpendiculare.
Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN altfel invizibile în gel,
în agaroză se adaugă bromură de etidiu, un colorant specific
pentru ADN, care determină fluorescenţa benzilor în lumină
ultravioletă.
• denaturare chimică alcalină prin incubare cu NaOH sau
termică: Moleculele de ADN dublu catenar sunt transformate
sub acţiunea unor factori chimici (mediu alcalin) sau fizici
(creşterea temperaturii) în molecule monocatenare prin ruperea
legăturilor de hidrogen;
• După această etapă, înainte de blotting, se poate intercala
opţional şi o fază de depurinare cu HCl, deoarece fragmentele
mai mari de 15 kb sunt dificil transferate pe membrană;
• transferul moleculelor de ADN monocatenare din gel cu
fragilitate crescută pe un suport solid şi imobilizarea lor în
poziţia în care au migrat;
156
Transferul se poate realiza prin capilaritate (blotting –
amprentare, sugere) sau cu vid, ceea ce reduce considerabil
durata.
Suportul solid pe care vor fi transferate fragmentele este o
membrană de nailon sau nitroceluloză. Nitroceluloza are o
capacitate de legare de aproximativ 100 µg/cm, iar nailonul de
500 µg/cm, acesta din urmă fiind preferat şi din cauza fragilităţii
mai reduse.
După transfer, tratatarea membranei de nailon cu lumină
ultravioletă şi a nitrocelulozei cu temperatură ridicată de
aproximativ 800C fixează ADN-ul pe suportul solid.
• Hibridizare cu sonde de ADN monocatenare marcate
radioactiv, complementare cu secvenţele căutate;
În urma incubării blot-ului cu sondele monocatenare se produce
hibridizarea, deci refacerea legăturilor de hidrogen între
secvenţele complementare (sonda şi molecula de ADN din
proba biologică);
Monocatenele de ADN sau ARN marcate cu izotopi sau
fluorocromi, având structură nucleotidică complementară cu
secvenţa investigată şi care în acest fel ajută la identificarea
prezenţei sau absenţei acestora, sunt denumite sonde. Marcarea
sondei se face radioactiv, colorimetric sau fluorescent (32P,
legare de biotină/ streptavidină, fosfatază alcalină, peroxidază);
Înainte de hibridizare se realizează o pre-hibridizare pentru
blocarea situsurilor nespecifice;
După hibridizare se va îndepărta excesul de sonde nehibridizate
prin spălare;
• Vizualizarea hibridizării: În funcţie de tipul de marcare a
sondei se va vizualiza hibridizarea prin autoradiografie,
colorimetrie sau fluorescenţă.
Apariţia unor benzi negre radioopace pe film după auto-
radiogafie, sau a unui produs colorat sau fluorescent după
incubare permite confirmarea prezenţei fragmentului căutat în
proba biologică.
157
Apariţia coloraţiei sau amprentării filmului Rontgen are
semnificaţia prezenţei secvenţei complementare cu sonda utilizată în
proba biologică studiată.
Lipsa coloraţiei sau amprentării filmului Rontgen are
semnificaţia absenţei secvenţei căutate în proba biologică investigată.
Poziţia sondei pe membrană permite totodată şi aprecierea
dimensiunii secvenţei căutate, prin utilizarea unei scale alcătuite din
fragmente cu dimensiune cunoscută. Supuse paralel electroferezei,
prin comparaţie, se poate deduce dimensiunea secvenţelor din benzi,
deoarece fragmentele de aceeaşi dimensiune migrează cu aceeaşi
viteză.

După introducerea metodei Southern blotting pentru studiul
ADN, au fost elaborate tehnici similare pentru ARN (Northern
blotting) şi proteine (Western blotting) care urmează aceeaşi
principii.
Metoda Northern blotting permite studiul transcripţiei, deci
caracterizarea spaţială, temporală şi cantitativă a expresiei genice.
Pentru hibridizarea moleculei ţintă de ARNm se folosesc sonde
monocatenare de ADN (oligonucleotide antisens sau ADNc).
Sensibilitatea moleculelor de ARN la ARN-aze, cantitatea mică şi
prezenţa variabilă a ARNm în celule în funcţie de ontogeneză şi
diferenţiere celulară, fac metoda Northern blotting mult mai dificilă
în comparaţie cu Southern blotting.
Metoda Southern blotting stă la baza analizei indirecte prin
RFLP, şi permite identificarea unor mutaţii genice în cadrul realizării
diagnosticului direct de ADN.
Tehnica permite identificarea prezenţei mutaţiei chiar în
stare heterozigotă, deci permite identificarea purtătorilor sănătoşi de
mutaţie şi diagnosticul presimptomatic. Southern blotting poate fi
folosit şi în cadrul diagnosticului prenatal.
158
În prezent, datorită existenţei unor metode de analiză mult
mai sensibile şi specifice, putem considera că Southern blotting
prezintă informativitate redusă. Utilizarea este limitată şi de
necesitatea cunoaşterii secvenţei sau poziţiei fragmentului căutat. Nu
poate fi folosită în mutaţiile punctiforme care nu afectează (abolesc
sau crează) situsuri de restricţie şi în mutaţiile cu dimensiune sub 50
- 100 pb. În aceste cazuri se vor utiliza tehnici alternative (de ex.
ASO, MLPA, etc.).
Cantitatea de ADN necesară pentru realizarea metodei
depinde de dimensiunea şi activitatea specifică a probei, dar poate fi
considerabilă.
Pe de altă parte tehnica este costisitoare, laborioasă,
complexă, necesitând etape multiple şi manipulare îndelungată, iar
utilizarea marcării radioactive este periculoasă şi impune condiţii de
lucru speciale.
Adrese utile
• http://omrf.ouhsc.edu/~frank/toc.html
• http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/shockwave/southan.html
Bibliografie
• Bembea M. - Genetică medicală clinică. Ed. Universităţii Oradea,
2001;
• Covic M., Ştefănescu D., Sandovici I. - Genetică medicală. Polirom,
2004;
• Friedman J.M., Dill F.J., Hayden M.R., McGilivary B.C. - Genetics.
Williams & Wilkins, 1996;
• Kopper L., Marcsek Z., Kovalszky I. - Molekuláris medicina.
Medicina Kiadó Rt, 1997;
• Paşcanu I., Csép K., Mureşan C. – Aplicaţii practice în genetica
umană. University Press, 2005;
• Ştefănescu D., Călin G., Stefănescu F.C. - Genetică medicală -
Progrese recente. Ed. Tehnică - Seria Medicină, 1998.
159
160
6.4 Tipizarea ADN– obţinerea amprentelor ADN

Dr. Csép Katalin
Definiţie
Metodele de tipizare ADN, introduse în 1985 de către Sir
Alec Jeffreys, sunt tehnici utilizate pentru identificarea indivizilor
provenind din aceeaşi specie folosind o probă de ADN. La fel ca şi
dermatoglifele (fingerprint – amprentă digitală), modelul de benzi
obţinut prin tehnici diferite este o trăsătură moştenită, unică şi
caracteristică fiecărui individ, şi astfel prin analogie studiul acestora
se numeşte DNA fingerprinting.
Principii
Ordinea nucleotidelor în ADN determină informaţia
ereditară specifică speciei şi individului. În loc de determinarea
secvenţei din întregul genom, pentru simplificare în practica
medicală se urmăresc numai anumiţi loci hipervariabili.
Genomul uman conţine 3 miliarde perechi de baze (pb), din
care peste 99% este identic, dar la fiecare 100-1.000 nucleotide apar
variaţii interindividuale. Aceste variaţii sunt răspândite în întregul
genom: pot fi situate intragenic şi astfel se pot exprima în fenotip,
dar având în vedere cantitatea mare de ADN, majoritatea diferenţelor
apar la nivelul secvenţelor necodante, extragenice. Frecvenţa mare a
variaţiilor la nivel extragenic se explică şi prin faptul că fiind
anodine nu sunt supuse presiunii selecţiei naturale.
Mini- şi microsateliţii sunt repetiţii variabile în tandem ale
unor secvenţe scurte de nucleotide, şi se întâlnesc dispersaţi în
întregul genom. Trăsătura lor esenţială o constituie hiper-
variabilitatea. Frecvenţa mare a expansiunii şi reducerii valorii „n”,
este cauzată de uniformitatea structurală, care predispune la erori ale
ADN polimerazei în timpul replicării, la crossing over inegal în
timpul meiozei sau la schimb inegal de material genetic între
cromatidele surori în celulele somatice (SCE). Hipervariabilitatea se
caracterizează prin zeci sau sute de alele pentru acelaşi locus.
161
Majoritatea persoanelor sunt heterozigote pentru un anumit locus,

moştenind alele diferite de la cei doi părinţi.
Termenul de polimorfism ADN poate fi folosit în cazurile în
care există mai multe variante alelice pentru un anumit locus, iar
frecvenţa celor mai răspândite alele în populaţie este peste 1%. Deşi
aceste secvenţe de ADN nu sunt gene, noţiunile de locus, alelă,
homozigot şi heterozigot se folosesc şi în cazul acestora.
Indicaţii
Tipizarea ADN a devenit rapid abordarea de elecţie în
identificarea persoanelor, respectiv determinarea provenienţei unor
probe biologice cu conţinut de ADN, în domenii diferite (în special
în medicina legală) pentru:
• identificarea suspecţilor şi victimelor în criminalistică;
• identificarea persoanelor decedate în războaie sau catastrofe
naturale;
• expertizarea paternităţii;
• determinarea înrudirii şi originii.

Cele mai importante variante ale metodei sunt:
• studiul polimorfismului lungimii fragmentelor de restricţie
(RFLP - restriction fragment length polymorhism);
• studiul numărului variabil al repetiţiilor în tandem (VNTR -
variable number of tandem repeats, STR - Short Tandem
Repeats – repetiţii scurte în tandem).
Schimbarea secvenţei nucleotidice în ADN la nivelul

situsurilor de restricţie recunoscute specific de către enzimele de
restricţie poate determina dispariţia acestora, sau cea produsă în alte
secvenţe poate duce la crearea unor situsuri noi. În ambele cazuri
modificările produse vor duce la schimbarea lungimii fragmentelor
de restricţie şi diferenţa profilului de benzi obţinut după electroforeză
(RFLP). Mutaţii punctiforme precum substituţiile (transversii,
162
tranziţii), deleţiile şi inserţiile pot schimba – aboli sau crea – situsuri
de restricţie.
RFLP a fost prima tehnică de tipizare ADN folosită pentru
identificarea indivizilor şi a proveninenţei materialelor biologice în
medicina legală, realizată prin Southern blot cu hibridizarea unor
sonde sau amplificare PCR, electroforeză şi vizualizarea benzilor cu
bromură de etidiu.
Menţionăm însă că RFLP constituie o metodă de diagnostic
ADN direct în cazurile de mutaţii genice punctiforme care apar la
nivelul situsurilor de restricţie, determinând dispariţia acestora,
respectiv în interiorul altor secvenţe creând situsuri noi.
Poate fi considerată o altă categorie de RFLP şi urmărirea
mini- şi microsateliţilor (VNTR) cu număr variabil al repetiţiilor
între două situsuri de restricţie, care prin modificarea lungimii
fragmentelor de restricţie schimbă profilul de benzi după electro-
foreză.
Polimorfismul mini- şi microsateliţilor permite utilizarea
acestora şi ca markeri ai regiunii în care se află, determinând în acest
fel utilizarea lor prin analize de înlănţuire genetică în diagnosticul
ADN indirect şi cartografiere genetică.
Varianta STR este folosită în medicina legală din 1999 (SUA
şi Marea Britanie). STR sunt alcătuite din repetiţia în tandem a unor
secvenţe scurte în general de 3 - 5 nucleotide (de ex.
TCATTCATTCAT: (TCAT)n, n = 3) Secvenţele STR studiate sunt
amplificate cu amorse specifice, iar fragmentele sunt separate prin
electroforeză în gel sau capilară.
Polimorfismele STR urmărite sunt frecvente (prezente la 5 -
20% din populaţie), dar urmărind 13 loci, datorită asortării
independente, metoda permite excluderea identităţii unor probe luate
la întâmplare în ciuda originii diferite cu o probabilitate foarte mare
(1:1018).
Rezultatele se interpretează prin compararea modelelor de
benzi provenite din probele biologice diferite în funcţie de situaţie
(Fig. 6.4.1).
163
Probă biologică Victimă Suspect 1 Suspect 2

de origine
necunoscută
Fig. 6.4.1: Compararea profilurilor de benzi obţinute din proba biologică

găsită la locul unei crime cu cele provenite de la victimă şi cei doi suspecţi
(se confirmă provenienţa probei de la al doilea suspect)
În timp ce dermatoglifele pot fi alterate cu ocazia unor
traumatisme sau intervenţii chirurgicale, amprentele ADN sunt
identice în cazul fiecărei celule provenite din acelaşi organism şi nu
pot fi modificate. Datorită acestor considerente, tipizarea ADN,
indiferent de tehnica folosită, constituie alegerea optimă pentru
stabilirea identităţii.
Dezavantajul major constă în faptul că identitatea probelor
nu poate fi confirmată cu certitudine, numai cu o probabilitate
ridicată. Pentru creşterea probabilităţii sunt studiaţi mai mulţi loci
(în general 13 - 16) şi se pot urmări polimorfisme mai rare.
164
Interpretarea rezultatelor este limitată şi de existenţa unor
diferenţe populaţionale în ceea ce priveşte frecvenţa alelică, şi lipsa
cunoaşterii acestora.
Prima metodă introdusă a fost RFLP, dar în prezent se
foloseşte rar în acest scop, deoarece există alternative mult mai puţin
laborioase şi mult mai rapide, sensibile, robuste, care necesită
cantităţi de ADN mult mai mici chiar de calitate precară. Aceste
tehnici noi bazate pe amplificare prezintă însă şi dezavantajele
reacţiei de PCR. VNTR rămâne şi în continuare o metodă populară,
datorită simplităţii, costului relativ redus, rapidităţii şi gradului
crescut de automatizare. În prezent cea mai folosită metodă este
STR. Varianta Y-STR permite o tipizare rapidă diferenţiată la
bărbaţi, iar originea uniparentală paternă poate fi de ajutor pentru
stabilirea înrudirii.
În anumite situaţii ADN-ul mitocondrial, prin trăsături
multiple care îl deosebesc de ADN-ul nuclear, poate fi folosit
preferenţial. Ereditatea uniparentală maternă şi numărul mare de
copii în celule permit utilizarea ADN-ului mitocondrial din probe
vechi, oase şi dinţi, iar diferenţe la nivelul unui singur nucleotid pot
fi suficiente pentru excludere.
Adrese utile
• http://www.jgi.doe.gov/
• http://www.jgi.doe.gov/education/how/
Bibliografie
• Strachan Th., Read A. - Human Molecular Genetics. Bioscientific
Publishers, 1999;
165
166
6.5 MLPA şi MAPH

Dr. Rusu Cristina
MLPA
Definiţie
MLPA (multiplex ligation- dependent probe amplification)
este o tehnică moleculară recent introdusă bazată pe PCR, care
permite analizarea într-un singur test a până la 40 secvenţe diferite de
ADN folosind o singură pereche de amorse. Pot fi analizate deci
regiuni cromozomiale diferite, gene diferite sau exoni ai unei gene.
Pentru fiecare secvenţă de analizat se pregătesc 2 secvenţe
oligonucleotidice (complementare cu jumătate din secvenţa de
analizat, dar care au la capăt şi un fragment identic pentru toate
secvenţele).
Oligonucleotidele se leagă la secvenţele de analizat, după
legare cele 2 jumătăţi fiind unite printr-o ligază. Apoi sondele
oligonucleotidice sunt amplificate prin PCR cu amorse fluorescente,
iar produşii de amplificare sunt analizaţi prin electroforeză capilară
de tip secvenţiere.
Indicaţii
Principalele aplicaţii ale tehnicii MLPA se referă la:
• Detecţia aneuploidiilor (anomalii de număr ale cromozomilor
13, 18, 21, X şi Y);
• Detecţia deleţiilor sau duplicaţiilor cromozomiale mari:
Sindrom velo- cardio- facial, Williams, atrofia musculară
spinală, retard mintal idiopatic (regiuni subtelomerice) etc;
• Detecţia anomaliilor genice (în plus sau în minus) în
ţesuturile tumorale: TP53, MYC etc;
• Detecţia deleţiilor sau duplicaţiilor ce afectează unul sau mai
mulţi exoni: distrofia musculară Duchenne/ Becker, talasemie,
167
BRCA 1 şi 2 (cancer de sân), MECP2 (Sindrom Rett), APC

(polipoză de colon), NF2 (neurofibromatoză) etc;
• Detecţia mutaţiilor punctiforme şi a SNP;
• Cuantificarea relativă a ARNm în inflamaţie sau apoptoză;
• Detecţia metilării regiunii critice Prader Willi/ Angelmann sau a
promotorilor genelor supresoare de tumori.
Principii
Sondele folosite în tehnica MLPA au o structură particulară
(Fig. 6.5.1), fiind formate din două secvenţe oligonucleotidice:
Regiune ţintă 1 Regiune ţintă 2
Modelul sondei
Oligonucleotid sintetic Oligonucleotid derivat M13
Loc de legare Secvenţe Secvenţa de Loc de legare

amorsa X specifice ţintei diferenţiere amorsa Y
Fig. 6.5.1: Structura unei sonde folosite în tehnica MLPA
• Oligonucleotidul sintetic - conţine următoarele secvenţe:

o Secvenţă complementară primei jumătăţi a secvenţei de
analizat;
168
o Secvenţă complementară amorsei X – identică pentru toate
secvenţele de analizat;
• Oligonucleotidul derivat M13 - conţine:
o Secvenţă complementară celei de-a doua jumătăţi a secvenţei
de analizat;
o Secvenţă de diferenţiere – fragmente de ADN cu lungime
diferită pentru fiecare secvenţă de analizat, ceea ce va
determina lungimi diferite ale sondelor şi respectiv ale
produşilor PCR, făcând posibilă diferenţierea fragmentelor
prin electroforeză (pe baza lungimii);
o Secvenţă complementară amorsei Y – identică pentru toate
secvenţele de analizat.
Realizarea tehnicii MLPA presupune parcurgerea etapelor
prezentate schematic în Fig. 6.5.2:
• Hibridizarea secvenţelor oligonucleotidice specifice la
secvenţele de analizat (în soluţie); dacă secvenţa de analizat nu
are structura normală, secvenţa oligonucleotidică nu se poate
lega, cea ce va duce la oprirea reacţiei pentru fragmentul
respectiv;
• Unirea celor 2 secvenţe oligonucleotidice prin intermediul
ligazei; rezultatul este sonda;
• Amplificarea prin PCR a sondelor, folosind aceleaşi amorse (X
şi Y) pentru toate sondele;
• Electroforeza produşilor de amplificare, care va duce la
diferenţierea fragmentelor în funcţie de lungime;
• Analiza computerizată a produşilor de amplificare –
amplitudinea vârfurilor este comparată cu o probă martor. De
exemplu în cazul unei duplicaţii (pe unul din cei 2 cromozomi
omologi), cantitatea de sonde legate va fi mai mare (1,5 x
normal), rezultând o cantitate mai mare de produşi de
amplificare şi deci o amplitudine de 1,5 ori fată de normal a
vârfului respectiv (Fig. 6.5.3).
169

Ligare
Amplificare PCR cu amorse

universale X şi Y
Analiză GeneScan
Mărime (pb)
Fig. 6.5.2: Etapele tehnicii MLPA
170

Alela 1
Alela 2
Alela 3 Regiune ţintă 2
Regiune ţintă 1
Raport vârfuri: 1/1,5 Raport vârfuri: 1/1
Mărime (pb)
Fig. 6.5.3: Duplicaţie identificată prin tehnica MLPA
Interpretarea rezultatelor trebuie să ţină cont de poziţia
vârfurilor şi de mărimea lor, făcând comparaţia cu o curbă martor
normală. Pot fi întâlnite următoarele tipuri de rezultate:
• Aneuploidii – de obicei kitul conţine sonde pentru cromozomii
cel mai frecvent implicaţi (13, 18, 21, X şi Y):
o Trisomie: vârful pentru cromozomul implicat are
amplitudinea 1,5 x normal (există 3 copii în loc de 2);
o Monosomie: vârful pentru cromozomul implicat are
amplitudinea 0,5 x normal;
• Deleţie
o Autosomi - lipsa vârfului corespunzător unui exon (homo-
zigot, deleţie pe ambii cromozomi) sau vârf cu amplitudinea
0,5 x normal (heterozigot, deleţie pe un singur cromozom);
o Afecţiuni legate de X (ex. Distrofia musculară Duchenne):
băieţi- lipsa vârfului confirmă prezenţa deleţiei; la femeile
purtătoare deleţia va apare sub forma unui vârf 0,5 x normal;
171
• Duplicaţie – vârf 2 x normal înseamnă fie duplicaţie pentru o

genă legată de X la băieţi, fie duplicaţie în stare homozigotă
(pentru gene autosomale); vârf 1,5 x normal semnifică fie
femeie purtătoare de duplicaţie (gene legate de X), fie duplicaţie
în stare heterozigotă (gene autosomale);
• Rearanjamente subtelomerice (deleţii sau duplicaţii) – se
folosesc sonde pentru regiunile subtelomerice p şi q ale tuturor
cromozomilor, cu excepţia braţelor p ale acrocentricilor; absenţa
unui vârf semnifică deleţie sau polimorfism (vezi mai jos); vârf
1,5 x normal semnifică duplicaţie;
• Mutaţiile punctiforme duc la dimensiuni mai mari/ mai mici ale
secvenţei de analizat, vârful fiind decalat faţă de poziţia
normală; polimorfismele pot să ducă la lipsa de fixare a uneia
din cele 2 secvenţe oligonucleotidice (ca în deleţie), cu lipsa
vârfului. De aceea, pentru a exclude polimorfismele, se
recomandă testarea în paralel cu 2 kituri, în care sondele se
leagă decalat la secvenţa de analizat;
• Analiza metilării – se practică în acelaşi timp reacţia cu ligază
şi digestia cu endonucleaze sensibile la metilare; în cazul
secvenţelor metilate endonucleaza va fi inactivată şi deci
secvenţa de analizat rămâne intactă; în cazul secvenţelor
nemetilate endonucleaza taie catena de ADN, care nu va mai
putea fi analizată; secvenţele complet metilate apar sub forma
unui vârf; secvenţele parţial metilate determină un vârf mai mic,
iar dacă secvenţa de analizat este nemetilată, vârful lipseşte
(vezi Fig. 6.5.4).

MLPA prezintă dezavantajul că secvenţele de analizat pot
avea dimensiuni numai între 100 şi 450 pb şi se pot analiza numai 40
probe la un singur test. Pentru a depăşi aceste inconveniente,
specialiştii din domeniu au introdus Array MLPA. Pe lângă creşterea
numărului de probe, tehnologia specifică metodei array determină
eliminarea oligonucleotidului derivat M13 (dificil de sintetizat), ceea
ce constituie un real avantaj.
172
Ţintă 1 metilată Ţintă 2 nemetilată

Denaturare, hibridizare
Ligare, digestie (endonucleaze sensibile la metilare) Complet metilată

Ţinta 1 Ţinta 2
50% metilată
PCR (amorse universale X şi Y)
Numai sonde ligate
sunt amplificate
Nemetilată
Analiza fragmentelor
Fig. 6.5.4: Analiza metilării prin tehnica MLPA
MAPH
Definiţie
MAPH (multiplex amplification and probe hybridization)
este o tehnică prin care ADN genomic este fixat pe o membrană şi
hibridizat cu un set de sonde corespunzător secvenţelor ţintă ce
trebuie detectate. Membranele sunt apoi spălate riguros pentru a
îndepărta sondele nelegate. Sondele legate sunt desprinse de pe
membrană şi amplificate simultan cu perechea universală de amorse.
Produşii de amplificare sunt separaţi prin electroforeză. Analiza
rezultatelor se face prin aprecierea intensităţii benzilor sau a înălţimii
vârfurilor.
Indicaţii
Indicaţiile tehnicii MAPH sunt:
• Detecţia deleţiilor sau duplicaţiilor cromozomiale mari;
• Detecţia deleţiilor sau duplicaţiilor ce afectează unul sau mai
mulţi exoni (în gene mari).
173
Principii
Realizarea tehnicii MAPH presupune următoarele etape
(vezi Fig. 6.5.5):
• Fixarea ADN genomic pe fragmente de hârtie de filtru; pentru
o reacţie este necesar 1 µg ADN; se folosesc atâtea fragmente
câte secvenţe vrem să testăm, fiecare fragment fiind introdus
într-un godeu (pe o placă cu godeuri);
• Hibridizarea sondelor specifice cu ADN-ul de analizat;
• Spălarea fragmentelor de hârtie de filtru (agresiv) pentru
îndepărtarea sondelor nelegate; în acest fel cantitatea de sonde
legate va fi proporţională cu cantitatea de secvenţe de analizat;
• Amplificarea prin PCR a sondelor, folosind aceleaşi amorse (X
şi Y) pentru toate sondele; amorsele conţin un fluorocrom care
ajută la identificarea ulterioară a produşilor de amplificare;
• Electroforeza produşilor de amplificare;
• Analiza computerizată a produşilor de amplificare –
amplitudinea vârfurilor este comparată cu o probă martor.
Hârtie de filtru Amorsă
cu ADN genomic Amestec de sonde Amorsă Situs de legare finală
iniţială
Secv.
de
ADN genomic difer.
Hibridizare peste noapte Hibridizare peste noapte
Spălare
Ligare
Transfer probe
Hârtie de filtru Amplificare Analiză Amplificare Analiză

în tuburi PCR PCR produşi PCR produşi
Denaturare PCR PCR
termică
Fig. 6.5.5: Comparaţie MAPH (stânga) – MLPA (dreapta)
174
Aprecierea rezultatelor unei testări MAPH se face după
aceleaşi principii ca şi la tehnica MLPA.

Pentru a creşte numărul de probe analizate simultan, recent a
fost introdusă tehnica Array MAPH.
Atât MLPA, cât şi MAPH sunt tehnici robuste, potenţial
aplicabile în diferite domenii, cu realizarea unui număr mai mic sau
mai mare de teste simultan. Ambele tehnici sunt la fel de sensibile la
calitatea probei de ADN.
Ambele tehnici au avantajul de a folosi amorse universale,
ceea ce dă posibilitatea de a efectua mai multe teste concomitent (test
tip multiplex). În plus, se foloseşte un singur fluorocrom pentru
identificare. Ambele condiţii conduc la reducerea substanţială a
costului testării.
În ceea ce priveşte sintetizarea sondelor în laboratorul
propriu, tehnica MAPH este mult mai avantajoasă (sinteza
oligonucleotidului derivat M13 pentru metoda MLPA este este foarte
dificilă tehnic).
Unul dintre dezavantajele tehnicii MAPH este riscul de
contaminare. Prin comparaţie, în cazul metodei MLPA se produce
amplificarea numai dacă ambele jumătăţi ale sondei s-au legat la
secvenţa de analizat (şi numai dacă aceasta este normală).
Etapa de spălare din cadrul MAPH este deosebit de
importantă. O spălare insuficientă poate duce la un exces de sonde,
cu furnizarea de rezultate incorecte.
Deoarece MLPA se realizează numai în fază lichidă, se
poate preta la automatizare, cu realizarea unui număr mare de teste
într-un timp scurt.
MAPH foloseşte 1µg ADN pentru un test, pe când în cazul
MLPA sunt necesare numai 20 ng ADN.
Polimorfismele sau mutaţiile ce afectează o singură bază
azotată pot afecta rezultatul MLPA (dând rezultat fals pozitiv de
175
deleţie). De aceea se preferă testarea în paralel cu 2 kituri cu sonde

ce se inseră uşor decalat. Polimorfismele nu afectează MAPH.
Adrese utile
• www.mrc-holland.com/
Bibliografie
• Dent K.M., Dunn D.M., von Niederhausern A.C. et al - Improved
Molecular Diagnosis of Dystrophinopathies in an Unselected
Clinical Cohort, Am J Med Genet 134A:295–298 (2005);
• Dudarewicz L., Holzgreve W., Jeziorowska A. et al - Molecular
methods for rapid detection of aneuploidy, J Appl Genet 46(2),
2005, pp. 207-215;
• Hollox E J, T Atia, G Cross, T Parkin, J A L Armour - High
throughput screening of human subtelomeric DNA for copy
number changes using multiplex amplifiable probe hybridisation
(MAPH), J Med Genet 2002; 39:790–795;
• Sellner L., Taylor G - MLPA and MAPH: New Techniques for
Detection of Gene Deletions, Hum Mut 23:413-419 (2004);
• White S.J., Sterrenburg E., van Ommen G-J B et al - An alternative
to FISH: detecting deletion and duplication carriers within 24
hours, J Med Genet 2003;40, 113-116.
176
6.6 Hibridizarea genomică comparativă cu

microcipuri ADN (array CGH)
Definiţie
Hibridizarea Genomică Comparativă cu microcipuri ADN
(a-CGH) este o metodă recent adoptată în laboratoarele clinice, care
poate detecta modificările numărului de copii ADN asociate
anomaliilor cromozomiale la o rezoluţie superioară metodei CGH
standard. Array CGH utilizează 2 probe de ADN genomic (test şi
martor) marcate diferit, care sunt hibridizate simultan cu ţinte de
ADN care se găsesc înşiruite pe o lamă de sticlă sau altă platformă
solidă.
Indicaţii
Array CGH permite examinarea întregului genom la o
rezoluţie înaltă (5-10 kilobaze) şi poate identifica amplificări
cromozomiale, microdeleţii şi rearanjamente neechilibrate,
furnizând date numeroase şi reproductibile privind locii genomici ai
bolii. Asemenea dezechilibre cromozomiale sunt frecvent întâlnite în
majoritatea tumorilor şi în multe din anomaliile congenitale. Array
CGH poate fi deci utilizată la:
• identificarea şi caracterizarea modificărilor genomice asociate
cu procesul de oncogeneză;
• identificarea unor noi regiuni cromozomice (ex: oncogene -
regiuni amplificate sau gene supresoare de tumori - regiuni
deletate) ca potenţiale ţinte terapeutice;
• înregistrarea diferitelor etape ale progresiei metastatice;
• dezvoltarea unor biomarkeri specifici care să ajute la stabilirea
diagnosticului şi prognosticului bolilor şi la precizarea unor
sub-clasificări ale bolii (subtipuri ale tumorii);
177
• explorarea mecanismelor de rezistenţă la medicamente

asociate cu schimbările genomice. De exemplu, în leucemia
mieloidă cronică, duplicaţii ale cromozomului Philadelphia şi o
creştere a numărului de copii ale oncogenei BCR-ABL s-au
dovedit a fi asociate cu rezistenţa la imatinib mesylate;
• definirea modificărilor genetice constituţionale sau dobândite.
Principii:
În aCGH fragmente unice de ADN (sondele nemarcate) sunt
ataşate de un substrat solid, care de obicei este sticlă. Un punct de
vedere simplist prin care se realizează acest lucru este următorul:
câteva mii de sonde imobilizate de acizi nucleici diferiţi cunoscuţi
sunt sintetizate sau depozitate cu ajutorul robotului într-un tipar
prestabilit pe o lamă de sticlă. Pentru majoritatea cip-urilor array,
există câte o sondă la fiecare 100-1000 µm2. Pentru fiecare sondă
depozitată într-o anumită locaţie pe cipul array se cunoaşte şi locaţia
acelei sonde în genom. Astfel, orice semnal detectat prin scanarea cu
microscopul confocal a unei lame hibridizate (o anumită sondă)
poate fi asociată prin intermediul unui software cu locaţia sa
cunoscută din genom.
Ţintele ADN pentru microarray pot proveni din clone
genomice precum cromozomii artificiali de levuri (YAC; pot
încorpora fragmente de ADN de 0,2-2 Mb), cromozomi artificiali
bacterieni (BAC, până la 300 kb), plasmide (~ 70-100 kb),
bacteriofagi (~ 130-150 kb) şi cosmide (~ 30-45 kb) şi sunt de câteva
ori mai mici decât ţintele cromozomiale. Această scădere în
dimensiuni a ţintei creşte rezoluţia de detecţie a dezechilibrului
numărului de copii faţă de CGH cromozomial. Practic rezoluţia
tehnicii este determinată de numărul de clone din array, de lungimea
genomică a clonelor şi de spaţierea genomică dintre ele. Având în
vedere diferenţele de complexitate structurală a ADN-ului ţintă faţă
de CGH cromozomial este necesară modificarea condiţiilor de
hibridizare.
Cromozomii artificiali bacterieni (BAC) constau în ADN de
E. coli care poartă segmente mari de cromozomi de mamifere, cu o
178
lungime de 150.000–200.000 pb. Aceste segmente ADN au fost
identificate prin poziţia lor de-a lungul fiecărui cromozom şi
corespund braţelor p şi q, centromerelor şi regiunilor telomerice din
fiecare cromozom. Aceste poziţii şi identitatea BACs sunt catalogate
în baza de date a Centrului Naţional pentru Informaţie Biologică
(NCBI). În funcţie de numărul de BACs ales, poate fi reprezentat
întregul genom pe un array cu acizi nucleici cu o anumită rezoluţie.
De exemplu, dacă se folosesc 2,600 BACs pentru a alcătui un array,
genomul va fi reprezentat cu o rezoluţie medie de o megabază de-a
lungul fiecărui cromozom. Array-uri specializate pot fi create prin
selectarea clonelor BAC asociate cu ajutorul bioinformaticii unei
anumite boli. De exemplu, Spectral Genomics a creat un Cip
Constituţional ™ folosind 464 clone BAC ce acoperă regiunile
cromozomiale cu amplificări sau deleţii în 40 sindroame cunoscute sau
defecte constituţionale ce asociază retard mintal, pentru cercetare în
diagnosticele genetice prenatale şi postnatale. Printre aceste
sindroame se numără trisomia 21, trisomia 18, sindromul Wolf-
Hirschorn, sindromul velo-cardio-facial şi rearanjamentele
subtelomerice.
Atunci când ADN-ul provenit de la pacient este amestecat cu
ADN-ul de referinţă şi competiţionează pentru hibridizarea cu sondele
de pe array, amplificările sau numărul de copii multiple ale
fragmentelor cromozomice din ADN-ul pacientului vor avea ca rezultat
o hibridizare favorabilă a probei pacientului faţă de ADN-ul de
referinţă normal, iar deleţiile vor avea ca rezultat o hibridizare
favorabilă a ADN-ului normal (vezi Fig. 6.6.1).
Gradul hibridizării este uşor detectat prin marcarea probelor de
ADN (de la pacient şi cel de referinţă) cu doi coloranţi fluorescenţi
diferiţi (Cy3 şi Cy5), amestecare şi observarea petelor verzi şi roşii, care
indică hibridizarea preferenţială, versus fluorescenţa galbenă, care
indică faptul că ADN-ul pacientului şi cel normal sunt hibridizate egal
cu sondele (vezi Fig. 6.6.2).
După ce hibridizarea este completă, array-ul este scanat
folosind unul dintre scanerele laser microarray disponibile. Rezultatele
hibridizării competitive de pe array pot fi reprezentate folosind
diferite aplicaţii software special concepute pentru analiza şi expunerea
179
datelor array CGH. Modul de expunere este special creat pentru ca

datele să fie uşor de citit şi interpretat.
Fig 6.6.1: Principiul tehnicii array CGH
Fig. 6.6.2: Imagine fluorescentă a unei

porţiuni de array CGH. Zonele colorate
în verde reprezintă deleţii, cele colorate
în roşu – amplificări, iar cele galbene
indică faptul că ADN-ul pacientului şi
cel normal au hibridizat în mod egal.
Principalele avantaje ale tehnicii array CGH constau în:
• Rapiditate: sub 48 ore pentru testare şi analizarea rezultatelor;
180
• Rezoluţie crescută: extinde aria de aplicare a tehnicii; are
posibilitate de detecţie a unor anomalii cromozomice relevante
clinic, dar care nu sunt vizibile la microscop;
• Testele produc date obiective: nu este necesară interpretarea
imaginilor;
• Zonă de acoperire mai mare: cercetătorul poate vedea toţi
cromozomii în acelaşi timp;
• Uşor de efectuat: datele pot fi generate de tehnicieni cu
cunoştinţe generale de laborator şi sunt procesate şi prezentate
în mod automat, sub formă de tabele şi grafice.
Spre deosebire de CGH clasic (care foloseşte cariotiparea
cromozomilor, este laborioasă, necesită culturi de celule şi rezultatele
sunt uneori neclare), array CGH este o “cariotipare moleculară” mai
uşor de folosit, având rezultate mai obiective şi permiţând analizarea
rezultatelor cu ajutorul unui software.
Deşi array-urile pentru întregul genom permit clinicienilor şi
cercetătorilor accesul fără precedent la pierderile/câştigul de material
genetic din genom, în special la nivel submicroscopic, aceste array-
uri au şi unele dezavantaje. Unul dintre ele se referă la variaţiile
normale ale numărului de copii. Într-un studiu publicat în American
Journal of Human Genetics, (vol. 77, pp. 606–616, 2005) s-a efectuat
un screening pe 100 indivizi cu array CGH pentru întregul genom;
10% dintre subiecţi aveau anomalii cromozomiale relevante din
punct de vedere clinic, dar 97% din cohortă prezenta anumite tipuri
de modificări în numărul de copii ADN moştenite de la părinţi cu
fenotip normal.
Cea mai frecvent folosită platformă de clonare pentru CGH
este clona BAC şi ocazional YAC sau PAC. Aceste clone au multe
avantaje, dar o rezoluţie limitată. Clonele au dimensiuni de
aproximativ 80 kb, iar suprapunerea lor poate duce rezoluţia totală
până spre 50 kb. Pentru a atinge o rezoluţie mai joasă trebuie luate în
considerare alte platforme.
Array CGH nu poate detecta anomaliile cromozomiale fără
modificări ale numărului de copii ADN; pentru acestea este nevoie
de FISH cu sonde specifice pentru punctul de ruptură al translocaţiei.
181
O altă problemă a array CGH este legată raportul

semnal/zgomot; principalul factor implicat în acest raport este
detecţia semnalului ADN-ului marcat legat de o sondă dată, faţă de
legarea nespecifică de fundalul lamei. Diferitele tipuri de cipuri array
pot fi separate în 2 grupuri:
• de complexitate joasă (ADN complementar, oligonucleotide,
SNP), care au o intensitate fundal/semnal mai mare (ceea ce
face dificilă detecţia unei singure modificări a numărului de
copii);
• de complexitate înaltă (ADN BAC sau PAC) care au o
intensitate semnal/fundal crescută (permit detecţia unei singure
modificări a numărului de copii).
Indiferent de cipul array folosit, se pare că raportul semnal/fundal va
fi întotdeauna mai slab dacă se foloseşte ADN provenit din ţesuturi
fixate cu formol şi incluse în parafină în loc de ţesuturi congelate, de
calitate înaltă.
Alte probleme legate de această tehnologie se referă la
modificările genomice aleatorii în tumorile complexe din punct de
vedere al cariotipului şi la variaţiile normale ale numărului de copii
(LCV) aflate în întreg genomul. Examinarea unui grup de tumori
similare şi acceptarea doar a modificărilor recurente peste un anumitt
procent poate rezolva problema modificărilor genomice aleatorii în
tumorile complexe din punct de vedere al cariotipului. Pentru a
aplica aCGH în domeniul clinic al patologiei va fi necesară o bază de
date complexă cu probe necesare pentru comparaţie.
Bibliografie
• Beheshti B., P.C. Park, I. Braude, J.A. Squire. Microarray CGH.
Methods Mol Biol. 204:191-207, 2002. http://individual.utoronto.ca/
beheshti/PDF/2002_Beheshti_Microarray_CGH.pdf;
• Chait Edward: Bac clone arrays measure disease-associated
chromosomal changes, Genetic Engineering News, Volume 24,
Number 10 May 15, 2004;
• Kong Chuang-Fong, Christopher Williams, and Amy McCann: High
Throughput Genomic Analysis using Comparative Genomic
182
Hybridization using (aCGH) http://las.perkinelmer.com/Content/
RelatedMaterials/Posters/PST_HTGenomicAnalysisUsingaCGH.pdf;
• Morrison Carl: Fluorescent In Situ Hybridization and Array
Comparative Genomic Hybridization: Complementary
Techniques for Genomic Evaluation, Archives of Pathology and
Laboratory Medicine 2006: Vol. 130, No. 7, pp. 967–974;
• Peterson Scott - Microarray Analysis: Practical Considerations and
Applications.
http://pfgrc.tigr.org/presentations/tigr_asm_conf/analysis.pdf;
• Shaffer Catherine: Array CGH Changes Genetic Diagnostics
http://www.genpromag.com.
183
184
6.7 Analiza mutaţiilor ADN folosind sonde

oligonucleotidice specifice unei alele (ASO)
Definiţie
Tehnica ASO (allele specific oligonucleotide hybridization)
poate detecta una sau mai multe mutaţii specifice cunoscute în
populaţie, cu ajutorul unor sonde nucleotidice scurte, specifice pentru
o anumită secvenţă ADN (mutaţie).
Indicaţii
Această tehnică de detecţie a mutaţiilor este folosită în
special pentru bolile genetice caracterizate printr-un număr mic de
mutaţii, precis definite (de exemplu la populaţiile de evrei Ashkenazi
şi pentru alte mutaţii cu efect de fondator).
Principii
Tehnica ASO constă în detectarea prezenţei sau absenţei
unei mutaţii punctiforme (la nivelul unui singur nucleotid) prin
realizarea hibridizării moleculare între secvenţa de testat şi 2 sonde
monocatenare specifice (una pentru alela normală şi cea de-a doua
pentru alela mutantă) corespunzătoare regiunii genice unde au fost
localizate mutaţii. Dacă sonda este suficient de scurtă (în general 20
de nucleotide), ea va putea hibridiza cu secvenţa de testat numai dacă
aceasta este perfect complementară. Astfel, oligosonda normală va
hibridiza stabil numai cu alela normală, nu şi cu cea mutantă, iar
oligosonda mutantă se va împerechea stabil doar cu alela mutantă, nu
şi cu cea normală. Hibridizările încrucişate nu sunt stabile datorită
împerecherii greşite între baze necomplementare (vezi Fig. 6.7.1).
Hibridizarea fiecăreia dintre cele 2 sonde face astfel posibilă
determinarea fără ambiguitate a genotipului pacientului la nivelul
locusului unei anumite mutaţii.
185
Cele două sonde sunt marcate radioactiv (cu 32P) sau

fluorescent (cu digoxigenină) pentru a putea detecta hibridizarea
moleculară prin autoradiografie.
Fig. 6.7.1: Principiu de funcţionare în tehnica ASO
Practic, ADN-ul pacientului este amplificat cu ajutorul PCR

la nivelul zonei de interes, produsul PCR este denaturat (pentru a
deveni monocatenar) şi apoi este depozitat în anumite puncte pe o
membrană de nitroceluloză. După o etapă cunoscută sub numele de
prehibridizare în timpul căreia membrana ce conţine ADN-ul este
supusă unor anumite condiţii de temperatură, pH şi salinitate
necesare hibridizării (condiţii de stringenţă înaltă), aceasta are loc
prin punerea în contact a ADN-ului cu una dintre oligosonde. Atunci
când o moleculă de sondă ADN va întâlni o moleculă ţintă de ADN
(produsul PCR), complementaritatea secvenţelor va permite
reasocierea celor două molecule monocatenare într-o moleculă
bicatenară. După o etapă de spălări, ce are rolul de a elimina
moleculele de sonde marcate nehibridizate, membrana este supusă
unei autoradiografii care va permite vizualizarea punctelor unde a
avut loc hibridizarea.
Dacă ADN-ul pacientului hibridizează numai cu oligosonda
specifică alelei mutante, atunci mutaţia pentru care s-a realizat
testarea este prezentă, iar pacientul este homozigot (afectat).
Dacă hibridizarea are loc atât cu sonda normală, cât şi cu cea
mutantă, atunci pacientul este purtător heterozigot.
186
Hibridizarea numai cu sondele normale semnifică absenţa
mutaţiei cercetate (vezi Fig. 6.7.2).
Fig. 6.7.2: Interpretarea rezultatelor la testul ASO: godeul din stânga –

individ normal - hibridizare numai cu sonda normală; godeul din mijloc –
individ heterozigot (purtător) – hibridizare cu ambele sonde; godeul din
dreapta – individ bolnav – hibridizare numai cu sonda anormală.

DASH (Dynamic Allele Specific Hybridization)
Tehnica DASH păstrează simplicitatea tehnicii ASO, dar
face şi discriminarea clară între SNP folosind condiţii de reacţie
standardizate. Reacţia are loc pe o placă cu 96 de godeuri tip Elisa
(care se pretează la automatizare). Se folosesc metode convenabile
de detecţie a semnalului fluorescent.
Principiul metodei este schiţat în Figura 6.7.3.
187
Fig. 6.7.3: Principiul metodei DASH
O secvenţă ţintă este amplificată prin PCR în care una dintre

amorse este biotinilată. Catena biotinilată este legată de un godeu
(din placa cu godeuri) tapetat cu streptavidină, iar cea ne-biotinilată
este îndepărtată folosind o soluţie de alcali (care produc denaturarea).
O sondă oligonucleotidică specifică pentru o alelă este hibridizată cu
ţinta la temperatură joasă. Se formează un duplex ADN care
interacţionează cu un marker fluorescent (ce se intercalează între cele
2 catene). După excitare, markerul emite un semnal fluorescent
proporţional cu cantitatea de ADN bicatenar (duplex sondă-ţintă)
prezentă. Proba este apoi supusă încălzirii progresive, semnalul
fluorescent fiind monitorizat continuu. O scădere rapidă a semnalului
indică temperatura de denaturare (sau „topire”) a duplexului sondă-
ţintă. Atunci când se realizează în condiţii corespunzătoare (de
tampon şi colorant), o eroare de împerechere a unei singure perechi
de baze între sondă şi ţintă are ca rezultat o scădere dramatică a
188
temperaturii de topire (Tm), ce poate fi detectată cu uşurinţă (vezi
Fig. 6.7.4). În cazul indivizilor normali vârful apare la temperaturi
înalte. La indivizii afectaţi (homozogoţi) se înregistrează un singur
vârf la temperatură scăzută. La heterozigoţi se înregistrează două
vârfuri.
Fig. 6.7.4: Interpretarea rezultatelor la testul DASH : albastru – homozigot

normal; roşu – heterozigot; galben – homozigot anormal.
Metodele ASO şi DASH permit detecţia rapidă şi eficientă a
mutaţiilor şi sunt automatizabile.
Sunt metode mai simple, mai rapide (nu necesită fracţionarea
ADN) şi mai sensibile decât Southern blot.
Sunt tehnici mai puţin costisitoare decât căutarea unei
mutaţii noi la membrii unei familii.
Deşi ASO este o metodă sensibilă la alterări minime ale
secvenţei genice (putând depista mutaţii ale unei singure perechi de
baze), ea este consumatoare de timp. Dezavantajele majore sunt însă
marcarea sondelor oligonucleotidice cu radioizotopi (folosirea
materialelor radioactive) şi imposibilitatea detectării mutaţiilor din
alte regiuni decât cele explorate prin sonda ASO, dacă acestea sunt
prezente. Polimorfismele care se găsesc lângă locusul mutaţiei pot
complica analiza.
Adrese utile
• http://www.informatics.jax.org/silver/frames/frame8-3-2-2.shtml
189
• http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR.html
• http://las.perkinelmer.com/content/snps/protocol.asp
Bibliografie
• Covic Mircea, Sandovici Ionel, Ştefănescu Dragoş – Genetică
medicală, Ed. Polirom 2004;
• Knight Julian, William McGuire, Moses Mosobo Kortok, Dominic
Kwiatkowski: Accuracy of Genotyping of Single-Nucleotide
Polymorphisms by PCR-ELISA Allele-specific Oligonucleotide
Hybridization Typing and by Amplification Refractory Mutation
System (Clinical Chemistry. 1999;45:1860-1863.);
• Randall K. Saiki, P. Sean Walsh, Corey H. Levenson, Henry A. Erlich:
Genetic Analysis of Amplified DNA with Immobilized Sequence-
Specific Oligonucleotide Probes - PNAS 1989 86: 6230-6234.
190
6.8 Testul de trunchiere a proteinelor (PTT)

Dr. Rusu Cristina
Definiţie
Testul de trunchiere a proteinelor (PTT) este un test rapid şi
eficient care depistează mutaţiile care duc la terminarea prematură a
translaţiei, cu producerea unei proteine mai scurte.
Indicaţii
Metoda a fost introdusă pentru diagnosticul Distrofiei
musculare Duchenne, dar ulterior a fost aplicată pentru multe alte
afecţiuni (vezi Tabel 6.8.1).
Tabel 6.8.1: Afecţiuni pentru diagnosticul cărora este util PTT

Boala % mutaţii Gena
cu
trunchiere
Polipoză adenomatoasă de colon 95 APC
Boala desmoidă ereditară 100 APC
Ataxie- telangiectazie 90 ATM
Cancer ereditar de sân şi ovar 90 BRCA1
90 BRCA2
Fibroză chistică 15 CFTR
Distrofie musculară Duchenne 95 DMD
Distrofie musculară Emery- Dreyfuss 80 EMD
Anemia Fanconi 80 FAA
Sindromul Hunter 50 IDS
Cancer colorectal nonpolipozic ereditar 80 hMSH2
70 hMLH1
Neurofibromatoză tip 1 50 NF1
Neurofibromatoză tip 2 65 NF2
Boala rinichiului polichistic 95 PKD1
Sindrom Rubinstein- Taybi 10 RTS
191
În general, testul proteinelor trunchiate este indicat în

următoarele situaţii practice:
• Mutaţii stop sau cu decalarea cadrului de lectură, care conduc
la formarea unui ARNm anormal ce determină sinteza unei
proteine mai scurte (trunchiate);
• În cazul afecţiunilor în care majoritatea cazurilor sunt
determinate de o singură mutaţie, pentru elucidarea situaţiilor
în care nu se găseşte mutaţia tipică; de exemplu, în fibroza
chistică, 70% dintre mutaţii sunt cunoscute; jumătate din restul
de 30% sunt mutaţii ce pot fi depistate prin PTT;
• Aprecierea relaţiei genotip/ fenotip – de obicei fenotipurile
severe sunt determinate de proteine trunchiate ce pot fi depistate
prin PTT;
• Diagnosticarea afecţiunilor în care există mai multe copii
genice (nu se poate folosi numai PCR).
Principii
Principiul testului de trunchiere a proteinelor constă în
scanarea unei gene codante pentru mutaţii ce induc terminarea
precoce a translaţiei, folosind sinteza proteică de novo dintr-o copie
amplificată (vezi Fig. 6.8.1).
Tehnica include trei trepte importante:
• Izolarea ADN genomic şi amplificarea secvenţei genice ţintă
folosind PCR
Sau
Izolarea ARNm şi amplificarea secvenţei genice ţintă folosind
RT- PCR (reverse transcripţia);
• Produşii PCR rezultaţi sunt folosiţi ca matriţă pentru sinteza in
vitro de ARNm (transcripţie), iar acesta din urmă este folosit
ulterior pentru sinteza de proteine (translaţie); în mediul de
reacţie sunt incluşi aminoacizi radioactivi (metionină sau
leucină), care vor fi incluşi în lanţul proteic nou sintetizat şi vor
servi pentru autoradiografie;
192
• Analiza prin electroforeză (SDS- PAGE) şi autoradiografie a
proteinei sintetizate – proteinele mai scurte (rezultate de la
genele mutante) vor migra mai mult decât proteinele normale la
electroforeză.
Celulă
(sânge/ ţesut)
ADN genomic
Exoni Exoni
ARNm
Revers transcripţie
ADNc
PCR
ADN
ATG
Amorsă iniţială Amorsă finală
T7
ADN
ATG PCR
T7
Transcripţie
/ translaţie
in vitro
Electroforeză în gel de
ATG
ARN agaroză a produşilor PCR
Proteină
SDS- PAGE plus

autoradiografie
Proteină completă
Proteină trunchiată
Fig. 6.8.1: Principiul testului de trunchiere a proteinelor
193
Elementul cheie pentru tehnica PTT îl reprezintă amorsa

iniţială sens special fabricată pentru etapa de amplificare PCR.
Amorsa conţine patru regiuni specifice (în următoarea ordine în sens
5’- 3’):
• Promotor T7, care orientează producerea de ARNm de către
ARN-polimeraza fagică;
• Secvenţă de 3-6 pb;
• Situs de iniţiere a translaţiei (secvenţă Kozak);
• Secvenţa genică ţintă – 17-20 pb; situată imediat după secvenţa
Kozak.
Secvenţele de mai sus uşurează procesul de transcripţie şi translaţie
in vitro.
Mai frecvent se foloseşte metoda care porneşte de la ARNm.
Cele mai bune surse de ARN sunt celulele în care gena ţintă este
exprimată din abundenţă, dar din motive practice ARN este extras
din limfocite din sânge periferic proaspăt recoltat sau din culturi de
fibroblaste din piele. De multe ori este necesar nested PCR pentru o
amplificare a cantităţilor foarte mici de proteine trunchiate.
În electroforeza finală se apreciază poziţia benzii de produs
proteic (vezi Fig. 6.8.1). Dacă o bandă a migrat mai mult decât ar fi
trebuit, înseamnă că ne aflăm în faţa unei proteine mai mici
(trunchiate), rezultat al unei mutaţii stop sau cu decalarea cadrului de
lectură.

Ulterior a fost introdusă o altă metodă, test al proteinelor
trunchiate în fază solidă cu eficienţă mare (HTS- PTT), care evită
folosirea particulelor radioactive şi a etapelor laborioase de după
electroforeza finală (SDS- PAGE). Se pot folosi plăci tip Elisa sau
format tip microarray, realizându-se în acelaşi timp mult mai multe
teste. Amplificaea ADN-ului regiunii de interes din gena ţintă se
realizează folosind amorse care incorporează epitopi N- şi C-
194
terminal, dar şi promotorul T7, secvenţa Kozak şi codonul start
(ATG). ADN-ul rezultat este introdus într-un sistem de expresie
proteică acelular. Acesta conţine un amestec de reacţie necesar
pentru transcripţie şi translaţie, la care se adaugă ARNt cu
aminoacizi modificaţi, care conţin secvenţe utile pentru afinitate sau
detecţie. Secvenţele de afinitate incorporate (de ex biotine) sunt
folosite pentru a capta proteinele translate din amestecul de reacţie pe
o suprafaţă solidă. Epitopii N- şi C- terminali sunt folosiţi pentru a
compara cantitatea totală de proteină legată (semnal N- terminal) faţă
de fracţiunea trunchiată (căreia îi lipseşte capătul C- terminal).
Incorporarea unor particule fluorescente permite detectarea directă
neizotopică a benzilor proteice după SDS- PAGE. Ulterior se poate
face secvenţierea ADN pentru a aprecia poziţia exactă şi natura
mutaţiei.
PTT este o metodă specifică pentru diagnosticul mutaţiilor
stop sau cu decalarea cadrului de lectură, situaţii întâlnite relativ
frecvent în practică.
Tehnica identifică poziţia mutaţiei.
În schimb, metoda este scumpă, din punct de vedere tehnic
este dificilă, cele mai bune rezultate se obţin cu ARN (şi nu cu
ADN) şi nu poate fi folosită pentru identificarea altor tipuri de
mutaţii.
Atunci când se foloseşte tehnica bazată pe ARN, principalul
dezavantaj constă în necesitatea rechemării pacienţilor în vederea
recoltării de probe proaspete pentru izolarea ARN.
Comparativ cu metoda PTT clasică, HTS- PTT nu foloseşte
izotopi, este rapidă şi se pretează la automatizare. Metoda poate fi
utilă pentru screening populaţional pentru cancer de colon.
Adrese utile
• http://www.promega.com/pnotes/62/7807_07/7807_07_core.pdf
195
Bibliografie
• Boehringer Mannheim – New Detection Methods for the Protein
Truncation Test Nonradioactive – Biochemica, nr 3/1997, p21;
• Dunnen Den, Van Ommen GJ – The protein truncation test: A
review – Hum Mutat, 1999, 14 (2), 95-102;
• Gite Sadanand, Lim Mark, Carlson Rick et al – A high-throughput
nonisotopic protein truncation test – Nature Biotechnology (2003), p
1- 4;
• Kirchgesser M., Albers A., Vossen R. et al – Optimized non-
radioactive protein truncation test for mutation analysis of the
adenomatous polyposis coli gene – Clin Chem Lab Med (1998), 36
(8), 567-70;
• Ransohoff D – Fecal DNA tests for Colorectal Cancer – NEJM vol
346, nr 24, p 1912- 1913 (2002);
• Strachan T., Read A. – Human Molecular Genetics – Bios Scientific
Publishers, 1996, p 430.
196
6.9 Polimorfismul conformaţional al

monocatenelor (SSCP)
Dr. Rusu Cristina
Definiţie
SSCP este o tehnică moleculară utilizată în mod curent
pentru depistarea mutaţiilor punctiforme. Metoda se bazează pe
migrarea electroforetică diferită a monocatenelor de ADN datorită
conformaţiei spaţiale diferite.
Indicaţii
Principalele indicaţii ale SSCP sunt:
• Depistarea mutaţiilor punctiforme;
• Teste de paternitate şi filiaţie;
• Evaluarea polimorfismelor în studii populaţionale – dacă o
genă conţine destul polimorfism ca să merite secvenţierea; care
porţiune din genă este mai polimorfică; ce nivel de variaţie
există etc;
• Identificarea stării de homozigot sau heterozigot la anumiţi
indivizi.
Principii
Modificarea unei singure baze azotate determină modificarea
conformaţiei moleculei de ADN. În condiţii ne-denaturante şi la
temperatură scăzută monocatenele de ADN capătă o conformaţie
specifică spaţială tridimensională, care variază mult în funcţie de
secvenţa de baze azotate. Migrarea electroforetică a fragmentelor de
ADN depinde de conformaţia lor spaţială. Pot fi două fragmente de
ADN care au aceeaşi lungime, dar care migrează diferit la
electroforeză datorită structurii spaţiale mai condensate sau mai
extinse. Acesta este principiul exploatat de metoda SSCP. În plus,
tehnica foloseşte monocatene şi nu fragmente bicatenare, deoarece
numai monocatenele au acea conformaţie spaţială specifică, dublul
197
helix fiind mult mai rigid, două fragmente bicatenare cu aceeaşi

lungime (unul normal şi unul anormal) migrând la fel.
Fragmentele analizate prin SSCP pot avea o mărime de 150-
200 pb, tehnica depistând 80-90% din mutaţiile punctiforme.
Realizarea propriu- zisă a tehnicii SSCP necesită parcurgerea
următoarelor etape (vezi Fig. 6.9.1):
• Amplificarea PCR a regiunii ce conţine posibila mutaţie
folosind amorse specifice;
Amplificarea
regiunii de interes
Denaturare
termică/ chimică
Răcire bruscă
Electroforeză
nedenaturantă
N
Normal
Mutant
Mut
Mobilitate
Fig. 6.9.1: Principiul tehnicii SSCP
• Denaturarea produşilor PCR bicatenari prin tratare cu

substanţe alcaline şi încălzire, urmată de răcire bruscă pentru a
preveni renaturarea (refacerea dublului helix prin unirea
catenelor complementare);
Sau
198
Obţinerea de fragmente monocatenare prin PCR asimetric – la
iniţierea reacţiei PCR se foloseşte în exces amorsă pentru un
capăt al fragmentului (faţă de amorsa pentru celălalt capăt); în
acest fel se va produce amplificarea preferenţială a unei singure
catene din fragmentul dublu catenar;
• Electroforeză pentru separarea fragmentelor monocatenare (gel
neutru de poliacrilamidă);
• Compararea fragmentelor de testat cu fragmente normale, dar
şi cu fragmente cu mutaţii cunoscute; benzile sunt detectate prin
marcare radioactivă (şi autoradiografie) sau prin colorare cu
argint;
• Ulterior mutaţia este confirmată prin secvenţiere.
Mutaţiile punctiforme identificate prin SSCP reprezintă fie
mutaţii patogene (care confirmă suspiciunea de boală), fie
polimorfisme (vezi Fig. 6.9.2).
Fragmentele ce conţin mutaţii punctiforme au conformaţie
spaţială diferită faţă de fragmentele normale şi deci vor migra mai
rapid sau mai lent decât acestea la electroforeză.

În timp au fost introduse şi alte variante ale testului SSCP:
• Metodă ce foloseşte ARN ca material de bază (RNA-SSCP)–
principalul avantaj constă în faptul că se pot analiza fragmente
mai mari de 200 pb; tehnica necesită o etapă adiţională de
transcripţie in vitro; conformaţia spaţială a monocatenelor este
mult diferită faţă de catenele normale, ceea ce determină o
migrare electroforetică total diferită;
• Metodă fluorescentă – evită folosirea particulelor radioactive.
199
I1 I2 I3 I4
II 3
II 1 II 2 II 4 II 5
III 1 III 2
A B C I1 I2 I3 I4 II1 II2 II3 II4 II5 III1 III2
Fig. 6.9.2: Exemplu de test SSCP – A=exon 1; B=exon 2; C=exon 3;

benzile decalate conţin mutaţii punctiforme – polimorfism în exonul 1,
mutaţie patogenă în exonul 3
Tehnica SSCP este o metodă simplă, ieftină, convenabilă şi
sensibilă de apreciere a variabilităţii genetice.
Principalele dezavantaje ale SSCP constau în:
• Dependenţa mobilităţii monocatenelor de ADN de
temperatură; pentru depăşirea acestui impediment se
recomandă practicarea electroforezei la temperatură constantă;
200
• Sensibilitatea este afectată de pH; de obicei denaturarea se face
prin adăugarea de substanţe bazice (pH crescut); adăugarea de
glicerol la gelul de poliacrilamidă scade pH-ul şi creşte
sensibilitatea metodei;
• Lungimea fragmentelor afectează analiza SSCP; pentru
rezultate optime mărimea fragmentelor de ADN trebuie să fie
cuprinsă între 150 şi 200 pb; adăugarea de glicerol la gel face
posibilă şi analiza unor fragmente mai mari;
• Tehnica nu evidenţiază poziţia mutaţiei;
• În condiţii optime 80-90% dintre mutaţii pot fi depistate;
• Dacă se cunoaşte nucleotidul responsabil pentru diferenţa de
mobilitate electroforetică, se poate folosi tehnica SNPs.
Atât SSCP, cât şi DGGE se folosesc pentru depistarea
mutaţiilor punctiforme:
• DGGE se foloseşte pentru identificarea mutaţiilor punctiforme
în fragmente mai mari de ADN;
• Tehnica DGGE necesită ca amorsa să aibă ataşată o clemă GC,
amorsa devenind foarte scumpă;
• Condiţiile de gradient în gel (pentru DGGE) trebuie să fie foarte
bine standardizate;
• DGGE necesită echipament specializat suplimentar;
• SSCP este mai indicat pentru secvenţe ce variază foarte mult.
Adrese utile
• http://www-
users.med.cornell.edu/~jawagne/screening_for_mutations.html
• www.uga.edu/srel/DNA_Lab/SSCP'96V2.rtf
• http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGw1/MG11129.html
• http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring200
3/Parker/method.html
• http://138.23.152.128/protocols/SSCP%20protocol.pdf
201
Bibliografie
• Hoffee Patricia – Medical Molecular Genetics - Fence Creek
Publishing 1998, p 123-133;
• Mogensen J., Bahl A., Kubo T. et al. – Comparison of fluorescent
SSCP and denaturing HPLC analysis with direct sequencing for
mutation screening in hypertrophic cardiomyopathy – J Med
Genet 2003;
• Rimoin D., Connor M., Pieritz R., Korf B. – Principles and Practice
of Medical Genetics – Churchill Livingstone 2002, vol 1, p 727,
1328;
Publishers, 1996, p395, 430.
202
6.10 Electroforeza în gel cu gradient denaturant

(DGGE)
Definiţie
Electroforeza în gel cu gradient denaturant (Denaturing

gradient gel electrophoresis - DGGE) este o metodă ce permite un
screening rapid pentru modificări ale unei singure perechi de baze la
nivelul unui segment de ADN amplificat prin PCR. DGGE se
bazează pe migrarea cu viteze diferite a moleculelor de ADN
bicatenar de tip normal şi mutant în geluri de poliacrilamidă ce
conţin concentraţii liniar crescătoare ale unui agent denaturant.
Indicaţii
Două dintre cele mai importante aplicaţii ale DGGE în
genetica umană sunt detectarea mutaţiilor punctiforme ce stau la
baza anumitor boli şi detectarea polimorfismelor cu sonde ADN
pentru analize de înlănţuire genetică.
În afară de analiza mutaţională, DGGE mai este folosită şi
pentru detectarea sursei contaminării unui produs, fiind deci utilă
în industria alimentară, farmaceutică etc.
Principii
Analiza DGGE este folosită pentru separarea unor fragmente
de ADN bicatenar de lungime egală, dar cu secvenţe diferite
(produse prin amplificare PCR).
DGGE are la bază faptul că moleculele de ADN bicatenar au
rate de denaturare unice, în funcţie de compoziţia nucleotidică a
secvenţei ADN (legăturile G-C fiind mai stabile decât cele A-T).
Atunci când sunt supuse unui mediu denaturant, moleculele de ADN
vor începe să se denatureze în anumite regiuni, numite
domenii/segmente de topire („melting domains”). Temperatura la
203
care segmentul de topire se denaturează este denumită temperatură

de topire (Tm).
Practic, un amestec de fragmente ADN de secvenţe diferite
sunt supuse electroforezei într-un gel de poliacrilamidă ce conţine un
gradient crescător de agenţi denaturanţi. Agenţii denaturanţi sunt
temperatura constantă de 600 C, formamida (0-40%) şi ureea (0-7 M).
În general, fragmentele ADN mai bogate în GC vor fi mai stabile şi
vor rămâne bicatenare până la atingerea unor concentraţii mai mari
de denaturant. Fragmentele de ADN bicatenar migrează mai uşor în
gelul de poliacrilamidă, în timp ce moleculele denaturate devin
ramificate, ceea ce duce la încetinirea sau oprirea migrării lor.
Prezenţa unei mutaţii (schimbarea secvenţei ADN) va modifica Tm
în acea regiune şi mobilitatea ADN-ului, acesta ocupând în final
poziţii diferite faţă de tipul normal (vezi Fig. 6.10.1).
Fig. 6.10.1:Reprezentare schematică a DGGE. Prin

denaturarea şi renaturarea fragmentelor de ADN normal şi mutant
rezultă 4 tipuri de hibrizi, care migrează diferit la electroforeza cu
gradient denaturant. Numerotarea fiecărei benzi corespunde cu
numerele duplexurilor.
204
În condiţii ideale, probele vor fi denaturate doar parţial,
pentru a maximiza diferenţele în mobilitate. Denaturarea completă
are ca rezultat o rezoluţie slabă, deoarece probele complet denaturate
vor avea mobilităţi echivalente. De aceea, pentru a preveni
denaturarea completă se încorporează în ADN o secvenţă de 30-40
de perechi GC („clema” GC). Deoarece perechile GC au Tm mai
înaltă decât secvenţele ADN cu o distribuţie mai uniformă a
nucleotidelor, fragmentul ADN de interes se poate denatura, dar
clema GC rămâne bicatenară. O asemenea clemă GC se adaugă cu
uşurinţă la regiunea ADN de interes prin amplificare PCR cu ajutorul
amorselor (una din ele poartă la capătul 5’ o secvenţă bogată în CG).
DGGE poate fi aplicată pe molecule ADN de 100-1.000 pb;
fragmentele mai mici necesită o concentraţie mai mare de poliacrilamidă
pentru a inhiba motilitatea şi a maximiza condiţiile denaturante.
Fiecare moleculă de ADN va apare ca o bandă separată (vezi
fig. 6.10.1) ce poate fi vizualizată folosind bromură de etidium, SYBR-
Gold combinat cu iluminare ultravioletă sau prin colorare argentică.

DGGE poate fi efectuată într-o direcţie perpendiculară sau
paralelă. Gradientul denaturant are o direcţie orizontală atunci când
se foloseşte un gel „perpendicular” şi o direcţie verticală (de sus în
jos) atunci când se foloseşte un gel denaturant paralel (Fig. 6.10.2).
În ambele situaţii electroforeza se face pe verticală.
A B
Fig. 6.10.2: Separarea produşilor PCR prin DGGE perpendiculară (A) şi

paralelă (B). Fiecare bandă corespunde unei alele diferite.
205
Când două seturi de fragmente aproape identice sunt

amestecate şi supuse electroforezei în gel cu gradient denaturant
„perpendicular”, domeniile diferite se vor topi în poziţii uşor diferite
şi vor produce benzi duble.
În cazul gelurilor cu gradient denaturant „paralel” este
posibilă compararea mai multor seturi de fragmente, fiecare set
ocupând o singură pistă.
O variantă mai reproductibilă a DGGE ce foloseşte gradientul
de temperatură ca agent denaturant este TGGE (temperature-gradient
gel electrophoresis); este o tehnică mai fidelă.
Principalele avantaje şi dezavantaje ale tehnicii DGGE sunt:
• Rată de detecţie şi sensibilitate înaltă;
• Metodologie simplă şi non-radioactivă;
• Fragmentele PCR pot fi izolate din gel şi folosite ulterior în
reacţii de secvenţiere;
• Amorsele sunt mai scumpe datorită celor 40 de baze ale clemei
GC;
• Pot fi necesare amorse adiţionale pentru secvenţiere;
• Alegerea amorselor este critică;
• Genele foarte bogate în GC nu sunt uşor de analizat prin
DGGE;
• Analiza fragmentelor PCR mari este dificilă – evaluarea
segmentelor cu mai mult de 400 pb are o rată mică de succes ;
• Gradientele chimice folosite în DGGE sunt greu reproductibile
şi dificil de stabilit.
Adrese utile
• http://www-
users.med.cornell.edu/~jawagne/screening_for_mutations.html
• http://hg.wustl.edu/hdk_lab_manual/dgge/dgge1.html
206
Bibliografie
• Fodde Riccardo, Losekoot Monique: Mutation detection by
denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Human Mutation
1994 Volume 3, Issue 2, Pages (p 83-94);
• Knapp L.A.: Denaturing gradient gel electrophoresis and its use in
the detection of major histocompatibility complex polymorphism
Tissue Antigens 2005: 65: 211–219;
Publishers, 1996, p 430;
• Wu Y, Hayes VM, Osinga J et al: Improvement of fragment and
primer selection for mutation detection by denaturing gradient gel
electrophoresis Nucleic Acids Research 1998 vol 26 nr 23 p 5432-
5440.
207
208
6.11 Analiza heteroduplexurilor (HDA)
Dr. Rusu Cristina
Definiţie
Analiza heteroduplexurilor (HDA, HA, HET) este o metodă
pentru detectarea mutaţiilor punctiforme în produşii PCR, rapidă,
simplă, fără folosirea particulelor radioactive sau a unui echipament
specializat.
Tehnica se bazează pe amplificarea prin PCR a unui
fragment de testat şi a unui fragment normal, amestecarea produşilor
amplificaţi, denaturare, renaturare (cu formarea de heteroduplexuri
care au o catenă normală şi una modificată) şi analiza electroforetică
a fragmentelor rezultate.
Indicaţii
Principalele indicaţii ale HDA se referă la:
• Evaluarea genelor umane pentru boli în care apar frecvent
mutaţii punctiforme – de exemplu genele BRCA 1 şi 2 pentru
cancer de sân, genele TSC 1 şi 2 pentru scleroză tuberoasă sau
gena FBN1 pentru Sindromul Marfan;
• Analiza genelor mari, exonii fiind scanaţi în paralel;
• Studii de microbiologie – de exemplu: identificarea mutaţiilor
punctiforme asociate cu rezistenţa la antibiotice; identificarea
germenilor (ex. Bacillus anthracis) în probe de mediu;
• Identificarea sexului în studii de medicină legală, diagnostic
prenatal sau antropologie;
• Studiul polimorfismelor;
• Diagnostic preimplantator – în asociere cu alte tehnici, pentru
depistarea situaţiilor în care una dintre alele nu se amplifică.
209
Principii
În general, tehnica HDA este indicată pentru analiza unor
fragmente de ADN de 200-600 pb, dar unele studii precizează
eficienţa cea mai bună pentru fragmente de 150-260 pb.
Realizarea HDA trebuie să urmeze etapele (vezi Fig. 6.11.1):
• Amplificarea prin PCR atât a fragmentului de analizat, cât şi a
unui fragment normal (acelaşi fragment de ADN, dar provenind
de la un individ normal), folosind acelaşi set de amorse;
Denaturare Renaturare Normal

Mutant Duplex
Homoduplexuri
Normal Benzi
hetero-
duplex
Mutant
Heteroduplexuri
Fig. 6.11.1: Etapele tehnicii de analiză a heteroduplexurilor
• Denaturare termică;
• Renaturare prin răcire lentă – catenele complementare se unesc,
refăcând homoduplexurile, dar şi heteroduplexuri (fragmente
care au o catenă normală şi una cu mutaţie);
• Electroforeză în gel de poliacrilamidă – în cazul
heteroduplexurilor, datorită necomplementarităţii bazelor de pe
catena normală şi cea mutantă se produce schimbarea
conformaţiei spaţiale a fragmentului; această modificare va duce
la scăderea mobilităţii electroforetice a fragmentului respectiv
(comparativ cu homoduplexurile);
• Mutaţiile/ polimorfismele identificate trebuie confirmate prin
secvenţiere.
210
Folosind tehnica de bază aproximativ 80% dintre mutaţiile
punctiforme sunt depistate. Prin optimizarea temperaturii, a
legăturilor din interiorul gelului şi a procentului de acrilamidă, dar şi
prin adăugarea de glicerol şi sucroză la gel se poate creşte
sensibilitatea metodei.
Tehnica HDA poate fi aplicată pentru un singur fragment
dintr-o genă sau pentru mai mulţi exoni ai aceleiaşi gene (în cazul
genelor mari), testele fiind efectuate în paralel.
Interpretarea este deosebit de simplă – atunci când există o
mutaţie punctiformă (substituţie, deleţie sau inserţie fără decalarea
cadrului de lectură), heteroduplexurile care conţin mutaţia/
polimorfismul vor migra mai lent, pe electroforeză apărând o bandă
separată (vezi Fig. 6.11.1).
Odată ce a fost identificat fragmentul care conţine mutaţia/
polimorfismul, investigarea trebuie completată cu secvenţiere pentru
o identificare precisă.

În timp au fost introduse diferite variante ale tehnicii HDA
care să crească eficienţa testării sau să scadă dezavantajele. Cele mai
importante variante sunt:
• Metodă ce utilizează un gel special pentru electroforeză – gelul
conţine un copolimer cu aspect spaţial de pieptene, format dintr-
un schelet de poli-acril-amidă cu greutate moleculară mare pe
care sunt prinse catene secundare de poli-dimetil-acrilamidă;
• Pentru situaţiile în care trebuie făcute multe teste în acelaşi timp
sau se testează în paralel mai mulţi exoni ai aceleiaşi gene (gene
mari) au fost introduse variantele ce utilizează electroforeza
capilară sau electroforeza de tip array (microcip);
• Pentru evitarea particulelor radioactive au început să se
folosească tehnici fluorescente;
• În vederea creşterii preciziei testării foarte recent au fost
introduse variante cantitative ale HDA;
211
• Din ce în ce mai multe servicii folosesc asocierea în tandem

HDA – SSCP pentru creşterea sensibilităţii investigaţiei.
Principalele avantaje ale tehnicii actuale HDA constau în
faptul că este o metodă foarte simplă, ce se poate realiza fără
folosirea de particule radioactive şi fără echipamente specializate şi
care se poate preta la aplicare pe scară largă.
Dezavantajele se referă la posibilitatea de testare numai a
fragmentelor mici (200 pb), cu sensibilitate relativ limitată, iar
investigarea nu stabileşte poziţia mutaţiei/ polimorfismului.
Adrese utile
• http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/42
• http://www.biocompare.com/technicalarticle/1219/Heteroduplex-
Analysis-Using-The-DCode(tm)-System-from-Bio-Rad.html
Bibliografie
• El-Hashemite Nisreen, Delhanty Joy – A technique for eliminating
allele specific amplification failure during DNA amplification of
heterozygous cells for preimplantation diagnosis – Molecular
Human Reproduction, vol 3, nr 11, p 975-978, 1997;
• Hestekin C.N., Jakupciak J.P., Chiesl T.N. et al. – An optimized
microchip electrophoresis system for mutation detection by
tandem SSCP and heteroduplex analysis for p53 gene exons 5-9 –
Electrophoresis (2006), 27, 3823-3835;
• Merrill L., Richardson J., Kuske C.R., Dunbar J. – Fluorescent
heteroduplex assay for monitoring Bacillus anthracis and close
relatives in environmental samples – Applied and Environmental
Microbiology (2003), vol 69, nr 6, p 3317-3326;
• Palais Bob – Quantitative heteroduplex analysis – Clinical
Chemistry 53: 1001-1003, 2007;
• Thomas G., Williams D., Soper S. – Capillary electrophoresis-based
heteroduplex analysis with a universal heteroduplex generator for
212
detection of point mutations associated with Rifampin tesistance in
tuberculosis – Clinical Chemistry 47: 1195-1203, 2001;
• Tian H., Brody L.C., Landers J.P. – Rapid detection of deletion,
insertion, and substitution mutations via heteroduplex analysis
using capillary – and microchip- based electrophoresis – Genome
Research, vol 10, issue 9, 1403- 1413, Sept 2000;
Publishers, 1996, p 430;
• Weber J., Barbier V., Pages- Berhouet S. et al. – A high throughput

mutation detection method based on heteroduplex analysis using
graft copolimer matrixes: application to BRCA1 and BRCA2
analysis – Anal Chem, 76 (16), 4839-4848 (2004).
213
214
6.12 Polimorfismul mononucleotidic (SNP)

Dr. Skrypnyk Cristina
Definiţie
SNP (single nuleotide polymorphism) - polimorfismul unei
singure nucleotide - reprezintă o variaţie a secvenţei de ADN care
apare atunci când, pentru o anumită poziţie în genom, o singură
nucleotidă - A, T, C, G - diferă între membrii aceleeaşi specii sau
între cromozomii perechi ai aceluiaşi individ. Un individ A are o
secvenţă dată GAACCT, în timp ce un individ B are, pentru aceeaşi
secvenţă, formula nuclotidică GAGCCT, polimorfismul fiind deci
A/G.
Clasificare
Aproape toate SNP comune au doar două alele. Pentru ca o
variaţie să fie considerată SNP, ea trebuie să apară la cel puţin 1%
din populaţie. SNPs, care reprezintă aproximativ 90% din toate
variaţiile genetice umane, apar la fiecare 100 - 300 de baze de-a
lungul celor 3 bilioane de perechi de baze ale genomului uman.
Există patru tipuri de SNPs bialelice:
• tranziţie C→T (G→A);
• trei transversii C→A (G→T), C→G (G→C), şi T→A (A→T).
2/3 din SNPs implică tranziţia C→T (G→A), celelalte apărând
aproape cu aceeaşi frecvenţă. Sunt câteva milioane de nucleotide
care diferă între doi indivizi şi aproximativ 100.000 de aminoacizi
care diferă în proteinele lor.
SNPs pot apare în secvenţele codante ale genelor, în regiuni
necodante sau în regiunile intergenice. SNPs dintr-o secvenţă
codantă nu schimbă obligatoriu secvenţa de aminoacizi a proteinei
codante. Când ambele forme ale unui SNP se soldează cu aceeaşi
secvenţă polipeptidică vorbim de SNPs sinonime (mutaţie
silenţioasă), iar dacă se produc secvenţe polipeptidice diferite atunci
e vorba de SNPs non-sinonime (aproape jumătate din secvenţele
codante SNPs). SNPs care nu sunt situate in regiunile codante pot
215
avea însă consecinţe asupra procesului de matisare, legarea factorilor

de transcripţie sau asupra secvenţelor de ARN non-codant.
În populaţia generală SNP poate fi definit ca alela cu frecvenţă
minoră - proporţia cromozomilor care poartă varianta cea mai rară în
comparaţie cu cei care poartă varianta cea mai frecventă. Există
variaţii între populaţiile umane, o alelă SNP comună într-o regiune
geografică sau la un anumit grup etnic, poate fi mult mai rară în alt
areal geografic sau la alt grup etnic. Din punct de vedere evolutiv
SNPs sunt stabile, ceea ce permite identificarea şi urmărirea lor
relativ uşor în studiile populaţionale.
Deşi mai mult de 99% din secvenţele ADN-ului uman sunt
aceleaşi la nivelul populaţiei umane, SNPs pot avea impact major în
modalitatea în care organismul uman răspunde la boală sau la factori
de mediu (bacterii, virusuri, toxine, chimicale, droguri sau
medicamente).
Aplicaţii
SNPs au o valoare deosebită pentru cercetarea medicală şi
pentru dezvoltarea de produse farmaceutice. Activitatea unor
multiple grupuri de cercetare (Human Genome Project- HGP, SNPs
consortium, TSC project, International Hap Map Project) s-a
concretizat în realizarea hărţii SNPs ale genomului uman (exemplu
în Fig. 6.12.1, harta SNPs a cromozomului 5). Din cele 3 milioane
SNPs estimate s-au identificat până în prezent 1,8 milioane.
Hărţile SNPs vor facilita identificarea genelor asociate cu boli
complexe, cum ar fi cancerul, diabetul, bolile vasculare şi unele boli
psihice. Aceste asocieri sunt dificil de stabilit cu metodele
convenţionale de identificare a genelor, deoarece modificarea unei
singure gene poate avea doar o contribuţie foarte mică la generarea
unei afecţiuni. Studiind însă secvenţele de ADN care poartă SNPs
asociate cu o anumită trăsătură putem ajunge la genele relevante
asociate cu o anumită boală. Studiul SNPs va permite înţelegerea
multor boli poligenice, oferind astfel calea spre noi metode
terapeutice. Este doar o chestiune de timp până când susceptibilitatea
unui individ pentru o anumită afecţiune va putea fi testată prin
identificarea unui model specific SNPs.
216
.
Fig. 6.12.1.: SNPs ale cromozomului 5

(http://las.perkinelmer.com/content/snps/genotyping.asp)
Definind şi înţelegând rolul factorilor genetici în procesul de

apariţie a unei boli, putem estima mai bine rolul factorilor
nongenetici, cum ar fi comportamentul, dieta, stilul de viaţă,
activitatea fizică.
Programul NIEHS Environmental Genome Project SNPs
(http://hgvbase.cgb.ki.se) are drept scop identificarea şi genotiparea
polimorfismelor unei singure nucleotide în genele responsabile de
răspunsul genomic la factorii de mediu. Prima etapă constă în
identificarea SNPs în genele implicate în repararea defectelor ADN,
precum şi cele din ciclul celular. În final proiectul va oferi date
despre harta genică a genelor umane care pot fi studiate în evaluarea
riscului de boală secundar expunerii la factorii de mediu.
Se urmăreşte şi identificarea acelor SNPs asociate cu efecte
biologice semnificative în răspunsul la medicamente. Unii oameni nu
răspund la terapii medicamentoase sau prezintă reacţii adverse, unele
217
dintre acestea fiind responsabile de mii de decese anual. Studiul

SNPs poate oferi soluţia pentru crearea medicametului perfect, în
doza optimă pentru persoana potrivită la momentul potrivit.
Alături de implicaţiile farmacogenomice, diagnostice şi ale
cercetării biomedicale, hărţile SNPs ajută la identificarea miilor de
markeri adiţionali ai genomului uman, simplificând căutarea lor în
hărţile genomului uman realizate din proiectul HPG (Genomul
Uman). 2,6 milioane de SNPs sunt utilizate ca markeri de referinţă
pentru anumite secvenţe genomice (reference sequence SNPs –
rsSNPs).
SNPs sunt de asemenea importante pentru studiul eredităţii şi
al consangvinizării.
Metode de identificare
În ultimii 20 de ani cercetările biomedicale au dezvoltat un
număr de tehnici care permit identificarea unei singure nucleotide în
genomul uman. Fiecare tehnică utilizează o altă metodă prin care se
compară regiuni selectate ale ADN obţinute de la indivizi diferiţi,
care au o trăsătură comună.
1. FP-TDI (Template Directed dye terminator Incorporation assay
with detection by Fluorescence Polarization) – protocolul a fost
original raportat în 1999 (PerkinElmer Life & Analytical Sciences),
are la bază extensia unei amorse (primer) pentru o singură pereche de
baze şi se desfăşoară în patru etape (Fig. 6.12.2):
• Amplificarea secvenţei de studiu prin protocolul PCR ;
• Purificarea produşilor PCR (Exo-SAP-It reagent);
• Extensia amorsei (primer) pentru o singură pereche de baze;
• Analiza în fluorescenţă polarizată şi procesarea datelor.
Fluorescenţa polarizată are drept principiu diferenţele de
greutate moleculară dintre moleculele marcate fluorescent. Când o
lumină polarizată excită fluorocromii, moleculele mici vor emite
lumina în toate direcţiile, în timp ce moleculele mari vor emite
lumina doar în acelaşi plan, determinând o fluorescenţă înalt
polarizată. Tehnica poate fi foarte uşor optimizată, se poate adapta la
218
un volum mic de SNPs sau la un volum mare, care să permită mai
mult de 50 000 de genotipări/zi, nu necesită marcarea amorselor,
reactivii costă aproximativ 0,5 $ pentru un SNP, iar echipamentul
aproximativ 30 000 $.
Fig. 6.12.2: Tehnica FP-TDI

(http://las.perkinelmer.com/content/snps/fp-tdi.asp)
2. Hibridizarea alelic specifică (ASO- allele specific oligo-

nucleotide hybridization) - are la bază diferenţierea prin hibridizare a
două molecule de ADN, care diferă printr-o singură bază.
Fragmentele de PCR marcate fluorescent sunt hibridizate cu
oligonucleotide care conţin SNP. După hibridizare şi spălarea
produşilor se măsoară intensitatea fluorescenţei pentru fiecare
oligonucleotidă SNP (Fig. 6.12.3).
219
Fig. 6.12.3: Hibridizarea alelic specifică
3. Extensia amorselor- amplificarea unei singure nucleotide dintr-o

regiune se poate realiza printr-o reacţie PCR cu o amorsă care se
leagă de o singură bază într-un loc polimorfic. Marcarea amorsei
poate fi urmată apoi de electroforeza produşilor sau produşii pot fi
divizaţi în fragmente mici, care vor fi apoi analizate prin
spectroscopie de masă. Cel mai frecvent se aplică marcarea
fluorescentă a amorsei şi blocarea extensiei lanţului de polimerizare
prin intermediul unei dideoxinucleotide (terminator) (Fig. 6.12.4).
Fig. 6.12.4: Extensia amorsei cu o dideoxinucleotidă
220
4. Ligarea oligonucleotidică alelic specifică - Alegând
olinucleotide complementare cu secvenţa ţintă, cu baze alelic
specifice la capetele 3’ şi 5’, se poate identifica genotipul secvenţei
ţintă amplificată prin PCR. Se poate astfel determina dacă o
oligonucleotidă complementară cu secvenţa ADN se leagă sau nu în
zona polimorfică de o oligonucleotidă alelic- specifică (Fig. 6.12.5).
Fig. 6.12.5: Ligarea oligonucleotidică alelic specifică.
5. Secvenţializarea – este o procedeul de elecţie în descoperirea şi

caracterizarea SNPs. Cea mai frecvent utilizată metodă este bazată pe
extensia amorselor. Produşii de reacţie sunt apoi separaţi prin
electroforeză în gel sau prin electroforeză capilară (Fig. 6.12.6).
Fig. 6.12.6: Secvenţializarea în analiza SNPs.
221
Adrese utile:
• The SNP Consortium LTD. International Hap Map Project
http://snp.cshl.org/;
• NCBI LocusLink
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene;
• dbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html;
• Human Genome Variation database http://hgvbase.cgb.ki.se/;
• GeneDis http://life2.tau.ac.il/GeneDis/;
• PharmGKB http://www.pharmgkb.org/do/serve?id=home.welcome;
• GeneCards http://www.genecards.org/index;
• NIEHS SNPs : http://www.genome.utah.edu/genesnps/" \o
"GeneSNPs" \t "_blank".
Bibliografie
• Akula, N., Chen, YS., Hennessay, K. et al.- Utility and Accuracy of
Template-Directed Dye-Terminator Incorporation with
Fluorescence Polarization Detection for Genotyping Single
Nucleotide Polymorphisms, Biotechniques (2002) 32:1072-1079.
• Chen, X., Levine, L., Kwok, P-Y.- Fluorescence polarization in
homogeneous nucleic acid analysis, Genome Res. (1999) 9,492-498.
• Freeman BD, Buchman TG, McGrath S. et al.- Template-Directed
Dye-Terminator Incorporation with Fluorescence Polarization
Detection for Analysis of Single Nucleotide Polymorphisms
Implicated in Sepsis, Journal of Molecular Diagnostics (2002) : Vol.
4, No. 4 : 209 - 215.
• Greene Richard A., James J. DiMeo, Mary E. Malone et al.- A Novel
Method for SNP Analysis Using Fluorescence Polarization,
PerkinElmer Life Sciences, P10131 rev. 07/01.
• Huang BE, Amos CI, Lin DY. Detecting haplotype effects in
genomewide association studies. Genet Epidemiol. 2007 Jun 4,
PMID-17549762.
• Human Genome Structural Variation Working Group, Eichler EE,
Nickerson DA, Altshuler D. et al.- Completing the map of human
222
genetic variation. Nature. 2007 May 10;447(7141):161-5. PMID:
17495918.
• Kwok Pui-Yan. Methods for Genotyping Single Nucleotide
Polymorphisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. 2: 235-258.
• Kwok, Pui-Yan. SNP Genotyping with fluorescence Polarization
Detection, Human Mutation (2002) 19: 315-323.
• Sripichai O, Fucharoen S. Genetic polymorphisms and implications
for human diseases. J Med Assoc Thai. 2007 Feb;90(2):394-8.
• Urayama KY, Wiencke JK, Buffler PA et al- Gene Variants, Indoor
Insecticide Exposure, and the Risk of Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007
Jun;16(6):1172-7.
223
224
6.13 Secvenţializarea ADN

Dr. Csép Katalin
Definiţie
Metodele de secvenţiere permit stabilirea secvenţei
nucleotidelor în molecula de ADN, deci cunoaşterea ordinii celor
patru tipuri de baze şi astfel descifrarea informaţiei ereditare
specifice diferitelor specii şi identificarea diferenţelor inter-
individuale, inclusiv a celor implicate în determinarea unor boli.
Indicaţii
Metodele de secvenţiere au o importanţă deosebită atât
pentru cercetare cât şi pentru ştiinţele aplicate în toate domeniile
biologiei.
Permit cunoaşterea secvenţei genomice la specii foarte
diferite, începând cu organismele model (Caenorrhabditis elegans,
Saccharomyces cerevisiae, Drosophyla melanogaster, şoareci,
şobolani, primate etc.) până la cele având importanţă economică
deosebită (orez, cereale, etc.) în cadrul unor proiecte. Evident, dintre
acestea, cel mai important este Proiectul Genomul Uman, iniţiat în
1990 şi finalizat în 2003, care şi-a propus ca obiectiv principal
cunoaşterea secvenţei genomului reprezentativ la om. Identificarea
genelor, deci a secvenţelor purtătoare de informaţie ereditară care
codifică molecule de ARN sau proteine, şi a polimorfismelor
respectiv mutaţiilor genice implicate în determinarea unor boli se
continuă şi în prezent.
În practica medicală, tehnicile de secvenţiere sunt folosite în
cadrul procesului de stabilire a diagnosticului la nivel molecular în
boli genetice sau infecţioase. Secvenţierea este alternativa cea mai
bună în cazurile în care există heterogenitate alelică importantă, şi în
cazul necunoaşterii mutaţiilor unor gene cunoscute implicate în
etiologia bolilor.
225
Clasificare - variante ale metodei

Secvenţierea poate fi realizată prin trei tehnici bazate pe
principii diferite:
• metoda enzimatică/de sinteză ADN („chain termination” -
Sanger-Coulson);
• metoda chimică („chemical cleavage” - Maxam-Gilbert)
(amândouă elaborate în 1977 şi publicate în aceeaşi revistă!);
• pirosecvenţiere („sequencing by synthesis” - Pal Nyren).
Din punct de vedere tehnic tehnicile de secvenţiere se pot

realiza:
• manual;
• automatizat.
A. METODA ENZIMATICĂ / DE SINTEZĂ ADN (SANGER)

Principii
Prin incorporarea celor patru tipuri de di-
dezoxiribonucleotide (di-dezoxiribonucleotid - analog nucleotidic
fără grupare – OH în poziţia 3’) sinteza catenei complementare cu
secvenţa investigată este terminată la nivele diferite prin
împiedicarea realizării legăturii ester cu următorul nucleotid.
(Frederick Sanger – premiu Nobel 1980). Metoda foloseşte ADN
monocatenar şi necesită clonare (de ex. cu vectorul bacteriofag M13)
şi/sau amplificare (PCR).
Pentru realizarea metodei sunt necesare următoarele
elemente:
• ADN polimerază;
• amorse marcate radioactiv la capătul 5’;
• cele patru di-dezoxiribonucleotide diferite (ddATP, ddGTP,
ddCTP, ddTTP).
226
Etapele secvenţierii enzimatice:
• clonare şi obţinerea secvenţei monocatenare;
• denaturarea fragmentului de ADN dublu catenar investigat;
• sinteză de ADN în patru eprubete separate în care vectorul
monocatenar care include fragmentul investigat este matriţa pe
care se sintetizează un lanţ complementar cu ajutorul ADN-
polimerazei şi celor patru tipuri de dezoxiribonucleotid. Însă în
fiecare eprubetă un alt tip de dezoxiribonucletid este înlocuit cu
di-dezoxiribonucleotidul corespunzător în cantitate limitată.
Sinteza continuă până ce la un moment dat se incorporează
aleatoriu un analog dezoxiribonucleotidic, care produce reacţia
de terminare a lanţului. Dacă raportul dezoxiribonucleotid - di-
dezoxiribonucleotid este mare reacţia se poate produce şi destul
de târziu, după sintetizarea unor lanţuri de sute de nucleotide;
• separarea fragmentelor de lungimi diferite prin electroforeză
în poliacrilamidă sau prin electroforeză capilară. Oprirea
creşterii lanţului prin incorporare de di-dezoxiribonucleotid
indică prezenţa bazei corespunzătoare. Separarea lanţurilor
complementare se poate realiza cu uree sau cu tensiune înaltă
care prin producţia de căldură previne şi renaturarea;
• citirea rezultatului.
Secvenţa de nucleotide se va citi direct de pe
electroforogramă pornind de la fragmentul cel mai scurt care a
migrat cel mai departe (Figura 6.12.1). Înainte de reacţie, molecula
ADN se marchează la capătul 5' radioactiv sau fluorescent, deci
identificarea fragmentelor informative este simplă prin
autoradiografie sau fluorescenţă. Rezoluţia permite citirea
diferenţelor de lungimi de un singur nucleotid.
227
1. 2. 3. 4. Secvenţă
ddGTP ddATP ddCTP ddTTP
G
A
C
C
G
T
G
G
Fig. 6.12.1: Citirea secvenţei de nucleotide folosind tehnica Sanger
Există două variante ale metodei. Iniţial amorsa a fost

marcată (dye-primer sequencing), dar se pot marca şi terminatorii.
Folosind un alt tip de fluocrom pentru fiecare ddNTP reacţia se poate
realiza într-o singură reacţie (dye-terminator read).
B. METODA CHIMICĂ (MAXAM - GILBERT)
Principii
Metoda de secvenţiere elaborată de Maxam şi Gilbert se
bazează pe recunoaşterea şi îndepărtarea specifică a anumitor baze
(G, C) sau tipuri de baze (purine, pirimidine) din lanţul denaturat
investigat folosind diferite substanţe chimice.
Metoda de secvenţiere chimică constă în parcurgerea
următoarelor etape:
• capătul 5’ al lanţului ADN dublu catenar este marcat cu
fosfor radioactiv utilizând polinucleotid-kinază şi 32P-dATP;
• utilizând dimetil-sulfoxid şi încălzire la 90ºC se produce
purificarea şi denaturarea moleculei ADN dublu catenare;
228
• probele monocatenare sunt introduse în patru eprubete şi tratate
cu diferiţi agenţi chimici care modifică şi îndepărtează
specific bazele G sau C respectiv purinele sau pirimidinele,
după care piperidina taie lanţurile la nivelul poziţiilor unde
lipsesc bazele (Tabel 6.12.1);
Tabel 6.12.1: Reactivii folosiţi pentru tratamentul diferit al celor 4 tipuri de

baze
Reactiv folosit
Reactiv folosit
pentru tăierea
Reactiv folosit pentru pentru
Bază lanţului la
modificarea bazei îndepărtarea bazei
nivelul bazei
modificate
modificate
G Dimetilsulfat Piperidină Piperidină
A+G Acid acid fumaric Acid Piperidină
C+T Hidrazină Piperidină Piperidină
C Hidrazină + baze Piperidină Piperidină
• separarea fragmentelor de diferite dimensiuni prin

electroforeză paralelă;
1. 2. 3. 4. Secvenţă
G
A
C
C
G
T
G
G
Fig. 6.12.2: Citirea secvenţei de ADN utilizând metoda Maxam-Gilbert
229
• autoradiografie sau vizualizare în lumină ultravioletă în

funcţie de tipul de marcare (radioactiv sau fluorocromi);
• interpretarea rezultatelor.
Secvenţa de nucleotide se va citi direct de pe gel, începând
cu fragmentele cele mai scurte migrate cel mai distal (Fig. 6.12.2).
C. PIROSECVENŢIERE
Principiu
Această metodă de secvenţiere prin sinteză a fost dezvoltată
de Pal Nyrén la un deceniu după apariţia metodelor clasice. Se
bazează pe o reacţie enzimatică chemi-luminiscentă, iar secventierea
se produce prin sinteza lanţului complementar cu monocatena
investigată. De fiecare dată când un nucleotid se incorporează în
lanţul nou sintetizat se declanşează o cascadă de reacţii enzimatice,
care în final determină apariţia unui semnal luminos.
Utilizarea tehnicii este indicată în special pentru secvenţierea
unor fragmente scurte, detectarea de SNP şi analiza gradului de
metilare.
Etapele metodei pot fi rezumate după cum urmează:
• o matriţă monocatenară de ADN amplificată prin PCR este
hibridizată cu o amorsă folosită pentru secvenţiere şi incubată
cu ADN-polimerază, ATP- sulfurilază, luciferază şi apirază
respectiv adenozin-5´-fosfosulfat şi luciferin;
• adăugarea celor patru tipuri de dezoxiribonucleotide iniţiază
incorporarea acestora în lanţul nou sintetizat, complementar cu
matriţa, iar prin incorporare se eliberează pirofosfat;
• ATP-sulfurilaza transformă pirofosfatul în ATP în prezenţa
adenozin-5´-fosfosulfatului, iar ATP-ul duce la transformarea
luciferinei în oxiluciferin în prezenţa luciferazei, care generează
lumină vizibilă proporţional cantitativ cu ATP, respectiv
pirofosfat ;
230
• lumina produsă de reacţie este detectată de o cameră şi este
analizată de către un program de calculator. Fiecare semnal
luminos este proporţional cu numărul de nucleotide incorporate;
• apiraza îndepărtează dezoxiribonucleotidele prin degradare.
Metoda este complet automatizată, precisă şi permite analiza
unui număr mare de probe într-un timp scurt la un preţ relativ redus.
Metoda a fost ulterior dezvoltată şi a fost elaborată tehnica 454, cea
mai rapidă metodă de secvenţiere existentă în prezent, sistemul fiind
capabil de a secvenţia 20 mB în 4 - 5 ore.
În general secvenţierea prezintă avantajul că detectează toate
modificările şi mutaţiile sunt complet caracterizate. În schimb,
tehnica este laborioasă şi generează informaţie în exces.
În ceea ce priveşte cele trei tehnici, fiecare metodă prezintă
avantaje şi dezavantaje, în prezent fiind folosite principiile metodelor
elaborate de Sanger şi Nyren, deşi iniţial tehnica descrisă de Maxam-
Gilbert a fost mai populară.
Tehnica Maxam-Gilbert foloseşte direct proba de ADN
izolată, fără clonare, sub formă bicatenară. Datorită complexităţii
tehnicii şi folosirii unor substanţe toxice, metoda se utilizează în
prezent mai mult pentru studiul interacţiunilor ADN - proteine şi al
modificărilor epigenetice.
Sanger necesită clonare/amplificare şi foloseşte ADN mono-
catenar. Numai secvenţe scurte pot fi analizate în fiecare reacţie.
Reacţia de PCR limitează lungimea fragmentului la 10.000 pb şi
bazându-se pe amplificare, prezintă dezavantajele obişnuite ale
reacţiei de PCR. Automatizarea metodei, respectiv înlocuirea
marcării radioactive cu flurocromi şi citirea cu laser permite o
analiză rapidă şi sigură. Folosind flourocromi diferiţi pentru cele
patru tipuri de di-dezoxiribonucleotide poate fi realizată o singură
electroforeză pentru cele patru tipuri de reacţii.
Având în vederea dimensiunea genomurilor, analiza
secvenţelor mai mari este necesară şi se realizează prin clonarea unor
fragmente suprapuse, secvenţiere şi asamblare ulterior prin analiza şi
231
interpretarea computerizată a datelor. Procesul este complex şi

predispus la erori în special în cazul unor secvenţe repetitive.
Achiziţionarea şi utilizarea aparaturii pentru secvenţiere
automatizată este costisitoare şi astfel mai puţin accesibilă.
Întotdeauna trebuie verificate şi corectate greşeli eventuale ale
calculatorului. Este necesară obţinerea unor semnale bune şi
distanţate. Pirosecvenţierea, în special varianta 454, constituie o
alternativă relativ ieftină şi mult mai rapidă, care permite
secvenţierea unor fragmente mult mai mari faţă de metoda Sanger,
dar nu permite identificarea precisă a secvenţelor repetitive.
Adrese utile
• http://www.jgi.doe.gov/
• http://www.jgi.doe.gov/education/how/
Bibliografie
• Dudutz Gy., Csép K. – Gyógyszeripari biotechnológia és génterápia
az ezredfordulón. Procardia, 1999;
• Strachan Th., Read A. - Human Molecular Genetics. Bioscientific
Publishers, 1999;
232
7 TEHNICI COMPUTERIZATE DE
DIAGNOSTIC
7.1 Programe de diagnostic
Dr. Rusu Cristina
Definiţie
Programele de diagnostic sunt programe computerizate
folosite de clinicieni pentru a stabili un diagnostic precis de boală
genetică. Astfel de programe sunt deosebit de utile în practică, multe
dintre afecţiunile genetice fiind deosebit de rare (şi deci greu de
recunoscut).
Indicaţii
Se recomandă folosirea programelor de diagnostic atunci
când pacientul asociază două sau mai multe din următoarele semne
clinice care pot să sugereze existenţa unei boli genetice:
• Anomalii de creştere pre şi postnatală:
o retard de creştere intrauterină – talie > -3 DS pentru vârsta
gestaţională,
o macrosomie fetală – greutate la naştere > 4.500 g (la
termen),
o nanism proporţionat/ nu – talie > -3 DS,
o talie înaltă proporţionată/ nu – talie > +3 DS,
o microcefalie – perimetrul cranian > -3 DS,
o macrocefalie – perimetrul cranian > +3 DS;
o asimetrie corporală;
• Anomalii congenitale multiple – 3/>;
• Stări intersexuale:
o Ambiguitate a organelor genitale externe la naştere;
233
o Dezvoltare anormală a caracterelor sexuale secundare la

pubertate;
• Anomalii ale SNC:
o Retard mintal – QI<70;
o Tulburări de comportament;
o Convulsii;
o Anomalii SNC depistate imagistic;
• Anomalii senzoriale:
o Cecitate;
o Surditate;
o Anomalii ale mirosului sau gustului;
• Cancere familiale.
Principii
Programele de diagnostic prezintă două componente majore:
• Program de căutare a unui diagnostic în funcţie de diferite
criterii:
o Pe baza semnelor clinice;
o După numele afecţiunii;
o După codul de clasificare internaţională (OMIM);
• Bază de date cu afecţiunile genetice – pentru fiecare afecţiune
în parte sunt furnizate:
o Rezumatul datelor semnificative referitoare la entitatea
respectivă;
o Lista de semne clinice şi paraclinice descrise la toate cazurile
din literatură;
o Fotografii ale pacienţilor;
o Bibliografia semnificativă;
234
Cea mai frecventă utilizare a programelor de diagnostic
constă în căutarea unui diagnostic specific pe baza semnelor clinice
ale pacientului. În acest scop, programul furnizează o listă de semne
clinice (pe segmente şi aparate şi sisteme). Din această listă
clinicianul selectează semnele clinice prezente la pacient şi apoi
lansează programul de căutare. Programul furnizează o listă cu
diagnosticele posibile în ordinea numărului de semne prezente. De
exemplu, dacă specialistul alege din listă 5 semne care sunt prezente
la pacient, programul va lista întâi afecţiunile care conţin toate cele 5
semne, apoi pe cele cu 4, apoi cu 3 etc. În alegerea diagnosticului
final din această listă este deosebit de importantă experienţa
clinicianului respectiv – de exemplu unele afecţiuni au fost descrise
la o singură familie în literatură, ceea ce face diagnosticul puţin
probabil, chiar dacă sunt îndeplinite mai multe semne.
Programele respective furnizează şi posibilitatea de stocare a
datelor pacienţilor proprii (date clinice + fotografii).
Pe lângă programele de diagnostic consacrate (LMD şi
POSSUM, vezi mai jos), în mai multe centre medicale mari au
început să fie introduse programe computerizate care compară
aspectul feţei pacientului cu aspectul caracteristic afecţiunii
respective. Programele respective au aplicaţie limitată (numai pentru
sindroamele cele mai frecvente) şi sunt folosite numai în câteva
centre din lume.

La ora actuală la nivel mondial există 2 programe de
diagnostic folosite în mod curent de specialiştii de Genetică
Medicală:
• London Medical Databases (LMD) - program ce conţine 4 baze
de date:
o Winter-Baraitser Dysmorphology Database (WBDD)-
conţine informaţii despre peste 3.400 sindroame cu anomalii
congenitale multiple şi retard mintal (boli monogenice,
sporadice sau determinate de mediu), cu peste 35.000
referinţe bibliografice;
235
o Baraitser-Winter Neurogenetics Database (BWND)

- conţine informaţii despre peste 3.250 sindroame ce
afectează sistemul nervos central sau periferic şi peste
38.000 referinţe bibliografice;
o Photo Library (WBDD and BWND)- o colecţie superbă de
peste 12.500 de fotografii care ilustrează trăsăturile sugestive
ale sindroamelor, dar şi imagini radiologice, de microscopie,
trasee EEG etc;
o London Ophthalmic Genetics Database (GENEEYE)- bază
de date ce conţine afecţiuni genetice oftalmologice (boli
monogenice, sporadice sau anomalii izolate), cu peste 29.000
referinţe bibliografice.
Programul foloseşte o interfaţă software Windows foarte
accesibilă. Datele sunt actualizate în permanenţă – sunt adăugate
sindroame noi, cele raportate anterior sunt revizuite, se adaugă
noi cazuri şi ultimele informaţii genetice.
Descrierea fiecărui sindrom conţine:
o Numele sindromului şi sinonimele folosite în mod curent;
o Locaţia cromozomială (dacă este cunoscută);
o Numărul McKusick/ OMIM (cu conectare directă la
OMIM);
o Simbolul genei;
o Tipul de transmitere;
o Rezumat detaliat cu datele literaturii;
o Listă detaliată a semnelor;
o Lista de referinţe bibliografice;
o Fotografii din literatură.
Folosirea LMD permite:
o Listarea sindroamelor şi referinţelor în ordine alfabetică;
o Etalarea de sindroame individuale;
o Căutarea sindroamelor pe baza unei combinaţii de semne;
236
o Căutarea referinţelor în funcţie de autor, titlu, revistă,
sindrom şi data publicării;
o Importarea fotografiilor pacienţilor proprii;
o Crearea de colecţii de fotografii de interes deosebit;
o Crearea de liste cu sindroamele selectate;
o Tipărirea sindroamelor şi referinţelor bibliografice sau
crearea unui fişier separat.
• POSSUM este o bază de date ce conţine informaţii despre peste

3.000 sindroame (boli monogenice, anomalii cromozomiale,
fetopatii sau afecţiuni sporadice). Recent a fost lansată varianta
pe Internet POSSUM Web.
Datele clinice sunt completate cu numeroase imagini:
o Fotografii ale cazurilor;
o Radiografii, imagini CT sau RMN;
o Imagini ecografice;
o Diagrame;
o Aspecte anatomo- patologice.
Pentru afecţiunile ce asociază mişcări sau comportament
caracteristic sunt incluse şi filme ce ilustrează aceste aspecte.
Categoriile de date prezentate pentru fiecare sindrom în parte
sunt similare cu cele din LMD.
Folosirea POSSUM permite:
o Listarea sindroamelor şi referinţelor în ordine alfabetică;
o Etalarea de sindroame individuale;
o Căutarea sindroamelor pe baza unei combinaţii de semne; o
particularitate constă în faptul că atunci când se introduc
semnele clinice pentru căutare se poate selecta „obişnuit”,
„obligatoriu” sau „exclus”, ceea ce ajută mult la stabilirea
diagnosticului;
o Importarea fotografiilor pacienţilor proprii;
o Crearea şi tipărirea de liste cu sindroamele selectate;
237
o Tipărirea sindroamelor şi referinţelor bibliografice;

o Consultarea unor fişiere cu descrierea semnelor.
În cazul London Medical Databases unul dintre avantaje este
prezentarea separată a afecţiunilor neurologice şi faptul că se poate
face căutarea nu numai în funcţie de semnele clinice, ci şi de vârsta
de debut, imagistică, date biochimice şi neuropatologice. Cel mai
important dezavantaj se referă la faptul că nu sunt incluse anomalii
cromozomiale.
POSSUM pezintă câteva avantaje majore: existenţa variantei
pe Internet (actualizată în permanenţă), includerea de anomalii
cromozomiale (categorie importantă de patologie genetică),
posibilitatea de selectare a importanţei semnului clinic pentru
diagnostic, includerea în criterii a datelor legate de etiologie şi de
evoluţia sarcinii, dar şi existenţa fişierelor cu descrierea semnelor
clinice.
Adrese utile
• http://www.lmdatabases.com/
• possum@mcri.edu.au
238
8 ASPECTE ETICE ALE TESTĂRII
GENETICE
Dr. Gavrilovici Cristina
Odată cu finalizarea proiectului descifrării genomului uman,

concretizat în anul 2000 în aşa zisa „carte a vieţii”, toată emulaţia
ştiinţifică de la acea vreme a prezis că această etapă de analiză
ştiinţifică va face posibilă eradicarea tuturor afecţiunilor ereditare,
depistarea vulnerabilităţii omului în faţa bolii, producerea unor
tratamente adaptate constituţiei genetice a fiecărui individ. Ca
urmare, astăzi dispunem de o gamă largă de teste genetice, ceea ce
modifică considerabil metodologia şi strategia de evaluare a
îngrijirilor de sănătate. Se impune însă o reflecţie aprofundată asupra
utilizării acestor tehnici, având în vedere multiplele implicaţii etice,
juridice şi sociale.
I. Aspecte etice generale
1. Comunicarea informaţiei. Consimţământul informat.

Dreptul de a şti. Dreptul de a nu şti.
Consimţământul informat este procesul de bază din cadrul

interacţiunii medic - pacient, modalitatea prin care pacientul primeşte
informaţiile relevante de care are nevoie pentru a lua o decizie
informată, fie în sensul acordului asupra unei proceduri, tehnici etc,
sau a refuzului informat. În principal, informaţiile furnizate înainte
de testare trebuie să includă:
• scopul testării, beneficiile şi riscurile derivate (psihologice,
sociale), şansa unei predicţii corecte (inclusiv posibilitatea unor
rezultate ambigue), eficacitatea şi limitele testului;
• implicaţiile şi consecinţele ulterioare individuale şi familiale;
• opţiuni şi alternative la testare – inclusiv opţiunea de a nu face
testul.
239
Informaţiile vor fi transmise “non-directiv”, fără nici o

recomandare, mai ales în cazul testelor ce pot influenţa o decizie
reproductivă sau al testelor pentru boli netratabile; o situaţie
deosebită apare în cazul testelor care oferă oportunităţi de prevenire a
bolii sau de îmbunătăţire a îngrijirilor, în care tot mai mulţi consilieri
preferă un sfat „suportiv” care să sprijine eventual luarea unei decizii
pozitive.
După testare, discuţiile cu pacientul se vor orienta pe trei
probleme: comunicarea şi explicarea rezultatelor, accesul la
informaţie, stocarea probelor.
Dacă pacientul acceptă testarea, orice rezultat pozitiv va fi
însoţit de un program special de consiliere şi sprijin, în concordanţă
cu gravitatea bolii (Astărăstoae). Rezultatele testelor, inclusiv cele
normale, vor trebui comunicate persoanei în cauză fără nici o
întârziere1. Medicul va explica pacientului – dar numai dacă acesta
doreşte acest lucru – semnificaţia rezultatelor obţinute pentru
sănătatea lui şi/ sau a copiilor săi, consecinţele şi alternativele de care
dispune pacientul.
Trebuie să subliniem că pacientul are şi „dreptul de a nu şti”,
de a nu cunoaşte rezultatele testărilor. Medicul nu este obligat să
informeze pacientul asupra acelor informaţii sau rezultate (de
exemplu, nonpaternitatea) care nu au implicaţii directe asupra
sănătăţii pacientului sau descendenţilor săi şi ar putea genera situaţii
neplăcute. Situaţia în care membrii familiei NU ar dori să afle
informaţii este la fel de dificilă. Dacă ei nu ştiu că una din rudele lor
a fost supusă screening-ului, ei nu vor şti nici dacă ar dori sau nu să
fie informaţi asupra rezultatelor. În aceste circumstanţe individul
care a fost testat ar trebui ţină cont de maniera în care alţi membri ai
familiei ar trebui informaţi (Gavrilovici).
1
Informaţia care ar putea cauza afectări grave psihologice sau
sociale poate fi temporar reţinută. Consilierul trebuie să hotărască
când persoana testată este pregătită să primească informaţia.
240
2. Respectul autonomiei pacientului
Respectul autonomiei este fundamentul relaţiei medic-
pacient, în virtutea căruia, adultul competent mintal va lua singur o
decizie, în virtutea propriilor sale valori, preferinţe sau necesităţi. Un
sistem medical bazat pe principiul autonomiei ajută pacienţii să
realizeze şi să obţină ceea ce îşi doresc, promovând astfel în mod
direct starea de sănătate fiindcă pacienţii pot decide mai bine pentru
ei decât alţii. Alt avantaj al unui astfel de sistem care acţionează ca
un factor de reglare a medicinii ca profesie liberală, este că
stimulează pacienţii să îşi asume responsabilitatea deciziilor şi
autoritatea asupra propriei vieţi. Condiţiile sine qua non sunt ca
pacienţii ar trebui să dorească să ia decizii, să dorească informaţii, să
le înţeleagă şi să le ţină minte, să analizeze adecvat problemele
medicale iar medicii evident ar trebui să poată şi să dorească să le
ofere aceste informaţii (Beauchamp, Fukuyama, May).
3. Respectul confidenţialităţii
Informaţiile obţinute în urma testării genetice au caracter
excepţional, atât prin faptul că antrenează decizii personale de viaţă,
cât şi prin aceea că pot influenţa deciziile procreative ale altor
membri ai familiei. Menţinerea confidenţialităţii asupra informaţiei
genetice întăreşte relaţia medic-pacient şi creşte autonomia
individului. Încălcarea confidenţialităţii aduce cu ea riscul
discriminării, cu atât mai mare cu cât angajatorul persoanei poate
folosi informaţia genetică în detrimentul persoanei angajate.
Pe de altă parte, a menţine o confidenţialitate absolută
impune o responsabilitate imensă pe umerii medicului, mai ales în
condiţiile în care păstrarea informaţiei (şi nerelatarea ei unor terţe
persoane din familie) ar determina consecinţe neconvenabile pentru
alţi membri ai familiei.
O situaţie specială o reprezintă folosirea probelor/rezultatelor
în diferire proiecte de cercetare; după explicaţii adecvate, se va cere
un acord de principiu “în alb” pentru accesul cercetătorilor, dar
numai după îndepărtarea semnelor de identificare a persoanei.
241
4. Apel la responsabilitate
Odată informaţiile primite, utilizarea lor face apel la
problema responsabilităţii individuale. Aceasta are cel puţin două
dimensiuni. Prima se referă la responsabilitatea dezvăluirii
informaţiilor relevante către alţi membri ai familiei, iar a doua este
responsabilitatea altor membri ai familiei de a manipula informaţia.
Pentru început, acceptăm părerea conform căreia o persoană de bună
credinţă ar dori în mod normal să comunice informaţiile genetice
importante altor membri ai familiei, care ar putea fi interesaţi de acea
informaţie, în special dacă ar fi necesară pentru asumarea unei
anumite decizii de viitor. De asemenea, considerăm că responsa-
bilitatea principală pentru comunicarea informaţiei genetice unui
membru al familiei sau unei a treia părţi aparţine individului, şi nu
medicului, deşi acesta ar putea-o face la cererea persoanei implicate
(Beauchamp, Fukuyama, May).
5. Principiul dreptăţii şi echităţii

Dreptatea a fost definită drept ceea ce se cuvine, se merită şi
este corect. Ea are valoare doar atunci când îndeplineşte anumite
standarde (politice, sociale, sau culturale). O persoană care pretinde
echitate, este o persoană care îşi exercită un drept constituţional. În
prezent pornim de la prezumţia că toţi cetăţenii au aceleaşi drepturi
politice, acces egal la serviciile publice şi tratare egală în faţa legii.
Destul de des însă acest principiu rămâne doar un ideal, mai ales în
condiţiile în care resursele sunt precare iar competiţia pentru
dobândirea lor este acerbă (Beauchamp, Fukuyama, May).
Exemplul cel bun de violare a respectului echităţii în
contextul utilizării informaţiei genetice de către diverşi angajatori,
spre a-şi selecta angajaţii de exemplu, pe baza riscului cel mai mic de
a dezvolta o boală incurabilă. De aceea una din recomandările cele
mai importante ale Comisiei Europene a fost ca, datele de
provenienţă genetică să nu fie folosite într-un mod care
dezavantajează sau discriminează pe nedrept indivizii, familiile sau
grupurile în orice context clinic sau non clinic, inclusiv locul de
242
muncă, asigurările, accesul la integrarea socială sau la alte
posibilităţi de bunăstare generală (vezi Adrese utile).
Ca urmare, genetica necontrolată ar putea deveni o putere
care să adâncească stratificarea socială.
6. Asigurarea calităţii testării genetice

În aparenţă, asigurarea calităţii testării genetice este un
aspect pur profesional, ştiinţific, şi evident ...financiar. Să nu uităm
însă, că neîndeplinirea standardelor de calitate ar produce un
rezultant nerelevant, şi ca urmare ar supune pacientul unui risc şi
unui consum inutil. Ar fi o altă formă de lipsă de respect a persoanei.
Testarea genetică se va face numai în laboratoare acreditate,
de către un personal a cărui competenţă este confirmată, şi pe baza
unor protocoale obligatorii, aprobate de către o comisie
instituţională, care va efectua periodic un control de calitate şi va
valida calitatea rezultatelor obţinute.
Cu privire la păstrarea probelor, inclusiv a ADN-ului,
aceasta poate aduce beneficii reale pentru pacient, în momentul în
care vor fi necesare noi analize, dar şi pentru familie, pentru
diagnosticul genetic la rudele prezente sau viitoare (Astărăstoae).
II. Aspecte etice particulare în testarea genetică
1. Teste genetice de screening antenatal

Screening-ul antenatal a apărut ca o binecuvântare pentru
multe cupluri care îşi începeau viaţa de familie sub ameninţarea
posibilităţii de a da naştere unui copil cu malformaţii congenitale
importante, cum ar fi sindromul Down sau spina bifida. Unul din
beneficiile programelor de screening antenatal este o mare libertate
de alegere conferită membrilor societăţii spre a decide dacă acceptă
sau nu să îşi completeze familia cu un copil care ar putea deveni o
sursă de suferinţă sau chiar o povară. La scară socială se presupune
că reducerea costurilor de tratament paleativ al acestor boli este un
avantaj net, mai ales pentru cei care ar putea beneficia chiar într-un
sens curativ.
243
Aspectul etic cel mai important derivă din potenţialul de

transformare al screening-ului genetic antenatal într-un instrument de
diagnostic cu rol de „triere” a embrionilor, o tehnică de tip „caută şi
distruge”, motivată de dorinţa seculară de a avea un copil sănătos.
Riscurile programelor de screening ante-natal al produsului
de concepţie derivă din următoarele întrebări de ordin moral:
• Ar fi mai acceptabilă o procreare in vitro urmată de testare şi
eventuala distrugere de embrioni versus testare in vivo (în
sarcină) urmată de avort? Ambele situaţii rezultă oricum în
moartea unei fiinţe. Diferenţa ar fi perceptibilă real funcţie de
momentul transformării produsului de concepţie în persoană: la
începutul procesului de diferenţiere (când ovulul s-a divizat în
două celule), la aproximativ patru săptămâni de la concepţie,
când apar primele bătăi fetale sau la şase săptămâni când pot fi
detectate primele semne de funcţionare a creierului. Deci dacă
embrionul nu este persoană şi nu are statut moral, distrugerea sa
in vitro (în circumstanţele cazului prezentat) ar părea mai
acceptabilă comparativ cu avortul (Sgreccia);
• Ar fi acceptabil moral să ne călăuzim conduita terapeutică în
virtutea absolută a principiului autonomiei? Dar dacă o persoană
matură şi competentă mental va dori un screening şi o
implantare selectivă a embrionilor consecutivă alegerii pe bază
de sex, inteligenţă, ochi, culoarea pielii, orientare sexuală, etc?
De ce să nu li se dea copiilor un avantaj genetic şi în plus să li se
şi corecteze „defectele” obţinute în urma loteriei genetice?
• Ar fi acceptabil moral să ne călăuzim conduita terapeutică în
virtutea absolută a principiul non vătămării? Dar cât de bine şi
cât de mult rău antrenează simultan aceste super tehnologii este
greu de apreciat într-un prim timp. Orice hotărâre surogat (în
numele unei alte persoane) chiar luată din altruism ar putea avea
repercusiuni negative pe termen lung pentru o generaţie
concepută....artificial.
244
2. Testarea genetică presimptomatică
În unele boli autosomal dominante cu debut tardiv testarea
presimptomatică imagistică (de exemplu, CT sau RMN în cazul
ADPKD), biochimică (de exemplu, bilanţul lipidic în hiper-
colesterolemia familială sau alte dislipidemii ereditare) şi/sau
moleculară (de exemplu în boala Huntington) poate pune un
diagnostic înaintea apariţiei manifestărilor clinice. Pentru familie
cunoaşterea statusului genetic al persoanei cu risc poate fi importantă
în planificarea familială. În principiu, consecinţele unui rezultat
pozitiv pentru pacient depind de posibilităţile actuale de tratare a
bolii sau ale complicaţiilor ei. Se pare însă că diagnosticul pozitiv
presimptomatic determină o schimbare profundă în stilul de viaţă şi
produce puternice traume psihologice. În schimb, un rezultat negativ
la o persoană cu risc de 50% de a moşteni mutaţia aduce bucurie şi
linişte (Ioan).
3. Testarea predispoziţiei la boală

Acest tip de testare, numit şi predictivă, se adresează în
special rudelor sănătoase, de gradul I sau II, ale unui pacient afectat
de o boală comună cu predispoziţie genetică, inclusiv unele forme de
cancer ereditar sau familial, pentru care există teste de punere în
evidenţă a genelor de predispoziţie.
Testarea susceptibilităţii genetice a unei persoane cu
antecedente familiale pentru boli comune cu posibilă predispoziţie
genetică ar trebui să fie încurajată, cu condiţia ca informaţia dată de
teste să fie folosită exclusiv pentru prevenţia sau tratamentul bolii.
Toate testele de susceptibilitate vor trebui să fie voluntare, precedate
de o informare corectă şi pe baza consimţământului informat
(autonomia).
În informarea pretestare se va insista în mod deosebit asupra
faptului că mutaţiile predispozante nu produc inevitabil boala. De
exemplu, purtătorii unor mutaţii ale genelor BRCA1 sau BRCA2
implicate în cancerele de sân ereditare au doar un risc de 50 - 90% de
a face un cancer de sân sau de ovar. Beneficiul identificării
purtătorilor de mutaţie constă în supravegherea atentă şi frecventă
pentru a depista precoce o tumoră; or este greu de apreciat dacă acest
245
beneficiu este mai mare decât “vătămarea” psihologică produsă de

un rezultat pozitiv (Ioan).
4. Testarea genetică a copiilor

Testarea predictivă a copiilor cu risc de a moşteni o mutaţie
ce se manifestă clinic la adult, ridică delicate probleme etice şi
psihologice. Părinţii pot cere stabilirea statusului genetic al copilului,
considerând că acest lucru ar putea fi benefic pentru controlul
evoluţiei bolii, reducerea morbidităţii, creşterea longevităţii şi/sau
pentru orientarea lui educaţională. Refuzul acestei solicitări ar putea
fi considerat ca o contestare a drepturilor de părinţi (autonomiei
parentale), inclusiv a datoriei lor de a informa şi pregăti copilul
pentru posibilitatea dezvoltării unei boli severe. Acceptarea testării
însă ar putea veni în contradicţie cu autonomia viitoare a copilului şi,
în situaţia unui test pozitiv, are riscul unei afectări psihologice, al
stigmatizării sau discriminării (non-beneficiu şi vătămare).
În prezent se consideră pe baza respectului autonomiei
individuale (autodeterminării) – că testarea precoce a copilului
trebuie amânată până la vârsta la care adolescentul este suficient de
matur pentru a lua singur o decizie informată (oricum înainte de a-şi
constitui o familie). Totuşi, testarea copiilor va fi acceptată – pe baza
principiilor non-vătămării şi beneficiului – numai în situaţiile în care
o intervenţie medicală precoce este utilă şi le aduce un beneficiu
direct şi clar (precum în hipercolesterolemia familială sau unele
forme de cancer ereditar, cum este neoplazia endocrină multiplă tip
2) (Astărăstoae).
În concluzie, pentru testarea şi screening-ul genetic
întrebarea fundamentală rămâne: cine va folosi informaţia rezultată,
cum se va utiliza şi în ce scopuri. Dacă testarea genetică va fi cu
adevărat o tehnică de tip „caută şi distruge”, cine ar trebui să deţină
controlul ei şi cine îi va seta limitele? Legislaţia, societatea, medicii
sau indivizii autonomi şi responsabili? De asemenea, în orice tip de
testare genetică se pune problema dacă beneficiul acestei tehnici este
superior prejudiciului psihologic posibil, la care se poate adăuga
riscul stigmatizării sau discriminării (la angajare, asigurări de viaţă
sau medicale).
246
Adrese utile
• html: europa.eu.int/comm/research/rtdinfo/index_en.: 25
recommendation on the ethical, legal and social implications of
genetic testing, 2004
Bibliografie
• Astărăstoae V., Gavrilovici C., Stoica O., Covic M., Probleme şi
dileme etice în genetica medicală, În Covic M., Ştefănescu D.,
Sandovici I., Genetica medicală, Ed Polirom, 555-575, 2004;
• Beauchamp TL., Childress JF., „Professional – patient relationship”
in Principles of biomedical ethics, Oxford University Press, 283-336,
2001;
• Fukuyama F., Human rights, In Our Posthuman future, Ed. Farar,
Straus and Giroux New York, 105-128, 2002;
• Gavrilovici C., Covic M., Aspecte etice la începutul vieţii. Etică şi
genetică, În Gavrilovici C., Introducere în bioetică, Ed Junimea, 77-
104, 2007;
• Ioan B., Gavrilovici C., Astărăstoae V., Testarea şi screening-ul
genetic ante şi neonatal, În Bioetica, cazuri celebre, Ed. Junimea,
67-73, 2005;
• May T., „The liberal framework”, In Bioethics in a liberal society,
Johns Hopkins University Press, 1-12, 2002;
• Sgreccia E., Tambone V., Manual de bioetică, Editura
Arhiepiscopiei Romano-Catolice Bucureşti, Bioetica şi tehnologiile de
fecundare umană.
247
248
9 GLOSAR
Dr. Rusu Cristina
• Acrocentric: tip de cromozom al cărui centromer este aproape

de capătul unui braţ; cromozomii acrocentrici la om fac parte
din grupele D (13, 14, 15) şi G (21, 22, Y) şi, exceptând Y, toţi
pot avea sateliţi pe braţele scurte;
• ADN complementar (c): formă de ADN sintetizată de către
transcriptaza inversă pe baza unei matriţe alcătuită din ARNm;
• ADN: acidul dezoxiribonucleic; deţine informaţia genetică
pentru structura şi funcţia organismelor vii, o exprimă prin
sinteza ARNm şi a unei proteine specifice şi o transmite în
succesiunea generaţiilor de celule şi organisme; este alcătuit din
2 catene polinucleotidice, spiralizate într-o elice dublă;
formează cromozomii;
• Alele: forme alternative de gene localizate în aceeaşi poziţie pe
cromozomii omologi şi care conţin informaţii pentru acelaşi
caracter;
• Alfa feto proteina (AFP): glicoproteină fetală (echivalentul
albuminei, de care este înlocuită ulterior) excretată în lichidul
amniotic şi în sângele femeii însărcinate; are nivel crescut în
defecte de tub neural şi scăzute în Sindromul Down;
• Amniocenteză: procedura de obţinere a unei probe de lichid
amniotic prin puncţie transabdominală, ghidată ecografic, proba
conţinând celule fetale care pot fi supuse testelor ADN pentru
detectarea mutaţiilor sau cultivate pentru a efectua analiza
cromozomilor;
• Amorsă (sin primer): secvenţă oligonucleotidică, sintetică, a
cărei legare specifică la o secvenţă ţintă de pe una din catenele
de ADN iniţiază în prezenţa unei polimeraze sinteza unei catene
complementare;
249
• Amprentă ADN: model specific de dispunere a unor repetiţii de

secvenţe scurte de ADN dispuse în tandem şi hipervariabile;
acest model este caracteristic fiecărui individ;
• Aneuploidie: anomalie de număr a cromozomilor care care
afectează un număr mic de cromozomi (1-2);
• ASO: oligonucleotide de sinteză care hibridizează cu o secvenţă
ţintă specifică de ADN; tehnică folosită pentru identificarea de
mutaţii cunoscute;
• Autozomi: cromozomi care determină caracteristici generale; se
notează cu numere (1,2,…, 22); 22 perechi în celulele somatice
la om;
• Bandare cromozomică (sin marcaj): obţinerea unei succesiuni
de benzi colorate şi necolorate, specifică fiecărui cromozom,
prin diferite metode de colorare a cromozomilor;
• Benzi: zone colorate sau necolorate vizibile pe cromozomi;
tipuri diverse G, Q, R, C sau T;
• Biopsie de vilozităţi corionice: puncţie practicată la 10-12
săptămâni de sarcină, prin care se recoltează un fragment de
placentă în vederea efectuării de teste genetice;
• Card Guthrie: hârtie de filtru specială pe care se recoltează
câteva picături de sânge (prin puncţia călcâiului nou născutului
în ziua a treia de viaţă) în vederea efectuării screeningului
neonatal;
• Cariotip: descrierea cromozomilor (număr, mărime, formă)
prezenţi în celulele somatice; aranjarea sistematizată a
cromozomilor unei celule pe baza anumitor standarde de
identificare;
• Centromer: regiunea în care cromatidele surori ale unui
cromozom sunt unite; împarte cromozomul în 2 braţe (p şi q);
• CGH: vezi Hibridizare genomică comparativă;
• Citogenetică: domeniu al Geneticii care studiază cromozomii şi
anomaliile lor;
250
• Congenital: anomalie prezentă şi manifestată la naştere;
• Coriocenteză: vezi biopsie de vilozităţi corionice;
• Corpuscul Barr (sin Cromatina sexuală X): corpuscul de
heterocromatină vizibil în nucleii interfazici ai celulelor
persoanelor de sex feminin (XX); reprezintă un cromozom X
inactivat; numărul corpusculilor Barr este egal cu suma
cromozomilor X -1;
• Corpuscul F: corpuscul fluorescent (colorat cu quinacrină) care
reprezintă condensarea a 2/3 distale din braţul lung al
cromozomului Y; numărul corpusculilor F este egal cu suma
cromozomilor Y;
• Cromatide: subunităţi longitudinale ale cromozomului; fiecare
cromatidă conţine o moleculă de ADN;
• Cromatina sexuală: condensarea unui cromozom sexual;
• Cromozom: aspectul materialului genetic în diviziune; în
celulele somatice cromozomii se găsesc în perechi de omologi –
cromozomi identici ca mărime, formă şi conţinut genetic, dar
diferiţi ca origine;
• Cvadruplu test: variantă de screening prenatal realizată la 15 –
20 săptămâni de vârstă gestaţională prin care se măsoară
nivelele de AFP, hCG sau βhCG, estriol, inhibină A în sângele
femeii însărcinate;
• Deleţie (del): pierderea unui fragment dintr-un cromozom sau
dintr-o genă;
• Denaturare ADN: ruperea legăturilor de hidrogen dintre
nucleotidele complementare (prin tratare termică sau cu alcali),
urmată de separarea celor 2 monocatene ale duplexului ADN;
• Diagnostic prenatal: stabilirea diagnosticului de boală genetică
în timpul sarcinii prin folosirea de tehnici mai mult sau mai
puţin periculoase pentru făt (invazive sau nu);
• Dismorfologie: studiul definirii, recunoaşterii şi etiologiei
sindroamelor plurimalformative;
251
• Dublu test: variantă de screening prenatal realizată la 13 – 22

săptămâni de vârstă gestaţională prin care se măsoară nivelele
de AFP şi fracţiunea liberă a βhCG în sângele femeii
însărcinate;
• Duplicaţie (dup): prezenţa unui fragment de cromozom sau
secvenţă de ADN de 2 ori în aceeaşi regiune;
• Enzime de restricţie: endonucleaze de origine bacteriană care
secţionează moleculele de ADN dublu catenar la nivelul unor
situsuri de recunoaştere specifice;
• Estriol neconjugat: hormon dozat în cadrul tehnicilor de
screening prenatal al serului matern;
• Fenilalanin- hidroxilază: enzimă care metabolizează
fenilalanină în tirozină; scăzută sau absentă în fenilcetonurie;
• Fenilcetonurie: afecţiune monogenică transmisă autozomal
recesiv caracterizată prin scăderea enzimei fenilalanin-
hidroxilază care metabolizează fenilalanină în tirozină; din
punct de vedere clinic se caracterizează prin afectare
neurologică progresivă şi deficit de pigmentare; se depistează
prin screening neonatal; se tratează prin dietă fără fenilalanină;
• Fenotip: totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice şi
biochimice ale unui organism sau celule;
• FISH (sin Fluorescence In Situ Hybridisation): o tehnică de
citogenetică moleculară în care sonde marcate fluorescent sunt
hibridizate cu anumite regiuni din cromozom şi apoi vizualizate
prin microscopia în fluorescenţă;
• Galactozemie: boală a metabolismului galactozei, transmisă
autozomal recesiv, cauzată de deficitul enzimei GALT
(galactozil-1 fosfat uridil transferază); se manifestă prin icter,
cataractă, hipoglicemie, tulburări de coagulare, imunitate
scăzută, deces prin sepsis; se depistează prin screening neonatal;
se tratează prin dietă fără galactoză;
• Genă: fragment de ADN care conţine informaţia pentru sinteza
unei proteine; ocupă un locus specific pe cromozom;
252
• Gonadotrofina corionică: hormon dozat în cadrul tehnicilor de

screening prenatal al serului matern;
• Heterocromatină: regiuni de cromozomi care rămân puternic
condensate pe întregul parcurs al ciclului celular; inactivă
genetic; constitutivă sau facultativă;
• Heterozigot: individ sau genotip cu gene alele diferite pentru un
anumit locus;
• Hibridizare genomică comparativă (sin CGH): o tehnică FISH
folosită pentru a compara dozajul genic din 2 probe diferite de
ADN;
• Hipotiroidism congenital: afecţiune de obicei sporadică,
determinată de scăderea hormonilor tiroidieni; în timp
determină retard de creştere staturo- ponderală şi retard mintal
sever; se depistează prin screening neonatal; se tratează prin
administrarea de hormoni tiroidieni;
• Homozigot: individ sau genotip cu gene alele identice pentru un
anumit locus;
• Inhibina A: parametru evaluat în cadrul screeningului serului
matern prin cvadruplu test (alături de AFP, hCG sau βhCG şi
estriol);
• Inserţie (ins): anomalie cromozomială structurală în care un
segment dintr-un cromozom este introdus într-un alt cromozom
neomolog;
• Inversie (inv): anomalie cromozomială de structură produsă
prin 2 rupturi într-un cromozom şi inversarea segmentului
cuprins între ele;
• Legat de X: caracter determinat de gene situate pe cromozomul
X;
• Locus: poziţia genei pe cromozom;
• Metacentric: tip de cromozom cu centromerul central şi braţele
aproximativ egale;
253
• Metafază: stadiu al diviziunii celulare în care cromozomii

condensaţi se dispun în planul ecuatorial al celulei; este stadiul
optim de analiză a cromozomilor;
• Metilare: adăugarea unei grupări metil la o secvenţă de ADN;
se asociază cu blocarea genei;
• Microdeleţie: deleţie cromozomială mică detectabilă prin FISH;
• MoM (multipli ai medianei): Mediana reprezintă valoarea
mijlocie a rezultatelor determinărilor fiecărui marker dozat în
cadrul screeningului seric matern efectuate într-o anumită
săptămână de vârstă gestaţională. Multiplu al medianei (MoM)
se obţine prin împărţirea valorii obţinute la o gravidă cu o
anumită vârstă gestaţională la valoarea mediană stabilită pentru
vârsta gestaţională respectivă. Intervalul acceptat pentru risc
este de 0,4 – 2,5 x MoM;
• Monosomie: anomalie cromozomială de număr (aneuploidie) în
care un cromozom sau un fragment cromozomic este prezent
într-un singur exemplar;
• Mozaic: individ cu 2 sau mai multe linii celulare cu genotipuri
diferite, dar care provin din acelaşi zigot;
• Mozaicism placentar: formă de mozaicism caracterizată prin
linii celulare diferite în placentă şi în embrion;
• Mutaţie: modificare permanentă şi transmisibilă (celulelor fiice
sau generaţiilor următoare) a structurii şi a funcţiei unei gene;
• Mutaţie dinamică: tip de mutaţie reprezentată de creşteri ale
numărului unor repetiţii trinucleotidice situate în vecinătatea
genelor; numărul de copii creşte când sunt transmise de la o
generaţie la alta;
• Nucleotid: component al acizilor nucleici alcătuit dintr-o bază
azotată, o pentoză şi un grup fosfat;
• Oligonucleotid: moleculă simetrică mică de ADN monocatenar
sau ARN folosită ca sondă în diagnosticul molecular sau ca
amorsă în PCR; cele antisens blochează expresia unei gene;
254
• PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A): marker seric
folosit în cadrul screeningului seric matern de prim trimestru (la
10 – 13,5 săptămâni de gestaţie) alături de β-hCG liber,
translucenţa nucală (>3 mm în săptămâna 12 de sarcină)
măsurată ecografic şi absenţa oaselor nazale (ecografic);
• PCR (Polymerase Chain Reaction): vezi Reacţia polimerizării
în lanţ;
• PKU: vezi fenilcetonurie;
• Polimorfism ADN: variaţii ereditare în secvenţa nucleotidelor,
de obicei în regiunile necodante;
• Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP):
polimorfism datorat diferenţelor în lungimea fragmentelor
alelice de restricţie, rezultat în urma unor mutaţii care abolesc
situsuri de restricţie sau generează altele noi;
• Premutaţie: în bolile cu repetiţii trinucleotidice – de exemplu în
Sindromul X fragil – o expansiune moderată a numărului de
triplete, fără efect fenotipic major, dar cu risc crescut de
amplificare când este transmisă la descendenţi, care pot fi
bolnavi;
• Probă: vezi sondă;
• Purtător: individ sănătos, heterozigot pentru o anumită alelă
recesivă;
• Reacţia Fölling: test calitativ folosit în diagnosticul
fenilcetonuriei; în prezenţa sărurilor ferice acidul fenil- piruvic
(metabolit urinar al fenilalaninei) dă în câteva secunde o
coloraţie verde;
• Reacţia polimerizării în lanţ (PCR): tehnică de amplificare a
unei secvenţe specifice de ADN prin cicluri repetate de sinteză
induse de perechi de primeri cu orientare reciprocă;
• RFLP: vezi Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie;
• Screening neonatal: baterie de teste prin care se evaluează în
ziua a treia de viaţă toţi nou- născuţii în vederea diagnosticării
255
unor boli genetice frecvente, pentru care există tratament şi care

dacă nu sunt tratate determină handicap sever; se puncţionează
călcâiul copilului, se recoltează câteva picături de sânge pe o
hârtie de filtru specială, din care se fac analize specifice; în mod
curent se fac teste pentru fenilcetonurie, hipotiroidism
congenital şi galactozemie;
• Screening prenatal: baterie de teste neinvazive (ecografie şi
analize din ser) prin care se testează toate femeile însărcinate în
vederea depistării unor afecţiuni genetice (anomalii
cromozomiale şi defecte de tub neural);
• Sfat genetic: furnizarea de informaţii şi asistenţă membrilor
familiei cu risc pentru o boală genetică;
• Situs fragil: un defect în cromatidele unui cromozom evidenţiat
în anumite condiţii de cultură sau după coloraţii speciale (de
exemplu X fragil);
• Situs de restricţie: secvenţă scurtă de ADN recunoscută de o
anumită enzimă de restricţie;
• SNP (sin Single Nucleotide Polymorphism): polimorfism al
ADN care rezultă prin variaţia unui singur nucleotid;
• Sondă ADN: secvenţă de ADN marcată fluorescent sau
radioactiv folosită pentru identificarea unei gene;
• Sondă alfoidă (centromerică): sondă folosită în tehnica FISH
pentru evidenţierea centromerului cromozomului;
• Southern blotting: metodă de analiză a ADN prin care
fragmentele obţinute după digestia cu o enzimă de restricţie sunt
separate prin electroforeză în gel şi apoi transferate pe o
membrană solidă de nitroceluloză;
• Spectrometrie de masă în tandem: test prin care se diferenţiază
mai multe substanţe din ser sau din urină (ex aminoacizi) în
funcţie de masa moleculară; foloseşte 2 spectrometre conectate;
• Submetacentric: tip de cromozom cu braţele inegale;
• Telomer: capetele unui cromozom;
256
• Teratogen: agent de mediu care poate produce anomalii

congenitale;
• Test Barr: test de evaluare a cromatinei sexuale X pe frotiu de
celule ale mucoasei bucale; rezultatul este negativ la sexual
masculin şi pozitiv (20%) la sexul feminin;
• Test Beutler: test prin care se măsoară activitatea enzimei
GALT (scăzută în galactozemie);
• Test Guthrie: recoltarea de sânge în ziua a treia de viaţă (prin
puncţionarea călcâiului copilului) pe o hârtie specială de filtru în
vederea efectuării testelor de screening neonatal;
• Test integrat: Screening seric în trimestrul I şi II, asociat cu
evaluare ecografică; la 12 săptămâni: ecografie fetală care caută
edemul nucal şi stabileşte cu precizie vârsta gestaţională; în
serul femeii gravide se dozează PAPP A; la 16 săptămâni se
măsoară în serul mamei: AFP, βHCG fracţiunea liberă, estriolul
neconjugat şi inhibina A;
• Translocaţie (t): transferul unui fragment de cromozom pe alt
cromozom;
• Translocaţie robertsoniană (rob): unirea a 2 cromozomi
omologi la nivelul centromerului, cu pierderea braţelor scurte;
• Triplu test: test efectuat la 16 săptămâni de sarcină care indică
riscul de a avea un copil cu Sindrom Down prin dozarea în serul
matern a alfa feto proteinei, estradiolului şi gonadotrofinei
corionice umane;
• Triplu test plus: Triplu test combinat cu fosfataza alcalină
rezistentă la uree a neutrofilelor;
• Trisomie: prezenţa unui cromozom suplimentar faţă de
perechea normală de cromozomi omologi;
• X fragil: se referă la cromozomul X care în situsul Xq27 poate
prezenta o ruptură atunci când celulele sunt cultivate în mediu
special.
257
258
10 INDEX ALFABETIC
Dr. Rusu Cristina
A
• Acetilcolinesterază – 77;
• ADN fetal liber în circulaţia maternă – 87, 91;
• Afectare a acizilor organici – 43;
• Afectare a aminoacizilor – 43;
• Afectare a ciclului ureei – 43;
• Afectare a oxidării acizilor graşi – 43;
• Alfa feto- proteină (AFP) – 4, 77;
• Amniocenteză – 71;
• Amorsă (primer) – 142;
• Amprente ADN – 161;
• Amprentele ADN (Genetic fingerprinting) – 149;
• Analiza heteroduplexurilor (HDA, HA, HET) – 209;
• Analiză a fluxului de injecţie (FIA) – 46;
• Apel la responsabilitate – 242;
• Array CGH – 177;
• Array MAPH – 175;
• Array MLPA – 172;
• Asigurarea calităţii testării genetice – 243;
• ASO – 185, 219;
• Assembly PCR – 147;
• Asymmetric PCR – 147;
259
B
• Biopsie de vilozităţi corionice – 81;
• Boală hemolitică a noului născut – 88, 92;
• Boli lizozomale – 55;
C
• Card Guthrie – 25;
• Cariotip – 105;
• Cariotip cu modificarea culorii (Color changing karyotyping,
CCK) – 118;
• Cariotip realizat din fibroblaste din piele – 110;
• CD71 – 91;
• Celule fetale în circulaţia maternă – 87;
• CGH – 123;
• Citometrie de flux – 89;
• Clonarea genelor – 149;
• Colony PCR – 148;
• Compararea expresiei genice – 151;
• Contraindicaţii cariotip – 107;
• Corpuscul Barr – 98;
• Corpuscul F – 103;
• Criterii Wilson – 25;
• Cromatina sexuală X – 97;
• Cromatina sexuală Y – 102;
• Cuantificare ADN – 138;
• Cvadruplu test – 9;
260
D
• DASH (Dynamic Allele Specific Hybridization) – 187;
• DGGE – 203;
• Diagnostic ecografic – 63;
• Dublu test – 8;
E
• Ecografie 4D sau ecografie tridimensională în timp real – 69;
• Ecografie tridimensională (3D) – 21, 69;
• Electroforeza în gel cu gradient denaturant (Denaturing gradient
gel electrophoresis - DGGE) – 203;
• Eritroblaste – 89;
• Estriol neconjugat (uE3) – 6;
• Extracţie de ADN – 135;
F
• Fenilcetonurie (PKU) – 27;
• FISH – 76, 84, 113, 151;
• FISH interfazic – 90, 116;
• FISH pe fibre cromatidiene (ECF FISH)- 116;
G
• Galactozemie – 39;
• GALT – 40;
• Gena FMR1 – 49;
• Glicoproteinoze – 58;
• Gonadotrofină corionică umană (hCG) – 6;
261
H
• HA – 209;
• HDA – 209;
• HET – 209;
• Hipotiroidism congenital – 35;
• Hot-start PCR - 148;
I
• Identificarea sexului fetal – 88, 91;
• Indicaţii amprente ADN – 162;
• Indicaţii cariotip – 106;
• Inverse PCR – 146;
L
• LATE PCR (Linear After The Exponential PCR) – 147;
• Linii celulare (clone) – 129;
• London Medical Databases (LMD) – 235;
M
• M FISH (FISH multiplex, multicolor FISH) – 118;
• M FISH centromeric (CM FISH) – 118;
• M FISH centromeric interfazic (iCM FISH) – 118;
• Manevră Ortolani – 25;
• MAPH – 173;
• Marcaj C – 110;
• Marcaj G – 108;
262
• Marcaj în benzi – 108;
• Marcaj NOR – 110;
• Marcaj Q – 110;
• Marcaj R – 110;
• Marcaj T – 110;
• Meta-PCR – 149;
• Methylation Specific PCR (MSP) – 148;
• Metoda Maxam – Gilbert – 228;
• Metoda Sanger – 226;
• MLPA – 149, 167;
• MLPA – 76;
• Morfologie fetală din trimestrul I – 13, 63;
• Morfologie fetală din trimestrul II – 14, 64;
• Morfologie fetală din trimestrul III – 14, 64;
• Mucopolizaharidoze – 58;
• Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) –
149, 167;
• Multiplex-PCR – 148;
• Mutageneză – 150;
• Mutageneză întâmplătoare – 150;
• Mutageneză orientată pe situs – 150;
N
• Nested PCR – 146;
O
• Oligonucleotide specifice unei alele (ASO) – 185, 219;
263
P
• PCR – 53, 141;
• Pirosecvenţiere ADN – 230;
• Polimorfism conformaţional al monocatenelor (SSCP) – 197;
• Polimorfism mononucleotidic – 215;
• POSSUM – 237;
• Preeclampsie – 93;
• Principiul dreptăţii şi echităţii – 242;
• Programe de diagnostic – 233;
• Puncţie de vilozităţi corionice – 81;
Q
• Quantitative PCR (Q-PCR) – 147;
R
• RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) – 147;
• Reacţie Beutler – 39;
• Reacţie Főlling – 31;
• Real time PCR – 87;
• Respectul autonomiei pacientului – 241;
• Respectul confidenţialităţii – 241;
• RFLP – 162;
• RT-PCR (reverse transcription PCR) – 146;
S
• Scor Herman – 18;
264
• Screening ecografic pentru patologie cromozomială în trimestrul
I de sarcină – 15;
• Screening ecografic pentru patologie cromozomială în trimestrul
II de sarcină – 18;
• Screening prenatal de prim trimestru – 8;
• SDS- PAGE – 192;
• Secvenţializare ADN – 225;
• Sindrom Klinefelter – 100;
• Sindrom X fragil – 49;
• SKY FISH – 119;
• SNP (single nuleotide polymorphism) – 215;
• Sonde ADN – 114;
• Sonde centromerice (alfoide) – 114;
• Sonde de ADN complementar – 115;
• Sonde de ARN – 115;
• Sonde pentru un cromozom specific – 115;
• Sonde specifice unui anumit locus- 114;
• Sortare a celulelor activate fluorescent (FACS) – 89;
• Sortare celulară magnetică (MACS) – 89;
• Southern blotting – 155;
• Southern blotting – 53;
• Spectrometrie de masă (MS) – 43, 94;
• Spectrometrie de masă în tandem (MS/MS) – 31, 44;
• Spectrometrie de masă prin cromatografie în gaz (GC/MS) – 46;
• Spectrometrie de masă prin cromatografie în lichid (LC/MS) –
45;
• SSCP – 197;
• STR – 91, 162;
265
T
• TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) – 148;
• Tehnici de înaltă rezoluţie – 110;
• Tehnici pentru evidenţierea situsurilor fragile – 110;
• Test anti-FMRP – 49;
• Test Barr – 97;
• Test Guthrie – 27;
• Test integrat – 9;
• Testarea genetică a copiilor – 246;
• Testarea genetică presimptomatică – 245;
• Testarea predispoziţiei la boală – 245;
• Teste de paternitate – 149;
• Testul de trunchiere a proteinelor (PTT) – 191;
• Tipizare ADN – 161;
• Touchdown PCR – 147;
• Triplu test – 7, 9;
• Triplu test plus – 9;
V
• Vârstă maternă avansată – 72, 81;
• VNTR – 162;
W
• Whole-Chromosome Painting – 117.
266

Metode Uzuale in Screenenigul Si Diagnosticul

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Metode Uzuale in Screenenigul Si Diagnosticul

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CRISTINA RUSU

Metode uzuale în screeningul

Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F. Iaşi

Metode uzuale în screeningul şi diagnosticul bolilor genetice: tehnici

Coordonator: Rusu Cristina

La acest volum au colaborat:

1 TEHNICI DE SCREENING PRENATAL ............................... 3

6 TEHNICI MOLECULARE DE DIAGNOSTIC POSTNATAL

Genetica Medicală este un domeniu foarte dinamic – din

În acest context, ne-am propus realizarea unui material

Volumul se adresează în principal medicilor geneticieni în

În speranţa că am reuşit să venim în întâmpinarea cerinţelor

1 TEHNICI DE SCREENING PRENATAL

1.1 Screeningul serului matern

• Deficit de steroid sulfatază (care produce ihtioză congenitală),

Alfa fetoproteina (AFP)

concentraţia creşte aproximativ constant şi atinge un maxim în

Cauze de AFP scăzută:

Gonadotrofina corionică umană (hCG)

Estriolul neconjugat (uE3)

defecte de tub neural. Aceste programe pot calcula şi riscul pentru

Tabel 1.1.1: Interpretarea triplului test

În cazul Sindromului Down, rata de detecţie a triplului test

Dacă are valori de >/- 2 MoM se dozează acetilcolinesteraza în

Variante ale metodei

Tabel 1.1.2: Markeri în MoM (multiplu al medianei) şi rata de detecţie în

d) Triplu test plus:

• Covic Mircea, Dragoş Ştefănescu, Ionel Sandovici – Genetică

1.2 Screeningul ecografic

o identificarea semnelor ecografice pentru anomalii

Aceste cazuri necesită şi folosirea ecografiei Doppler pentru

Screeningul ecografic pentru patologie cromozomială în primul

• Se face plasarea corectă a calliper-ului (unul la nivelul interfeţei

Fig. 1.2.1: Sarcină 11s.a.+5zile. Ecografie transabdominală.

Fig.1.2.2: Sarcina 11s.a.+6zile. Ecografie transvaginală.

Este nevoie de un antrenament suficient de mare pentru ca

Tabel 1.2.1: Scorul Herman (1998)

Screeningul ecografic pentru patologie cromozomială în

Calcularea factorului de probabilitate pentru patologia

Riscul post- ecografie pentru patologia cromozomială (Trisomia 21,

Risc post-ecografie = Risc bazal × Factor de probabilitate MoM pliu nucal

Această modalitate de interpretare a valorilor grosimii pliului nucal

Interpretarea rezultatelor „sonografiei genetice” se face în

Variante ale metodei

• Hutchon DJR, Khattab A. - How to use Bayes theorem to estimate

2 TEHNICI DE SCREENING NEONATAL

• Anomalii ale metabolismului acizilor organici;

2.1 Screeningul neonatal pentru fenilcetonurie

Fig 2.1.1: Recoltarea sângelui pentru testul Guthrie

• Analiza propriu-zisă a probelor - Testul Guthrie este un test de

o După perioada de incubare de 16 de ore se citesc plăcile cu

Sânge aplicat pe hârtie de filtru

Discuri aşezate pe gel agar

Lipsa creşterii bacteriene

Fig. 2.1.2: Etapele efectuării testului Guthrie pentru screeningul PKU

La un copil normal, beta 2 thienil-alanina inhibă creşterea

Pacienţii cu PKU clasică prezintă un nivel sangvin crescut

Alternative ale metodei

scutecele umede o picătură de FeCl3 sau o bandeletă de hârtie

Dezavantajele screeningului pentru PKU constau în :

• Covic M., Ştefănescu D., Sandovici I. – Genetică medicală, Ed

2.2 Screeningul neonatal pentru hipotiroidism

Alte programe de screening fac ambele dozări de la început.