Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2022-2023

Lucrarea nr. 3

Extractia si analiza prin cromatografie pe strat subtire a pigmentilor din plante verzi

1. Notiuni privind cromatografia

Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri, care se bazeaza
pe interactiunea diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu doua faze cromatografice: faza
mobila si faza stationara.
Cromatografia a fost initiata în 1901 de botanistul rus Ţvet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana
umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei
metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere
în limba greaca).
Principiul de baza al separarii cromatografice consta în distributia inegala a componentelor unui amestec între
faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila.
Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de
capacitatea diferita de a difuza în acestea.

Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc în momentul initial ametecate, într-un volum restrâns, vor
avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice.
Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute în
aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei
componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în
timpul deplasarii în coloana, deci este in proces dinamic.
In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie, coloana este inlocuita cu un strat adsorbant
(silicagel, alumina, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub
capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe
placuta prin actiune capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite.

2. Extractia si analiza cromatografica a pigmentilor naturali din frunzele verzi

Clorofila (din greacă chloros-verde si phylos-frunza) este un pigment de culoare verde, esenţial în procesul de
fotosinteză, prin intermediul acesteia avînd loc transformarea energiei luminoase în energie. Clorofila a fost izolata
pentru prima dată de Joseph Bienaimé Caventou și Pierre Joseph Pelletier in 1817.
Clorofila este un pigment cu structura clorinica, similar din punct de vedere structural cu alte produse de tip
porfirinic, cum ar fi hemul. In centrul inelului clorinic se gaseste un ion de magneziu. Inelul clorinic poate avea ca
substituenti mai multe lanţuri de diferite lungimi si de obicei, un lanţ lung de tip fitol. Există câteva forme diferite care
apar în mod natural, dar tipurile cel mai des intalnite în plantele terestre sunt clorofila a si clorofila b. Structura generală
a clorofilei a fost elucidată de către Hans Fischer în 1940, iar în 1960, când cea mai mare parte astereochimiei
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2022-2023

clorofilei a fost cunoscută, Robert Burns Woodward a publicat o sinteză totală a moleculei. În 1967, ultima elucidare
rămasă privind stereochimia a fost completată de Ian Fleming, şi în 1990 Woodward a publicat o sinteza actualizată.

Clorofila a Clorofila b

In frunzele plantelor pe langa pigmentii clorofilieni totodeauna se intalnesc si alti pigmenti naturali cum ar fi
carotenii si diverse xantofile toti acesti compusi avand un rol activ in procesul de fotosinteza.

β-caroten
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2022-2023

Xantofile (criptoxantina)

Mod de lucru

1. Extractia clorofilei din frunzele verzi.

a. Se cantaresc circa 3g frunze verzi. Se maruntesc bine si se introduc intr-un pahar Berzelius de 50ml.
b. Se adauga in pahar 15 ml etanol si paharul se acopera cu o sticla de ceas.
c. Se mentine circa 1.5 ore agitand ocazional cu o bagheta de sticla pentru maruntirea frunzelor.
d. Extractul obtinut se utilizeaza pentru analiza cromatografica.

2. Analiza amestecului extras prin cromatografie pe strat subtire.

Pentru cromatografie se utilizeaza placute de cromatografie cu strat de oxid de aluminiu.

Eluentul este o solutie de eter de petrol, isooctan, acetat de etil, acetona si metanol in raport 6:1.6:1:1:0.4 (volum)
gata preparat pe care il gasiti in balonul cotat de pe masa-Eluent I.
a. Intr-un pahar Berzelius curat si uscat se adauga o cantitate de eluent care sa acopere fundul paharului (un
strat de 2-3mm) si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.
b. Se ia o placuta de cromatografie si cu ajutorul unui creion se trage o linie subtire la circa 1 cm de baza
placutei.
c. Cu ajutorul unei capilare se aplica in centrul placutei pe linia desenata anterior un spot cu diametrul de circa
5mm. Se lasa solventul sa se evapore, dupa care se repeta operatia de 3- 4 ori pentru a obtine o proba mai
concentrata, avand grija sa se mentina aceasi marime a spotului si lasand sa se usuce dupa fiecare aplicare.
d. Placuta se introduce in paharul cu eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.
e. Se elueaza proba pana la aproximativ 1 cm fata de capatul superior al placutei, cand aceasta se scoate din
pahar.
f. Cu ajutorul creionului se macheaza rapid linia finala a frontului de eluent, precum si spoturile ce se pot
identifica pe placuta.
g. Se determină valorile Rf (factor de retenţie) pentru toate spoturile. Se măsoară distanta de la linia de start pana
la linia frontului de eluent. Apoi se măsoară distanta de la linia de start pana la linia fiecarui spot.

distantade la linia de start la linia pigmentului

Rf=
distanta de la linia de start la linia frontului de eluent

Valorile Rf mai mari corespund compusilor mai putin polari. In literatura, valorile Rf pentru fiecare component sunt:
Rf = 0.16 pentru xantofile, Rf = 0.32 pentru clorofila b, Rf = 0.44 pentru clorofila a, si Rf = 0.95 pentru caroten.

Completati urmatoarele date:

1. Cantitatea de frunze: ____ g
2. Completati tabelul:
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2022-2023

Spot Culoare Rf Identitate probabila

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

 Intrebari
1. Care compus din cei separati in lucrarea de laborator este mai polar? Dar care mai putin polar? De unde va puteti
da seama?
2. De ce nu se poate utiliza un stilou cu cerneala sau un pix in locul creionului?
3. Placuta A de mai jos reprezintă cromatograma in strat subtire a unui compus X realizată pe silicagel, utilizând ca
eluent n-hexan. Acelaşi compus a fost cromatografiat utilizând o plăcuţă mai mare, folosind acelaşi eluent. Care din
plăcuţele B, C şi D reprezintă cromatograma corectă a compusului X? Explicaţi răspunsul dat.

4. Cromatografia in strat subtire se utilizeaza cu succes si pentru identificarea amestecurilor de aminoacizi. In acest
caz se utilizeaza placute de silicagel, iar ca eluent alcool izoamilic : apa:acid acetic = 6 : 5 : 3 v/v.
a. Pentru un amestec ce contine fenilalanina, tirozina, glicina si acid glutamic indicati ordinea crescatoare de separare
in functie de valorile Rf. (indicatie: scrieti structurile compusilor!).
b. Avand in vedere ca solutiile aminoacizilor sunt incolore propuneti, pe baza cunostintelor din lucrarile de laborator
anterioare o metoda de vizualizare a spoturilor acestora pe placuţa cromatografică.