ENZIME (2)

Conf. Dr. Elena Petrescu

1
 CINETICĂ ENZIMATICĂ
• Studiază viteza reacțiilor catalizate enzimatic și factorii care o influențează
• Enzimele pot fi extrase și izolate din celule, iar apoi proprietățile lor pot fi studiate
în eprubete, în laborator (in vitro) → datele obținute oferă informații valoroase
despre funcționarea enzimelor în celulele vii (in vivo)

• Viteza de reacție = numărul de molecule de substrat transformate în produs în

unitatea de timp
• Se exprimă, de obicei, în μmoli de produs formați pe minut (= UI - unitate
internațională)

➢ Factori care influențează viteza de reacție:

• 1. Temperatura
• 2. pH
• 3. Concentrația substratului
2
 Cinetică enzimatică

1. Temperatura

• Viteza de reacție crește odată cu creșterea temperaturii, până la atingerea unui

maxim (datorită creșterii energiei cinetice a substratelor → acestea vor atinge mai
ușor starea de tranziție)

• Creșterea suplimentară a temperaturii (> 50-60oC) duce la scăderea vitezei de

reacție ca urmare a denaturării enzimei

• Pentru majoritatea enzimelor care acționează

în corpul uman, temperatura optimă este în jur
de 37⁰C

• Enzimele bacteriilor termofile (care trăiesc în izvoare

geotermale) sunt remarcabil de termostabile:
Taq polimeraza utilizată în amplificarea
ADN prin PCR (polymerase chain reaction) are
temperatura optimă de ≈75oC și nu este denaturată la 95oC
3
 Cinetică enzimatică
2. pH

• Fiecare enzimă are un pH optim (la care activitatea catalitică maximă este atinsă)
• pH-ul optim este diferit pentru diverse enzime (între 5 și 9 pentru enzimele
intracelulare); excepție notabilă: pepsina din stomac → pH optim = 1,5
• pH-ul influențează starea de ionizare a unor grupări funcționale din centrul activ al
enzimei, precum și a grupărilor implicate în legături ionice care stabilizează
structura terțiară a enzimelor
• Modificările semnificative de pH (față de pH-ul optim al enzimei) pot cauza
denaturarea enzimei

4
 3. Concentrația substratului, [S]
❑ Cinetica Michaelis-Menten (caracterizează mare parte dintre enzime):

(k1, k−1, k2 = constante de viteză)

• Ecuația Michaelis-Menten (Leonor Michaelis și Maud Menten) – descrie modul cum

viteza de reacție variază cu concentrația substratului:
V0 = viteza inițială
Vmax = viteza maximă
[S] = concentrația substratului
Km = constanta Michaelis-Menten

➢ Condiții utilizate în experimentele care studiază cinetica Michaelis-Menten:

• Viteza care se măsoară este viteza inițială (V0) – în primele momente după ce
enzima și substratul au fost puse în contact
• [S] este aleasă să fie mult mai mare decât concentrația enzimei (până la de 105-106
ori mai mare)
• Mai multe eprubete – concentrația enzimei este aceeași în fiecare eprubetă, iar [S]
este diferită (valori progresiv crescânde) → V0 este investigată în funcție de [S] 5
 Cinetica Michaelis-Menten
• La concentrații mici de substrat → V0 crește aproape liniar pe măsură ce [S] crește
• La concentrații mai mari de substrat → V0 crește din ce în ce mai lent odată cu
creșterea [S]
• În cele din urmă, viteza maximă (Vmax) este atinsă: creșteri suplimentare ale [S] nu
determină o creștere suplimentară a V0 (regiunea platou)
• Vmax corespunde situației în care enzima este saturată cu substrat
(centrele active ale tuturor moleculelor de
enzimă din mediu sunt ocupate cu molecule
de substrat)
• Curba are un aspect hiperbolic

6
 Cinetica Michaelis-Menten

• Km = constanta Michaelis-Menten

• În cazul particular în care V0 = ½ Vmax – ecuația Michaelis-Menten devine:

→ →

• Km este echivalentă cu concentrația substratului la care viteza inițială este

jumătate din viteza maximă (jumătate din centrele active ale moleculelor de
enzimă sunt ocupate cu molecule de substrat)

7
 Semnificația Km
• Fiecare enzimă este caracterizată de anumite valori ale parametrilor cinetici Km și
Vmax, care permit studierea și compararea enzimelor între ele

• Km este o măsură a afinității enzimei pentru substrat

- ele sunt invers corelate (Km mare = afinitate mică
și vice versa) (afinitatea enzimei este proporțională
cu 1/Km)

• Km oferă o măsură a concentrației de substrat care

este necesară pentru ca o cataliză semnificativă
să aibă loc
• Pentru majoritatea enzimelor, Km este cuprins între
10−1 și 10−7 M

• In vivo, majoritatea enzimelor nu sunt, în mod

obișnuit, saturate cu substrat (în condiții fiziologice,
raportul [S]/Km este cuprins între 0,01 și 1,0)
8
Reprezentarea unei enzime la concentrații de substrat mici (A), mari (C),
și egală cu Km (B)

9
 Semnificația Vmax
• Vmax arată cât de rapid poate enzima să genereze produs atunci când este saturată
cu substrat
• Fiecare enzimă este caracterizată de un anumit ”turnover number” (kcat) =
numărul de molecule de substrat transformate în produs de către o moleculă de
enzimă în unitatea de timp, atunci când enzima este saturată cu substrat

10
 Graficul Lineweaver-Burk

• Măsurarea directă a valorii Vmax și calcularea valorii Km utilizând ecuația Michaelis-

Menten sunt, de obicei, dificile
• Prin inversarea acestei ecuații, se obține un grafic liniar (ecuație de tipul y = ax + b)

→ →

• Graficul Lineweaver-Burk permite calcularea cu exactitate a valorilor Vmax și Km

(care pot fi doar aproximate utilizând graficul Michaelis-Menten)

11
 Inhibiția enzimatică
• Inhibitorii enzimatici sunt molecule care interferă cu acțiunea catalitică a
enzimelor și determină scăderea vitezei de reacție
• Deoarece majoritatea proceselor celulare sunt catalizate de enzime, mulți agenți
farmacologici acționează ca inhibitori ai unor enzime cheie din organism
• Inhibiția enzimatică poate fi reversibilă sau ireversibilă

I. Inhibiția reversibilă
• Inhibitorii reversibili interacționează cu enzima prin legături necovalente → ei pot
fi ulterior îndepărtați din mediu, iar enzima revine la starea originală și își poate
recupera complet activitatea
• Poate fi de două tipuri: competitivă și necompetitivă

12
 1. Inhibiția competitivă

• Inhibitorii competitivi au structură asemănătoare cu substratul (”analogi de

substrat”) → concurează cu acesta pentru legarea la centrul activ al enzimei
• Legarea inhibitorului (I) în centrul activ al enzimei determină ocuparea acestuia și
imposibilitatea de legare a substratului
• O enzimă poate lega fie substratul (cu formarea complexului ES), fie inhibitorul
competitiv (cu formarea complexului EI), dar nu le poate lega pe amândouă

• Un inhibitor competitiv determină scăderea vitezei de reacție prin reducerea

numărului de molecule de enzimă libere, capabile să lege substratul și să formeze
complexul ES, pentru a genera produs de reacție

• Inhibiția competitivă poate fi înlăturată prin creșterea concentrației de substrat:

aceasta va duce la creșterea probabilității ca substratul să se lege la enzimă, în
locul inhibitorului → va scădea concentrația complexelor EI și va crește
concentrația complexelor ES → viteza de reacție va reveni spre valoarea normală

13
 Inhibiția competitivă

• Efectele inhibitorilor competitivi asupra parametrilor cinetici ai enzimelor:

- creșterea valorii Km (scăderea afinității enzimei pentru substrat) → o
concentrație mai mare de substrat va fi necesară pentru a atinge ½ Vmax
- valoarea Vmax rămâne nemodificată

14
Inhibiția competitivă

15
 Exemple de inhibiție competitivă

• Inhibiția succinat dehidrogenazei (SDH - din ciclul Krebs) de către malonat

• SDH catalizează oxidarea succinatului (substratul său natural) la fumarat
• Structura malonatului este asemănătoare cu cea a succinatului

16
 Exemple de inhibiție competitivă
• Inhibiția HMG-CoA reductazei (enzimă cheie din calea de sinteză a colesterolului)
de către medicamente numite statine (ex. Simvastatin)
• Statinele au structură asemănătoare cu substratul natural al enzimei: HMG-
coenzima A
• Aceste medicamente sunt utilizate în tratamentul hipercolesterolemiei
(concentrație crescută a colesterolului în sânge), care este un factor de risc major
pentru bolile cardiovasculare

17
 2. Inhibiția necompetitivă
• Inhibitorii necompetitivi nu au asemănare structurală cu substratul enzimei → se
leagă de enzimă într-un loc diferit de centrul activ; legarea inhibitorului permite și
legarea substratului
• Inhibitorul se poate lega la enzima liberă sau la complexul ES → se pot forma
complexe EI și ESI
• Ca urmare a legării, inhibitorul necompetitiv cauzează o modificare în structura
enzimei, în special în jurul centrului activ → substratul este capabil să se lege în
centrul activ, dar enzima nu va putea cataliza reacția atunci când inhibitorul este
legat (complexul ESI nu generează produs de reacție)

18
 Inhibiția necompetitivă
• Efectele inhibitorilor necompetitivi asupra parametrilor cinetici ai enzimelor:
- scăderea valorii Vmax
- valoarea Km rămâne nemodificată

• Inhibitorii necompetitivi duc la scăderea numărului de molecule de enzimă

funcționale

• Inhibiția necompetitivă nu poate fi înlăturată prin creșterea concentrației

substratului
19
Inhibiția necompetitivă

20
 II. Inhibiția ireversibilă

• Inhibitorii ireversibili se leagă covalent la o grupare funcțională a enzimei care este

esențială pentru activitatea enzimei (pentru legarea substratului, cataliză, sau
pentru menținerea conformației funcționale a enzimei) – de obicei legarea are loc
în centrul activ
• Aceste modificări covalente sunt stabile → o enzimă care a fost “otrăvită” de un
inhibitor ireversibil rămâne inhibată și după îndepărtarea restului de inhibitor din
mediu (enzima nu poate fi regenerată în forma sa inițială)
• Aplicabilitate practică: unele medicamente acționează prin inhibiția ireversibilă a
unor enzime

21
 Inhibiția ireversibilă

1. Inhibitori care reacționează cu grupări funcționale specifice ale enzimelor

• Compuși organofosforici (diizopropil fluorfosfat - DIPF; sunt compuși toxici folosiți

ca insecticide) → se leagă covalent la gruparea –OH a unui rest de serină din
centrul activ al acetilcolin-esterazei (care catalizează hidroliza
neurotransmițătorului acetilcolină) și o inhibă → acetilcolina se acumulează în
exces → suprastimulare a SNV parasimpatic și la nivelul plăcilor neuro-motorii

22
 Inhibiția ireversibilă

• Aspirina (acid acetil-salicilic) – inhibă ireversibil cicloxigenaza (implicată în sinteza

prostaglandinelor cu rol pro-inflamator) prin acetilarea unui rest de serină din
centrul activ → efect anti-inflamator

23
 Inhibiția ireversibilă
2. Inhibiția bazată pe mecanismul de reacție (inhibitori ”sinucigași”)

• Inhibitorul se leagă la enzimă la fel ca substratul natural (datorită similitudinii

structurale) și este supus mecanismului catalitic → se generează un intermediar
reactiv anormal care rămâne legat ireversibil în centrul activ al enzimei → enzima
este inactivată
• Exemplu - inhibiția xantin oxidazei de către allopurinol:
- allopurinolul seamănă cu hipoxantina, substratul natural al xantin oxidazei (enzimă
implicată în degradarea nucleotidelor purinice la acid uric) → este transformat în
oxipurinol, care blochează centrul activ al enzimei
- utilizat în terapia gutei (cauzată de nivelul excesiv de acid uric)

24