CROMOSOMII UMANI

Material genetic → Cromosomi

• Forma de organizare a materialului genetic în cursul diviziunii

Cromatină

Cromosomi
 Funcții
• Transportă + distribuie
materialul genetic în cursul
diviziunii asigură stabilitatea
proceselor ereditare
• Asigură recombinarea
genetică în meioză

Profaza
Fibrele de
Cromosomi
cromatină
Telofaza
Numărul de cromosomi – caracteristic speciei

Femeie
• Specia umană → 46 cromosomi 22x2 44
• Set 23 cromosomi=set HAPLOID=n XX 2
Total 46
• Set diploid (2n) → 46 cromosomi
• → 22 perechi AUTOSOMI
• → 1 pereche GONOSOMI Bărbat
22x2 44
XY 2
• Set haploid (n) → 23 cromosomi Total 46
• 22 autosomi
• 1 gonosom X/Y
48 32 44 38

78 64 38 40
METODE DE STUDIU - principii
fundamentale
• 1. obţinerea de celule în diviziune (mitoză sau meioză);

• 2. blocarea diviziunii în metafază sau prometafază;

• 3. obţinerea preparatelor cromosomice

• 4. analiza la microscop
OBTINEREA DE CELULE IN DIVIZIUNE
• √ direct → ţesuturi cu diviziuni active: măduvă
hematogenă, gonade, tumori

• √ indirect → culturi de ţesuturi:

♦ de scurtă durată: sânge periferic (limfocite T)
♦ de lungă durată: fibroblaşti din ţesutul conjunctiv
(piele, fascii) celule din lichidul amniotic, din vilozităţile
coriale sau tumori solide
Recoltare
• Sânge → culturile de limfocite T → durata culturii 3 zile

• stimularea diviziunilor celulare → substanţe mitogene

(fitohemaglutinina)→ indice mitotic crescut

• Măduvă osoasă → durata culturii între 24-72 ore

• Celule amniotice → durata culturii 10-14 zile

• Celule trofoblastice → durata culturii 10-14 zile

 Etapele obtinerii preparatului cromosomic.
Pregatirea
Adaugare antibiotic
preparatului
Adaugarea sangelui. Adaugare phytohemaglutinina
cromosomic
pentru stimularea mitozei
Recoltare de sange
venos pe heparina
Incubare la 37°C pentru 3
zile
• Centrifugare
• Hipotonizare pentru
dispersarea cromosomilor

Transferul Blocarea diviziunii in

• Fixare – 3 fixari celulelor in metafaza cu COLCEMID
eprubeta
Specimens
•Sange periferic
•Fibroblaste
•Maduva hematogena
•Tumori solide

Etalare pe lama de microscop

Procesare digitalizata a
Examinare la imaginii captate pe
Colorare cu Giemsa. microscop. calculator pentru
realizarea cariotipului
Iniţierea culturii celulare

Recoltare Pregătirea culturii Cultură

celulare
In tub cu heparină Mediu de cultură + Incubare pentru 68-72
sânge + AB+ ore la 37°C, 5% CO2,
fitohemaglutinină 90% umiditate
BLOCAREA DIVIZIUNILOR
• Metafaza = stadiul mitotic optim pentru studiul
cromosomilor (bine individualizaţi; dispuşi în acelaşi plan)

• blocarea diviziunii în stadiul în care cromosomii sunt

bicromatidieni (metafază, prometafază, profază)

• substanţe statmokinetice (colchicina şi derivaţii ei) → inhibă

formarea fusului de diviziune (polimerizarea tubulinei).
Colchicina – extrasă din brânduşa de toamnă
 OBŢINEREA PREPA- RATELOR
CROMOSOMICE - PRELUCRARE
• hipotonizare - dilatarea celulelor şi dispersarea cromosomilor
(într-un volum celular mai mare)
• fixarea celulelor ‑ întrerupe brusc activitatea vitală, păstrând
structura morfologică prealabilă fixării
• etalarea suspensiei celulare pe o lamă de microscopie →
dispunerea cromosomilor în acelaşi plan → preparate definitive;
• colorare - pentru obţinerea de cromosomi uniform coloraţi se face
colorarea preparatelor cu coloranţi bazici (soluţie Giemsa)
Examinarea la microscop
• obiectiv cu imersie x100→ metafaze cu cromosomi bine dispersaţi,
contractaţi şi net conturaţi.
• analiza a 16-20 de celule
• mozaic: minimum 30 metafaze pentru a decela liniile celulare cu o
incidenţă mai mică de 10%.
• clone celulare → analiza suplimentară a unui număr sporit de
metafaze (aprecierea procentajului fiecărei linii)
 Cromosomii metafazici
• Bicromatidieni
• Bine condensaţi şi individualizaţi
• Localizaţi în acelaşi plan –
vizualizare uşoară la microscopul
optic

• Putem evalua dimensiunea şi

poziţia centromerului
 Analiza cromosomilor

• √ Clasic:
• fotografierea metafazelor optime
• decuparea cromosomilor
fotografiaţi
• realizarea cariotipului.
• √ Actual:
• preluarea imaginilor cu o cameră
video
• analiza cromosomilor pe computer
→ soft specializat.
MATERIAL ŞI METODE - CARIOTIP
21/10/11
Cariograma (Cariotip)
• dispunerea sistematizata, in perechi de omologi, a
cromosomilor unei singure celule, pe baza
• lungimii,
• pozitiei centromerului sau altor criterii morfologice (constrictii
secundare, sateliti, benzi),
• precis codificate prin standarde internaţionale.
 Identificarea cromosomilor umani

Morfologia cromosomului metafazic

Elemente comune tuturor cromozomilor:
CROMATIDELE
- cromosom - bicromatidian (replicare in faza S)
- 1 cromatida = 1 moleculă de ADN + Pr
CENTROMERUL
- împarte cromatida în două braţe
- braţ lung – q
- braţ scurt –p
TELOMERELE
 CENTROMERUL
• locul de ataşare a cromatidelor surori
• unic → constricţie primară
• împarte cromatidele în braţele “p” şi “q”
• poziţie fixă – determinată de o secvenţă ADN
repetitiv (ADN satelit) identică la toţi cromozomii
+ ADN specific fiecărui cromozom;
• Împarte cromosomii în trei categorii
• Metacentrici
• Submetacentrici
• Acrocentrici
 Cromosomul metafazic
• lungime
• localizarea centromerului
• sateliti

sateliti
Brat scurt
centromer

Brat lung
 Cromosom
ADN
Secventa
repretitiva Telomer
(TTAGGG)n Brat scurt (p-)
Secventa
repretitiva
Centromer
(satellit)

Cromatida
Brat lung (q-)

Secventa
repretitiva Telomer
(TTAGGG)n
 CENTROMERUL
• Rol esenţial pentru SEGREGAREA
cromozomilor din cursul diviziunii
celulare

• La ADN cen se fixează = kinetocorii →

locul de fixare a filamentelor fus de
diviziune → ce vor tracta cromatidele la
poli (în anafază)

T
 TELOMERELE
• structuri specializate, formate din ADN repetitiv
+ proteine asociate, care “acoperă” şi
protejează capetele cromozomilor.
• Funcţii:
• Menţine stabilitatea şi integritatea
structurală;
• Asigură replicarea completă;
• Stabileşte arhitectura tridimensională a
nucleului
• Iniţiaza sinapsa corectă a cromozomilor
omologi la începutul profazei meiozei I
 Elemente caracteristice unor cromozomi
• SATELIŢII = mase mici de heterocromatină ataşate pe
braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici (13, 14,
15, 21, 22); (exceptând Y) = variante normale → 13ps

• CONSTRICŢIILE SECUNDARE (h)= heterocromatină

(ADN repetitiv) situate pe 1q, 9q, 16q – lângă
centromer = variante normale → 1qh+

• SITURILE FRAGILE = lacune necolorate pe cromatidele

unor cromozomi. Majoritatea = variante normale;
excepţie fra Xq27 asociat cu retard mintal
X fragil X X X Y
• = Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn)
Clasificarea
cromosomilor
• crs. mari+metacentrici=A
• crs. mari+submetacentrici=B
• crs. mijlocii+submetacentrici=C
• crs. mijlocii+acrocentrici =D
• crs. mijlociu+metacentric =E
• crs. mici+submetacentrici=E
• crs. mici+metacentrici =F
• crs. mici+acrocentrici=G
Clasificarea
cromosomilor
normali

Metacentrici Submetacentrici Acrocentrici

Grupa A Grupa B
4, 5
Mari 1, 2, 3
Grupa C
Grupa D
6, 7, 8, 9, 10, 11,
Mijlocii 16 13, 14, 15
12, X
Grupa F Grupa E Grupa G
Mici
19, 20 17,18 21, 22, Y
Elemente specifice fiecărui cromozom:
BENZILE
• Prin diferite tratament – se observă pe
cromozomii metafazici o serie continuă de
benzi alternative
- unele intens colorate
- ce alternează cu benzi slab colorate

Tratament cu Tripsină + colorare cu Giemsa

→ marcaj G
- Benzile intens colorate – G (+)
- Benzile slab colorate – G (-)
 Benzile
• Benzile reflectă structura internă,
heterogenă, a cromozomilor.

• Fiecare cromozom – are un model

caracteristic de benzi → identificarea
sa precisă.

• Idiograma – Reprezentare grafică a

benzilor cromosomiale, care ne ajuă la
identificarea precisă a cromosomilor
şi/sau fragmentelor cromosomiale
 Identificarea cromosomilor prin marcaj în benzi
• Colorarea uniformă – oferă informaţii despre dimensiune şi poziţia
centromerului
• Banda = segment cromosomic distinct, se deosebește prin intensitatea
colorației
• Marcaj Q - quinacrină→ + =fluorescente(HC)
• Marcaj G – Giemsa → + colorate (HC)
• Marcaj R - ”reverse” + colorate (EC)
• Marcaj C - centromer
• Marcaj T - regiunea telomerelor
• Marcaj NOR – regiunile organizatorilor nucleolari
Identificarea cromosomilor prin marcaj în benzi
Celule in interfaza
Corpuscul Barr (cromatina X)
Celule in metafaza– marcaj cromosomic

 Colorare uniforma
 Marcaj G
 Marcaj R
 Marcaj Q
 Marcaj C-centromer
 Marcaj NOR-sateliti
Marcaj cromosomic Marcaj cromosomic
generalizat localizat

 Marcaj G Marcaj RMarcaj C-centromer

Marcaj G:
• Marcaj R: «reverse» (inverse).
Marcaj Q – necesita colorare
cu quinacrina si examinare
in microscopie cu
fluorescenta

Benzi:
Hc=G+ = R-= Q+
Eu = G- = R+= Q-
• Marcaj C = centromer (benzile C sunt zone de heterocromatina constitutiva
la nivelul centromerului)
• Marcaj C

Centromer

Constricţii secundare
(1, 9, 16)

Heterocromatina de pe
cromosomul Y (2/3
distale ale braţului
lung)
Benzi T = telomere
Marcaj NOR– specific pentru sateliti
 Cariotip de inalta rezolutie

High
Resolution

400-500/ band 550-600 / band

800-900 / band
per set haploid -metafaza per set haploid -prometafaza
per set haploid -profaza
• Rezolutia depinde de stadiul mitotic in care se gaseste celula
• Fiecare banda corespunde la 5-10Mb
 Rezolutia cariotipului

18
7
 NOMENCLATURA CROMOSOMILOR
UMANI
• Conţinutul informaţional al cariotipului se redă astfel:
• mai întâi se notează numărul total de cromosomi (autosomi + gonosomi)
urmat, după o virgulă, de
• cromosomii sexuali urmat, după o virgulă,
• anomalia identificată

• 46,XX ‑ cariotip normal, sex genetic feminin

• 46,XY ‑ cariotip normal, sex genetic masculin

• Rezultatul la cariotip – Formulă cromosomială

Numărul Gonosomii Anomalia
total de identificată
cromosomi
Sistemul internaţional de standardizare şi nomenclatură – ISCN,
elaborat la Paris, în 1970 şi actualizat la următoarele Conferinţe
internaţionale
 Nomenclatura cromosomilor (ISCN)

• Regiune, Banda & Sub-banda

 Fiecare zona primeste un numar
 Numar mai mic spre centromer
 Numar mai mare spre telomer (distal)

 1p31.1
•Cromosom 1
•Brat scurt
•Regiunea 3 , banda 1, subbanda 1
Notare locus cromosomial

18p21.31
Cromosom
Braţ
Regiune
Bandă
Subbandă
Subsubbandă
• 45,X
Rezultate posibile la cariotip
• 47,XXY
• 47,XY,+21
• mos 45,X/46,XX
• 47,XY,+21/46,XY
• 46,XY,1q+
• 46,XX,5p-
• Constricţia secundară se notează cu litera "h", plasată după simbolul
braţului pe care se găseşte; creşterea ei în lungime se notează cu +. De
exemplu:
• 46,XY,9qh+ ‑ cariotip normal al unei persoane de sex masculin cu 46
cromosomi şi alungirea constricţiei secundare de pe braţul lung al
cromosomului 9.
 TEHNICI DE STUDIERE A CROMOZOMILOR
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

• Metoda folosita pentru:

• Defecte cromozomice mici;
• Diagnosticul prenatal al aneuploidiilor (21, 18,
13, X, Y) – este necesar un rezultat rapid;
• Translocatii – SKY (cariotipare spectrala,
chromosome painting);
• Tehnica scumpa.

27/03/2024 50
Sonde marcate fluorescent

DNA
TT FF
AA
TT AA
GG CC TT
AA GG AA
CC GG
TT CC
Marcaj fluorescent
FF
Sonda FISH
Principiile tehnicii FISH
• Vizualizarea indirectă a segmentelor
de ADN de interes, folosind probe
marcate fluorescent.
• Denaturarea moleculei de ADN
• Hibridizarea cu probele marcate
fluorescent.
MATERIAL ŞI METODE - FISH
Sonde FISH
Fluorescence InSitu Hypridization
FISH

13 (green)
21 (red)

X (green),
Y (red)
18 (aqua)
 TEHNICI PENTRU STUDIUL CROMOZOMILOR
CGH (Comparative Genome Hybridization)
• Metoda folosita pentru:
• Defecte cromozomice mici;
• Principii metoda:
• ADN pacient (marcat cu rosu) si ADN de referinta
(normal, marcat cu verde) se hibridizeaza pe un preparat
cromozomic;
• Examinare la microscop fluorescenta:
• Coloratie uniforma (maro) → pacient normal;
• Verde → deletie (lipsa ADN);
• Rosu → duplicatie (exces ADN);
• Array CGH – se verifica mai multe gene in acelasi timp
(“chip ADN”);

• Scump.

27/03/2024 56
MATERIAL ŞI METODE – arrayCGH+SNP