Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Metodele pentru studiul cromosomilor la animale presupun parcurgerea urm toarelor faze: colchicinizarea, hipotonia, fixarea, etalarea cromosomilor pe lam i colorarea. 1. COLCHICINIZAREA pre-tratamentul cu un inhibitor mitotic (colchicin sau colcemid) realizeaz acumularea n esuturi a unui num r mare de mitoze blocate n metafaz (prin inhibarea fusului de diviziune) 2. HIPOTONIA - tratamentul cu solu ii hipotonice de KCl 0,56%, citrat de sodiu 0,6-1,2%, determin o umflare i o fluidizare a citoplasmei, permi nd dispersia cromozomilor, deci o bun etalare a acestora. Timpul de hipotonie variaz ntre 10 i 60 min. n func ie de consisten a esutului i temperatura la care se realizeaz tratamentul. 3. FIXAREA - determin moartea celulelor f r s altereze componentele celulare. Cel mai folosit fixator este amestecul de alcool metilic sau etilic cu acid acetic glacial n raport de 3:1. Timpul necesar fix rii este de 5-10 min. 4. COLORAREA se face pentru ob inerea contrastului necesar observ rii la microscop a cromosomilor. Colorarea trebuie s se realizeze naintea efectu rii preparatelor tip squash sau dup efectuarea frotiurilor uscate la aer. Coloran ii nucleari cei mai folosi i n citogenetic sunt: carminul acetic, orceina acetic , reactivul Schiff i solu ia Giemsa. 5. ETALAREA - cromosomilor n celul se face n timpul realiz rii preparatelor pe lam pentru observarea la microscop prin dou metode: tehnica squash i tehnica frotiurilor uscate la aer sau flac r .
a. TEHNICA SQUASH
1. 2. 3. 4. In mijlocul unei lame bine degresate se pun: o pic tur de acid acetic (dac materialul este bine colorat, dac nu, se folose te orcein acetic care realizeaz simultan fixarea i colorarea esutului) i fragmente de esut; peste aceasta se pune o lamel (uns cu albumin glicerinat i trecut repede prin flac r pentru coagularea albuminei, care are rolul de-a mpiedica dispersarea cromosomilor n celul ); lamela se love te cu un be i or de lemn pentru etalarea materialului; pentru eliminarea excesului de acid acetic sau colorant, se pune peste lamela o bucata de hrtie de filtru si cu degetul mare se apasa uniform si destul de puternic; preparatele prospete astfel obtinute se pot observa la microscop.
A) BENZILE HETEROCROMATINICE CONSTANTE sunt echivalente cu cele de tip C, N i T. Ele sunt vizibile pe tot parcursul ciclului celular (n interfaz i diviziunea celular ) fiind relativ constante ca m rime. La plante, sunt singurelele tipuri de benzi care se eviden iaz . B) BENZILE HETEROCROMATINICE FLUCTUANTE sunt echivalente cu benzile Q, G i R. Acestea nu se disting n interfaz , n profaz apar ca puncte care ncep s fuzioneze, iar n metafaz devin benzi ntunecate. Au fost eviden iate la p s ri, mamifere i reptile. C) BENZILE Cd apar la nceputul mitozei i dispar la sfr itul ei. M rimea i pozi ia acestor benzi corespunde cu kinetocorii.
Tipuri de bandare
BANDAREA Q se realizeaz cu ajutorul coloran ilor fluorescen i de tipul: - quinacrin , - acridin- orange - sau a unor antibiotice (adriamicin ); rezulta benzi pozitive verzi alternnd cu interbenzi ro ii-portocalii ce pot fi observate la microscopul cu fluorescen . Benzile mai intense corespund regiunilor din ADN bogate n A-T , n timp ce n regiunile C-G intensitatea scade.
BANDAREA G se realizeaz cu solu ie Giemsa i permite ob inerea de preparate permanente. Benzile intens colorate corespund, ca i la bandarea Q, cu regiunile bogate n A-T. Ambele tipuri de benzi caracterizeaz heterocromatina intercalar . BANDAREA R presupune colorarea cu solu ie Giemsa sau acridin orange (colorant fluorescent). sunt eviden iate zonele bogate n CG. Acest tip de bandare este reversul band rii Q i G, i coloreaz i termina iile cromosomilor.
BANDAREA C eviden iaz zona centromeric alc tuit din heterocromatin constitutiv , Principiul acestei metode se bazeaz pe denaturarea - renaturarea diferen iat a ADN prin diferite tratamente (denaturare cu NaOH urmata de neutralizare cu HCl). Benzile C se eviden iaz prin colorare cu solu ie Giemsa.
BANDAREA T eviden iaz heterocromatina constitutiv de la nivelul telomerelor i se folose te pentru identificarea cromosomilor care nu difer mult n dimensiuni i morfologie. Colorarea se realizeaz cu solu ie Giemsa sau acridin orange. BANDAREA N permite eviden ierea organizatorului nucleolar (regiune n care exist genele pentru ARNr). Colorarea se realizeaz cu argint, care se leag preferen ial de proteinele histonice sau nonhistonice, rezultnd un corpuscul brunnegru sferic pe cromatid .
Grupa A (1-3): cuprinde cromozomi mari metacentrici (1 i 3) i submetacentrici (2). Cromozomii se pot deosebi u or ntre ei prin m rimea i pozi ia centromerului. Grupa B (4-5): cuprinde cromozomi mari submetacentrici. Se deosebesc cu dificultate ntre ei. Grupa C (6-12) i cromozomul X: cuprinde cromozomi de m rime medie. Cromozomii din perechile 6, 7, 8 i 11 sunt metacentrici. Cromozomi din perechile 9, 10 i 12 sunt submetacentrici. Grupa D (13-15): cuprinde cromosomi acrocentrici de m rime medie. To i cromozomii acestui grup prezint sateli i. Grupa E (16-18): cuprinde cromozomi mici cu centromer situat aproape median (16) sau submedian. Grupa F (19-20): cuprinde cromozomi scur i cu centromeri aproximativ mediani Grupa G (21-22) i cromozomul Y : uprinde cromozomi acrocentrici foarte scur i. Cromozomii 21 i 22 pot avea sateli i. Cromozomul Y este asem n tor cu ace ti cromozomi, fiind de obicei mai mare dect ei.
Aneuploidii autozomale
Trisomia 13 (47, +13), sindromul Patau Trisomia 18 (47, +18), sindromul Edwards Trisomia 21 (47, +21), sindromul Down.
Poliploidii
Triplodia 69 XXY, 69 XXX, 69 XYY Tetrapoidia XXYY, XXXX
Modific ri structurale
Sindromul Cri-du-chat (del 5p) Sindromul Prader-Willi (del 15q). Sindromul Down 45 t (21; 14) Sindrom X fragil Leucemia cronic mieloid t (9; 22).
Aneuploidii heterozomale
Embrionii f r un cromosom X sunt neviabili i sunt elimina i prin avort spontan. Adi ia unui cromosom X sau Y determin tulbur ri fizice i psihice la indivizii afecta i. Sindromul Klinefelter 47 XXY, 48 XXXY, 49 XXXXY. Se remarc napoierea mintal accentuat , dezvoltare sexual slab i fertilitate redus n 60% din cazuri cauza apari iei trisomiei este nondisjunc ia de origine matern . Prezen a unui cromosom X suplimentar la b rbat, legat de apari ia corpusculului Barr, are o inciden medie de 1/1.000 de na teri la b ie i. Adi ia unui cromosom X accentueaz simptomele maladiei.
Cariotip 47 XYY Cromosomul Y supranumerar, conduce la o tulburare a personalit ii, indivizii avnd un comportament antisocial. Anomaliile somatice lipsesc, au n l ime peste medie, indivizii nu sunt sterili, organele genitale sunt normale iar inteligen a este medie sau la limita inferioar a normalului. Zigotul 47 XYY are viabilitate mare. Frecven a sindromului este de 1/1.000 de na teri la b ie i. Cariotip 47 XXX Persoanele cu acest cariotip pot fi normale sau s prezinte o u oar cre tere a sterilit ii i napoiere mintal . Frecven a sindromului este de 1/1.000 de na teri la fete. Sindromul Turner 45 XO Femeile prezint anomalii n dezvoltarea sexual , somatic , tulbur ri metabolice i psihice. Talia copilului este mic , exces de piele pe ceaf , malforma ii cardiace, dezvoltarea mental n limite normale. Individele supuse unui tratament hormonal pot avea copii dar riscul de avort este mare. Inciden de 1/ 2500 de na teri feminine, dar 90-95% din embrionii XO mor nainte de na tere.
Aneuploidii autozomale
Trisomia 13 (47, +13), sindromul Patau. Sindrom rar ntlnit, 1/ 20.000 de na teri, 50% din copii mor n prima lun , iar restul pn la 6 luni. Copii cu ochi mici buze t iate, polidactilie, malforma ii ale sistemului nervos i cardiac, ceea ce presupune c modific rile anormale ncep n timpul embriogenezei. Trisomia 18 (47, +18), sindromul Edwards. Majoritatea copiilor cu acest sindrom sunt de sex feminin (80%), sunt mici la na tere, cresc ncet i sunt ntrzia i mintal. Supravie uiesc 2-4 luni. Frecven a apari iei sindromului este de 1/ 8.000 de na teri.
Trisomia 21 (47, +21), sindromul Down. Prezint cea mai mare r spndire dintre toate aneuploidiile. Copiii se nasc de obicei prematur (2,9 kg) i prezint microcefalie, urechi i nas mici, o cut specific a pielii din col ul ochiul ochiului (mongolism) buze groase, gt scurt i tegumentul aspru, anomalii cardiace, ntrziere mintal .
Este asociat cu vrsta naintat a mamei frecven a este de 1:50 pentru cele de peste 40 de ani i 1:1500 pentru cele sub 30 de ani. La persoanele n vrst cu sindrom Down s-a constat c apare maladia Alzheimer, care este provocat de gene (pentru sinteza proteinei F-amiloid) plasate pe bra ul lung al cromosomului 21.
Poliploidii
n urma unor diviziuni meiotice anormale pot apare game i diplozi, care prin fecundare duc la formarea unor zigo i triploizi sau tetraploizi. Triplodia 69 XXY, 69 XXX, 69 XYY. n 15-20% din avorturile spontane fetu ii sunt triploizi. Circa 75% dintre triploizi au dou genomuri paterne i unul matern, cauza form rii acestora fiind fecundarea unui ovul de doi spermatozoizi. Triploizii mor ntr-o lun de la na tere prezentnd multiple anomalii: cap mare, degete reunite, malforma ii ale gurii, achilor i organelor genitale. Frecven a este de 1/ 10.000. Tetrapoidia XXYY, XXXX. Apare n 5% din avorturile spontane i foarte rar se nasc copii. Cauza producerii acestora se presupune c este prima diviziune mitotic anormal dup fecundare, n care dup replicarea i separarea cromosomilor nu se mai realizeaz citokineza.
Modific ri structurale
Abera iile cromosomale structurale pot fi detectate cu ajutorul band rilor, deoarece cromosomii omologi trebuie s prezinte acela i model de bandare. Modific rile structurale constau n transloca ii, duplica ii, dele ii, inversii. Au fost descrise modific ri structurale la toate perechile de cromosomi.
Sindromul Cri-du-chat (del 5p). Este determinat de o dele ie a bra ului scurt (p) al cromosomului 5 (grupa B). Copiii prezint defecte faciale, dezvoltarea anormal a glotei din cauza c reia emit un ip t asem n tor cu cel al pisicii, malforma ii gastrointestinale, ntrziere mintal . Frecven a este de 1/ 100.000 de na teri.
Sindromul Prader-Willi (del 15q). Este determinat de o dele ie a unui mic fragment din bra ul lung (q) al cromosomului 15. Persoanele afectate prezint o dezvoltare fizic redus , ntrziere mintal , obezitate, diabet (deoarece copii de la 4-5 ani manifest o poft de mncare anormal ). Frecven a este de 1/ 10.000- 1/ 25.000 i afecteaz n specia b ie ii.
Sindromul Down 45 t (21; 14). La 5% dintre persoanele afectate de acest sindrom este prezent o transloca ie ntre cromosomii 14 i 21 (acrocentricii din grupele D i G). De i au 2n=45 de cromosomi, persoanele afectate sunt normale, ele avnd un cromosom normal 14, unul 21 i un cromosom translocat 14/21. Probabilitatea de-a avea copii cu sindrom Down este de 33% sau 1/3 putndu-se ob ine trei categorii de zigo i viabili 2n = 46 normal, 2n= 46 sindrom Down prin transloca ie, 2n=45 purt tor al tranloca iei i trei zigo i neviabili (monosomie 14, monosomie 21 i trisomie 14). Sindrom X fragil. Locusurile fragile sunt regiuni cromozomiale susceptibile la rupturi. Acest sindrom se transmite ereditar X-linkat manifestndu-se prin ntrziere mintal . Leucemia cronic mieloid t (9; 22). reprezinta o proliferare a globulelor albe din seria granulocitelor (polinucleare). LMC este asociata cu o anomalie cromozomiala (cromozomul Philadelphia), in care se produce o translocare de material genetic intre cromozomii 9 si 22, ceea ce duce la o scurtare a bratului lung al cromozomului 22, antrenand perturbari genetice ce se afla la originea LMC. Acest tip de leucemie este mai rar si nu reprezinta decat 2 sau 3% din leucemiile copilului. LMC se prezinta sub doua forme: forma juvenila, care afecteaza copiii cu varste sub 2 ani si forma adulta, care afecteaza indeosebi adolescentii.
Cauzele anomaliilor cromosomale sunt adesea : vrsta naintat a mamei; gene care favorizeaz nondisjunc ia cromosomal ; tulbur ri autoimune parentale (cnd mama are anticorpi antitiroidieni apar abera ii numerice); ac iunea mutagen a radia iilor preconcep ionale nondisjunc ie; infec ii virale parentale, mai ales materne; mame foarte tinere embrioni monosomici sau trisomici.