Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” Iaşi

Facultatea de Biologie
Specializarea Biotehnologii Microbiene Și Celulare

MODELE ANIMALE ÎN STUDIUL BOLII PARKINSON

MOLDOVAN Cristina-Veronica
MOROȘANU Raluca
 Boala Parkinson (PD) este a doua cea mai comună boală neurodegenerativă după boala
Alzheimer ce se caracterizează prin tremuraturi, rigiditate, bradichinezie (încetineală în
efectuarea mișcărilor), instabilitate posturală și modificări de mers. Aceste simptome sunt legate
de distrugerea neuronilor dopaminergici ce se găsesc în substanța neagră din mezencefal. Ca și în
cazul altor boli neurodegenerative, mecanismele moleculare și celulare care stau la baza morții
celulelor neuronale sunt înca neclare. Cu toate că majoritatea cazurilor de Parkinson sunt
sporadice și probabil sunt influențate de factorii de mediu, au fost identificate mai multe gene
responsabile de apariția cazurilor familiale de boala Parkinson. Dintre genele identificate până în
prezent, mutații ale α-sinucleinei (PARK1), ubiquitin C-terminal hidroxilaza L1 (UCHL1) și
receptorul nuclear NR4A2 s-au dovedit a fi cauze ale apariției bolii Parkinson autozomal
dominante, iar mutațiile Parkin (PARK2), DJ1 și PINK1, au fost asociate cu apariția de
Parkinson juvenil autozomal recesiv (AR-JP). AR-JP reprezintă o formă de debut precoce a bolii
Parkinson care apare, în general, înainte de vârsta de 40 de ani. Pentru a studia etiologia bolii
Parkinson, precum și pentru cercetările de screening al medicamentelor sunt utilizate diferite
modele animale, cărora li se administrează toxine, fie la nivel local (6-hidroxidopamina, 1-metil-
4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridină), fie sistemic (rezerpină, rotenonă, inhibitori proteozomali).

I. Modele clasice neurotoxice

6-OHDA

6-hidroxidopamina (6-OHDA), un analog hidroxilat al dopaminei, reprezintă un model

clasic în studierea bolii Parkinson, bazat pe administrarea de toxină unui animal test. Numeroase
informații legate de efectele comportamentale, biochimice și fiziologice ale dopaminei in SNC
au fost demonstrate pe baza acestui model. 6-OHDA prezintă o afinitate ridicată pentru câtiva
transportori catecolaminici, precum transportorul de dopamină (DAT) și transportorul de
norepinefrină (NET), care sunt adesea utilizați în asociere cu desipramina (inhibitor al recaptării
noradrenalinei). Șoarecii, pisicile, câinii, porcușorii de Guineea și maimuțele sunt sensibile la 6-
OHDA, însă cele mai utilizate modele animale sunt șobolanii. Această substantă se
administrează de-a lungul tractului nigrostriatal, folosind proceduri stereotaxice. Animalele sunt
plasate într-un cadru stereotaxic și utilizând o tăietură sagitală, craniul și bregma (punct
craniometric situat la joncțiunea între sutura sagitală, situată între cele două oase parietale, și
sutura coronală, situată între osul frontal și cele două oase parietale) sunt expuse, iar o canulă
este coborâtă la adâncimea corectă și toxina este introdusă incet, fie cu ajutorul unei pompe
automate, fie manual. Odată preluat în neuroni, 6-OHDA se acumulează în citosol unde este ușor
oxidat, conducând la formarea de specii reactive de oxigen, și în cele din urmă la stres oxidativ.
6-OHDA este frecvent utilizat ca un model unilateral, deoarece injectarea bilaterală a acestui
compus în corpii striați (nucleii bazali) produce adipsie severă (lipsă parțială/totală a senzației de
sete), afagie și în cele din urmă moarte. Mărimea leziunii depinde de cantitatea de 6-OHDA
injectată, de locul injectării și de tipurile de animale folosite. Deși, în general, terminațiile
nervoase sunt mai sensibile la toxicitatea 6-OHDA decât axonul și corpul celulei nervoase,
injectarea în substanta neagră sau în fascicolul median al prozencefalului produce o leziune
completă și rapidă în calea nigrostriatală (implicată în controlul motilității).

Fig. 1. Reprezentare schematică a unui cadru sterotaxic. Capul, urechile si maxilarul sunt
fixate. Rama conține o seringă Hamilton la care este atașat un capilar de sticlă cu ajutorul
căruia este injectată toxina.

MPTP

Modelul 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) a fost propus în urma

descoperirilor ce au avut loc la începutul anilor 1980, când mai mulți consumatori californieni de
droguri intravenoase ce au fost internați în spitale, prezentau simptome severe asemănătoare cu
cele ale bolii Parkinson. Investigațiile amănunțite au arătat că acei pacienți și-au administrat
meperidină sintetică (analgezic) contaminată cu MPTP. MPTP este foarte lipofil și după
administrarea sistemică traversează rapid bariera de sânge. Odată ajuns la nivelul creierului,
acesta intră în astrocite și este metabolizat la MPP+ (metabolit activ) de către
monoaminooxidaza B. MPP+ este eliberat apoi de către astrocite în spațiul extracelular, de unde
este preluat în neuronii dopaminergici învecinați și în terminațiile nervoase prin intermediul
DAT (transportor al dopaminei). MPP+ este capabil să inhibe complexul I al lanțului
mitocondrial transportor de electroni, ducând la eliberarea de specii reactive de oxigen, precum
și la reducerea producției de ATP. MPTP este utilizat în principal pe șoareci și primate, însă
poate fi utilizat și pe câini, pisici, ovine și porcușori de Guineea. Șobolanii sunt mai puțin
sensibili la toxicitatea MPTP decât șoarecii. MPTP poate fi administrat prin injectare sistemică
(subcutanată, intravenoasă).
 II. Alte modele neurotoxice nigrostriatale

Lipopolizaharidele

Se consideră că neuroinflamația este implicată în apariția bolii Parkinson. Aceasta nu

reprezintă principala cauză a morții celulare ce apare în cazul modelelor neurotoxice, însă poate
fi o etapă secundară care perpetuează ciclul vicios al neurotoxicității. Pentru a studia rolul
neuroinflamației se utilizează modelul bazat pe lipopolizaharide (LPS). LPS sunt endotoxine
produse de către bacteriile gram-negative care activează microglia prin intermediul receptorului
4, conducând astfel la producerea de citokine inflamatorii și chemokine. Pentru producerea de
leziuni nigrostriatale, lipopolizaharidele se pot administra stereotaxic în substanța neagră, în
corpii striați sau în fascicolul median al prozencefalului. Modelul LPS nu este utilizat pe scară
largă, motiv pentru care există mai multe motive pentru care acesta este lipsit de popularitate:
► injectarea stereotaxică reprezintă un factor tehnic descurajator pentru mai multe laboratoare;
► detectarea daunelor nigrostriatale produse de injecțiile intraperitoneale necesită o perioadă
îndelungată de timp;
► agregarea proteinelor, precum și patologia extranigrală nu au fost raportate;
► relevanța sa pentru boala Parkinson este nesigură.

Amfetaminele

Derivații amfetaminici, cum ar fi p-cloramfetamina (PCA), metamfetamina, 3,4-

metilendioximetamfetamina (MDMA) și fenfluramina au efecte deosebit de toxice asupra
sistemului nervos, cauzând astfel nu doar deficite funcționale, cât și alterări structurale. Modelul
bazat pe metamfetamină este cel mai frecvent utilizat, acest compus distrugând în primul rând
terminațiile nervoase dopaminergice din corpii striați, nucleul accumbens (implicat în sistemul
motivațional) și cortexul frontal, dar nu și celulele din substanța neagră sau din aria tegumentală
ventrală. În cazul în care metamfetamina este administrată în cantitate mare, celulele nervoase
din substanța neagră și din aria tegumentară pot fi distruse.

III. EXEMPLE DE PESTICIDE ȘI ERBICIDE

Paraquatul (PQ)

Este un erbicid utilizat pe scară largă în agricultură care prezintă o structură și un

comportament asemănător cu MPP+ (metabolit activ). PQ-ul își manifestă efectele dăunătoare
prin stresul oxidativ mediat de ciclul redox care genereaza ROS (specii reactive de oxigen) și
duce la deteriorarea lipidelor, proteinelor, ADN-ului și ARN-ului.
Rappold și colab. demonstrează că PQ-ul în doze mari este toxic pentru neuronii DA
(dopaminergici) din SN (sistemul nervos). Odata cu injectarea erbicidului în șoareci s-a observat
faptul că acesta provoacă deficiențe motorii și pierderea neuronilor dopaminergici, efecte
produse atât de cantitatea de PQ, cât și de vârsta șoarecilor.
Chiar și în studiile în care este detectată o pierdere a neuronilor dopaminergici, PQ-ul nu
are efect asupra nivelurilor striate ale dopaminei. O pierdere mai semnificativăa acestor neuroni,
precum și o reducere vizibilă a nivelurilor striate se poate realiza datorita etilenului bis
ditiocarbamat de mangan (Maneb).
În urma cercetărilor efectuate s-a demonstrat că utilizarea PQ-ului în boala Parkinson este
necesară datorită:
►abilității sale de a induce creșteri ale £-sinucleinei la nivelul neuronilor dopaminergici
individuali din substanța neagră compactă (SNpc);
►capacității acestuia de a forma structuri asemănătoare corpului Lewy la nivelul neuronilor
dopaminergici din substanța neagră compactă (SNpc).
Importanța PQ-ului în cercetările afecțiunii Parkinson este adesea limitată la studiul
procesului de formare a corpului Lewy în neuronii dopaminergici, precum și la rolul £-
sinucleinei. Cu toate acestea, lipsa efectului semnificativ al paraquatului asupra epuizării
nivelurilor striate ale dopaminei în tratamentele utilizate în mod obișnuit poate limita utilizarea
acestuia pentru a evalua terapiile neuroprotectoare ale bolii.

Rotenona

Spre deosebire de paraquat care este utilizat ca erbicid, rotenona este atât erbicid, cât și
insecticid. Datorită lipofilicității sale mari, rotenona poate traversa ușor bariera hemato-
encefalică și poate intra în toate celulele, fără a fi dependentă de un transportor specific.
Rotenona pare să inducă aproape toate simptomele distinctive ale afecțiunii, inclusiv modificările
comportamentale, inflamația, agregarea sinucleinei, formarea corpului Lewy, stresul oxidativ și
problemele gastro-intestinale.
La animale, rotenona a fost administrată pe diferite căi. Administrarea orală pare să
provoace o mică neurotoxicitate. Administrarea la nivelul sistemului cronic cu ajutorul pompelor
osmotice a fost utilizată cel mai frecvent, în special la șobolanul Lewis care poate fi mai sensibil
la rotenonă decat alte specii de șobolani. Injecțiile intraperitoneale au fost realizate pentru a
provoca deficite comportamentale și neurochimice. Administrarea intravenoasă este capabilă să
provoace leziuni neuronilor dopaminergici nigrostriați care este însoțită de agregarea £-
sinucleinei, formarea corpului Lewy și stresul oxidativ.
Când este perfuzată continuu printr-o canulă atașată la o minipompă osmotică
subcutanată de vena jugulară, rotenona produce neurodegenerarea nigrostriatală selectivă și
incluziuni citoplasmatice ale £-sinucleinei. S-au realizat experimente și pe alte tipuri de animale
(șoareci, maimuțe), dar acestea au eșuat. Până în prezent, rotenona nu a fost administrată la
oameni. Studiile recente au demonstrat că administrarea pe cale orală a rotenonei la șoareci
cauzează degenerare nigrală, scăderea nivelurilor striate de dopamină, disfuncționalitate motorie,
precum și agregarea £-sinucleinei în diferite zone ale creierului.
IV. EXEMPLE FARMACOLOGICE

Reserpina

Este primul exemplu farmacologic recunoscut în boala Parkinson. Carlsson și colab. au

arătat că atunci când rozătoarele au fost tratate cu reserpină pentru a epuiza dopamina și alte
catecolamine din creier, au dezvoltat akinezia (stare patologică constând în incapacitatea de a
efectua anumite mișcări) care ar putea fi eliminată cu succes de levodopa (L-dopa) (aminoacid
neesențial). Scăderea monoaminelor și deficitele motorii induse de reserpină au fost reproduse și
la iepuri, cobai, pisici și maimuțe.
Reserpina a contribuit, de asemenea, la înțelegerea legăturii dintre scăderea monoaminelor
și simptomele parkinsoniene. Toate medicamentele dopaminergice utilizate în prezent pentru a
trata simptomele afecțiunii Parkinson (apomorfina, pramipexolul, ropinirolul, pergolida,
bromocriptina și cabergolina) au prezentat eficacitate la șobolanul tratat cu reserpină. Deoarece
efectele reserpinei sunt tranzitorii, nespecifice dopaminei și neurotoxice față de calea
nigrostriatală, reserpina nu mai este o alegere pentru această boală.

α-metil-para-tirozina

Este un alt agent farmacologic utilizat pentru diminuarea cantității de dopamină. La fel ca
și în cazul reserpinei, efectul α-metil-para-tirozinei este tranzitoriu și lipsit de o neurodegenerare
a structurii nigrostriatale. Și în acest caz, agentul farmcologic prezintă o acțiune limitată.
Ocazional, este utilizat împreună cu reserpina pentru a evidenția efectul scăderii cantității de
dopamină.

Haloperidolul

Acesta funcționează prin antagonizarea dopaminei D2 și, într-o mică măsură, a receptorilor
D1 în neuronii spinoși de dimensiuni medii care cuprind căile indirecte și directe ale circuitului
motor. Forma transmisiei striate a dopaminei are ca rezultat arderea anormală în circuitele
ganglionilor bazali care se manifestă ca simptome de rigiditate musculară și catalepsie în 60 de
minute de la injectarea cu haloperidol.
Deși, exemplele farmacologice au un loc important în descoperirea medicamentelor care
tratează simptomele bolii Parkinson, ele au și limitări serioase:
►sunt doar tranzitorii, ceea ce limitează utilizarea lor pe termen lung. În cazul acestei
boli, medicamentele vor fi administrate pe o perioadă îndelungată;
►deoarece aceste modele farmacologice nu prezintă nicio patologie, ele nu sunt de folos
atunci când se investighează strategii noi care vizează asigurarea neuroprotecției sau
neurorefacerii.
 V. EXEMPLE GENETICE

Deși, boala Parkinson a fost mult timp considerată o tulburare nongenetică de origine
"sporadică", mutațiile genetice sunt rare și reprezintă aproximativ 10% din toate cazurile.
Această boală se transmite pe două căi:

1. Boala Parkinson cu transmitere autozomal dominantă

►α-sinucleina

Mutațiile genetice care apar la nivelul £-sinucleinei joacă un rol important în reciclarea
veziculelor sinaptice, fiind primele dovezi în ceea ce privește legătura genetică cu boala. Două
mutații la nivelul α-sinucleinei (A53T, A30P) provoacă o formă dominantă a afecțiunii. Studiile
efectuate pe șoarecii transgenici au arătat că mutația A53T poate avea ca rezultat formarea unui
fenotip motor sever care poate duce în cele din urmă la paralizie și moarte. În plus, mutatiile de
acest tip produc incluziuni care se aseamănă cu corpurile Lewy.
S-a demonstrat că distrugerea α-sinucleinei nu afectează dezvoltarea sau întreținerea
neuronilor dopaminergici. În urma studiilor realizate pe Drosophila s-a observat pierderea
celulelor dopaminergice, incluziuni intraneuronale filamentoase și deficiențe motorii.
Unii dintre șoarecii transgenici au prezentat deficiențe olfactive, disfuncții ale colonului și
alte anomalii.

►LRRK2 (Leucine-Rich Repeat Kinase2)

Spre deosebire de £-sinucleina care este omniprezentă, LRRK2 (Leucine-Rich Repeat

Kinase 2) este localizată în membrane. S-a constatat că distrugerea genei nu are niciun efect
asupra dezvoltării și întreținerii neuronilor dopaminergici.

2.Boala Parkinson cu transmitere autozomal recesivă

►DJ1, Parkin, PINK1

Mutațiile Parkin (care reprezintă aproximativ 50% din cazurile familiale ale bolii și 20%
din cazurile bolii cu debut la tineri), DJ1 (proteina chaperonă) și PINK1 (localizată în spațiul
mitocondrial intermembranar) determină forme autozomal recesive ale afecțiunii Parkinson.
Recent, s-a demonstrat că eliminarea genei Parkin la șoarecii adulți cauzează
neurodegenerare în sistemul nervos central.
BIBLIOGRAFIE

1. NEDA VALIAN, ABOLHASSAN AHMADIANI (2015) - Animal models of Parkinson’s

disease din Animal Models of Multiple sclerosis, Neuroscience Research Center, Shahid
Beheshti University of Medical Sciences, Iran