L9 BANP

Asist. Univ. Dr. Lupăescu Ancuța-Veronica

Dozarea proteinelor din vin si suc prin metoda Lowry

Scop: Estimarea cantității de proteină din proba dată prin metoda lui Lowry.
Introducere: Testul proteinei Lowry este un test biochimic pentru determinarea nivelului total de
proteine dintr-o soluție. Concentrația totală de proteine este prezentată printr-o schimbare de culoare a
soluției de probă proporțional cu concentrația de proteine, care poate fi apoi măsurată folosind tehnici
colorimetrice. Este numit după biochimistul Oliver H. Lowry care a dezvoltat reactivul în anii 1940.
Lucrarea sa din 1951 care descrie tehnica este cea mai citată lucrare vreodată în literatura științifică,
citată de peste 300.000 de ori
Principiu: Metoda Lowry se bazează pe o combinație a două reacții diferite. Prima reacție constă în
reducerea ionilor de Cu2+ (la Cu+) ca urmare a interacțiunii acestora cu grupele peptidice ale proteinei
din probele analizate (reacția biuretului) în condiții alcaline. În acest caz, cationii de cupru formează un
compus complex (cromofor biuret) cu legături amidice ale grupărilor peptidice, timp în care sunt reduse.
Cromoforul biuretului este în continuare stabilizat de tartrat (acid tartric). Reacția biuretului în sine nu
are o sensibilitate mare (limita inferioară a sensibilității este de câteva mg de proteină în probă).
Utilizarea suplimentară a reactivului Folin-Ciocalteu (un amestec de acid fosfotungstic și acid
fosfomolibdic în reacția Folin–Ciocalteu) crește sensibilitatea acestei metode de aproximativ 100 de ori.
A doua reacție constă tocmai în reducerea heteropoliacidului molibden-tungsten, care face parte din
reactivul Folin-Ciocalteu, cu ioni Cu+, resturile de aminoacizi ale tirozinei, triptofanului, histidinei și
cisteinei la albastru de molibden-tungsten, care are o culoare albastru-violet și o lumină intens
absorbantă în intervalul 500-750 nm (de obicei, absorbția se măsoară la o lungime de undă de 660 sau
750 nm; absorbția la 750 nm este de obicei mai mare, iar măsurarea la această lungime de undă are o
sensibilitate mai mare).

Figura 1. Mecanismul metodei Lowry

1
 L9 BANP
Asist. Univ. Dr. Lupăescu Ancuța-Veronica

Metoda Lowry este sensibilă la modificările pH-ului și, prin urmare, pH-ul soluției de testare trebuie
menținut la 10 - 10,5. Metoda Lowry este sensibilă la concentrații scăzute de proteine. Unii autori
sugerează concentrații cuprinse între 0,10 - 2 mg de proteină per ml în timp ce altii sugerează
concentrații de 0,005 - 0,10 mg de proteină per ml. Dezavantajul major al metodei Lowry este intervalul
îngust de pH în care este precisă. Cu toate acestea, putem folosi volume foarte mici de probă, care vor
avea un efect redus sau deloc asupra pH-ului amestecului de reacție.
Din păcate, o varietate de compuși pot interfera cu procedura Lowry. Acestea includ unii
derivați de aminoacizi, anumite tampoane, medicamente, lipide, zaharuri, săruri, acizi nucleici și
reactivi sulfidril [Dunn, 1992]. Prin urmare, aceste substanțe trebuie îndepărtate sau diluate înainte de a
efectua testele Lowry.

Parte experimentala

A. Echipamente si materiale necesare

Spectrofotometru; Cuve din plastic; Pipete Pasteur; Tuburi Eppendorf; Vortex

B. Reactivi
A. 2% Na2CO3 în NaOH 0,1 N
B. 1% tartrat de Na si K în H2O
C. 0,5% CuS04,5 H2O în H2O
D. Reactiv I: 48 ml de A, 1 ml de B, 1 ml C
E. Reactiv II- 1 parte Folin-Fenol [2 N]: 1 parte apă
F. BSA Standard - 1 mg/ ml

C. Mod de lucru:
Realizare curba de etalonare:
• se pipeteaza 0,1 ml de standard BSA de diferite concentrații/apa în 5 microtuburi.
• se adaugă peste 0.25 ml apă distilată.
• se adauga 1,5 ml de reactiv I și se incubează timp de 10 minute la 37°C.
• după incubare se adaugă 0,15 ml de reactiv II și se incubează timp de 30 de minute
• se masoara absorbanța la 660 nm și se trasați graficul standard.
• se estimeaza cantitatea de proteină prezentă în proba dată din graficul standard.

Tabel 1. Curba de etalonare

Concentrație
Absorbanță

2
 L9 BANP
Asist. Univ. Dr. Lupăescu Ancuța-Veronica

Pregătirea proba:
O prima determinarea se va realiza pe proba bruta respectând protocolul e la curba de etalonare.
Valoarea obținută va fi trecuta in tabelul de mai jos.
In paralel se va face o precipitarea a proteinelor cu acetona. Precipitatul obținut va fi redizolvat in apa
distilata si se va determina concentrația acestuia. Valoarea obținută va fi trecuta de asemenea in tabelul
de mai jos.
La final se vor compara rezultatele obtinute la proba bruta si extract.

1. Probe
Vin Suc
Proba Bruta precipitata Bruta precipitata
Concentrație
Absorbanță

Bibliografie
https://www.linkedin.com/pulse/unveiling-clarity-winemaking-lowry-method-barnak-saha
https://www.scribd.com/document/222426959/Metoda-Lowry-de-Determinare-a-Proteinelor
https://www.researchgate.net/publication/336835980_Determination_of_protein_concentration_by_the_Lowry_method_in_t
he_Peterson_modification

3
 L9 BANP
Asist. Univ. Dr. Lupăescu Ancuța-Veronica

Proteinele din vin: curiozități

Formarea de ceață proteică în vinurile albe este o preocupare comună în crame. Problema este doar un defect
vizual, care nu afectează trăsăturile de gust și aromă și nici nu reprezintă un risc pentru sănătate; cu toate acestea,
consumatorii consideră acest defect inacceptabil. Înțelegerea principalelor componente, fenomene și mecanisme
implicate în formarea opacității proteice este esențială pentru a analiza și dezvolta noi tehnologii de stabilizare a
proteinelor.
Ce proteine devin instabile?
Formarea ceață este atribuită în principal denaturarii lente a proteinelor instabile, care poate apărea în timpul
depozitării sau transportului vinurilor albe. Proteinele predominante care cauzează ceață sunt proteinele
asemănătoare taumatinei (TLP) și chitinazele (CHIs), care sunt proteine derivate din struguri legate de
patogeneza (PR). Alte proteine PR, cum ar fi β-glucanaza, proteinele legate de coacerea strugurilor (GRIP)
precum GRIP22 și GRIP32, invertaza și proteinele de transfer lipidic (LTP), au fost identificate ca contribuitori
minori la formarea opacității. Formarea ceață este asociată în principal cu CHI și TLP-uri în intervalul 15-30 kDa,
unde acesta din urmă este mai puțin susceptibil la ceață indusă de căldură decât CHI, chiar și atunci când vinul
este supus la temperaturi de 30 ° C timp de 22 de ore. Aceste proteine au proprietăți de desfășurare diferite; unele
TLP au un comportament reversibil, adică pot fi repliate după încălzire, în timp ce CHI-urile se caracterizează
printr-un comportament ireversibil, adică ele, ca chitinază de clasa IV, rămân desfășurate după încălzire. Această
caracteristică ar putea explica de ce CHI-urile sunt mai susceptibile la formarea de ceață.
Care sunt factorii care afectează formarea ceață?
Factorii non-proteici care afectează formarea tulburelii includ polizaharidele, polifenolii, sulfații, modificările
pH-ului și factorii care cresc concentrația de proteine în struguri, cum ar fi recoltarea la mașină, transportul pe
distanțe lungi, infecțiile strugurilor și schimbările climatice. Compușii fenolici și sulfatul promovează creșterea
agregatelor proteice și cresc ceața, în timp ce polizaharidele pot interfera cu procesul de agregare, dar nu îl pot
împiedica. În plus, o ușoară modificare a pH-ului ar putea afecta solubilitatea proteinelor datorită interacțiunii lor
cu alte macromolecule.
În timpul coacerii, strugurii sunt predispuși la infecții fungice, răni sau stres, ceea ce duce la concentrații mari
de proteine PR. De exemplu, infecția strugurilor cu mucegai praf – cauzată de agentul patogen fungic Uncinula
necator – declanșează o creștere a proteinelor PR. Sulfații influențează și formarea de ceață, care, în prezența
CHI-urilor, produce o ușoară creștere a ceață la vinurile albe.
Care este tratamentul actual?
Adăugarea în lot de bentonită de sodiu este cea mai utilizată metodă pentru tratarea instabilității vinului alb;
cu toate acestea, este asociat cu impacturi negative asupra mediului, pierderi de vin și degradare a calității. În
plus, adăugarea de bentonită este o metodă relativ costisitoare; pe lângă bentonită, alte costuri relevante sunt forța
de muncă intensivă, costurile de operare și gestionarea deșeurilor. În consecință, sunt necesare noi metode pentru
a reduce costul și impactul asupra mediului al tehnologiei actuale de stabilizare a proteinelor. Au fost cercetate
diferite metode în ultimii ani, dar niciuna dintre ele nu a reușit să înlocuiască utilizarea bentonitei. Sunt:
- Îmbunătățirea stabilizării tradiționale (bentonită)
- Tratamente cu ultrasunete de mare putere
- Tratamente cu căldură plus enzime
- Tratamente cu enzime imobilizate suportate pe chitosan
- Nanoparticule magnetice acoperite cu acid acrilic prin polimerizare cu plasmă
- Zeoliți
- Pulbere de semințe de struguri
- Oxid de zirconiu
- Manoproteine
- Caragenan și pectină
- Chitină și chitosan
- Tulpini de drojdie cu niveluri ridicate de chitină
https://sawine.co.za/causes-and-factors-contributing-to-protein-instability-in-wines/
4